PT97337B

PT97337B - Metodo para o tratamento de doencas neoplasticas com conjugados do acido difluoroglutamico com folatos e anti-folatos

Info

Publication number: PT97337B
Application number: PT97337A
Authority: PT
Inventors: Philippe Bey; James K Coward; John J Mcguire
Original assignee: Merrell Dow Pharma; Health Research Inc; Univ Michigan
Priority date: 1990-04-12
Filing date: 1991-04-11
Publication date: 1998-08-31
Also published as: JP2894576B2; EP0451836B1; JPH04234854A; IE911234A1; HU911193D0; ES2082029T3; AU631055B2; FI911788A7; CA2039855A1; PT97337A; IL97815A0; US5286726A; DE69115744T2; ZA912555B; AU7417591A; NO911415L; DE69115744D1; FI911788L; HUT57793A; CA2039855C

Description

MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS NEOPLÃSTICAS COM

CONJUGADOS DO ÃCIDO DIFLUOROGLUTÃMICQ COM FOLATOS E

ANTI-FOLATOS

ÂMBITO DA PRESENTE INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a novos conjugados do ácido difluoroglutâmico com folatos e anti-folatos, ã utilização des. tes conjugados no tratamento de doenças neoplásticas e a compostos intermédios utilizados na preparação dos conjugados.

ANTECEDENTES DA PRESENTE INVENÇÃO

Os folatos e os anti-folatos clássicos, tais como MTX^ são convertidos intracelularmente em metabolitos poli (jT-glutami Lo) e pelo enzima folilpoliglutamato-sintetase.

PteGlu + ATP + L-Glu -> PteGlu ,. + ADP + P. η n+1 í

A partir do momento em que se teve conhecimento de que os folilpoliglutamatos eram essenciais para o adequado funcionamento do metabolismo dos folatos e que os antifolilpoliglutamatos se en contravam implicados na acção citotóxica de anti-folatos clássicos tais como a MTX, o enzima folilpoliglutamato-sintetase tornou -se um enzima importante para o estudo da bioquímica dos folatos e da farmacologia bioquímica dos folatos. Com este objectivo, in

vestigaram-se extensivamente a especificidade deste enzima para os substractos pteroílo e L-glutamato. Para os substractos pteroílo a estrutura do componente heterocíclico pode variar de um modo considerável mas verificou-se que o resíduo terminal de L-glutamato era absoiutamente necessário para a actividade do substracto em todas as referências efectuadas até ã data. A especificidade para a entrada do aminoácido ê rigorosa mas não absoluta. 0 ãcido L-monocisteico e D,L-eritro- ou D,L-treo-4-fluoroglutamato podem servir como substractos alternativos ef_i cazes mas em cada um dos casos a incorporação causa a terminação da cadeia. A terminação da cadeia pelos diastereómeros de

4-fluoroglutamato demonstra a rigorosa especificidade para o L-glutamato no sítio receptor de T-glutamilo.

FgGlu ê um potente inibidor de poli-(T-glutamilação) de 3 pendente da concentração, utilizando como substractos [ H] Glu e ou metotrexatos, (4-Nh₂-10-Chg PteGlu) ou tetra-hidrofolatos.

A requerente verificou que F₂Glu ^actua· como um substracto alternativo mas, em contraste com o substracto alternativo previamente caracterizado, 4-fluoroglutamato (McGuire e Coward, J. Biol. Chem. 260 (1985) 6747), este não origina a terminação do prolongamento da cadeia do poliglutamato. Em vez disso, F₂G1u promove o prolongamento da cadeia. Deste modo, a síntese de pro dutos a partir de [ H]metotrexato contendo l e 2 resíduos amino ácidos adicionais ocorre numa proporção substancialmente mais elevada na presença de F₂G1u em comparação com reacções idênti. cas na presença de Glu: este-facto torna-se mais pronunciado pa ra o produto que contém dois resíduos adicionais. A proporção

crescente de adição não é uma função exclusiva da ligação de FgGlu a Glu interna ou a FgGlu previamente incorporado, uma vez que a ligação de Glu a 4-NH₂-10-CHgPtGlu-^-(3,3-difluoroglutama to) também se encontra aumentada. Estes resultados são consistentes com a intensificação da síntese de metabolitos de poli- (^-glutamato) efectuada por FgGlu ao nível quer dos aminoãcidos que entram (análogo de glutamato) quer das espécies de receptores de ^-glutamilo. Deste modo, FgGlu é o primeiro análogo de glutamato que intensifica o prolongamento da cadeia cata iisado pela folilpoliglutamato-sintetase.

SUMÃRIO DA PRESENTE INVENÇÃO

Utiliza-se o composto 3,3-difluoroglutamato (FgGlu) para se preparar conjugados com determinados folatos e anti-folatos de fórmula

co₂H na qual Rg representa um átomo de hidrogénio ou um grupo -NHg ou -CHg;

R₂ representa um grupo -NH₂ ou -OH?

R^ representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo C^-C^, alilo.ou propargilo; e

X, Y e Z representam, cada um, independentemente, um ãto. mo de azoto ou um grupo CH?

e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Os conjugados da estrutura 1, são utilizáveis no tratamento de tumores e de psoriase. Para além disto, utiliza-se o composto F₂Glu e determina dos compostos PABA-F₂G'lu como compostos intermédios na preparação de compostos de fórmula geral 1.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA PRESENTE INVENÇÃO

A porção difluoro-glutamato dos compostos da presente invenção possui um centro aquirálico e como tal os compostos da presente invenção existem sob a forma de pares de isómeros este reoquímicos. Embora se dê preferência ao enantiómero, que corres ponde à configuração natural do ãcido glutâmico, a Requerente considera no âmbito da presente invenção os isómeros individuais e as misturas de isómeros· individuais, incluindo as misturas racémicas. Salvo indicação em contrário, os compostos da presente invenção são misturas dos dois estereoisõmeros.

Para além disto, os compostos de fórmula geral 1 na qual o símbolo Z representa um grupo CH e R^ não representa um átomo de hidrogénio possuem um segundo sítio aquirálico. A con-5>#* figuração estereoquímica em redor deste segundo sítio aquiráli co não é crítica e a Requerente considera também que os isómeros separados e as suas misturas se encontram incluídos no âmbito da presente invenção. Dá-se preferência a uma mi-stura racémica de isómeros no que respeita a este segundo sítio aquirá lico.

Os compostos de formula geral 1 contêm dois radicais de ácido carboxilico e podem formar sais mono ou dibásicos. A títu lo de exemplo estes sais incluem os sais de metais alcalinos, como, por exemplo, os sais de sódio e de potássio; os sais de metais alcalino-terrosos, tais como os sais de cálcio e de magnésio; os sais de metais leves do Grupo IIIA, incluindo o alu mínio; e os sais de aminas orgânicas primárias, secundárias e terciárias, tal como, por exemplo, trialquilaminas, incluindo trietilamina, procaína, dibenzilamina, 1-etanamina, Ν,Ν'-dibenziletilenodiamina, di-hidroabietilamina, N-alquil(inferior)-pipe ridina, e outras aminas adequadas. Dã-se preferência aos sais de sódio.

Os compostos de fórmula geral 1 também podem formar sais aceitáveis por adição de ácido com qualquer ácido não tóxico, or ganico ou inorgânico. Exemplos de ácidos inorgânicos que formam sais adequados incluem o ácido clorídrico, o ácido bromídrico, oácido sulfúrico e o ãcicfo fosfórico e sais metálicos de ácidos, tais como o mono-hidrogéno-ortofesfato de sódio e o hidrcgeno-su.1 fato de potássio. Exemplos de ácidos orgânicos que formam sais adequados incluem os ácidos mono, di e tricarboxílicos. Exemplos de tais ácidos são, por exemplo, o ácido acético, glicõlico, lá-

ctico, pirúvico, malónico, succínico, glutárico, fumárico, mãlico, tartárico, cítrico, ascórbico, maleico, hidroximaleico, benzóico, hidroxibenzóico, fenilacético, cinâmico, salicílico, ácido 2-fenoxibenzõico e os ácidos sulfónicos tais como o ácido metano-sulfónico e o ácido 2-hidroxietano-sulfónico. Dá-se preferência aos cloridratos.

Podem preparar-se os compostos de fórmula geral 1 protegendo a remoção do grupo do produto de reacção do folato ou do derivado de anti-folato de fórmula geral

(2) na qual , R₂ e R3, X, Y e Z têm os significados defi nidos antes para os compostos de fórmula geral 1 com um derivado adequadamente protegido, de F₂Glu, tal como o derivado de éster t-butilico de fórmula 3 ,F₂glu(OHBu₂)

C{O)OtBu

I

H_ONCH ² I

CF (3)

I ²

CH_n

C{O)OtBu

s acoplamento do composto de fórmula geral 2 e do der_i vado F₂Glu protegido de fórmula geral 3, pode ser efectuado de acordo com qualquer método adequado para a preparação de uma amida a partir de uma amina e de um ãcido carboxilico. A Reque rente acoplou o composto de fórmula geral 2 e o composto de fõr mula geral 3 utilizando fosforocianioato de dietilo ((E£O^F(=0)CN). Efectua-se esta reacção adicionando (adição lenta e gota a gota) uma solução de um composto de fórmula geral 2 adequado a uma solução de ((EtO)₂P(=0)CN) e um e um agente de fixação de ãcido, tal como a piridina ou de preferência trietilamina. Deixa-se reagir a mistura resultante a uma temperatura compreendida entre cerca de 0°C e cerca de 60°C, de prefereência ã temperatura ambiente, durante um período compreendido entre cerca de 1 hora e cerca de 10 horas, de preferência entre cerca de 2 horas e cer ca de 5 horas, até que o composto de fórmula geral 2 tenha reag_i do substancialmente com o fosforocianidato. Depois adiciona-se a esta mistura uma solução de F₂Glu(OtBu)₂ e deixa-se prosseguir a reacção durante um período compreendido entre cerca de 24 horas e cerca de 100 horas, geralmente entre cerca de 72 horas, a uma temperatura compreendida entre cerca de 0°C e cerca de 60°C, de preferência à temperatura ambiente. Isola-se o produto bruto, por exemplo, por evaporação do dissolvente, lava-se com água e seca-se. Depois, trata-se o produto bruto com ãcido trifluoroacético (puro) para se remover os grupos protectores de éster t-butílico. Isola-se o composto de fórmula geral 1 desejado e pu rifica-se, por exemplo, por cromatografia em coluna. Os dissolventes adequados, para a reacção de ligação anteriormente descrita, incluem dissolvente no qual os diversos reagentes sejam solúveis e que não interfiram com a reacção, tais como o dímetil

formamida (DMF), a que se dá preferência.

Podem preparar-se os compostos de fórmula geral :1:na qual Z representa um átomo de azoto, por um procedimento alter nativo fazendo reagir um derivado do ãcido p>-aminobenzõico (PA BA) de fórmula geral

co₂h (4) na qual R^ tem o significado atribuído antes para os compostos de fórmula geral 1, com um composto de fórmu la geral 3, F₂Glu(OtBu)₂ para se obter o composto inter médio de fórmula

C(O)OtBu

CH₂

C(O)OtBu

Pode efectuar-se este acoplamento de acordo com qualquer dos métodos adequados, tal como de acordo com os procedimentos descritos em McGuire, e outros, Câncer Research (1989) , 49, 4517-4525; Galican e outros, Proc. Natl. Acad. Sei., USA,

1985, 82, 2598-2602; Piper e Montgomery, J. Org. Chem., 42(2)

Ζ’

208-211 (1977); Taylor, e outros, J. Med. Chem. 28, 913-921 (1985); Taylor, e outros, J. Med. Chem. 28, 1517-1522 (1985); Jones, e outros, J. Med. Chem. 32, 847-852 (1989) .

Em seguida, condensa-se o composto intermédio de fórmu la 5 com o derivado bromometilo de fórmula geral

na qual R^, R₂ , X e Y têm os significados definidos anteriormente para os compostos de fórmula geral 1, para se obterem os compostos protegidos por t-butoxi, os quais após hidrólise para remover os grupos protectores p-butoxi, por exemplo, com ácido trifluoroacético, dão os compostos desejados de fórmula geral 1. Pode efectuar-se esta reacção deixando reagir a mistura dos compostos de fórmula 5 e 6 e dimetilacetamida (Me₂NAC) durante cerca de 2 a 12 horas, de preferência durante aproximadamente 4 horas, a uma temperatura compreendida entre cerca de 25°C e cerca de 80°C, de preferência compreendida entre 50° e 55°C e deixando depois a mistura reaccional em repouso à temperatura ambiente durante um intervalo de tempo compreendido entre aproximadamente 6 horas e aproximadamente 24 horas, de pre

ferência durante aproximadamente 12 horas. Remove-se depois Me₂NAC sob condições de pressão reduzida e coloca-se o produto bruto num banho de gelo e trata-se com ãcido trifluoroacético, deixando a mistura aquecer até à temperatura ambiente após a adição se encontrar completa. Após um repouso durante um inter valo de tempo compreendido entre cerca de 1 e cerca de 6 horas, usualmente durante aproximadamente 4 horas, remove-se o TFA sob condições de pressão reduzida, para se obter o produto bruto de sejado de fórmula geral 1. Pode purificar-se este produto por exemplo por cromatografia (DEAE-celulose com um gradiente de NH^HCO^). Esta reacção de condensação encontra-se descrita de um modo mais completo nas referências mencionadas no parágrafo precedente.

A selecção e utilização de grupos de bloqueio especiais são do conhecimento do especialista. Geralmente escolher-se-ão os grupos de bloqueio que protejam de um modo adequado os grupos amino ou hidroxi em questão durante os subsequentes passos de síntese e que sejam facilmente removíveis sob condições que nao originem a degradação do produto desejado. Constituem exemplos de grupos protectores do radical hidroxi adequados os gru pos alquilo C-^-C^, tetra-hidropiranilo, metoximetilo, metoxieto xi-metilo, t-butilo, benzoílo e trifenilmetilo. A designação alquilo C_n-C_r refere-se a um radical hidrocarbilo saturado com 1 a 6 átomos de carbono de cadeia linear ou ramificada ou de configuração cíclica. Pode formar-se o derivado benzoilado fazendo rea gir o composto não bloqueado com cloreto de benzoílo na presença de piridina. São exemplos de grupos protectores amino adequados benzoílo, formilo, acetilo, trifluoroacetilo, ftalilo, tosilo,

-fi* benzeno-sulfonilo, benziloxicarbonilo, benziloxicarbonilo subsi tituido (por exemplo, derivados jo-cloro, £-bromo, £-nitro, £-me toxi, o-cloro, 2,4-dicloro e 2,6-dicloro), t-butiloxicarbonilo (Boc), t-amiloxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, 2-(£-bifenil)-isopropiloxicarbonilo, aliloxicarbonilo, ciclopentiloxicarboni_ lo, ciclo-hexiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo, feniltiocar_ bonilo e trifenilmetil. Os compostos amino-protegidos preferidos incluem os derivados de benzóílo, preparado mediante reacção do grupo não bloqueado com cloreto de benzóílo e o derivado acetilo obtido fazendo reagir o composto não bloqueado com anidrido acético.

A presente invenção proporciona um método para tratar um paciente que sofra de uma doença neoplásica, que consiste em administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz e anti-neoplásica de um composto de fórmula geral 1. Ao administrar-se a um paciente que sofra de uma doença neoplásica uma quantidade terapeuticamente eficaz e anti-neoplásica de um composto de fórmula geral 1 proporciona-se um efeito anti-neoplásico. 0 termo paciente refere-se a um animal de sangue quente, tal como os primatas, incluindo seres humanos, cabras, cavalos, gado bovino, porcos, cães, gatos ratazanas e ratos.

A designação doença neoplásica, tal como se utiliza na presente invenção refere-se a um estado ou situação anormal cara cterizado pela rápida proliferação do crescimento celular ou neo plasma. Com base em técnicas experimentais laboratoriais normalizadas e em procedimentos bem conhecidos pelos especialistas, assim como em comparações com compostos de utilidade conhecida,

4l2os compostos de fórmula geral 1 são utilizáveis no tratamento de pacientes que sofram de doenças neoplásicas que geralmente são ou podem ser tratadas com folatos e anti-folatos, tais como o metotrexatro, a aminopterina, 5,10-didesazafolato e leucovorina. Estas doenças neoplásicas incluem: leucemias, incluindo mas não se limitando a, doenças linfoblásticas agudas, doenças linfocíticas crónicas, doenças mieloblãsticas agudas e doenças mielocíticas crónicas, carcinomas incluindo, mas não se limitan do aos carcinomas da cerviz do esófago, do estômago, do intesti, no delgado, do cólon e dos pulmões; sarcomas, incluindo mas não se limitando a osteroma, osteossarcoma, lipoma, lipossarcoma, hemangioma e hemangiossarcoma; melanomas, incluindo tumores ame lanóticos e melanóticos; e tipos mistos de neoplasias, tais como, por exemplo, carcinossarcoma. Os de tipotde tecido linfóide, o rectículo folicular, o sarcoma celular e a doença de Hodgkins É evidente que o especialista reconhecerá que nem todos os compostos de fórmula geral 1 são eficazes em relação a todos os es tados de doenças neoplásicas e que a selecção do composto mais adequado é da responsabilidade do especialista e dependerá/ de diversos factores, incluindo a verificação dos resultados obtidos em modelos normalizados de animais com tumores. Geralmente, os compostos de fórmula geral. 1 são utilizáveis no tratamento das doenças neoplásicas, usualmente tratadas com folatos e anti -folatos. Espera-se que os compostos da presente invenção sejam mais potentes e mais selectivos do que os folatos e anti-folatos não conjugados. Pensa-se que a potência adicional dos compostos da presente invenção resulte da tendência dos compostos para promoverem o prolongamento da cadeia glutamilo e causarem, deste modo, a acumulação de folato tóxico e de anti-folato no

interior das células.

A designação efeito anti-neoplásico e a expressão tra tar uma doença neoplásica referem-se a um efeito de controlo do crescimento ou proliferação do neoplasma ou ao prolongamento do tempo de vida do paciente para além do esperado, na ausência desse tratamento. Considera-se que se controla o crescimento ou proliferação de um neoplasma quando se diminui, interrompe, se torna mais lenta ou se pára completamente o seu crescimento, pro liferação ou as suas metástases. A expressão tratar uma doença neoplásica não indica, por isso, necessariamente uma total eliminação da doença neoplásica. Pensa-se que, prolongando a sobrevivência do paciente, para além de constituir um efeito vantajoso significativo, também indica que o crescimento da doença neoplãsica se encontra controlado. .

Quando se efectua o tratamento de um paciente que sofre de uma doença neoplásica, tal como as anteriormente descritas, pode administrar-se um composto de fórmula geral 1 de qualquer uma das formas ou modos que tornem o composto bio-utilizável, em quantidades anti-neoplãsicas, terapeuticamente eficazes, incluin do as vias orais e parenterais. Por exemplo, podem administrar-se os compostos de fórmula geral 1 por via oral, tópica, subcutânea, intramuscular, intravenosa, transdérmica, intranasal, rectal e si milares. Dá-se preferência ã administração oral, o especialista seleccionará facilmente a forma e o modo adequado para administração, dependendo de características especiais do composto seleccionado para o estado do paciente a ser tratado, a fase da do ença e outras circunstâncias relevantes.

4Tal como se utiliza, na presente invenção, a designação quantidade anti-neoplãsica terapeuticamente eficaz refere-se a uma quantidade do composto de fórmula geral 1 que seja eficaz e proporcione um efeito anti-neoplásico. Uma quantidade anti-neoplãsica terapeuticamente eficaz pode ser facilmente de terminada pelo médico assistente, bem como por um especialista na matéria utilizando técnicas conhecidas e observando os resul tados obtidos sob circunstâncias análogas. Para determinar a quantidade anti-neoplãsica terapeuticamente eficaz, o médico assistente deverá considerar diversos factores, incluindo, mas não se limitando a: a espécie de mamíferos? o seu tamanho; ida de; estado geral de saúde; a doença específica envolvida; o grau ou envolvimento ou a gravidade da doença; a resposta individual do paciente; o composto particular a ser administrado; o modo de administração; as característieas de bio-utilização da prepara ção administrada; o regime de dose seleccionado; a utilização de medicação concomitante; e outras circunstâncias relevantes.

Considera-se que uma quantidade anti-neoplãsica terapeu ticamente eficaz de um composto de fórmula geral 1 estã compreen dida entre cerca de 0,1 mg por Kg do peso do corpo por dia (mg/ Kg/dia) e cerca de 500 mg/Kg/dia. Espera-se que as quantidades preferidas estejam compreendidas entre cerca de 1 e cerca de 20 mg/Kg/dia. Estes intervalos representam particularmente as quan tidades eficazes após administração oral, mas também correspondem aos intervalos funcionais para administração parenteral. Admi nistrar-se-ão de preferência uma a quatro doses diárias são usualmente com 5 a 100 mg do composto activo por dose.

Também se utilizou metotrexato e outros agentes folatos e anti-folatos no tratamento da psoríase, uma doença cara, cterizada por um acréscimo da velocidade de proliferação de cê lulas da epiderme. Espera-se que os compostos de fórmula geral 1, devido ao facto de funcionarem de acordo com os mesmos meca nismos subjacentes, sejam novos agentes valiosos no tratamento da psoríase. A dosagem anti-psoríase é idêntica à dosagem anti -neoplãsica, exceptuando o facto de que quando se utilizam com postos de fórmula geral 1 no tratamento da psoríase se dã preferência ã aplicação tópica.

Podem administrar-se os compostos separadamente ou na forma de composições farmacêuticas, em associação com veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, cuja proporção e natureza é determinada pela solubilidade e propriedades químicas do composto seleccionado, via de administração escolhida e a prática farmacêutica normalizada. Os compostos de fórmula ge ral 1, embora sejam por si próprios eficazes, podem formular-se e administrar-se sob a forma dos seus sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis, por uma questão de estabilidade, conveniência de cristalização, maior solubilidade e similares.

Podem proporcionar-se os compostos de fórmula geral 1 em composições que englobam uma quantidade analisãvel de um composto de fórmula geral 1 misturada com um ou mais veículos inertes. Estas composiçSes são utilizáveis, por exemplo, como padrões de ensaio, como meios convenientes para se efectuarem cargas volumosas, ou como composições farmacêuticas. Uma quant_i dade analisãvel de um composto de fórmula geral 1 é uma quanti/ísdade que é facilmente mensurável de acordo com procedimentos normalizados de ensaio e técnicas que são do conhecimento do especialista.

As quantidades analisáveis de um composto de fórmula ge ral 1 estão geralmente compreendidas entre cerca de 0,001% e cerca de 75% da composição, em peso. Os veículos inertes podem ser quaisquer materiais que não degradem ou reajam covalentemen te com um composto de fórmula geral 1. São exemplos de veículos inertes adequados a água; tampões aquosos, tais como os que são geralmente utilizados na Cromatografia Líquida de Alta Resolução (HPLC); dissolventes orgânicos, tais como o acetonitrilo, o acetato de etilo, o hexano e similares; e veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Preparam-se estas composições misturando o composto de fórmula geral 1 com os veículos inertes utilizando técnicas e métodos bem conhecidos do especialista.

Particularizando., podem proporcionar-se compostos de fórmula geral 1 em composições farmacêuticas que contêm uma quan tidade anti-neoplásica terapeuticamente eficaz de um composto de fórmula geral 1 misturada ou em associação com um ou mais veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

Preparam-se as composições farmacêuticas de .acordo com mé todos bem conhecidos na especialidade farmacêutica. O veículo ou excipiente pode ser um material sólido, semi-sólido ou líquido que pode servir como veículo ou meio para o ingrediente activo. Os veículos ou excipientes adequados são bem conhecidos na especialidade. Pode adaptar-se a composição farmacêutica para admini

tração oral ou parenteral ao paciente sob a forma de comprimidos, cápsulas, supositórios, soluções, suspensões ou similares.

Podem administrar-se oralmente os compostos de fórmula geral 1, por exemplo, com um diluente inerte ou com um veículo edivel. Podem ser introduzidos em cápsulas de gelatina ou apresentar-se sob a forma de comprimidos. Para administração terapeu tica oral, os compostos podem ser incorporados em excipientes e utilizados sob a forma de comprimidos, rebuçados, cápsulas, elá. xires, suspensões, xaropes, hóstia, pastilha elástica e similares. Estas composições deverão conter pelo menos 4% do composto da presente invenção, o ingrediente activo, mas esta quantidade pode ser variável, dependendo da forma em especial e pode estar compreendida, vantajosamente, entre 4% e cerca de 70% do peso da unidade. A quantidade do composto presente em composições será indicada de modo a obter-se a dosagem adequada. Preparam-se as composições e as preparações preferenciais de acordo com a pre sente invenção, de tal modo que uma forma unitária de dosagem oral contenha 5,0 a 300 miligramas de um composto da presente in venção.

Os comprimidos, as pílulas, as cápsulas, os rebuçados e similares também podem conter um ou mais dos seguintes adjuvan tes: ligantes, tais como celulose microcristalina, goma alcantira ou gelatina; excipientes, tais como amido ou lactose, agentes de desintegração, tais como ácido algínico, Primogel, amido de milho e similares; lubrificantes, tais como estearato de magnésio ou Sterotex; deslizantes, tais como dióxido de sílicio co loidal; podem adicionar-se edulcorantes, tais como sacarose ou sa

-Ζ8/ carina, ou um agente aromatizante, tal como hortelã pimenta, salicilato de metilo ou essência de laranja. Quando a forma de dosagem unitária é uma cápsula, esta pode conter, para além dos materiais do tipo anterior, um veículo líquido, tal como polietilenoglicol ou um óleo gordo. Outras formas de dosagem unitã ria podem conter vários outros materiais que modifiquem a forma física da unidade de dosagem, por exemplo, como revestimen tos. Assim, os comprimidos ou pílulas podem encontrar-se reves_ tidos por açúcar, goma-laca ou outros agentes de revestimento entérico. Um xarope pode conter, além dos compostos da presente invenção, sacarose como agente edulcorante e determinados conservantes, corantes e agentes de coloração e aromatizantes.

Os materiais utilizados na preparação destas diversas composições deverão ser farmaceuticamente puros e não tóxicos nas quantidades utilizadas. Quando se pretende uma composição para administração terapêutica parenteral, podem incorporar-se os compostos de fórmula geral 1 numa solução ou suspensão. Estas preparações deverão conter, pelo menos, 0,1% de um composto de fórmula geral 1. No entanto, esta quantidade pode variar en tre 0,1 e aproximadamente 50% do respectivo peso. A quantidade do>composto presente em tais composições deverá ser de tal ordem que se obtenha uma dosagem adequada. As composições e preparações preferidas de acordo com a presente invenção preparam-se de modo a que uma unidade de dosagem parenteral contenha 5,0 a 100 miligramas do composto da presente invenção.

As soluções ou suspensões também podem incluir um ou mais dos seguintes adjuvantes: diluentes esterilizados, tais co /

·' ,-19mo ãgua para injecção, solução salina, óleos de fixação, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros dissolven tes sintéticos; agentes antibacterianos, tais como ãlcool benzílico ou metil-parabeno; anti-oxidantes, tais como o ãcido as^ cõrbico ou o bissulfito de sódio; agentes quelantes, tais como o ãcido etilenodiaminotetraacêtico; tampões, tais como acetatos, citratos ou fosfatos, e agentes para o ajustamento de tonicidade, tais como cloreto de sódio ou dextrose. A preparação paren teral pode ser introduzida em ampolas, seringas descartáveis ou em ampolas de doses múltiplas feitas de vidro ou de plástico.

Tal como acontece com qualquer grupo de compostos estruturalmente relacionados, que possuem uma utilidade específica genérica, dã-se preferência a determinados grupos e configurações para os compostos de fórmula geral 1 na sua aplicação final

A Requerente prefere os compostos nos quais R^ e R₂ representam cada um, um grupo -NHg, X, Y e Z representam, cada um, um ãtomo de azoto e Rg representa um grupo metilo. A Requerente prefere também os compostos nos quais o radical R^ representa um grupo -NHg, o radical Rg representa um grupo OH, o radical Rg representa um átomo de hidrogénio e os símbolos X e Z representem cada um deles um grupo -CH e o símbolo Y representa um ãtomo de azoto.

Z *-20EXEMPLO 1

Ãcido N-[4- ( [ (2,4-diamino-6-pteridinil-metil]-metilamino)-benzoil]-4,4-D-fluoroglutâmico

Agitou-se uma mistura de N-CHgPABA-FgGlu(OBu)₂ (0,201 mmole) e de bromidrato de 2,4-diaminopteridina-6-bromometilo (75 mg, 0,223 mmole) em MegNAc (2,5 ml) a uma temperatura com preendida entre 50° e 55° C durante 4 horas e, depois, deixou -se em repouso à temperatura ambiente durante a noite. Depois removeu-se Me₂NAc sob pressão reduzida. Colocou-se o produto bruto num banho de gelo e adicionou-se, com agitação, 2 ml de ácido trifluoroacético. Decorridos 10 minutos deixou-se a mis tura reaccional aquecer até à temperatura ambiente e, depois, agitou-se durante 4 horas. Removeu-se o ácido trifluoroacético sob pressão reduzida, obtendo-se o produto bruto. Purificou-se o produto bruto por cromatografia sobre DEAE-celulose com um gradiente de NH^HCOg (15-600 mM) . A liofilização do efluente da coluna que continha o produto desejado deu o produto puro pretendido.

EXEMPLO 2

Ãcido 4-amino-4-desoxi-10-metilpteroil[D,L-eritro,treo-4,4- (difluoro)-glutamico] (l.R₁. Rg =NH₂: X, Y, Z=N: Rg=CH )_

Num balão de fundo chato de 15 ml equipado com um tubo de secagem colocou-se 2,5 ml de DMF, 23 jil de Et^N (0,16 mmole) e 25 jjí (0,16 mmole) de fosforocianidato de dietilo. Depois adi

’ — - -—««Λ*¹ cionou-se ο diaminopteroato (1,R^, R₂=NH₂; X, Y, Z=N; R^CH^) (0,16 mmole) e agitou-se a solução reaccional à temperatura ambiente. Decorridas 3 horas adicionou-se mais 5 yml (0,04 mmole) de fosforocianidato de dietilo. Dissolveu-se F₂Glu (0,16 mmole) em 1 ml de dimetilformamida e adicionou-se ao balão de reacção e continuou a agitar-se durante 72 horas ã temperatura ambiente. Removeu-se o dissolvente DMF sob vazio, dissolveu -se o resíduo em 35 ml de CHCl^ e lavou-se com NH^OH a 1% (2 x 20 ml) para se remover o composto inicial que não reagiu. Lavou -se a camada orgânica com 20 ml de água e depois secou-se sobre Na^O^ e evaporou-se sob vazio, para se obter o produto bruto bloqueado. Dissolveu-se este produto acoplado em TFA puro (3 ml) e seguiu-se por TLC o progresso da reacção de desesterificação. Decorridas 24 horas, removeu-se o dissolvente TFA por eva poração rotativa e secou-se o resíduo sob vazio.

Dissolveu-se o produto bruto em 20 ml de ãgua, ajustou-se o pH para 8 com NH^OH diluído e ajustou-se o volume da amos tra para 160 ml, de modo a obter uma condutância suficientemente baixa antes de se carregar numa coluna (30 x 1 C’.m) de DEAE-celulose (Whatman DE-52). Lavou-se a coluna com 100 ml de ãgua e eluiu-se o composto desejado de fórmula geral 1, a partir da co luna com um gradiente linear formado a partir de 175 ml de NH₄HCO₃ 15 mM e de 175 ml de NH₄HCO₃ 500 mM.

EXEMPLO 3

Éster bis-L-butilico de ácido , jp-difluoroglutâmico

3a) 2,2-difluoropent-4-enamida

A uma solução agitada de ácido 2,2-dif luoropent-4-enó_i co (27,2 g, 0,2 mole) em hexano (200 ml), num balão de três tu buladoras, equipado com um condensador de refluxo e com um ori fício de admissão de azoto, adicionou-se dimetilformamida (20 gotas, catalítico) e cloreto de oxalilo (20 ml, 0,23 mole). Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 2 horas, a_l tura em que já não se verificava qualquer libertação de gãs. Arrefeceu-se a solução num banho de gelo/solução saturada de cloreto de sódio, substituiu-se o orifício de N₂ por um tubo cheio de CaCl₂ (para evitar que qualquer material sólido se es_ cape do balão) e fez-se passar um fluxo de gãs NH^ através do balão. 0 fluxo de gãs conservou-se durante 30 minutos após ter diminuído a vigorosa, reacção inicial. Depois verteu-se a mistu ra em H₂O (1 litro) e Et₂O (0,5 litro). Lavou-se o recipiente de vidro com H₂O e Et₂O e adicionaram-se as lavagens à mistura. Adicionou-se celite e removeu-se o material insolúvel, por fil tração. Separaram-se as fases. Lavou-se a fase Et₂O uma vez com solução saturada de cloreto de sódio, secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se. Extraiu-se a fase aquosa, duas vezes, com CH₂C1₂. Lavaram-se uma vez os extratos reunidos com solução saturada de cloreto de sódio. Secaram-se sobre Na₂SO^, reu niram-se aos resíduos da fase éterea e concentrou-se. Destilou -se o resíduo, para se obter a amida em epígrafe (20,6 g, 76%),

Λ²³p.b.: 100°-110°C/10 Torr, sob a forma de um óleo levemente ama relado, que solidificou por arrefecimento, e apresentou um pon to de fusão de 33°-35°C. RMN ^XH (CDC1₃) ó 7,0-6,0 (2H, d largo), 5,75 (1H, ddt, J = 18,9, 6 Hz), 5,3 (2H, m), 2,87 (2H, dt, J = = 6,17 Hz) . RMN. ^X?F (<5 C_rF_r = 0) £ - 56,0 (t, J = 17 Hz).

Ό O

Anãl. Calcd. para C^H^NO: C, 44,45; H, 5,22; N, 10,37.

Encontrado: C, 42,03; H, 4,74; N, 9,33.

3b) 2,2-difluoropent-4-enonitrilo

A uma solução da amida anterior (3a) (20,6 g, 0,152 mole) em piridina seca (25 ml, 0,31 mole) com arrefecimento com N₂ num banho de gelo/solução saturada de cloreto de sódio, adicionou-se, gota a gota, durante 90 minutos, anidrido trifluoroacético (TFAA,

23,5 ml, 0,166 mole). A mistura reaccional tornou-se sólida e deixou-se em repouso à temperatura ambiente durante 4 horas. Depois equipou-se o balão para destilação sob atmosfera de azoto e aqueceu-se num banho de óleo (temperatura final de 130°C). Recolheu-se o destilado, obtendo-se 17,7 g de um óleo incolor fumegante p.p.j_ 70°-80°C/760 Torr. A anãlise por RMN indicou que a composição do destilado consistia em nitrilo: TFAA: piridina nu ma relação de 80:12:8. Assim,, a produção de nitrilo foi de 0,116 mole (76%). RMN ¹H (CDC13) 6,0-5,5 (1H, m), 5,4 (2H, m), 2,93 (2H, dt, J = 6,15 Hz). RMN ¹⁹F (h CgFg = 0) & - 71,7 (t, J = 15

Hz) .

3c)

Cloridrato de 4-4-difluoroocta-1,6-dien-5-ilamina

Preparou-se brometo de propenil-magnésio, mediante adjL ção de uma solução de brometo de 1-propenilo (27,22 g, 0,225 mo le) em THF (225 ml) aaparas. de magnésio (5,47 g, 0,225 mole), com uma velocidade tal que mantivesse a mistura quente mas não em ebulição. Terminada a adição, agitou-se a mistura durante 20 minutos e depois diluiu-se com THF (300 ml) e arrefeceu-se até ã temperatura de -15°C. Adicionou-se a esta mistura uma solução do nitrilo (0,116 mmole), preparada no Exemplo 3b, em THF (80 ml) com uma velocidade tal que a temperatura da mistura reaccional permanessece dentro do intervalo -15°0·<Τ -10°C. Agitou-se a mistura durante mais 1 hora neste intervalo de temperatura e de pois arrefeceu-se até à temperatura de -40°C. Adicionou-se de uma só vez uma solução arrefecida (-40°C) de NaBH^ (6,4 g, 0,169 mole) em MeOH (650 ml) e água (30 ml). Removeu-se o banho de arre fecimento, agitou-se a mistura durante 2 horas e depois verteu-se em HC1 6 N (800 ml). Removeram-se os dissolventes orgânicos por evaporação rotativa e lavou-se duas vezes a solução aquosa CH₂C1₂. Depois alcalinizou-se a solução até pH 10, com grãos de NaOH (arrefecendo com gelo, se necessário) e saturou-se com NaCl. Adicionou-se celite e removeu-se, por filtração, o Mg(OH)₂ precipitado. Lavou-se o resíduo sólido com CH₂C1₂. Extraiu-se o fil trado com CH₂C1₂ três vezes e secaram-se os extractos reunidos e os resíduos de lavagem sobre Na₂SO^, filtraram-se, acidificaram-se com Et₂O/HCl e evaporaram-se, para se obter o sal de amina em epígrafe, sob a forma de um sólido amarelo pálido (3 g). Não se purificou este produto neste passo.

3d)

N-(t-butiloxicarbonil)-4,4-difluoroocta-1,6-dien-5-ilamina

Dissolveu-se o sal-bruto anterior, do Exemplo 3c (35 g) em água (200 ml) e dioxano (200 ml). Adicionou-se KHCO^ sólido para se obter uma mistura neutra em papel de pH à qual se adicionou mais KHCOg (12 g, 0,12 mole) e dicarbonato de di-t-buti lo (34 g, 0,156 mole). Agitou-se a mistura à temperatura ambien te durante a noite e depois saturou-se com NaCl. Separaram-se as fases. Extraiu-se a fase aquosa com hexano (3 vezes) . Reuni ram-se os extractos às fases orgânicas e lavou-se com água (3 vezes). Extrairam-se as lavagens aquosas reunidas uma vez com hexano. Reuniu-se este extracto às fases orgânicas e depois la vou-se com solução saturada de cloreto de sódio, secou-se sobre Na₂SO^ e concentrou-se. Purificou-se o resíduo por cromatogra fia rápida (eluente CE^C^/pentano) a 1:1) para se obter o car bamato em epígrafe (19 g, 65%) , RF 0,29 sob a forma de um óleo que solidificou em repouso. RMN (CDC1₃) è 6,0-5,5 (2H, m) ;

5,5-4,5 (5H, m); 2,67 (2H, dt, J = 7,16 Hz); 1,73 (3H, dd*,

J = 7,1 Hz); 1,47 (9H, s) . RMN ¹⁹F í&CgFg = 0) 8 - 53,2 (m) .

3e) Cloridrato de ácido -difluoroglutâmico

A uma solução de KMnO^ (52,56 g, 0,33 mole) em água (1,2 litro) arrefecida em gelo adicionou-se uma solução de car bamato preparado no Exemplo 3d (10,95 g, 0,042 mole) em AcOH (160 ml). Agitou-se a mistura durante uma noite à temperatura ambiente, tempo durante o qual se precipitou um sólido castanho. Adicionou-se dissulfureto de sódio sólido para descolorar a mis

-26tura, seguido de ácido clorídrico concentrado para se obter uma solução com pH 2. Extraiu-se esta solução com Et₂O (3 x 500 ml) e depois saturou-se com NaCl e extraiu-se mais duas vezes com Et₂O. Lavaram-se as fracções orgânicas reunidas uma vez com solução saturada de cloreto de sódio es concentrou-se. Retcmou-se o resíduo com HC1 IN (500 ml) e concentrou-se. Retomou-se novamente o resíduo com HC1 1 N, agueceu-se a mistura e adicionou-se carvão activado. Agitou-se a mistura durante 10 minutos, filtrou-se e evaporou-se o filtrado atê ã secura. A extracção do resíduo com isopropanol deu o aminoácido bruto (2,22 g). Uma nova extracção do produto insolúvel em isopropanol com EtOH não deu qualquer produto útil. RMN ¹⁹F (D₂O: 5 CFgCC^H = 0) & + 23 (ddt, J = 280,

5, 21 Hz), + 27 (ddt, J - 280, 22, 9 Hz); + 28 (t); números inteiros relativos 5:5:3.

f) Éster bis-t-butllico de ácido ^,^-difluoroglutâmico

Fez-se uma suspensão do ácido bruto do Exemplo 3e (2,22 g) em acetato de t-butilo (500 ml) e adicionou-se a mistura HCIO^ (2,16 ml de uma solução aquosa a 70%, 25 mmoles). Agitou -se a mistura à temperatura ambiente durante 48 horas e depois extraiu-se com H₂0 (2 x 200 ml). Lavaram-se os extractos reunidos com CH₂C1₂ (2 x 100 ml) e depois alcalinizou-se até pH 10 (NaOH 4 N). Extraiu-se a solução com CH₂C1₂ (3 x 100 ml). Reuni ram-se os extractos e lavou-se com solução salina, secou-se sobre Na₂SO^ e concentrou-se atê um terço do seu volume. Pode uti. lizar-se esta solução no passo seguinte sem qualquer outro tratamento. Uma amostra que se evaporou de um modo mais completo indicou RMN H (CDClg) £ 4,10 (1H, t, J = 14 Hz), 3,10 (1H, t,

J = 15 Hz), 3,00 (1H, t, J = 15 Hz), 1,5 (18H, 2 s); RMN ¹⁹F ( 8 CgFg = 0) 8 - 58,7 (dt, J = 14,15 Hz).

EXEMPLO 4

Cloridrato de g,^-difluoroglutâmico

A uma solução do BOC-bis-éster do Exemplo 3 (300 mg, 0,76 mmoleL) em Et₂O seco (10 ml) adicionou-se Et₂O/HCl satura do (3 ml). Agitou-se a mistura à temperatura ambiente (com pro tecção do tubo de CaCl₂) durante 6 dias. Recolheu-se o precipi tado branco sólido e lavou-se com Et₂O. A análise por TLC e RMN indicou que a cisão dos ésteres não estava completa. Retomou-se o produto com HC1 IN (5 ml) e agitou-se â temperatura ambiente durante uma noite. A reacção ainda não estava completa. Adicio naram-se algumas gotas de HC1 concentrado e agitou-se a mistura durante 3 dias. Removeu-se a água sob vazio e secou-se o re síduo por evaporação azeotrópica com CaCL₄. A trituração com éter di-isopropílico (2 vezes) deu um pó levemente esverdeado, que se recolheu e secou sobre Ρ₂Ο^, obtendo-se o aminoácido em r 1 epígrafe (175 mg, 100%) . RMN H (D₂O) · Si^na-is obscurecidos pelo solvente. RMN ¹⁹F ( & CF₃CC>₂H=0) 8 + 23 (ddt, J = 280, 5,

Hz), + 27 (ddt, J = 280, 22, 9 Hz). EM (Cl, NH^) m/e 184 (MH+, 100%) , 140 (75%) , 120 (40%) , 102 (40%) . RF (HOAc/H₂O/

BuOH 1/1/3) 0,19.

Análise Cale, para C₅H_?F₂NO₄ .HC1: C, 27,35; H, 3,67; N, 6,38

Encontrado: C, 28,13; H, 3,58; N, 6,52.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1.- Método para o tratamento de uma doença neoplástica num paciente, caracterizado pelo facto de se administrar ao paciente uma quantidade eficaz, de preferência compreendida entre 0,1 e 500 mg/Kg de peso do corpo por dia, de um composto de fórmula geral

COtH

CÍOINHCH

I

CF·

CH;

CO;H na qual

R^ representa um ãtomo de hidrogénio, um grupo -NH₂ou -CH^;

representa um grupo -NH₂ ou -OH;

R^ representa um ãtomo de hidrogénio, um grupo al···-..-· : ------ quilo C^-C^, alilo ou propargilo; e X, Y e Z representam, cada um, independentemente, um ãtomo de azo, to ou um grupo CH;

ou de um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
2,- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se administrar um composto de fórmula geral I na qual R^ e R₂ representam, cada um, um grupo -NH₂, R^ representa um grupo metilo e X, Y e Z representam, cada um, um átomo de azoto.
3.- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se administrar um composto de fórmula geral I na qual R^ representa um grupo -NH₂, R₂ representa um gru

-30po -OH, representa um átomo de hidrogénio; e X e Z representam, cada um, um grupo CH, e Y representa um átomo de azoto.

Lisboa, 11 de Abril, de 1991 O Agente Oficial da Prcpdeciade Industrial (

-31RESUMO '

MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS NEOPLÂSTICAS COM CONJUGADOS DO ÃCIDO DIFLUOROGLUTÃMICO COM FOLATOS E ANTI-FOLATOS

A presente invenção refere-se a um método de tratamento de doenças neoplãsticas que consiste em administrar a um paciente 0,1 a 500 mg/Kg de peso do paciente por dia de um composto de fõr mula, geral po -OH, R^ representa um ãtomo de hidrogénio; e X e Z representam, cada um, um grupo CH, e Y representa um átomo de azoto.

Lisboa, 11 de Abril de 1991

O Açisnte Oficiai da Prcpdsdade industrial