PT96908A - Processo para a preparacao de produtos imunoprofilaticos que contem anticorpos contra o virus da raiva e de antigenes desse virus - Google Patents
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Descrição referente à patente de invenção de BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D-3550 Marburg, República Federal Alemã, ( inventores: Dr. Karlheinz Enssle, Dr. Joa-chim Hilfenhaus, Roland Kõhler, Dr. Roland Kurrle e Dr. Frie-drich-Rober Seilar, residentes na República Federal Alemã), para "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PRODUTOS IMUNOPROFILÃ-TICOS QUE CONTEM ANTICORPOS CONTRA 0 VlRUS DA RAIVA E DE ANTIGENES DESSE VlRUS". D E S C R I Ç Ã 0 0 presente pedido de patente refere-se a anticorpos monoclonais humanos contra o vírus da raiva e ao seu emprego em agentes de diagnóstico, profilaxia e terapia. Os anticorpos contra o epítopo definido através do anticorpo monoclo-nal humano TW-1 da glicoproteína de 67 kD do invólucro do vírus protegem melhor depois de várias infecções contra a eclosão de raiva do que os preparados de imunoglobulinas humanas correntes no comércio.
Na raiva estamos perante uma encefalomielite com evolução fatal que é causada pelo vírus da raiva da família * dos Rhabdoviridas. Poucos são os países desenvolvidos onde esta • doença constitui um grande problema, mas a Índia, após uma cui- N. 1
dadosa avaliação são atribuidas à raiva mais de 20000 mortes por ano. O contágio resulta normalmente através da dentada de um animal infectado (Canidae, Chiroptera). As primeiras células atacadas parecem ser as células musculares em volta do ponto de entrada. Apôs a entrada nos nervos periféricos o virus viaja do local da infecção através de transporte axoplasmático retrógra do até ao sistema nervoso central e à medula espinal. Feita a replicação virai no sistema nervoso central o vírus viaja dos nervos até diversos tecidos do corpo sensíveis, p. ex. até ãs glândulas salivares.
Condicionada pelo longo tempo de incubação, re lativamente a outras infecções virais, até ao aparecimento de sintomas específicos da raiva, cerca de 30 a 90 dias, é possível uma vacinação pôs-exposição. Até à reacção de uma imunização activa para se obter uma protecção rápida é recomendada pelo WHO juntamente com a imunização activa uma imunização passiva imediata com preparados de soro homólogos ou heterólogos.Nos paises subdesenvolvidos são utilizados principalmente preparados de soro de cavalo, o que coloca o sério problema de reac-ções anafilãticas.
Ao contrário de preparados policlonais, os anticorpos monoclonais oferecem a vantagem da especificidade está vel. Os anticorpos monoclonais humanos (ACMHU) evitam reacções imunológicas indesejadas do receptor contra anticorpos monoclonais heterólogos de origem merina e parecem ter um período de circulação no corpo mais prolongado. 0 vírus da raiva é encapsulado e de morfologia em forma de bala. O ARN de cadeia simples do vírus encontra-se associado com uma proteína nuclear de 55 kD ã molécula "large transcriptase" de 190 kD e ã proteína não estrutural de 38 kD. 0 invólucro do vírus contém uma proteína matriz de 26 kD e uma glicoproteína 67 kD. Esta glicoproteína constitui um importante ponto de ligação para os anticorpos que neutralizam o vírus (D. • L. Lodmell, J. Virol·., 61, 10: 3314-3318, 1987). Para o mecanis 2
mo de neutralização supõe-se uma inibição intraendossomai, i.e., impede-se um "uncoating" do virus. Dietzschold et al. (Virolo-gy, 161: 29-36, (1987)) descrevem a neutralização de vírus da raiva através de ACMs de murinos contra a proteína de 67 kD. Enquanto que uma técnica estabelecida desde há longo tempo (B. Kohler e C. Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975) permite de uma forma relativamente simples lançar anticorpos monoclonais de murinos contra determinados antigenes como a glicoproteína do vírus da raiva (D.L. Lodmell, a.a.O.), é muito difícil obterem-se anticorpos monoclonais humanos para emprego terapêutico. Até agora não se sabia se tais anticorpos monoclonais humanos não se ligavam apenas à glicoproteína, mas se neutralizavam vírus da raiva infecciosos e se poderiam proporcionar protecção in vivo antes do aparecimento da doença.
Para a obtenção dos anticorpos monoclonais humanos TW-1 contra o vírus da raiva aqui descritos foram incubados linfõcitos de sangue periféricos humanos de um dador seropo sitivo saudável com vírus de Epstein-Barr (EBV). Os linfõcitos B tranzformados pelo EBV que suportam o crescimento foram experimentados por ELISA sobre anticorpos específicos de raiva. As linhas produtoras específicas de cálulas B foram fundidas para estabilização da produção de anticorpos com uma linha de células de mieloma de rato SP2/0. Os hibridomas obtidos formam clo-nados por várias vezes e ensaiados para a verificação da produção específica de anticorpos da classe IgG. 0 processo foi modificado a partir de um método conhecido (D. Kozbor & J.C. Ro-der, Immunol. Today, 4:72-79, 1983) e foi levada a cabo tal como se descreveu noutro lugar (J. Hilfenhaus et al., Behring Inst. Mitt., 80:31-41, 1986). A selecção de células produtoras de anticorpos realizou-se através de ensaios do sobrenadante da cultura por ELISA em material de revestimento contendo vírus da raiva. O método de ELISA utilizado é melhor explicado no Exemplo 1.
Verificou-se que os anticorpos monoclonais hu-
* manos contra vírus da raiva TW-1 aqui descritos no ensaio ELISA • só reagiram especificamente contra material de revestimento con 3 r
tendo vírus da raiva (realizado com as estirpes Pitman-Moore, Fluri-LEP e CVS), mas não contra material de controlo sem vírus da raiva. Da mesma forma não se verificou qualquer ligação de TW-1 em material de revestimento em camadas contendo vírus de controlo como VZV, CMV, Rubéola, HSV ou sarampo. 0 TW-1 liga-se a fibroblastos de frango fixados infectados e não aos não infectados, uma vez que após a incubação do TW-1 com essas células e subsequente incubação com anti-soro contra a imunoglobulina humana acoplada a FITC somente nas células infectadas se pode determinar a fluorescência típica da raiva. Além disso verificou-se que o TW-1 pertence â classe de imunoglobulina IgGl (Lam bda). Após electroforese em gel de SDS de antigenes de raiva re duzidos com ditiotreitol (DTT) (levado a cabo com as estirpes Pitman-Moore e Fluri-LEP) pode-se encontrar por análise de mancha de Western uma reacção de TW-1 com uma banda de 67 kD. Comparando os dados encontrados com os dados recolhidos da literatura (W.H. Wunner et al., Reviews of Infectious Diseases, 10, 4:771-784, 1988) pode-se concluir que a proteína reconhecida pe lo TW-1 é a glicoproteína do vírus da raiva. Isto foi confirmado pela observação de que após digestão do antigene da raiva com endoglicosidade F antes do antigene se desfazer em gel de SDS por análise de mancha de Western pode-se observar uma redução do peso molecular da proteína marcada com TW-1. Uma vez que o radical açúcar N-glicosídico combinado por endoglicosida-se-F se separa da proteína, pode-se concluir dos dados obtidos que as bandas marcadas com TW-1 na mancha de Western são provenientes da glicoproteína do vírus da raiva. A reacção cruzada de TW-1 com as estirpes de vírus da raiva Pitman-Moore, Fluri--LEP e CVS ensaiadas indica uma ligação num epítopo relativamen te conservado no interior da glicoproteína. A verificação da capacidade do TW-1 para a neu tralização do vírus da raiva foi levada a cabo por dois métodos diferentes conhecidos em si. No primeiro tipo de verificação foi realizado um ensaio de neutralização-fluorescência "in vitro". Misturaram-se diluições de anticorpos com vírus da raiva acti-• vos. Após adição de células susceptíveis ã raiva incubou-se du- 4
ir rante 24 horas, em seguida incubou-se com anti-soro acoplado a FITC específico da raiva e observou-se num invertoscópio de fluorescência. As culturas que apresentavam a fluorescência específica da raiva foram consideradas positivas. Como as culturas negativas só intervim quando os vírus da raiva são neutrali zados completamente através da adição de anticorpos, pode-se com este ensaio, por meio de diluições apropriadas e comparação com soro padrão específico da raiva de actividade conhecida, in vestigar a actividade neutralizador específica da raiva de um anticorpo. Como segundo ensaio de neutralização foi levada a ca bo uma experiência, durante a qual, após a mistura de diluições de anticorpos com vírus da raiva infecciosos, após uma incubação "in vitro" a mistura foi aplicada por via intracerebral em ratos NMRI (P. Atanasiu, Laboratory Techn. in Rabies, 3rd Edi-tion, Editores M.M. Kaplan e H. Koprowski, WHO (1973) 314-318). Se os vírus da raiva activos forem completamente neutralizados através dos anticorpos adicionados, então a porção de animais doentes neste grupo é inferior do que no de aplicação de vírus puros sem anterior mistura de anticorpos. Verificou-se que tanto no ensaio de aplicação em ratos (estirpes CVS) o vírus da rai va foi neutralizado pelo TW-1.
Como prova de que a adição do anticorpo TW-1 in vivo numa infecção com vírus da raiva pode inibir ou reduzir o surgimento da doença foram realizadas investigações de prote-cção em ratos NMRI. Verificou-se que o anticorpo TW-1 em ratos NMRI pode proteger até duas horas depois da infecção com vírus da raiva antes do aparecimento da doença. Em comparação com uma preparação de soro humano com anticorpos contra a raiva (dispo-níveis no mercado sob a marca Berirab , Behringwerke AG), o ensaio com a adição de TW-1 necessitou de nitidamente menos proteínas para a mesma acção neutralizadora e protectora. Esta cir cunstância representa uma clara vantagem do TW-1.
Juntamente com o seu emprego como imunoprofilá tico, o anticorpo pode ser empregue para purificação de vírus • da raiva ou de glicoproteínas de vírus da raiva, ligado a um ma 5
terial de suporte apropriado, num processo de cromatografia de afinidade. Além disso o anticorpo é apropriado para a validação da porção de glicoproteína em preparados de vacinação, uma vez que a glicoproteína do vírus da raiva, tal como se demonstra nos exemplos, pode ser detectada de modo específico. A presente invenção refere-se também a um epí-topo da glicoproteína de 67 kD do vírus da raiva, o qual é defi nido por meio do anticorpo monoclonal TW-1, bem como a anticorpos policlonais ou de preferência monoclonais humanos contra o epítopo mencionado, de modo especialmente preferido ao anticorpo TW-1.
Igualmente é também abrangido pelo âmbito da presente invenção o emprego do anticorpo mencionado anteriormen te para a preparação de vacinas passivas, para diagnóstico, para purificação de vírus da raiva ou glicoproteína de vírus da raiva e para validação de preparações de vacinação. A presente invenção é ainda ilustrada através dos exemplos e definida pelas reivindicações. 0 hibridoma que segrega o anticorpo monoclonal humano TW-1 foi depositado sob o número 90022604 de acordo com tratado de Budapeste na European Collection of Animal Cell Cul-tures (ECACC), Porton Down, Salisbury, UK em 26.02.1990.
EXEMPLOS
Os exemplos que se seguem têm por objectivo um melhor esclarecimento da presente invenção, sem contudo a limitar. Para as experiências descritas nos exemplos foram empregues anticorpos purificados por cromatografia de afinidade.
Exemplo 1: Especificidade dos anticorpos TW-1 em ELISA
Placas de ELISA de 96 alvéolos foram revesti-* das durante 24 horas à temperatura ambiente com células MRC-5 6
(estirpe Pitman-Moore) ou fibroblastos de frango (estirpe Flu-ri-LEP) infectados por meio de concentrado do sobrenadante de culturas inactivado com $-propioactona e purificados por meio de centrifugação de gradiente de sucrose ou com as células correspondentes não infectadas como controlo. Diluições de amostras de anticorpos foram incubadas durante 1 hora na placa e os anticorpos não ligados foram removidos através de lavagem. Os anticorpos ligados foram marcados por incubação durante uma hora com um anticorpo conjugado por peroxidase (IgG de coelho an-ti-humano, Behringwerke). Por meio de uma reaccção corada catalisada por peroxidase podem-se detectar os anticorpos humanos
com especificidade para vírus da raiva. Na Fig. 1 é apresentada ~ R a titulaçao de TW-1 e Berirab nos antigenes de raiva mencionados e nos antigenes de controlo correspondentes. Se foram aplicados vírus de varicela-zoster, citomegalo-vírus, vírus da ru-béola, vírus de herpes simples 1 ou vírus do sarampo para o revestimento, não se dá qualquer reacção. Pode-se assim admitir que o TW-1 se liga de modo altamente específico ao vírus da rai va.Uma vez que as curvas de ligação de TW-1 contra as estirpes de raiva utilizadas se desenvolvem de forma bastante semelhante, pode-se admitir uma afinidade de ligação semelhante do TW-1 con tra Fluri-LEP e Pitman-Moore.
Exemplo 2: Caracterização dos epítopos de ligação do anticorpo TW-1 em mancha de Western
Desfizeram-se vírus da raiva purificados em gel de poliacrilamida a 10% segundo Laemmli com 1% de SDS/DTT 50 mM. Apôs depósito dò antigene desfeito sobre nitrocelulose incubou-se com anticorpo TW-1, soro humano positivo à raiva e negativo à raiva. A detecção foi efectuada com imunoglobulina de ovelha-anti-humana acoplada a biotina (Amersham), incubação subsequente com estreptavidina-peroxidade (Amersham) e revelação com cloronaftol (Marck). O anticorpo TW-1 reage na análise de mancha de Western com uma banda de 67 kD (Fig. 2). Das indicações na literatura (W. Wunner et al., a;a.o.) pode-se con-• cluir que se trata de glicoproteína do vírus da raiva. Foi con- 7
mado através da digestão da proteína da raiva com endoglicosi-dase F (Boehringer Mannheim) antes de depositar em gel de SDS. A digestão foi levada a cabo segundo as indicações do fornecedor. Através da cisão do radical açúcar da glicoproteína dever--se-ia observar uma redução do peso molecular. Tal redução pode-se claramente reconhecer na banda dos 67 kD após reacção do anticorpo TW-1 na análise de mancha de Western em comparação com os antigenes originais e aponta assim para uma glicolisaçãò das proteínas reconhecidas pelo anticorpo TW-1. Não se deu qual quer reacção do anticorpo TW-1 com os antigenes de controlo, co mo o CMV, com albumina de soro de bovino ou albumina de soro hu mano.
Exemplo 3: Ensaio de neutralização de fluorescência in vitro (RFFIT)
Este ensaio foi levado a cabo in vitro de acor do com o método de Smith et al., (J.S. Smith et al. Laboratory Techn. in Rabies, 3rd Edition, Editores M.M. Kaplan e H. Kopro-wsky, WHO (1973), 354-357) como microanãlise em placas de micro titulação (E. Zalan, J. of Biol. Stand., 7:213-220, 1979). Misturaram-se diluições de amostras (anticorpos ou PBS para o controlo do vírus para o controlo do vírus) com vírus da raiva in-fecciosos. A partir dos ensaios levados a cabo (Fig. 2) pode-se concluir que o anticorpo TW-1 neste ensaio apresenta ainda, em concentrações de cerca de 0,14 ^pg/ml, um efeito neutralizador nas quantidades de vírus empregues. Do soro de referência (cavalo) utilizado foram necessários para o mesmo efeito acerca de 13,88 jig/ml. Um anticorpo monoclonal humano contra varicela zos ter (VZV-6) utilizando para controlo com o mesmo isotipo não te ve qualquer efeito sobre a infecciosidade do vírus em concentra ções comparáveis.
Exemplo 4: Ensaio de neutralização com inoculação da mistura de anticorpo/antigene em ratos NMRI susceptíveis
Este ensaio foi levado a cabo de acordo com 8
Atanasiu (a.a.o.)· Para a experiência foram utilizados ratos NMRI de 20 g de peso. Para a quantidade de vírus foram empregues 60 LD50 por rato. Tal como no Exemplo 3 em qualquer lugar foram misturadas in vitro e incubadas diluições de amostras (an ticorpo ou controle) com vírus de raiva activo. Para controle da neutralização a mistura foi aplicada em seguida por via in-tracerebral em ratos NMRI. Os ratos foram controlados diariamen te durante 14 dias e o número dos animais sobreviventes foi com parado para o anticorpo TW-1, soro de controlo específico da raiva, de um ACMHu específico de VZV e aplicação de vírus puro. Os dados correspondentes a 14 dias de incubação são apresentados na Fig. 3. Tornou-se evidente que o anticorpo TW-1 mostra uma clara neutralização do vírus da raiva mesmo nas concentrações aplicadas fracas de 0,08 jug/ml, enquanto que o VZV-6 em concentrações iguais não mostra nenhum efeito neutralizador.
Exemplo jj: Experiência de protecção 0 ensaio de protecção foi levado a cabo com ra tos NMRI susceptíveis a vírus da raiva (peso: 20 g). A carga de vírus aplicada foi de 150 i.m. (estirpe CVS). Foram minis tradas por via intravenosa diluições do anticorpo TW-1, de Be-rirab comercial ou de VZV-6 2 horas antes ou 2 horas depois da aplicação de vírus da raiva activos. Na experiência apresentada na Fif. 4 obteve-se com 2,5 jxg/ml de anticorpo TW-1 IgG a mesma protecção que com 1,5 mg/ml de BerirabR policlonal. Como controlo foi aplicado VZV-6 em concentração dupla do anticorpo TW-1. O efeito do VZV-6 situou-se no âmbito do controlo de vírus sem aplicação de anticorpos.
Legenda da Fig. 1 (Exemplo 1):
Especificidade do anticorpo TW-1 em ELISA
Como concentração inicial aplicou-se 1 ^g/ml , de anticorpo TW-1 e 100 ^ig/ml de IgG Berirab (Behringwerke). A • medição da extinção realizou-se a 492 nm. - 9 -
0 revestimento das placas ELISA foi levado a cabo com 0,4 iU/ml A significa extinção, Cone, a concentração dos anticorpos aplicados . + TW-1 sobre antigene de raiva * TW-1 sobre antigene de controlo
R
O Berirab sobre antigene de raiva R - Berirab sobre antigene de controlo Legenda da Fig. 2 (Exemplo 3);
Ensaio de neutralização com avaliação de fluorescência in vivo
Como concentração inicial aplicaram-se 4,4 jig/ml (= 1:100) do anticorpo TW-1.
Cl. significa culturas infectadas
Em abeissas representa-se a diluição do anticorpo (Dil.) + TW-1 O padrão de raiva * VZV-6
Legenda para a Fig. 3 (Exemplo 5);
Ensaio de neutralização in vitro, avaliação in vivo
Como concentração inicial foram aplicados 0,7 ^ig/ml do anticorpo TW-1 (= 1:600), 18,5 jxg/ml de Berirab** (Be-hringwerke AG) e 0,6 Jig/ml de VZV-6 (= 1:600). A.S. significa: animais sobreviventes
Em abeissas representa-se a diluição do anticorpo (Dil.) + TW-1 O padrão de raiva * VZV-6
Legenda da Fig. 4:
Experiência de protecção in vivo 10
Claims (1)
- h \a Fig. 4 A: Aplicação do anticorpo 2 horas antes da administração do vírus. Fig. 4 B: aplicação do anticorpo 2 horas depois da administração do vírus. Foram aplicados 2,5 jag/ml do anticorpo TW-1, 1,5 mg/ml de IgG Berirab^ e 5 yag/ml de VZV-6. A.S. ver acima d.p.a. significa: dias após a aplicação. REIVINDICAÇÕES - lâ - Processo para a preparação de produtos imuno-profiláticos, caracterizado por se utilizarem anticorpos que reagem com um epítopo da glicoproteína de 67 kD do vírus da raiva, reagindo o referido epítopo com o anticorpo que é segre gado pelo hibridoma depositado na European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) sob o número de depósito NQ 90022604. - 2ã - Processo para a detecção de uma infecção pelo vírus da raiva, caracterizado por serem usados os anticorpos utilizados no processo de acordo com a reivindicação 1 ou ser empregue o anticorpo do hibridoma NQ 90022604 depositado na ECACC. 11 - 3& - * Processo para a validação de um produto imuno-profilático, caracterizado por serem usados os anticorpos utili zados no processo de acordo com a reivindicação 1 ou ser empregue o anticorpo do hibridoma NQ 90022604. - 4ã - Processo para a purificação de um antigene do vírus da raiva, caracterizado por serem usados os anticorpos utilizados no processo de acordo com a reivindicação 1 ou ser empregue o anticorpo do hibridoma Ne 90022604. A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente alemão apresentado em 3 de Março de 1990, sob o NQ P 40 06 630.4 Lisboa, 28 de Fevereiro de 199112
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