PT96110A - Metodo para a regulacao da fosforilacao do produto genetico do retinoblastoma humano dependente do ciclo celular - Google Patents

Description

RESEARCH DEVELOPMENT FOUNDATION "MÉTODO PARA REGULAÇÃO DA FOSFORILAÇÃO DO PRODUTO GENÉTICO DO RETINOBLASTOMA HUMANO DEPENDENTE DO CICLO CELULAR" Âmbito da Presente Invenção A presente invenção refere-se a inibição da proliferação celular. Alem disso, a presente invenção refere-se â pre venção e tratamento de cancros e de doenças de proliferação ce lular.

Antecedentes Da Presente Invenção

Privadas dos factores de crescimento, as células em proliferação activa interrompem a sua proliferação na fase Gq do ciclo celular. Inversamente, as células em repouso são induzidas a proliferar quando providas dos factores de crescimen to adequados. A exposição das células em repouso a estímulos de crescimento conduz a alterações quantitativas e qualitativas na expressão de muitos genes específicos e dos seus produtos. Por exemplo, a exposição das células em repouso e factores do crescimento derivados de plaquetas (PDGF)(Wahl, et al., Mo1.Ce11. Βίο1., 9 (1989) 2934 Meisenhelder, et. al., Cell, 57 (1989) 1109 ou a factores do crescimento epidérmico (Wahl et. al. ,' Proc. NatlAcad. Sei. USA,’ '86, (1989) 1568; Margolis, et al., Cell, 57, (1989) 1101 leva â activação da actividade da tirosino-quinase dos seus receptores, a qual pode fosforilar directamente a fosfolipase C. Isto pode, por sua vez, originar outras respostas bioquímicas, tais como o aumento dos iões de -2 cálcio intracelulares, a hidrólise dos fosfoinositidos, a modulação da fosforilação das proteínas e a indução da síntese de novo mARN /'Ver Deuel.' AhriuY ReVY Cell Biol.' 3 (1987) 443 J. Devido ao facto de alguns genes transcripcionalmente activados serem proto-oncogenes, os estudos do controlo da proliferação celular centralizaram-se no isolamento e caracterização de genes semelhantes cuja expressão fosse activada nas primeiras ho ras da resposta proliferativa. (Cochran, e outros Science 226 (1984) 1080; Thompson, et al.Nature: 319 (1986) 374; Lau and Nathans, Proc. Natl. AcadY Sei. (U.SYA.) 84 (1987) 1182; Ryter, Proc. Natl. Acad'. Sei. (U.SYA) 85 (1988) 1487.Também se isolaram diversos genes que se exprimem especificamente no estado de repouso (Schneider. et. al., Cell 14 (1988) 787; Bedard, et. al. , Simmons e Erikson, Mo'l.' Cell. Biol. jí (1989) 1371. A expressão destes genes é reprimida quando se expõe uma célula a um estímulo de crescimento. Deste modo, a regulação descendente de genes específicos também pode ser importante para a resposta mitogênica por remoção dos bloqueios da proliferação celular. O gene do retinoblastoma humano, RBl, ê o protótipo de uma classe de genes na qual se sabe que ambos os alelos são essenciais para o crescimento neoplãsico. O isolamento de RBl permitiu a confirmação a nível molecular da perda do gene no retinoblastoma e nos tumores que lhe estão clinicamente associa dos tais como os osteossarcomas (Friend e outros, Nature, 323 (1986) 643; Fung et al., Science, 236 (1987) 1657; Lee e outros Science, 235 (1987) 1394). Para além disso, análises utilizando a sonda de cADN de RBl e anticorpos para o seu produto genético (Rb) revelaram a perda de RBl num grande número de tumores -3- de adultos, tais como o carcinoma de células pequenas do pulmão (Harbour et. al.,' Science,' 241 (1988) 353; Yokota et al., Oncogene,' 3 (1988) 471) e em tumores da mama (T'Ang, et al., Science, 242 (1988) 263). A importante função de RB1 no contro lo do crescimento neoplãsico tem como suporte o facto de Rb formar uma associação física com as proteínas de transformação doadenovírus ElA(Whyte e outros,' Wature,' 334 (1988) 124), do gran de antígeno T do vírus simiano 40(SV40)(Decaprio et al., Cell, 54, (1988) 275) e da proteína E7 do vírus do Papiloma humano Ti po 16 (Dyson, e outros, Science,' 243 (1988) 934) .

Breve Descrição das Figuras A FiguralA apresenta a imunoprecipitaçio de RB com RB 1-AB 20 por SDS- PAGE. A Figura 1B demonstra a análise do estado estacionário de RB por citometria de fluxo. A Figura 1C representa uma análise SDS-PAGE da degradação de Rb em ensaios por descarga de impulsos. A Figura 2 demonstra a fosforilação de Rb numa célula sob diferentes condições de desenvolvimento. A Figura 3 demonstra a fosforilação de Rb em células HL-60A cuja diferenciação foi induzida por diversos produtos químicos.

Resumo da Presente invenção A inactivação de RB1 encontra-se associada com a tumo-rogênese. É um objecto da presente invenção utilizar a função de Rb para limitar a proliferação celular. Ê um outro objecto da presente invenção proporcionar um método para inibir a proliferação celular nas células que con -4- têm a proteína Rb e que consiste em administrar um composto capaz de inibir a fosforilação do referido Rb nas células em proliferação.

Constitui um outro objecto da presente invenção proporcionar um método para inibir a proliferação celular nas células que contêm a proteína Rb quando o referido composto ê es colhido entre acido retinôico, dimetilsulfoxido, ácido butírico e TGF-B.

Constitui um outro objecto da presente invenção proporcionar um método para evitar a proliferação celular nas células que contêm a proteína Rb que consiste em administrar um composto susceptível de inibir a fosforilação do referido Rb nas células em proliferação.

Constitui ainda um objecto da presente invenção proporcionar um método para evitar a proliferação celular que con siste em administrar um composto escolhido entre ácido retinõi co, dimetilsulfoxido, ácido butírico e TGF-B a células que con têm a proteína Rb. i A activação induzida pelo factor do crescimento da expressão dos genes que têm um efeito positivo no crescimento celular parece ser importante no controlo da proliferação celular. No entanto, a modulação descendente da expressão dos genes que inibem o crescimento celular também pode ser importante na regulação do crescimento. 0 facto da inactivação de RBl se encontrar associado ao desenvolvimento de tumores sugere que es te gene participa no controlo da proliferação celular. A Requerente demonstrou que o Rb recentemente sintetizado nas células nas fases GQ e G1 se encontra sub-fosforilado e que o Rb actual mente sintetizado ê fosforilado em múltiplos sítios apenas nas -5- -5-

cêlulas que se encontram na fronteira C-^/S e na fase S. As observações da Requerente são consistentes com a interpretação de que a forma sub-fosforilada de Rb é a forma activa e que es ta forma de Rb se torna inactiva por fosforilação em vim ou mais sítios críticos antes de se iniciar a síntese do ADN. 0 grande antígeno T de SV40 pode apenas ligar-se e presumivelmente inac-tivar a forma sub-fosforilada de Rb (Ludlow et. al., Cell, 56, (1989) 57). Deste modo, a inactivação de Rb por fosforilação pode ser um fenómeno obrigatório para as células que atravessam a fronteira G^/S. Deste modo, o controlo da proliferação celular pode exercer-se ao nível da inactivação de Rb. Não se encon tra completamente clarificado se a variação observada na abundância de espécies de Rb fosforiladas. ê ou não devida a alterações na actividade da quinase, actividade da fosfatase ou ambas.

Descrição Pormenorizada da Presente Invenção Exemplo 1

Estudou-se a regulação de expressão de Rb nas células sob diversas condições de crescimento.

Sintetizaram-se péptidos que representavam a maior parte das regiões hidrófilas de Rb e utilizaram-se para se imunizar coelhos e ratos Balb/c para a produção de anticorpos po-liclonais e monoclonais. Para a preparação de anticorpos contra Rb, utilizaram-se os péptidos que se sintetizaram de acordo com a sequência das proteínas deduzida a partir da sequência de cADN de RB1, para se imunizarem coelhos jovens da Nova Zelândia. Para Rb-l-AB o pêptido utilizado (P4) foi CEEIYLKNKDLDARLFLDHDK (aminoâcidos 322 a 341). Para Rb-l-AB 20 o pêptido utilizado (P5) foi CEGSNPPKPLKKLRF DIEGSDEAD (aminoâcidos 864 a 886). Pa- -6-

ra RB-l-AB Al, o pêptido utilizado (P2) foi CRMQKQKMNDSMDTSNKEEK (aminoãcidos 910 a 928). A Figura 1 (A) demonstra a imunopreci- pitação de Rb com Rb-l-AB 20. Incubou-se uma população aleatô- ria que proliferava activamente de 17Μ-σϋΒ-3 (4 x 10 células) em meio de Eagles Modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 5% de soro de feto de vitela dialisado (FCS) sem metionina (pistas 1 e 2) ou fosfato (pista 3) durante 1 hora e depois marcaram-se com 1 ml de DMEM + soro de feto de vitela dialisado a 5% (FCS) contendo 300 jjCí de L S_7 - metionina (Γ 000 Ci/mmole) (pis- ta 1 e 2) ou 300 ^íCi de /, P J ~ ortofosfato (285 Ci/mg) (pista 3 ) durante 2 horas a 37°C. Depois lavaram-se as células duas vezes com solução salina tamponizada com fosfato (PBS) e- éxtrairam -se as proteínas com 0,5 ml de EBC (tris-HCL 40 mM j£"pH 8,0^7), NaCi 120 mM, NP-40 a 0,5%, 2 ^ig/ml de aprotinina, 2 jug/ml de pe pestatina e 2 ^ag/ml de leupeptina e 100 Jig/ml de fluoreto de fe /-32 ,o. nilmetilsulfonilo a 0 C durante 1 hora. Clarificaram-se os li-sados celulares por centrifugação a 15 000 rpm durante 10 minutos a 4°C. Incubou-se o sobrenadante com 5-10 jil de anti-soro de Rbl-AB (pistas 1 e 3), ou incubou-se previamente com 100 ^ag do pêptido P^, a 4°C durante 2 horas (pista 2). Recolheu-se o complexo imunologico sobre proteína A-agarose (Calbiochem) e la vou-se 5 vezes com EBC. Eluiram-se as proteínas imunoprecipita-das por aquecimento durante 1 minuto a 90°C, em tampão de amostra (Tris-HCl 62,5 mM) (pH 6,8), ρ-mercaptoetanol a 5%, SDS a 2,3%, glicerol a 10% e azul de bromofenol a 0,001%) e separaram -se por analise SDS-PAGE. Fixou-se o gel e expôs-se a uma película de raios X. A Figura 1 B representa a analise do nível de estado fixo de Rb por citometria de fluxo. Efectuou-se uma suspensão -7-. das células HL-60 que proliferavam de modo exponencial (2 x 10 ) em 0,1 ml de PBS a 4°C e fixaram-se adicionando 0,9 ml de metanol arrefecido â temperatura de 80°C. Efectuou-se uma nova suspensão das células fixadas a 4°C em 120 jlI de PBS-NGS (PBS a 50% soro normal de cabra a 50%, Triton X-100 a 0,002% e 10 jí\ de Rb-l-AB 20).

Incubou-se a suspensão durante 1,5 horas a 37°C mexendo periodicamente. Arrefeceu-se a suspensão em gelo durante 2 minutos e depois adicionou-se 150 ^al de PBS. Incubaram-se as células durante 30 minutos a 4°c com agitação periódica. Para se efectuar uma coloração secundária, efectuou-se uma nova suspensão das células em 195 ^il de PBS-NGS e 5 jil de FITC-GAR (anticorpo da cabra para a IgG do coelho conjugado com isotiociana to de fluoresceína). Incubou-se a suspensão durante 1 hora a 37°C, arrefeceu-se durante 2 minutos em gelo e depois adicionou -se 150 jil de PBS-NGS. Repetiu-se este passo de lavagem uma vez e depois trataram-se as células com RNase A (5 ^ig/ml) durante 30 minutos a 37°C. Finalmente, coraram-se as células com iodeto de propídio (5 jiq/jil) e analisaram-se por citometria de fluxo. Efectuou-se a citometria de fluxo utilizando um citõmetro de fluxo laser de iões de ãrgon (Profile Model, Coulter Electronics) A excitação foi efectuada a 488 nm. Captou-se a emissão verde com um fotomultímetro equipado com um filtro de passagem da faixa de 525 nm para se medir o teor de Rb e captou-se a fluorescência vermelha com um fotomultímetro equipado com um filtro de * 4 passagem longa a 610 nm. Verificaram-se estes casos (2 x 10 ) a um caudal de amostra de 10 ^il/minuto.

Os histogramas de variação unilateral indicaram a distribuição do numero relativo de células (eixo vertical) em fun- -8- ção de Rb celular ou do teor de ADN (eixo horizontal). 0 teor de Rb versus o teor de ADN ê representado sob a forma de um diagrama de densidade de pontos. As fases do ciclo celular en-contram-se indicadas no diagrama. A Figura 1C representa a medição de degradação de Rb por ensaios de descarga de impulsos. Marcaram-se as células SW613 por impulsos tal como se descre-veu anteriormente com 300 jiCi de £ SJ7-metionina (1000 Ci/ jxmole) durante 90 minutos e colocaram-se em RPM1640 mais FCS a 10% durante 22 horas. Extraíram-se as amostras de proteína RB replicadas, imunoprecipitaram-se e separaram-se por SDS-PAGE, tal como se descreveu anteriormente com intervalos de duas horas durante o período de descarga.

Exemplo 2 A regulação da fosforilação de Rb nas células sob diferentes condições de desenvolvimento encontra-se indicada na Figura 2. Desenvolveu-se uma população aleatória de VM-CUB-3, que se desenvolvia activamente, na ausência de soro em meio RPML 1640 durante 4 dias. Durante esses 4 dias, marcaram-se as células com 300 ^aCi de £ $>£ - metionina (1000 Ci/mmole) . Ex traiu-se a proteína Rb e imunoprecipitou-se decorrridas 0 (Figu ra 2A, pista 1), 24 (Figura 2A, pista 2), 48 (Figura 2A, pista 3), 72 (Figura 2A, pista 4) e 96 horas (Figura 2A, pista 7) e analisaram-se as amostras, tal como se descreveu anteriormente.

Exemplo 3

Tornaram-se quiescentes células SW613 por insuficien cia de soro durante 2 dias e estimularam-se para se desenvolve rem enriquecendo o meio com soro de feto de vitela a 10%. Após -9- -9-

ter-se adicionado o soro âs células, mediu-se a síntese de ADN em intervalos regulares, por captação de £ Hl^J-timidina, tal como i descrito por Macher e outros, Exp.CeTl Pies., 117 (1978) 95). Em cada um dos intervalos marcaram-se células de culturas -"*35 em duplicado com ^ S J^-metionina, tal como se descreveu no Exemplo IA. Para se analisar de um modo mais preciso a altura em que se deu início â fosforilação múltipla, sincronizaram-se as células por insuficiência de soro e imobilizaram-se na fron teira G^/S por tratamento com afidicolina (5ng/ml) durante 24 horas (Figura 2C, pista 13). Decorridas 24 horas de tratamento, marcaram-se estas células durante 2 horas com 300jpCi de £ §7“ -metionina (1000 Ci/mmole) na presença de afidicolina e analisaram-se tal como se descreveu no Exemplo IA. Os resultados en contram-se indicados na Figura 2C (pista 1, fase GQ; pista 2, idêntica â pista 1 com excepçio de se ter incubado previamente o anti-soro Rbl-AB20 a 4°C durante 2 horas com 100 jig do pépti-do P5; pistas 3 e 4, início da fase G-^; pista 5, última parte da fase G, início da fase S; pistas 6 a 10, fases S; pistas 11 e 12, fases + M; pista 13, fronteira G^/S; pista 14 idêntica â pista 13 com excepção de se ter incubado previamente Rbl--AB-20 a 4°C durante 2 horas com 100 jig de péptido P5.

Exemplo 4 A Figura 3 demonstra a fosforilação de Rb nas células HL-60A induzidas para se diferenciarem de modo terminal por diversos produtos químicos. (A) Tratou-se uma população aleatõ ria de células HL-60A em proliferação exponencial em RPM1 1640, FCS a 10% com 5 X 10 6RA (.0) ou com 1,25% de DMSO (Yen et. al. Exp. Ce11 Pes., 168, (1987) 247 durante períodos diferentes. -10

Contou-se o numero de células no momento zero e com intervalos de 24 horas. Os resultados encontram-se indicados na Figura 3A. A amostra de controlo nio tratada ê indicada por X, as amostras tratadas com RA são indicadas por o e as amostras de DSMO por +.

Exemplo 5

Marcou-se uma cultura em duplicado de células HL-60A 35 do Exemplo 3 com 3Q0JjCí de £ S j-metionina (1000 Ci/mmole) e analisou-se tal como se descreveu no Exemplo IA. Trataram-se —6

as células com 5 X 10 M de RA (pistas 1 a 6), 1,25% de DMSO -3 (pistas 7 a 9) ou com 4 X 10 M de BA (pista 10). A marcaçao. metabólica das células efectuou-se no ponto O (pista 1), 12 ho ras (pista 2), 24 horas (pista 3), 48 horas (pista 4) 72 horas (pista 5), 96 horas (pista 6), 12 horas (pista 7), 24 horas (pista 8), 96 horas (pista 9) e 96 horas (pista 10). As setas referem-se a éspecies de Rb de cerca de 98 KD que parecem ser reprodutíveis em células tratadas com os produtos químicos anteriores durante 96 horas. (C) Isolaram-se células HL-60 nas fases Gq e G1 por elutriação centrífuga a partir de uma população celular em pro liferação activa. Efectuou-se a elutriação centrífuga numa cen trifugadora Beckman J21-C com um rotor JE-6 que continha um compartimento de 40 ml. Colocaram-se no compartimento 10 cêlu las. Conservou-se a velocidade do rotor a 2000 rpm e aumentou--se o caudal desde um caudal inicial de 11,5 ml/minuto até um caudal final de 29 ml/minuto aumentando por 12 vezes. Recolheram-se as células nas fases Gq e G^ a 14,3 ml/minuto e observou-se o seu tamanho através do microscópio. Desenvolveram-se -li

as culturas em duplicado das amostras recolhidas em RPMl 1640 mais FCS a 10% na presença (X) ou na ausência (O) de 5 x 10 M de RA durante 48 horas. Mediu-se a síntese do ADN por incorpo-ração de £ H^-timidina tal como é descrito por Ludlow et. al., Cell, 56_ (1989) 57.

Exemplo 6

Tomou-se uma pequena amostra em cada um dos intervalos de tempo do Exemplo 5 para se analisar quanto â diferencia ção celular por incorporação de NBT tal como é descrito por Collins et, al., Int J„ Câncer, 25 (1980) 213. Os resultados encontram-se indicados na Figura 3D. As células que se mostraram positivas em relação a NBT exprimiram-se como uma percenta gem do numero total de células contadas, (X), células tratadas por RA; (0), controlo. Utilizaram-se as amostras em duplicado das células HL-60A nas fases Gq e a partir dos ensaios ante riormente descritos, para se analisar a expressão de Rb. Trata ram-se as células recolhidas com RA no ponto 0 e efectuou-se a analise de Rb apõs cerca de 0, 4, 8 e 18 horas. Os resultados encontram-se indicados na Figura 3E. Recolheram-se as células decorridas 2,5 horas (pista 1), 6,5 horas (pista 2), 10,5 horas (pista 3) e 20,5 horas (pista 4) apos a recolha. Uma vez que não. ê possível separar-se as células do início e da parte final da fase G^, algumas células atravessaram a fronteira G^/s durante o período de marcação.

Detectaram-se múltiplas formas de Rb com pesos molecu lares aparentes compreendidos entre 105 e 115 KD, por imunopre cipitação a partir da linha de células de tumores da bexiga hu r* 35 mana VM-CUB-3 marcada com £. S_7-metionina, seguida de elec- -12- troforese sobre gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) (Fig. 1A# pista 1). Não foi possível efectuar a precipitação de uma tal proteína quando se efectuou a absorção prévia de anticorpos com os pêptidos Rb correspondentes (Fig. IA, pista 2). As mar-cações metabólicas com J pJ7"0^tofosfato demonstraram que os polipéptidos de Rb com pesos moleculares aparentes mais elevados estavam mais fortemente fosforilados (Figura IA, pista 3). 0 tratamento das fosfoproteínas com fosfatase ácida da batata, i antes de se efectuar a imunoprecipitação originou o desapareci mento destas espécies de Rb. A coloração imuno-histoquímica de células utilizando estes anticorpos revelou que a localização nuclear de Rb estava de acordo com o descrito (Lee et. al., Na-ture, 329 (1987) 642; Varley et. al., Oncogene,4, (1989) 721) e que a sua forma era previsível a partir da presença de uma faixa de aminoãcidos VRSPKKK (resíduos amino vazios de 609 a 615) que eram uma reminiscência do sinal de translocação nuclear encontrado no grande antígeno T de SV40. (Sao as seguintes as abreviaturas para os resíduos aminoãcidos: A, Ala; C, Cys; D, Asp; Ef Glu; F, Phe; G, Gly; H,

J

His; I, Ile; K, Lys; Lf Leu; M, Met; N, Asn; P, Pro; Q, Gin; R,

Arg; S, Ser; Tf Thr; V, Yal; W, Trp; e Y, Tyr.)

Exemplo 7 A síntese e degradação de Rb é regulada de um modo de pendente do ciclo celular. Mediu-se a quantidade de Rb em estado estacionário em função do ciclo celular. Devido ao facto de osanticorpos policlonais de coelho Rb 1-AB 20, Rb 1-AB 16 e Rb 1-AB-Al detectarem as diversas formas fosforiladas de Rb mediu- -13- -13- i i

-se a quantidade total de Rb nas células. Fixaram-se as células HL-60 de tipo primitivo em proliferação exponencial e coraram-se com Rbl-AB 20 e com o anticorpo secundário de coelho para a imunoglobulina G (IgG) conjugada com fluoresceína. Depois trataram-se as células com ribonuclease A (AKNase A) e co raram-se com iodeto de propídio para se efectuar a quantificação de ADN. Devido ao facto de a emissão da fluoresceína ser de cor verde e a emissão do iodeto de propídio ser vermelha quando as células foram irradiadas a 488 nm, efectuou-se a medição simultânea das intensidades de emissão e por isso do teor de Rb e de ADN por citometria de fluxo (Figura 1B). O teor de Rb por célula aumentou â medida que as células amadureciam progressivamente através das fases G^, S, e + M do criclo celular. As células nas fases + M continham aproximadamente duas vezes mais Rb do que as células que entravam na fase G^. Deste mo do, o teor de Rb de uma célula em proliferação conserva-se sempre no limiar ou acima deste nas fases Gq e G^. Isto seria espe rado. se a velocidade da síntese de Rb excedesse a da sua degradação. Reproduziram-se estes resultados quando se efectuaram os ensaios com Rb 1-AB Al.

Para se verificar a dinâmica da variação de Rb, estudou-se a síntese e a degradação de Rb por imunoprecipitação. Marcou-se por impulsos as células SW613 do tumor da mama humana durante 90 minutos, com £ S^7-metionina e observou-se a velocidade de degradação de Rb marcado (Figura 1C). O rastreio den-sitométrico das intensidades das diversas formas de Rb mostrou que a semi-vida de Rb era de pelo menos 10 horas. Outros investigadores observaram características de semi-vida de Rb semelhantes (Whyte, et al.Nature, 334, (1988) 124; Xu, et al., -14- -14-

Oncogene,4 (1989) 807). A síntese de Rb como uma função do ciclo celular em SW613 e VM-CUB-3 encontra-se indicada na Figura 2. Dois ou tres dias apôs a retirada de soro, cessou a proliferação das células de crescimento exponencial. O numero de células permaneceu constante e não ocorreu síntese de ADN durante os cinco dias se guintes. Quando estas células entraram na fase proliferativa por adição de soro ou de EGF mais insulina e transferrina sozinha, atravessaram de modo síncrono o ciclo celular. Impulsio-naram-se estas células com £ S^-metionina em intervalos de tempo regulares e imunoprecipitou-se Rb para analise. Nestas condições, descobriu-se que Rb era sintetizado no estado quies-cente (Figura 2A, pistas 1 a 5, Figura 2B, pista 1), assim como nas fases proliferativas (Figura 2B, pistas 3 a 13). O facto de Rb ser estável e de ser constantemente sintetizado é consistente com a acumulação em estado estacionário observada para a pro teína â medida que o volume celular aumenta. A incapacidade da célula para modular de modo descendente o seu teor de Rb sugere que devem existir outras vias de regulação da actividade desta proteína. No estado quiescente, as células têm apenas uma única espécie de Rb subfosforilado com um peso molecular aparente de 105KD (Fig. 2A, pistas 3 a 5, Fig. 2B, pista 1). Apôs reintrodução do soro, as células sincronizadas atravessaram o ciclo celular exibindo ainda apenas a forma subfosforilada de Rb no início da fase G^ (Fig. 2B, pistas 3 e 4). No entanto, as células na fronteira G^/S e na fase S (Fig. 2B, pistas 5 a 10) readquiriram a capacidade de produzirem novo Rb multiplamente fosforilado. Do anteriormente exposto, verifica-se que a síntese do ADN não. é necessária para as células pro duzirem Rb multiplamente fosforilado. As células imobilizadas na fronteira G^/S com afidicolina durante 24 horas eram perfei tamente capazes de produzir e conservar o novo Rb sintetizado no seu estado multiplamente fosforilado (Fig. 2B, pista 13).

Na fase + M, as formas subfosforiladas de Rb tornam-se nova mente mais proeminentes (Fig. 2B, pistas 11 e 12). No entanto, as células imobilizadas na fase M com 3-(1-anilinoetilideno)-5-benzilpirrolidina-2,4-diona (WAKO Chemicals U.S.A., Inc) ainda exibiam mais do que uma forma de Rb. O facto de Rb se tornar fortemente fosforilado imediatamente an tes do inicio da síntese da ADN sugere uma possível correlação entre o estado de fosforilação de Rb e do controlo da proliferação celular. 0 efeito das condições de crescimento anormais impostas pela insuficiência de soro sobre as características de fosforilação foi comparado com as características de fosforilação de Rb em células induzidas a efectuar uma diferenciação terminal. Podem induzir-se as células HL-60 para se diferenciarem de modo terminal aò longo de diferentes linhagens por tratamento com diversos produtos químicos. 0 tratamento com ácido retinõi-co (RA) ou com dimetilsulfõxido (DMSQ) induz a diferenciação mi elocítica, enquanto o tratamento com 1,25-di-hidroxivitamina D3 e com 12-0-tetradecanoil-forbol-13-acetato (TPA) induziu a diferenciação monocítica. 0 processo de indução ocorre geralmente apõs um período correspondente a dois ciclos celulares (Yen, et al., Leukemia Res.,' '10, (1986) 619. No primeiro ciclo celular as células expostas a indutores desenvolvem um estado de pré-re clusão. A exposição de HL-60A a um indutor durante um único ciclo celular ê suficiente para despoletar a paragem das células -16 e dar início à diferenciação. A relação de afinidade entre o controlo da proliferação celular e o estado de fosforilação de Rb foi determinado por tratamento de uma população aleatória de células HL-60A que proliferavam activamente com RA. 0 número de células duplicou nas primeiras 24 horas de tratamento com RA (Fig. 3A). A inibição da proliferação ocorreu depois disso, embora não se observasse qualquer aumento do número de células. Decorridas 12 horas após o tratamento, observou-se a modulação descendente da fosforilação de Rb (Fig. 3B, pistas 2 e 7). Decorridas 24 horas apôs o tratamento com RA ou com DMSO, virtualmente todos os Rb recentemente sintetizados se encontra vam subfosforilados (pistas 3 e 8). ***

No entanto, estes dados só por si não esclarecem facilmente se a alteração nas características de fosforilação de Rb são uma causa ou uma consequência da paragem do crescimento. É possível que o tratamento com RA possa modular de modo descendente directamente o grau de fosforilação de Rb em todas as células conduzindo, deste modo, â paragem do crescimento. Em alternativa a modulação descendente da fosforilação de Rb pode ocorrer apenas num ponto restrito do ciclo celular, por exemplo, nas fases Gq e G^. A modulação descendente da fosforila-çao de Rb no último caso seria por isso um reflexo do facto de as células terem parado o seu crescimento nas fases Gq e G^ e a acumulação observada de Rb subfosforilada após o tratamento com RA poderia representar a chegada gradual das células ao ponto de ...restrição. Tendo em vista esta questão, a Requerente efectuou os seguintes ensaios; em primeiro lugar isolou-se uma população síncrona Gq/G1 de células HL-60A por elutriaçao cen- -17 trífuga. Apôs isolamento, dividiram-se as células em duas porções, uma das quais se tratou com RA. Em intervalos regulares, tomaram-se amostras de células para analise das característi-cas de fosforilação de Rb por imunoprecipitação e por medição da proliferação por absorção de £ H J -timidina. As células HL-60A sincronizadas foram capazes de se desenvolverem na presença de RA durante uma divisão celular antes de se iniciar a paragem do crescimento (Fig.3C). Durante este ciclo, o Rb recentemente sintetizado foi fosforilado â medida que as células se moviam em direcção â fase S, de um modo indistinguível do das células não tratadas (Fig. 3E, pistas 1 a 4). Decorridas 30 horas apôs o tratamento, as células tratadas com RA iniciaram a paragem do crescimento e também perderam a capaci dade para produzirem Rb multiplamente fosforilado (Fig. 3E, pista 5). Uma percentagem significativa de células começou a diferenciar-se tal como se mediu por coloração com nitro-azul de tetrazôlio (NBT) Fig. 3D. Concluiu-se que o tratamento com RA modula indirectamente a fosforilação da proteína. A modulação descendente da fosforilação de Rb recentemente sintetizado está associada â paragem do crescimento induzida por RA. Estas observações também se verificaram com o tratamento das células HL-60A com compostos, tais como TPA, DMSO, ou butirato de sódio (BA); todas elas originaram um análogo decurso de tempo de modulação descendente de fosforilação de Rb (Fig. 3B, pistas 7 a 10), apesar de cada um destes compostos afectar um alvo celu lar diferente. Decorridas 96 horas de tratamento com RA, BA ou DMSO, as células exibiram uma subfosforilação da proteína Rb de 98 KD. Apesar da análise da mancha de Northern revelar um mARN de tamanho normal a origem deste Rb truncado podia dever- -18- -18-

-se â iniciação de transferência num ATG interno. Uma vez que esta espécie de Rb foi observada em células tratadas com diver sos indutores químicos,, pode associar-se o seu aparecimento mais ao estado de paragem de crescimento do que ao estado de diferenciação celular. A fosforilação da proteína do retinoblastoma é muito importante para o controlo da sua actividade. Uma preparação parcialmente purificada de Rb quinase que pode fosforilar a proteína Rb contêm quinase CDC 2 associada com ciclina B. 0 complexo CDC 2/ciclina B fosforila a proteína de Rb in vitro. A maioria dos.sítios de fosforilação que podem ser utilizados por este enzima i'n' vitro também o podem ser' in vivo.

Os sítios de fosforilação na proteína Rb que contêm um motivo S/TPXY em que o símbolo Y pode representar os R, R ou H são reconhecidos pela quinase CDC 2. Existem 11 destes sítios de fosforilação potencial na proteína Rb (Fig. 4f sublinhados) . Alguns deles podem ser importantes para a regulação da actividade, isto é, se estes sítios importantes forem fosforilados, a proteína Rb tornar-se-ã inactiva.

Existem pelo menos duas vias para se efectuar a distinção entre a forma fosforilada da proteína Rb (forma inactiva) e a forma subfosforilada (forma activa) da proteína Rb. Um dos métodos consiste na imunoprecipitação, em que se marcam as células em culturas de tecidos, quer com £ Sj7"metionina quer com P. Depois, extrai-se a proteína Rb e precipita-se por incubação com um anticorpo contra a proteína Rb. A forma subfosforilada da proteína Rb tem um peso molecular (aproximadamente 105 Kilodaltons) menor do que a forma fortemente fosforilada, podendo ser distinguidas por electroforese sobre gel. Uma -19- -19- i

outra via segundo a qual se pode identificar a forma subfos-forilada da proteína Rb consiste na utilização de coloração imuno-histoquímica de cortes de tecidos ou de células em cultura. Os anticorpos contra um péptido não fosforilado que con têm o sítio de fosforilação apenas podem reconhecer a proteína Rb que contém um sítio não fosforilado. Um destes anticorpos, 0S3 é específico para o péptido GSPRTPRRGQNRSAR, a região do péptido Rb que contém o ôítiô potencial de fosforilação de CDC 2 quinase desde o aminoãcido 248 até ao aminoãcido 262 (Fig. 4). 0 anticorpo contra este péptido apenas detecta a for ma subfosforilada da proteína Rb, tal como se indica na Fig. 5, pista 1, se o peso molecular da proteína Rb imunoprecipitada com 0S3 for de cerca de 105 KD. Pelo contrário, um anticorpo OSl, dirigido contra uma outra parte da proteína Rb que não possua sítio de fosforilação, detecta tanto a forma subfosforilada como a forma fortemente fosforilada da proteína Rb, tal como se indica na Figura 5,'pista 2. Alguns sítios de fosforila ção, por exemplo aquele que acabou de se referir, não são aleatoriamente fosforilados, o que significa que a ausência de fosforilação deste sítio se encontra· sempre associada â forma subfosforilada da proteína Rb (forma' activa da proteína Rb). Um anticorpo contra este e/ou outros sítios semelhantes apenas efectuaria a distinção entre a forma fosforilada e a forma subfosforilada da proteína Rb por imunoprecipitação ou por coloração imuno-histoquímica de cortes de tecidos que não fossem de cultura. Os anticorpos lançados contra estes sítios de fosforilação ou a sua vizinhança seriam utilizáveis para estes estu dos, especialmente para estudos de coloração imuno-histoquímica. Estes sítios encontram-se sublinhados na Figura 4. Utili- -20- -20-

zaram-se oligopéptidos de 15 resíduos aminoãcidos ou mais que continham estes sítios para construir os anticorpos específicos do sítio. Muitos reagentes terapêuticos para paragem do crescimento e diferenciação, por exemplo, um interferão (alfa, beta, gama), o factor de necrose de tumor e o factor do crescimento de tumor podem induzir a diferenciação e a paragem do crescimento de muitos tipos de células diferentes, tais como as células leucémicas e tumores solidos. Uma acção comum a es tes fãrmacos consiste na depressão da regulação da fosforila-ção da proteína Rb.

Quando se introduziu o gene Rb em diversos tipos de células de tumores, o crescimento das células foi inibido num ou em poucos ciclos celulares muitas vezes ao nível da célula individual. Estes dados sugerem que o efeito anti-proliferatL vo é um efeito intrínseco da proteína Rb. A transfecção conduz essencialmente â produção de uma quantidade excessiva da forma activa da proteína Rb que não pode ser desfosforilada pela célula sendo a presença de uma tal proteína activa suficiente para parar o crescimento celular. Muitos dos agentes terapêuticos conduzem â depressão da regulação da fosforilação da pro teína Rb activando, deste modo, a proteína Rb.

Pode determinar-se a eficácia de um dado regímen de um tratamento com um fãrmaco observando o status de fosforila ção da proteína Rb. Esta verificação ê particularmente útil, uma vez que proporciona um método rápido para se determinar se um determinado fãrmaco ê eficaz na inibição da proliferação de células anormais em células que contêm o gene Rb. Removem--se espécimes de células tumorais durante e apõs o tratamento com o fãrmaco e determina-se o grau de fosforilação da proteí -21-

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na Rb. Pode determinar-se de acordo com diversos métodos se um dado fãrmaco inibin a fosforilação da proteína Rb quando administrado sozinho ou em associação com outros fãrmacos. Pode efectuar-se a biópsia de .células tumorais ou podem ser removidas do paciente e submetidas ao tratamento com um dado fãrmaco ou associação de fãrmacos" iri Vibro. Mede-se a fosfori laçao da proteína Rb por imunoprecipitação e/ou coloração imu no-histoquímica em diversos instantes após o tratamento, para se verificar se se tinha iniciado a fosforilação de Rb. Sè não houver inibição da fosforilação in Vitro, o tratamento não ê adequado para induzir a paragem do crescimento celular. Por outro lado, se o fãrmaco^ inibiu eficazmente a fosforilação da proteína Rb in Vitro, existe uma elevada probabilidade de que o tratamento seja bem sucedido no paciente.

Em alternativa, durante o tratamento do paciente po de efectuar-se biópsias de amostras de tumor e submeter-se essas mesmas amostras a procedimentos de coloração imuno-his-toquímica sem se efectuar uma cultura utilizando anticorpos contra sítios específicos de fosforilação para se verificar a eficácia do tratamento com o fãrmaco e se a regulação descendente de fosforilação da proteína Rb tinha sido induzida. 0 ponto final de qualquer ensaio de eficácia de um tratamento com um fãrmaco seria a determinação da capacidade do fãrmaco em questão para inibir a fosforilação da proteína Rb nos sítios importantes. i

Claims (7)

1. -22-

   REIVINDICAÇÕES 1. - Método para inibir a proliferação celular em células que contêm a proteína Rb, caracterizado .por se administrar uma quantidade eficaz de um composto susceptível de inibir a fosforilação da referida Rb relativa às células proliferativas.
2. 2. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido composto ser seleccionado entre o grupo constituído por ácido retinõico, dimetil-sulfóxido, ácido butírico e TGF-B. -23-
3. 3. - Método para evitar a proliferação celular em células que contêm a proteína Rb, caracterizado pelo facto de se ad ministrar um composto susceptível de inibir a fosforilação da referida Rb relativa ãs células proliferativas.
4. 4. - Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o referido composto ser seleccionado entre o grupo constituído por ácido retinóico, dimetil-sulfóxido, ácido butlrico e TGF-B.
5. 5. - Método para. a identificação de fármacos que inibem a proliferação celular, caracterizado pelo facto de se fazer a incubação do referido fãrmaco com células proliferativas que contenham a proteína Rb durante um determinado intervalo de tem po de modo a permitir a fosforilação dessa proteína R^ e por se medir a amplitude da subfosforilação da referida proteína Rb.
6. 6. - Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de o intervalo de tempo ser de 12 horas.
7. 7. - Método, para determinar se uma célula proliferativa se desenvolverá inibida em resposta a um fãrmaco, caracterizado pelo facto de se incubar o referido fãrmaco com células prolife rativas que contenham a proteína Rb durante um determinado intervalo de tempo de modo a permitir a fosforilação dessa proteí na Rb e por se medir a amplitude da subfosforilaçao da referida proteína Rb. Lisboa, 6 de Dezembro de 199.0 í-~-- - · - '*·'-* 1 ·*