PT95689A - Metodo para a obtencao de uma n alfa-acetiltransferase da metionina - Google Patents

Description

Pedidos de tado em 31

Este pedida de patente é uma continuação-em-parte dos Patente dos E,U=A. Nos» de Série €>7/473 = 276 (apresen-de Janeiro» 1990) e €>7/426 = 328 <apresentado em 25 de

Outubro , 1990), ambos aqui incorporados como referência»

Campo do Inventos 0 invento refere-se a um enzima Na-Acetiltransferasa que é capas de acet.ilar resíduos da metionina de um peptádeo ou proteína, e a moléculas recombinantes que codificam este enzima, e a células hospedeira que expressam o enzima» 0 invento também se refere à purificação do enzima a partir de vários hospedeiros, tais como a. levedura, Sacchramyces cerevisiae. Adicionalmente, o inventa refere—se às utilizações do enzima na pesquisa e nas aplicações industriais»

Fundamentos do Inventos A acílação terminal de amino é uma modificação co--translacional importante de proteínas em células procariontes e eucariontes. Embora fqrmilo, piruvoilo, α-cetobutirilo, glicosi-lo, glucuronxlo, a-sminoacilo, p-glutamilo, mirxstoilo, e acetilo sejam grupos N^-acilantes bem conhecidos, é claro que a aeetila— ção constitui a modificação química mais comum do grupo a-NHg das proteinas eucariontes {Tsunasawa, S», et al»» Methods En£vmol 106s165-170 (1984); Driessen, H»P»C», et al», CRC Crit» ftev» Biochem 18;281-325 <1985))» A Ma-acetilação desempenha um papel na translação e processamento dos eucariontes normais CWold, F», Trends Biochem» Sei. 9; 256-257» <1984)) e protege contra a degradação 3 3 H., J. J. Biol. (1975) 979)>. proteoiítica ÍJornvall, Rubenstein, P«5 et al««

Theor. Biol», ou2 i — i 2 Chern- 254 11142-11147 (1 .Depois da descoberta de que uma metade aceiila era o grupo de bloqueio N-teraiinal da proteína de revestimento do vírus mosaico do tabaco (Narita, K., st......Ríochim. Bioohys» Ac ta 3 282184-191 {1958)) e peptídeo estimulador do melanocito a (Harris, J.I., et al -biochem J. 71 s 451-459 (1959)), um grande número de proteinas de vários organismos revelou possuir resíduos N-terminais acetilados (Brown J „ L. , et al.n J.. Biol» Chem» 25121009-1614 (1976)3 Brown, J.L., et al-, j> Biol. Chem. 25421447-1449 (1979))» Por exemplo, células-L e células ascíticas de Ehrlich do ratinho fim cerca de 86% das suas proteinas solúveis intracelulares PÍ®-acetiladas (Brown, J.L., et ah. J. Bipl. Chern« 25121069-1014 (Í97ó>3 Brown, J.L., et al., J» Biol. Chem. 254g1447-1449 (1979))» Em organismos eucariontes inferiores, cerca de 50% das proteinas solúveis são acetiladas (Brown, J.L», i

Int iConoi-u Biochem. fifastr. (International Union of Biochemistry, Canada) Vol. 11.290 (1979)). Estes dados demonstram que o grupo Na-acetilo é um grupo'bloqueador muito importante. Foi sugerido que a função biológica deste grupo bloqueador pode ser protegida contra catabolismo proteico prematuro (Jornvall, H.5 J. Theor. Biol. 55b1-12 (1975)) e degradação proteolítica da proteína (Rubenstein, P» and Deuchler, J., J. Biol. Chem. 254s11142 (1979)). Contudo, nas células-L do ratinho essa Na-acetilação não tem aparentemente essa função biológica (Brown,. J.L., J. Biol. Chem. 25421447 (

Embora não se tenha avaliado com exactidão uma função geral clara para a NM-acetilação, foram observados alguns efeitos específicas para um pequeno número de proteinas. Uma deshidroge-rtase glutamato NADP-específica não acetilada num mutante de

Meurosorora crassa é instável em relação ao calor, em contraste cosi a forma acetilada (Siddig et aL«. _ <1980))= Ur mutante da Escherlchia coli 137:125 J» Mol. Biol em que a proteína ribosómica S5 não é acetilada, apresenta termo-sensibilidade (Cumberlidqe, A. B. and Isono, K», J. Mol. Biol, 131:16? <1979), ,a A N^—acetilação de dois dos produtos a partir do precursor proteína proopiomelanocortin apresenta um acentuada efeito regulador sobre a actividade biológica destes polipeptideos; a actxv.idade apioide da β-endorfina é completamente suprimida, enquanto que o efeito melanctrópico de α—§ΐπ é aumentado se Ne-acetilado (Smytft et ai., Nature 279:252 <1970)$ Bmyth, D»B. and Zakarian, S.Nature 288:613 <198β)| a Ramacharidran, J» and

Li, C.H., Adv, Ensymol» 29:391 <1967)). A actina citoplasmica tanto acetilada como não acetilada das células de cultura de Drosophila participa na reunião de microfilamentos, esta última, contudo, com menor eficiência (Berger et aL, Biochem, 6enet» 19:321 (1981)), Mais recentemente, a ta:-ca do turnover da proteína mediada pelo sistema de degradação dependente da ubiquitina revelou depender da presença de um grupo cc-Mi-k, no terminus-N de ,* A* uma proteina CHershko et al„» Proc. Nat 1 Acad. Sei,_U«S.A„ 81,:9021-9025 <1984) and Bachmair et al.» Science 234s 179-186 ¢1986)), sugerindo que a Nw-acetiIaç3o pode desempenhar um papel no impedimento do turnover da proteina» A Na-acetilação é mediada por pelo menos uma Na-acetil-transferase, que catalisa a transferência de um grupo acetilo do acetil coensima A para o grupo <s—NH=, das proteínas e peptídeos» As N^-aceyiltransferases foram préviamente demonstradas em E, coli (Brot, N», st......al,, Arch»_______Biqçhsm,».......Bigghys»_ 155:475-477 <1973)), fígado de rato (Pestana, A,, et al»» Biochemistrv 14:1397-1403 <1975)? Pestana, A., at al», Biochemistrv 14:1404--1412 <1975)5 Vamada, R«, et, al,, Ist Svfflposium of the Protein Societv 625:34 Í19S7)), cérebro de rato <0 Donohue, T.L., J» Biol, Chgffl. 258«2163-2167 <1983), pituitária do rato (Woodford, ' £ V- ο.ν ' £ V- ο.ν Τ»A», et al < ? íLe. et ai .. &s-ch, Biochem. Biophys

Biol. Chem. 254j4993-4999 (1979); Pease, K.A.

We( al., J 212s177-185 (1981); Bembotski, ríqí. Chem, 257i10501-10509 (1982)\ Chappell, M.C., at

Riel „ Chem» 261 s 1088-1091 ¢1986)), pituitária bovina (Seíutio tski, C»C»$ J a 6i.ol 8 Chem. 257s 10501—105ví9 \ 198.^)) , cristã.— linos bovinos (Sranqer 5 M., at ai., Proc. Natl * ficad. Sei» USA 7353Θ10-314 ¢1976)), oviducto de de galinha (Tsunasawa, S«9 et al-, .1- Riochgn. 87s645-650 ¢19853)), e germe de trigo (Kido, H., at al», arrh, Biochem. Bioahvs. 208595-100 <1981)). Os enzimas

Ma-acetiltransferass destas fontes, contudo, nunca foram purificados utais do que 40 vezes»

Resumo dn Invento A Wa-aceiilaçSo constitui a principal uiodif icsçSa química do grupo s-amino de proteínas que ocorrem em células eucariontes. A Na~acetilação afecta aceniuadamenie a actividade biológica de proteínas e de peptídeos. Além disso, a taxa do turnover da proteina mediado pelo sistema de degradação dependente da ubiquitina depende da presença de um α-amino, e esta depsndencia indica que a N^-aceiiIaçao pode desempenhar um papel crucial no impedimento do turnover da proteina. A transferencia de um grupo aeetilo a partir de acefcil— -Coenzima A para o grupo «-amino de resíduos cornamente acetilados <tais como serina, alanina, metionina, glicina e treoninaí em proteínas foi considerada préviamente como sendo cataiisada por uma única N^-acetiltransferase. 0 presente invento revela que uma segunda N^-acetiltransferase é responsável pela acetilaçso dos resíduos da metionina» A identificação desta Na~acetiltransferase da metionina proporciona uma explicação para as duas classes distintas de proteínas Ma-acetiladas que existem na naturezas aquelas cujo iniciador metionina é acetilado, e aquelas cujo ί

penúltimo resíduo é acetilado após clivagem do iniciador metioni-na. uma de

Em detalhe, o presente invento refere-se assim a Na-acetiltransferase que se apresenta substancialmente livre con tam.inan tes. 0 invento refere-se ainda a uma célula que expressa uma N^-acetí1transferase da metionina alterada- da levedura que alterada, e, em substancia1men te 0 inventa também se refere a célula expressa uma W -acetiltransferase· da metionina particular, uma célula da levedura a que falta activiodade aaal da M^-acetiltrarvferase. 0 invento inclui também uma molécula recombinante codificando uma M^-acetiltransferase da metionina. 0 invento também inclui uma célula que expressa, uma molécula recombinante codificando uma Na—acetiltransferase da metionina- 0 invento também proporciona um método para produzir um peptídeo a que falta um terminas amino N^-acetilado da metionina que compreende a expressão do peptídeo numa célula da levedura tendo uma mutação no gene da N^-acetiltransferase da metionina da levedura, em que a mutação resulta, em substancial perda de actividade da N^-acetíltransferase da metionina, e que torna a célula incapaz de catalisar a N^—acetilação do peptídeo. 0 invento também proporciona um método para determinar a sequência de amino ácidos de um peptídeo ou proteina que compreende s * ‘i ί

A» expressão -do peptideo ou proteina numa célula de levedura tenda uma mutação num'gene que codifica uma M^-acetiltransferase da metionina* em que a mutação resulta na perda substancial da actividade da Na~açetiltransferase da metionina, e torna a. célula incapas de catalisar a N^-acetilaçãc de peptldeos ou proteínas§ B» recuperação da peptideo ou proteina; e _ C. determinação da sequência de amino ácidos do peptideo ou proteina»

Descrição Resumida das Fiourass A Figura 1 .indica uma via proposta para a modificação translacional de proteínas eucariontes envolvendo aminopeptidase da metionina (liftp) e uma única N^-acetiltransferase CN^-AT). A Figura 2 indica íft) via proposta para a modificação translacional de proteínas eucariontes mediada por N^—acefcil— transferase da metionina <Μ-ΝαΑΤ)5 aminopeptidase da metionina (MAP), e N^-aceti 1 transferase <.Na-AT) , e <B> via alternativa envolvendo uma única Ν'*-AT actuando em dois estádios diferentes de acetilaçSo e de hidrolase de ac 5.1-amino ácido (AAH)»

Descrição das Aoresentacões Preferidass A» N^-acetiltransferases A M^-aceti 1 ação constitui a modificação química mais comum do grupo «-amino nos terminais de amino de proteínas eucariontes (Tsunasawa, S„3 et al., Hethods Enzvmol» 106s165 (Í984); Driessen, H.P.C., et al» » CRC Crit» Rev» Biochem. 18;281 (1985); Wold* F», Trenda Biochem» Sei. 9s256 (1984); Jornvall, H» ? J» Theoret» Biol» 55; 1 (1975); Rubenstein, F’» et al»» »J» ί

Biol, Chem» 254s11142 í1979))= Marita (narita, K,, Biochem™ Biophvs,, Acta 2gsl84 (1958)) foram os primeiros a demonstrar a presença de um grupo f^-acetilo -na proteina de revestimento do vírus mosaica do tabaco, e é hoje sabida que 5@-8β% das prateinas dos eucariontes são acetiladas ÍBrown, J»L«, et al», J» Biol. Chem» 251 s 1 &Φ9 (1976) \ Brown s u . L = , J »......Βία 1=......Chem »„ 254 e 1448 (1979) ? Brown, Intl» Congress Biochem. Abstr», Vol. íí, International Union of Biochemistry, Canada, ρ» 9® (1979))= Por exemplo, verificou-se que a Na-acetilaçao tem um profunda efeito regulador sobre a actividade biológica da proopiomslanocortin. A actividade opioide da β-endorfína é complstamente suprimida, enquanto que o efeito melanotropico da hormona estimuladora do «-fflelanocito se apresenta acsntuadamente aumentado (Smyth, D»8. et al.. Nature 279s252 (1979)5 Smyth, D»B, et al», Nature 288:613 (1980) 5 Ramachandran, J. et al.. Adv. Enzvaol. 29:591 (1967)). A actina não acetilada participa menos eficientemente na reunião dos microfilamentos do que a actina Mu-acetilada (Berger, E.M, et al =, Biochem „ Genet = 1.9139í (1981)) »

Em contraste com a hemoglobina não-aeeiilada, normal, a variante da hemoglobina Raleigh <β^ valin —> acatilalanina), a hemoglobina fetal F1 humana secundária, e a hemoglobina felina com resíduos amino-terminais N -acetilados apresentam uma afinidade diminuída em relação ao oxigénio e uma interseção diminuída com co-factores fosfato orgânico CTaketa, F» et al.» J* Biol» Chem, 246s4471 (1971)? Moo-Pen, W.F. et al „, Biochem. 16:4872 C1 in u Invést= 49s iΘ88 ( í970>)

Sc ience

Além disso, a taxa do turnover da proteina mediada pelo sistema de degradação dependente de ubiquitin depende da presença de um grupo α-amino no terminus-amino de proteínas modelo (Hershko, ft«, et al», Proc. Natl» Acad. Sei» USA 81.:7021 (1984); Bachmair, A», et al» . Science 254a 179 (1980)? Mayer, A» et al»,

Science 244 si 48# C i 989)} , e esta dependeríeis indica que a N^-ace-tilação pode desempenhar um papel cruciai no impedimento do turnover da proteína» Assim., a Nu-acetilação desempenha papeis importantes na regulação de diversas funções proteicas»

Existem duas ciasses distintas de proteínas Na-acetila~ dasj (i) aquelas em que o penúltimo resíduo é acetilado após clivagem do iniciador metionina e íii) aquelas cuja iniciador metionina é acetilado (Arfin, S.M», et al», Biochemistrv 27s7979 (1988)5 Smith, J.A., et em Therapeutic Peptides and al

Proteínas fissessing the New T&chnoiogigs» Marshak, D«R«, s eds., Cold Spring Harhor Laboratory, Cold Dpririg Harbor, New Yorks pp„ 69-75 (1988)) é indicada na Figura i uma via proposta para a modificação co-translacional de profceinas eucariantes envolvendo aminapepfcidase da metionina (MAP) e uma. única Na-acetiltransfera-se CN^-AT), tal como foi préviamente proposto por Arfin and Bradshaw (Arfin, S«M», et al.Biochemistrv 27s7979 (1908). Na via indicada.» MftP remove o iniciador Met de algumas mas não de outras proteínas s uma única Na-AT acetilatos de certas proteínas de cada classe» 0 iniciador metionina, penúltimo resíduo, e grupo acetilo no grupo ít-amino são indicados por Η, X, e Ac, respecti- vamente» 0 polipeptídeo nascente ê indicado (---)«As aeçoes positivas (+> e negativas (-> dos encimas para o substrato proteico são indicadas, A transferencia de um grupo acetilo do acetil-coenzima e. A para o grupo α-amino é catalisada por Na-aceti1transferas at al J» Biol» Chem

Recentemente, NA-acetiltransferases com substrato específico id‘êntico foram purificadas a partir da levedura e do ovitíucfco da galinha (Lee, F-J«S«, et al., J« Bio.1» Chem. 2635 14948 (1988)? Kamitani, K„, et al.. J, Biol- Chem, 264s13189 (1989))» 0 encima 1®

da levedura é codificado por um único gene (AAA.l s também chamado ΜΑΤΙ (Mu 11 en, J.R», et al, EM50 ,3. 6:2Bè7 (1939)? Lee, F-J.S., et al. . J, Biochem.· 264 s 12559 (1989), que foi quebrado por substituição do gene para dar origem a um mu tanto do gene < aaa i? também chamado natí) faltando-lhe actividade da 1M -acetil transfe-rase (Mullen, J„R„, et al», EHBO J. Bs2©ô7 (1989).? Lee, F.-J.S., st ai,, 3. Bacteriol. 1.7ij5795-5802 <1989), Requerimento ds patente dos E.UtA· de John A. Bmith, e Fang—Jen S» Lee, registada sm 25 de Outubro, 1989, com o título "'ISOLAMENTO DE ESTIRPES DE SACCHAROHVCES CFREVISIAE TENDO ACTIVIDADE ALTERADA DA Ma~ACETIL-TRANSFERASE,"cujas referências são aqui incorporadas como referência). Este mutante teve uma esporulação deficiente, mostrou-se sensível ao calor, e apresentou uma função deficiente na união com tipo-a.

Uma análise de proteínas solúveis do mutante aaal e da estirpe de levedura do tipo-selvagem por elecfcrofores de gel bi-dimensional indicou que apenas 2*3% das proteínas solúveis no mutante aaal eram deslocadas electroforéticamente de um modo esperado para proteinas sem grupo W^-acetilo (Lee, F-J.S», et al, FEBS Letters(1989), cuja referência é aqui incorporada como referência). Pelo contrário, é sabida que apro^imadamente 5<õ% de proteinas solúveis são Na-acetiladas (Brown, J»L», et al.. J. Biol. Chem. 251: 1«3Θ9 ( 1976) ? Bro^n, J.L., J. Biol. Chem. 254:1448 (1979)? Brown, J.L., Intl. Congress Biochem. Abstr., Vol. 11, International Union of Biochemistry, Canada, p„ 9Ô (1979)). Corno o mutante aaal não tinha a única N^-acetiltransfe-rase conhecida, este achado sugeriu que se encontrava presente u.ma N^-acetiltransf erase adicional no mutante aaal. O presente invento deriva, em parte, desta descoberta. Q presente invento refere-se ao enzima Na-acetiltrans- ou ferase, ou a uma sua variante, que é “substancialmente pura"

que foi "substancialmente purificada". Tal como são aqui usadas,, as expressões "substancialmente pura" ou “substancialmente purifiçada" pretendem ser equivalentes, e servem para descrever uma N"‘-acetiltrânsferase da metionina que se apresenta substancial mente livre de um composto normalmente associado ao enzima no seu estado natural, isto è, uma proteína, hidrato de carbono, lipido, etc» A expressão pretende ainda descrever uma Na-acetil-transferase da metionina que é homogénea por um ou mais dos ensaios de pureza ou homogeneidade usados pelos especialistas nesta técnica. Por exemplo, uma iMu-acetil transferase da metionina substancialmente pura apresentará características constantes e reprodutíveis com desvias padrão experimentais para parâmetros tais como os que se seguems peso molecular, técnicas de cromato-grafia, etc. A expressão 11 substancial mente pura", contudo, não pretende excluir misturas artificiais ou sintéticas do enzima com outros compostos. A expressão também não pretende -excluir a presença de impurezas que não iniereferero com a actividade biológica do enzima, © que podem estar presentes, por exempla, devido a uma purificação incompleta. B„ Clonagem do Bene da N^-acetiltransferase

Pode-se usar qualquer um de entre uma série de processos para a clonagem do gene da N<3-acetil transferase de

Sacc.haromvces cerevisiae do presente invento. Um desses métodos pretende analisar uma biblioteca de vectores vaivém de implantes de cADN (derivados de uma célula expressando Nw-acetiltransferase) quanto à presença de um implante que contenha o gene da W^-acetiltransferase. Essa análise pode ser conduzida por trans- fecçãa de células com d vector fazendo—se então o ensaio em relação è. expressão da Na-acetiltransfers.se» 0 método preferido para a clonagem deste gene consiste em determinar a sequância de 12

amino ácidos do enzima N -acetiltransferase e em usar essas ssqu.§'ncias para indicar dispositivos de ADM (probos) capazes de hibridizar com cADN codificador da WM~acetiltransferase. Para realizar esta tarefa, fazem—se sequências da proisina N**—acetil— transferase purificada ou de fragmentos desta proteina (obtida, por exemplo, com brometo de ciancgénio, ou com proteases tais como papaina, quimotripsin ou tripsin (Oifce, Y. st al», J. Biol. Chem» 257 s9751-9758 (1982)5 Liu, C. at al.. Int» J, Fept» Protein Res. 218209-215 (1983))» De preferência, essa sequência é realizada usando aparelhos automáticos para realizar sequências. Se se fizerem sequências de peptídeos com mais de í@ amino ácidos» a informação sequencial é geralmente suficiente para permitir a clonagem de um gene tal como o gene para a Ms-acetxltransferase.

Uma vez a molécula completa, ou feita a sequência de um ou mais fragmentos peptídicos apropriados da molécula, são examinadas as sequências de ADM capazes de as codificar» Porque o código genética degenerou, pode-se usar mais um codão para codificar um determinado amino ácido (Watson, J.D., Ins Molecular B.i9j-.S0.Y...P.Í..Jíllê....S®.D..ê.íi 3rd Ed=, W«A« Benjamin, Inc», Hen 1 α Park, CA (1977), pp» 356-357)» Os fragmentos peptídicos são analisados para identificar sequências de amino ácidos que podem ser codificados por oligormcleétides tendo o grau mais baixo de degenerescência» Isto é realizado de preferência identifiçando sequências que contêm amino ácidos que são codificados por apenas um único codão» Embora ocasionalmente essas sequências de amino ácidos possam ser codificadas por apenas um oligonucleótido, frequentemente a sequência de amino ácidos pode ser codificadas por qualquer um de uma série de oligoncleótidos» Facto importante, enquanto todos os membros do conjunta contêm oligon-ucleótidos que são capazes de codificar o fragmento peptídico e, assim, contêm potencialmente a mesma sequência de nucleótidos que o gene que codifica o fragmento'peptídico, apenas um membro do conjunto

conténs uma sequência de nuc 1 sútidos que é idêntica è. sequência de nucleótidos deste gene. Porque este membro está presente no conjunto., e é capas de nibridisar o ADN mesmo na presença de outros membros do conjunto, é possível utilizar o conjunto não fraccionado de oligonucleótidos do mesmo modo que se utilizaria um único oligonucleótido para fazer a clonagem do gene que codifica o peptideo.

De um modo exactamente análogo ao descrioto anterior-mente pode-se utilizar um oligonucleótido í ou conjunto de oligonucleótido®)· que tem uma sequência de nucleótidos que é complementar da sequência de oligonucleótidos ou do conjunto de sequências que é capaz de codificar o fragmento peptídica.

Um oligonucleótido apropriado, ou. conjunto de oligonu-cleótidos que é capaz de codificar um fragmento do gene de NG~acetiltransferase (ou que é complementar em relação a esse oligonucleótido, ou conjunto de oligonucleótidos) é identificada (usando o processo anteriormente descrito), sintetizado, e hibridizado, por meios bem conhecidos nesta técnica, em relação a ADiM ou, com maior preferência, uma preparação de cÂDN derivada de células ds levedura que são capazes de expressar as sequências de gene da Na-acetiltransferase. Técnicas de hibridização de ácido nuclaico são apresentadas por Maniatis, T. et al-, In; Molecular Clonino» A laboratorv Manual, Cold Spring Harbor, NY (1982), e por Ham-as, B.D. and Higgins, S,J«5 In; Nuc 1 eic Ac id

Hvbridization. a Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985), cujas referências são aqui incorporadas como referência. A fonte de ADN ou de cADN usada terá sido, de preferência, enriquecida em relação a sequências de Na-acetiltransferase. Esse enriquecimento pode ser mais fácilmente obtido a partir de cADN obtido por extração de ARN a partir de células em cultura em condições que são caracterizadas por expressão de N acetiltransferes©, Técnicas tais como* ou semelhantes as as descritas anteriarmente permitiram real irar com êxito a clonagein de genes para deshidroçenases de aldsido humanas (Hsu, L.o et al

Proc,

Natl. ftcad» Sc et a1», Eur , USA 82;5771-5775 (1985)), fihronectin (Suzuki, Mol. Biol- Oraan. 3 - 4ϊ2519-2524 ¢1985)), o gene do receptor de estrogénio humano (Walter, P. et .al,».? Proc»—,!?jat_L°. ftcad. Sei- USA 82s7889-7893 ¢1985)), activadordo plasminogénio do tipo tissular (Pennica, D» et al,, Matura 301.5214-221 (198o)} e ADM complementar da fosfatas® alcalina da placenta de termo humana (Kam, W= et al«, Proc. Mat l« Acad. S.6. §.<£.*8715—8/19 (1985)>.

Numa via alternativa preferida de clonagcm o gene Na-aceti1transferase, uma livraria de vectores de expressão é preparada por clonagem de AON ou, com maior preferencia de cADN, a partir de uma célula capaz de expressar a N —acetiltransferase num vector de expressão» ft livraria é então analisada quanto a membros capazes de expressar uma proteina que se .ligue ao anticorpo anti-N -acetiltransferase, e que tenha uma sequência de nucleótidos que seja capaz de codificar polipeptideos que tenham a mesma sequência de amino ácidos que a N®—acetiltransferase ou fragmentos de Na-adetiltransferase» 0 gene da Na-sceti2transferase clonado, obtido por meio de métodos descritos anteriarmente, pade ser operàvelmente ligado a u.m vector de expressão, e introduzido em células bacterianas ou eucariontes a fim de produzir a proteina da Na-acetlltransferase» As técnicas para essas manipulações são apresentadas por Maniatis, T. et al,. supra» e são bem conhecidas nesta técnica. A codificação da-sequência de A DM para N'"'~acati 1 trans— ferase pode ser derivada de uma série de fontes» Por exemplo, rnARN codificado para N01—acetiltransíerase pode ser isolado a partir de tecidos de qualquer espécie que produza α enzima, usando o método de mancha Northern CAlwine et al»* Nethod Enzvmol» 69g22Θ-242 (1979)), e dispositivos de oligonucleótidos marcados» 0 rARN pode ser então convertido no cftBN por técnicas conhecidas pelos especialistas nesta técnica» 0 dispositivo de ADN pode ser marcado com um grupo detectável« Esse grupo detectável pode ser qualquer material tendo uma propriedade física ou química detectável» Esses materiais têm sido bem desenvolvidos no campo dos imunoensaios e em geral a maior parte dos marcadores úteis nesses métodos pode ser aplicada ao presente- invento» Particuiarmente úteis são grupas enzimáticamente activos, tais como enzimas (ver Clin» Chem» 22ϊ1243 <1976)), substratos ensimáticos íver Patente Britânica No» 1.548.741), coenzimas (ver Patente dos E.U.A, No» 4.230.797 e 4,238.565) e inibidores enzimáticos íver Patente dos E.U.A» No» 4»134,792)g agentes de fluorescência (ver Clin. Chem. 25s353 <1979))p cromóforos; agentes de luminescência tais como agentes de quimioluminescêrtcia e agentes de bio 1 um 1 nescê'ncia (ver Clin. Chem» 25s512 (1979))p ligandas específicamente ligáveisρ pares j'Jn s, com interactuação próxima? e radioisótopos tais como '""Ή. Τ'"? 1 P„ 1'"“ l e 14f m-arcadore e pares de marcação são detecta- dos tendo como base as suas próprias propriedades físicas (por exemplo, agentes de fluorescência, cromóforos e radioisótopos) ou as suas propriedades reactivas ou de ligação (por exemplo enzimas, substratos enzimáticos, coenzimas e inibidores). Por exemplo, um dispositivo marcado çom cofactor pode ser detectado adicionando o enzima em relação ao qual o marcador è cofactor e um substrato para o enzima» Por exemplo, pode-se usar um enzima que actue sobre o substrato a fim ds gerar um produto com uma propriedade física mensurável» Exemplos deste' último incluem, mas não se limitam a, beta-galactosidase, fosfatase alcalina e peroxidases» _y

Variantes de Sequência de Amino.Ácidos da N^-aceti1transferase

As variantes da sequência de amino ácidos da N —acetil— transferase podem ser preparadas introduzindo mutações na sequên-cia de cftDN de Ν’®—acetil transferase clonada. Essas variantes incluem, por exemplo, eliminações a partir de, ou inserções ou substituições de, resíduos na sequência de amino ácidos codificada pelo gene de Nw-acetiltransferase. Pode ser feita qualquer combinação de eliminação, inserção e substituição, òbviamente, a não ser que sejam desejados mutantes nulos, as mutações que vão ser feitas no ADN codificando a variante nSo devem colocar a sequência fora de um quadro de leitura e de preferência não irão criar regiões complementares que possam produzir estrutura otARN secundária (ver Publicação do requerimento da Patente EP Mo. 75.444).

Ao nível genético, estas variantes habitualmente são preparadas por mutegenese de nucleátidos dirigida ao sítio no ADN codificando a N®-acetiltransferase, produzindo desse modo a variante, e em seguida expressando o ADN em cultura de células recombinantes.

Embora o sítio para introdução de uma variação da sequência de amino ácidas possa ser determinada antecipadamente, a mutação p.er..se não necessita de ser prédeterminada. Por exemplo, a fim de optimizar a performance da uma mutação num determinado sítio, pode ser realizada.mutagenese ao acaso no codão ou % 17

região alvos e as variantes expressas de Na-acetiltransferase podem ser analisadas em relação a uma combinação óptima de actividade desejada.·. As técnicas para realizar as mutações de substituição em sities predeterminados no ADN tendo uma. sequência conhecida são bem conhecidas, por exemplo, mutagenese específica sm relação ao sitio» cl A preparação de uma variante de N —acetiltransferase de acordo com o que aqui foi dito é de preferência realizada por mutagenese específica. em relação ao sitio de ABM que codifica uma variante preparada anteriornente ou uma versão não variante rfa proteina. A mutagenese especifica em relação ao sitio permite a produção ds variantes da. Ν'*—acetil transf erase pela utilização de sequências de olxgonucleótidos específicas que codificam a sequência de ADN da mutação desejada, assim como um número suficiente de nucleótidos adjacentes, para proporcionar um sequência de prímeros (molécula cuja presença è requerida para a formação de mais moléculas do mesmo tipo) de tamanho e complexidade sequencial suficientes para formar um duplex estável em ambos os lados da junção de eliminação a ser cruzada. Tipicamente, é preferido um prímero com um comprimento de cerca de 20 a 25 nucleótidos, com cerca de 5 a 10 resíduos em ambos os lados da junção da sequência a ser alterada. Em geral, a técnica da mutagéness especifica em relação ao sítio é bem conhecida neste campo, tal como á exemplificado por publicações tais como Adelman et al.. DMA 2slS3 (1983), cuja apresentação é aqui incorporada como referência.

Como irá ser constatado, a técnica de mutagenese específica em relação ao sítio utiliza tipicamente um vecfcor fágico que existe numa forma tanto helicoidal simples como helicoidal dupla. Os vectores típicos úteis em mutageness dirigida ao sítio incluem vectores tais como o agente fágico Í113, por

Vr\ 5*0' exemplo5 tal como é indicado por Messíng, J. et—al., 3rd Cleveland Symp» Macrorolecules Recotubinant UNA, Editor A» Walton, Elsevier, Amstardam < i98í 5 , cuja apresentação é aqui incorporada como referência» Estes agentes fágicos encontram-se comercializados e a sua utilização è geralmente bem conhecida pelos especialistas nesta técnica» Alternativamente, vectores plasmídios que contêm um agente fágico de hélice simples que origina repiicação (Veira et al»» Heth. Enzymo1» 153 s 3 (1987)) podem ser utilizados para se obter ADN de hélice simples»

Em geral, a mutageness dirigida ao sítio de acordo com o que foi aqui referido é realizada obtendo em primeiro lugar um vecter de hélice simples que inclui na sua sequência uma sequência de ADN que codifica a proteína importante» Um prímero de oligonucleétidos com a desejada sequência submetida a mutação é preparado, geralmente sintáticamente, por exemplo, pelo método de Crea et al», Proc» Nafcl. Acad» Sei» (USA) 75s5765 (1978). Este prímero é então recazido com o vector contenda sequência de proteína de hélice simples, e submetido a enzimas polimerizadores do ADN tais como fragmenta I Klenaw da polimerase de E« coli» para completar a síntese da hélice com mutação» Assim, uma sequência submetida a mutação e a segunda hélice apresentam a desejada mutação» Este vector heteroduplex é então usado para transformar células apropriadas tais como células JMlôl e 5^0 seleccionados danes que incluem vectores recombinantes apresentando o arranjo sequencial submetido a mutação» com maior

Depois de se ter seleccionado esse clone, a região da proteína submetida a mutação pode ser removida e colocada no vector apropriado para produção de proteína, geralmente um vector de expressão do tipo que pode ser utilizada para transformação de um hospedeiro apropriado» As eliminações na sequência de amino ácidos variam geralmente entre 1 e 3© resíduos. PC·'·'··' preferincia í a 1& resíduosf e são tipicamente (embora não necessári ame-n te) eon t íguas.

As inserções na sequência de amimo ácidos incluem fusões terminais no amino e/ou carboxilo de desde um resíduo a polipeptídeos de comprimento essencialmente não restringido, assim como inserções intrssequihciais de resíduos de amino ácidos-simples ou múltiplos. As inserções intrasecjuênciais (isto é5 inserções na sequência completa de codificação da Na-~acetiltrans-ferase) podem variar geralmente entre cerca de 1 e 1Θ resíduos5 com maior preferincia entre 1 e 5. Um exemplo de uma inserção terminal inclui uma fusão de uma sequência extraordinária, quer heteráIoga quer homóloga em relação à célula hospedeira, no terminus-N da Na-acetiltransferase para facilitar a secreção de Na~acetiltransfer.ase em plena maturação a partir dos hospedeiros recombinant.es. 0 terceiro grupa de variantes são aqueles em que pelo menos um resíduo amino ácida na Na~acetiltransferase, e de preferincia!. apenas um, foi removido sendo inserida em seu lugar um resíduo diferente. Esssas substituições são feitas de preferincia de acordo com o Quadro 1 que se segue quando se deseja modular finamente as características da Na-aceti1transi'erase„

SUBSTITUIÇÕES DE AMINO ÁCIDO

Resíduo Original Exemplos de Substituições

Ala gly; ser Arg lys Asn gin; his Asp glu Cys ser Gin asn Glu asp Gly ala; pro His asn; gin Ile leu; vai Leu ile; vai Lys arg; gin; glu Met leu; tyr; ile Phe met; leu; tyr Ser thr Thr ser Trp tyr Tyr trp; phe Vai ile; leu São feitas alterações substanciais !- na identidade funcional ou imunológica seleccionando substituiçõí ?s que sej am menos conservatiy as do que as indicadas no Quadro 1, isto é, seleccionando resíduos que diferem meie significativamente no seu efeito sobre a manutenção de ía) a estrutura-da espinha dorsal do polipeptídeo na zona de substituição, por exemplo., uma conformação plana ou helicoidal, íh> a carga ds hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou íc) a massa da cadeia lateral. As substituições que em geral são esperadas para"ãqueles em que (a) glicina e/ou pralina é substituída par outra amina ácido ou ê eliminada au inserida? íb> um resíduo hidrofílico, por exemplo, serilo ou treonilo, substitui ou é substituído por um resíduo hidrofóbico, por exemplo leucilo, isoleucilo, fenilalaniio, valilo, au alanilo? íc> um resíduo de cisteina substitui ou é substituído por qualquer outro resíduo? <d) um resíduo tendo uma cadeia lateral electropositiva, por exemplo, lisilo, arginilo, ou histidilo, substitui ou é substituído por tun resíduo tendo uma carga elsctronegativa, por exemplo, glutamilo ou aspartilo? ou íe) um resíduo tendo uma cadeia lateral volumosa, por exemplo, fenilalanina, substitui ou é substituido por um resíduo não tendo essa cadeia lateral, por exemplo glicina»

Mio se espera que a maior parte das eliminações e inserções, e substituições em particular, produzam alterações radicais nas características da molécula. Contudo, quando è difícil predizer o efeito exacto da substituição, eliminaçlo ou inserção antes da sua realização, um especialista nesta técnica considerará que o efeito será avaliada por enasaios com análises de rotina» Por exemplo, uma variante é tipicamente realizada por mutagenese específica em relação ao sítio do ácido nucleico natural que codifica a Na-acet.iltrarisferase, expressão do ácido nucleico variante em cultura de células recombinarstes, e, facultativamente, purificação a partir da cultura de células, por exemplo, por absorção de imunoafinídade numa coluna políclona! de anti-M^-acetiltransferase ípara absorver a variante ligando-a a pelo menos um epítopo imunitário restante)* A actividade do lisado celular ou da variante purificada de Ma-acetiltransferase á entlo avaliada num ensaio de análise apropriado para a característica desejada» Por exemplo, uma alteração na característica imunológica da Wa-acetiltransferase . V*

alterada, tal come? afinidade medida por meio de um imunoensa -¾... _ h . ν' v- ' . para um determinado anticorpo, é io do tipo competitivo. Modifica o>; idação-redução ções dessas propriedades proteicas tais como da ou estabxlidade térmica, hidrofobicirfade, susceptibiI idade am relação a degradação prateaiítica ou a tend'ência par-a agregação com veículos ou em multímeros são avaliadas por métodos bem conhecidos dos especialistas nesta técnica = A fim de identificar variantes das Na-aceti1transfera-ses a que falta uma actividade substancial da Na-acetiltransfera-se, clones da Na~aceti1transferase normal (isto é activa) podem ser submetidos a mutação, e introduzidos num mutante nulo. Vista que a maior parte dos transformantes irão apresentar actividade da Na~acetiltransferase, os clones sem actividade da Ma-acetil-transferase podem ser rápidamente identifiçados.

De um modo análogo, è possível identificar clones apresentando actividade aumentada ou. alterada da N —aceti1trans— ferase. Clones de alslo nulo (tendo substituiç^Q ou eliminação de 1“1@ antino ácidos) podem ser submetidos a mutação e introduzidos numa célula que apresente uma deficiente activx<^atíe da ^ ”acer.il--transferase (tal como um mutante nulo). Os clones que, devido <a mutagenese, receberam u?na mutação "correctara" ou compensadora" irão, após introdução na célula, e>;pressar actividade sa H ace ti I transf srase?. Esta actividade pode ser ensaiada (do modo descrito anteriormentsí e podem ser obtidas s® variantes alteradas desejadas. 23 D.

Na-acetiltransfsrase

As moléculas de ADN ou de cftDN que codificam o enzima W^-acetiltransferase do presente invento podem ser ligadas de um modo operatório num vector de expressão e introduzidas numa célula hospedeiro para permitir a expressão do enzima Na-acetil~ transferase por essa célula» É referida que as sequências de ADN itais como uma sequência de região promotora e uma sequência de ·—' codificação do enzima desejada) são ligadas operéveIntente se a natureza da ligação entre as duas sequências de ADN não Ci> resultar na introdução de uma mutação em que um certo número de nucleótidos não divisível por três é inserido ou eliminado de modo a alguns codões triplet serem lidos incorrectamente durante a translação genética, ¢2) interferir com a capacidade da sequência da região promotora dirigir a transcrição da sequência genética de codificação do enzima desejado, ou <3> interferir com a capacidade da sequência genética do enzima desejado ser transcrita pela sequência da região promotora»

Cl A sequência de ADN que codifica a N -acetiltraneferaee pode ser recombinada com vector ADN de acordo com técnicas convencionais, incluindo os termini de extremidade embotada ou de extremidade em ziguezague para ligação, restrição da digestão do enzima para proporcionar termini apropriados, introdução de extremidades adesivas como seja apropriado, tratamento com fosfatase alcalina para evitar junções indesejáveis, s ligação com ligases apropriadas», O oresente invento inclui a expressão do enzima desejado em quaisquer células procariontes ou eucariontes» -η. χ .. ί ν χ '

Numa apresentação, é utilizado um vector que é capaz de integração das sequ@nc.ias genéticas desejadas no cromossoma da célula hospedeira» As células que integram de um modo estável o AON introduzido nos seus cromossomas podem ser seleccionadas introduzindo um ou mais marcadores que permitem a selecçSo das células hospedeiras que contêm o vector de expressão» 0 marcador pode proporcionar complsmentarmente uma auxotrafia no hospedeiro (tal como leu.2» ou ura3» que são marcadores auxotróficos comuns da levedura), resistência biocida, por exemplo, antibióticos, ou metais pesados, tais como cobre,' etc. 0 gene marcador seleccioná-vel pode ser ou directamente ligado às sequências genéticas de ABN a ser expressas, ou introduzido nas mesmas células por co-transformação.

Numa apresentação preferida, a sequência introduzida será incorporada num plasmídeo ou vector virai capaz de replica-ção autónoma no hospedeiro recipiente. Pode-se utilizar para esta finalidade um ampla série de vectores. Factores importantes a sar considerados na selecção de um determinado plasmideo ou vector virai incluems a facilidade com a qual as células recipiente que contêm o vector podem ser reconhecidas e seleccionadas das células recipiente que não contêm o vector; o número de cópias do vector desejado num determinado hospedeiros e se é ou não desejável que o vector faça "vaivém1* entre células hospedeiras de espécies diferentes. A N^-acetiltransferase do invento pode ser isolada e purificada de acordo com condições convencionais, tais como extracção, precipitação, cromatografia, cromatografia de afinidade, electroforese, etc»

1. Expressão em Células Procariontes

Os hospedeiros procariontes preferidos incluem bactérias tais coíso E „ coli. Bacil lus. Streotomvces , Fseudomonas , Salmonellat Serratia. etc. 0 hospdeiro procarionte ma is preferido é E„ coli« Os hospedeiros hacterisnos de particular interesse incluem E» coli estirpe 294 (ATCC 31446), E. coli X1776 (ATCC 31537)5 E. co1i W31ÍÔ CF ? lambda ? prototrófico (ATCC 27325)), e outras entercbactérias tais coro Salmonel1a typhimurium ou Serratia marcescens, e várias espécies de Pseudomonas» 0 hospedeiro procarionte deve ser compatível com ò replicon e com as sequências de controlo na expressão plasmidio»

Para expressar o enzima desejado numa célula procarion-te (tal camoj por exemplo, E. coli, 3. subtilis. Pseudomonas. Streptomvces, etc»), é necessário ligar de um modo operável a sequência de codificação do enzima desejada a um promotor proca-rionte funcional. Esses parâmetros podem ser ou constitutivos ou, com maior preferência, controláveis Cisto é induziveis ou desrs-primíveis). Exemplos de promotores constitutivos incluem o promotor int do bacteriofago S, e o promotor bla do gene fi-lacta-mase de pBR322, etc. Exemplos de promotores procariontes indusi- veis incluem os promotores principais direito e esquerdo do bacteriéfago >; CP^ e P^>, os promotores trp. recA. 1 ac Z, lací, qal, e tac de E. col1. a «-amilase (iilmanen, I., et al.. j. Bacteriol. 1.62s 176-182 (1985) e os promotores σ-28-especí f icos de B. subtil is CBilman, M.Z., et al.« Sene 32;11—2& (1984)), os promotores dos bacteriófagos de Bacillus CSryczan, T.J., In; The Molecular Bioloov of the Bacilli. Academic Press, Inc., ΜΎ (1982)), e promotores St reptomvces (Ward, J.M., et..al._, Mol. s<=>r>-Genet. 205s468-475 ÍÍ9B6))» Os promotores procariontes são revistas por Glick, B.R., (3. Ind. Hicrobiol. Is277-282 í1987))j ' M £ V v dtt

Cenatiempo, V. (Bidchimie ó8s5β5-5ί6 ( i98ó)) ? e Sottesman, <ftnn. Rev, Benet, 18 s 415-442 (1984))» A expressão apropriada numa célula procarionte também requere a presença de um sítio de ligação do ribosscroa numa direcção ao longo de uma molécula de ARW oposta à direcção na qual tem lugar a transcrição e a translação da sequência que codifica o gene» Esses sítios de ligação ao ribossoma são apresentados, por exemplo, por Boid, L=, et al. (finn. Rev» Hicí-ohiol. 35:365-404 (1981))= A sequência de codificação do enzima desejado e um promotor ligada de um modo operável podem ser introduzidos numa célula recipiente procarionte ou eucarionte ou como uma molécula não-replicadora de ADN (ou. ARN) , que pode ser uma molécula linear ou, com maior preferência, uma molécula circular covalente fechada» Visto estas moléculas serem incapazes de repiicação autónoma, a expressão do enzima desejado pode ocorrer através de expressão transitória da sequência introduzida» Alternativamente, pode ocorrer expressão permanente através da integração da sequência .introduzida no cromossoma hospedeiro» e bacteriófagos de streptomyces tais como

Os vectores procariontes preferidos incluem plasmídios tais como os que são capazes de repiicação em E» coli (tal como, por exemplo, pBR322, ColEl, pSCiei, pACYC 184, nVX, Esses plasmi-dios são, por exemplo, apresentados por Mania tis, I», -at al» (Ins Molecular Clonino» A Laboratorv Manual» Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, MY (1982))» Os plasmídios de Baci11us incluem pC194, pC221, pT127, etc» Esses plasmídios são apresentados por Sryczan, T» (Ins The Molecular Βχαίοαν of the Bacilli. Academic Press, NY (1982), pp» 307-329). Palsmídios de Streptamvces apropriados incluem DIJÍ01 (Kendall» !<»J»= et al»„ j» Bacteriol. 169s4177-4183 U987)), * *

0C3i (Chater, K.F„, et al»„ Ins Si>;th International Symposiuffl on Actinomycetalas Bioiogy» ftkademiai Kaido, Budapest , Hungary (1986), pp» 45-54). 0-5 plasmídios das pseudomonas são revistos por John 9 J.F», et al.» (Rev. Infect. Pis. 8 s 693-704 < 1986)),, e Izaki, K. (Jon» J. Bacteriol» 53s729-742 (1978))»

Uma vsz o vector ou a sequência contendo os elementos idealizados preparados fjara expressão, os elementos idealizados de AON podem ssr introduzidos num hospedeira apropriado» Podem ser utilizadas várias técnicas, tais como fusão protoplástica, precipitação de fosfato de cálcio, electroporação ou outras técnicas convencionais» Depois da fusão, as células são feitas crescer em meios e avaliadas quanto a actividades apropriadas» A expressão da sequãncia resulta na produção de atninopeptidase específica em relação ao substrato» 2. Expressão em Células Eucariontes

Os hospedeiros eucariontes preferidos incluem levedura, fungos (especialmente Aspergi!lus)» células de mamíferos (tais como, por exemplo, células humanas ou de primatas) e células de plantas quer in vivo» quer em cultura de tecidos» A expressão do enzima desejado em hospedeiros eucariontes requere- a utilização de regiões reguladoras eucariontes» Essas regiSes incluirão, em geral, uma região promotora suficiente para dirigir a iniciação da síntese de ARN» Os promotores eucariontes preferidos incluem o promotor da gene I nustalotianei-na do ratinho (Hamer, D», et al., J» nol» fiaol» Sen» í?273-238 (1982))? o promotor T!< do vírus herpes (McKnight, S», csll 51;555-365 <i982>>? o promotor precoce SV4B (Benoist, C», st al»» nature (London) 29@5-3θ4-31@ (1981))? o promotor do gene qa 14 da 4 4·

1evedura <Johnston? S = A., et al,, Z2s6971-6975 Í1982); Si1ver, P.A., (USA) 8125951-5955 í1984)).

Froc, Natlu Acad. Sei., (USA? et al„ Proc. Natl. Acad» Sei.

Como é sobejamente sabido., a translação do mARN euca-rionte ê iniciada no codão que codifica a primeira metionina. Por esta razão, Ê preferível assegurar que a ligação entre um promotor eucarionte e uma sequência de .ADN que codifica o enzima desejado (ou um seu derivado funcional) não contem quaisquer codões intervenientes que sejam capazes de codificar & metionina Cisto é, AUS>. A presença desses codões resulta quer numa formação de uma proteína de fusão (se o codão AUS se situar no mesmo quadro de leitura que a sequência de ADN que codifica o enzima desejado) quer numa mutação que desvia esse quadra (se o codão AU© não se encontrar no mesmo quadro de leitura que a sequência de codificação do enzima desejado). a. Expressão na Levedura ft levedura constitui o hospedeiro preferido do presente invento. A utilização de levedura proporciona vantagens substanciais pelo facto da levedura poder também apresentar modificações peptídicas pós-translacionais incluindo glicosilação» Existe um certo número de estratégias de ADN recombinante que utilizam sequências promotoras fortes e elevado número de copias de plasmídios que podem ser utilizadas para a produção das proteinas desejadas na levedura. A levedura reconhece sequências leader em produtos genéticos de mamíferos clonados e segrega peptídeos que têm sequências leader Cisto é, pré-peptideos)«

Podem ser utilizados quaisquer séries de sistemas de expressão genética da levedura. Exemplos desses vectores de expressão Incluem d circula de dias de expressão YEPÍ3, YCP 2 microns da levedura, as pl asm .ία YRP, etc., ou seus derivados»

Esses plasmídios são bêm conhecidos nesta técnica (Botstein, D», et ai.... Hiami Mntr. Svmo. 19g265-274 (1982), Broach». J.R., Ins The Molecular Bialogy i:rf the Yeast Sscçharomycess Life Cvcle and Inheritance., Cold Spririg Harbor Laboratory» Cold Spring Harbor, NY, p. 445-470 (1981)? Braach, J.R., Cell 28s203-204 < í882)). YEP13 é d vector preferido do presente invento» b. Expressão'em Células de Mamíferos

As células de mamíferos proporcionam modificações pós-translacionais às moléculas de proteína incluindo flexibilidade correcta ou glicosilação nos sítios correctos» As células de mamíferos que podem ser úteis incluem células de origem fibro-hlástica. tais como VERO ou CH0-K1, e seus derivados» Para um hospedeiro mamífero, encontram-se disponíveis vários vectores possíveis para a expressão do enzima desejado* Pode-se utilizar uma ampla série de sequências reguladoras transcricionaxs e transiacionais, dependendo da natureza do hospedeira» Qs sinais reguladores transcricionais a translacionais podem ser derivados de fontes virais, tais com o adenovirus, vírus do papiloma bovino, vírus Simian, ate», em que os sinais reguladores estio associados a um determinado gene que possui um elevado nível de expressão* Alternativamente, podem ser utilizados promotores a partir de produtos de expressão de mamíferos, tais como actina, colagènio, miosina, etc* Podem ser seleccionados sinais reguladores de iniciação transcricional que permitem repressão ou activa-ção, de modo a poder ser modulada a expressão de genes. Também apresentam interesse os sinais reguladores que são sensíveis è·. temperatura de modo tal que ao variar a temperatura a expressão pode ser reprimida ou iniciada, ou que são submetidas a regulação química, por exemplo, metaholito»

Para um hospedeira mamífero, encontram-se disponíveis pana exprsss*ão vários sistemas vectores possíveis. Uma classe de vsctores utiliza elementos ds ADN que proporcionam replicação autónoma de piasmídios extra-cromossómicos, derivados de vírus de animais tais coma a vírus do papiAoma bovino, vxrus polioma, adenovírus, ou vírus SV4©« Uma segunda classe de vectores baseia--se na integração das sequências genéticas desejadas no cromossoma do hospedeiro. As células· que integraram de um modo estável o AON introduzido nos seus cromossomas podem ser seleccionadas introduzindo também um ou mais marcadores que permitem a selecção das células hospedeiras que contêm o vactor de expressão. O marcador pode proporcionar prototropia a um hospedeiro auxotró~ pico, resistência biocida, por exemplo, antibióticos, ou metais pesados, tais como cobre, etc. O gene marcador seleccionável pode ou ser ligado directamente às sequências de ADN a ser expressas, ou introduzida na mesma célula por co~transformação» Podem, também ser necessários elementos adicionais para uma síntese óptima do rARM» Estes elementos podem incluir sinais de união, asssim como promotores de transcrição, agentes favorecedores, e sinais de terminação. Os vectores de expressão de cADW incorporando esses elementos incluem os descritos por Dkayama, H., Mol. Dell. Biol», 35280 (1983), e outros.

Expressão em Células de Plantas A Nw-âcetiltransferase do presente invento pode ser introduzida numa planta por técnicas de engenharia genética para aumentar a taxa de acetilação. é sabido que certos herbicidas são inactivados por acetilação. Assim, é possível produzir uma planta 31

que seja mais tolerante em relação ao herbicida» Assim numa outra apresentação deste invento., o gene da Na-acstiltransferase é usado para transformar uma planta para aumentar a tolerância herbicida da planta» A região de codificação para um gene da N^-acetiltrans-íerase que pode ser usado neste invento pode ser homóloga ou hateróloga em relação à célula ou planta a ser transformada» é necessário,, contudo, que a codificação da sequência genética para a N^-aceti2transferase seja expressa, e produzida, como uma proteína ou polipeptídeo funcional na célula da planta resultante» Assim, o invento compreende plantas contendo ou genes da Nw--acetil transferase homólogos ou genes da Na-aceti1transferase haterólogos que expressam o enzima.

Numa apresentação deste invento, a Na-acetiltransferase compreende uma N^-acetiltransferase da planta que é homóloga em relação à planta a ser transformada» Numa outra apresentação deste invento, a Na-*acetiltransferase compreende u.m enzima que é heterólogo em relação à planta a ser transformada» Além disso, pode-se usar neste invento ADN de ambos os genoras ADN e cADM que codificam um gene da N^-acetiltransferase. Além disso, um gene da Na-aceti1transferase pode ser construído parcialmente de um clone de cADN e parcialmente de um clone genómico» Além disso, a codificação de ADN para o gene da Na-acsti1transferase pode compreender porções de várias espécies»

Existe uma série de apresentações abrangidas no conceito amplo do invento» Numa destas apresentações, este invento compreende sequências genéticas quiméricass

\)a cé <a) uma primeira sequência genética codificando para etiltransfsrass que após expressão do gene numa rfeternu élula de planta è funcional para Ns-acet.i 1transferaseϊ <b) uma ou mais sequências genéticas adicionalíais) ligadas de um modo operável em qualquer dos lados da região codificadora da M^-acetiltransferase. Estas sequências genéticas adicionais contêm sequências para promotor(es) ou t.erminador(es) » As sequên— cias reguladoras da planta podem ser heterólogas ou homólogas em relação à célula hospedeira.

Numa apresentação preferida, o promotor do gene da N -aceti1transferase é usado para expressar a sequência genética quimérica. Outros promotores que podem ser usados na. sequência genética incluem promotores .nos, ocs, e CaHV. Um promotor eficiente para planta que pode ser usado é um promotor para planta de super-produçSo» Este promotor em ligação operável com a sequência genética para M^-acetiltransferase deverá ser capas de promover expressão da referida N^-acetil transf erase de- modo a que a planta transformada apresente tolerância aumentada em relação a um herbicida. Promotores de superprodução para planta que podem ser usados neste inventa incluem a promotor da subunidade pequena íss) da ribulose-i,i-bifosfato carboxilase a partir da soja (Berry-Lowe et al., J. Molecular and Aoo. 5sn., i.s 483-498 (1982)), e o promotor da proteína de ligação a/b da crorofila» Sabe-se que estes dois promotores são .ligeiramente induzidos em células de plantas eucariontes (ver, pôr exemplo, Senetic Enai-neerina of Plants- an Aoricultural Perspective, A. Cashmore, Plenum, New York 1983, páginas 29-38$ Corruzi, 8» et al., J. of Biol. Chem., 258s1399 (1983)| e Bunsmuir, P„ et a1.« J. of Mo1. and fioglied Genet.» 2g285 i1983)).

Além disso., numa outra apresentação preferida, a expressão da sequência genética quimérica compreendendo o gene da N^-acetiltransferase é ligada de um modo operável num esquema de leitura correcta com um promotor da planta e com uma sequência de sinal de secreção do gene» A sequência genética quimérica compreendendo um gene da N^-acetiltransferase ligado de um modo operável a um promotor de planta,, e na apresentação preferida com as sequências de sinal de secreção» pode ser ligada a um vsctor de clonagem apropriado» Em geral? são usados vectores piasmídios ou virais íbacteriófagos) contendo sequências de replicação e de controlo derivadas de espécies compatíveis com o hospedeiro» 0 vector de clonagem terá tipicamente uma origem de replicação assim como genes específicos que são capazes de proporcionar marcadores de selecção fenotípica em células hospedeiras transformadas,, tipicamente resistência aos antibióticos» Os vectores transformadores podem ser seiecctonados por estes marcadores fenotípicos após transformação numa célula hospedeira.»

As células hospedeiras que podem ser usadas neste invento incluem procariontes, incluindo hospedeiros bacterianos tais como E» coli, S» typhimurium„ e Serratia marcescens» Os hospedeiros eucariantes tais como a levedura ou fungos filamentosos podem também ser usadas neste invento» 0 vector de clonagem e a célula hospedeira, transformada com o vector são usados neste invento tipicamente para aumentar α número de cópias do vector» Com um número de cópias aumentado, os vectores contendo a gene de Na-acetiltransferase podem ser isolados e, por exemplo, usados para introduzir as sequências genéticas quiméricas nas células das plantas» 0 material genético contido no vector pode ser microinjectado directamente nas

Λ ϊ V células da planta pela utilização de micropipstas para transferir mecSnicamente o ADN reeombinante» D material genético pode também ser transferida para a célula da planta usando polieiilene glicol que forma um cos^plexo de precipitação com o material genético que Λ ϊ V é ficado pela célula- CPaszkoHsk: (1984)). et al. EMBO J- τ - i ~r_O**?· . / i. ‘ *

Numa apresentação alternativa deste invento, o gane da

Na-acetiltraneferase pode ser introduzido nas células da planta por e 1 ec troporaçao, (Fromm et ai,» "Expressiori of Genes

Transferred into Honocot and Dicot Plant Cells by *

Electroporation, "Proc. Nat 1- ftcad. Bei- U - S - A = 82s5824 i Í9B5)) -Nesta técnica, os protoplastos da planta são electroporados na presença de plamídios contendo os elementos idealizados genéticos da Na-acetiltransferase. Os impulsos eléctricos de elevada energia de campo permeabilizam reversívelmente as hiomembranas permitindo a introdução dos plasmídios. Os protoplastos da planta electroporados reformam a parede celular, dividem, e formam borreletes cicatriciais da planta- A selecção das células transformadas da planta com a Na—acetiltransferase expressa pode ser realizada usando os marcadores fenotípicos tal como foi descrita an teriormente-

Um outro método de introdução do gene da Ns-acetil~ transferase nas células da planta consiste em infectar a célula da planta com Aqrobacterium tumefaciens transformado com o gene de Na-acetiltransferase. Em condições apropriadas conhecidas na técnica, as células transformadas da planta são feitas crescer para formar rebentos de plantas, raizes, e se desenvolverem posteriormente em plantas. As sequências genéticas da MG—acetil— transferase podem ser introduzidas nas células apropriadas das plantas, por exemplo, por meio do plasmídio Ti de Agrobacterium tumefaciens. 0 plasmidio Ti é transmitido a células de plantas infectadas por fiqrobacterium tumefaciens e é integrado estávelmente no genoma da planta, (Horsch et &!..« "Inheritance of Functional Forsign Bsnes in Plants," Science 255.-5496-498 (1984>p Fraley et al., Froc. Matl ficad. Sei. U.S.fl. 8#s48#5 (1983)),

Os plasmidios Ti cont?S! duas regiões essenciais para a produção de células transformadas» Uma destas, denominada ADN de transferfrscia (T DNA), induz a formação de tumor, A outra, chamada região virulenta, é essencial para a formação mas não para a manutenção de tumores, A região de transferência de ADN, que transfere para o genoma da planta, pode ter o seu tamanha aumentado pela inserção da sequência genética do enzima sem que a sua capacidade de transferência seja afectada. Removendo os genes causadores de tumor de modo a que não continuem a interferir, o plasmídio Ti modificado pode então ser usado como um vector para a transferência dos elementos idealizados do gene do invento para uma célula de planta apropriada,

Todas as células de planta que podem ser transforladas por Agrohacterium e plantas completas regeneradas a partir das células transformadas podem também ser transformadas de acordo com o invento de modo a produzir plantas completas transformadas que contêm a gene da N^-aceti1transferase transferido»

Existem presente-mente dois modos diferentes de transformar células de plantas com Agrobacteriumg (i> co-cultura de Aarabacterium com protoplastos isolados de culturas, ou (2) transformação* de células ou tecidos -com Agr obac ter ium

Oíè O método <i) requere um sistema de cultura estabelecida que permita a cultura de protoplastos e a regeneração da planta a partir de protoplastos em cultura» 0 método <2) requere <a) que as células ou tecidos da planta sejam transformados por Aorobacterium e <b) que as células ou tecidos transformados possam ser induzidos para se regenerarem em plantas completas» No sistema binário, para haver infseção, são necessários dois plasmídioss um plasmídio contendo T-DIMft e um plasmidio vir»

Após transformação da célula da planta ou da planta, as células da planta ou plantas transformadas pelo plasmidio Ti de modo a que o enzima seja expresso, podem ser seleccionadas por meio de marcador fenotipico apropriado» Estes marcadores fenoti— picos incluem, mas não se limitam a, resistência ao antibiótico» SIo conhecidos nesta técnica outras marcadores fenotipicos que podem ser usados neste invento»

Todas as plantas a partir das quais se podem isolar e cultivar protoplastos para dar origem a plantas regeneradas completas podem ser transformadas pelo presente invento de modo a que sejam recuperadas plantas completas que contenham o gene transferido da NIjl-acelil transferase* Algumas plantas apropriadas incluem, por exemplo, espécies dos géneros Fragaría» Lotus, Medi cago. Onobrvchis* Trifoliem, Triaonella, Viana» Citrus, Linum, Seranium, Manicot» Dauçus, Arabidoosis» Brassica, Raphanus. Sinaosis, Atro-pa, Capsieum, Satura, Hyosc yamus,

Lvcopersion. Micotiana, Solanum» P-stunia» Digitalis» Hajgrana, Cichorium. Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum,

Hemeroca11is» Memesia» Pelaraonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salgiqlossis, Cueumis, Browallia» Blvcine, Lo 1 ium» Zea, Tri ticum Sorghum» e Satura« - V*· -V, . . · · ·

Existe uma evidência cada vez maior de que práticamente todas as plantas podem ser regeneradas a partir de células ou tecidas em cultura, incluindo mas não se limitando a todas as principais espécies de cereais, cana do açúcar, beterraba, algodão, árvores de fruto e outras árvores, verduras e legumes. Presentemente existe um conhecimento limitado sobre a possibilidade de todas estas plantas poderem ser transformadas por ftprobacterium„ As espécies que são uma planta hospedeiro natural para Agrobacterium podem ser transformáveis in vitro. As plantas monocotiledóneas, e em particular, os cereais e relvas, não são hospedeiros naturais de Agrobaçterium » Tentativas para as transformar usando fia robac ter ium não têm sido coroadas de êxito até uma data recente. (Hooykas-Van Slcgteren et al.. Nature 311s756-—764 (1984)). Existe agora uma evidência cada vez maior de que certas monocotiledóneas podem ser transformadas por fiqi-ohac ter ium. Usando novas técnicas experimentais que se tornaram SCtuaImante disponíveis, os cereais e certas espécies de relvas podem ser transformáveis. Géneros de plantas adicionais que podem ser transformadas por figrobacterium incluem IposoeaPassiflora. Cyclamen. Halus „ Prunus« Rosa, Ru bus. Populus, San ta ium. All.ium, Li 1 ium. Marcissus» ftnanas. Arachis. Phaseolus. e Pisum. A regeneração de plantas a partir de protoplastos de cultura é descrita em Evans et aL. “Protoplast Isolation and Cultura,11 em Handbook of Plant Ce 11 Culture l_sl24-176 (Hacmillan Publishing Co„, Metrf York, 1983) s M«R. Davey, "Recent Developments in the Culture and Rehensration of Plant Protoplasts, “ Protoplasts., 19B3 - Lecture Proceedings, pp. 19-29 (Birkhauser, Basal, 1983)5 P.J. Dais, "Protoplast Culture and Plant Regenera-tion of Cereais and Other Recalcitrant Crops," in Protoplasts 1983 - Lecture Proceedings, pp. 31-41 (Birkhauser, Basel, 1983); e H» Binding, "Regeneratian of Plants," in Plant Protoolasts. pp„ 21-37 (CRC Press, Boca Raton, 1985), ft regeneração varia de espécie para espécie de plantas, mas geralmente é proporcionada em primeiro lugar Lima suspensão de protoplastos transformados contendo sul 1 ti pias cópias do gene da Ma~acetiltransferase.-. A formação do embriga pode então ser induzida a partir de suspensões de protoplasto, até ao estádio de amadurecimento e germinação como embriões naturais. Os meios de cultura irão conter geral mente vários amirio ácidos e hormonas, tais como auxina e citoquininas. É também vantajoso adicionar ácido glutlmico e prolina ao meio, especialmente para espécies tais como milho e alfalfa. Os rebentos e as raizes normalmente desenvolvem-se simultâneamente. A regeneração eficiente dependerá do meio, do genotipo, e da história da cultura. Se estas tr§-s variáveis forem controladas, então a regeneração será completamente reproduzível e repetivai.

As plantas em plena maturação, que cresceram a partir das células de planta transformadas, são diferenciadas para produzirem plantas naturais reproduzidas. A planta reproduzida produz sementes contendo o gene para N^-acetiltransferase aumentada» Estas sementes podem crescer para produzir plantas que apresentam uma taxa aumentada de acetilação.

As plantas reproduzidas de acordo com este invento podem ser usadas para desenvolver híbridos tolerantes a herbicidas, Neste método, uma linhagem reproduzida tolerante a herbicida é cruzada com outra linhagem reproduzida a fim de produzir o híbrido»

Partes obtidas a partir da planta regenerada, tais como flores, sementes, folhas, ramos, frutos, etc. são abrangidas pelo ί i -V /

inventa contanto que estas partes compreendam as células tolerantes ao herbicida» Sãso também incluídos no âmbito deste invento a descendência e variantess e mutentes das plantas regeneradas.

Mas plantas diploides, tipicamente- uma planta originária pode ser transformada pela sequência genética da N^-acetí1-transferase e a outra planta originária è do tipo selvagem» Após cruzamento das plantas originárias, os híbridos da primeira geração ÍF1) revelarão uma distribuição de 1/2 de Mw-acetil trans-·· ferase/tipo selvagem:1/2 Na-acetiltransferase/tipo selvagem» Estes híbridos da primeira geração (Fl) são diferenciados para produzir híbridos da segunda geração íF2>» A distribuição genética dos híbridas F2 é de 1/4 Na-âcetiltransferase/Na~acetiltrans-ferase/N -acetiltransferase s 1/2 N^-acetiltransferase/tipo selvagem s 1/4 tipo selvagem/tipo selvagem» Os híbridas F2 com a estrutura genética de N^-acetiltransferase/N^-acetiltransferase sã‘o escolhidos como as plantas tolerantes aos herbicidas» acetila-

Tal como á- aqui usada, a variante descreve alterações feno-típicas que são estáveis e heriditárias, incluindo a variação heriditária que é transmitida - sexualmente à descendência das plantas, contanto que a variante compreenda ainda uma planta tolerante ao herbicida devido a uma taxa aumentada de scetilação» Também, tal como é usado aqui, o mutante descreve a variação como um resultado de condições ambientais, tais como radiação, ou como resultado da variação genética em que uma característica ê transmitida pela meiose de acordo com leis de heriditariadade bem estabelecidas» A planta mutante, contudo, deve apresentar ainda uma tolerância herbicida devido a uma taxa aumentada de ção de acordo com o invento» - 4@,α

Utilizações da Ν -Acetiltransferase do Presente Invento presente N ~a.cet.xl~ genes que

Tal como foi discutido anteriormente, o invento proporciona meios para a. produção de encimas transferase, e para a introdução de sequências de codificam estes encimas em diversos hospedeiros»

As células que não apresentam actividade da -acet.il- fl transfers.se (isto é que expressam uma M‘'-acetiltransfera.se a que falta substancialmente a actividade da Na-acetiltransferase) são altamente desejáveis para facilitar a determinação da sequência de amino ácidos das proteínas» Tal como foi discutido anterior- Λ mente, a presença de grupos N -acetilo nos amino ácidos das proteínas dificulta grandemente os esforças para determinar a sequência de amino ácidos dessas moléculas. Visto uma célula a que falta a actividade da Na-aceti1transferase não catalisar a transferência dos grupos acetilo para o terminas de amino das proteínas, uma proteína produzida nessa célula pode ser sequen-ciada rápidamente» Assim, por exemplo, uma célula com mutação nula no seu gene d-a Na-acetí 1 transf erase pode ser usada para produzir proteínas endógenas da levedura sem Na-scatilação» Essas células, por exemplo, podem ser usadas para expressar uma proteína ou peptidea recombinante a que falta um grupo acetilo no grupo a-amino da proteína (ou do peptideo)= Essas proteínas podem ser fácilmente sequenciadas usando métodos conhecidos»

De um modo semelhante, essa célula mutante nula pode ser usada como um hospedeiro para a produção de proteínas heteré-logas (isto é proteínas que não são naturalmente ou normalmente produzidas por essa célula) a fim de facilitar a elucidação da sequência de amino ácidos dessa proteina» f f

- 41 - ' , ,-ν°Λ A capacidade para produzir células mutantss cuja Na~acetiltransferase é mais aclive? ou é produzida a níveis mais elevados, do que a N^-acetiltransferase normal, é desejável quando se deseja produzir proteínas tendo Na-acetilaçlo aumentada» Tal como foi discutido antariormenie, essas proteínas sSo desejáveis pelo facto de serem mais estáveis do que as proteínas nSo-acetiladas» A capacidade de alterar a actividade da Na-acetíltrans-ferase em conformidade com uma actividade desejada (tal como especificidade do substrato aumentada ou diminuída, estabilidade térmica* etc») é útil pelo facto de permitir o desenvolvimento de células hospedeiras capazes de produzir proteínas tendo caracte-rísticas de Na-acatilação alteradas»

Os enzimas Na~acetiltransferase alteradas podem ser purificados e usados in vitro do mesmo modo que foi descrito anteriormente para as células mutantes do hospedeiro.

Tendo agora este invento sido descrito na sua generalidade* o mesmo seré mais detalhado tendo como referencia exemplos específicos, que sSo aqui incluídos tendo ap-enas fins ilustrativos, e que nâo se pretende que sejam limitativos, a nSo ser que especificado de um modo diferente» * Λ

EXEMPLO 1 ACÃO A A> PURIFICAÇÃO DE Na-ftCETILTRANSFERftSE ESPECIFICA EM REL METIOMIMA A PARTIR SE S« CEREVISIAE (ESTIRPE T3A-

Uma cultura f 1€? x 1 litro) de levedura <S» cerevisiae (estirpe t3a-a) foi feita crescer a 3Θ°C, 200 rpm em meio YDP lisados crús de levedura, e a usando inibidor 3 da proteina-terminada tal como foi prévia-e os usados p-ara avaliar a ados tal como foi descrita por para A^^ = 6,0« Foram preparados actividade da W -acetiltransfere.se se A íi-24) como substrato foi de mente descrito» Estes processos.* actividade enzimática foram realiz

Lee et ai- (Lee, F-J„S«, et ai -„ J. Biol., Chem„ 263s14948 (1988)? Kamitani, K«, et al.. J. Biol. Chem. 264;13188 (1989), cujas referfncias sSo aqui incorporadas como referência). N-Etilmaleimida (NEM), ácido iodoacético CIAA), iodoacetamida (IftM>, brometo de dimetil—<2-hidraxi-5-nitroben— zilísulfonium (HNBS(CFU)^~Br), M-acetilimidazole, p-cloromercu-ribenzoato ípCMB), M-br omosucc irsimida ÍNBS), pirocarbonato de dietilo (ΒΕΡΟ, HEPES, MES, CHES, DTT, hidroxilamina, albumina do soro bovino, padrões de proteína para determinações de 2-mercaptoetanol, glucose, sorbitol, liticasa, Bis-Tris, Tris e glicerol (grau de enzima) foram fornecidos por Sigma. BEAE--Sepharose CL-6B, Mono P ÍHR5/5), Poli tampão 96, Sepíiarose CL-6B foram fornecidos por Pharmacia.. Celulose DE-52 e celulose CM-52 foram fornecidas por Whatman. Reagente de ensaia da proteína (método de Bradford), hidroxilapatite (biogsl HT>, reagentes da electrofores Af fi-Gel Blue gel e SDS-PASE foram fornecidos por *Ç

Bio—Rad. Acetil coenzima A foi fornecido por Amersham, e o acetil coenzima A não maracado foi fornecido por P-L Biochemicals. Os reagentes e solventes para análise de amino ácidas e cocktails de cintilação Ready-Solv EP foram fornecidos

por Beckman» A membrana SP foi fornecida por Cuna Inc» ft membrana ΡΜ--3Θ foi fornecida por ftmicon « 0 eKíracto de levedura e Bacto- ~peptona foram fornecidos por Difco. HC1 (6 N) em constante ebulição e Polybrene foram fornecidos por Pierce» 0 fenol foi fornecido por BRL» O mieradialisador foi fornecido por Health ^ Products» Os reagentes e solventes para análise sequencial das proteinas foram fornecidas por Applied Biasystems» Os reagentes para a síntese de peptídeos foram fornecidos por Applied Siosystems, e os solventes para a síntese de peptídeos foram fornecidos por Anachem» Os amino ácidos-Boc foram fornecidos por Peninsula. Todos os outros produtos químicos eram da qualidade reagente ou melhores» • As medições com UV foram obtidas usando um espectrofo-tómetro Hewlett-Packard 8450A UV» Os ensaios das proteinas foram realizados pelo método de Bradford ESradford, M»M», Anal» Biachem» 72s248-254 (1976)3 usando albumina do soro bovino como o padrão» Amostras radíoaetivas foram analisadas num contador de cintilação Beckman LS 3801» A actividade da N^-acetiltransferase foi determinada tal como foi préviamente descrito ELee et a 1 *u» Biol» Chem» 263s14948-14955 (1988)3. Porções alíquotas do lisado ou fracções ^ cromatogréficas foram adicionadas a tubos de Eppendorf de 1 r,5 ml contendo uma mistura de reacção de HEPES 50 mM, pH 7,4, KC1 150 mM, DTT 1 mM, 25 μΜ de C ~'H 3 acetil coenzima A í Θ , 5 μΟί> e 50 μΜ de peptídeo sintético com um volume final ajustado de ί&Θ μΐ» A mistura do ensaio foi incubada a 30°C durante 30 minutos» A reacção foi interrompida adicionando 17 μΐ de ácido acético Θ?5 M e arrefecida num banha de gela» fts amostras da reacção foram filtradas através de discos de membrana SP (Cuno> (préviamente pré-dilatados em acido acético 0,5 M), sendo entSo lavadas três vezes com í ml de ácido acético 0,5 M em amostras repetidas

Millipare 1225« As membranas parcialmente secas foram colocadas em cocktail de cintilação e contadas coe um contador de cintilação Beckman LS 38© 1» Uma unidade de actividade foi definida como a quantidade de enzima capaz de transferir X pmol do grupo Í'"'H3 acetilo do ΓΊ43 acetil coenzima A para peptxdeo sintético por min em condições de ensaio enzimático padrão definidas anteriormente. A solução flutuante de lisados crés foi concentrada até ura volume de 1® ml, usando uma membrana de ultrafiltração e

dialisado durante a noite com 2 x 2 litros de tampão HBB CHEPES 2® mM, pH 7,4, DDT ©,5 mM, i©% ív/v) da glicerol e ©,02% NaN^> *«> contendo KC1 ©,2 Μ. Γ.1 líquida flutuante dialisado foi aplicado a DEAE Bepbarose CL-6B (2,5 x 55 cm) equilibrada com com tampão HD6 contendo K.C1 Φ,2 M e eluida com o mesmo tampão. As fracções ¢4 ml cada) contendo actividade enzimática foram reunidas, concentradas até um volume de 5 ml, dialisadas durante a noite com 2 x 2 litros de tampão HDB contenda 0,05 KOI θ·,®5, sendo então aplicadas a uma coluna de celulose DE-52 (2,5 x 55 cro) equilibrada com tampão HDS contendo KOI β,05 M« A coluna foi eluida com um gradiente linear de KC1 0,©5 Μ (25© ml) a ©,5 M (25© ml) em tampão HD8« FracçSes (3,5 ml cada) contendo actividade ©nzimática foram reunidas, concentradas até um volume de 2,5 ml, dialisadas durante a noite com 2 x 2 litros de tampão HDS (MES 2© mM, pH é,7, DDT ©,5 mM, i©% (v/v) de glicerol e ©,©2% de NaNT) contendo KC1 ©,©5 M, sendo ent-lo aplicadas a uma coluna de celulose CH-52 2,5 x 5© cm) equilibrada em tampão HDS contendo KC1 ©,©5 M« A coluna foi eluida com um gradiente linear de KC1 ©,©3 M (25© ml) a ©,5 M (25© ml) em tampão MDG. Foram recolhidas fracções (3,© ml cada), e as fracções contendo actividade enzimática (KOI a cerca de 0,15 H) foram reunidas, concentradas até um volume de i,© ml, e aplicadas a uma coluna de Sepharose CL-6B (2,© x 9© cm) equilibrada com tampão fosfato de potássio ©,1 H, pH 7,4, DDT ©,5 mm, 10¾ ív/v) de glicerol, €i,©2% de NaN·?. ft coluna foi eluida com α 43

tica foram reunidas» concentradas até um volume de Θ,O ml, e aplicadas a uma coluna de hidroxilapatite (Bio-Rad) <2,α x 15 cm) equilibrada com tampão fosfato de potássio $, 1 M, pH 7,4, DDT 0,5 mH, 1*3% <v/v) de glicerol, 0,02% de MaM_r» A coluna foi eluida cora um gradiente linear de fosfato de potássio 0,1 M <100 ml) a 0,6 M <100 ml), pH 7,4, contendo DDT Θ,5 mH, 10% <v/v) de glicerol, 2,0 mi cada), @ -âS ;e ΚΗ,-,ΡΟ,, sL *t Çj c 43* de O, b mi« A Bio-Rad) (33) 0,Θ2% de NaN-,« foram recolhidas fracçãe* fracçSes contendo actividade ensimática <a cerca d H) foram reunidas e concentradas até um volume p*roteina foi determinada ρ-elo ensaio de Bradford < com albumina do soro bovino como o padrSo»

Os resultados da purificação antsriorments descrita sSo indicados no Quadro 2 a seguir. •„y

a partir de S« cerevisiae

Passo

Actividade Proteina (un idades) C mg)

Actividade Puri-Espec£ fica Cunidade/mq) (vezes) ficaçdo Rendimento i *í \ \ fu β 1 .Eiítrac to Crú 64Θ0 220Θ

|V 100 2„DEAE-

Sepharose 376® 410 9. 3.DE52- celulose 2450 110 22,3 7,7 4«CM52- x—C~. w· w lulose 1 4e é>3>£ 219 5-Affi-Bel Blu.e gel 94€í

0 .. B 1180 40' B.HidroKil··- apatite 380 0,04 9500 328Θ 6 a Um inibidor aparente foi removido durante este passo cromato-gráfico»

,α

PURIi-ICAcaO DE M. “ACETIl TRANSFERftSE ESPECÍFICA EH

ΗΕΎΧΏΗΙΝΑ A PARTIR ΠΡ S.CEREVIS IAE ÍEBTIRPETB RELAC%0 à 71«B ) N^-AcetiItransfersse especifica em relação á metionina fai também purificada até homogeneidade aparente a partir de S. cerevisiae estirpe TB 71.8. A activida.de do enzima foi determinada tal como foi descrito no Exemplo 1. 1.00Φ litros de cultura de levedura ÍTD 71.8) cresceram aeróbicamente a 30°C em meio YBP (1% de extracto de levedura, 2% de Bacto-peptona, 2% de glucose) num fermentador Chemap AB (Chemap AS, Volketswil, SMitzerland). As células foram recolhidas quando a cultura atingiu um GD,,,-, de oo@ nm 14, concentrada até 24 litros pelo sistema de separação ftlfa~La~ vai (Alfa-Laval separation AB, Tumba, Sfteden), e armazenada a -2®°C com lô% (v/v) de gliceral até 4 meses sem perda de activi-dade.

Extracção de Células. Cultura de levedura concentrada <4 litros) foi descongelada e recolhida por centrifugação a 4.000 rpm durante 20 minutos (rotor JS-4»®, Beckman). As células (&&Φ g, peso húmido) foram suspensas de novo em 750 ml de tampão A <50 mH Tris-HCl, pH 7,8, MgCl^ 10 mM, DBT 3 mH, sorbitol 1 M> contendo 60 mg de liticase, e a suspensão de células foi agitada suavemente a 30C'C durante 45 minutos» Todos os passos subsequentes foram realizados a 4*0. Os esferoplastos foram recolhidos por um num centrifugação a 4«0€)€> rpm durante 15 minutos <rotor JS-4,0, Beckman), lavados por nova suspensão suave em 500 ml de tampão A, recolhidas por centrifugação e suspensos de novo su&vemente em 360 ml de tampão E ÍHEPES i& mM, pH 7,4, MgCl^, 1,5 mM, KC1 10 mM, e DDT 0,5 mM), Os esferoplastos foram Lisado neste tampão hipotónico por quinze batimentos com um pilão hermeticamente fechado e quize batimentos com um pilão frouxo num agente de

48 I

rÍD ’·. 2 5 !é M) pare dar origem a uma concentração final de KC1 de &?2 Μ. O e homogenato foi aqitado suavemante durante 45 minuto* resíduos foram removidos por centrifugação a 14.0ΘΘ rpm durante 45 minutos (rotor JA 14, Beckman)·. A solução flutuante foi concentrada até um volume de 60 ml, usando uma membrana de filtração PM-3® e dialisada durante a noite com 2 x 4 litros de tampão HDB (ΗΞ?:·ΈΒ 2Θ mM, pH 7,4, DDT Φ, 5 mM, 10% (v/v) de g 1 i cera 1 s &,02% de iMaN-j) contendo i<Cl $ = 2 H« *-Jj

Cromatograf ia e-m DEAE-Seoharase CL-B6. Preparou-se DEAE Sepharose CL-6B, que se desqaseificou., ε que se formou, numa coluna (2,5 y. 55 cm) seguindo as recomendações do fabricante» A coluna foi lavada com 4 volumes da coluna de tampão HD8 contendo KC1 0,2 M. 0 líquido flutuante dialisada foi aplicado a DEAE Sepharose CL-6B equilibrada com tampão HDG contendo KOI 0,2 M= A actividade metionina acetiltransferase foi eluida com o mesmo tampão a 24 ml/hora. Foram recolhidas fracçSes (5 ml), e as fracçSes contendo actividade da acetiltransferase da metionina foram reunidas e concentradas até um volume de 30 ml, usando uma membrana de filtração PM--3®.

Cromatografia em Celulose DE-52. 0 produto eluida concentrado da cromatografia em DEAE Sepharose CL-6B foi dialisada durante a noite com 2x4 litros de tampão HDG contendo KC1 β,Θ5 M e em seguida aplicado a uma coluna de celulose DE-52 (2,5 x 55 cm) equilibrada em tampão HDG contendo KC1 0,fc/5 Μ. A coluna foi eluida com um gradiente linear de KCi de Θ,Θ5 M 8250 ml) a 0,5 M (250 ml) em tampão HDG a 24 ml/hora. Foram recolhidas fracçSes, e as fracçSes contendo actividade da acetiltransferase da metionina foram reunidas e concentradas até um volume de 15 ml, usando uma membrana de ultrafxltração PM-30.

I ♦

W'/

Cromatoqrafia em Celulose CM-25« 0 produto eluida concentrado da cromatografia em celulose DE—52 foi dialisado durante a noite com 2 x 4 litros de tampão HDG (MES 2ô mH, pH 6,7, DDT 0,5 mH, 1 &% (v/v) de glicerol e @,02%de NaN^) contendo KC1 0,1 M e em seguida aplicado a uma coluna de celulose CM-52 (2,5 κ 55 cm) equilibrada -em tampão HDS contendo KC1 0,1 M« A coluna foi eluida com um gradiente linear de KC1 de 0,1 M í'25® ml) a 0,5 M 8250 ml> em tampão SiDS a 24 ml/hora» FracçSes (3,0 ml) foram recolhidas, analisadas quanto a A r,conductividade, e actividade da acetiltransferase, tal como foi descrito anterior-mente, s as fracçSes contendo actividade da acetiltransferase da metionina foram reunidas e concentradas até um volume de 1,5 ml, usando uma membrana de ultrafiltraçSo PM-30»

Crornatoqrafia em Affi-Gel Blue Bei» 0 produto eluido concentrado de cromatoçraíia em celulose CM-25 foi dialisado durante a noite com 4 litros de tampão HDG contendo KOI ·3,£>5 M e aplicado a umas colunai de ftffi-Gel Blue gel (1,5 κ 20 cm) equilibrada e;« tampão HDG contendo KC1 0,05 Μ. A coluna foi eluida com um gradiente linear de KCl de 0,05 M (110 ml) a 0,5 Μ (110 ml) em tampão HDG a 12 ml/hora e analisada quanto a Aconductivida-de, e actividade da acetiltransferase, tal como foi descrito anteriormsnte, e as fracçSes contendo actividade da acetiltransferase da metionina foram reunidas e concentradas até um volume de 0,5 ml, usando uma membrana de ultrafiltraçSo PM-30 =

Cromatoarafia em Hidroxilapatite. O produto eluido concentrado de cromatografia eas Affi-Gel Blue gel foi dialisado durante a noite com 2 x 2 litros de tampão fosfato de potássio 0,2 M, pH 7,2, DTT 0,5 mH, 107. (v/v) de glicerol, 0,02% de NaM^ e aplicada a uma coluna de hidroxilapatite (2,0 κ 15 cm) equilibrada com o mesmo tampão que foi usado para a diélise. A coluna foi eluida com um gradiente linear de tampão fosfato de potássio 0,1

Μ i 100 ml) a 0S8 Μ ( íôô ml 5 , pH 7,2 P contendo DTT Θ35 mM, 10% (.v/v) de gl ice rol,, 6?Θ2% de N-aM^ a 24 ml/hora» Fracções V2?Q ml) foram recolhidas., analisadas quanto a ft^gg? conductivida.de5 e activida.de da acetiltrsnsferase, tal como foi descrito anterior-mente5 e as fracções contendo actividade da acetilt.ransfera.se da metionina foram reunidas e concentradas- até um volume de €is5 ml, usando uma membrana de ui traf.il traçSo PM-30. 51

amida,

Electroforese em SodaciX Sulfato de Sódio-Poliacri1-iima amostra de hidroKilapatite contendo acet.iltransierase da metionina, dialisada com água tiuplamante destilada, foi carregada num gel SD8-PAGE (9¾) e submetida a electrofores, em condições redutoras, tal como ê descrito por Laemmli (Laemfflli, U.K», htature 227s660-685 (197©)). Para determinação de das subunidades de enzima purificada, faram usados coma padrões do peso molecular5 miosina (205-0©©),$-gaiactosidase da E. coli (1Í6.©©©), fasforilase da músculo da coelho (97,000), albumina do soro bovino (66.©©©), albumina do ovo (45-00©) e anidrase carbónica do baço do cavalo (29«©©©). As bandas de prateina foram coradas com Coomassis Brilliant Blue R- Observou-se uma única banda de Mr 69.0©© i 2.000,

Determinação do Tamanho Molecular. 0 M da acetiltrans- r ferase da metionina natural foi avaliado por comparação com os pesos moleculares padrão por filtração por gel em coluna de Sepharose CL-6B (2,5 x 95 cm). 0 enzima pareialmente purificado, purificado por meio de cromatografia em Affi-Bel Blue gel, foi aplicado à coluna- A coluna foi eluida com tampão HDG contendo KC1 ©,i H a 2© ml/hora. 0 volume de eluição do enzima foi determinado por e actividade do enzima» a o peso molecular aparente da acetiltransferase da metionina foi calculado por comparação com os volumes de eluiçãa relativos de padrões proteicos incluindo tiroglobulina (669.00©), apoferrina (443.000), fl-amilase <2©©.00©>, deshidrogenase do álcool (15€?.&ΘΘ) , albumina do soro bovino (66-0©©) e anidrase carbónica (29.0©©). O Mr do enzima natural foi avaliada em 7©.©O© ± 5„©©©.

Cromatoconverqtncia em Mono F. Enzima pareialmente purificado, purificado através de cromatografia em Affi-Bel Blue gel, foi aplicado a uma coluna de Mono P (HR 5/5) equilibrada com ,0>. tampão ácida Tris-acético 75 mH ípH 9?3> e eluxda com Poli tampão 96 (pH 6) com um caudal de 1 ml/minuto a 4°C» A eluição foi monitorizada por A^g^. nm? e foram recolhidas fracções de ®,5 ml para medição do pH e da actividade enzimática.

Tal como é indicado no Quadro ·-* a purxrxcaçao em passos múltiplos de 6ΘΘ g de células da levedura resultou numa purificação de 22»@©@ vezes» 0 enzima consistia em aproximadamen— te 0,€>01% da proteina celular total. SDS-PASE revelou uma única banda corada com Coomassxe blue com M = 69»000 Í2»y%?0» A croma™ tografia de filtração em gel em Sepharose CL-6B revelou que o da M-IMaAT natural ê de 70.000 ± 5„. Estes dados indicaram que a Na-acetiltransferase especifica em relação à metionina é monomárica» A cromaioconverçãncia em Mono P revelou, um único pico em pi aparente - 853»

Foi investigado o efeito da temperatura e do pH sobra a acetiltransferase da metianina. A actividade especifica da acetiltransferase da levedura em relação a PAI doi determinada a diferentes temperaturas tal como foi descrito anteriormente, A actividade especifica da acetiltransferase da levedura em relação a PAI foi determinada em tampões de fosfato de potássio 50 mMfl tampões HEPES* CHEB e CAPS com diferentes pHs tal como foi descrita anteriormente» Os ensaios para determinação da temperatura óptima para M-N^-scatiltransferase foram realizados de 5 a 55 °C, e o enzima revelou uma actividade máxima a temperaturas entre 25 e 37°C« A desnaturação irreversível ocorreu após 1 minuto a 6@°C» Q enzima revelou maior estabilidade quando armazenado a 4°C em tampão HDS ÍMES 2Θ mH* pH 6?75 DTT 0,5 mH, 107. <v/v> de glicerol e €*5©2% de NaNT) contendo KC1 0,1 M. Nestas condições a meia—vida do enzima purificado foi de aproximadamente 14 dias. 0 enzima apresentou uma perda de actividade de aproxima-demente 25% por cada ciclo de congelação-descongelação» A • >*. dspendencia do pH da M-hP-acetiltransferase foi medida fazendo ensaios com valores de pH de 5 a 10 na presença de 5@ mH de tampões fosfato de potássio? HEPESs CHES? ou MES» A actividade enzimâtica máxima foi observada com pH 7= A actividade enzimâtica foi < 25% com pH abaixo de 5 e superior a 9« A presença de KOI ou de NaCl até &55 fi nSo afectou a actividade enzimâtica,, embora se tenha observado uma reduçSo ds 5©% na actividade enzimática quando o ensaio do enzima se realizou com Θ,8 li de KC1 ou. de NaCl.

GUASRO 5

Purificação de Na—Acetiltransferaoe da Hetionina a partir de S·.· cerevisias

Passo

Actividade (unidades)

Proteína (mg >

Ac tivida.de Específica, íunidade/mq)

Pu r i—ficação Rendimento (vezes) <%) 1 «Eíítracto

Crú 6 142Θ€ϊ 1 í 0® 2.DEAE- 8,9 4,7 102

Bepharose 273©© 31©® 3.DE52* celulose 53200 a30 64 4.CM52- celulose 16800 1 0 0 t3é 5»Affi-Gel BIue gel 6240 9600 5050 ò.HidroKil·- apetite 2100

Um inibidor aparente foi removido durante este passo cromato- gráfico

EXEMPLO

CARACTERIZAÇÃO DA Na-ACETILTRANSFERASE

Visto que ds substratos peptidicos usados préviamente no ensaio do encima N^-acetiltransferase codificada com fiftAl continham ou serina ou alanina como resíduos amirio—terminais (Lee, F-J,S«, et ai», J, Biol» Chem» 263s14948 (1988)>s Kamitani, K., et al, J. Biol. Chem» 264s 131S8 (1989))« estes substratos peptidicos foram usados no presente invento para ensaiar lisados crús do mutante aaai e das estirpes de levedura do tipo selvagem (Quadro 4). *3 0 Quadra 4 apresenta a N -acstilaçSo de várias substratos peptidicos por lisados crús de levedura a partir das estirpes do tipo selvagem e mutante aaai» As estirpes do tipío selvagem (contendo actividads endógena da Na~acetiltransferase) e aaal (sem actividade endógena da Na—acetiltransferase> foram, respec- tivamente, T3A e T3A-a \Le;

F-J «S vJ» 3 et al

Bacteríol 171 em impressão (1989))» A hormona adrenocorticotrópica (1-24), deshidrogenase do álcool da levedura (1-24), e a dismutase superóxida humana (1.-24) fim ou serina ou alanina como resíduos amino-terminais, enquanto que o inibidar 3 da proteinase A tem um resíduo metionina» A síntese dos substratos peptidicos, a produção de homogenato crú ds levedura, e o ensaio da actividade enzimática foram tal como foi descrito préviamente por Lee et al» (lee, et al»J, Biol- Chem» 263 s 14948 (1988) 5 Kamitani, K., et al,. J» Biol, Chem» 264s15188 (1989))» Os números entre--parenteses referem-se aos números de resíduos, e as letras entre-parenteses especificam a sequincia de amirio ácidos» Abre-viaturass A (alanina), C (cisteina), D (ácido aspártico), E (ácido glufãmico), F (fenilalanina), B (glicina), H (histidina), I (isoleucina), K Clisina), L íieucina), M (metionina),

N(asparagina) , P (prolina), Q <giuLamina), K (arginina), S Cserina), T (treonina), V (valina), W <triptofano), Os dadas são referidas como actividade média ± SD ÍN == 3-5) e são normalizados para a actividade do homogenato em relação à hormona adrenocorti-cotrópica humana (1-24)=

Embora se esperasse que apegas uma Na-acetiltransferase seria responsável pela transferencia de um grupo acetilo para o grupo α-amino de proteínas capazes de serem N^-acetiladas CTsunasawa, S-, et al.Hethods Enzvmol - í06s 165 (1984)? Driessen, H-P-C-, et al.. CRC Crit. Rev» Biochem» 18.s281 (1985)? Wold, F„, Ύrenda Biochem- Sei- 9*256 (1984)? Jornvall, H,, 3-Theoret - Bio 1 - 55 i 1 (1975)? Rubenstein, P» et al - - J- Biol, Chem-254 s 11142 (1979))., foi ensaiada a presença de u.ma Na-acetil trans-ferase da metionina, vistd se ter assumido que se existiam N^-acetiltransferases adicionais poderia então existir uma específica para a metionina (Figura 1),

Usando um substrato peptidico que imitava o terminas amino da única proteina da levedura na sequência de partida da proteína SwissPrQt que é sabido conter um resíduo de metionina W -acetilada, ínibidor 3 da proteinase A CBiederman» K-, et al-„ Carlsberq Res, Commun 455225 (1980)), observou—se que ambas as estirpes routante aaal e tipo selvagem eram capazes de acetilar este substrato., embora, como esperado, o mutante aaal fosse incapaz de acetilar os substratos peptídicos contendo serina ou alanina como resíduos terminais amino (Quadro 4). Estes dados demonstram defínitivamsnte que existe nas células da levedura uma N^—acetiltransferase da metionina»

Ac t. i v i d ad e C %)

Pegtideo HHhI Sãêi 1 im±s

Hormona adrenocor ticotrópic a <1-24) (Humana) (S"Y"S-H-E-H-F-R-W-6-K-P-V”G-!<-K~R-R~P~V-K-V-Y-P5

Deshidrogenase do Álcool {S-I-P-E-T-Q-K-s-V-I~f-Y-E-S~H-8-K-L—E—Y-K-D—I-P) D i smu t ase Su. pe r ó κ i tí a < A-T-K—A-V—C-V-L-K-S-D-8-P-V-Q-S-3—I-N-F~E~Q-1<-E) B&±c 0

Inibidor 3 Proteinase ft /5±5 8Θ±5 (M-N-T-D-Q-Q-K-V-S-E-I-F-Q-S-S-K-E-K-L-Q-G-D-A-K) EXEMPLO 4

E5PECIFICIDADE DA Na-ACETILTkANSFERABE A partir de uma análise da sequências de proteínas de eucariotes., Jornval 1 s colaboradores demonstraram préviamente que cinco resíduos amino ácidos (isto é5 alanina, ssrina-, metioninas glicina.;, e treonina) constituem 95Y, de todos os resíduos aceti-lados nas proteínas de eucariontes e que a metionina -ace t. i 1 ad a á invariávelmente seguida por ácido aspértico5 ácido giutãmica ou asparagina í Perrson ;i B., et aL, Eur„ J, Biachem-, 15Ξ s 523 (1985)>.

r *, T rends Bioc hem« Crif „ Rev, Biochem. 27s7979-Biochem. 152s523-527

Eur,

Hethods Enzvmol - ΙΘόs i65—í7Θ (1984)? Wold, Sei. 9s256-267 (1984)? Driessen at a.L, CB.Q. lgs281-325 (1985)? Mullen et aL, EMBO 3. 8:2067-2075 (1989)? Lee et ai. . ,7. Bacteriol, Í7J.s 5795-5802 (1989)? Hershko et aL. Proc. Natl. Acad. Sei- USA 81:7021-7825 <1984)? Bachmair et_al,,

Science 234s 179-186 (1986)? Arfin et al.» Biochemi sí-.rv -7984 (1988)? Perrson et al. (1985)? Huang et al,. BiQchemistrv 26:8242-8246 (1987)? Lee et al.J. Biol. Chem» 265:14948-14955 (1988)? Kamitani et al. « 3a.

Biol. Chem. 264s 13188-13193 (1989)) é a única proteína da levedura conhecida que é acetilada no seu resíduo m&tionina termi nal CBiedermann et aL, Carlsbera Res·. Commi.m- 45s225-235 (1980))= Assim-, uma série de substratos peptidícos imitando várias proteínas íso-l-citocromo c mutantes (préviamente estabelecido serem Nffl-acetiladas ou conterem um grupo α-amino livre (Tsunasawa, J , W«, 3« Biol» Chem, 2603 5382 (1985)), assim como actina, foram sintetizados (Quadro 5). 0 Quadro 5 apresenta a Na-aceiilaçSo de vários substratos peptidicos contendo metio-nina amino-terminal por um homogenato crú de levedura a partir da estirpe mu.tante aaa 1 (sem actividade endógena da Na-acetiltrans-ferase), T3A-a (Lee, F-J.S», et al.. 3. Bacteriol. 171:5795-5802 (1989)), A síntese dos substratos peptidicos, a preparação do homogenato crú de levedura, e o ensaio da actividade enzimática foram tal como foi préviamente descrita por Lee et al. (Lee, F-J.S», et al.. J» Biol. Chem. 263s14948 (1988)? Kamitani, K., et al.. J, Biol» Chem» 264:13188 (1989))« Os números entre-parenfce-ses referem-se aos números de resíduos, e as letras entre—parênteses referem-se à sequência, de amino ácidas» As abreviaturas sSo as mesmas que as da Figura 1« Os dados sSo referidos como actividade média ± SD CM = 3-5) e são normalizados para a actividade do homogenato em relação ao inibidor 3 da proteinase A da levedura. A sequência desta proteína és

Cada substrato continha uma metionina amino—terminal e asparagina, ácido aspártica, alanina5 lsucina? ou treonina5 como os penúltimos resíduos. Verificou-se que a N^-Acetilação da metionina ocorria, apenas em substratos contendo asparagina ou ácido aspartico como o penúltimo resídua.-Qs dados são referidos com activida.de média ± SD <N=3 - 5). £Λ'

QUADRO

ACTIVIDADE RELATIVA DA ACETILTRANSFERASE DA METIONINA

i puptíí íps, pc-,pí, c, ag-ar.FTT! ar-sn γ.ρ ρρρττγ-.ρπρ p t νατ^τ i £OS

Substrato Actlvidade í%)a INIBIDOR 3 PROTEINASE A 100 ± 5 (1-24) iLevedura) LAla2jINIBID0R 3 PROTEINASE A & <i-24) £ Levedura) CArg31ΜIBIDOR 3 PROTEINASE A 0 (1-24) (Levedura) lAsp^jINIBIDQR 3 PROTEINASE A (1-24) (Levedura. CCys^31ΜIBIDOR 3 PROTEINASE a β í1-24) < Levedura) CGln^JlNIBIDOR 3 PROTEINASE A 9 (1-24) (Levedura)

Ceiu^JlNIBIDOR 3 PROTEINASE A 21 ± 3 jC. £1-24) < Levedura)

Ceiy23INIBIDOR 3 PROTEINASE A Pi (1-24) (Levedura)

11 le^jl IWIBIDOR

PROTEINASE A 0 (i-24) í Levedura > [Leu^JlMIBIDOR 3 PROTEINASE A < i-24) (Levedura) E H i s11NIBIDOR 3 PROTEINASE A (I-24) (Levedura) íLys_ ] INIBI.DOR 3 PROTEINASE A í1-24) < Levedura)

M

[Het^HNIBIDOR 3 PROTEINASE A <1-24 > (Leved u ra) & CPhe^HNIBIDOR 3 PROTEINASE A (í“24) (Levedura) CPro^IINIBIDOR 3 PROTEINASE A (i-24) (Levedura) CSer^IINIBIDOR 3 PROTEINASE A í 1—24) (Levedura.) CThr?3INIBIDOR 3 PROTEINASE A (1-24) (Levedura) CTrp23INIBIDOR 3 PROTEINASE A (1-24) (Levedura) CTyro3INIBID0R 3 PROTEINASE A í1-24) <Lev edura)

í Vai ~.j INI BI DOR 3 PROTEINASE A a

Assim, usando PAI, as seus análogos e outros peptideos, foram estudadas as características estruturais dos substratos _y M~NUAT» Dezanove análogos de PAI sintéticos cosi substituição na penúltima posição foram comparados com PAI, que se demonstrou préviamente ser efectivamente Na--acetilada (Lee at ai.9 J* Biol-CheiTs. 5&.S53603-5606 ίΙ99£ί)> COuadro 5). Apenas tris dos dezanove análogos foram acetilados, embora a eficiência da sua acetilação —^ tenha variado de 9 a. 55¾ íAsp>BIu>Bin/ » Embora tenha sido prévia- mente demonstrado que as proteínas variantes iso-citocromo c ÍHet-Ile-ftrg---, Met-Ile-Lys---, Met-fíet-Asn---) podem ser

Na~aceti 1 adas in vivo CTsunasawa et ai», J. Biol. Ch-em» 2όΘ;53Β2~ -5391 <1985)), os peptideos sintéticos imitando os 24 resíduos amino ácidos NH^—terminal destas- variantes iso—citocromo c não foram acetilados pela M-NaAT da levedura. EXEMPLO 5 E5PECIFICIPAPE COMPARfiTIVADfíB Na~ACETILTRfiNSFEPASE5 A fim de comparar a especificidade e actividade relati « vas da actividade da Ns-acetiltransferase da metionina (M-N^-AT) do presente invento com a especificidade e actividade da AAA1 N -acetiltransfera.se (hf-AT) de Lee. -J.S. et al J.

Bacteriol«. 171. <1989), Requerimento de Patente dos E.U.A. de John A. Smithj e Fang—Jen B„ Lee. registado em 25 de Outubro, 1989, com o título “-ISOLAMENTO DE ESTIRPES DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE TENDO ACTIVIDADE ALTERADA DA Ma~ACETILTRANSFERASE11 (cujas referências foram aqui incorporadas como referência) foram preparadas peptideos sintéticos. Estes peptideos foram avaliados quanto à sua capacidade para servir de substratos para os dois t\v t\v enzimas* Quadros 6 nal sobre penúltimo tigado.

Os resultados desta experiência sao indicados nos e 7. No Quadro 6? o efeito do amino ácido amino termi-a actividade ê investigados no Quadro 7S o efeito do amino ácido amino terminal sobre a actividade é invés-

A

ftCTIVIDADE RELATIVA DAS ACETILTRANSFERASES N -AT E Na-ACETILAçKD DOS PEPTIDEDS SINTÉTICOS: INFLUÊNCIA -TERMINAL AMIMO

M-N®-AT PARA DD RE B í DUO

A substrato

Ac t i v idade <%) (actlvidade média ± S»D.) Na—ATM—AT

ACTH (Humano) S-Y-S-M-E-H-F-R - W - G -K-P-V-S-K-K-R-R-P-V-K-V-Y-P

DESHIDRDSENASE I DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura) 1Ô2±50 S I -P-E-T-Q-K-S-V-1 —F—Y—E—S—Η—Θ—1<—L—E—Y—K—D— I -P

CA“3 DESHIDRDSENASE I DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura) A-1 ~p ~E - T -Q --K - G -V -1 -F-Y-E-S-H-G-K-L-E-Y-K-D-1 -P

CR^ J .UESHIJjROSENABE Ϊ DO ÁLCOOL (1—24) (Levedura) R-I-P-E-T-Q-K-8-V-I-F-Y-E-S-H-G-K-L-E-Y-K-D-I-P

ISM13 DESHIDROGENASE I DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura) N-1 -p-E-T-Q-K-S-V-1-F-Y-E-S-H--6-K-L-E-Y-K--D-·· I -P

ίϋ11 DEBHIDROSEMASfc. I DO ÁLCOOL (1—24) (Levedura) ©@ D-1“P-E-T-Q-K-S-V-I-F-Y-E-S-H- G-K-L-E-Y-K-D-1-P lC 3 DEBHIDkDGEMASE Σ DO ÁLCOOL <í-k’4) (Levedura) ΘΦ C~I-P-E-T-Q-K-S-V-I-F-Y-E-S-H-S-K-L-E-Y-K-D-I-P CQ^3 DEBHIDROBEM-ABE I DO ÁLCOOL (1—24) (Levedura) ΘΘ λ »α Λ iN W -h ϊ.·'u

Q— I —p—e-T-Q-K—S—V—Σ -p-Y""E“S“H™*S"*K”L—E-Y”*K-“D" I —P

[e 3 DEBHIiiROSENASE I DO ÁLCOOL < í — >:4) C Levedura) ΟΘ E~1 -P-E-T-G -K-S-V- Ϊ -F-Y-E-S-H*" G -K-L-E-Y-K-D-1 ~P

EB13 DESHIDROSENASE I DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura) 23± B-I-P-E-T-Q-K-B-V-Σ-F-Y-E-S-H-B-K-L-E-Y-K-D-I~P 00

EI *3 EíESHIDRDBENABE I DO ÁLCOOL <1-24> (Levedura) I -1-P-E-T-Q-K-B-V-1—F—Y—E—S—Η—Θ—K-L—E-Y-K—D-1-P

lL1j DESHIDROSENASE I DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura) L-I-F-E-T-G-K-S-V-I-F-Y-E-S-H-G-K-L-E-Y-K-D-I-P

EH 3 DEBHIDROBENASE I DO ÁLCOOL 01-24) (Levedura) 19+ Η-1-P-E-T-0-K-6-V-1-F-Y-E-S- H- S-K-L-E-Y-K-D-Ϊ~P

ÍKX1 DESHIDROSENASE I DD ÁLCOOL (1-24) (Levedura) 0Θ K—I-P-E-T-Q-K-S—V-I-F~¥-E-S~H-S—K-LHE-Y-K—D—I-P

EM13 DEBHIDROBENASE I DO ÁLCOOL <1-24) (Levedura) 15± M~I-P-E-T-Q-K-G-V-I-F-Y-E-S-H-S-K-L-E-Y-K-D-I-P

CF1] DESHIDROSENASE I DQ ÁLCOOL íí-24) (Levedura) 9± F-I-P-E-T-Q-K-B-V-I-F-Y-E-S-H-B-K-L-E-Y-K-D-I-P

CP1] DESHIDROSENASE I DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura) 7®± P-I-P-E-T-Q-K-B-V-I-F-Y-E-S-H-B-K-L-E-Y-K-D-I-P

CT1] DESHIDRGGENASE I DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura) 103± T-I—P—E—T-Q-K-S—V—I-F-Y-E-S-H-B-K-L-E-Y-K-D-I-P CW·1] DEBHIDROBENASE I DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura) 00 *

W~ I -P-E-T-Q-K-S-V-1 -F-Y—E-S-H-B-K-L-E-·V—K—D-1 -P

:4) ÍLevedur E-Y-K-D-I-P

[Y13 DESHIDRDBENASE I DO ÁLCOOL (1 Y-1 -P-E-T-Q-K-G-V-1 -F-Y—E-S- H- G ··!<-

1-24) \IEVEDORA) -L-E-Y-K—D-I-P

[V1] DE SBí DRQBEMADE I DO ÁLCOOL < V—I—P—£—T—G—K—S~V—I —F—Y—E—S—H—8—K ; '{Τ' , ‘ -κ ., QUADRO 7

ACTIVIDADE RELATIVA DAS ACETILTEANSFEEASES MS~AT E M-Na-AT PARA A Na-ACETILAçaO DOS PEPTIDEOS SINTÉTICOS5- INFLUÊNCIA DO PENÚLTIMO RESÍDUO TERMINAL AMINO

Substrato

Actxvida.de (¾) (actividade média ± S«D.) NS~AT H-NS-AT

ACTH (Humana) iWtítO S-Y—S—Μ—E—H~F~R"isí~S“K—P“V-S-K“K“-R—R—P—V—K—V—Y—P s3

DESHIDROSENASE I DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura) 1®2±S S-1 —p—E—T—Q—K~S~V~ I -F-¥-E-S--H-e-K-L~E“Y-K-D-1 ~P ’-ϋ [ΑΌ DESHΪDROSENASE I DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura) Í68±B r — P—V-ir.·„q__u_.ir.„y .. v~n_τ_p 0 CR*13 DESHIDROSENASE I DO ÁLCOOL íl-24) (Levedura) iô2±5 S-R-F-E-T-Q-K-S--V-I“F~Y"€-S-H-6"K-L“E“Y“K“D~I-p

EΝ'1-3 DESHIDRDSENASfc·. I DO ÁLCOOL (i—24) (Levedura) ii6±5 S-N_p„E-T—Q-K—S--V-I-F-Y-E-S-H-S-K-L-E-Y -K-D- I -P

H :4) (Leve dura) 171 ±9 0 E—Y -K-D- I —p :4) (Levedura > 13è±7 0 E-Y -K-D- I —P :4) ( l^tayta dura) 134±7 0

ν'-

S-Q-P-E-T-G-K-G-V-1 -F-Y-E-S-H-S-K-L-E-Y --K-D-1 ~Ρ lE^3 DESHIDR08ENASE I DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura) Í2116 0 DESHIDRDBENABE Ϊ DD ÁLCOOL (1-24) (Levedura) 84±5 i-e-P-E-T-Q-K-S-V-I-F-Y-E-S-H-

-í-;·——I

-E-Y-K-D-I-P

[L^j DESHIDRuGENAtíE I DO ALuQUL (1-24) (Levedura) 12ò±5 S-L-p-E-T-Q-K-e-V"I-F-Y-E-S-H-G-K-L-E-Y-K-D-I-P Φ CH*3 DEBHIDROBENASE I DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura) Í2516

ΖΥΓΙ DESHIDROSENASE· I DO ÁLCOOL (1-243 (Levedura) 15116 S—K—P—E—T—G-K-G—V— I -F-Y-E-S-H-G-K-L-E-Y-K-D-1 ~P

EM"“3 DEBHIDRQSENASE I DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura) 14017 S-M-P-E-T-Q-K-G-V-1 -F-Y-E-S -H-G --K-L-E-Y-K-D-1 ~P 0

IF"3 DESHIDROSENASE I DO ÁLCOOL (1-243 (Levedura) 11816 S-F-P-E-T-G-K-G-V-I-F-Y-E-S-H-G-K-L-E-Y-K-D-I-P

CP*3 DEBHIDROBENASE I DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura) β S-P-P-E-T-G-K—G-V-I-F-Y-E-S-H-G-K-L-E-Y-K-D-I-P 0

ZS' 3 DEBHIDRQShNASE Ϊ Du ALCuOL (1-243 (Levedura) 14016 g_g_p_E_T-G-K—G-V-I -F-Y-E-S-H-G-K-L-E-Y-K-D-I -P 0

CT*3 DEBHIDROBENABh i DO ÁLCOOL (1—24) (Levedura) 1441B S-T-P-E-T-Q-K-G-V-I-F-Y-E-S-H-S-K-L-E-Y-K-D-I-P Φ CW*3 DESHIDROBENADE I DO ÁLCOOL (1-24) (Levedura) 9115 Θ

ΕΥ23 DESHIDROGENASE I DO AALCOOL {1-24} (Levedura>169+8 B_Y_p_E_T _q_k_6--v- i -F-Y-E-S-H-e-K-L-E-Y-K-D-1 -P 0 DE6HIDRD6ENASE í DO AÁLCOOL (1-24) (Levedura)123±7 EXEMPLO 6

ANÁLISE DOS AMIMO ÁCIDOS DA Nq-ACETILTRANSFERASE O produto eluido concentrado a partir de cromatografia em Affi-Sel Blue gel foi aplicado a 9/i de gel SDS—PASE com 1,5 mm de espessura num recipiente de 12 cm, submetido a electroforese, e e-Iectroeluido tal como foi préviamente descrito (Hunkapiller et al. » Methads Enzvmol» 91s2S7-23& Íi983)>« A Na-acetil transf srass da metionina purificada foi eiectroeluida a partir de cromatogra-fia preparativa em gel SDS-PASE. A composição de amino ácidos foi determinada a partir de quatro preparações diferentes de enzima usando um Analisador de Amino ácidos Beckman 630€s após 24 horas de hidrólise a 11θ°0 em HC1 ó N contendo 6,1% da fenol ÍHewick et al -, 3» Biol„ Chem» 256§799@-7997 < 1981) ρ Moore, S», em Chemistry and Bioiogy of Peotides (Meienhofers J =,, ed»), Ann A-rhor Science, Ann Arbor, hl <1972), p» 629-652)= fisx = Asp + Asnp Sl>í = Glu τ

Gin» 0 número de resíduos por suhunidade de enzima foi calculado tendo como base M = 69=©0@, e assumindo uma massa de 11© para cada resíduo amino ácido» NSo foi feita qualquer correcção para as quantidades de Ser e Thr destruídas durante as 24 horas da hidrólise» Cys e Thr não foram determinadas» QUADRO 8

OhPOcsívKO Dc. AMIr-lU aL- I DOb D A N —ACE i IL. i HÃNSFEEASE DA METIONINA A PARTIR DE S a CEkEV151AE

Amino Ácidc

Resíduos Observados

Asx 84 Thr 29 Ser 47 Glx 74 Pro 27 Gly 48 Ala 38 Vai 44 Met 2 Ile 23 Leu 64 Tyr 11 Phe 31 Lys 54 His 16 Arg 32 íâv λ EXEMPLO 7

EFEITO DE CATIBES Dl VALENTES SOBRE A ACTIVIDADE EímIIMÀTICA

Fax determinada a efeita de várias catiões divalentes w' sabre a actividade da M-N^AT (Quadro 9)» A acetiltransferase da metionin-a da levedura foi incubada na presença, de várias catiSgc. divalentes è temperatura ambiente durante 5 minutos em HEPES 5^ mH, pH 7,4 contendo Dtt 1 mH. A actividade do enzima foi deternj^^ nada em condições de ensaia padrão usando PAI <N=3>, tal como f *.. 2-f '-1 · descrita anteriormente. Ma concentração de 1 mH» CA-*' , Mq^ ι-i T ~

Mn4*- n-So tiveram qualquer efeito, enquanto que ocorreu inibira^ pronunciada e dependente da dose na presença de outros divalentes (ΖπΛ+ = Cu2* = Cd2* > CO2* = FE^*) que inactiVf^ parcialinente o enzima a 0,1 mil» Além disso, foi demonstrado qu& os efeitos pronunciados, observados com CuSQ^ e ZnSO^s nSo deviam ao anião Β04”"2? visto MgS04 não afe-ctar a activiq^^ enzimática em comparação com a actividade na presença de MgCl Além disso, a inibição com CdCl0 não foi devida a Cl , vi«.£

CaCI0, MgCle MnCl„ não afectsrem a actividade enzimática»

X. -í· j£L QUADRO 8

EFEITO DE CAUSES DIVALENTES SOBRE ACTIVIDADE DO ENZIMA

Na~ACETILTRANBF ERAS-E DA METIOMINA A PARTIR DE

S. CEREVISIAE

V * \ Λ V ’V'!

Sal adicionado Actividade de Enzima (%) Concentração (iriM) 1 0.1 0.01 Nenhum 100 — — CaCl, 102 — -— Mgci, 98 105 — Mgso* 97 102 —- Mnci, 98 103 —- FeSO, 40 93 108 CoClt 38 95 106 CdCl, 0 72 103 CuSO, 0 65 101 ZnSOá 0 52 95 EXEMPLO 8

ffft-γπ PE MODIFICfiCSES QUÍMICAS SOBRE ACTIVIDADE DD ENZIMA fí fim de determinar o possível papel catalítico para diferentes tipos de resíduos amino ácidos no enzima, foram realizadas várias modificações químicas (Quadro 9)» A acetil-transferase da metionina da levedura foi incubada com cada reagente a 3€>°C durante 15 minutos, dialisada com HEPES 5Θ mH, pH 7,4, 150 mM, DTT a mm a 4°C durante 3 a 4 horas» A actividade do enzima foi determinada em condições de ensaio padrão usando PAI (N=3), ensaiada tal como foi descrito anteriormente.

-X X _

As abreviaturas usadas sãos a—MQH, hormona estimuladora do «-melanocito·, DHEB, ácido 2-<N-cicIohexilâmiriQ}etenessulfóni-ca5 DEPC, pirocarbonato de dietilof tampão HD8, HEPES 20 mH, pH 7,4j DTT ®,5 mH, (v/v) de glicerol e Θ,£*2% de NaN^s NBS?

Nb r omosuc c i n i in i d a 5 HÍMBS (CH-^) ,.,-Er , brometo de d i me ΐ i 1 ~ (2 - h i d r o - O j£. xi-S-nitrobensil }sulfónio.s HEPES, ácido H~2~hidroxieti 1 piperazi- t na-~M -2-etanessulfónico? IAA, ácido iodoacéticop IA=M, iodoaceta-«‘idag tampão MDG, MES 2« mH, pH 6,7, DTT Θ,5 mH, 16¾ (v/v) de glicerol e *3,02% de NaN-^p HEB, ácido 2-(N-morfolino)etanessulfónica» H~NaAT, Nu-acetil trsnsfsrase da metioninap NC'hT N^-acetiltransferasep MBS, N-bromosuccinimida; HEM, N~etilmaleimida$ PAI, inibidor da proteinase ftp pCMB, p~clarome? curibenzoato, SDS—PASE, electroforese em gel sulfatepoliacral— ®mida tíotíecílica de sódio» A reacção tíe Μ--ΝαΑΤ com pirocarbonato de distilo, um reaqente modificador da histidina IMiles, E»W=, listhods Ensviiisl» 47;431-442 (1977)5, causou uma quase completa inctivação da enzima» Após incubação durante 6 horas à temperatura ambiente com hidroxilamirta 0,25 M, um reagente capaz de reversão da toxiformi- lação de um resíduo histidina, ^ 507» da actividade original do enzima foi recuperada, embora exposição prolongada a hidroxilami

na tenha inactivado lentamente o enzim triptofano cataiiticamenta importante cação química com MBS (Spand& SÍ—âli.? (19675) e HNBSÍCH,) ~Br (Horton et_al_„_ •-Γ* íL a» A presença de um resíduo foi investigada por motíifi-

Methods Enzvmol» 111 , Hsthods Enzvmol. 506-522 25ϊ468- -482 (1972))» MBS inactivou parcialmente o enzima a Θ,5 mH e inacti-vou comp 1 etamente o enzima a ^ 4iM» Embora HNBS ÍCH^)^ Br banha inactivado parcial mente o ensima, a per da de actividade do enzima foi menor em comparação com Como MBS pode também modificar os resíduos histidina e tirosina (Witxop, Já», Adv» Protein Chem» i6s221-321 C1963))s é passível que a inaetivaçSo possa ser devida a uma modificação química da(s> mesma(s) histidinaCs)g presumivelmente modificadaís) por DEPC. Agentes redutores de sulfhidrila (isto èf 2-mercaptaetanal e DTT) naa afectaram a actividade do enzima» Reagentes modificadores de sulfhidrilo (isto és ácido iodoacáticof iodoacetaroida, s pCHB) também não revelaram qualquer efeito a 1 mf15 mas observou-se inactivação parcial do encima a 0.,5 mH com NEM e a 1Φ mil com os outros reagentes» N-acetilimida-cole, um reagente modificador da tirasina, também na o revelou, qualquer efeito ERiordan. et al»» Methods Encvmol» 25s500-506 } .

{1972 N , > ι- QUADRQ 9

PRUTEINA SOBRE ACTIVIDADE METIONINA A PARTIR DE

ΕΡΕ I TO DE REASENTEB Dt HCDIFICACSO DA DO ENZIMA DE Ntí-ACETILTRANSFERASE DA

A

CEREVISIAE ; t Concen- Actividade Reagente Adicionado tração de Enzima (mM) (%) 1 Nenhum 100.0 DEPC 0.05 59 0.5 0 NBS 0.5 30 5.0 0 HNBS (CHj) 2~Br 1.0 93 10.0 62 2-mercaptoei:'.ano 1 10.0 96 DTT 10.0 95 NEM 0.5 77 5.0 20 IAA 1.0 102 10.0 75 IAM 1.0 100 10.0 86 pCMB 1.0 94 10.0 25 N-acetilimidazole 1.0 100 10.0 93 EXEMPLO 8

-ACETILACrtO O presente Inventa esclarece α papel de uma N^-acetil™ transferase na síntese de proteína. Uma possibilidade é a de a N^'™ a c e t i 1 aç a o de proteínas contendo metionina (contribuindo com 5-6”/, de proteínas ace tiladas (Perrson, B. 5 et ai,, Eur, J« Biochem, 152ΐ523 (1985)) ser requerida sob uma forma -a 1 temente específica para facilitar funções biológicas importantes, embora a razão pela qual a N^-acetilação de todas as outras proteinas é aparentemente tão não específica não seja clara.

Uma outra possibilidade ê a da acetilaçSo das proteinas contendo metlonina ocorrer num estádio diferente da síntese proteica a partir da acstilação deoutras proteinas (Figuras 2A e B). A Figura 2 indica íft) via proposta para a modificação cotranslacional de proteinas de -eucarxontes mediadas por N^-ace-t..iltransferase da metionina <M~NaAT), aminopeptidase da metlonina (MAP) 3 e N^-acetiltransferase (NCÍ~AT)3 e (B) via alternativa envolvendo uma única Na~AT actuando em dois estádios diferentes de acetilação e hidrolase com ácido acil-amino (AAHí, tal como foi préviamente proposto por Wold (Wold» F»„ Irends Bigcfrem«.....Sei, 9:256 (1984)), Está via não requere a acção de MAP. Os símbolos são tal como foram indicados na Figura 1« Por exemplo» se a acetilação do iniciador metionina (Figura 2ft> ? não a sua clivagem por uma aminopeptidase da metionina (Figura i)5 for o primeiro passo no processamento cotranslacional da proteína de certas proteinas, então a especificidade úci substrato de N^-acetiItransferase da metionina pode controlar qual a proteína a ser clivada pela aminopeptidase da. metionina, e desse modo que proteinas 77 -

* . Ν SSfcíG tíiâis tsfds SCSti 13ϋ55 ρΟΓ LuTiS Qliora [S|^~scstil transfsra.se * h! terna ti vamen te , a N —acetil transferase ^a fíie tion .ina pode funcionar em proteínas contendo uma metionina amino-terminal no mesmo estádio de síntese em que a outra Ns-acetiltransferase funciona (Finura i>.

Em resumo, é agora claro que a acetilaçSo nem é mediada por uma única N^-acetiltransferase afectando todos os resíduos amino-terminais (Figura 1) nem por uma única Na-acetiltransferase actuando em dois estádios distintos de modificação co-transiacionai (Narita, K„, Biochim. Sioghys. Ac ta 2Ssl84 (1858)), mas que as duas í\i-a-acetiltransferases distintas regulam a Na-scetilação das proteínas dos eucariontes» M~NaAT transfere se1ec ti vamen ts um grupo acetilo de acetil-CoA para os resíduas rlet WH..,-terminais adjacentes a Asp,

Asn;i Blu, ou Gin» A M-iMaAT da levedura foi purificada 22„ΘΘΘ vezes com uma recuperação total de 8% por processos cromatográfi- cos sucessivos utilizando DEAE-Sepharose, DE52~celuloses CM52-cs- lulose, Affi-Sel Blue gel, e hidroxilapatite (Quadro 3)„ 0 enzima foi bloqueado NH^-termina1msnte„ 0 M do encima natural foi de 7Θ.Θ0Θ ±5„0Θ05 s o enzima era um monómero com um de 69=,000 ± 2.0Θ0 como foi revelado a partir de SDS-PASE. M-Ν'*AT também difere de NaAT tanto no seu H (7®„ΘΘΘ versus 2ΘΘ„Θ&Θ) e estrutu- r ff

ra da subunidade (monómero versas dímera) „ A1 έω disso, M-Ν'"AT e NaAT foram inibidas acentuadamente por Cu„, e Zn^h, embora M-N"‘AT *74· «i. mas não NUAT fosse também inibido por Cd*" (Quadro 8) „

Além disso, nem M—WaAT nem NaAT foram activados por ião cloreto, como foi préviamente demonstrado para o NaAT do germe de trigo (Kido et ai.. Arch- Bi achem,, Bipphvs. 208s85-100 (1981)). 78

Estudos envolvendo outras acetiltransferases indicaram que a modificação química da cisteina em acetilCoftsarilamina N—acetil transferase ( Jencks et al» , 3, Biol» Chem» 247.S3/56-376¾¾ (19725 ) e colina O-aceti 1 transfer ase (Roskoski, R. , 3r«, 3 - Biol« Chem. 249?. 2156-2159 <1974)5 ou de histidina em aceti 1 -CaA·.a-g 1 u-cosaminida N~acetiltransferase (Bame et al«< 3« Biol» Chem» 261i10127-10152 <1986)5 inactivava estes encimas» A incapacidade do B-mercaptoetanol, DTT, NEM, pCMB, IAA, e IAM para inactivarem ambos os encimas indica que um resíduo cisteina provavelmente não está envolvido no mecanismo catalítico (Quadro 9)» Os estudos usando DEPC <e possivelmente MBS) sugere que α resíduo histidina pode estar localizado no sítio activo da M-N*"4AT da levedura, coma foi préviamente sugerido para N Ai da levedura (Lee et ah, 3» Biol» Chem,. 2632 14948-14955 (1988)), Fc*i também proposto que esse resídua histidina funcione como uma base geral no sítio catalítico da acetiltransferes© do cloramfenicol (Leslie et al., Proc.

Sei ».,,USA 85s4í33-4137 C 1988) > , A partir de uma análise de sequências de proteínas nos eucariantes, foi préviamente demonstrado que cinco resíduos amino ácidos (isto é, alanina, serina, metionina, glicina e treonina) contribuem para 95% de todos os resíduos acetilados em proteínas de eucariontes ÍTsunasawa et al», Methods Enzvmol„ 106s165-17¾ (1984) j Wold5 F», Trends Biochem. Sei» 9s256-267 (1984)p Driessen et al,« CRC Crit» Rev» Biochem, 18s281-325 (1985)5 Jornvall, H», 3» Theoret«... . Biol.» 55si —12 <1975)5 Arfin et .al.. Biochemistrv 272 7979-7984 (1988); Perssort et al.« Eur, 3» Biochem. 1555523-527 (1985) )» Embora esta utilização predominante de certos resíduos amino ácidos suqira que um resíduo WH-*-ter minai é o or * ncif^l A — f. _ r.~ sinal de reconhecimento para N «-acetiltrsnsferases, existem numerosos exemplos de proteínas tendo estes amino ácidos como os seus NH2~terminus que não são acetilados» Assim, é provável que os enzimas possam também reconhecer resíduos adjacentes (por -V .- -V .- exemplo, meti^í^s Ns-acetilada é usualmente seguida por aspara— gina, ácido aspártico, ou ácido glutSroico), resíduos distais (Kamitani et 3. Biol . Chem-· 264 s 13180-13193 (1989)5 Lee- et al „, .3 „ Biol —£hgm. 265; ía ser impresso) (1990)$·· ftugen st aL , Trends BioctiOgL·-— Sc; JJ. -3494-497 (1986)5 DiKon et al.. Hethods EnzviTiol, ι@όϊ 17€?~179 <1984)) ou carac terísticas cunformacionais na região NH0"'^er<ninal de uma proteína ou de um peptídeo» Assim» foi sintetizada uma série de substratos peptídicos sintéticos imitando PAI Φ-'ε se sabe ser N*3—acetilada na sua metionina NH^-terminal (Bisderman at a3.«Carlsbera Res» Commun. 45 2 ~ , ‘~J **”* (1980)), assim como variantes iso-l-citocromo c (préviamente estabelecido serem N^-acetiladas in vivo (Tsunasawa et al», J» Biol. Chem. 5.6¾s5382-5391 (1985))» Cada substrato determinada tinha uma metionina NH^-terminal com vários smino ácidos no penúltimo resíduo. Verificou-se que a Na-aceti.1 ação da metionina ocorria apenas para substratos contenda asparagina, ácido aspár— tico, ácido giutãmico ou glutamina, como o penúltimo resíduo (Quadro 5). Além disso, as diferenças na actividade relativa para acet.il ação da Í1et NH.-/-· ter minai de PAI e seus análogas indicaram que o penúltimo resíduo desempenhava um papel principal no controlo da Na-acetilaçSo por M~iMaAT„ Embora uma proteína contendo uma metionina termina 1 Na-a.cetilada seguida, por 81 n não tenha sido observada em vários dados básicos da proteína (Driessen et a 1 „ CRC Crit. Rev. Biochem» 18s281-325 (1985) 5 Jornvall, H», J» Theoret. Biol. 5551-12 (1975)5 Perssan et al«» Eur.......3_e...Biochem„ 152s523-527 (1985)? Huang et al.. Biocheniistrv 26.58242-8246 (1987)), esta incapacidade para identificar essa proteína pode ser devida ao número limitado de prateinas Ns-acetiladas que foram caractsrizadas até à data» 0 facto de outros peptideos sintéticos de proteina humana-tirosina-fosfata.se poderem ser levedura (Lee s-t al». 3» Biol. Chem» acetilados 265 5 360: 36©6 pela Μ-Ν'-'ΑΤ da (1990)) indica

QÇ} ~ 'v"’ λ u "N ^ ' ^ V 1 o*· . ·' ’. que a a especif idade do substrato da Η·-|\ΓιΑτ' è provável mente altamente conservada entre levedura e humano» Assim, N-NaAT da levedura purificada pode proporcionar uma fonte rápida de enzima para estudar o mecanismo catalítico e a especificidade do substrato dos enzimas da levedura e humano» cu

Uma função biológica para N AT da levedura no crescimento celular e reunião foi indicada, prêviamente quebrando o seu iâò/- gene (AAAij também chamado NAT1 CMulle et ah, EMBO 3, ~.£>ô7szi í 1989) | Lee et al»a J , Biol» Chem» 264s 12559) inicialmente acetilado, que a metionina aeetilada è subsequeniements removida ípresumiv©imente por ou uma N—acetilmetionina aminopeptidase (Radhakrishna et al„ J, Biol* Chem» 26189572-9575 (1986)} ou uma hidrolase acilpeptídica (Tsunasawa et al.« u, Biachem» (Tokvo? 77s89-162 (1975)5 Kobayashi et al·. J. Biol. Chem. 262¾11435--11445 (1987))), e que o penúltimo resíduo ê subsequentemente acetilado a a presente demonstração de que M-NaAT acetilar-â um peptídeo sintético com 24 resíduas imitando o terminus NH^ da levedura activa (Lee at al»» 3» Biol» Chem. 2&5s3665-5666 (199¾))), é provável que a acetilação selectiva d© Het seja importante na regulação das vias de processamento de WH^—terminal da acfcina e de outras proteínas eucariáticãs»

Dados M-NaAT da sequfncia proteica parcial foram determinados a partir de peptítíeos tripticos e fsm sida corrente-mente utilizadas para clonagem de gene de codificação» Posterior-mente, ao usar a levedura como um sistema de análise genética, o gene clonado irá formar a base de uma investigação directa do papel funcional de Μ—NaAT na i\iG-acetilação da proteína» & que tmbora o inventa tenha sido descrito em relação com suas apresentações específicas, deverá ser tomado em consideração que se podem fazer nosteriores modificações e que este Μ'u requerimento pretende abranger qualquer variações, utilizações ou adaptações do invento seguindo, em geral, os princípios do invento e incluindo essas variantes desta apresentação na prática conhecida ou habitual da técnica à qual o invento pertence podendo ser aplicadas as caracterlsticas essenciais aqui ante-riormente indicadas s como se segue no âmbito das reivindicações apensas

Claims (1)

1. 15» — Mt: t.Quuí para rase da. metionina, caractsri urna célula adequada, de modo da metionina que se apresant nantes naturais = a obtenção de uma N"'-acetil transf e··-a d o oor se pcrocader ã sKpress^o oe a obter-se uma N'A—acetil transferase suBstancialmente Ixvre cie contamx 2â„ - Célula utilizada no método -de acordo com a Reivindicação í, caracterizada por expressar uma N^—acetiltransferase da metionina alterada, 3:5-« - Célula de acordo com a Reivindicação 2;i caracts-rizada por ser urna célula da levedura, 4ã= - Célula de levedura de acordo com a Reivindicação ! 1 3, caracterizada por lhe faltar substancialmente actividade da Na-acet.i 1 transf erase, 5â« - Célula de levedura de acordo com a Reivindicação 4, caracterizada por conter um aleio aaal~l ou aaal—2 do qene HHH1 » célula adequada de modo codifica uma ttA—acetiltransf o para & pFSDíSfâCáC* dê uma ;ado por se proceder -a 8K pfSSS- i a obter uma moléc u1a recombii •ansferass d a me t i on i n a ,s utilizada no processo de acan írizada po r exρressa r a molécula uma nante da Reivindicação 6» « - - ν - ·ίc Γ ·=:: Ê5 »*· «s^s r . ‘v -Λ •«t · Ό ΐ* Λ '· > -- * % ν ^ Ce“? 8Q, - Método para a produção de um peptídeo ao qual falta um terminal amino na metionina Na-acetilada5 caracterizado por compreender a expressão do referido peptídeo numa célula da levedura tendo uma mutação no pene da N'4—acetiltransfera.se da metionina da levedura5 e-ai que a referida mutação resulta na perda f"{ substancial de actividade da N^-acetiltransfera.se da metionina5 s torna a referida célula incapaz de catalisar a referida Nu—ace-tilaçao do referido peptídeo, 9a. Método pari amino-ácidos de um peptído a determinação da sequência de proteína, caracterizado por com- preenoer1 a. a expressão do referido peptídeo ou proteína numa célula de levedura tendo uma mutação num gene que codifica uma N"~ace-ti 1transferase da metionina, em que a referida mutação resulta na perda substancial da actividade da íM^-aceti 1 transf erase da metioninaj e torna, a referida célula incapaz de catalisar a N^-acetilação de oepiídeos ou proteínas? b, a recuperação do referido peptídeo ou proteína 5 e f £C? X fi í~ c. a determinação da sequência de amino-ácidos do peptídeo ou proteína. List iStfUd , b de Uutubro de 199'β 0 ADJUNTO

   d PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial _RUA VICTOR CORDON, 10-A 3,fl 1200 USBOA