PT95688A - Celula que expressa uma n alfa-acetiltransferase alterada e metodo para a producao de uma molecula recombinante contendo um gene aa1 alterado, e de um peptideoao quql falta um terminal amino n alfa-acetilado - Google Patents

Description

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Referincia-Cruzada a. Pedidas de Patente Afins5

Este pedida de patente ê um pedida contirmaçSo-επ*,-parte Ϊ4.344, das Pedidos de Patente das E.U.A. Wos. de Série apresentada em 14 de Dezembro5 1988, s 0//153.361, apresentada em 8 d-e Fevereiro, 1988, cujas conteúdos sSa aqui completamente incorporados como refsrSncia,

Campa ria Inventos 0 inventa é dirigida ao isolamento, purificação? e caracterização de estirpes da levedura? Saccharomyces cerevisiae tendo actividade da Ν'*—acetiltransferase alterada. 0 inventa também inclui os enzimas N^-acetiltransferase alteradas produzidos por essas estirpes.

Pundementas do Invente?s ft aci 1ação terminal em amino constitui uma importante modificação co-translacionai de proteínas de células eucarióticas s procarióticas. Embora d formilo, piruvoilo, a-cetobutirilo, glicosilo, glucuronilo, α-arainoacilo, p-glutamilo, mi ris tu i lo, a acetila sejam grupas de N^-acetilaçSía bem conhecidas? é evidente que a acetilaçKa é a modificação química mais comum do grupo a-NH.-, das proteínas eucarióticas CTsunasawa, S., et aí,, Methods Enzvmol 1õ&s165—17© (1984)% Drisssen, H.P.C., et al» CRC Çrit. Rev» jJioc hem 18?. 281 —325 ( í 98o) 5 . A Nu-acetilaçSo desempenha um papel na translação processamento eucarióticas normais Utald, F., Trends Biochem

Sei. 9s256-257, (1884))« e protege contra a degradação prateai£-ties í Jornvai 1 , H», J . fheor. Bioi ,.· 55.1 — 12 (1975}« Rubensfcein, P·= f. e-t al. „ j« Biol,, Chem» 25411142— 11147 (1878))« Além disso? a

V v £·* y

et al . „ Science 254s 179-186 a taxa de turnover proteico mediada pelo sistema de degradação dependente da ubiquitin depende da presença de um grupo <s-NH0 livre (Hershko, A., st aL, Proc„ Na11, Acad„, Sei. U, S. A» Sis7021“7025 (1984)? Bachmaxr, A„ < 1986)), e esta dependencia indica que a N~'-ace til ação pode desempenhar um papel crucial no turnover proteico iminente.

Depois da descoberta de que uma metade acetilo era o grupo de bloqueio W~terminal da proteína de revestimento do vírus mosaico do tabaco (Narita, !<. , et al.. Biochim. BiQPhys. Ac ta. 28s184-191 <1958)), e peptídeo estimulador do α-melanacito (Harris, J.I., et al.. Biochem J. 71s451-459 (1959)), verificou--se que um grande número de proteínas de vários organismos possui

Biol resíduos acetilados no N terminal (Brown, J.L,

Chem. ií 51609-1014 <1976 )

Brown 5 t-f .L. et al

Biol

Chem 254 ϊ1447-1449 (1979)). Por exemplo, células-L do ratinha e células de ascite de Ehrlich apresentam cerca de 8€?% das susas proteínas solúveis intracelulares Ma—acetiladas (Brown, 3.L., et al., J- Biol. Chem. 251 s 1009-1014 (1976)? Brown, J.L., et al , J._ Biol. Chem. 254s-1447-1449 (1979)). Nos organismos eucarióticos inferiores cerca de 5ΘΧ das proteínas solúveis são acetiladas (Brown, J.L., Int 1. Ccncr. Biochem. Abstr. íInternational Union af BioCheittistry, Canada) Vol. 11,5 90 (1979)). Estes' dados demonstram que o grupo Na~acetilo è um grupo bloqueador muito importante. Foi sugerido que a função biológica deste grupo bloqueador pode ser protegida contra prematuro catabolismo proteico (Jornvall, H», J. Iheor. Biol» 55s1-12 (1975)) e contra degradação proteol í t.ica proteica (Ruhenstein, p« and Deuchler, u., J. Biol. Chem. 254s11142 (1979)). Contudo, em células-L do ratinho essa Na~acetilação não tem, aparsntemente, esta função biológica (Brown, J.L., J. Biol. Chem. 254;1447 <i979)>. 9

•ν V

Embora. não tenha sido avaliada com exactidSo uma função geral evidente para a ΝΏ~aceti1açSo, foram observados alguns efeitos específicos em relação a um pequeno número de proteínas, A deshidrogena.se do g.tutamato específica em relação a NADP não acetilado num mutante de SMeurospora crassa â instável s?m relação ao calor, em contraste com a forma acet.ila.da (Siddig et alJ·. Mol. Bioi. 157% 125 (1980))» Um mutante de Escharichia coli, em que a proteína ribosómica S5 não á acetilada, apresenta termosen-sibilidade (Cum&erlidge, A,8., e Isono, K„, «J. Mol, Bxol« 15 ij 169 ¢1979)). A Ma-acstilaç'lo de dois dos produtos da proteína precu* sora proopiomelanocortina tem um efeito regulador profundo sobre a actividade biológica destes polipeptídeos? a actividade opioide da {Ί-endorfina é completamente suprimida, enquanto que o efeito melanotrópico de α-MSH é aumentada se N'"-acetiΪado (Smyth et al., Nature 2/92252 (1970)? Smyth, D.8. and Zakarian, 3«, Mature 288s615 <1980)? e Samachandran, J, and Li, C.H., Adv, Enzymol. 09=791 (19é7)^“ A actina citoplasmática tanto acetilada como não acetinada das células Drosophila de cultura participam na reunião i a^^ntos, esta última, contudo, com menos eficácia

Cffc* HU.Cf D ! J. j.<a***~** * (Berger et. al-a.? Siochem, Benet, 19; 521 (1981)). Mais recentemen-te verificou·"55" que a ^axa dD turnover da proteína mediada pelo sistema de degradação dependente da ubiquitin depende da presença de um αν~Μρο na terminus-M de uma proteína (Hershko et aL,

Proc

Sci‘ υ"5“Α- 81 f902i-9025 (1984) e Bachmair et 234 s '1.79-186 (1986)), sugerindo que a M^-acetilação

Science impedimento do turnover da proteína. . 1 -tí-triHar um papel pode desemperirs·* f 1- ^ ^CL-acetilação é mediada por pelo menos uma Na—acetil- ., aus catalisa a transferência de um arupo acetilo da trans reí ase , n-1 - ^ . ^ima A para o grupo a-WH0- de proteínas s peptídeos» As ciCST-X* u.DsH’'-Α jC.

Na--icptutraos^efases foram préviamente demonstradas em E. coli (Brot» N=>s fígado do rate-

Arch« Biochem. Biophvs. 155£475-477 (1973)), (Pestana, A,, et al., Biochemistry 14s1397—1403

Ν ·

(19/5pestanay η, , et al« ., Biochemistry 14s 1404—1412 (197o); γamada, R·, j~t_,.al..»., lst. Syjgpt3sj.Ugl of the Protsin Society 625s34 (1987))5 cérebro do rato (Q^anohue, T.U, J. Bioi. Chem» 253s2163-2167 (1983)), pituitária, do rato (Woodford, T»A», et âLs.» J«..S..Í5L·_SílÊSL· 254;4993-4999 (1979)? Pease, K.A.* et al.. ν_/'

Arci-u Binchem, Biophys.. 212.5 177-185 (1981); Gembotski, C»C», J». 7nem.

Bi Dl _______________ 257x10501-10509 (1982)? Chappell, W. C.s et aL, J». §l..S.Lz—kb^iíL;- ££Í.51088—1091 ¢1986)), pituitária bovina (Gembotski, C»C», Jj·_MZQ.Ls—Cfiem» 257s 1 ΘοΘ 1 — 10509 (1982)), cristalinas bovinas (Granger, M., et al » Proc. Mati - Acad» Sei» USA 73s3010-314

(1976)5, oviducto de galinha ÍTsunasawa, S st al»» <3

Biochem. 87s645—650 (1980)), i-:·: germe Biochem» Biophvs» 208s95-100 ferases a partir destas font de trigo (Kido, H., et al» , Arch» (1981))» Os enzimas Na-acetiltransis. nunca foram, contudo, purificadas ma is da que 40 vezes» intos

Sumária da Inv A acetilaçSo é a modificação química que ocorre mais frequentemente da grupa a-NH„ de proteínas eucsrióticas e é catalisada por uma . H —acetiltransferase. A purificação até à homegeneidade de uma N^-aceti1transferase a partir de

Saccharcmyces cerevisiae. e a determinação da especificidade do seu substrato (Lee, F-

Lin L~W= and Smith, d»A»» J,

Biol

Uhem» 263s14948-14955 (1988)), permitiu α isalamenta de um cADN cam tada a comprimento codificando esta Na-acetiltransferase da xevedura» Este clone Q6 cAL/N toí submetido a mutscjeness s obteve— -se uma mutação nula (designada 11 asai"). A mutação, embora não letal, leva as células a crescerem lentamente e de um modo heterogéneo» Embora os diplaides aaal/AAAl passam formar quatro esporos inicialmente viáveis, os dois esporos aaa1 no interior do esporangio deram consistentemente origem a pequenas colónias» .- - e" : -.vi aprasen tairi defe.1 tu na esporo- •iveis em relação ao choque fase estac lonária» A mutação Ά1©{Γι C’í I.SiSG Οtv.- QXp ÁO.i.dSS asai / S&i 1açao„ Os mutantes aaal são sí calorifero e não podem entrar r aaal também reduz especificamente as funções de reunião em células do tipo de reunião s:a" r. Estes resultados indicam que a iMa-asstilaçSo constitui unta modificação química importante das proteinas eucarióticas. A disponibilidade deste mutante permite a obtenção de outras mutações5 s tem aplicação na expressão genética? s na d eterraí naçIo da sequtnc ia da prote ina« Em deta1he, o invento praporciona uma célula que expressa uma N“'—acetiltransferase alterada» Numa apresentação* o inventa refere-se a uma célula da levedura que expressa uma Nw~acetiltransferases e particularments a uma célula da levedura tendo uma mutação no gene Aftfii» De especial interesse para o invento sao mucaçwas do gene Ar^n.1 que xevam a que a célula apresente uma substancial falta de actividade da N^-acetiltrans-ferase» 0 invento também se refere a uma molécula recombinante contendo um gene AAh1 alterado» 0 invento também se refere a um método para produzir um peptideo ou proteina a que falta um terminus ami.no N®—acetilado que compreende a expressão do peptideo ou proteina numa célula de levedura tendo um gene Aftft 1em que o gene contem uma mutação resultando numa substancial perda de actividade do produto do gene AAA1» e que torna a célula incapaz de catalisar a N^-aceti-lação do peptideo ou da proteina» .. V*L Ν Ο invento também se refere a um método para determinar a sequência de amino ácidos tíe um peptídeo que compreendes a» expressão do peptídeo numa célula de levedura tenda um gene AAAi== em que o gene contém uma mutação resultando em pertia substancial de actividade do produto da gene AAAi, e torna a célula incapaz de catalisar a Na~acetilaç2o dos peptídeos? b. recuperação do peptídeos e c» determinação da ssqu'§ncia de amino ácidos do peptídeo» Descricão Resumida das Figurass AAAI sua A Figura i indica a sequência dos amino ácidos de da N^-acetiltransferase de Saccbarpmycgs- cerevisiaes a sequincia cADN» A Figura 2 indica um mapa de restricção do gene AAAí» <a> indica o comprimento total do clone AftAl <pBN9> (linha escura á cADW? linha tracejada fragmento 3 HindiII de p mento hisB-URA3-hisS 3»3 è Bluescript)^ (b> a eliminação BM9 (pBHN9)? e (c) a inserção do f kfa no sítio EcoRV de p'BNH9 ípBNHU9) » do raq- A Figura 3 indica a sensibilidade ao choque de calor das estirpes aaal» As células são feitas crescer atá à última fase log em meio- YDP» diluídas em: meio SD,, e incubadas a 54°C„ a percentagem de sobrevivência- foi determinada, em cada tempo indicado. Os genotipos das estirpes são indicados no Quadro 2»

Descricão das Apresentações Preferidas;·, A Ma~acetil transferase de Saccharomvces cerevisiae foi purificada até homogeneidade aparente <4.6©θ vezes) e caracteri-zada como uma proteína dimérica* cuja subunidade H era de Γ 95,000, e que transferia efectivamente um grupo acetilo para vários substratos pep-tidicos dismutase superóxido humana levedura (1—24) (Lee, et -14955 (1988), Requerimentos da Θ7/284.344, e Φ/Ζιόο»361, cujas sintéticos (incluindo ACTH (í—24), (1-24), e d es h i d rogsn a se do álcool da al», 3» Biol» Chem» 263s14948-Patentes dos E»U»A» Séries Wds = referências são aqui incorporadas como referiTicia)»

Além dxsso, foi demonstrado que este enzima não transfere um grupo acetxlo para o grupo 6~ami.no de residuos iisilo em várias substratos peptídicos e histonas» 0 enzima Na-acetiltrans— fersse é codificado por um ánico qene (AAAi, amxno-terminal *:-amino, acetiitransferass) que se' encontra localizado no cromossoma IV de Saccharoi»vcac csrsyisiae. A purificação do enzima Mu~acetiltransferase permitiu a elucidação desta sequência de amlno ácidos» Esta elucidação permitiu a identificação e ca o enzima na levedura» ft uma investigação da função na síntese e degradação da clonaqem da sequ'i'ncia cADN que codifιοί onagem de cADN da levedura permite biológica e regulação da Na-acstilaçla proteina eucarióticas.

Específicamente, a disponibilidade desta molécula de cADN permite a construção de alelos de mutantes do gene da N^-aceti ltransfera.se de Bacc harotnyces cerevisiae» e a introdução desses alelos alterados na levedura e células de plantas a fim de produzir células que expressem enzimas Nu-acetiltransferase alterados» A construção e utilização desses mutantes é descrita por Lee, F»~3», Lin, L»~W» and Smith, J»A», 3» Bacteriol» 171 (11) (Novembro 1989), cuja referência é aqui incorporada como referência»

Um aspecto do presente invento refere-se assim a Sacc.haromvçss^^ e a estirpes de plantas tendo actividade tal como ê aqui usada, da N^-acetHtransferase alterada, expressão “alterada11 pretende referir-se a uma comparação entre as características das actividades de M--acet.il transferase do presente invento e as do-enzima normal (isto é não mutante ou do 11 tipo selvagem11 de Saccharomvces cerevisiag» Métodos para. o isolamento, purificação e ensaio da W*-acetiltransferase normal de Saccharomvces eerevisiae» e as características deste enzima (isto é especificidade do substrato, actiyxdade especifica, estabilidade, etc») são descritos nos Requerimentos da Patente dos E„U»A» Nos» 07/284.344, e 07/Í53.361, cujas referências são aqui incorporadas como referência»

As actividades da N^—acetiltransferase alteradas do presente invento podem ter, por exemplo, uma actividade especifica inferior (unidades de actividade por unidade de peso) à encontrada em células normais» Por exemplo, uma mutação “nula" (tal como a mutação aaal discutida mais abaixo) pode ser produzida e usada para construir urna célula a. cuja Ntí-acetiltransferase falte substancialmente toda a actividade da N*'—acetiltransferase associada â proteína normal. Quando uro tal aielo é introduzido numa célula de levedura, características celulares básicas tais como sensibilidade a temperaturas elevadas, passagem para a fase estacionária, e funções de reunião são afectatias» Este resultado indica que a N®-acetilaçâo constitui uma modificação química importante de proteínas aucariéticas a afecta várias funções biológicas não afins em células eucarióticas» estirpes de 0 presente invento também inclui Saccharomvces eerevisiae tendo um nível aumentado de Na—acefcil transferase (isto é elevado no que && refere ao nível normal)» 0 inventa inclui ainda estirpes de gaccharorovces eerevisiae tendo actividade da. Nâ-acetiltransferase com características de especificidade, estabilidade alteradas (isto é, não-normais) =. i ·. -X -,- i ·. -X -,- ν,α N ~acs~ 0 presente invento também se refere ao enzima tiltrans-ferase do presente invento, ou às suas variantes, que é "substancialmente· puro" ou que foi "substancialmente purificado”« Tal como são aqui usadas, as expressões "substancialmente pura" ou "substancialmente purificada" pretendem ser equivalentes, e descrever uma Nu~acetiltransferase que se apresente substancial-mente livre da um composto normalmente associada ao enzima, no seu estádio natural, isto é, uma proteína, hidrato de carbono, lipido, etc» A expressão pretende ainda descrever uma Na-acetil-transferasa que é homogénea por um ou mais dos ensaios de pureza ou homogeneidade usados pelos especialistas neste técnica» Por exemplo, uma N^-acetiliransferasé substancialmente pura irá mostrar caracteristicas constantes e reproduzíveis com desvios experimentais padrão para parâmetros tais como os que se seguems peso molecular, técnicas cramatográficas, etc» Contudo, a expressão "substancialments pura”, não pretende excluir misturas artifiçais ou sintéticas do enzima com outros compostos» ft expressão também não pretende excluir a presença de impurezas que não interfiram com a actividade biológica do enzima, e que podem estar presentes, por exemplo, devido a uma purificação incompleta. »

Engenharia Genética da Na~Acetiltrsnsferase A- Sequência da N^-acetiltransferase

Os inventores completaram a clonagem molecular e determinaram a análise sequencial completa de cADN de um gene de et al». dt

Biol N^-acetí 1 transferase sucari6tico (Lee, F—-J»S« 265;14943-14955 (1988), Requerimentos da Patente dos E»U»A» Nos. 07/284.344, e @7/153.361),- A proteina de

V

Í1 iM^-acstiltransferase da levedura é codificada por um quadro de .leitura, aberto tíe 2562 bases e consiste em 854 atai no ácidas» 0 seu peso molecular calculado a partir da sua composição em amino ácidos é de 98 ,· 575 dal tons 5 e este peso molecular está de acorda com a subunidada Í*L, avaliada em 95»Θ0Θ±2»00Θ« A análise da r sequência proteica da proteina natural revelou que era bloqueada termina Intente em N, sendo provável que após a clivagem do resíduo Met N-terminal o penúltimo resídua serilo fosse acilado (possivelmente acetilado)» Embora o encima não seja considerado uma glicoproteina, ele contém 6 sítios putativos de N-glicosi-lação (isto é? sequências Asn-X-Ser (ou Thr}} nos resíduos í2€ϊ~ 1225 181-183, 843-845, 7&2-7Θ4, 781-783, 792-793» A região hidrofí 1 ica, extensa, entre os resíduos 5Θ8 ε 72Θ constitui uma. característica estrutural não usual da molécula, embora não seja claro se esta região desempenha um papel funcional na regulação ou localização do enzima» Uma comparação das sequências de

f*V W-acetiltransferase na. proteína com outras acetiltransferases não revela uma semelhança percentual apreciável entre elas, embora certas sequências curtas tenham uma semelhança superior a 50%„ Estas são regiões possíveis onde as mutações espoeificas em relação ao sítio devem ser introduzidas em tentativas precoces para identificar resíduos envolvidas na catálise» A sequência da N"-aceciltransferase de Baccharomycrersvisiae e do seu cADN é indicada na Figura 1» B» G Bene da IMa-acetiltransferase

Os resultados das hihridiazaçSes do Norte ® Sul indicam que existe um gene que codifica esta· Na-acetíltransfera-se» Contudo, não è claro se a levedura contém ou não ainda, outras «cetiltransfsrases capazes de modificar o grupa a-NHo ProLei·-nas. Além disso, estudas prévios sobre a especi^icidade do

•V

,α substrato da Ν'""'—acetil transferase da levedura · demonstraram elaramente que este enzima não é capaz de dssacetilar grupos €—NH^ em substratos peptídicos ou em histonas , embora tenha sido demonstrada uma acetiltransferes© específica em relação à histona na levedura (Travis, B*H» et al (1984)).

Biol . Chem. 144t*õ-" 1441 0 gene AAAl è localizado no cromossoma IV s é colocada ; numa posição imediatamente adjacente à. sequência ladeadora 5 do gene SIR2» Visto SIR2 e três outros genes SIR não ligados afectarem a repressão trans da transcrição das genes HMR e HML , que estão envolvidos na determinação do tipo de reunião da levedura hapol.if.1e5 não existe uma relação evidente entre a função destes genes e AAAl* A clonagem do gene AAAl da levedura permite que sejam determinados os detalhes moleculares do papel da Ní2-ace til ação na separação e degradação das proteínas eucsrióticas, C. Formação de Mutante e de Alelos alterados da Sequência Genética da N“-acetiltransferase

Variantes da sequência de amino ácidos da N^-acetil-transferase podem ser preparadas introduzindo mutações na sequência d-e cADn da N^-acetiltransferase clonada» Essas variantes incluem, por exemplo, eliminações de, ou inserções ou substituições de, resíduos na sequência de amino ácidos indicada na Figura 1« Pode ser feita, qualquer combinação de eliminação, inserção, & substituição, óbviamente, a não ser que se desejem mutantes nulos, as mutações a serem feitas no ADN codificando a variante não devem colocar a sequência fora do quadro de leitura e de preferência não irão criar regiões complementares que possam Ν - produzir estrutura mARN secundária tver Publicação de requerimento de Patente EP No* 75.444)«

Ao nível genético, estas variantes são habitualmente preparadas por mutagenese de nucleótidos dirigida ao sítio no ADN codificando a variante,, e expressando em seguida o ADN na cultura de células recombinaniss.

Embora o sítio para a introdução de uma variação da sequência de amino ácidos possa ser determinado préviamente, a mutação per se não precisa de ser prédeterminada. Por exemplo, a fim de optimizar a performance de uma mutação num determinado sítio, pode-se realizar uma mutagenese ao acaso no codão ou região alvo sendo as variantes expressas da ΝΛ~acetiltransferase avaliadas em relação à combinação óptima da actividade desejada* Técnicas para realizar mutações de substituição em sítios préde-terminados no ADN tendo uma sequência conhecida são bem conhecidas, por exemplo3 mutagenese específica do sítio. A preparação de uma variante da Na-acetiltransferase de acordo com o que foi aqui dito é de preferência realizada por mutagenese específica em relação, ao sítio de ADN que codifica urna variante preparada préviaments ou uma versão não variante da proteína» A mutagenese especifica em relação ao sitio permite a produção da variantes da N^-acetiltransferase pela utilização de sequências específicas de oligonucleótido que codificam a sequência de ADN da mutação desejada, assim como um número suficiente de nucleótidos adjacentes, a fim de proporcionar uma sequência de prímeros com tamanha e complexidade da sequência suficientes para formar um duplex estável em ambos os lados da junção de eliminação a ser atravessada. Típicamente, é preferido um prímero com cerca de 20 a 25 nucleótidos de comprimento, com cerca de 5 a 10 resíduos em ambos os lados da junção da. sequência a ser alterada. \ - '' ~ . -ίν-ί \

Em geral, a técnica de mutagenese especifica em relação ao sitio è bem conhecida nesta técnica, tal como ê exejnplifiçado por publicaçSes tais coma Adelman et al . DMA 2s 183 <1983), cuja apresentação á aqui incorporada coma referencia.

Como será tomado em consideração, a técnica de mutage-nese especifica em relação ao sítio utiliza um vector fágico que exista sob uma foram tanto de hélice simples como de hélice dupla. Vsctores típicos úteis na mutagénese dirigida ao sítio incluem vectores tais como o elemento fágico Μ13, par exemplo, tal como á indicada por messing, J. et al.5rd C1 eve 1 and Svmp

Macromolecules Recombinant___DNA, Editor A. Wálton, Elsevier,

Amstertíam C1981), cuja apresentação é aqui incorporada como referência. Estes elementos fágicos encontram-se comercialisados e a sua utilização é geralmente bem conhecida pelos especialistas nesta técnica. Alternativamente, vectores plasmídeos que confim uma fase de hélice simples origem de replicação (Vieira et al.„ Heth. Enzvmol. 153s3 (1987)) podem ser utilizados para se obter ADN de hélice simples.

Em geral, a mutagenese dirigida ao sítio de acordo com o que foi aqui dito é realizada obtendo primeiro um vector de hélice simples que inclua na sua sequência uma sequência de ADN que codifique a proteína importante. έ preparado, geralmente siniètícamenie um primero oligonucleétido tendo a desejada sequência com a mutação desejada, por exemplo, pelo método de Crea-et al.. Froc. Natl, Acad. Sei. (USA? 75s5765 (1978). Este prímero é então recozido com o vector contenda sequência proteica com hélice simples, e submetido a enzimas de polimerização do ADN tais como fragmento Klenaw. da polimerass I da E. coli. a fim de completar a síntese da hélice que transporta a mutação. Assim, uma sequência submetida a mutação e a segunda hélice tem a mutação desejada. Este vector heteroduplex é então usado para transformar células apropriadas tais como células JM1CU sendo seleccionados clones qu-s incluem vectores recombinantes tendo o arranjo sequencial com mutação„ a região uepoxs de se ter seleccionado esse clone. proteica que sorrsu mutação pode ser removida e colocada num vector apropriado para produção de proteína» geralmente um vector de expressão do tipo que pode ser utilizado para transformação de um hospedeiro apropriado»

As eliminações na sequ/êneia de amino ácidos variam geral mente entre cerca de i e 30 resíduos,, com maior pref erincia 1 e 1 €' resíduos» e são tipicamente (embora não necessáriamente) contíguas»

As inserções na sequincia de amino ácidos incluem fusões de amino s/ou carboxilo terminal variando de um resídua a polipeptídeos com um comprimento essencialmente não restringido, assim como inserções na intra-sequência de resíduos amino ácidos únicos ou múltiplos» As inserções intrasequinc iais (isto é, inserções no interior da ssqu/encia de codificação completa da iMa---acetiltransf erase) podem variar geral mente entre cerca de i e i0 resíduos, com maior preferincia entre 1 e 5» Um exempip de uma inserção terminal inclui uma fusão de uma sequeπcia assinalada, quer heteróloga quer homóloga em relação à célula hospetíeir0ii a u.m terminus-SM de uma Nffi-aceti 1 transf erase para f*cilitar a secreção de Na-acetiltrans'ferase e(íi· maturação a partir tje hospedeiros recombinantes» de cas 0 terceiro grupo de variantes são aquelas em que pelo menos um resíduo amino ácido na N®—aceti 1 transfera«5e? e ps preferincia, apenas um, foi removido sendo um resíduo diferente inserido no seu luqar» Essas substituições sSo fçs·; i 'te y

ρref·er'ãncia de acordo com o desejado modular finamente as

Quadro Σ que a r ac t e r i s t i c a se seque quando & da Nw-acet.i 1 fcrans— ferase» QUftDRD 1

Resíduo Orioinal SUBSTITUIÇÕES DE AHINO ÁCIDOS Su bs t i t u i c Ses E < em d 1 i f i < Ala q i y 5 ~sr Aro, 1 ys Asn gIn ;his Asp glu Cys eer Bln asn Slu w. s p Gly a 1 a ; pro His \S Si ΓÈ j; g 1 n I le 1 eu 5 V CÃ 1 Leu ile; vai Lys arg § gin; glu Met leu? tyr; ile Phe met ρ leu? tyr Ser i. *— ~ V.3 U Thr 30Γ T rp tyr Tyr trp| phe Vai i 1 e; leu b-Êta realizadas- &.I fc&r ae;a&s substanciais na identidade funcional ou imunológica se 1 eccionando substituições que são menos conservativas do que as do Quadro í, isto é, selsccionando resíduos que diferem maís significativamente no seu efeito sobre a manutenção qa <a) a estrutura da espinha dorsal do polipeptídeo na zona da substituição, por exemplo, com uma configuração plana ou helicoidal 3 (b.) a carga ou hitirafofaicidads da molécula no sítio alvo, ou (c) a massa, da cadeia lateral. As substituições que em geral são esperadas são aquelas em que (a) glicina e/ou .prolina é substituída por outro amino ácido ou eliminada ou inserida? <b) um resíduo hidrofílico, por exemplo, serilo ou treonilo, substitui ou é substituído por um resíduo hidrofóbico, por exemplo, Isucilo, isalaucila, fenilalanilo, valilo, ou alanilost <c) um resíduo cisteina substitui ou è substituído por um outro resíduo? (d), um resíduo tendo uma cadeia lateral elec-tropositiva, por exemplo, lisilo, arginilo, ou histidilo, substitui ou é substituído por um resíduo tendo uma carga electronega-tiva, por exemplo, glutamilo ou. aspar ti lo? ou Ce) um resíduo tendo uma cadeia lateral volumosa, por exemplo, fsnilalanina, substitui ou é su.bstitu.ido por um que não tenha uma tal cadeia lai_eral, por exemplo, glicina» MSo se espera que a maior parte das eliminações e das inserções, e substituições em particular, produzam alterações radicais nas características da molécula. Contudo, quando é difícil predizer o efeito exacto da substituição, eliminação ou inserção antes da sua realização, qualquer especialista nesta técnica considerará que o efeito irá ser avaliada por ensaias de avaliação de rotina. Por exemplo, é realizada tipicamente uma variação por mutagenese específica em relação ao sítio do ácido nucleico natural que codifica a Na~âceti. 1 transfera.se» expressão da variante ácido nucleico em cultura de células recombinantes, e, facultativamente, purificação a partir da cultura de células. - \ST’

-\V o par exempla, par absorção de imunaafinidade, adsorção numa coluna

Pi anti-N -acetiltransfsrase (para absorver a variante ligando-a a pelo menos um epitopo imunitário restante)= A actividade do lisado de células ou da variante purificada de N^-acetiltransferase é então avaliada num ensaio de avaliação apropriado para a característica desejada,. Por exemplo, uma alteração no caracter imunológico da N^-acetiitransferase alterada, tal como afinidade em relação a um determinado anticorpo, é medida por meio de um imunoensaio da tipo competitivo» Modificações das propriedades dessa proteína tais como oxidação--redução ou. estabilidade térmica, hidrofobicids.de, susceptibili-dade a degradação protsoiitiea ou a tendencia para agregação com veículos ou em multímeros são ensaiadas por métodos bem conhecidos pelos técnicos especializados» A fim de identificar N^-acetiltransferases variantes ás quais falta substancialmente actividade de N^-acetiltransferase? clones da Na-acetiltransferase (isto é activa) podem ser submetidos a mutação, e introduzidos num mutante nulo íaaal)» Visto que a maior parte:· dos transformantes irão então apresentar actividade da N^-acetiltransferase, os clones aos quais falta actividade da N^-acetiltransferase podem ser identificados rápidamente» actividesoe da

De um modo análogo, é possível identificar clones tendo actividade da Nw-acetiltransferase aumentada ou alterada» Os clones com alelo nulo (tendo uma substituição ou. eliminação de 1—10 amino ácidos) podem ser mutagenizados e introduzidos numa célula que seja deficiente em actividade da N^-aceti1transferase (tal coíbo um mutante nulo)» Os clones que, devido a mutagenese receberam uma mutação "correctora" ou. "compensadora" irão, após introdução na célula, espressar

iç —

Na~aceti1transiersse* Esta aetividade pode ser ensaiada 'do modo descrito anteriormente) e podem ser obtidas as variantes alteradas desejadas» a D, A Clonaqem da Gene da N -aceti 1 transferase

Pode utilizar-se qualquer um de uma série de processos para a clonagem do gene da Nw-acet:il transf erase de Sacc haramvces cerevislas. Um desses métodos implica a análise de uma livraria de vector de vai-vém de inserção de cADN (derivada de uma célula que esípressa lMa~acetiI transferase) em relação è presença de uma inserção que contem o gene da M^-acetiltransferase» Essa análise pode ser efectuada por 'transfecção ds células com o vector e em seguida fazendo um ensaio em relação â expressão de N^-acetil-transferase» 0 método preferido para a clonagem deste gene consiste em determinar a. sequência de amino ácidos do enzima N^-acetiltransferase s em usar estas sequências para criar dispositivos capazes de hibridização com cfiDN codificador de N^-acetiltransferase. Para realizar esta tarefa, faz-se a sequência da proteína purificada da Nw-aceti1transferase ou de fragmentas desta proteína (obtida, por exemplo, com brometo de cianogá-nio, ou com proteases tais como papaina, cromotripsina ou tripsi-na (Oike, Y» et al,, J, Biol„ Chem. 257a 9751-9759 (1982)§ Liu, C„ et al., Int. J, Pept. Protein Res» 21s289-215 (1983))= De preferência, essa sequenciaçMo é realizada usando sequenciadores automáticos» Se se sequenciarem peptideos coe mais de lu amino ácidos, a informação sequencial é geralmente suficiente para permitir que se cione um gene tal como o gene para Na-acetil™ transferase»

Uma vez a molécula completa, ou que um ou mais fragmen tos peptídicos apropriado* da molécula, tenha< m) 5100

-X sequenciada(s) s as sequências de ADN capazes de os codificar são examinadas. Porque o código genético é degenerado, pode ser usado mais de um codão para codificar um amino ácido particular íWatson, J.D.j ins Molecular Bioloqv af foe Gene. 3rd Ed., W.A. Benjamin, Inc«, Menlo Park, CA <1977), pp« 356-357). Os fragmentos peptítíicos são analisados para identificar sequências de amino ácidos que podem ser codificados por oligonucleótidos tendo o grau mínimo de degeneração. Isto é de preferência realizado identificando sequências que contêm amino ácidos que são codificados por apenas um único codSo. Embora ocasionalmsnte essas sequências de amino ácidos possam ser codificadas por apenas um único oligonucleótido, frequentemente a sequência de amino ácidos pode ser codificada por qualquer um de um grupo de oligonucleótidos semelhantes. De um modo .importantes embora todos os membros do grupo contenham oligonucleótidos que são capazes de codificar o fragmento peptídico b, assim, contêm potencialmente a mesma sequência de nucleótidos que o gene que codifica o fragmento peptídico, apenas um membro do grupo contem uma sequência de nucleótidos que é idêntica à sequência de nucleótidos deste gene. Porque este membro está presente no grupo, e é capas de hibridi— zar o AON mesmo na presença de outros membros do grupo, é possível utilizar o grupo não fnaccionado de oligonucleótidos do mesmo modo pelo qual se utiliza um único oligonucleótido para clonar α gene que codifica o peptídeo.

De um modo exactamente análogo ao descrito anteriornien— te, pode-se utilizar um oligonucleótido (ou grupo de oligonucleó-tidos) que têm uma sequência de nucleótidos que é complementar da sequência ou grupo de sequências de oligonucleótidos que é capaz de codificar o fragmento peptídico.

Um oligonucleotido, ou grupo de oligonucleótidos aproriatíoís) que é (sejam capaz(es) de codificar um fragmento de gene de Na~acetiltransierase (ou que é complementar desse oligo-tmcleófcxdo, au. desse grupo de Oligonucleótidos) é identificado (usando o processo descrito anterionnsnte), sintetizado, e iixoriaizado, por mexos becn conhsq^jjpçj }-5^ técnica, em relação a ADN ou5 com maior prelerlncia, Uma preparação de cADN derivada de células de levedura que são capazes de expressar sequências genéticas da ίΊ -acetileransferass Técnicas de HibridizsçSo de ácido nucleico são apresentadas por Maniatis, T. st al.. Ins

Molecular Clcsninq, a Laboratorv Hanuai, Cold Spring Harbor, NY (1982), e por Hames,. B.D. and Higgins, S.J., Ins Nucleic Acid Hybridization, a Practical Approach. IRL Press, Washington, DC <1985), cujas referências são aqu.i incorporadas como referência. A fonte de ADN ou de cADN terá de preferência sido enriquecida em relação a sequências de N^-acetiItransferase. Esse enriquecimento pode ser obtido mais fácilmente a partir de cADN obtido extraindo ARM de células cultivadas em condições que são caractsrizadas por expressão de Na-acetiltransferase» Técnicas tais como, ou. semelhantes às descritas ante-riormente permitiram realizar com sucesso a clonagem de genes para deshidregenasas de aldeido humanas <Hsu, L.C. et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8253771-3775 <1985>), fibronectina (Suzuki, S. at al.. EurHol. Biol. Qraan. 3. 4; 2519-2524 (1985)), α gene receptor do estro-gênio humano (Walter, P» et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82s7889-7893 <1985)), aciivador do plasminogénio do tipo tissular íPennica» D. st al. . Nature 3€?1 s214-221 <1983)) e ADN complementar da fosfatase alcalina da placenta de termo humana (Kam, W- et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8258715-8719 <1985)).

Num modo alternativo preferido de clonagem do gene da Nw-acetiltransfersse, é preparada uma livraria de vectores de expressão por clonagem de ADN ou, com maior preferência de cADN,

ò Λ \Λ V a partir de uma célula capaz de expressar a N^-aceti1 transferase num vector de expressão„ A livraria é então analisada em relação a membros capazes de expressar uma proteína que se 1 igtie a um anticorpo anti—M^-aceiiliransferase, e que tenha um sequência de nucleótidos que -seja capaz de codificar polipeptídeos que t‘im a mesma sequência de amíno ácidas como Nu-acstiltransferase ou fragmentos de N^-acetiltransferase. 0 gene da Na—âi_etiltr«nsferase clonado, obtido pelos métodos descritos anteriormente, pode ser ligado de qm modo operatório a um vector de expressão* s introduzido em células bacisrianas, ou eucariófcicas a fim de produzir a proteína de N^-acetiltransferase, Técnicas para essa manipulação são apresentadas por Man ia tis, T. et_aLf supra* e são bem cnhecidos neste campo. par a a N ” -3 c e ti I ~ fontBB. PQr eJiem_ pode «r lsolado a A codificação da. sequência de ADN transferase pode ser derivada de uma série de pio* mARN codificado para Ns-acetiltransferase enzima* riethod sótidos conhe- partir de tecidas de quaisquer espécies oue produzam o usando o método da mancha Northern CAlwine et ai. Enxymol, 68s223-242' ¢1979)), e'dispositivos de oliqonui-·* “ **** *h» ^ marcados. 0 mARN pode ser convertido em cADn oor técnica^ cidas pelos especialistas, neste campo. 0 dispositivo de ADN pode ser marcado com detestávelEsse grupo detestável poda ser qualquer dm grupo apresentando uma propriedade física ou material química detectávsjj _ »a,ios e materiais tfm sido bem desenvolvidos no campo de imurtoene. útsis em geral a maior parte de quaisquer marcadores nesses métodos pode ser aplicada ao presente invento- Partir, . , . “ --ilarmente úxeis sáo grup-os enzimauicamente activos tais como enzim 5 ' ^mas (ver __u.·>6in._ 1^.4o ¢19/0)) , suostratos enzimáticos (

Esoec,

Pat» Britânica 1 >.548*7415 , coenzlmas (ver Patentes dos E.U.A. Mos» 4.23Φ.797 e 4.238=565) e inibidores de enzima (ver Patente dos E.U.A* No» 4-134=,792) s agentes de fluorescência (ver Clin. Chem., 25s355 (1979)? cromófoross agentes de luminescência tais como agentes de quimioluminescência e agentes de bioluminescência (ver Clin. Chsm. 25s512 (1979)}; iigandos específicamente ligáveis? pares intersotuantes próximos? e radioisótopos tais como 1 a * z/7 "Η., '“'"S, WT, iA,JI e —C, Esses marcadores e pares marcadores são detectados tendo como base as suas próprias propriedades físicas (por exemplo, agentes de fluorescência, cromóforos s radioisóto- pos) ou as suas propriedades reactivas ou de ligação (por exemplo, enzimas, substratos, coenzimas e inibidores). Por exemplo, um dispositivo cofactor-marcado pode ser detestado adicionando o enzima em relação ao qual o marcador é um cofactor e um substrato para o enzima. Por exemplo, pode-se usar um enzima que actue sobre um substrato a fim de dar origem a um produto com uma propriedade física mensurável. Exemplos deste último incluem, mas não se limitam a, beta-glicosidase, fosfatase alcalina e peroxi-dase» E, Expressão das Sequências do gene da Na—aceti1transferase

As moléculas de ADM ou de cADN que codificam o enzima Na-acetiltransferase podem ser ligadas de um modo operável a um vector de expressão e introduzidas numa célula hospedeiro para permitir a expressão do enzima Ms-acetiltransferase por essa célula, é referido que duas sequências de ADN (tais como sequên— cia de região promotora e uma sequência de codificação do enzima desejado) são ligadas de um modo operável se a natureza da ligação entre as duas sequências de AON não <i) resultar na introdução de uma mutação deslocada no quadro, (2) interferir com 04 »

a capacidade da. sequência da. região promotora para dirigir a transes· iç=ia da sequência do gene codificador do enzima desejado, ou ícO iutarftít ir com a capacidade da sequênciadα gene do enzima desejado ser transcrita pela sequência da região promotora»

Uma sequencia de ADN codificando Ma-ace t i 11ransferase pode ser recomoinada com vecior A£>N de acordo com técnicas convencionais5 incluindo terminus plano ou em ziguscague para IxgaçdOj digestão &izimatics com restrição para proporcionar termini apropriados, obturação das extremidades coesivas como seja apropriados tratamento com fesfatass alcalina para. evitar reunião indesejável, e ligação com ligases apropriadas. 0 presente invento abrange a expressão do enzima desejado em quaisquer céimas procarióticas ou sucarióticas. Numa apresentação, utiliza-se u.m vector que é capaz de integrar as sequências do gene desejado no cromossoma da célula hospedeira» Células que integraram estávelmente o ADN introduz‘ido nos seus cromossomas podem ser seleccionadas introduzindo também um ou mais marcadores que permitem a selecção ds células hospedeiras que contêm o vector ds expressão» 0 marcador pode proporcionar como complemento uma auxotrofia no hospedeiro (tal como 1 eu.2,, ou. ura.5 g que são marcadores auxotróficos comuns da levedura), resistência biocida, por exemplo, antibióticos, ou metais pesados, tais como cobre, etc» 0 marcador seleccionável do gene pode ser ou. tíirectamsnte ligado às sequências do gene do ADN a ser expresso, ou introduzido rsa mesma célula por co-transfecçSo»

Numa apresentação preferida, a sequência introduzida irá ser incorporada num plasmídeo ou vector virai capaz de replicação autónoma, no hospedeiro recipiente» Pode-se utilizar para esta finalidade qualquer um de uma série de vectores» Factores importantes para a- selecçSo de um piasm.i.deo ou vector

'ν’' - •w/ virai incluems a facilidade com que as células recipientes que contêm o vector podem ser reconhecidas e seleccionadas de entre as células recipientes que nao contêm o vectorp α número de cópias do vector que são desejadas num determinado hospedeiroj e se é desejável que o vector faça (vai—vem) entre células hospedeiras de espécies diferentes. A N^-aceti1transferase do invento pode ser isolada e purificada de acordo com condições convencionais» tais coma extracçMo, precipitação» cromatoqrafia» cronsatografia de afinidade, electroforese, etc, 1« Expressão sm Células procarióticas

Hospedeiros procarióticos preferidos incluem bacterias tais como Ε_»_col iBac i 11 u.s, St reot omyces, Pseudomonas,

Salinonslla, Serratia,, etc» 0 hospedeiro procariótico mais preferido é E. coli» Os hospedeiros bacterianos de particular interesse incluem E»...coli KÍ2 estirpe Ξ94 (ATCC 31446), L·.,.çol_i X1776 (ATCC 31537), E. cdIí W3U0 \F~, lambda”, prototrófico (ATCC 27325)), s outras enterobacterium tais como Saljngnel la typhimurium ou Serratia marcescens, e várias espécies

Pseudomonas» 0 hospedeiro procariótico deve ser compatível com as sequências de rsplicação e de controlo no pl aso ide-o de expressão.

Para expressar o encima desejado numa célula procarió-tica (tal como, por exemplo, E» coli, S- subtilis» Pseudomonas, Streptomyces, etc.), é necessário ligar de um modo opei- ável = sequência de codificação do encima desejado a um promotor proca— riótico funcional. Esses promotores podem ser quer constitutivos quer, com maior, preferência, reguláveis (xsxo é, induza.vel ou desrepressível), Exemplos de promotores constitutivos incluem o

:ís -· . Λ ·. Λ \ *» ν ν- promotor int do bacteriófago & = e o promotor bla do gene β~lacta-mase de pBR-322, etc» Exemplos de promotores procarióticos induzi-veis incluem os principais promotores direitos s esquerdos do bacterióf agi * U Λ ÍPL s PR ) , 05 qal ,i e tac de ετ i~ a colin a a -rtmr*\4·rt**·'£»«: ^r\r-r\ vear-õ· _ 1 7 1 »r* T _ et al„

α-amilase (Ulmanen, I

Bacteriol, 162; 176-182 (1985)) & os promotores er-2S—específicos de B. subtil is ÍOilman, M»Z«;í et a 1 .Sena 32;·; 11-20 (1984) ), os promotores de bacteriéfagos de Bac111us <Grycsan, T = J =„ I n s The Molecular Bioloav of the Baci 111Academic Press, Inc=, NY (1982) )3 e promotores de Streptomyces (Ward? J»M=S et ai-, liol» Sen. Senet» 203s468-478 (1986))= Os promotores procarióticos são revistos por SIick „ B.R., ΐ J Inri„ Microh1 o 1 = 15277-282 <1987)>p Cena ti empo5 Y, (Biochimis 68; 505-516 (1986))5 e Sottesman, S = íAnn» Rev. Genet. 18s415-442 (1984)) = A expressão apropriada numa célula procariótica também requere a. presença de u.m sitio de ligação ao ribosoma para cima da sequtncia codificadora do gene- Esses sítios de ligação ao ribosoma são indicados 5 por exemplo, por Sol d , L= , et al» ,, (Ann = Rev« Microbiol. 35s365-404 (1981>) = A sequtncia de codificação do enzima desejado e um promotor ligado de um modo operável podem ser introduzidos num recipiente célula procariótica ou. eucariótica ou como molécula de ADN de nSo-replicação íou ARM)5 que pode ser ou uma molécula linear ou, com maior preferência., uma. molécula circular cova lente fechada,, Visto que essas moléculas são incapazes de replicação autónoma, a. expressão do enzima desejado pode ocorrer através de expressão transitória da sequtncia introduzida» Alternativamente, pode ocorrer expressão permanente através da integração da sequtncia introduzida no cromossoma hospedeiro,,

Ί7 aí * ΧΠ %

Vectares procarióticos preferidos incluem plasmídeos tais como os capares de repiicação em E* colt (tais como, por exemplo, pBR322s CoIEJ., pSC18í 5 pACYG 184? irvK« Esses plasmídeos são, por exemplo, apresentados por Hiniatis, T=, et_ l?.Sͧ.£yiãr..„Ç.J.OD.iD.9.9...B....i#.i?P.r.ã.tsr.Y..„Manual.j, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982))« Plasmídeos Baci11us incluem pC194, pC221, pT127, etc» Esses plasmídeos são apresentados por Bryczan, T» (Ins The Holecular Bioloqv of the Bacilli, Academic Press, NY (1982), pp. 387-329).·, Plasmídeos -Streptomvces apropria dos inc 1 íiesi ρ 1 d 1 & 1 (Kenda 11 K.J, et ai » iriol= 169s4177-4183 (1987)), e bacteriófagos streptomyces tais como 0031 (Chater, !< = F=, et al. , Ins Sixth International Svfriposiu.m on Actinomycetales Bioloqv„ Akademiai Kaido, Budapesi, Hungary (1986), pp= 45-54)= Os plasmídeos pseudomonas são revistos por John, J*F=, et al », (Rev= Infect. Pis, 8^695-784 (1986)), e Izaki, K» (dpn,. 3» Bacteriol» 33s792-742 (1978))»

Uma vez o vector ou a sequência de ADN contenda os elementos idealizados, preparados para expressão, os elementos idealizados de ADN podem ser introduzidos num hospedeiro apropriado» Podem ser utilizadas várias técnicas, tais como fusão protoplástica, prec ipitáÇãO de fosfato de cálcio, e1ectroporaç ao ou ou t r as têc π i c as convenci DRciiSir Apos a fusão, as células são feitas crescer em tneicHs e eao anal I s a d a· s quanto a actividades apropriadas» A expressão cia sequência rssulta na produção do substrata-aminopeptidase específ ica«

Exoressão em Células Eucariótieas

Os hospedeiros eucarióticos preferidos incluem levedura, fungos (especialmente Aspergi I lus-) = células de mamífera* \ΦΛ && (tais coma? por exempla? células humanas ou de primatas) e células de plantas quer in vivo, qu.er em cultura de tecidos. A espressão do enzima desejada em hospedeiras eucariá-ticos requere a utilização de regiões reguladoras eucarióticas, Essasa regiSes? incluirão? em geral? uma região promotora suficiente para dirigir a iniciação da síntese do ARN» Promotores eucarióticas preferidos incluem a promotor do gene I de metala-tionein do ratinho (Hamer? D.? et al.t 3. Hol. fippi« Bsn. 1_5273-288 (1982))5 o promotor Tl< do vírus Herpes (McKnight? S* ? Cel 1 31 s355-365 (1982))5 o promotor precoce BV4£t (Benoist? C»? et alKiature (London) 29;?:ι3Ô4-31 €? (1981) >5 o promotor do gene qai4 da levedura (Johnston, S.fl», et ah. Proc. Na ti, ficad. Sei. (USA) 79 s6971 -6975 (1982)| Si 1 ver? P«A„ ? st_aL.5 Proc, Hatl« Acad, Sci (USA) 81s5951-5955 (1984)),

Como é amplamente sabida? a translação de mARN eucarió-tico é iniciada no codão que codifica a primeira metionina. Por esta razão? é preferível assegurar que a ligação entre um promotor eucsrióticQ e uma sequência de ADN que codifica o enzima desejada (ou um seu derivada funcional) não contem, quaisquer codoes interferentes que são capazes de codificar uma metionina (isto é? AU8). A presença desses codães resulta ou numa formação de uma proteína de fusão (se o codão AUS se situar no mesmo quadro de leitura que a sequência de ADN de codificação do enzima) ou uma mutação de desvio no quadro (se o codão AUE não se situar no mesmo quadra de leitura que a sequência de codificação do enzima desejado),

a» Expressão η5. Levedura

As células da levedura são hospedeiras preferidos do presente invento= A utilização da levedura proporciona vantagens substanciais pelo facto da levedura poder também apresentar modificações peptídicas pós-translacionais incluindo ylicosila— ção* Pode ser utilizado um certo número de estratégias de ADN recombinante que utilizam sequências promotoras fortes e elevado número de cópias de plasmídeos que podem ser utilizados para produção das proteínas desejadas na levedura» A levedura reconhece sequências leader nos produtos do gene de mamífero clonada e segrega peptírfeos tendo sequências leader (isto é, prépeptídeos)«

Podem ser utilizados quaisquer uns de uma série de sistemas de expressão genética da levedura» Exemplos desses (Botstein., D» Broach, J=R» et

Miami Wntr lo de 2 míc rons da leveda- YCP a YRP q ÍZf*CC. « 5 ou seus conhecidos nssta técn ica Svmp» 1 0 Sf à .·' li 2ϋ5*"^ / 4 (1982)p O i. O 1 oqy of the Yeast , t-cÃHCE' ii Cold Spring Barbor

Laboratoryj, Cold Spring Harbor, NY» ρ„ 445-47Θ (1981 >5 Broach;, J.R.» Cel1 23 s295-204 (1982))= YEP13 é o vector preferido do presente inven to» bípressSo em Células de Mamíferos

As células dos mamíferos proporcionam modificações pós-translacionais âs moléculas proteicas incluindo dobraqem correcta ou glicosilaçlo nos sítios correctos» As células de mamíferos que podem ser úteis como hospedeiros incluem células de -¾ -- -¾ -- seus derivadas. origem fihrohlástiea tais como VERO ou CHO-Κϊ ,

Para um hospedeira mamífera,; existem vários sistemas vectores possíveis disponíveis para a expressão do enzima desejado, Pode—se utilizar uma ampla séria de sequências reguladoras transcricionais e translaciortais, dependendo da natureza do translado- adenovírus, os sinais hospedeiro. Os sinais reguladores transcricionais e nais podem ser derivadas de fontes virais., tais como vírus do papiloma bovino, vírus Simian, etc,, onde reguladores se encontram associados a um gene particular que tem um elevado nível de expressão» Alternativamente, podem ser utilizados promotores de expressão de mamíferos, tais como actina, colagénio, miosina, etc. Podem ser seleccionados sinais reguladores de iniciação transcricional que permitem a repressão ou activação, de modo a que a expressão dos genes possa ser modulada, Apresentam interesse os sinais regulatérios que são sensíveis à temperatura de tal modo que ao variar a temperatura, a expressão pode ser reprimida ou iniciada, ou qua são submetidos a regulação química, por exemplo, metabolito» ou

Para um hospedeiro mamífero, encontram-se disponíveis para expressão vários, sistemas vectores possíveis. Uma classe de vectores utiliza elementos de ADN que proporcionam plasmídeos extracromossómicos de replicação autónoma, derivados de vírus de animais tais como vírus do papiloma bovino, vírus do papiloma, adenovírus, ou vírus SV4Ô. Uma segunda classe de vectores apoia-~se na integração das sequências genéticas desejadas no cromossoma hospedeiro. As células que integraram estávelmente o ADN nos seus cromossomas podem ser ssleccionadas introduzindo também um marcador que permite a selecção de células hospedeiras que contêm o vector de expressão, 0 marcador 'pode proporcionar prototropia a um hospedeiro auxotrópico, resistência biocida, por exemplo antibióticos, ou metais pesados, tais como cobre, etc, 0 marcador seleccionável do gene pode ser ou directamente ligado às "Xi . ;.ν ν..,. sequências de ADN a ser expressas, cu introduzido na mesma célula por catransformaçlo» Elementos adicionais podem também ser necessárias para síntese óptima de mARM. Estes elementos podem incluir sinais de união, assslm como promotores de transcrição, agentes favorecedores, e sinais de terminação. Os vectores de <3 expressão de cADN incorporando esses elementos incluem os descritas por Okayama, H„, Mol. Cell. Siol» 3t28Θ <1983) , e outros. c. Expressão em Células de Plantas A N -acetiltransferase pode ser introduzida numa planta por técnicas da engenharia genética para aumentar a taxa de acetilação» έ sabido que certos herbicidas são inactivados por acetilação. Assim, é possível produzir uma planta que seja mais tolerante em relação ao herbicida. Nesta outra apresentação deste «**/ invento, o gene da M^-acstiltransferase é utilizado para transformar uma planta para aumentar a tolerância herbicida da planta. A região de codificação para um gene da Na-acetiltransferase que pode ser usada neste invento pode ser homóloga ou heteróloga em relação à célula da planta ou planta a ser transformada. ú necessário, contudo, que a codificação dá sequência genética para a N‘3-acetiltransferase seja expressa, e produzida, como uma proteina ou. po.lipept.ideo funcional na célula da planta, resultante. Assim, o invento compreende plantas contendo genes das Na-aceti1transferase homóloga ou da NQ~acetiltransferase heteróloga que expressa o enzima»

Numa apresentação deste invento, a N-*1—acetil transferase compreende uma Na—acetiltransferase da planta que è homóloga em relação à planta a ser transformada. Numa outra apresentação deste invento, a N®-acetiltransferase compreende um enzima que s ser transformada» A1és heterólogo em relação à planta a ser transformada.» Além disso, pode ser usado neste invento ADN de ambos ds ADM e cADN genómico codificando um gene da Ma~acetiltransferase» E ainda, um gene da Nw-acetiltransferase pode ser construído parcialmente de um clone de cftDN e parcialmente de um clone genomico, Além disso, a codificação de ADN para o gene da Nc''-acstil transferase pode compreender porções de várias espécies»

Existe uma série de apresentações abrangidas no conceito amplo do invento» Numa destas apresentações, este invento compreende sequências genéticas quiméricas-.

Ca) uma primeira codificação de sequência genética para uma N -acet.iltransferase a qual após expressão do gene numa determinada célula de planta é funcional para Nw-acetiltransferasep

Cb) uma ou mais sequências, genéticas adicionais ligadas de um modo operável em qualquer um dos lados da região de codificação da Nu-acetiltransferase» Estas sequências genéticas adicionais contêm sequências para promotoríes) ou terminador<es)» As sequências rsguiadoras das plantas podem ser heteróloqas ou homólogas em relação à célula do hospedeiro»

Numa apresentação preferida, o promotor do gene da Mfjt-acetil transferase é usado para expressar a sequência genética quimérica» Outros promotores que podem ser usados na sequência genética incluem promotores nos, ocs, e CaMV» Um promotor de planta eficiente que pode ser usado é um promotor de superprodução da planta. Este promotor em ligação operável com a sequência genética para a Mw~aceti1transferase deve ser capas de promover a expressão da referida Na-aceti1transferase de tal modo que a planta transformada tenha tolerância aumentada a um herbicida. Os promotores de superprodução da planta que podem ser usados neste invento incluem o promotor da pequena subunidade íss) da carboxi-lase ribulDse-1,5-bifosfato a partir ds soja {Berry-Lowe et ai.» J, Molecular and Αοο., Gen»» l.s 483-498 proteína -de ligação a/b da clorofila» (1982))? e o promotor Estes dois promotores d *

SãO conhecidas por serem induzidos pele. luz nas células de plantas eucarióticas (ver? por exemplo? genetic Enqineering ofPlants,an &Jjr.ÍÇ.UJ.ÍyXAÍ....E®E^ê£lfe.Í.lí®s A- Cashmore? Plenum? New York 1983? pages 29-381 Corruzi? B. et ai»? J. of Biol» Chem. 253;'1399 (1983)? e Dunsmuir, P» et al.J. of· Mol. and Applied Genet....·, 2s285 (1983))»

Além disso? expressão da sequência Na-acetiltransferase è leitura correcto com um numa outra apresentação preferida? a genética quimérica compreendendo o gene da ligado de um modo operávsl em quadro de promotor de planta e com uma. sequência de bll ’lâ 1 ri cs secreção do gene. A sequfncia genética quimérica compreendendo um gene de N‘JÍ-acetiltransferase ligado de um modo operável a um promotor da planta? e na aprssentação preferida com as sequências de sinal de secreção? pode ser ligada a um vector de clonagem apropriado» Em geral? são usados piasmídeo ou vectares virais (bacteriofagos) contendo sequências de replicação e de controlo derivadas de espécies compatíveis com as células hospedeiro» 0 vector de clonagem apresentará tipicamente uma origem de replicação? assim como ganes específicos que são capazes de proporcionar marcadores de selecção fenotípiea em células hospedeiro transformadas? tipicamente resistência a antibióticos» Os veetores de transformação podem ser seleceionados por estes marcadores fenotipicos após transformação numa célula hospdsira»

As células hospdeiras que podem ser usadas neste inventa incluem procariotas? incluindo hospdeiras bacterianos tais como E„ coli» 5» t i oh imu r i um e Serratia _marcescens.

Hospedeiros euearióticos tais como leveduras ou funqas filamenta" sos podem também ser usados neste inventa. 0 vectar dâ clonegem e a célula hospedeira transformada com o vector são usados neste invento tipicamente· para aumentar o número de cópias do vector, Com um número de cópias aumentado, os vectores contendo o gene da Na~acetiltransferase podem ser isolados e5 por exemplo, usados para introduzir as sequências genéticas quiméricas nas células das plantas. 0 material genética contido no vector pode ser microinjectado directamente para células da planta pela utilização de micropipetas que transferem mecânicamente o ADN recombinante. 0 material genético pode também ser transferido para a célula da planta usando polietilene glicol que forma um complexo d é fixado pela célula. (1984)).

precipitação com o material genético que (Faszkowski et ah, EMBO J„ 3s2717-22

Numa apresentação alternativa deste invento, o gene da NW"aceti1transferase pode ser introduzido nas células da planta por electroporação. íFromm et al.. "Expressio cg 8enes

Transferred into Monocot and Dicot Flant Cells by í EIectroporátion s " Proc . Nat 1. Acad. Csi. U.S.ft. 82s5B24 (1985)). Nesta técnica, os protoplastos da planta são electroporados na w- presença de plasmideos contendo o elemento idealizado genético da N^-acetiltransferase, Os impulsos eléctricôs de elevada energia de campo permeabilizam reversivelmente as biomembranas permitindo a introdução de plasmideos.Os· protoplastos da planta electropora-da reformam a parede celular, dividem, e formam o calo da planta. A selecção das células ds plantas transformadas com Nu-acetil-transferase expressa pode ser realizada usando os marcadores fenotipicos tal como foi descrito anteriormente. , Λ-s s α \

Um outro método pera introduzir o gene da Na-acetil'" transferase em células de plantas consiste em infectar a céluls da planta com com ftgrotaact.grImn tumefaciens transformada com ° gene da Na~acetiltransferase. Em condições apropriadas conhecidas ne técnica, as células da planta transformadas são feitas cresce*1* para formar rebentos, raízes, e para desenvolver ainda plantas·” As sequências genéticas da N^-acetiltransferase podem ser introduzidas em células de plantas apropriadas, por exemplo, por meio do plasmideo Ti de Aorobacterium tumefaciens. 0 plasmideo Ti é transmitido a células ds plantas por infecção por Aorobacterium tumefaciens e é estávelmente integrado no genoma da planta. íHprsch et......al.,_, P1 ants,11 Science í acad. Sei, U.S.ft» "Inheritance of Functional Foreign 8enes in 33s496-498 ÍÍ984)5 Fraley at al.. Froc. Nat 1 8054803 <1983))=

Os plasmídeos Ti contêm duas regiões essenciais para a produção de células transformadas» Uma delas, chamada ADN de transferência CT DMA), induz a formação de tumor. A outra, chamada região virulenta, é essencial para a formação mas não a manutenção de tumores. A região de ADN de transferência, que faz a transferência do genoma da planta, pode ser aumentada de tamanho pela inserção da sequência genética do enzima sem que a sua capacidade de transferência seja afectada. Por remoção dos genes causadores do tumor de modo a não continuarem a interferir, o plasmideo Ti modificado pode então ser usado como um vector para a transferência dos elementos idealizados para o gene do invento para uma célula de planta apropriada.

Todas as células de plantas que ptidem ser transformadas por Agrobacterium e plantas totais regeneradas a partir de células transformadas podem também ser transformadas de acordo com o invento de modo a produzir plantas totais transformadas que contêm o gene da Nw-acetiltransferase transferido. 36

Existem presentemente dois modos diferentes de transformar células de plantas com Aarofaact&riums (1) co-cultura de ftgrobacteriu.m com protoplastos isolados de cultura, ou (2) transformação de células ou tecidos com Ag robac ter iam» 0 método i15 requere um sistema de cultura estabelecida que permita a cultura de protoplastos e a regeneração da planta a partir de protoplastos de cultura» 0 método íi) requere \a) que as células ou tecidos das plantas passam ser transformados por AqrQbacterium e (b) que as células ou tecidos transformados gQssam ser induzidos para. se regenerarem em plantas totais» No sisteina binário, para ter infseção, slo necessários dois pIee*ideoeí um plaBinideo contendo T-DNA e um piasmídeo vir»

AnA=i tr^nsformacão da célrti , . ura da pianta ou planta, es-sas células de plantas ou plantas transfDrmadas pelQ plasmldeo Ti de modo ao enzima ser expressado, podem Ser selecionadas por meio de um marcador fenotioico acrooriado» c-. . , , , .1,«. cf., upi -«ju. -scss ffiarcaoorss Tenotípxcos incluem, mas não se limitam a, resistfncia ao antibiótico. Outros marcadores fenotipicos são conhecidos na técnica e podefn eer usados neste invento» aria, Latas» Medicaaa. Viana« Citrus» Linum. Qeranium. Nanicot, Daucus» ArabidQQí. is

Iodas as plaFfw5 ra partir das quais os protoplastos podem ser isolados e cultivados para darem origem a plantas regeneradas totais podem ser transfDriT:adas pelo presente invento de modo a serem recuperadas plantas totais que contenham o gene da N«~acetiltransferase. Algumas plantas apropriadas incluem, por exempla, espécies dos géneros f r

Onobrychis, Trifol i.um, Trjqonella. anus»

Urassaca. ί*Γ Ο

Sinaosis 5 Atropa- Ca os ic um,, Da tu ra» Hyoscvamus. Lvcooersion Nicotiana , Sol anum , Petunia , Digital is , Ma _i orana , Cichorium , Hsl lanthus, Lac tucaBromus» Assaraoiis, Antirrhinum,

Hemeroc a 11 i s, Memesia, pelaraoniunu Fanicam, Fennisetum, Ranunculus, Senecio. Salpiqlossis, Cucumis» Browallia, Elycine, Lolium, Zsa, Triticum, Sorqhum, e Datura.

Existe cada vez maior evid'incia de que pràticamente todas as plantas podem ser regeneradas a partir de células ou tecidos em cultura, incluindo mas não se limitando a todas as espécies principais tíe cereais, cana do açúcar, beterraba, algodão5 árvores de fruta e outras árvores, saladas e legumes» Presentemente existe um conhecimento limitado sobre o facto de todas as plantas poderem ser transformadas por Aqrohacterimn.As espécies que são plantas hospedeiras naturais para Aorobacterium podem ser transformáveis in vitro» Ãs plantas monocotiledóneas, e em particular, os cereais e as relvas, não slo hospedeiros naturais para Aarobacterium» Tentativas para as transformar usando Ag robac ter ium não t§’m sido até há pouco coroadas de txito» (Hooyka.s-Van Slogteren et ai. , Nature 511 g765-764 (1984))» Existe actualmente cada vez maior evidencia de que certos- monocotos podem ser transformados por Aarobacterium» Usando novas técnicas experimentais que se tornaram actualmente disponíveis espécies de cereais e de relvas podem ser transformáveis» Béneros de plantas adicionais que podem ser transtorma-dos por Agrobacterium incluem loomoea» Fassif lorá.? Uvçlamen, Malus. Prunus» Rosa, Ru bus, Populus» San ta Ium» AllijáEs LjJJjmLí Narcissus» Arianas, Arachls, Phaseolus» e Pisum» A regeneração da planta a partir de protoplastos de cultura é descrita em Evans et al», "Protoplast Isolation and Culture," em Handbook of Plant Cell Culture 1_% 124-176 CMcMillan -¾ ·\

Publishing Co,? New York, 1983)? M.R. Davey, "Recent Develpments xn thfa Culture and regsneration of Plant Protoplasts,-'‘P-CS&íglasts, 1983 - Lecture Proceeriings? pp, 19-29 CBiríchauser? Basel, 1983)» p,j« Dale, “Protoplast Culture and Plant regenera-tion of Cereais and Other Recalcitrant Crops? "in Frotoplastg. 1983 - Lecture Procsedings? pp« 31-41 (Birkhauser, Basel5 1983)5 £ H, Binding, "Regeneration of Plants? ” in Plant Protoolasts., pp» 21-37 (CRC Press, Boca Raton, 1985)« A regeneração varia de espécie para espécie de plantas? mas geralmente è proporcionada em primeiro lugar uma suspensão de protoplastos transformados contendo múltiplas cópias do gene da (λ N —acetiltransfsrase. A formação de embriões pode então ser induzida a partir de suspensões de protoplasto? até ao estádio de amadurecimento e de germinação como embriões naturais, Os meios de cultura conterão geralmente várias amino ácidas e hormonas? tais como auxina e cítoquininas, é também vantajoso adicionar ácido glutãmico e prolina ao meio? especialmente para espécies tais como milho e alfalfa» Rebentos e raízes normalmente desenvolvem-se simultaneamente, A regeneração eficiente irá depender do meio? do genotipo? e da história da cultura. Se estas três variáveis forem controladas? então a regeneração será completamente reproduzível e repetível,

As plantas em maturação completa? feitas crescer a partir das células de plantas transformadas? são caracterizadas a fim de produzirem uma planta reproduzida, A planta reproduzida produz sementes contendo o gene para a Na-acetiltransferase aumentada. Estas sementes podem ser feitas crescer para produzirem plantas que ttm uma taxa aumentada da acatilação. invento relação

As plantas reproduzidas de acordo com este podem ser usadas para desenvolver híbridos tolerantes em

•V ao herbicida» Nwste método, uma 1 inhagem de plantas reproduzidas tolerantes em relação ao herbicida é cruzada com outra linhagem de plantas reproduzzdas a Tlm de produzir o hibrido»

Partes obtzdas a partir da planta regenerada, tais como floress sementas, falhas, ramos, frutos, etc são abrangidas pelo i ri vento contanto que estas partes compreendam as células tolerantes em relação ao nerbicida.» A descendência a varisntesj e mutantes das plantas regeneradas são também incluídos no âmbito deste .invento»

Em plantas diploides, tipicamente um ascendente pode ser transformado pela sequência genética da N^-acetiltransferase e D outro ascendente á do tipo selvagem» Após cruzamento dos ascendentes, os híbridos da primeira geração CF1) irão revelar uma distribuição de 1/2 í\ia~.acsti 1 transfera.se/tipo selvagem?1/2 N^-acetiltransfera.se/tipo selvagem. Estes híbridos de primeira geração C F1) são caracterizados de modo a produzirem híbridas da segunda geração <F2), A distribuição genética dos híbridos F2 é 1/4 Na-acetiltransferase/Nu-acefciltransferase; 1/2 Ns-acetil-transferase/tipo selvagem s i/4 tipo selvagem/tipo selvagem» Os híbridos F2 com a estrutura genética de Na-acetiltransferase/Na--acetiltransferase são escolhidos como as plantas tolerantes em relação ao herbicida»

Tal como é aqui usada, variante descreve alterações fenotípicas que são estáveis e hereditárias, incluindo variação hereditária que é sexualmente transmitida á descendência das plantas, contanto que a variante ainda compreenda uma planta tolerante em relação ao herbicida por meio de taxa aumentada de aeetilação» Também, coma ê aqui usado, mutante descreve variação como um resultado de condições ambientais, tais como radiação, ou como resultada de variação genética em que um traço é transmitido meioticamente de acardc com leis da hereditariedade bem estabelecidas. Contudo? a planta mutante, deve ainda apresentar uma tolerância em relação ao herbicida por meio de taxa aumentada de acetilação de acordo coe o invento. II» Utilização de estirpes do presente invento e suas N^-Aceti1transferases

Tal como foi discutido anteriormente, o presente invento proporciona um meio para produzir enzimas N^-acetiltrans-ferases alterados, e para introduzir sequências genéticas que codificam estes enzimas nos diversas hospedeiros. Células a que falta a actividade da Mu-acetiltransfera-se íisto é que expressam uma N^-acsti1transferase alterada a que falta substancialmente actividade da .N^-acetiltransferase) são altamente desejáveis para facilitar a determinação da sequência de amino ácidos de proteínas. Tal como foi discutido antsriormen-te5 a presença de grupas Na-ecetilo nas amino ácidos das proteínas dificulta grandemente os esforços para determinar a sequência de amino ácidos dessas moléculas. Como uma célula à aual falta actividade da Mu~acetiltransferase não irá catalisar s transferência de grupos acetilo para o terminus amino de Pf"oteinas, uma proteína produzida numa dessas células pode ser rápidamente· sequenciada. Assim, por exemplo, uma célula com uma mutação nula no seu gene da Na-acetiltransfsra.se (tal como a mu.taç§0 aaai^l de pode ser usada para produzir proteínas da levedura endóíjenas a que falta N""~acefciiação. Essas células, por exemplo, podem ser usadas para expressar um,a proteína ou peptídeo recombinante a que falta um grupo acetilQ no qrupo oí-amino da proteína (ou do peptídeo). Essas proteínas podem ser fácilmente sequenciadas utilizando métodos conhecidos.

e3¾¾ usluiâ mutatitte* nu. ser usada como um hospedeiro para a produção de proteínas Iogas (isto é proteínas não natural mente ou. normal mente das por essas células) a fim de facilitar a. elucidação da cia de asiino ácidos dessas proteínas»

De um modo semelhantes la pode heteró- porduzi- sequsn- A capacidade para produzir células mutantes cuja N‘JÍ~acetiltransferase seja mais níveis mais elevados* do que activa , ou seja produzida em N^-aceti 1 trarrsfera.se normal, é desejável quando ΐ>ε prst.&iiOH !'·:>~aceti 1 açaα aumentada.. Tal essas proteínas são desejáveis produzir proteínas apresentando como foi discutido antsriorments, por serem mais estáveis do que as proteínas nau scstxladas» A capacidade para alterar a actividade da N"-aceti 1-transfera.se de acordo coe uma actividade desejada (tal como especificidade do substrato aumentada ou diminuída, estabilidade térmica, etc») é útil para permitir o desenvolvimento de células hospedeiras capazes de produzir proteínas apresentando caracte-rísticas de Nacetilacão alteradas.

Os enzimas N" -~a.eetil transferases alterados podem ser purificados e usados in vibro do mesmo modo que foi descrita anteriormente para células hospedeiras mutantes.

Tendo agora descrito em geral este invento, este último será melhor compreendido tendo como referencia exemplos específicos, que são aqui incluídos tendo finalidades apenas ilustrativas, e que- não pretendem ser limitativos a não ser que especificado de um modo diferente. ?vc>-' EXEMPLO i

CRESCIMENTO DE CÉLULAS DA LEVEDURA

Os meios de cultura da levedura foram preparados, tal. como foi descrito por Sherman et a1„(Sherman» F«5 et al-« Methods ifí Yeast Benetics» Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor , SMY \ 1986>) s YDP continha í% de sxtracto de levedura-Bacio, 2% de peptona—Bacto, s 2% de glucose; YGP continha IX de extracto de levedura-Bacto, 2% de peptona-BactDj s 3% de glice-rol; SD continha 0,7% de base de aso to da levedura. Difco sem amino ácidos e 25 de glucose;·; e agentes nutritivos essenciais para estirpes auxotróficas foram fornecidos em concentrações especificadas (Sherman, F», et al«„ Methods in Yeast genetics, Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1986))» EXEMPLO. 2

ISOLAMENTO, PURIFICAnKO E ENSAIO SE Ng-ftCETILTRANSFEfiftSE

O

Um método preferido para purificar a N '-aceti ltransf e-rase normal ou alterada do presente invento é o de Lee, F,-J»S», et al.., (J „ Biol „ Chem, 263í14948-í4955 (1998), cuja referincia é aqui incorporada integraImante como refertncia). Resumidamente, os métodos isolam f/^-aceti 1transferase tratando células da levedura com liticasa e em seguida homogeneizando os resultantes esferoplastos num tampão b.ipoténico» A Na-acetiltransferase da levedura è libertada a partir do lisado das células por meio de agitação suave- A N -aceti ltransf erase pode ser concentrada, por exemplo por ultrafiltração com membrana ΡΜ-3Θ, e dialisada durante a noite usando, por exemplo, tampão HB8 (HEPES 20 mM--K+, pH 7,4, DTT 0 a ? *-í mM, 1« 9% (v/v> de glicerol e ,02% de NaN_> * contendo KC1 0 o 5 A- Μ, A meia vida das preparações de Na-a.cetil- transferase da levedura pode ser estabilizada pela adição de 1©% de glicerol. A preparação de N‘ íf-aceti ltransf erase pode facul tativa- mente ser residuais ainda purificada por remoção de biomateriais celulares no produto flutuante.» Pode utilizar-se para este cromatografia em BEAE-Sepharose com (KC1 0,2 M) constitui um processa processo a permuta tónica» eluição constante com sal preferido.

Se desejado, a Na-acetiltransferase pode ser ainda purificada reunindo e concentrando fracçSes de pico a partir de cromatografia de permuta iónica, dialisandq com tampão apropriado < tal como tampão HD8 contendo KC1 Θ,tío ti), e carregando numa coluna de resina de permuta iónica (por exemplo, DEAE-Sepharosa> com eluição com um gradaente salino continuo (por exemplo, KC1 0,05 a 0,5M). A reunião de acetiltransferase a partir desta 4¾ ''/> --

coluna pode ser concentradas dialisada e analisada em relação è. actividade da acetil transfera.se»

As fracçSes de pica a partir da coluna da per anu ta iónica podem ser ainda purificadas pela utilização de uma coluna de adsorção usando hidroxilapatite» Como é -sabido nesta técnica, uma coluna de hldroxilapatite irà adsorber selectivamente proteínas para ISes de cálcio sob- a forma de hidroxifosfato de cálcio» A coluna de hidroxilapatite é de preferência eluida com um gradiente linear de sal e as fracçSes activas podem ser identificadas e reunidas»

Se desejado, as fracçSes de pico a partir da coluna de hidroxilapatite podem ser reunidas, concentradas, dialisads com tampão apropriado ítal como tampSo HDS contendo KCl Θ,Θ5 M), e carregadas numa coluna de permuta ióniea, de preferência celulo-SE—D-E52, com um gradiente contínuo de sal»

As fracçSes da pico a partir da coluna· de DE52—celulose podem ser ainda purificadas, se desejado, reunindo as fracçSes rt activas? concentrando a actividade da Ν' -acati 1 transfera.se5 dialisando com tampão apropriado ítal como tampão HD8 contendo KCl 0?©5 M), e aplicando numa coluna de afinidade, tal como

Affi-Slue gel, com uma eluição de gradiente contínuo ds sal ítal como KCl 0,05 a Ι,θ n> = é gerado um único pico de actividade que se centrou a KCl θ,6 M.

Usando estas séries de passos de cromatografia,' a acet.iltransíerase da levedura· pode ser purificada aproximadamente 4,,400 vezes a partir do extraçto celular com um rendimento de 27%,, A actividade da Ns-acetiltransferase pode ser medida como se segues foram preparados lisados crús de levedura, e a actividade da N^-acetiltransferass foi determinada tal como foi préviamente

ή ο

Bio 1. Cheu» .= 263:14948-14955 descri to (Lee =, F~J . S., et ai (1989))« Porções alíquotas do lisado foram adicionadas a tubos de Eppendorí com a,5 ml contendo a mistura da reacção de HEPES 5© mM, pH 7,4, KC1 15© mM, DTT 1 mM, í'"'HJ acetil caenzima A 25 μΜ (©,5 μΟΙ) e ACTH 5© μΜ (1-24) com um volume final ajustado de 1©© μΐ. ft mistura do ensaio foi incubada a 3©':‘C durante 3© minutos» A reacção foi interrompida adicionando ácido acético ©,5 M e arrefecendo num banho de gelo» As amostras da reacção foram filtradas através de discos de membrana SP (Cuno), sendo am seguida lavadas com ácido acético 0,5 M numa máquina para amos parcialmente secas tras de repetição Millipore 1225« As membrana foram colocadas num cocktail de cintilação e contadas com um 38®í« A radioaetividade no dos compostos endógenos é contador de cintilação Beckman LS controlo representando acetilação subtraída de cada determinação de amostra» Uma unidade de activi-tíade é definida como 1 pmol de resíduos de acetila incorporado em ACTH (1-24) em condições de ensaio padrão»

Tal como é aqui usada» a expressão "substancialmerite pura" ou. "substancialmente purificada" pretende descrever Na-ace-tiltransferase que se apresenta substancialmente livre de qualquer composto normalmente associado ao encima no seu estadia

natural, isto é, livre de proteína e de componentes hidratos de carbono» A expressão pretende ainda descrever Ne—acetiItransfera-se que é homogénea em relação a uma ou mais características de pureza ou de homogeneidade usadas pelos especialistas nesta técnica» Por exemplo, uma Na-acetlltransferase substancialmente pura apresentará características constantes e reproduzíveis com desvios experimentais padrão para parâmetros tais como os que se seguem s peso molecular. técnicas de cromatograf ia, e ou.tros parâmetros» A e artificiais ou pressão, contudo, não pretende excluir mistur sintéticas dos enzimas com outros compostos, expressão também não pretende

H cluif a presença de impurezas -6.

.η .* _ w.r\ «* ensima, e que podem estar presentes» por exemplo, devido purificação incompleta» EXEMPLO 3

ESPECIFICIDADE COMPARATIVA DAS N“-ACETItTRANSFERASE

Verificou—se que a mutante aaa. 1 possuis, uma segunda N^-aceti I transf erase até agora não suspeitada» Esta segunda f'V f*i W-acetilrransfsrasE é uma actividade da Ν' -acetil transferase da 11· metionina, e é designada como !in-N”-A! " = Esta segunda Ma-scet transferase é o assunto do Requerimento da Patente dos b»U»ft» de John A» Smith and Fang-Jen S» Lee» registado em 25 de Outubro, 19B95 com o titulo 11 IDENTIFICAÇÃO DA Ne-ACETILTRANSFERASE DA METϊOMINA" que ê aqui incorporado como referência» A fim de comparar a especificidade e a actividade relativas da AAA1 N^-aceti 1 transferase ί”Να-ΑΤ") do presente invento com a activi-dade da N“-acetiltransferase da metionina (!Í~N"~AT) do Requerimento da Patente: dos E.U.A. de John A» Smith and Fang-Jen S» Lee? registado em 25 de Outubro, 1989, com o título "IDENTIFICAÇÃO DA N^-ACETILTRANSFERASE"5 foram preparados peptídeos sintéticos» Estes peptídeos foram avaliados quanto à sua capacidade para servirem como substratos para os dois encimas» Os resultados desta experiência são indicadas nos Quadros 2 a 3» No Quadro 2, é investigado o efeito do amino ácido do amino terminal % no Quadro 3, é investigado o efeito do amino ácido do penúltima amino sobre a actividade»

ftCTIVIDADE RELATIVA DAS ACETILTRANSFERASES ftT-AT E M-N NS-ACETIL.AÇSD DOS PEPTIDE05 SINTÉTICOS; INFLUÊNCIA DO TERMINAL AMIMO

a~AT PARA A RESÍDUO

Substrato

Actividade (%) (aciividade média ± S*D.) N &-AT M - N& ~ AT ACTH (Humano) S—Y-S—M—E—H—F—R—W-S-K—P—V—S-K-K—R—R—P—V-K—V—Y- 1 00+ÍJ00

DESHIDROSENASE I DO ÁLCOOL ti-24) (Levedura) 102+50 S-I-P-E-T-Q-K-e-V-I-F-Y-E-S-H-G-K-L-E-Y-K-D-I-P CA13 DESHIDROGENASE I DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura) 00 A—Ϊ —P—E—T—Q—Κ—Θ—V -1 ~ F—Y—E—3—Η ~· 3 ~ K ~ L ~ E—Y ~ R ~· D— Σ —P CR13 DESHIDROSENASE I DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura) 00 R-I-P-E-T-Q-K-G-V-I-F-Y-E-S-H-S-K-L-E-Y-K-D-I-P

CN~] DESHIDROSENASE I DO ÁLCOOL (1—24) (Levedura) Ν-Σ-Ρ-Ε-Τ-Q-K-G-V-I-F-Y-E-S-H-B-K-L-E-Y-K-D-I-P

CD^ 3 DESHIDROSENASt. I DD ÁLCOOL (1—243 (Levedura) D-I-P-E-T-G--K-S-V-Σ-F-Y-E-S-H-e-K-L-E-Y-K-D-I-P

L-)IA

CC-3 DESHIDHOSeNASE I Du ÁLCOOL (1—24) (Levedura) 00 C~I-P-E-T-G-K-e-V-I—F—Y—E—S—H—G—K—L—E—Y—K—D—I-P CQ *3 DESHIDROSENASt I DO ÁLCOOL (1—24) (Levedura ;! ) 00 -X - -X - δ&.&· k .¾

Q- τ-P-E-TH2-K-6-V-1-F-Y-E-S-H-G-K-L-E-Y-K-D-1~P le13 DEBHIDRDBEWABE I DO ALCODL (1-24) (Levedura) ©Θ E- I -P-E-T-Q-K-G-V- ϊ -F-Y-E-S ·· H · G -K-L-E-Y-K-D-1 -P

CS“3 DESBIDROGEWASE I DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura’ G~ Σ“P—E—T—G~K—G“V—Ι-F-Y-E-S-H-G-K-L-E-Y-K-D-1-P -,,1. . .1 fc> JL « P-I-P-E-T-Q-K—G~v ftlASE Ϊ DO ÁLCOOL (1—24) (Levedura) 00 i-V-í-F- ( ci. d? i i o -K-L-E-Y-K-D-I-P jMASE I DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura) 00 i-V-I-F- Y—È-S-H-G- - K - L - E - Y - K -D -1 -p "ftlASE I DO ÁLCOOL Bi-24 > (Levedura) i 9±2€í i-V-I—F- •Y-E-S-H-G- -K—L—E—Y-K-D—I-P ;nase i DO ÁLCOOL (1-24 > (Levedura) 00 í-V-I-F- •Y-E-S-H-G· -K-L-E-Y-K-D-Σ-P :NAkífc I DO ALCODL ( í -24) < Leved u. ra) í 5±2β 1 —F~ •Y-E-S-H-G- -K-L-E-Y-K-D-Σ-Ρ :nase ς DO ÁLCOOL {1—24 > í Levedura) 9±2ô r-V—I-F- •Y-E-S-H-G- -K—L-E-Y-K-D-Σ —P :?MASE I DO ÁLCOOL (1-24) C Levedura) 7©±40 i-V-I-F- Λ/_|T.^C* ..O .. CL i L. d? í i w -K-L-E-Y-K-D-Σ-P :nase i DO ÁLCOOL (1-24) (Leved u ra) 1Θ3±5β ϊ—V—X—F- -Y-E-S-H-G- -K-L-E-Y-K-D-I-P lBAvSEH. 1 DO ALCODL (i-24 > (Levedura) 0©

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1 DE3HXDR0BENASE I -Ρ-Ε-Τ—Q—K—G—V—ϊ-F

LfO ÁLCOOL (J--24) (L.0v aou_ra) Y -E-S-H-G-K-L-E-V -K-D-1 -P CV1] DESH V-T-P-E-T·

DROGENADE I DO •8-K-G-V-I-F-Y-E

ÁLCOOL <1—24) ÍIÊVEDURA) ~3—H—G—fc.—L—E—Y-k"·!?— I —P

QUADRE

ACTivIDADE RELATIVA DAS ACETILTRAWSFERASES Να-ΑΤ E M-N®-AT PARA A NS-ACETILAÇÃO DOS PEPTIDEOS SINTÉTICOSs INFLUÉSMCIA DO PENÚLTIMO RESÍDUO TERMINAL ΑΜΪΝΟ

Substrato Ãctividade 11) (act I v ida de mád i a ± S«D.) Na-AT M- -Na~AT 10Θ±5 1 ®2±5 ACTH (Huiiicu iD)

S—Y—S—M—E—H—F—R—US—S—K—P—V—S—K—K—R—R—P—V—K—V-Y—P DESHIDRDShNASE I DO ALCUOL (1-24) (Levedura)

S-I-P-E-T-G-K-G-V-I-F-Y-E-S-HH3-K-L-E-Y-K-D-I~P CA2j DESHIDROSENASE I DO ÁLCOOL (í ~24) fa—H— P-E-T-G-K-G—V-I-F- -Y-E-S-H-S-K- L--E- ER2! DE3HIDRQGENASE I DQ ÁLCOOL (1 -24) S-R- P-E-T-Q-K-G-V-I-F- -Y-E-S-H-S-K- L-E-’ 102±5 0 -X . CM"] DESHIDROBENASE I DO ÁLCOOL (1-24) (Levedara) 11615 s-n-p-e-t-g-k-g-v-x-f-y-e-s-h-s-k-l-e-y-k-d-i-p

CD2] DEBH1DROBENASE I DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura) 171±9 S-D-P-E-T-Q-K—G—V—I—F-Y-E-S—H—G-K-L-E-Y-K-D-I-P

CC2J DESHIDROBENASE I DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura) 13617 S-C-P-E-T-G-K-G-V-I-F-Y-E-S-H-G-K-L-E-Y-K-D-I-P

EG23 DESHIDROBENASE I DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura) 134±7 S-Q-P-E- T-Q - K-G-V-1 --F-Y -E-S—H—S-K-L—E—Y -K-D- ϊ -P

CE23 DESHIDROBENASE Γ DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura) 12116 S-E-F-E-T-Q-K-e-v-I-F-Y-E-S-H-G-i<-L~E-Y-K-D-I-P CG"3 DESHIDROBENASE 3 DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura) 8415 ^-G-P-E-T-Q-K-G-V-I -F-Y-E-S-H-G-K—L-E-Y -K-D-

CL~3 DESHIDRDSENASE I DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura) 12615 S-L-P-E-T-Q-K-G-V-I-F-Y-E-S-H-G-K-L-E-Y-K-D-I~P

DESHIDROBENASE I DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura) 12516 S-H-P-E-T-Q-K-G-V-I-F-Y-E-S-H-G-K-L-E-Y-K-D-I-P

Π<"~3 DESHIDROBENASE I DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura) 15116 S-K-P-E-T-G-K-G-V-I-F-Y-E-S-H-8-K-L-E-Y-K-D-I-P

C3 DESHIDROBENASE I DO ÁLCOOL (1-24J (Levedura) 14017 S-M-P-E-T-Q-K-G-V-1-F-Y-E-S-H-G-K-L-E-Y~K-D-1 -P lF"j DESHIDROBENASE I DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura) 118+6 S-F-P-E—T-Q—K-G-V-I-F-Y-E-S-H-B-K-L-E-Y-K-D-I-P "(Si 4Α

' '

CP23 DESBIDRDSENASE I DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura) Θ S-P-P-b-T-Q-K-e-V-1 -F -Y-E-S-H-6-K-L-E-Y-K-D·-1 -P

CS23 DEBHIDRD5ENASE I DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura) 148±é S-S-P-E-T-Q-K-G~V-I-F-Y-E-S-H-G-K-L-E-Y-K-D-I-P

lT~3 DESBIDRDSEMASE I DO ÁLCOOL í1-24) (Levedura) 144+8 S“T“F--€“T-Q-K--B--V~I-F-Y-E-S~H--G"fí:~L"E-Y-K-D-I-P

[Λ DESHIDROBENADE I DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura) 9i±5 8-W-P-E-T-Q-K-e-V-I-F-Y-E-S-H-G-K-L-E-Y-K-D-I-P LY23 DESHIDR06EWASE I DO AALCOOL (1-24) (Levedura)169±8 B-Y-P-E-J-Q-K-G-V-I-F-Y-E-B-H-B-K-L-E-Y-K-D-Ϊ-Ρ 0 lV^3 DEBHIDRDGEHABE 1 DD HÁLCOOL (1-24) (Levedura)123±7 EXEMPLO 4 ROTURA DD GENE AAAÍ

Um fragmento Hindi II foi removido da es treiuida.de 3 do gene AAftl „ eliminando desse modo aproximadamente 45% do gene,, e 35B kh do gene hisG-URA3—hisG foi inserido num sitio EeoRV (Figura 2ft)* Um fragmento de ADN contendo a sequfncia aaa 1—1 — hisG—URA3—his-6 foi então transformado numa levedura diploide ura3/ura3 (Estirpe MGD502) (Quadro 4) Cito et ai., L Bacteriol » 153sló3-lóS (1983))» Estes passos foram rea.lica.dos da modo que se segue» dade 0 plasmídeo pBNH9 foi construído eliminando a extremi-de AAA1 a partir do sítio HindiII na inserção AAA1 no

JZ 0 fragmento 3,8 kb de ADN contendo o gene URA3 da levedura e duas sequências repetidas hisG foi extirpada, do plssiuideo pMKYSi (Alanip E»3 et aL, Genetics 116;; 541-545 (1987)) por digestão com BglII e BamHI, e a.s suas extremidades viscosas foram preenchidas com fragmento Klenow» 0 plasmídeo pBMH9 foi aberto cortando com EcoRV, ε o fragmento contendo 3?8 kb de *nisG—U8fi3—hisS foi ligada com extremidade cega a pBMH9 resultando em pBNHU9« A fim de estudar o significado biológico da NG'-acetila~ çSo das proteínas? foi feita, uma mutação com eliminação por rotura por meio de transposição do gene num passo único (Rothstein, R«J» Met» Enzvmo 1» 101 s2=32-211 (1983) 3 cuja referência é aqui incorporada como referência)* Básicamente, um fragmento 4,9 kb de ADN foi libertado de p8NHU9 por digestão com XhoI, e este fragmenta foi usado para transformar várias estirpes» Foram seleccionados orototrofos de uracilo» A eliminação do gene URA3 e um hisS repetida foi — -f* — realizada aplicando Ura , estirpe aaa (Aírfl8-â> em placas de 5-F0ft (ácido 5-fluoro-orótico)5 que são selectivas para estirpes ura3 (uracilo mais 5—FOA), tal como foi descrito préviamente (Boefce, J.B», et al-, iiol. Gen„ Benet. 197s345-346 (1984))»

Assim» AB18-ap (aaalss HisG, ura5), uma estirpe resistente 5-FOA, foi derivada de AB18-a. „

Os transfDementes tira foram isolados e esporulados, e os asei resultantes foram dissecados em esporos individuais para análise tétrada. A maior parte dos diploides deram origem a cada tétrada completa (2*3 com tamanho do tipo selvagem zação de tétradas completas pequenas esporos peludos viáveis» Contudo, tétradas) consistia em duas colónia.·: e duas colónias pequenas» A caracter

Sv \ P! □r célu Ias Π.Γ5 0 ul + ura n i CS5 de mane ha de de na stri ção foram or dS ADN foram indicou que as colónias grandes eram composta que as colónias pequenas eram formadas por células ura adquiridas a New England Bioblas» Os marcadores rfs ADN obtidos nos Bethesds. Research Laboratories» A membrana SensScresn PIus foi fornecida por NEN« 0 ADN genómico da levedura foi isolado (Bherman, F , et ai,, Methods in Yeast oenetics, Cold Spring Harbor Laboratory» Cold Spring Harbor, NY (1986)), digerido com encimas de restrição, submetido a electroforese em €>,8% de agarose em tampão Tris-boratOj transferido para membrana GeneScreen Plus, e hibridizado com um fragmento preparado ao •γ· .«-*· acaso, l'"'^pj-Xhol/BamHI de AAA1 (derivado de pBN9) durante 24 horas, lavado, a autoradiografada (Southern, E», J. Mol» Biol 98s503-517 (1975)}»

Esta análise de Hiancna d0 ADN de tétradas ura continham o fragmento 1,1 kb XhoX/Bs; ti correspondente à versão do tipo selva enquanto que os esporos ura‘ continham o fragmento de gene 3,8 kb URAS adicional (Figura 2B> = Porque as estirpes haploides e diploides eram viáveis quando continham apenas a rotura aaa1-1s-‘URA3» é evidente que Aftftl não é um gene essencial» Confirmação posterior de que o marcador URAS define agora o gene aaal foi obtida por ensaio do enzima Nc'—aceti 1 transferase (Lee, F»~<J»S», et al»» J» Biol» Charr, „ 2,9-5s 14948—14955 \ 1988) ) » ϋ ensaio do enzima das extractos de proteína a partir . ________r........ .......................... ....+ esporos ura apresentavam fragmento de ADN contendo sequência asa conti .nham acti vidade que o di ploid e nlo < +·/ aaal 1 ) * ϊ 5 0 OS 4- *| i-HtiZÍ V- .ΐ. 1» :a n arma 1 s Um .t t (!·· i 3 5 ur- ;A3 foi também

transformado em estirpes de levedura haploides ura5 ÍAB18, T3A) (Quadro 4)= Foram isolados os transforinant.es ura desteas estirpes haploides» A análise de manchai de ADN e o ensaio errai má tico também confirmaram que o gene AAA1 tinha, sido submetido a rotura,

MGD502 MATa/MATa+/ade2, arg4/±, cvhr/cvhs. his3+, 1eu2/leu2 trpl/trpl, ura3/ura3

MGD502a MATa/MATa-f/ade2, arg4/+, cvhr/cvhs. his3-K

Ieu2/1eu2 trpl/trpl, ura3/ura3. aaal-l/AAAl MGD5022a MATa/MATa+/ide2, arq4/+, cvhr/cvhs, his3+, 1eu2/1eu2 trpl/trpl, ura3/ura3. aaal-1/aaal-l MGD502.4b MATa, AAA1 ara4, £Yhr, his3. 1eu2, trpl, ura3. MGD502.4a MATa, aaal-1 arai, his3. leu2. trpl, ura3. HGD502.4C MATa ade2, çyhs, Teu2, trpl, ura3, AAA1 MGD502.4d MATa ade2, çyhs, leu2. trpl. ura3, aaal-1 ABI8 MATa ade2-a, his5, lvs2. trpl, ura3. aaal-1 AB18-ap MATa ade2-l. his5, 1vs2. trpl. ura3. aaal-2 T3A MATa his3. Ieu2. ura3, AAA1 T3A-a MATa hi_s3, leu2, ura3, aaal-1 MS MATa/MATa ade2-l/+, hi s5/hi s3. +/1eu2. b lvs2/+trol/+, ura3/ura3 MS-a MATa/MATa ade2-l/+, hi s5/hi s3, +/1eu2, c 1vs2/+trpl/+, ura3/ura3, aaal-l/AAAl MS-2a MATa/MATa ade2-l/+. hi s5/hi s3. +/1 eu2, d 1 vs2/nrtrpl/+, ura3/ura3, aaal-l/aaal-1 F676 MATa ade2, his6, meti, sstl-3. ural. remi Λ ν aaaal-i representa aaal%shisS-URA-hisBg aaaí-2 representa aaa1;shisS, tal como foi descrito em materiais e Métodos. !_ “Diploide £& partir de um cruzamento de ABI8 e 1' 3A. u'Diploide Θ. partir d€? um cruzamento de ABiS—a e T3A. d Diploide Cí partir de um cruzamento de ABiB-a e T3A-a»

EXEMPLO FENPTIPO E ESTIRPES ftftftl 0 fenotipa das estirpes AAAÍ foi examinado do modo que se segue» A morfologia da colónia foi examinada fazendo crescer as estirpes testadas em meio ¥PD a 30°C durante 3 dias a colocando ersiio as células em placas com YPE». 0 tamanho e a morfologia das colónias foram avaliados após 5 dias de crescimento»

Taxas de crescimento especificas das es-tirpes testadas foram obtidas fazendo crescer células em meio YPD a 3Θ°C,, 2®@ rpm, e os valores 00, ,.Λ foram determinados com intervalos de tempo específicos. A entrada na fase estacionária foi determinada pelos três métodos que se sequem; íx) determinação da percentagem de células germinadas em culturas com 3 dias de idade feitas crescer em meio YPD5 misturando uma porção aliquota da. cultura com volume igual de 1€>% de forraaldeido* soniçando cocn brevidade,, e contando as células germinadas e não germinadas com um hemocitómetro (cerca de células por determinação)j íii) determinação da pe rc sn tag em da foram mantidas sobrevivência na fase estacionária (as em meio SD a 30°C durante 5 dias, e após células diluição

as células contou-se o foram colocadas em placas com YPD? e após 2 dias número de colónias)p e. <iii> determinação da acumula dias sobre durante 3 ção de glicogénio invertendo placas com culturas com 5 cristais de iodo num recipiente herrnéticamente fechado a 5 minutos e registando a aparição de colónias castanho contendo glicogénio» A esporulação foi realizada tal como foi préviamente descrito (Sherman? F», et al. , Hethods in Yeast genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor? NY (1986)). As placas de préesporulaçSo continham €>?57 de levedura—Bacto? @?57 ds peptona-Bacto, 1% de glucose e 2% de agar-Bacto. As células foram feitas crescer nestas placas durante 1 dia antes de serem transferidas para placas de esporulação, contendo 1% ds acetato de potássio 3 v 51X- de extracto de levedura—Bac to ? '2% de agar— ~Bacto* e agentes nutritivos auxotróficos apropriados» As células foram feitas crescer a 30°C a não ser que indicado de um modo diferente» A transformação da levedura foi feita pelo método do acetato cie lítio (Ifco, H» ? ev a 1»„ J, Bacteriol» 153s 163-168 (1983))» Foram usadas técnicas padrão para construção diploide e dissecção tétrada C sherman ? F»? et al», Hethods in Yeast

Senetics, Cold Spring Harbor Laboratory? Cold Spring Harbor? NY (1986))» Os plasmídeos foram construídos por protocolos padrão tal como foi descrito por Martiatis et al» (mania tis,, T»? et al» Molecular Cloninos A 'Lafaoratorv· Manual» Cold Spring Harbor

Laboratory? Cold Spring Harbor? NY (1982)). testada como se segues comYPD? foram transfe A eficiência da esporulação foi as células foram feitas crescer em placas ridas para meio de esporulação (17. da acetato de potássio? «, 17 de extracto de 1 evsdura-Bacto? Φ?©57 de dextrose) com agentes nutritivos auxotróficos apropriados a 25°C? 25€> rpm durante 1 dia» As células foram recolhidas por centrifugação (1»x g

-X X ,· «\ durante 5 minutos a 2ô°C)„ e suspensas de novo em meio de esporu— Iação mínima (acetato de potássio aquoso a 1%) com agentes nutritivos auxotróficos apropriados e incubadas durante 2 dias-» A percentagem de células esporuladas foi determinada contando >50€» células» A sensibilidade ao calor foi determinada fazendo crescer as células até à fase log tardia sai meio YPD a 30 °C,

ÍSnÍL diluindo até cerca de 1 ;< 10 por. ml em meio SD, e com choque de calor a 54C'C„ Foram removidas porções aliquotas rsos tempos indicados, que foram arrefecidas num banho de gelo, e após diluição, as células foram colocadas em placas com YPD» Três dias mais tarde, foram contadas as colónias, e foram determinadas as percentagens de sobrevivência» EXEMPLO 6 MORFOLQGlfi fífiG ESTIRPES fiftfti

As colónias pequenas formadas por células ura por análise tétrada proporcionaram evidência genética de que as células crescendo lentamente poderiam ter sofrida de rotura aaai—1„ Foi determinada a taxa de crescimento específico de cada célula hap.lo2.de (tipo selvagem ε mutante aaal)» Os dados demonstraram claramente que ds mutantes aaa1 apresentam uma diminuição de 4®-60% na sua taxa de crescimento específico (Quadro 5)» A fim de determinar se a mutação aaai vai afectar a entrada da célula numa fase estacionária, foram examinadas a taxa da células germinadas, a percentagem de sobrevivências estacionárias, e a acumulação de g.licogénio» As culturas da cada uma das oito estirpes (Uuadro 5) foram feitas crescer em meio YPD durante 3--S dias a 30 °C, até não se detectar posterior aumento no número -V - Ν · ·;. ν ·' .5 de C £·; 11 .ilas aaal de 'am ta xas de célu 1 ciB ’ X C 3. £* d-C? culturas da itirpes dO tipo sei V ci'-*· célu taxas ΠΡ SS da gem apresentavam taxas de germinação características de culturas de fase estacionária„ Além disso, sítios múltiplos e germinação aberrante foram frequentemente observados para as células mutan-tesA percentagem de sobrevivência na fase estacionária foi determinada fazendo crescer cada uma das oito estirpes em meio SD durante 5 dias a 3©°Ce Esta experiência revelou que culturas não proliferativas de estirpes- aaal perderam a viabilidade mais rápidamente do que culturas do tipo selvagem (Quadro 5). A acumulação de glicogénio foi determinada após colocação de cada. uma das oito estirpes em placa com YPD durante 5 dias. Estas culturas em placas sem crescimento foram tratadas com curta exposição a vapor de iodo. Apenas o tipo selvagem se tornou castanho escuro devida a acumulação de glicogénio de armazenamento quando a célula entrou na fase estacionária. Os resultados apresentados anteriormente indicaram que a N^-aceti1transferase é necessária oars. aua as células entrem na fase estacionária.

Quando culturas com 3 dias foram colocadas em placas com YPD, verificou-se que as colónias aaal variavam de tamanho e apresentavam deformações, observando-se que aproximadamsnts &&% tinham um tamanho menor do que a;:; de células do tipo selvagem.Colónias mutantss múltiplas foram colhidas, feitas crescer Em YPD durante 3 dias, e colocadas em placas com YPD. Estas colónias mutantes aaal também apresentavam variações do tamanho e apresentavam deformações.

^•>0 > X X QUADRO 5

EFEITO DE AAA1 SOBRE A TAXA DE CRESCIMENTO ESPECÍFICO E ENTRADA NA FASE ESTACIONARIA

Acumulação

Taxa Crescimento Células Sobrevivência a hspec:i ΐ icd tierisma- em rase hs

Estirpe íhr JL » ) das i %) tacionàriaCA) SI MGD502.4b (AAA1) 0.439 8 71 + MGD502.4a íaaal-11 0.169 45 9 MGD502.4c (AAA1) 0.435 10 62 + MGD502.4d (aaal-11 0.179 48 6 AB18 l ΑΑΑΠ 0.421 7 56 + AB18-a íaaal-1) 0.172 46 6 T3A (AAA1) 0.496 10 73 + T3A-a íaaal-1) 0.302 54 10 aAs células sã o f e i t a s- C fESC :er em meio YPD a 30oC« foi determinada em vár ‘A 05 .1 .ntervalas de tempo* t t

"As células foram feitas crescer 3 dias» Após curta sonicaçã.o, as célul nadas foram contadas com um hemocitóme contadas para cada determinação» b'D a 30°C durante 5 com YPDj e as colónias ~hs estirpes foram mantidas· em meio dias» As células foram colocadas em placas foram contadas após dois dias» EXEMPLO 7

0 GENE AAftl é REQUERIDO PARA A ESPGRULACKQ A esporulaç-lo em levedura? iniciada após regime de fome de células diploides HATa/MATcc? representa um programa regulado de diferenciação <Esposita5 R»E» et a 1 „ In; The Molecular BiQloqy of ths Veast Saccharamvces-s Life Cycle and Inheritance < St.rat.hern 5 J»N« et al» Eds») Cold Spring Harbor Laboratory5 Cold Sorinq Harbor, NY (198i) > „ A fim de avaliar se a Nw-sceiilaçlo desempenha um papel na. esporulação, foram usados dois grupos de genotipo de estirpes de levedura diploide (MGD502 e MS) (ver Quadro 4), representando diploides do tipo selvagem í+/+)? heterosigoto com rotura C-t/aaal-1) » homosigoto com rutura (aaa 1-1 /aaaí-1) » Tal como é indicado no Quadro 5, ambas as estirpes diploides homoeigóticas (aaai — í/aaa 1 — 1) (MS—2a e nBD'5©2---2a) não esoorularam eficientemen— v ·«*<·. -x .-v -

í,1 A AÍ\> EXEMPLO 8

O GEME AAftl é REQUERIPR PfiRft FUNCgQ TIPO REUNIgQ

As experiências de reunião foram realizadas da modo que se seque. As estirpes a ser testadas' quanto a reunião foram feitas crescer durante a noite em meio YPD. Números iguais de

i A células de cada txpo de reunião (cerca de 5 x 1Θ'~5 foram misturados, incubados em meio YPD durante 6 horas a 3©°C, e examinados quanto ã aglutinação. Além disso, as células foram colocadas em placas com SD, contendo agentes nutritivos essenciais para de selecçSo auxotrófica, nas quais apenas diploides resultantes reunião deveriam crescer. As células do tipo de reunião individual foram também colocadas isoladamente em placas com SD para ensaiar quanto- à reversão de marcadores auxotróficos, e não foram observados quaisquer prctotrofos. 4

Para o ensaio do factor-a, cerca de 10 células da estirpe do teste 3268-1-3 να ss2—1) foram espalhadas numa placa com YPD (pH 4,5, e as células das estirpes do ti-po-a a serem testadas foram reconhecidas na placa. Zonas de inibição do crescimento eram claramente visíveis após 2—3 dias de incubação a «

3Θ °C

Mutantes aaal <MDG502»4a s ABIS-a? ambos do tipo de reunião-a) foram testados quanta è. resposta em rslaçao aa factor— -a. As células cresceram durante a noite a 30°C em YPD, sendo lavadas, suspensas de novo em 5 ml de YPD contendo o factor-ct (1 μΜ) com uma densidade celular de 1 x 10& células por ml, e incubadas a 3@°C. Amostras (Θ,Ι ml) foram removidas com vários intervalos, misturadas com um volume igual de 10% de formaldeido, e as células apreendidas da fase Gi foram determinadas pela relação entre as células germinadas e não germinadas. 3s •v Í '

As células S» cerevisiae haploidss aparecem em dois tipos de reuniãop a e a, determinados pelo locus HAT (Nasyint.h,; K., et ai., Science 237s1162-117® (1987)), As células com tipos de reunião opostos podem participar numa re-scção d& reunião que resulta em fusão celular e criação de uma célula tíiploide í Bender 5 A», et aL, gene tios 151 s 463-476 C1989) \ Sprague, B , et al« n -Annu=, Rev» Microbiol» 37'»623-66® (1983), Thorner, J»3 Ins The Molecular Bioloav of the Yeast SaccharpmvcEs; Life Cvcle and I nh e r i t a π ç e, Strathern, E„W«,, st al» (eds»)5 Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring H-arbor» MY, pp» 143—ÍB® í1981))„ Várias proteínas são responsáveis peio processo de reunião, embora não seja claro se ocorre a N'"'1—acetilação de alguma delas»

As reuniões foram assim real içadas por mistura suave das estirpes aaal (MD85C12»4d («5 , HDG5®2»4a(a.}, 7 3 A—a(o;) ou. AB18—i(a)í com estirpes do tipo de reunião oposto» Surpreendente-mentes as estirpes de mutanie aaal do tipo-a (ABIS-a e HDSS®2»4a) não se aglutinaram tão bem como células do tipo-a do tipo selvagem quando misturadas com células do tipo-α do tipo selvagem» Testes de reunião quantitativos indicaram que a eficiência da reunião das células a.aa 1 MATa se encontrava significativamente reduzida, embora não desaparecida (Quadro 7)» Dois mutantes aaal do tipo—α (T3A—a e HGD5®2»4d) produziram facto*—a em níveis semelhantes aos das estirpes do tipo selvagem (T3A e HD85®2»4c)» Contudo, dois mutant.es aaal do tipo—a (AB18-a e MDS5®2»4a) produziram menos factor-a do que as estirpes do tipo selvagem CAB18 e !1SD5®2»4b) = 0 mutante aaal do tipo-a (H8D5@2«4a) produziu, pelo menos 3® vezes menos factor-a do que o tipo selvagem CM8D502»4b)» Verificaram-se resultados semelhantes com ΑΒ'18-a em comparação com AB-1S»

Babe-se que as células do tipo-a segregam o produto genético BAR1chamado actividade de barreira, que degrada o ·*Χ ' ' . factor-α e desse modo desencadeia a resposta de reunião (Bicks,, J.B», et sL.Nature 26Θ 246-248 (1976)? Kronstad, J, U. , Ce 11 J. Bacteriol. 50x369-377 (1987); Manney, T.R, (1983); Sprague,, B.F., 3r., et ai -660 (1983)),

1 » 7Q 291-3Θ1

An nu, Rev, Microbiol. 37. s 62.3* A actividatíe de barreira foi detectada por interferência em zonss produzidas por factor-α por uma fiada de células do tipo de reuni ao-a tal como é descrito por Sprague and Herskowitz (Sprague, S»F„, Jr», et al, , J , Hol, Biol. 153s305-521 (1981)) e (ssti) F67!6 como ks and Herskowitz .B.A. 81 57021-70 Ξ-olvido em 9Θ7 de metanol =stirpe do teste? tal como é descrito i i c k s, A,H , , at al, , proc, Natl, Acad, 9ci , U„S, A, 81 s7021-7025 (1984)), 0 factor—α sintético foi amprado a Bacoem uxoscxence inc, e d^

Esta experiência revelou que as estirpes mutarstes do tipo--a (AB18~a e MBS502.4a) apresentavam apenas uma ligeira, redução das activitíade de barreira em comparação com as células do tipo selvagem e supersensíveis. Além disso, muiantes aaa1 do tipo-a (ABí8~a e MDG5W2„ia) não conseguiram parar na fase 81, quando as células foram suspensas de novo no YPD contendo factor--a Ί μΜ„ EXEMPLO 9

ENSAIO QUANTO A PRODUCSO DE FEROMONE

As medição quantitativa da produção de feromone foi realizada como se segues as células foram feitas crescer até ã fase log tardia a 3u’-'C5 200 rpsn5 em meio YF‘D, As- células foram , .-.4 *uniuas em pílula duas vezes por centrifugação a 1,3 x 10 durante 5 minutos antes de ensaiar o produto flutuante quanto rm !3 λ e> - actividade de feromor>e = D x 1 uiccíes ssriad as (duas a quatro vszesí de produtos flutuantes contendo feromone em tampa o citrato (pH 4,5) foram localizadas í 1 €> μΐ) numa camada de células supersensíveis às feromones e incubadas durante 3Ó--4B horas a 23°C = EXEMPLO 16 REGULAÇÃO TRAWSCRTCIGNA·. DO GENE AAA1 Células de culturas de 56© ml foram colhidas na fase log média em meio YPD e em diferentes estádios do crescimento em meio YPD» 0 choque pelo calor foi realizado como se segue: quando o A. „da cultura em YPD atingiu cerca de 2,6, foram removidas ôuu · · duas porções aliquotas de 75 ml? uma foi aquecida a 37°C durante 2 horas, e a outra foi incubada a 36°C. 0 ARN total foi extraído de cada amostra (tíherman, F.

Hethods in Yeast Benetics,

Cold tópring Harbor laboratory, Cold típrig Harbor, HY C19Só>), 0 ARN da levedura í1© pg > foi submetido a electroforese em 1,2% de gel agarase/formaldeido íLehrach, H., et ah, Biochemistry 16s4743-4751 (1977)), A camada contendo os marcadores ARN foi cortada em lâminas, visualizada por coloração com brometo de etidio, e usada para determinar os tamanhos moleculares dos ARNs. 0 ARN foi transferido para membrana GeneScreen Plus e hibridizado com pr aduzida ao acaso (derivado de ϊϊ Figura 2A> e P> - tu bu 1 i n a (Ne f f, N, F» , st al., Ce11 33 ;.s211-219 (1983: > ADN durante 24 horas. lavado e autoradiografado C Thomas, D C* i a wF π b F!roc»

NatI» ficad, Sei, USA 7/:5261-5265 (19a6))» Os níveis dos mARNs para AAA1 e jl-tubulina f oram determinados * u ARN total foi assim preparado a partir de células feitas crescer em meio YFD na fase log média e meio YPD na fase log inicial, na fase log média, na fase estacionária, e após choque pelo calor a 37°C durante 2 horas» A análise da mancha de Ν AR Η foi realizada cosn AAA1 t ^ P 3—r a d i qri a r c a d o = produzido ao acaso e dispositivos da {5-tubulina da levedura» Não houve efeito de repressão d-a glucose, fase de crescimento, ou choque de calor nos níveis de transcrição de AAA1 em comparação com o gene fá-tufau.lina CNeff ? N»F», et al. Ce11 53s211-219 (1983))» EXEMPLO 11

OS MUTANTES AAA1 3S0 SENSÍVEIS AO CROQUE DE CALOR . . , ..af-acetilacão desempenhava um papel i-ox sugerido que a N - r r na protecção de várias proteinas contra a degradação proteolítica intracelular (Gornvall H,

Theot b> XO' • s 1-12

Rubenstein, et aí d» Biol

Chern» 2S4s11142-11147 (1979))» A tara do turnover da proteína mediado pelo sistema de degradação dependente da uhiquitin foi também documentada concluindo-se que dependia da presença de um grupo α-Ni-L, livre no terminus-M das proteinas modelo (Bachmair, A», et al», Science 254 s 179— 1 Sé-(1986)), e em células da levedura, verificou—se aue a poliubiqui—

tin era uma proteína do choque de calor (Firtley, D _a_i =, L-

Cb’ 1 48 s1©35-1©46 <1987); Tanaka, K», (1988))= Contudo, não se verificou et......al..»_ ,a

EMBO »e a - a c s í\ i .1. a ç ã a das proteínas desempenhava ou nlo um papel na resistência ao choque de calor» Por esse motivo, células em crescimento exponencial em oito estirpes diploides (4 mutantes a.aa 1 e 4 do tipo selvagem) foram submetidas a choque de calor a 54°CS e as percentagens de sobrevivência foram determinadas em vários pontos do tempo» Tal como é indicado na Figura 3, as estirpes, aaa1 (M6D592«4a e M-SD5©2»4d> são roais sensíveis ao choque de calor que as estirpes do txpo selvagem <MGD582»4c e MGD502«4b)» Outras estirpes aaal (ABlS~a e T3A-a) mostraram—se também mais sensíveis do que as-estirpes do tipo selvagem (AB18 e T3A)» ^Ν. .- - λ?a,s -N-, -- EXEMPLO 12 A EXPRESSÃO DO GENE Aftftl ΡΟΓιΕ COMPLEMENTAR A HUTAcaO AAfti

Os piasmideos de expressão para α gene AAfti foram construídos por inserção da região de codificação hhAI nos vectores de expressão- pVT-LlÔ® (contendo um marcador LEU2) ou pVT--U 10€i (contendo um marcador URAS) no sítio Xbal seguindo imediatamente o promotor ADHI (vernet, T«, et ai. gene 52:225-

~233 <1987))« Estes piasmideos são identificados como pLAi ou pUA15 respec ti vamen te E Vários mutantes a a. a 1 foram transformados com piasmideos pLAÍ ou pUAl ;1 contendo o gene AAAi . 0 transformante MD©5®2.2a/T (contendo pLAl> restaurou a deficiência da especulação encontrada em r1DG5©2~2:a (Quadro 6)- Além disso, a introdução de pLAl em MDB5@2.4a CMATa, aaaI) e pUAl em ABIB-ap (HATa, aaai-2)restaurou a eficiência da reunião (Quadro 7)» Estes transformantes também expressaram o factor de reunião—a tão abundantemente como o cipo selvagem» Alem disso, a tama de crescimento específico destes transformantes foi restaurada, e as células foram capazes de entrar na fase estacionária» QUADRO 6

EFEITO DE AAA1 SOBRE A EFICIêf úClrt DA ESPORULAçSOh Eficiência de Estirpe AAAl/Locus Esporulação PUsmidio 1%1 PLAI(AAA1+) MGD502 AAA1/AAA1 27 MGD502-a aaal-l/AAAl 23 MGD502-2a aaal-l/aaal-1 <0.1 MGD502-2a/Tb aaal-1/aaal-1 21 , MS AAA1/AAA1 U1 T 16 MS-a aaal-l/AAAl 12 MS-2a aaal-l/aaal-1 <0.1 após Í",P" Aí", jCTJ " L, cl*— ,* . Eucisnci incubação durante 3 a. de esporulaçâo de cada estirpe foi determinada em meias de esparulaçãa e de esporu 1 açao mínima a dias= tal como foi descrito.em Materiais e Méto dos» fa„ nlSD502'~2a/T é KtíD502-2a transformado com plasmídèo pLAi que expressa o uene AAAi » X · QUADRO 7

H EFICIâNCIAS DA REUNIHO DO TIPO SELVAGEM t DAS ESTIRPES AAAi

estirpe^ estirpe a Eficácia de {Φ4 de diolo Estirpe Genotipo Estirpe Genotipo MGD502.4c α AAAI MGD502.4b a AAAI 2.1 x 105 HGD502.4C α AAAI MGD502.4a a aaal-1 <100 MGD502.4d a aaal-1 MGD502.4b a AAAI 8.2 x 104 MGD502-4d a aaal-1 MGD502.4a a aaal-1 <100 T3A a AAAI AB18 a AAAI 1.4 x 105 T3A α AAAI AB18-a a aaal-1 <100 T3A-a α aaal-1 ABI 8 a AAAI 7.5 x 104 T3A-a o aaal-1 MGD502. a aaal-1 7.3 x 104 4a/Tb pLAl(aaal+) T3A α AAAI AB18 a aaal-2 6.7 x 104 -ap/Tc pUAl(AAA1+) a Eficácia K; euniSo fo X deter minada a *C descrita em Materiais e Métodos» dM6D5€v2„4a/T foi MSD502»4a transformado com pLAÍ transportando o gene AAAi cABiB-ap/T foi AB18~ap transformado com pUAi transportando o qene AAAi»

/«F EXEMPLO 15

O BENE AAA1 DA LEVEDURA

As estirpes de levedura a que faltava o gene da Na~ace~ til transferase ? fiAfil» cresceram como colónias ma is pequenas, com tamanhas variáveis, e deformadas em comparação com estirpes do tipo selvagem e as células destas estirpes germinaram de forma múltipla e anormal. Além disso, demonstrou-se que AAA1 era necessário para a entrada em fase estacionária, espcrulaçlo, resistência ao choque de calor e funções do tipo reunião especifica-a, embora o papel da Nu-acetilação nestes processas continue a não ser claro.

Hersbko et al, (Hershko, ft«, et al., Proc. Natl. Acad« Sei. USA 8i.í7®21-7®25 (1984)) indicaram que as proteínas Ms-aca~ tiladas são degradadas pelo sistema ubiquitin, dependente de ATP meno rápidamente do que as proteínas com termini-N livres, e sugeriram que Na-acetilaçSo se encontra envolvida na protecçSa contra a degradação da proteina. Além disso, a indução do gene UB14 (ubiquitin de codificação) por choque com calor sugeriu que a ubiquitin desempenha um papel na resposta ao choque com calor e que o seu papel fisiológico pode consistir em degradar proteínas alteradas ou tóxicas geradas paio stress ambiental (Finley, D», et al., Cel 1 48 £ 1Θ35-1 €<46 (1987)¾- Tanafca, K., et a!., EMBQ J. 7.5495-502 (1988). Demonstrámos indirectamenie que a Nu-acetilação desempenha um papel na resistência ao choque de calor» Contudo, é presentemente desconhecido quantas proteínas Na“acetiladas se encontram envolvidas na protecção contra o choque de calor e se um grupo exposto numa ou mais destas proteínas forma um sinal de reconhecimento para a conjugação de ubiquitin e para a degradação mediada pela ubiquitin» ' *. ί ν> ^ "

Talvez que ο mais notável dos fenotipos identificados dos mutantes aaal soja o do tipo-a5 mas não o tipo-α? tendo os mutant.es aaal se reunido menos eficientemente- Foi observado anteriorments que mutações em STE2(recptor do factor-α) íHarting, A», f.t...a Mol. Dell Biol. 6;. 2166--2114 (1986)¾ lenness, D * D » et al „ Cel 1 35s521-529 (1983))¾ STE6 e STE16 (genes requeridos para tor-a de maturação) < Powers c- ? ** ** 9 31 al „ „ Cell 47 s 41 3 “-422 p Wilí 50Π h K»L,, et âl s « Mol» Cell » Biol» 4 s 2420 *“24.2 / 5 MFa] [ e l’jha.2 (um íív_ ti-ír ) (M ichael is 9 s« tx 3 TL -Si ., Mol» Cell

Biol a 8s 13=69-1318 (1988)) resultaram numa redução de um milhão de vezes da -eficácia do tipo de reunião = Em contraste3 a mutação aaal resultou numa redução de um milhar de vezes da eficácia do tipo de reunião» Assim3 é provável que a mutação aaa1 tenha reduzido mas não abolido, a eKpressão de certos produtos genéticos específicos em relação a a3 tal como foi observado para a mutação ardi (Whiteway, M, ;t al», Dell 43s483-492 (1985))= Foi sua e κpressão sugerido que o produto genético ARDI actua3 directamente ou i n d í r ec t amente„ no 1ocus HHL e que reprime '13-3722 (1987)) CWhíteway* M», et al=, Mol» Cell Biol. Níveis diferentes de acetilação foram observados para várias proteínas eucariéticas (Garlickj RJ Chem „ 2Í a 1727-1731 (1981> % JornvalI, H 72:443- /1 cr^ í1977)p MacLeod3 A«R« « et al 78s281-291 (1977)¾ Hahonev, W.C. 5 et al», Biochemlstrv 19s4436-—4442 (1 vtíú) 3 Smythj D = B» 3 et aI,Nature 28.8 5 613—615 (1981?) i Bteaink, L»D», et al, , 3= Biol» Chem» 246s3€?€?l— 3007 (1971)5 et ai =

Biol

Eur,

Biochem, fc.u r, J »_B i oc hem „ rEMS Lett. 140s63-66' '(1982) ) . Além disso,

Takahashi, !<», et al também se verificou que os isoenzimas (ADR I e ADR II) diferiam nos seus níveis de acetilação (Jornvall, H„, et ai » , FEEiS Le11» 111 £214-218 (1V8£?}>= Esta acetilação diferencial oode ser devida uma falta ac ti vidade a diferenças na estrutura primária entre as isozimas, de acetil-CoA disponível, ou diferenças no nível da /2

enzimática» Contudo, peptídeos sintéticos imitando resíduos í-24 de ambos os isoenzimas ADH foram igualmente acetiiados pela N^-aceti1transfsrass da levedura, sugerindo que em condiçBes nas quais o acetil CoA se encontra em excesso a acetilação eficaz de ambos os enzimas- deve prossegir (Lss, F-J.S-, et al,, 3» Biol « Chem» 265¾ 14948-14955 (1988))» Além disso, a análise da mancha de ARN revela que nla se verificou um efeito .importante sobre a repressão da glucose, fase de crescimento diferente, ou choque com calor sobre a regulação transcricional do gene AAA1» Contudo, estes resultados não excluem que a Ma-acsti1ação não seja regulada por modificação pós-transiacionai (fosforilação ou glicosila-ção) de ou regulação (inibição ou. activaçlo) da Na-acetiltransfe-rase» A utilização expandida destes- mutantes aaal e do gene AAA1 constitui a base para a elucidação da função biológica s da regulação da N^-acstilação na levedura» EXEMPLO 14

Q ALELO aaal ALTERA A S1NTE9E SfiS PROTEÍNAS EM SftCCHARDHVCES CEREVJSJAE Não é claro como é que a N*3— acetilação afecta a translação e o processamento euearióticos (Wold, F», frenda Siochem. Sei» 9s256-257 (1984) e protege contra a degradação proteolítica (Jornva.il, H., 3» Theor. Biol. Sgsl-lZ <1975) 5 Rubenstein et al,, J. Biol. Chem» 254? 11'142-11147 (19/9)1» Além disso, a taxa do turnover da prateina mediada pelo sistema de degradação dependente da ubiquitin depende de um grupo ^ ivre n° terminus—NH2

de proteínas modelo (Hershko et al».? P!Q2C · ^$£1 ?......ftç.gd.».-5ç„i.._USA 81! 7021-7025 (1984)? Bachmair et......ã.l.->í Science 234=179-186 sv ao <1986)5, e esta dependência indica que a. Na—aceti 1 açSo desempenha um papel crucial no impedimento do turnover d-a proteína» A serina e a alanina sSo os resíduos terminais em M em proteínas acetiladas, e estes resíduos, conjuntamente com metio— nina, glicina, treonina, vaiina e ácido aspártico contribuem para quase a totatidade dos resíduos N^-acetilados» (Tsunasawa et al., methods Enzymoi., 1Θ6?. 165-17© (1984) ? Driessen et_al.».s C8C Crit. Rev,, Biocfíem·.· 18s5Bl-355 < 1985) 5 Persson et al.. Eur. 0» Biochem. 152 í 523-527 <1985)? Augen et ah, Ttrends Biochecn. Sei» JJ, 2 494-497 (1986); Tsunasawa et al», -3. Biol» Chem. 260 s 5382-5391 (1985))» Contudo, visto nem todas as proteínas com estes resíduos nos termini N serem acetiladas, o mecanismo pelo qual certas proteínas se tornam acetiladas permanece obscura» A fim de estudar o efeito da deficiência da N~-acetil— transferase sobre a síntese das proteínas na levedura, uma comparação entre as proteínas solúveis» isoladas e depois separadas por eleciroforese em gel bi—dimensional, e o tipo selvagem e o mutante aaai foi realizada por meio de análise em computador de geles proteicos hi-dimensionaís»

Para esta finalidade, foram usadas estirpes i3A da levedura CHAT cu his5. Ieu2. ura3« AAAI) e T3A-a (MATq, his3, 1eu2» ura5» aaai-i). Os meios de cultura da levedura foram preparados, tal como foi descrito por Sherman et al. (Methods in Yeast Benetics (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, MY> (1986)>s YPD continha 1% de e;·; trac to de levedura—Baeta, 2% de peptana-Bacto, e 2% da glucose» Maio YNBs succinato, 10,© q/1 ? MaOH, 6,© g/1? (NH^)-,804, 5,© g/1? base com azoto da levedura (sem amino ácidos e ÍNH^Í^SO^), 1,7 g/15 18 amino ácidos (sem metionina e cisteina), 12,5 mg/1 cada? adenina e uracilo, 1© mg/1 cada? e glucose 2© g/1» Α levedura foi feita crescer num agitador rotativa a 25°C, 20Θ rpm em meio NYB a A,,, = 0,75» As proteínas da levedura -rgífirt? ?

Toram marcadas adicionando C "”"S)~mstioriina (—1200 Ci/mmal) a uma cultura de ΙΘ ml de levedura a uma concentração de i© pCi/ml e agitadas durante mais 20 minutas a 25 °C. Após adição de gelo para arrefecer a cultura, as células foram isoladas- por centrifugação (7»©00 x g) a 4°C durante 5 minutos em tubos Coreu de 15 ml 5 lavadas uma vez com água destilada fria, e centrifugadas. Adicio-nou-se 30Θμ! de água destilada fria á pilula celular, seguindo-se a adição de pérolas de vidro de 0,45 mm até ao menisco» As células foram submetidas a rotura por redemoinho vigoroso durante 3Θ segundos (4 vezes) com arrefecimento com gelo em 1 entre cada irrupção de 3Θ segundos» 0 produto homogéneo foi removido das pérolas de vidro com uma pipeta de Eppendorf e colocado num tubo de micrafugação de 1,5 ml» As pérolas de vidro foram lavadas duas vezes com 1ΘΘ μΐ de água destilada, e os produtos de lavagem foram adicionados ao produto homogéneo. Adicionaram—se 4Θ μΐ < I /10 vol) de uma solução contendo '0,3% de SBS,.1,©% de fi-mercap-toetanol, Tris-HCl 5u mH» pH 8,ô» A solução foi aquecida no banho de água em ebulição durante 2 minutos sendo então arrefecida em gelo» 5Ô μΐ de uma solução contendo í mg/ml de DNase I, 5ΘΘ pg/ml de RMase A, MgCl0 50 mM em Tris—HC1 5C? mM» pH 7„0 foram adiciona— dos ao lisado, e a solução foi incubada em gelo durante 10 minutos» 0 lisado foi centrifugado em micrafugação durante 8 minutos, e o produto flutuante foi transferido para um tubo fresco e congelado em azoto líquida»

Pares de geles bi-dimensionais foram utilizados para duas preparações de amostras diferentes e analisadas em computador por Protein Databases Inc. (Huntington Station, MV)» Os geles foram preparados de acordo com o método de Garreis (Garreis, Ί «I», 3 » Biol» Chem» 264»52&9—5282' (1989))» Os Usados contendo —400»000 cpm foram carregados em cada gel» A taxa de amfolina Λ Λ Λ Λ para a focagem A concentração isat-1 ei_tri*_a <primeira dimensão) fax pH de 4 * 7» de poliacrilamida do sulfato dodecílico de sódio (segunda dimensão) foi de 12,5%= Os geles foram processados para fluorografia« Foram preparados trts grupos ds sKposiçSes- para cada amostra em duas ewperifnelas (3.-, 6-, 12-dias)» As películas foram analisadas com scanner Optronics P-1000 como interface de um computador PDP-ii/60, Os dados foram transferidos para uma estação de trabalho FDQuest. As manchas de proteina foram identificadas, quantificadas, e comparadas com o sistema PDQu.es t, que se baseia no sistema de Barreis and Franza (Barreis et al», u» Biol. Chem. 264 ϊ 5283-5298 <1989)). da N^-acetiltransferass sabre examinados por meio de uma 0i> efeitos da deficiência a síntese da proteina foram assim comparação do padrão electroforético do gel bi-dimensional das proteínas solúveis do tipo selvagem e das células de 1evsdora mutants aaaí.. J-oram detetetadas por análise computorisada dos geles, b‘o5 manchas discretas de proteina» Sem uma alteração na sua massa molecular, observou-se que 48 proteínas, identificadas nas células do tipo selvagem, tinham valores pl mais elevados nas células de mutante aaa 1.« Esses desvios para pis mais elevados resultam provávelmente da protonação do grupo σ-Nl-L, nas protei- ιί nas, a que falta um grupo acet.ilo» Além disso, as células muian-tes -aaal continham menos 144 proteínas do que as células do tipo selvagem»

Hershko et a 1 = (Hershko et a 1». ,Proc„ Matl» Acad. Scl». USA 81.s702i-7025 < 19S4)) revelou que as proteínas Na-acetiladas slo degradadas peio sistema ubiquitin/dependente de ATP menos rápidamente do que as proteínas com um terminus-N livre e sugeriram que a N^-acetilação pode evitar a degradaçãci por este sistema» é possível que as 144 proteínas jâ não det.eetadas no mutante aaal tenham sido degradadas por esta via» Contudo, a maior parte '0- ν ,· das proteínas "desviadas" naa eram ma is lâbeis» Assim ? a Mu—acs— tilaçSo não pode ser o único factor envolvido na prevenção da degradação da proteína.

Apareceram 27 novas proteínas no mutante aaalA síntese destas proteínas resulta da desrspressão ou. activaçSo da genes regulados por proteínas reguladoras,, que já não são aceti-1fidas = Foi sugerido ser esta a hipótese para um tipo de genes da reuniâo w. to f-VÍAu- íTOj regulador da proteina no mutante CHullen et ENSO J„ 8s:2067-2075 (1989)

Além disso,, uma comparação entra as proteínas do tipo selvagem e mutante aaaí revelou que 71 proteínas do mutante aaal diminuíam em >5©% a 34 proteínas aumentavam em >2®0% = Essa sínteses diminuída ou aumentada pode também ser controlada por proteínas reguladoras a que falta. Ν α - a c s i. i 1 a ç ã o „

As experiências revelaram que apenas 2@% das proteínas solúveis eram ou deslocadas ou desapareciam no mutante aaal <isia é, indicando que provávelmente lhas faltava um grupo acetila)? embora tenha sido sugerido que 50% das proteínas solúveis na levedura são Na-aeeti ladas ÍBrcwn* J „ L „Int Conqr „ Biochem„

Abstr.Vol 11, International Union of Biochemistry5 Canad pp» pode 9Θ (19/9)). A presença de Na—acetiltransferases adicion contriouir para esca dÍTerença spsrents.

H N^-acetilação constitui uma modific ação quimaca importante das proteínas eucarioticas3 tal como ê indicado pelo grande número de proteínas cuja síntese- é alterada pela eliminação do gene da MtA—acetiltransfgrase.

Embora o invento tenha sido descrito em relação com suas apresentações específicas,, deverá ser tomado em consideração Λ λ Λ λ Q LI 0 3-áo pGSSxYSis OUtf patente abranger quais do invento seguindo, cluindo essas derivaçt pratica conhecida au podendo ser aplicadas indicadas e como se ss "as modificações pretendendo este pedido de jquer variações, utilizações ou adaptações em geral, os princípios do invento e in·-Ses da presente apresentação no âmbito da. habitual da técnica referente ao invento aos aspectos essenciais aqui anteriorntenis *gue nas reivindicações apensas.

Claims (1)

1. Rei v indicações is-„ - Célula» adequada para ser utilizada na produçãc de um peptídeo ao qual falta um terminai amino M^-acetilado, caracterizada por expressar uma M"''-acetiltransfersse alterada,. 2â= - Célula de acordo com a reivindicação 15 caracterizada por ser uma célula da levedura» ds = - Célul 3. d a. levedura de ac :ordo com A reIvi nd icaçao terizada por t$3 r la ma mutação no gene AAhÍ .= 4â» - Célul 3. de A SV^SOLICS Π0 0Γ :ordo com 3 rei ví nd i c acao 3» caracterizada por lhe faltar substancialmente actividade de - ,cí aceti i crai is f sr âss„ rsivinoicac ac Célula de levedura de acordo com 45 caracterizada por conter um alela aaa1-1 ou aaa1—z do gene Hhh 1 6â- Método para a obtenção de uma molécula recombi-nante, caracterizada par se incluir na referida molécula um gen-í A Ah 1 a .i t e r a d o = :pressão da referido peptídeo numa célula de j. s v"" S1 ti u r a QSHS Ahr1 - em que o referido CjOne c ori tem uma mutação 7ã. — Método para a produção de um peptídeo ao qual falta um terminal amino N^-acetilado, caracterizada por compreender a resultandu numa p«rda substancial de actividade do produto qens Λ Λ a -5 r*tr'U*i 3. q bf se *8r f: referids Na- -acet. a referida célula incapaz de catalisar a pep Ο2.αοο χ

   eâ am χ η ο·~ ácidos compreender s — Método para a determinação da sequência de de um pepiídeo ou proteína, caracterisado por roteina numa célula ido gene contem uma de actividade do célula incapas de a. a expressão do referido peptideo ou p de levedura tendo um gene AftAi» em que α refer mutação que resulta numa perda substancial produto do gene hhA 1 ... e torna a referida catalisar a .11 açao de peptideos ou proteina* b. a recuperação do referido peptideo ou proteína? e a determinação da. sequência, de smino—ácidos do referido peptideo ou proteína» Lisboa, 2'o de Outubro de 1990

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