PT96623A

PT96623A - Processo para a preparacao de precursores de farmacos de antraciclina-glicosilo

Info

Publication number: PT96623A
Application number: PT96623A
Authority: PT
Inventors: Dieter Hoffmann; Joerg Czech; Klaus Bosslet; Gerhard Seemann; Hans Harald Sedlacek; Manfred Gerken; Manfred Krause
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1990-02-01
Filing date: 1991-01-31
Publication date: 1991-10-15
Also published as: IE910334A1; EP0441218A2; DE4002888A1; CA2035385A1; EP0441218A3; KR910021408A; AU7011791A; JPH0616690A

Description

Descrição referente à patente de invenção de BEHRINGWERKE AKTIENGE SELLSCHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D-3550 Mar burg, República Federal Alemã, (inventores: Manfred Gerken, Man-fred Krause, Jõrg Czech, Klaus Bosslet, Gerhard Seemann, Dieter Hoffmann e Hans-Harald Sedlacek, residentes na República Federal Alemã), para "PROCESSO PARA A PRE PARAÇÃO DE PRECURSORES DE FÃRMA-COS DE ANTRACICLINA-GLICOSILO".

DESCRIÇÃO A presente invenção refere-se a precursores de fármacos de antraciclina-glicosilo, ao processo para a sua preparação e â sua utilização, em combinação com conjugados enzimáticos funcionalisados específicos de tumores, para o tratamento de doenças do foro cancerígeno; neste caso referem-se especialmente as 14-0-glicosil-antraciclinas como precursores de fármacos que, por acção de conjugados enzimáticos específicos de tumores, podem ser desdobrados em substâncias activas ci. totóxicas, sendo a substância activa libertada, devido à sua eficácia citotóxica, apropriada para o tratamento de doenças cancerígenas.

Um modelo no qual podem ser ensaiados ] como agentes terapêuticos combinações de precursores de fãrma-cos e conjugados anticorpo-enzima específicos de tumores, está 1 N.

descrito na literatura da especialidade. No presente caso injec taram-se anticorpos dirigidos contra determinados tecidos, aos quais estava ligado por covalência um enzima que dissocia o pre cursor do fármaco, a um animal no qual estavam transplantados estes tecidos. Depois da localização do conjugado MAK-enzima no tecido visado, administra-se um composto precursor activável pe lo enzima. Sob a acção do conjugado anticorpo-enzima fixado ao tecido o precursor é transformado num veneno celular que desenvolve uma acção citotóxica contra o tecido transplantado.

Na especificação WO 88/07378 descreve--se um sistema terapêutico contendo 2 componentes, constituído por um componente anticorpo-enzima e um componente de precursor activável pelo enzima. Para a preparação do conjugado anticorpo -enzima utilisam-se neste caso enzimas não provenientes de mamí feros e exclui-se a utilização de enzimas endógenos, devido à possível libertação de substância activa não específica. Como os enzimas exógenos são reconhecidos pelo organismo como antige nes estranhos, a sua utilização está associada ao inconveniente de uma resposta imune relativamente a estas substâncias que não são próprias do corpo, devido â qual o enzima imobilizado no an ticorpo é desactivado e eventualmente é eliminado todo o conjugado. Além disso utilizam-se no presente caso o ácido p-bis-N--(2-cloroetil)-aminobenzil-glutâmico e os seus derivados como precursores, cuja semi-vida química é relativamente curta e se situa preferivelmente no intervalo compreendido entre 5,0 e 17,0 horas. A instabilidade química de um precursor é desvantajosa devido às acções secundárias esperadas.

Na especificação EP A 0 302 473 A2 é descrito igualmente um sistema terapêutico de 2 componentes no qual o conjugado anticorpo-enzima, localizado no tecido do tumor, dissocia um composto precursor a uma substância activa citotóxica. A utilização combinada, aqui descrita entre outras, de um derivado de N-fenoxiacetilo da adriamicina como precursor e de L6-penicilina V-amidase imobilizada no ant_i corpo para libertação da adriamicina, apresenta inconvenientes • ^ . devido a imunogenidade do enzima bacteriano. Um outro inconveni 1 ente deste precursor é a alta lipofilia do precursor derivada 2

da acilação do grupo amino da adriamicina, diminuindo a solubilidade no plasma e podendo ter lugar a adsorção não específica do precursor nas membranas celulares. A síntese das 14-0-glicosil-antracicli-nas é descrita há muito tempo apenas como uma reacção secundária indesejável da glicosidação de adriamicinona com 2-desoxi--L-fucose (Horton et al, Carbohydrate Research 94, 11-25, 1981).

Surpreendentemente, prova-se que é possível realizar uma glicosidação de antraciclinas na posição 14, tendo em consideração determinados padrões de grupos de bloqueio na antraciclina, como também nos dadores de glicosilo.

Partindo-se deste conhecimento, bem como tendo em consideração os inconvenientes anteriormente descri tos das combinações conhecidas até ao presente de precursores e conjugados anticorpo-enzima, punha-se ã presente invenção o problema de se prepararem 14-0-glicosil-antraciclinas sintéticas, dissociáveis enzimaticamente, assim como enzimas funciona-lizados específicos de tumores, isto é, enzimas que estão modificados de modo que se liguem a células de tumores, que sejam apropriados para a terapia de doenças cancerígenas.

Este problema foi solucionado através da preparação dos compostos de fórmula I, assim como de enzimas funcionalisados específicos de tumores, que na sua utilização combinada se mostram activos no ensaio da actividade citoestáti ca. 0 objecto da invenção são pois 14-0-gli^ cosil-antraciclinas de fórmula I, assim como dos seus sais com ácidos orgânicos ou inorgânicos. 0 R' 3 0

R 7 3

I

na qual 12 3 R , R e R , independentemente uns dos outros, representam hidrogénio , hidroxi, metoxi,

A C C R , R e R , independentemente uns dos outros, representam hidrogénio, hidroxi, halogéneo, aciloxi alifático com 1 a 8 átomos de carbono, benzoiloxi ou benzoiloxi substituído como por exemplo para-nitrobenzoiloxi, alquiloxi com 1 a 8 átomos de carbono, aliloxi, benziloxi ou benziloxi substituído, tetrahidropiraniloxi, amino, NH-acilo com 1 a 8 átomos de carbono, NH-(9-fluorenilmetoxicarbonilo), morfolino ou morfolino substituído, de preferência 3-0-metil-morfoli-no ou 2-ciano-morfolino, 7

R representa um hidrato de carbono de formula II

na qual o R representa metilo, hidroximetilo, aciloximetilo com 1 a 8 átomos de carbono na parte acilo, alquiloximetilo com 1 a 8 átomos de carbono na parte alquilo, benziloximetilo, alilo- ximetilo, carboxi, carboximetilo ou carboxialilo, 9 10 11 R , R e R , independentemente uns dos outros, representam hi drogênio, hidroxi, aciloxi com 1 a 8 átomos de carbono, ben zoiloxi ou benzoiloxi substituído, tal como para-nitrobenzoiloxi, alquiloxi com 1 a 8 átomos de carbono, aliloxi, benziloxi ou benziloxi substituído, amino, NH-acilo com 1 a 8 átomos de carbono ou NH-(9-fluorenilmetoxicarbonilo).

Exceptuam-se os compostos nos quais 4 5 9 11 . 6 ii R =R =R =R =0-acetilo e R =R =hidrogenio, na conformação ot-L- -desoxifucose.

Por grupo acilo entende-se também um grupo mono, di ou trihalogenoacetilo, tendo como átomos de halo • ^ , geneo de preferencia fluor ou cloro. 1 Preferivelmente entende-se por benzilo- 4

xi substituído um grupo benziloxi substituído por um ou dois grupos metoxi.

Por um enzima específico de tumor fun-cionalizado entende-se, no âmbito da invenção, um enzima de fór mula III

A - Sp - E III na qual A representa um anticorpo ou um seu fragmento que apresentam especificidade a um antigene associado a tumor, ou uma bio-molécula que se acumula num tumor, como por exemplo EGF (Epidermal Growth Factor), TGF-®( (Transforming Growth Fac-toroC), PDGF (Platelet derived Growth Factor) , IGF I+II (In sulin-like Growth Factor I+II) ou a+b FGF (acidic + basic Fibroblast Growth Factor)

E representa uma glicosidase não imunogénea ou pouco imunogé-nea, de preferência uma glicosidase de mamífero, tal como <K ou ^-glucosidase, oC-galactosidase, oc ou ^-manosidase, <?C-fu cosidase, N-acetil-o(-galactosaminidase, N-acetil-^-/N-ace-til-o(-glucosaminidase ou (3-glucuronidase, e Sp (Spacer) representa um grupo contendo sulfureto ou dissulfu reto bifuncional, de fórmula IV X(S)nY IV ou (s)n na qual 12 13 X ou Y representam -CO-R -(N-succinimido)- ou -C(=R )-CH - 12 . z -C^- em que R representa -CE^-CI^-·, 1,4-ciclohexilideno, 1,3- ou 1,4-fenileno ou metoxicarbonil- ou clorofeno-1,4-13 -íleno e R representa 0 ou NH, 13 13 Y representa -C (=R )-CE^-CE^-, em que R tem o significado indicado, e n tem os valores 1 ou 2, ou um "spacer" polipeptídico.

Como exemplo, um enzima funcionalizado específico de tumor que representa um gene de fusão de VH, CHI, Hinge e gene enzimático, pode ser clonado num plasmídeo de expressão que é apropriado para a expressão em células eucariôntjL \ cas e que transporta um marcador de selecção. 0 plasmídeo de ex ^ pressão com o gene de fusão é transfectado em células de exprej= 5 ι·»'»·» ............. são eucariônticas, conjuntamente com um plasmídeo de expressão que contém o gene de cadeia leve pertencente ao anticorpo. Depois da selecção com um antibiótico apropriado, são identificados os clones do transfectoma que contêm o plasmídeo de expressão.

Por meio de métodos de comprovação apro priados (BioDot, ELISA) são identificados os clones do transfec toma que decompõem a proteína de fusão de fórmula III constituída por anticorpo e enzima. São preferidos no âmbito da invenção os compostos de fórmula I na qual os radicais 1 ... R representa hidroxi ou metoxi, 2 3 . . R e R representam hidroxi, 4 R representa hidrogénio, hidroxi, tetrahidropiramloxi, ammo ou aciloxi possuindo 1 a 8 átomos de carbono, 5 ... R representa hidroxi, aciloxi possuindo 1 a 8 átomos de carbo no amino, NH-acilo com 1 a 8 átomos de carbono ou NH-(9--fluorenilmetoxicarbonilo) R representa hidrogénio, hidroxi, halogéneo ou aciloxi, 7 R representa um hidrato de carbono de formula II em que g R representa metilo, hidroximetilo, aciloximetilo com 1 a 8 átomos de carbono na parte acilo, alquiloximetilo, carboxi, carboximetilo, carboxibenzilo ou carboxialilo, e 9 10 11 R , R , R , independentemente uns dos outros, representam hidrogénio, hidroxi, aciloxi com 1 a 8 átomos de carbono ou alquiloxi, 4 5 9 10 excluindo-se os compostos nos quais R =R =R =R =0-acetilo e 6 11 ·- ~ R =R =hidrogénio estão na configuração oC-L-desoxifucose. Ê ainda preferido um enzima específico de tumor funcionalizado de fórmula III, na qual A representa um anticorpo ou um seu fragmento que possuem especificidade relativamente a um antigene associado a um tumor, ou uma biomolécula que se acumula no tumor ou junto deste, como por exemplo EGF (Epidermal Growth Factor), TGF--oC (Transforming Growth Factor (X) , PDGF (Platelet derived Growth Factor), IGF I+II (Insulin like Growth Factor I+II) , ou a+b FGF (acidic + basic Fibroblast Growth Factor) 1 E representa uma glicosidase não imunogénea ou pouco imunogé- 6

nea, de preferência uma glicosidase de mamífero, especialmente uma oC- ou (ã-glucosidase, oC-galactosidase, <K- ou ^3--manosidase, o(-fucosidase, N-acetil-o(-galactosaminidase, N-acetil-^-/N-acetil-oC-glucosaminidase ou ^3-glucuronidase, Sp representa um grupo de fórmula IV contendo um dissulfureto bifuncional ou (S)n em que 12 13 X ou Y representam -CO-R -(N-succinimido)- ou -C(=R )-CH„- 12 ^ -CH2" em que R representa -CH2-CH2- ou 1,4-fenileno e R^ representa 0 ou NH, 13 13 Y representa -C(=R )-CH2-CH2~, em que R tem o significado indicado, e n tem os valores 1 ou 2, ou

Sp representa um polipeptídeo espaçador apropriado.

É também um objectivo da invenção um processo para a preparação de um composto de fórmula I com as definições indicadas anteriormente, o qual consiste em se fazer reagir uma antraciclina de fórmula V

1 2 3 4 5 6

na qual R , R , R , R , R e R tem os significados indicados acima, com um componente hidrato de carbono de fórmula VI

7

VI

na qual 8 R representa metilo, aciloximetileno com 1 a 8 átomos de carbono na parte acilo, alquiloximetileno com 1 a 8 átomos de carbono na parte alquilo, benziloximetileno, aliloximetile-no, carboximetilo, carboxibenzilo ou carboxialquilo, R^, R^ e R^ independentemente uns dos outros representam aci-loxi com 1 a 8 átomos de carbono, benzoiloxi ou benzoiloxi substituído, como por exemplo para-nitrobenzoiloxi, alquilo xi com 1 a 8 átomos de carbono, aliloxi, benziloxi, benzilo xi substituído, NH-acilo ou NH-(9-fluorenilmetoxicarbonilo) e Z representa um grupo dissociãvel como por exemplo um átomo de halogéneo, um grupo hidroxi, um grupo tri-alquilsililoxi com 1 a 4 átomos de carbono na parte alquilo, um grupo de bloqueio de acilo ligado através de um átomo de oxigénio, ou um tricloroacetimidato ligado através de um átomo de oxi^ génio, na presença de um promotor e eventualmente de um agente de fixa ção de ácidos e/ou de um agente desidratante, num dissolvente, * a uma temperatura compreendida entre -50° até +80QC, com obtenção de um derivado de 14-0-glicosil-antraciclina de fórmula I na qual todos os radicais R até R mantêm os seus significados anteriormente definidos, e em eventualmente se dissociarem nestes compostos os grupos de bloqueio existentes, ou alguns dos grupos de bloqueio, hidroliticamente ou com auxílio de um catalizador apropriado.

Em particular procede-se no presente ca so do seguinte modo: uma antraciclina de fórmula V, se transportar uma função amino 4 5 6 como um dos radicais R , R ou R , tem primeiramente que ser bloqueada neste grupo, por exemplo como NH-trifluoracetato ou NH-(9-fluorenilmetoxicarbonilo).

Para a glicozidação na posição 14 da an traciclina utilizam-se componentes hidrato de carbono funciona- „ 9 lizados de formula VI que contem tipicamente como radicais R , 10 11 R e R grupos 0-acilo, 0-alquilo ou 0-alilo, se transportarem radicais ligados através de um átomo de oxigénio. O radical

O R é igualmente bloqueado como aciloximetileno, alquiloximetile 8

no ou carboxialquilo.

No centro anomérico os derivados de hidrato de carbono têm que ter grupos dissociáveis Z apropriados. Os halogenetos de glicosilo, como por exemplo o fluoreto, o cio reto ou o brometo, são preparados por exemplo a partir de derivados de 1-0-acilo por meio de HF, HC1, HBr ou TiBr^. Outros compostos com grupos dissociáveis, tais como tricloroacetimida- to, bem como com diversas configurações de grupos de bloqueio 8 11 para R a R , são preparados de acordo com métodos correntes na química dos hidratos de carbono.

Para a glicozidação da antraciclina apta ao acoplamento com um dador de glicozilo é necessário um pro motor. No caso da utilização de fluoreto de glicozilo, de 1-hi-droxi-glicósidos-l-aciloxiglicõzidos ou de 1-tricloroacetimida-tos de hidratos de carbono são utilizados ácidos de Lewis, como por exemplo BF^ x éter ou triflato de trimetilsililo, enquanto que no caso de cloretos e de brometos de glicozilo são utilizados sais de prata ou de mercúrio. A glicozidação tem lugar num dissolvente orgânico aprõtico ou numa mistura de dissolventes, como por exemplo acetona, acetato de etilo, éter, tolueno, diclorometano, dicloroetano, acetonitrilo, nitrometano. Eventualmente com utilização de um agente de fixação de ácidos ou de um desidratante por exemplo um crivo molecular, a reacção, consoante a reactivi dade do dador de glicozilo, é realizada a temperaturas compreen didas entre -50S e +80QC. A dissociação subsequente dos grupos de bloqueio é realizada com os métodos correntes na química dos hidratos de carbono.

Para a preparação de A-Sp-E pode ser acoplado ou o espaçador (Sp) através de um grupo amino a um enzima e ao anticorpo, ou a biomolécula através de um grupo HS in troduzido ou produzido por dissociação de uma ponte dissulfure-to, ou são acopladas por covalência sequências de aminoácidos que codificam as partes A, Sp e E, por meio de métodos de biolo gia molecular, formando-se um gene de fusão, e prepara-se o com posto A-Sp-E por processos de tecnologia genética.

Este processo pode realizar-se de diver sos modos: 9

Δ) um sítio de corte de restrição A é introduzido na extremida de 31 do exão CHI no gene da cadeia pesada da imunoglobuli-na com a auxílio de mutagénese específica. É gerado o mesmo sítio de corte de restrição A na extremidade 5' do oligonu-cleótido que codifica o oligopeptídeo que funciona como es-paçador. Ambos os sítios de corte de restrição A são então ligados de modo que o gene de imunoglobulina possa ser acoplado com o oligonucleótido através do sítio de corte de restrição A, sem perturbar a sequência de leitura.

Na extremidade 3' do oligonucleótido ê criado um sítio de corte de restrição B. Este sítio de corte de restrição B é introduzido no gene que codifica o enzi^ ma, no sítio em que começa a sequência de ácidos nucleicos codificantes da proteína madura. Em seguida o gene do enzima é acoplado através do sítio de corte de restrição B com o construído "linker" do gene de imunoglobulina. Os sítios de corte de restrição B são ligados de modo que não seja perturbada a sequência de leitura no acoplamento. 0 gene de fusão obtido do enzima de ligação para as cadeias pesadas da imunoglobulina VH e CHI, é clonado num plasmídeo de expressão que é apropriado para a expressão em células euca-rionticas e transporta um marcador de selecção. O plasmídeo de expressão com o gene de fusão, conjuntamente com um outro plasmídeo de expressão que transporta o gene para a cadeia leve pertencente ao antieor po, é transfectado em células eucarionticas (por exemplo cé lulas de mieloma). Por selecção com antibióticos apropriados isolam-se clones de células que contêm os plasmídeos com o gene de fusão e o gene da cadeia leve (transfectomas).

Por métodos de comprovação apropriados (BioDot; ELISA) identificam-se os transfectomas que seccionam a proteína de fusão de fórmula A-Sp-E constituída por uma parte MAK-Fab, polipeptídeo ligante e enzima. B) um sítio de corte de restrição A é introduzido na extremida de 3' do exão Hinge do gene para a cadeia pesada da imunoglobulina. 0 sítio de corte de restrição A é introduzido no ponto do gene do enzima no qual começa a sequência de nu-cleótidos codificante para a proteína madura. 0 fragmento 10

de gene da cadeia pesada da imunoglobulina com os exões VH, CHI e Hinge é acoplado com o gene do enzima através do sítio de corte de restrição A.

Os sítios de corte de restrição A são então posicionados de modo que no acoplamento não seja perturbada a sequência de leitura. A parte Hinge do anticorpo tem nesta construção a função de espaçador polipeptídico. 0 gene de fusão de VH, CHI-Hinge e do gene do enzima é clona-do num plasmídeo de expressão que é apropriado para a expressão em células eucationticas e que transporta um marcador de selecção. 0 plasmídeo de expressão com o gene de fusão é transfectado em células de expressão eucationticas, conjuntamente com um outro plasmídeo de expressão que contém o gene da cadeia leve pertencente ao anticorpo. Depois da selecção com um antibiótico apropriado identificam-se os clones de transfectoma que contêm o plasmídeo de expressão. Por métodos de comprovação apropriados (BioDot, ELISA) são identificados os clones de transfectomas que seccionam a proteína de fusão de fórmula III que consiste no anticorpo e no enzima. 0 acoplamento entre o enzima e o anticorpo, dos seus fragmentos ou de uma biomolécula é realizado de acordo com processos descritos na literatura (A. H. Blair e T. I. Ghose, I. Immunolog. Methods 59 (1983) 129-143; T. I. Ghose et al. Methods in Enzymology Vol. 93 (1983) 280-333). Neste caso funcionaliza-se primeiro o enzima através do seu grupo amino por meio de um 1-carboxilato de succinimidil-N-maleimido-alqui-lideno, de cicloalquilideno ou de arileno, ocorrendo a reacção da dupla ligação da função maleimido numa reacção com o grupo HS do anticorpo funcionalizado, do seu fragmento ou da biomolécula, com formação de uma função tioéter. Para a preparação do conjugado anticorpo-enzima podem ser utilizados anticorpos mono clonais, por exemplo os que são descritos na Especificação EP--A0 141 079, de preferência os anticorpos 431/26, 250/183, 704/ /152 e 494/32. A especificidade destes anticorpos relativamente a antigenes associados ao tumor foi já comprovada no homem e nos animais por meio de imunocintilografia e imunohistoquímica. A sequência de nucleõsidos do gene V destes anticorpos monoclo- 11

nais está descrita no Pedido de Patente Alemã DE-A-3 909 799.4.

Para a preparação dos conjugados de enzima específicos de tumor, os enzimas citados adiante podem ser preparados a partir das fontes indicadas de harmonia com os pro cessos da literatura também referidos: - oC-galactosidade A a partir de placenta humana: Bishop, D. F. (1981), J. Biol. Chem. 256, 1307-1316, ou de células de mamí fero transfectadas (Tsuji, S. (1987) Eur. J. Biochem. 165, 275-280. ^-glucuronidase a partir de placenta humana: Brot, F. E. (1978) Biochemistry 17, 385-391. - (3 -glucuronidase humana a partir de células de mamífero trans fectadas: Oshima, A. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 685-689. - oC -L-fucosidase a partir de fígado humano: Dawson, G., Tsay, G. (1877) Arch. Biochem. Biophys. 184, 12-23. - d( -manosidase a partir de fígado humano: Grabowski, G. A., Ikonne, J. U., Desnick, R. J. (1980) Enzyme 25, 13-25. oC-manosidase a partir de placenta humana: Noeske, C., Mers-mann, G. (1983) Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 364, 1645--1651. - (3 -glucosidase a partir de mucosa de estômago e intestino hu mano: Asp, N.-G., Gudmand-Hoeyer, E., Christiansen, P.M., Dahlquist, A. (1974) Scand. J. Clin. Lab Invest. 33. 15, 239-245. - oC-glucosidase a partir de fígado humano: Daniels, L. B., Coyle, P. J., Chião, Y.-B., Glew, R. H. (1981) J. Biol. Chem. 256, 13004-13013. - @ -glucocerebrosidase a partir de placenta humana: Furbish, F. S., Blair, Η. E., Shiloach, J., Pentcheu, P. G., Brady, R. O. (1977) Proc. Natl. Acad. Sei, USA 74, 3560-3563. (3 -N-acetilglucosaminidase a partir de placenta humana: Roehrborn, W., Von Figura, K. (1978) Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 359, 1353-1362. - oC -N-acetilglucosaminidase a partir de membrana amniótica hu mana: Orlacchio, A., Amiliani, C., Di Renzo, G. C., Cosmi, E. V. (1986) Clin. Chim. Acta 159, 279-289. φ -N-acetilgalactosaminidase: de acordo com Salvayre, R. Ne- 12

gre, A., Marest, A., Douste-Blazy, L. (1984) Pathol. Biol. (Paris) 32, 269-284. A actividade glicolítica dos enzimas es pecíficos de tumor funcionalizados foi determinada em ensaios comparativos com p-nitrofenilglicõsidos, em pH óptimo em cada caso. Ê ainda um objectivo da invenção uma em balagem contendo uma 14-0-glicosil-antraciclina de acordo com a invenção e um conjugado de enzima específico de tumor funciona-lizado.

Para o ensaio da eficácia de uma utilização combinada desfazada em tempo administrou-se a ratos tran£ plantados o enzima funcionalizado, esperou-se até ao dia em que o nível no plasma do enzima praticamente tinha vindo a zero, ad ministrou-se a 14-0-glicosil-antraciclina e observou-se se tinha ocorrido uma paragem de crescimento e uma regressão nos tecidos transplantados.

Exemplos:

Os exemplos que se seguem elucidam a in venção em pormenor sem contudo a limitarem: A Síntese dos precursores de fármacos:

As estruturas dos compostos preparados l foram determinadas por meio de espectroscopia de RMN de H e de 13 C, com recurso a métodos de RMN bidimensionais e outras tecni_ cas de RMN de impulsos múltiplos, bem como espectroscopia de massa, de UV e de IR. A evolução das reacções, assim como os compostos resultantes, foram ensaiados cromatograficamente em camada delgada ou por meio da técnica HPLC.

Exemplo 1: 2-0-alil-l,3,4,6-tetra-0-acetil-o^-D-galacto-hexo-piranose (1)

Uma solução de 1,3,4,6-tetra-0-acetil- 13

-D-galactopiranose (3,48 g = 10 mmol) e de tricloroacetimida to de alilo (14 ml de uma solução a 30% em hexano) em diclorome tano (15 ml) foi misturada com ácido trifluorametanossulfónico (0,25 ml) e agitou-se 4 horas, aquecendo-se a mistura a 40QC. Depois do arrefecimento filtrou-se e o filtrado foi extraído com solução aquosa de hidrogenocarbonato de sódio. A fase orgânica foi separada cromatogra ficamente em coluna (eluente: acetato de etilo/éter de petróleo = 1:4) .

Rendimento: 1.52 g (3.9 mmol = 39%), mp 133QC, [oC] + 68.6 (c = 1.0 in Diclorometano). 1 ^ H NMR (300 MHz, CDC13) &6.40 (d, 1H, 2 = 3.6 Hz, H-l), 5.83 (dddd, 1H, Alilo), 5.47 (dd, 1H, J3 4 = 3.3 Hz, J4 5 = 1.2 Hz, H-4), 5.32-5.17 (m, 3H, Alilo, H-3), 4.30 (dt, J4 5 = 1.2 Hz, J5 6a = J5 6b = 6,6 Hz' H_5)' 4.16-4.06 (m, 4H, H-6a, H-6b, Ali lo), 3.88 (dd, 1H, 2 = 3*6 Hz' J2 3 = 10,5 Hz' H"2)' 2*17 (s, 3H, OAc), 2.15 (s, 3H, OAc), 2.04 (s, 3H, OAc), 2.03 (s, 3H, OAc). 13C NMR (50 MHz, CDCl^S 117.4 (Alilo), 93.5 (Alilo), 89.7 (C-l), 71.8 (Alilo), 71.7 (02) , 69.0 (03), 68.2 (05), 67.4 (04), 61.0 (06), 20.6 (OAc), 20.4 (OAc), 20.3 (OAc), 20.1 (OAc).

Exemplo 2: brometo de 2-0-alil-3,4,6-tri-0-acetil-oCD-galacto-hexo-pirano-silo (2) 0 composto 1 (940 mg = 2,42 mmol) foi dissolvido em diclorometano (2 ml), misturou-se a O^C com ácido bromídrico em ácido acético (11 ml; solução a 33% de HBr) e agi tou-se 2 horas a esta temperatura. A mistura reactiva foi verti da sobre gelo e foi extraída com diclorometano. A fase orgânica foi extraída com solução aquosa de hidrogenocarbonato de sódio até reacção levemente básica, secou-se com sulfato de sódio e extraiu-se várias vezes com tolueno. | Rendimento: 930 mg (2.27 mmol = 94%), Xarope. * 1H NMR (200 MHz, CDC13) $6.58 (d, 1H, Ηχ 2 = 3.8 Hz, H-l), 5.90 14

(dddd, 1H, Alilo), 5.49 (dd, 1H, J3 4 = 3.4 Hz, J4 5 = 1-3 Hz, H-4), 5.38-5.20 (m, 3H, H-3, Alilo), 4.48 (dt, lH, J4 5 = 1-3 Hz, Jc - = Jc = 6.3 Hz, H-5), 4.23-4.04 (m, 4H, Alilo, H-6a,

O / O 9. D/vlD H-6b), 3.77 (dd, 1H, 2 = 3.8 Hz, J2 3 = 10.3 Hz, H-2), 2.17 (s, 3H, OAc), 2.08 (s, 3H, =Ac), 2.03 (s, 3H, OAc). 13C NMR (50MHz, CDC13) & 170.2 (OAc), 169.7 (OAc), 169.6 (OAc), 133.7 (Alilo), 117.9 (Alilo), 90.6 (C-l), 72.8 (C-2), 71.7 (Ali lo), 70,9 (C-5), 69.9 (C-3), 67.2 (C-4), 60.8 (C-6), 20.6 (OAc), 20.5 (OAc), 20.4 (OAc).

Exemplo 3: N-(9-fluorenilmetoxicarbonil)-doxorrubicina (3) A uma suspensão de cloridrato de doxorrubicina (107 mg = 0,184 mmol) em metanol absoluto (10 ml) adicionou-se uma solução de metanolato de sódio (a 30% em metanol) até se verificar uma reacção levemente alcalina, dissolvendo-se assim a substância. Depois da adição de carbonato de sódio (anjL dro)(98 mg = 0,92 mmol) e de cloreto de 9-fluorenilmetoxicarbo-nilo (142 mg = 0,552 mmol) agitou-se 1 hora â temperatura ambiente. Depois da filtração e concentração separou-se cromatogra-ficamente em coluna (eluente: diclorometano/metanol/ãcido fórmi co = 20:1:0,1) .

Rendimento: 139 mg (0.181 mmol = 98%), mp 165-1660C, [oC]jp + 156e (C = 0.02 em Clorofórmio). 1H NMR (200 MHz, CDC13) S13.86 (s, 1H, OH-6), 13.09 (s, 1H, OH--11), 7.98-6.70 (m, 11H, H-l, H-2, H-3, 8 Fmoc- H aromático), 5.39 (bs, 1H, H-l'), 5.14 (m, 2H, NH, H-7), 4.71 (s, 2H, H-14), 4.48 (s, 2H, Fmoc-CH), 4.25 (s, 1H, Fmoc-CH), 4.07 (q, 1H, H-5'), 3.99 (s, 3H, OMe), 3.80 (m, 2H, H-3’, H-41), 3.55 (bs, 1H, OH), 3.15 (d, 1H, J1Qa 1Qb = 18.7 Hz, H-lOa), 2.99 (bs, lH, OH), 2.82 (d, 1H, H10a 1Qb = 18.7 Hz, H-lOb), 2.48-2.03 (m, 4H, H-8a, H- -8b, H-2a1, H-2e'), 1.23 (d, 3H, J5, βΙ = 6.5 Hz, CH3-6'). FAB-MS, m/z = 766 (M+H). 15

Exemplo 4: 14-0-(2-0-alil-3,4,6-tri-0-acetil-oC-D-galacto-hexo-piranosil)--N-trifluoracetil-doxorrubicina (4) A uma solução de N-trifluoracetil-doxor rubicina (70 mg = 0,11 mmol) numa mistura de dissolventes forma da por tolueno absoluto e nitrometano absoluto (7 ml; 1:1) com crivo molecular (4 A) adicionou-se carbonato de prata (90 mg = 0,33 mmol) e perclorato de prata (23 mg = 0,11 mmol) e agitou--se 1 hora à temperatura ambiente. A esta mistura adicionou-se uma solução do composto 2 (134 mg = 0,33 mmol) em tolueno absoluto (1 ml) e agitou-se 22 horas à temperatura ambiente. Depois da filtração e lavagem repetida com tolueno e adição de dicloro metano, extraiu-se com solução de hidrogenocarbonato de sódio e seguidamente com água, e a fase orgânica foi seca com sulfato de sódio. Por cromatografia em coluna (eluente diclorometano/me tanol/ácido fórmico = 20:1:0,1) obteve-se o produto em forma cristalina.

Rendimento: 48 mg (0.05 mmol = 45%), mp 131-132QC, [°C]23 + 220 (c = 0.02 em Clorofórmio). 1H NMR (300 MHz, CDCl,) £14.01 (s, 1H, OH-6) , 13.23 (s, 1H, OH- -11) , 8 .04 (d , 1H, Jl, 2 = 8 .7 Hz , H-l) , 7 .79 (t, 1H, J 1,2 = J2,3 = 8.5 Hz , H-2) , 7 • 40 (d, 1H 7 J2,3 = 8.3 Hz, H-3) , 6. 72 (d, 1H, J3, NH = 8 .2 Hz, NH 1 ), 5 .93 (dddd, 1H, Alilo) , 5.54 (d , 1H, J3", 4" = 3 .4 Hz, H- 4") / 5.50 (d, 1H, J 1', 2a· = 2 .9 Hz, H- 1'), 5.44 -5. 17 (m, 4H, H -7, H-3' , 2 x Alilo), 5.15 (d , 1H, Jn II ,2" 3.6 Hz, H- 1") , 5.00 (d / 1H, J14a ,14b 19 .5 Hz, H-14a) , 4 .86 (d, 1H, J14a, 14b = 19. 5 Hz, H-14b), 4. 49 (t, 1H, J5",6a" = J5", 6b" = 6.5 Hz, H -5" ) , 4. 18 (m , 6H, 2 x Alilo, H-3' , H- 5' , H- -6a" , H -6b 4.09 (s, 3H, OMe) , 3.87 (dd , 1H, J 1" , 2 " = 3 .5 Hz, J2\ 3" = 10.5 Hz, H -2" ) , 3. 67 (d , 1H, J31 ,4' = 3 .7 Hz, H- 4'), 3.27 (d ., 1H, J10a,10b = 19. 0 Hz, H-lOa), 2.98 (d , 1H, J10 a,10b = 19 .0 Hz, H- 10b) , 2.36 -1.7 (m, 4H, H- 8a, H-8b, H-2a', H- 2e1) , 2.16 (s, 3H, OAc), 2.07 (s, 3H, OAc), 2.04 (s, 3H, OAc), 1.33 (d, 3H, J5, 6, = 6.5 Hz, CH3-6). FAB-MS, m/z = 990 (M + Na). 16

Exemplo 5: 14-0-(2-0-alil-3, 4,6-tri-0-acetil-oC-D-galacto-hexo-piranosil)--N-(9-fluorenilmetoxicarbonil)-doxorrubicina (5) 0 composto 3 (93 mg = 0,122 mmol) foi submetido a reacção, nas condições descritas no Exemplo 4, com carbonato de prata (111 mg = 0,366 mmol), com perclorato de pra ta (25 mg = 0,122 mmol) e com o composto 2 (150 mg = 0,366 mmol) e procedeu-se ao tratamento põs-reactivo.

Rendimento: 65 mg (0.66 mmol = 49%), mp 148-149QC, [0C[25 + 17qq (C = o.02 em Clorofórmio). 1H NMR (200 MHz, CDC13) 13.97 (s, 1H, OH-6), 13.20 (s, 1H, OH--11), 8.08-7.01 (m, 11H, H-l, H-2, H-3, 8 x Fmoc H-aromático), 5.95 (dddd, 1H, Alilo), 5.52 (d, 1H, J3„ 4„ = 3.0 Hz, H-4"), 5.45 (d, 1H, J., , 0. = 2.8 Hz, H-l'), 5.43-5.11 (m, 5H, 2 x Ali lo, H-7, H-l", H-3"), 4.94 (m, 2H, H-14a, H-14b), 4.57-4.03 (m, 13H, OMe, 2 x Alilo, 3 x Fmoc, H-6a", H-6b", H-3', H-5', H5"), 3.87 (dd, 1H, J^, 2„ = 3.3 Hz, J2„ 3„ = 10.4 Hz, 2"-H), 3.67 (m, 1H, H-4’)/ 3.25 (d, 1H, J14a 14b = 19.0 Hz, H-14a), 2.93 (d, 1H, J14a 14b = 19.0 Hz, H-14b, 2.15 (s, 3H, OAc), 2.06 (s, 3H, OAc), 2.03 (s, 3H, OAc), 1.31 (d, 3H, J5, gI = 6.3 Hz, CH3--6'). FAB-MS, m/z = 1116 (M + Na).

Exemplo 6: 14-0-(3,4,6-tri-0-acetil-o(-D-galacto-hexo-piranosil)-N-(9-fluo renilmetoxicarbonil)-doxorrubicina (6)

Uma solução de hexafluorfosfato de 1,5--ciclooctadieno-bis[metildifenilfosfina]-irídio (5 mg) em tetra hidrofurano absoluto (5 ml) foi hidrogenada até à descoloração à pressão atmosférica e foi misturada e agitada duas horas com uma solução do composto 5 (44 mg = 0,04 mmol) em tetrahidrofura * no absoluto. Em seguida adicionou-se água (1 ml) e iodo e agi-^ tou-se por mais 30 minutos. A mistura reactiva foi misturada 17

com diclorometano e foi extraída primeiro com solução aquosa de tiossulfato de sódio e em seguida com solução aquosa de hidroge nocarbonato de sódio. Depois da secagem com sulfato de sódio e concentração purificou-se cromatograficamente em coluna (eluen-te: diclorometano/metanol/ácido fórmico = 20:1:0,1). Rendimento: 15 mg (0,014 mmol = 35%).

Exemplo 7: 14-0-(3,4,6-tri-0-acetil-o(-D-galacto-hexo-piranosil)-doxorrubi cina (7)

Uma solução do composto 6 (12 mg = 0,011 mmol) em morfolina (2 ml) foi agitada 3 horas à temperatura ambiente e em seguida foi extraída duas vezes com tolueno. Depois de se tomar o resíduo com diclorometano extraiu-se com tampão de acetato aquoso (pH 5). Rendimento: 9 mg (0.0103 mmol = 94%). 1H NMR (200 MHz, CDC13) δ 8.03 (d t—I h» Jl,2 " 7.7 Hz , H- -1) , 7.79 (t , 1H, Jl,2 “ J2, 3 8. 0 Hz , H-2) , 7.39 (d, 1H, 2,3 = 8.2 Hz, H-3) , 5.52 (m, 1H, H- 4") , 5.46 (d, 1H , 1 , 2a 1 = 3 .3 Hz, H-l '), 5. 34 (m, 1H, H- 7) , 5.26 (dd, 1H, H 2", 3" = 10. ,5 Hz J3", 4" = 3.2 Hz, H- 3") , 4. 98 (d, 1H, ", 2 " 3.8 HZ, H- -1" ), 4.92 (m , 2H, H-14a, H-14b) , 4 .39 (t, 1H ' J5", 6a" = : J5 ",6b" = 6.5 Hz, H-5") , 4.14 -3.97 (m, 6H, OMe, H -5' , H -6a", H- 6b' '), 3 (s, 1H, H-4 1) , 3.27 (d, 1H , J 10a, 10b 19.0 Hz, H- 10a) , 2. 99 (d, 1H, J10a, 10b = 19.0 Hz , H -10b), 2.15 (s, 3H, OAc) , : 2.07 6H, 2 x OAc) , 1.36 (d, 3H, J5 ',6' = 6.6 Hz, CH3-6) •

Exemplo 8: 14-0-(3,4,6-tri-O-acetil-oC-D-galacto-hexo-piranosil)-N-trifluo racetil-doxorrubicina (8) O composto 4 foi submetido à reacção nas condições indicadas no Exemplo 7. 18 1H NMR (200 MHz , CDC1 3) s 14.05 (s, 1H, OH- 6) , 13 .28 (s, 1H, OH -11) f 8.06 (dd, 1H, J 1,2 = 7.8 Hz, J 1,3 0 .8 Hz, H- D, 7.80 (t, 1H ' J1, 2 J2,3 8.0 Hz, H -2), 7.40 (dd, 1H, J2 / 3 = 8.7 Hz, co I—1 = 0.8 Hz, H-3) , 6.67 (d, 1H, J3 1 ,NH = 8. 5 HZ , NH), 5.57 (d, 1H , J3.. #4" = 2.8 Hz, H-4") ; 5.45 (d, 1H / Ji·. 2a' = 3 .6 Hz, H-l' ), 5.33 (m, 1H, H -7), 5.23 (dd, 1H, J 2" ,3 II “ 10. 5 Hz ' J3",4" = 2. 9 Hz, H -3") , 5.02 (d, 1H, j l"^" = 3. 8 f Hz , H- •1") , 4. 87 (m, 2H, H- 14a, H-14b), 4. 37 (t, 1H / J5", 6a" = J 5" ,6b* 6.5 Hz, H- -5") / 4.20 (q> 1H, J5 \6' = 6, 3 Hz, H-5') r 4. 09 s, 3H, OMe) , 3.65 (m, 1H, H-4'), 3.33 (d, 1H, J1Qa = 18.5 Hz, H-lOa), 2.98 (d, 1H, J1Qa 1Qb = 18.5 Hz, H-lOb), 2.15 (s, 3H# OAc), 2.08 (s, 3H, OAc), 2.04 (s, 3H, OAc), 1.32 (d, 3H, J_, , = 6.5 Hz,

5 f D CH3-6').

Exemplo 9: 14-0-(2-0-alil-oÇ-D-galacto-hexo-piranosil)-N-trifluoracetil-do xorrubicina (9)

Uma solução do composto 4 (15 mg = 0,015 mmol) em metanol (2 ml) foi misturada com uma quantidade catalí. tica de metanolato de sódio e agitou-se 1 hora à temperatura am biente. Com uma resina permutadora de iões ácida (Dowex WX 50) neutralizou-se em seguida e concentrou-se depois da filtração. Rendimento: 12 mg (0.014 mmol = 93%) 1H NMR (400 MHz, CDC13 + CD3OD) £ 14.02 (s, 1H, OH-6), 13.28 (s, 1H, OH-11), 8.03 (d, 1H, J1 2 = 7.8 Hz, H-l), 7.80 (t, 1H, J1 2 = J2 3 = 8,0 Hz' H"2)' 7,40 <d, 1H' J2 3 = 8·5 Hz, H-3), 6.01 (m, 1H, Alilo), 5.55 (m, 1H, H-l'), 5.26 (m, 1H, H-7), 5.17 (d, 1H, Jv, 2„ = 3.5 Hz, H-l"), 4.94 (d, 1H, J14a = 19.0 Hz, H-14a), 4.85 (d, 1H, J14 14b = 19.0 Hz, H-14b), 4.08 (s, 3H, OMe), 3.28 (d, 1H, J1Qa 1Qb = 18.5 Hz, H-lOa), 3.02 (d, 1H, J10a 10b = 18,5 Hz' H“10b)' 1>32 (ã’ 3H/ J5i 6i = 6-5 Hz, CH3~ -6')! 19

Exemplo 10: 14-0-oC-D-galacto-hexopiranosil-doxorrubicina (10) a) o composto 7 (4 mg = 0,005 mmol) foi submetido à reacção nas condições descritas no Exemplo 9.

Rendimento: 2,8 mg (0,004 mmol = 80%). b) Uma solução do composto 8 (11 mg = 0,012 mmol) em metanol (1 ml) e soda cáustica 0,5 N (0,5 ml) foi agitada 90 minutos â temperatura ambiente. Depois da neutralização com ãci do clorídrico diluído extraiu-se várias vezes com tolueno, seguidamente tomou-se com metanol, filtrou-se através de ce lite e concentrou-se. A purificação foi realizada por meio de HPLC (eluente: tampão de fosfato/acetonitrilo/tetrahidro furano = 30:60:10). XH NMR (200 MHz, CDC13 + CD3OD) £ 7.90 (d, 1H, Jj 2 = 7,6

Hz, H-l), 7.73 (t, 1H, υ3 2 = J2 3 = 8 Hz, H-2), 7.22 )d, 1H, J2 3 = 8.4 Hz, H-3), 5.37 (s, 1H, H-l')/ 5.12 (s, 1H, H-7), 4.85 (s, 2H, H-14a, H-14b), 4.75 (m, 1H, H-l")/ 3.98 (s, 3H, OMe), 2.29 (d, 1H, J1Qa 1Qb = 15.5 Hz, H-lOa), 2.06 (d, 1H, J10afl0b = 15.5 Hz, H-lOb), 1.21 (d, 3H, J4, 5, = 6.6 Hz, CH3-6). B. Dissociação do precursor do fármaco por enzimas:

Exemplo 11:

Dissociação de 14-0-a: -D-galacto-hexo--piranosil-doxorrubicina (composto 10) por oC -galactosidase A de placenta humana 0,5 mg do composto de partida foram dissolvidos em 0,5 ml de tampão de fosfato, pH 5, contendo 0,03 U/ml de OC-galactosidase A isolada da placenta humana e incubou-se a 37QC no escuro. Depois de diversos períodos de incubação retiraram-se amostras do preparado de incubação e analizaram-se directamente por meio de cromatografia líquida de alta pressão (coluna: Nucleosil 100 (RP 18, 5 pm de diâmetro de partículas, 125 x 4,6 mm; fase móvel: gradiente de solução A e B: 20 i

0 min - 20% A, 10 min - 30% A, 15 min - 30% A, solução A = 100% acetonitrilo, solução B = tampão de fosfato 0,02 M pH 3,0: débi to: 1 ml/min; detecção:; fluorescência, ex. 495 nm, em. 560 nm). 0 tempo de retenção do composto de partida nestas condições de cromatografia é de 9,0 minutos. O composto formado durante a in cubação possui um tempo de retenção de 12,6 minutos, idêntico ao da adriamicina. O tempo de semi-período da dissociação nas condições descritas foi de cerca de 54 horas (valor extrapo lado). Na incubação do composto de partida em solução tampão isenta de enzima o composto permaneceu estável durante este período de tempo.

Exemplo 12:

Dissociação de 14-0-<K-D-galacto-hexo-piranosil-doxorrubicina (composto 10) por pC-galactosidase de grãos de café O composto de partida foi incubado, nas mesmas condições descritas para o Exemplo 11, na presença de 0,03 U/ml de oC-galactosidase de grãos de café (Sigma). O semi--período da dissociação na presença do enzima foi de cerca de 20 minutos. C. Determinação da actividade enzimática dos conjugados de enzima:

Exemplo 13:

Determinação da actividade enzimática de conjugados de ^3-glucuronidase A ^-glucuronidase purificada de harmonia com o processo descrito acima foi acoplada ao anticorpo/biomolécula e determinou-se a actividade do enzima, assim como do conjugado, do seguinte modo: a 500 jil de uma solução de 2,5 mM de β -D-glucuronido de p-nitro fenilo em 100 mM de HEPES (ácido N-2-hidroxietil-piperazino-N'- 21

-2-etanossulfónico) pH 5, ádicionaram-se 500 μΐ da solução de conjugado de enzima a determinar. 0 preparado de ensaio foi incubado a 37QC e passados 6 minutos parou-se a incubação com 500 μΐ de uma solução 0,4 M de glicina, pH 10,8. Em seguida realizou-se a determinação do p-nitrofenol libertado por medição da extinção a 405 nm.

Resultados: O conjugado mostrou uma actividade enzimática apenas insignificantemente diminuída.

Exemplo 14:

Determinação da actividade enzimática de conjugados de oí-D-ga-lactosidase A A oC-galactosidase A purificada de acordo com o processo descri to acima foi acoplada ao anticorpo/biomolécula e determinou-se a actividade do enzima, assim como do conjugado, do seguinte mo do: a 500 μΐ de uma solução de 2,5 mM de oC-D-galactopiranósido de p-nitrofenilo em 100 mM HEPES (ácido Ν-2-hidroxietil-piperazino -N1-2-etano-sulfónico) pH 5, adicionaram-se 500 μΐ da solução do conjugado do enzima a determinar. O preparado de ensaio foi incubado a 37QC e passados 6 minutos a reacção foi parada com 500 μΐ de uma solução 0,4 M de glicina, pH 10,8. Em seguida rea lizou-se a determinação do p-nitrofenol libertado por medição da extinção a 405 nm.

Resultados: O conjugado apresentou uma actividade enzimática apenas insigni ficantemente reduzida. D Presença do enzima em plasma humano:

Exemplo 15:

Presença de β -D-glucuronidase em plasma humano 22

A 500 μΐ de uma solução 2,5 mM de (3-D--glucuronido de p-nitrofenilo em 100 mM HEPES (ácido Ν-2-hidro-xietil-piperazino-N,-2“etanosulf6nico), pH 7,4, adicionaram-se 500 μΐ de plasma humano. O preparado de ensaio foi incubado a 30QC e passados 30 min. parou-se a reacção com 500 μΐ de uma so lução 0,4 M de glicina, pH 10.8. Em seguida realizou-se a deter minação do p-nitrofenol libertado por medição da extinção a 405 nm.

Resultados;

Nas condições do ensaio não pôde determinar-se qualquer activi-dade enzimãtica para φ -D-glucuronidase.

Exemplo 16:

Presença de oC-D-glactosidase em plasma humano A 500 μΐ de uma solução 2,5 mM de OC-D--galactopiranósido de p-nitrofenilo em 100 mM HEPES (ácido N-2--hidroxietil-piperazino-N'-2-etanosulfónico) pH 7,4, adiciona-ram-se 500 μΐ de plasma humano. O preparado de ensaio foi incubado a 30QC e decorridos 30 min. parou-se a reacção com 500 jul de uma solução 0,4 M de glicina, pH 10,8. Em seguida realizou--se a determinação do p-nitrofenol libertado por medição da extinção a 405 nm.

Resultados:

Nas condições do ensaio não pôde determinar-se qualquer activi-dade enzimática para o(-D-galactosidase. D Efeito antitumõrico in vivo:

Exemplo 17:

Efeito antitumõrico in vivo do sistema precursor de fãrmaco 14--0-glicosilantraciclina . 30 ratos NMRI nu/nu receberam no dia 0, 1 por cada animal, uma inoculação subcutânea de pedaços de tumor 23

humano CoCa 4 com cerca de 5 mm de tamanho. Depois do crescimen to do tecido do tumor humano nos ratos (dia 7-14) cada 6 animais dos grupos a,b,c receberam 5 x 500 pg de conjugado Mak BW 494/ /32-galactosidade, do grupo d receberam 5 x 500 pg de MAk BW 494/32, do grupo e receberam 5 x 500 pg de galactosidade e injectaram-se 5 x 500 pl de PBS em 5 dias consecutivos por via intravenosa.

Nos 59, 69 e 79 dias depois do termo das injecções de MAk BW 4 94/32-galactosidade', MAk BW 494/32, de galactosidase ou de PBS, os ratos dos grupos a, d e e receberam por animal um terço da dose tolerável máxima (MTD) de 14-0-gli-cosil-antraciclina por dia, por injecção intravenosa. Os ratos do grupo b receberam cada um 1/10 da MTD, e os do grupo c receberam 1/20 da MTD nos mesmos dias.

Resultados;

Nos grupos d e e verificou-se um crescimento do tumor, que não se distingue significativamente do do grupo f. Os grupos a, b e c apresentaram uma inibição nítida do crescimento do tumor, ten do sido mais nítidos os efeitos no grupo a.

Foram obtidos resultados comparáveis com os MAk BW 431/26, BW 250/183 no sistema "Xenograft" CoCa4, assim como com os MAk BW 704 no sistema "Xenograft" M21. 24

Claims

REIVINDICAÇÃO Processo para a preparação de um compoís to de fórmula I, assim como dos seus sais com ácidos orgânicos

na qual 12 3 R , R e R , xndependentemente uns dos outros, representam hidrogénio, hidroxi, metoxi, 4 5 6 R , R e R , independentemente uns dos outros, representam hidrogénio, hidroxi, halogéneo, aciloxi alifático com 1 a 8 átomos de carbono, benzoiloxi ou benzoiloxi substituído como por exemplo para-nitrobenzoiloxi, alquiloxi com 1 a 8 átomos de carbono, aliloxi, benziloxi ou benziloxi substituído, te-trahidropiraniloxi, amino, NH-acilo com 1 a 8 átomos de carbono, NH-(9-fluorenilmetoxicarbonilo), morfolino ou morfoli-no substituído, de preferência 3-0-metil-morfolino ou 2-cia-no-morfolino, 7 R representa um hidrato de carbono de formula II

II na qual g R representa metilo, hidroximetilo, aciloximetilo com 1 a 8 átomos de carbono na parte acilo, alquiloximetilo com 1 a 8 átomos de carbono na parte alquilo, benziloximetilo, aliloxi metilo, carboxi, carboximetilo ou carboxialilo, 25

9 10 11 R , R e R , independentemente uns dos outros, representam hidrogénio, hidroxi, aciloxi com 1 a 8 átomos de carbono, ben zoiloxi ou benzoiloxi substituído, tal como para-nitroben-zoiloxi, alquiloxi com 1 a 8 átomos de carbono, aliloxi, benziloxi ou benziloxi substituído, amino, NH-acilo com 1 a 8 átomos de carbono ou NH-(9-fluorenilmetoxicarbonilo), na qual um grupo acilo é um grupo mono, di ou trihalogenoaceti- lo, de preferência tendo como átomos de halogéneo fluor ou clo- 4 5 9 11 ro, exceptuando-se os compostos nos quais R =R =R =R =0-acetilc 6 11 ~ e R =R =hidrogénio na conformação oC-L-desoxifucose, caracterizado por se fazer reagir uma antraciclina de fórmula V

V 1 2 3 4 5 6 - na qual R,R,R,R,R eR tem os significados indicados acima, com um componente hidrato de carbono de fórmula VI

VI na qual 8 R representa metilo, aciloximetileno com 1 a 8 átomos de carbono na parte acilo, alquiloximetileno com 1 a 8 átomos de carbono na parte alquilo, benziloximetileno, aliloximetile- no, carboximetilo, carboxibenzilo ou carboxialquilo, 9 10 11 R , R e R independentemente uns dos outros representam aciloxi com 1 a 8 átomos de carbono, benzoiloxi ou benzoiloxi substituído como por exemplo para-nitrobenzoiloxi, alquilo- 26 ι xi com 1 a 8 átomos de carbono, aliloxi, benziloxi, benzilo xi substituído, NH-acilo ou NH-(9-fluorenilmetoxicarbonilo) e Z representa um grupo dissociável como por exemplo um átomo de halogéneo, um grupo hidroxi, um grupo tri-alquilsililoxi com 1 a 4 átomos de carbono na parte alquilo, um grupo de bloqueio de acilo ligado através de um átomo de oxigénio, ou um tricloroacetimidato ligado através de um átomo de oxi génio, na presença de um promotor e eventualmente de um agente de fixa ção de ácidos e/ou de um agente desidratante, num dissolvente, a uma temperatura compreendida entre -50© até +80©C, com obtenção de um derivado de 14-0-glicosil-antraciclina de fórmula I 1 , li . na qual todos os radicais R ate R mantém os seus significados anteriormente definidos, e por eventualmente se dissociarem nestes compostos os grupos de bloqueio existentes, ou alguns dos grupos de bloqueio, hidroliticamente ou com auxílio de um catalisador apropriado. A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente alemão apresentado em 1 de Fevereiro de 1990, sob o NQ. P 40 02 888.7. Lisboa, 31 de Janeiro de 1991.

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