PT948623E - Genes de células monócitos de mamífero isolados; reagentes relacionados - Google Patents

Description

ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Genes de células monócitos de mamífero isolados; reagentes relacionados"

CAMPO DO INVENTO 0 presente invento contempla composições relacionadas com genes presentes em células monócitos, células que funcionam no sistema imunitário. Estes genes funcionam no controlo do desenvolvimento, diferenciação e/ou fisiologia do sistema imunitário de mamíferos. Nomeadamente, o pedido proporciona ácidos nucleicos, proteínas, anticorpos e métodos para os utilizar.

ANTECEDENTES DO INVENTO A componente circulatória do sistema circulatório de mamífero inclui vários tipos de células, incluindo eritrócitos e glóbulos brancos das linhas celulares eritróide e mielóide. Consultar, e.g., Rapaport (1987) Introduction to Hematology (2a ed.) Lippincott, Philadelphia, PA; Jandl (1987) Blood: Textbook of Hematology. Little, Brown e Co., Boston, MA.; e Paul (ed.) (1993) Fundamental Immunology (3a ed.) Raven Press, N. Y.

Os monócitos são células fagocíticas pertencentes ao sistema de fagócitos mononucleares e estão presentes na circulação. Consultar Roitt (ed) Encyclopedia of Immunology Academic Press, San Diego. Estas células provêm da medula óssea e permanecem apenas um curto intervalo de tempo no compartimento da medula após diferenciação. Seguidamente entram na circulação onde podem permanecer durante um período de tempo relativamente longo, e.g., alguns dias. Os monócitos podem entrar nos tecidos e nas cavidades do corpo através do processo designado por diapedese, no qual se diferenciam em macrófagos e possivelmente em células dendríticas. Numa resposta inflamatória, o número de monócitos na circulação pode duplicar e muitos dos monócitos deste número aumentado sofrem diapedese para o local da inflamação. 2 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ A apresentação de antigénios refere-se aos eventos celulares nos quais um antigénio proteináceo é absorvido, processado por células apresentadoras de antigénios (APC) e seguidamente reconhecido para iniciar uma resposta imunitária. As células apresentadoras de antigénios mais activas têm sido caracterizadas como macrófagos, que são produtos directos do desenvolvimento de monócitos; células dendriticas e determinadas células B.

Os macrófagos encontram-se na maioria dos tecidos e são altamente activos na internalização de uma vasta variedade de antigénios de proteína e microrganismos. Os macrófagos apresentam uma actividade endocítica altamente desenvolvida e excretam muitos produtos importantes na iniciação de uma resposta imunitária. Por este motivo, pensa-se que muitos genes expressos por monócitos ou induzidos por activação de monócitos são provavelmente importantes na absorção, processamento e apresentação de antigénios ou na regulação da resposta imunitária resultante.

Contudo, os monócitos estão pouco caracterizados, tanto em termos de proteínas que expressam como de muitas das suas funções e mecanismos de acção, incluindo os seus estados activados. Nomeadamente, os processos e mecanismos relacionados com a iniciação de uma resposta imunitária, incluindo processamento e apresentação de antigénio, permanecem pouco claros. A ausência de conhecimento sobre as propriedades estruturais, biológicas e fisiológicas destas células limita a sua compreensão. Assim, as condições médicas com regulação, desenvolvimento ou fisiologia de células apresentadoras de antigénios fora do comum, são intratáveis. A revelação completa refere-se a várias proteínas e consequentemente utilizou-se a designação "proteínas de monócitos". Contudo, considerar-se-á que o invento é dirigido a YE01 tal como definido nas reivindicações anexas.

Mais especificamente, as células assassinas naturais são capazes de lisar células transformadas e infectadas por vírus. As interacções moleculares que desencadeiam as suas funções citolíticas não são bem compreendidas. Na arte anterior, identificaram-se receptores de inibição de células assassinas 3 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ que são membros da superfamília das imunoglobulinas (Colonna e Samaridis (1995), Science 268:405-408). Há necessidade de identificar factores envolvidos neste mecanismo.

SUMÁRIO DO INVENTO

Para identificar moléculas que estão envolvidas em sinalização negativa, imunizaram-se ratinhos com um clone de células NK humanas e rastrearam-se anticorpos para a sua capacidade de, quando reticulados, inibirem lise de determinados alvos mediada por células NK. Em consequência identificou-se o anticorpo DX26. O DX26 também reconhece um receptor presente em células NK em repouso denominado DLAIR (receptor 1 do tipo imunoglobulina associado a leucócitos). O gene que codifica uma proteína que é reconhecida por DX26 foi clonado e denominado YE01. O produto do gene YE01 é um receptor do tipo Fc gama/alfa.

Assim, o presente invento proporciona uma proteína ou péptido de YE01 substancialmente puros ou recombinantes apresentando uma identidade de sequência de pelo menos 80% com a sequência de aminoácidos completa de SEQ ID NO: 6, 8 ou 10; uma sequência natural de YE01 de SEQ ID NO:6, 8 ou 10; ou uma proteína de fusão incluindo a sequência de YE01 e uma proteína heteróloga.

As sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 e 8 são idênticas. Assim, para evitar duplicação de identificadores de sequência apenas se refere SEQ ID: 6 na exposição aqui apresentada.

Tal como aqui revelado, a proteína substancialmente pura ou isolada inclui um segmento que apresenta identidade de sequência com uma parte correspondente de uma YE01, em que: a homologia é de pelo menos cerca de 90% de identidade e a parte é de pelo menos cerca de 9 aminoácidos; a homologia é de pelo menos cerca de 80% de identidade e a parte é de pelo menos cerca de 17 aminoácidos; ou a homologia é de pelo menos cerca de 70% de identidade e a parte é de pelo menos cerca de 25 aminoácidos. Noutras formas, o invento proporciona tais composições de matéria, em que ο YE01 inclui uma sequência 4 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ madura de SEQ ID NO:6 ou 10. A proteína ou péptido pode ser de um animal de sangue quente seleccionado de um mamífero, incluindo um primata ou roedor. O invento também se refere a uma proteína ou polipéptido que inclui pelo menos um segmento de polipéptido de SEQ ID NO:6 ou 10; apresenta uma pluralidade de partes apresentando a identidade; é uma variante alélica natural de YE01; tem um comprimento de pelo menos cerca de 30 aminoácidos; apresenta pelo menos dois epítopos não sobreponiveis que são específicos de YE01 de mamífero; apresenta uma identidade de sequência de pelo menos cerca de 90% ao longo de um comprimento de pelo menos cerca de 20 aminoácidos com um YE01 de roedor; apresenta pelo menos dois epítopos não sobreponiveis que são específicos de um YE01 de primata; apresenta uma identidade de sequência de pelo menos cerca de 90% ao longo de um comprimento de pelo menos cerca de 20 aminoácidos com um YE01 de primata; está glicosilado; tem um peso molecular de pelo menos 7 kD com glicosilação natural; é um polipéptido sintético; está ligado a um substrato sólido; está conjugado com outra parte química; apresenta uma substituição de 5 vezes ou menos relativamente à sequência natural; ou é uma variante de deleção ou inserção de uma sequência natural.

Outras composições incluem as que compreendem: uma proteína ou péptido YE01 estéreis; a proteína ou péptido YE01 e um transportador em que o transportador é: um composto aquoso, incluindo água, solução salina e/ou tampão; e/ou formulado para administração oral, rectal, nasal, tópica ou parentérica.

Em concretizações de proteína de fusão o invento proporciona as que compreendem: sequência de proteína madura de SEQ ID NO:10; um marcador de detecção ou purificação, incluindo uma sequência FLAG, His6 ou Ig; ou uma sequência de outra proteína de superfície celular.

Revelam-se aqui vários kits incluindo os que compreendem uma proteína ou polipéptido e: um compartimento compreendendo a proteína ou polipéptido; e/ou instruções de utilização ou eliminação de reagentes no kit. 5 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Os anticorpos e compostos de ligação incluem os que compreendem uma parte de ligação ao antigénio de um anticorpo que se liga especificamente a uma proteina YE01 natural, em que: a proteina é uma proteina de primata; o composto de ligação é um fragmento Fv, Fab ou Fab2; o composto de ligação está conjugado com outra parte química; ou o anticorpo: é criado contra uma sequência peptídica de um polipéptido maduro de SEQ ID NO: 6 ou 10, é criado contra uma YE01 madura, é criado contra uma YE01 purificada; é seleccionado imunologicamente; é um anticorpo policlonal; liga-se a uma YE01 desnaturada; apresenta uma Kd para antigénio de pelo menos 3 0 mM; está ligado a um substrato sólido incluindo uma pérola ou membrana de plástico; está numa composição estéril; ou está marcado para detecção incluindo um marcador radioactivo ou fluorescente. Proporciona-se um kit compreendendo o composto de ligação incluindo, e.g., o composto de ligação e: um compartimento compreendendo o composto de ligação; e/ou instruções para utilização ou eliminação de reagentes no kit. Preferentemente, o kit é capaz de efectuar uma análise qualitativa ou quantitativa. Várias outras composições incluindo as que compreendem: um composto de ligação estéril; ou o composto de ligação e um transportador em que o transportador é: um composto aquoso, incluindo água, solução salina e/ou tampão; e/ou formulado para administração oral, rectal, nasal, tópica ou parentérica. O invento também se refere a O invento também se refere a um ácido nucleico isolado ou recombinante que codifica uma proteína ou péptido ou proteína de fusão tal como descrito, em que: a proteína é de um mamífero, incluindo um primata; ou o ácido nucleico: codifica uma sequência peptídica antigénica de SEQ ID NO: 6 ou 10, codifica uma pluralidade de sequências peptídicas antigénicas de SEQ ID NO: 6-10; apresenta pelo menos cerca de 80% de identidade com um ADNc natural que codifica o segmento; é um vector de expressão; inclui adicionalmente uma origem de replicação; é de uma fonte natural; compreende um marcador detectável; compreende uma sequência de nucleótidos sintética; tem menos de 6 kb, preferentemente menos de 3 kb; é de um mamífero, incluindo um primata, compreende uma sequência de codificação de comprimento completo natural; é uma sonda de 6 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ hibridação para um gene que codifica a proteína; ou é um iniciador de PCR, produto de PCR ou iniciador de mutagénese.

Proporcionam-se várias células, incluindo as que compreendem um ácido nucleico recombinante descrito. Preferentemente, a célula é: uma célula procariótica; uma célula eucariótica; uma célula bacteriana; uma célula de levedura; uma célula de insecto; uma célula de mamífero; uma célula de ratinho; uma célula de primata; ou uma célula humana. Kits com tais ácidos nucleicos incluem os que têm o ácido nucleico e: um compartimento compreendendo o ácido nucleico; um compartimento compreendendo adicionalmente uma YE01, proteína ou polipéptido; e/ou instruções para utilização ou eliminação de reagentes no kit. Preferentemente, o kit é capaz de efectuar uma análise qualitativa ou quantitativa.

Outros ácidos nucleicos aqui revelados incluem aqueles que: hibridam sob condições de lavagem de 30°C e sal a menos de 2 M com SEQ ID NO:5, 7 ou 9; apresentam pelo menos cerca de 85% de identidade num porção de pelo menos cerca de 30 nucleótidos com uma YE01 de primata. Em concretizações preferidas, as condições de lavagem são 45°C e/ou sal a 500 mM; ou 55°C e/ou sal a 150 mM; ou a identidade é de pelo menos 90% e/ou a porção é de pelo menos 55 nucleótidos; ou a identidade é de pelo menos 95% e/ou a porção é de pelo menos 75 nucleótidos.

Também se revela um método de modular fisiologia ou desenvolvimento de uma célula ou célula de cultura de tecidos compreendendo por em contacto a célula com um agonista ou antagonista de uma YE01. Em concretizações preferidas, a célula é um leucócito e o antagonista é contra YE01 e é um anticorpo monoclonal que se liga a DLAIR-1. O invento proporciona concretizações específicas preferidas tal como definido nas reivindicações anexas. DESCRIÇÃO DETALHADA I. Geral O presente invento proporciona sequências de ADN que codificam proteínas de mamífero expressas em monócitos. Para 7 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ uma revisão sobre monócitos e suas funções, consultar, e.g., Gallin, et al. (ed. 1988) Inflammation: Basis Principies and Clinicai Correlates Raven Press, NY; van Furth (ed. 1985) Mononuclear Phagocytes: Characteristics. Physiology and

Function Martinus Nijhoff, Dordrecht, Países Baixos.

Proporcionam-se seguidamente concretizações humanas específicas destas proteínas. As descrições seguidamente apresentadas dirigem-se, com objectivos exemplificativos, a genes de monócitos humanos mas são igualmente aplicáveis a concretizações relacionadas estruturalmente, e.g., sequência, de outras fontes ou espécies de mamíferos, incluindo variantes polimórficas ou individuais. Tais incluirão, e.g., proteínas que apresentam relativamente poucas alterações de sequência, e.g., menos de cerca de 5% e contam com, e.g., menos de 20 substituições de resíduos, tipicamente menos de 15, de preferência menos de 10 e com maior preferência menos de 5 substituições. Estas também incluirão versões que são truncadas relativamente ao comprimento completo tal como descrito e proteínas de fusão contendo segmentos substanciais dessas sequências. II. Definições A expressão "composição de ligação" refere-se a moléculas que se ligam com especificidade a uma dessas proteínas de monócitos, e.g., numa interacção anticorpo-antigénio ou compostos, e.g., proteínas, que se associam especificamente com a proteína respectiva. Tipicamente, a associação será numa interacção proteína-proteína relevante fisiologicamente natural, quer covalente quer não covalente e pode incluir membros de um complexo multiproteínas, incluindo compostos transportadores ou parceiros de dimerização. A molécula pode ser um polímero ou reagente químico. Um análogo funcional pode ser uma proteína com modificações estruturais ou pode ser uma molécula completamente não relacionada, e.g., que tem uma forma molecular que interage com os determinantes de interacção adequados. As variantes podem servir como agonistas ou antagonistas da proteína, consultar, e.g., Goodman, et al. (ed.) (1990) Goodman e Gilman: The Pharmacological Bases of

Therapeutics (8a ed.) Pergamon Press, Tarrytown, N.Y. 8 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ A expressão “complexo agente de ligação:proteína de monócito", tal como aqui utilizada, refere-se a um complexo de um agente de ligação e da proteína de monócito. A ligação específica do agente de ligação significa que o agente de ligação tem um local de ligação especifica que reconhece um local na proteína de monócito respectiva. Por exemplo, anticorpos criados contra a proteína de monócito e que reconhecem um epítopo na proteína de monócito são capazes de formar um complexo agente de ligação:proteína de monócito por ligação específica. Tipicamente, a formação de um complexo agente de ligação:proteína de monócito permite a medição de proteína de monócito numa mistura de outras proteínas e produtos biológicos. A expressão "complexo anticorpo:proteína de monócito" refere-se a um complexo agente de ligação:proteína de monócito no qual o agente de ligação é um anticorpo. 0 anticorpo pode ser monoclonal, policlonal ou até um fragmento de ligação ao antigénio de um anticorpo.

As sequências de ácido nucleico "homólogas", quando comparadas, apresentam semelhanças significativas. Os padrões de homologia de ácidos nucleicos são medidas de homologia geralmente utilizadas na especialidade por comparação de sequências e/ou relação filogenética ou podem basear-se nas condições de hibridação. As condições de hibridação descrevem-se mais detalhadamente em seguida.

Um ácido nucleico "isolado" é um ácido nucleico, e.g., um ARN, ADN ou um polímero misto, que está substancialmente separado de outras componentes que acompanham naturalmente uma sequência nativa, e.g., proteínas e sequências genómicas flanqueadoras da espécie de origem. A expressão abrange uma sequência de ácido nucleico que foi removida do seu ambiente de ocorrência natural e inclui isolados de ADN recombinante ou clonado e análogos sintetizados quimicamente ou análogos sintetizados biologicamente por sistemas heterólogos. Uma molécula substancialmente pura inclui formas isoladas da molécula. Um ácido nucleico isolado será geralmente uma composição homogénea de moléculas, mas conterá, nalgumas concretizações, heterogeneidades em pequeno grau. Estas heterogeneidades são tipicamente encontradas nas extremidades do polímero ou em partes que não são críticas para uma função ou actividade biológica pretendida. 9 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ A "proteína de monócito" do invento abrangerá, quando utilizada num contexto de proteína, uma proteína com sequências de aminoácidos tal como apresentada em SEQ ID NO:6, 8 ou 10 ou um fragmento significativo de tal proteína. Refere-se a um polipéptido que interage com os componentes de ligação de proteína de monócito específicos respectivos. Estes componentes de ligação, e.g., anticorpos, ligam-se tipicamente à proteína de monócito com afinidade elevada, e.g., pelo menos cerca de 100 nM, habitualmente mais que cerca de 30 nM, de preferência mais que cerca de 10 nM e com maior preferência mais que cerca de 3 nM.

Também se revelam aqui fragmentos ou segmentos significativos da referida proteína de monócito, abrangendo uma parte de resíduos de aminoácido de pelo menos cerca de 8 aminoácidos, geralmente pelo menos 10 aminoácidos, mais geralmente pelo menos 12 aminoácidos, frequentemente pelo menos 14 aminoácidos, mais frequentemente pelo menos 16 aminoácidos, tipicamente pelo menos 18 aminoácidos, mais tipicamente pelo menos 20 aminoácidos, habitualmente pelo menos 22 aminoácidos, mais habitualmente pelo menos 24 aminoácidos, de preferência pelo menos 26 aminoácidos, com maior preferência pelo menos 28 aminoácidos e pelo menos cerca de 30 ou mais aminoácidos. Fragmentos ou limitações de tamanho aplicáveis para comparação a um grupo não implicam necessariamente limitações de tamanho de fragmentos para os outros grupos.

Define-se um ácido nucleico "recombinante" pelo seu método de produção ou pela sua estrutura. Em referência a este método de produção, e.g., um produto produzido por um processo; o processo é utilização de técnicas de ácido nucleico recombinante, e.g., envolvendo intervenção humana na sequência de nucleótido tipicamente selecção ou produção. Alternativamente, pode ser um ácido nucleico produzido por geração de uma sequência compreendendo fusão de dois fragmentos que não são naturalmente contíguos entre si, mas pretende-se que exclua produtos da natureza, e.g., mutantes de ocorrência natural. Assim, por exemplo, são abrangidos produtos produzidos por transformação de células com qualquer vector de ocorrência não natural, assim como ácidos nucleicos 10 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ compreendendo sequências derivadas utilizando qualquer processo de oligonucleótido sintético. Tal é muitas vezes efectuado para substituir um codão por um codão redundante que codifica o mesmo aminoácido ou um aminoácido conservativo, enquanto tipicamente introduz ou remove um local de reconhecimento de sequência. Alternativamente, efectua-se para unir segmentos de ácido nucleico ou funções pretendidas para gerar uma entidade genética única compreendendo uma combinação de funções pretendida não encontrada nas formas naturais habitualmente disponíveis. Os locais de reconhecimento de enzima de restrição são muitas vezes o alvo de tais manipulações artificiais, mas podem incorporar-se por concepção outros alvos de local específico, e.g., promotores, locais de replicação de ADN, sequências de regulação, sequências de controlo ou outras características úteis. Pretende-se um conceito semelhante para um polipéptido recombinante, e.g., fusão. Incluem-se especificamente ácidos nucleicos sintéticos que, por redundância de código genético, codificam polipéptidos semelhantes a fragmentos desses antigénios e fusões de sequências de vários variantes de espécie diferentes. “Solubilidade" reflecte-se pela sedimentação medida em unidades de Svedberg, que são uma medida da velocidade de sedimentação de uma molécula sob condições específicas. A determinação da velocidade de sedimentação foi tradicionalmente efectuada numa ultracentrífuga analítica mas é actualmente tipicamente efectuada numa ultracentrífuga padrão. Consultar, Freifelder (1982) Physical Biochemistry (2a ed.) W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA; e Cantor e

Schimmel (1980) Biophysical Chemistry partes 1-3, W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA. Para uma determinação grosseira, centrifuga-se uma amostra contendo um polipéptido supostamente solúvel numa ultracentrífuga de tamanho grande padrão a cerca de 50K rpm durante cerca de 10 minutos e as moléculas solúveis permanecerão no sobrenadante. Uma partícula ou polipéptido solúveis terá tipicamente menos de cerca de 30S, mais tipicamente menos de cerca de 15S, habitualmente menos de

cerca de 10S, mais habitualmente menos de cerca de 6S e em concretizações específicas, de preferência menos de cerca de 4S e com maior preferência menos de cerca de 3S. A solubilidade de um polipéptido ou fragmento depende do 11 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ ambiente e do polipéptido. A solubilidade do polipéptido é afectada por vários parâmetros, incluindo temperatura, ambiente electrolítico, tamanho e caracteristicas moleculares do polipéptido e natureza do solvente. Tipicamente, a temperatura à qual se utiliza o polipéptido varia entre cerca de 4°C a cerca de 65°C. Habitualmente a temperatura de utilização é maior que cerca de 18°C e mais habitualmente maior que cerca de 22°C. Para objectivos de diagnóstico, a temperatura será habitualmente cerca da temperatura ambiente ou mais quente mas inferior à temperatura de desnaturação das componentes no ensaio. Para objectivos terapêuticos, a temperatura será habitualmente a temperatura corporal, tipicamente cerca de 37°C para humanos, apesar de a temperatura poder ser aumentada ou diminuída in situ ou in vitro em determinadas situações. 0 tamanho e estrutura do polipéptido devem estar geralmente num estado substancialmente estável e habitualmente não estão num estado desnaturado. 0 polipéptido pode estar associado com outros polipéptidos numa estrutura quaternária, e.g., para conferir solubilidade ou associado com lipidos ou detergentes de um modo semelhante a interacções de bicamadas lipidicas naturais. 0 solvente será habitualmente um tampão compatível biologicamente de um tipo utilizado para manutenção das actividades biológicas e será habitualmente próximo de um solvente fisiológico. Habitualmente o solvente terá um pH neutro, tipicamente entre cerca de 5 e 10 e de preferência cerca de 7,5. Nalguns casos adicionar-se-á um detergente, tipicamente um detergente ligeiramente não desnaturante, e.g., CHS ou CHAPS ou a uma concentração suficientemente reduzida de modo a evitar quebra significativa de propriedades estruturais ou fisiológicas da proteína. "Substancialmente pura" significa tipicamente que a proteína está isolada de outras proteínas, ácidos nucleicos e outros agentes biológicos contaminantes derivados do organismo fonte original. Pode ensaiar-se pureza ou "isolamento" por métodos padrão e será habitualmente pelo menos cerca de 50% pura, mais habitualmente pelo menos cerca de 60% pura, geralmente pelo menos cerca de 70% pura, mais geralmente pelo 12 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ menos cerca de 80% pura, muitas vezes pelo menos cerca de 85% pura, mais frequentemente pelo menos cerca de 90% pura, de preferência pelo menos cerca de 95% pura, com maior preferência pelo menos cerca de 98% pura e na maioria das concretizações preferidas, pelo menos 99% pura. "Semelhança substancial" no contexto de comparação de sequência de ácido nucleico significa que os segmentos ou as suas cadeias complementares quando comparados são idênticas quando estão optimamente alinhadas, com inserções ou deleções de nucleótidos adequadas, em pelo menos cerca de 50% dos nucleótidos, geralmente pelo menos 56%, mais geralmente pelo menos 59%, habitualmente pelo menos 62%, mais habitualmente pelo menos 65%, frequentemente pelo menos 68%, mais frequentemente pelo menos 71%, tipicamente pelo menos 74%, mais tipicamente pelo menos 77%, habitualmente pelo menos 80%, mais habitualmente pelo menos cerca de 85%, de preferência pelo menos cerca de 90%, com maior preferência pelo menos cerca de 95 a 98% ou mais e em concretizações especificas, tão elevada como cerca de 99% ou mais dos nucleótidos. Alternativamente, existem semelhanças substanciais quando os segmentos hibridam sob condições de hibridação selectivas com uma cadeia ou a sua complementar, tipicamente utilizando uma sequência derivada de SEQ ID NO:l ou 3; 5, 7 ou 9; ou 11, 13 ou 15. Tipicamente, ocorrerá hibridação selectiva quando há pelo menos cerca de 55% de semelhança ao longo de uma porção de pelo menos cerca de 30 nucleótidos, de preferência pelo menos cerca de 65% ao longo de uma porção de pelo menos cerca de 25 nucleótidos, com maior preferência pelo menos cerca de 75% e com a maior preferência pelo menos cerca de 90% ao longo de cerca de 20 nucleótidos. Consultar, e.g., Kanehisa (1984) Nuc. Acids Res. 12:203-213. O comprimento da comparação de semelhança, tal como descrito, pode ser ao longo de porções longas e em determinadas concretizações será ao longo de uma porção de pelo menos cerca de 17 nucleótidos, habitualmente pelo menos cerca de 20 nucleótidos, mais habitualmente pelo menos cerca de 24 nucleótidos, tipicamente pelo menos cerca de 28 nucleótidos, mais tipicamente pelo menos cerca de 40 nucleótidos, de preferência pelo menos cerca de 50 nucleótidos e com maior preferência pelo menos cerca de 75 a 100 ou mais nucleótidos. 13 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ “Condições rigorosas", relativamente a homologia ou semelhança substancial no contexto de hibridação, serão condições rigorosas combinadas de sal, temperatura, solventes orgânicos e outros parâmetros, tipicamente os que se controlam em reacções de hibridação. A combinação de parâmetros é mais importante do que a medição de qualquer parâmetro único. Consultar, e.g., Wetmur e Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31:349-370. Uma sonda de ácido nucleico que se liga a um ácido nucleico alvo sob condições rigorosas é específica para o referido ácido nucleico alvo. Tal sonda tem tipicamente um comprimento superior a 11 nucleótidos e é suficientemente idêntica ou complementar a um ácido nucleico alvo ao longo da região especificada pela sequência da sonda de modo a ligar o alvo sob condições de hibridação rigorosas.

As proteínas de monócitos correspondentes de outras espécies de mamíferos podem ser clonadas e isoladas por hibridação interespécies de espécies estritamente relacionadas. Consultar, e.g., seguidamente. A semelhança pode ser relativamente baixa entre espécies com relação distante e assim aconselha-se a hibridação de espécies com relação relativamente próxima. Alternativamente, a produção de uma preparação de anticorpo que apresenta menor especificidade de espécies pode ser útil em abordagens de expressão de clonagem. A frase "liga-se especificamente a um anticorpo" ou "especificamente imunorreactivo com", em referência a uma proteína ou péptido, refere-se a uma reacção de ligação que determina a presença da proteína na presença de uma população heterogénea de proteínas e outras componentes biológicas. Assim, sob condições de imunoensaio designadas, os anticorpos especificados reagem com uma proteína específica e não se ligam significativamente a outras proteínas presentes na amostra. A ligação especifica a um anticorpo sob tais condições pode necessitar de um anticorpo que é seleccionado pela sua especificidade relativamente a uma proteína específica. Por exemplo, podem seleccionar-se anticorpos criados contra o imunogénio da proteína de monócito humana com a sequência de aminoácidos apresentada por uma SEQ ID NO: particular para obter anticorpos especificamente imunorreactivos com essa proteína de monócito e não com outras 14 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ proteínas. Esses anticorpos reconhecem proteínas altamente semelhantes à proteína de monócito humana homóloga. III. Ácidos nucleicos

Estes genes de monócito são expressos especificamente em células dendríticas. As concretizações preferidas, tal como reveladas, serão úteis em procedimentos padrão para isolar genes de outras espécies, e.g., animais de sangue quente tal como aves e mamíferos. A hibridação cruzada permitirá isolamento de proteínas relacionadas de indivíduos, estirpes ou espécies. Estão disponíveis várias abordagens bem sucedidas diferentes para isolar um clone de ácido nucleico adequado com base na informação aqui proporcionada. Os estudos de hibridação por transferência "Southern" devem identificar genes homólogos noutras espécies sob condições de hibridação adequadas.

As proteínas ou péptidos definidos purificados são úteis para gerar anticorpos por métodos padrão, tal como seguidamente descrito. Os péptidos sintéticos ou a proteína purificada podem ser apresentados a um sistema imunitário para gerar anticorpos policlonais e monoclonais. Consultar, e.g., Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; e Harlow e Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY, que são aqui incorporados por referência. Alternativamente, uma composição de ligação de proteína CD pode ser útil como um reagente de ligação específico e pode tirar-se vantagem da sua especificidade de ligação para, e.g., purificar uma proteína de monócito.

Pode utilizar-se a composição de ligação específica para rastrear uma biblioteca de expressão produzida a partir de uma linha celular que expressa a respectiva proteína de monócito. Encontram-se disponíveis muitos métodos de rastreio, e.g., coloração padrão de ligando expresso à superfície ou por ciclos de selecção. Pode também efectuar-se rastreio de expressão intracelular por vários procedimentos de coloração ou imunofluorescência. As composições de ligação podem ser utilizadas para purificar por afinidade ou seleccionar células que expressam o ligando. 15 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Podem também utilizar-se os segmentos de péptido para produzir oligonucleótidos adequados para rastrear uma biblioteca para determinar a presença de um gene semelhante, e.g., idêntico ou uma variante polimórfica ou para identificar um monócito. Pode utilizar-se o código genético para seleccionar oligonucleótidos adequados úteis como sondas para rastreio. Em combinação com técnicas de reacção de polimerização em cadeia (PCR), os oligonucleótidos sintéticos serão úteis na selecção dos clones pretendidos de uma biblioteca.

As sequências complementares também serão utilizadas como sondas ou iniciadores. Com base na identificação de um possivel terminal amino, outros péptidos deverão ser especialmente úteis, e.g., acoplados com técnicas de PCR de vector ancorado ou de complementaridade poli-A ou com ADN complementar de outros péptidos.

As técnicas para manipulação de ácido nucleico de genes que codificam essas proteínas de monócitos, e.g., subclonagem de sequências de ácido nucleico que codificam polipéptidos para vectores de expressão, sondas de marcação, hibridação de ADN e semelhantes, descrevem-se na generalidade em Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2a ed.) vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, que é aqui incorporada por referência e doravante referida como "Sambrook, et al". Consultar igualmente, Coligan, et al. (1987 e suplementos periódicos) Current Protocols in Molecular Biology Greene/Wiley, New York, NY, referido como "Coligan, et al."

Existem vários métodos de isolar as sequências de ADN que codificam estas proteínas de monócitos. Por exemplo, isola-se ADN de uma biblioteca genómica ou de ADNc utilizando sondas de oligonucleótidos marcadas apresentando sequências idênticas ou complementares às sequências aqui reveladas. Podem utilizar-se sondas completas ou podem gerar-se sondas de oligonucleótido por comparação das sequências aqui reveladas com outras proteínas e selecção de iniciadores específicos. Tais sondas podem ser utilizadas directamente em ensaios de hibridação para isolar ADN que codifica proteínas de monócitos ou podem conceber-se sondas para utilização em técnicas de amplificação 16 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ tais como PCR para o isolamento de ADN que codifica proteínas de monócitos.

Para preparar uma biblioteca de ADNc, isola-se ARNm a partir de células que expressam a proteína de monócito. Prepara-se ADNc a partir de ARNm e liga-se para um vector recombinante. Transfecta-se o vector para um hospedeiro recombinante para propagação, rastreio e clonagem. São bem conhecidos métodos para preparar e rastrear bibliotecas de ADNc. Consultar Gubler e Hoffman (1983) Gene 25:263-269; Sambrook, et al.} ou Coligan, et al.

Para uma biblioteca genómica pode extrair-se o ADN a partir de tecido e parti-lo mecanicamente ou digeri-lo enzimaticamente para proporcionar fragmentos de cerca de 12-20 kb. Os fragmentos são então separados por centrifugação de gradiente e clonados em vectores de bacteriófago lambda. Estes vectores e o fago são empacotados in vltro, tal como descrito, e.g., em Sambrook, et al. ou Coligan, et al. Analisam-se fagos recombinantes por hibridação de placas tal como descrito em Benton e Davis (1977) Science 196:180-182. Efectua-se hibridação de colónias tal como descrito na generalidade em, e.g., Grunstein, et al. (1975) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72:3961-3965.

Pode identificar-se ADN que codifica uma proteína de monócito em bibliotecas de ADNc ou genómicas pela sua capacidade de hibridar com as sondas de ácido nucleico aqui descritas, por exemplo em experiências de hibridação de colónia ou de placa. Isolam-se as regiões de ADN correspondentes por métodos padrão conhecidos dos peritos na especialidade. Consultar Sambrook, et al.

Podem também utilizar-se diferentes métodos para amplificar sequências alvo, tais como a reacção em cadeia pela polimerase, para preparar ADN que codifica proteína de monócito. Utiliza-se tecnologia de reacção de polimerização em cadeia (PCR) para amplificar tais sequências de ácido nucleico directamente a partir de ARNm, de ADNc e de bibliotecas genómicas ou bibliotecas de ADNc. Podem também utilizar-se as sequências isoladas que codificam proteínas de monócitos como moldes para amplificação por PCR. 17 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Em técnicas de PCR, sintetizam-se iniciadores de oligonucleótidos complementares às duas regiões 5' na região de ADN a ser amplificada. Efectua-se então uma reacção de polimerização em cadeia utilizando os dois iniciadores. Consultar Innis, et al. (ed.) (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Application Academic Press, San Diego, CA. Podem seleccionar-se iniciadores para amplificar as regiões completas que codificam uma proteína de monócito completa seleccionada ou para amplificar segmentos de ADN mais pequenos tal como pretendido. Após amplificação de tais regiões por PCR, estas podem ser sequenciadas e podem preparar-se sondas de oligonucleótido a partir de sequências obtidas por utilização de técnicas padrão. Estas sondas podem ser então utilizadas para isolar ADN que codificam outras formas das proteínas de monócitos.

Os oligonucleótidos para utilização como sondas são sintetizados quimicamente de acordo com o método do triéster de fosforamidito em fase sólida inicialmente descrito por Beaucage e Carruthers (1983) Tetrahedron Lett. 22(20): 1859-1862 ou utilizando um sintetizador automático tal como descrito em Needham-VanDevanter, et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:6159-6168. Efectua-se purificação de oligonucleótidos e.g., por electrof orese em gel de acrilamida nativo ou por HPLC de permuta aniónica tal como descrito em Pearson e Regnier (1983) J. Chrom. 255: 137-149. A sequência do oligonucleótido sintético pode ser verificada utilizando o método de degradação química de Maxam e Gilbert em Grossman e Moldave (ed.) (1980) Methods in Enzymology 65:499-560 Academic Press, New York.

Isolou-se um clone de célula monócito humano a partir de uma biblioteca de células monócitos activada e designou-se YE01. Ο YE01 está relacionado com os receptores para Fc gama e/ou Fc alfa. Esta proteína é aqui referida como um receptor Fc gama/alfa e descreve-se em SEQ ID NO:5 e 6. Um equivalente de ratinho é provavelmente codificado na EST W55567.

Clonou-se um gene semelhante por clonagem de expressão utilizando um anticorpo monoclonal DX26, que foi criado contra o imunogénio do clone NK681.D5 de células NK humanas e 18 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ seleccionado para inibir morte por clones de células NK de células alvo apresentando receptor Fc (SP2/0). Descreve-se este isolado em SEQ ID NO:7 e 8.

Revelam-se ácidos nucleicos e possíveis sequências de aminoácidos de uma forma solúvel dos receptores, denominado DLAIR-2, em SEQ ID NO: 9 e 10. A sequência de sinalização vai desde cerca de Meti a Thr21. Apesar de o gene ter sido inicialmente descrito como um gene derivado de monócito, a análise de expressão indica que o gene é mais específico para expressão em linfócitos. Assim, no caso de YE01, o descritor "gene de monócito" pode indicar a sua identificação original numa população enriquecida para esse tipo de células apesar de poder também conter alguns outros tipos de células. A análise de sequência sugere que YE01 é um membro da superfamília de receptores Ig; e está estritamente relacionado com a família CD8, que contém um enrolamento do tipo V1J, nomeadamente os receptores Fc alfa e/ou gama. Devido a conter um motivo do tipo ITAM, a proteína pode ser uma versão de linfócito dos

Receptores de Inibição de Morte (KIR), que enviam um sinal negativo para inibir a função de células assassinas. Esta proteína apresenta uma função semelhante na inibição da função efectora de linfócitos, e.g., apresentação de antigénio ou iniciação de resposta subsequente.

Nomeadamente, a sinalização através da molécula reconhecida pelo anticorpo monoclonal DX26 (designado receptor do tipo imunoglobulina associado a leucócito DNAX (DLAIR)), emite um sinal negativo para clones de células NK que evita que estas matem células alvo específicas. Contudo, a molécula é expressa noutros linfócitos incluindo células T e monócitos. Assim, o anticorpo DX26 representa provavelmente um anticorpo que inibe morte de células NK e de células T citotóxicas e a distribuição de monócitos sugere que a molécula pode inibir as funções efectoras mediadas por monócitos ou mediadas por linfócitos.

Este invento proporciona ADN isolado ou fragmentos para codificar uma proteína de monócito tal como definido nas reivindicações anexas. Também se revela ADN isolado ou recombinante que codifica uma proteína ou polipéptido activos biologicamente que é capaz de hibridar sob condições 19 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ adequadas, e.g., rigor elevado, com as sequências de ADN aqui descritas. Os referidos proteina ou polipéptido activos biologicamente podem ser uma forma de ocorrência natural ou uma proteina ou fragmento recombinantes e têm uma sequência de aminoácidos tal como revelada em SEQ ID NO: 6 ou 10. As concretizações preferidas serão isolados naturais completos, e.g., de um primata. Na forma glicosilada, as proteínas devem apresentar tamanhos maiores. Além disso, este invento refere-se à utilização de ADN isolado ou recombinante ou seus fragmentos, que codifica proteínas que são homólogas a cada proteína de monócito respectiva. O ADN isolado pode ter as respectivas sequências de regulação nos flancos 5' e 3', e.g., promotores, potenciadores, sinais de adição poli-A e outros. IV. Produção de produtos de gene de monócito

Os ADN que codificam estas proteínas de monócitos ou seus fragmentos podem obter-se por síntese química, rastreio de bibliotecas de ADNc ou por rastreio de bibliotecas genómicas preparadas a partir de uma grande variedade de linhas celulares ou de amostras de tecido.

Estes ADN podem ser expressos numa grande variedade de células hospedeiras para a síntese de proteínas completas ou fragmentos que podem, e.g., ser utilizados para gerar anticorpos policlonais ou monoclonais; para estudos de ligação; para construção e expressão de moléculas modificadas; e para estudos de estrutura/função. Cada uma destas proteínas de monócitos ou seus fragmentos pode ser expressa em células hospedeiras que são transformadas ou transfectadas com vectores de expressão adequados. Estas moléculas podem ser substancialmente purificadas para ficarem isentas de contaminantes proteicos ou celulares diferentes daqueles que derivam do hospedeiro recombinante e são consequentemente especialmente úteis em composições farmacêuticas quando combinados com ou transportador e/ou diluente farmaceuticamente aceitável. O antigénio ou suas partes podem ser expressos como fusões com outras proteínas.

Os vectores de expressão são tipicamente construções de ADN ou ARN com auto-replicação contendo os genes de monócito ou seus fragmentos pretendidos, habitualmente ligados 20 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ operacionalmente a elementos de controlo genético apropriados que são reconhecidos numa célula hospedeira adequada. Estes elementos de controlo são capazes de efectuar expressão no interior de um hóspede adequado. O tipo especifico de elementos de controlo necessário para efectuar expressão dependerá da célula hospedeira eventualmente utilizada. De um modo geral, os elementos de controlo genético podem incluir um sistema de promotor procariótico ou um sistema de controlo de expressão de promotor eucariótico e incluem tipicamente um promotor de transcrição, um operador opcional para controlo do arranque de transcrição, potenciadores de transcrição para aumentar o nível de expressão de ARNm, uma sequência que codifica um local de ligação de ribossoma adequado e sequências que terminam transcrição e tradução. Os vectores de expressão contêm também habitualmente uma origem de replicação que permite que o vector se replique independentemente da célula hospedeira.

Os vectores deste invento contêm ADN que codificam as diferentes proteínas de monócitos ou um seu fragmento, que codificam tipicamente, e.g., um polipéptido ou proteína biologicamente activos. O ADN pode estar sob o controlo de um promotor virai e pode codificar um marcador de selecção. Este invento abrange adicionalmente a utilização de tais vectores de expressão que são capazes de expressar ADNc eucariótico que codifica uma proteína de monócito num hospedeiro procariótico ou eucariótico, em que o vector é compatível com o hospedeiro e em que o ADNc eucariótico que codifica para a proteína é inserido no vector de modo a que o crescimento do hospedeiro que contém o vector expressa o ADNc em questão. Habitualmente, concebem-se vectores de expressão para replicação estável nas suas células hospedeiras ou para amplificação para aumentar grandemente o número total de cópias do gene pretendido por célula. Não é sempre necessário que um vector de expressão se replique numa célula hospedeira, e.g., é possível efectuar expressão transitória da proteína ou dos seus fragmentos nos diferentes hospedeiros utilizando vectores que não contêm uma origem de replicação que é reconhecida pela célula hospedeira. É também possível utilizar vectores que causam integração de um gene de monócito ou dos seus fragmentos no ADN do hospedeiro por recombinação ou para integrar um promotor que controla expressão de um gene endógeno. 21 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Os vectores, tal como aqui utilizados, compreendem plasmideos, vírus, bacteriófagos, fragmentos de ADN integráveis e outros veículos que permitem a integração de fragmentos de ADN no genoma do hospedeiro. Os vectores de expressão são vectores especializados que contêm elementos de controlo genético que efectuam expressão de genes ligados operacionalmente. Os plasmideos são a forma de vector mais habitualmente utilizada mas todas as outras formas de vectores que desempenham uma função equivalente são adequadas para utilização aqui. Consultar, e.g., Pouwels, et al. (1985 e suplementos) Cloning Vectors: A Laboratory Manual Elsevier, N.Y.; e Rodriquez, et al. (ed.) (1988) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, MA.

As células de hospedeiro adequadas incluem procariotas, eucariotas inferiores e eucariotas superiores. Os procariotas incluem organismos Gram-negativos e Gram-positivos, e.g., E. coli e B. subtilis. Os eucariotas inferiores incluem leveduras, e.g., S. cerevisiae e Pichia e espécies do género Dictyostelium. Os eucariotas superiores incluem linhas celulares de culturas de tecidos estabelecidas de células animais tanto de origem não mamífera, e.g., células de insecto e de aves, como de origem mamífera, e.g., humanos, primatas e roedores.

Os sistemas hospedeiro-vector procarióticos incluem uma grande variedade de vectores de muitas espécies diferentes. Tal como aqui utilizada, E. coli e os seus vectores serão genericamente utilizados para incluir vectores equivalentes utilizados noutros procariotas. pBR322 ou os seus derivados são vectores representativos para amplificação de ADN. Os vectores que podem ser utilizados para expressar proteínas de monócitos ou fragmentos incluem, entre outros, vectores tais como os que contêm o promotor lac (série pUC); promotor trp (pBR322-trp); promotor Ipp (série pIN); promotores lambda-pP ou promotores pR (pOTS); ou promotores híbridos tais como ptac (pDR540). Consultar Brosius, et al. (1988) "Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and Ipp-derived Promoters", em Rodriguez e Denhardt (ed.) Vectors: A Survey of Molecular 22 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Cloning Vectors and Their Uses 10:205-236 Buttersworth, Boston, MA.

Podem transformar-se eucariotas inferiores, e.g., leveduras e Dictyostelium com vectores contendo seguências de genes de monócitos. Para os objectivos deste invento, o hospedeiro eucariótico inferior mais comum é a levedura de padeiro, Saccharomyces cerevisiae. Será utilizada genericamente para representar eucariotas inferiores apesar de se encontrarem igualmente disponíveis várias outras estirpes e espécies. Os vectores de levedura consistem tipicamente de uma origem de replicação (excepto para o tipo de integração), um gene de selecção, um promotor, ADN gue codifica a proteína pretendida ou seus fragmentos e seguências para terminação de tradução, poliadenilação e terminação de transcrição. Os vectores de expressão adeguados para levedura incluem promotores constitutivos tais como 3-fosfoglicerato-guinase e vários outros promotores de genes de enzimas glicolíticas ou promotores indutíveis como o promotor 2 de álcool desidrogenase ou o promotor de metalotionina. Vectores adequados incluem derivados dos seguintes tipos: com auto-replicação e número de cópias reduzido (tal como a série YRp), com auto-replicação e número de cópias elevado (tal como a série YEp) ; tipos de integração (tal como a série YIp) ou minicromossomas (tal como a série YCp).

As células de culturas de tecidos de eucariotas superiores são as células hospedeiras preferidas para expressão da proteína de monócito. Em princípio, pode utilizar-se praticamente qualquer linha celular de culturas de tecidos de eucariotas superiores, e.g., sistemas de expressão de baculovírus de insecto de uma fonte de invertebrado ou vertebrado. Contudo, preferem-se células de mamífero para obter o processamento adequado tanto concomitante com a tradução como após esta. A transformação ou transfecção e propagação de tais células são rotineiras. Linhas celulares úteis incluem células HeLa, linhas celulares de ovário de hamster chinês (CHO), linhas celulares de rim de rato bebe (BRK), linhas celulares de insecto, linhas celulares de ave e linhas celulares de macaco (COS) . Os vectores de expressão para tais linhas celulares incluem geralmente uma origem de replicação, um promotor, um local de iniciação de tradução, 23 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ locais de splicing de ARN (e.g., caso se utilize ADN genómico), um local de poliadenilação e um local de terminação de transcrição. Estes vectores podem também conter um gene de selecção ou um gene de amplificação. Vectores de expressão adeguados podem ser plasmídeos, vírus ou retrovírus apresentando promotores derivados, e.g., de fontes tais como adenovírus, SV40, parvovírus, vírus vaccinia ou citomegalovírus. Exemplos representativos de vectores de expressão adequados incluem pCDNAl; pCD, consultar Okayama, et al. (1985) Mol. Cell Biol. 5:1136-1142; pMClneo Poly-A, consultar Thomas, et al. (1987) Cell 51:503-512; e um vector de baculovírus tal como pAC 373 ou pAC 610.

Em determinadas situações, as proteínas de monócitos não necessitam ser glicosiladas para desencadear respostas biológicas em determinados ensaios. Contudo, será muitas vezes desejável expressar um polipéptido de monócito num sistema que proporcione um padrão de glicosilação específico ou definido. Neste caso, o padrão habitual será o que for proporcionado naturalmente pelo sistema de expressão. Contudo, o padrão poderá ser modificado por exposição do polipéptido, e.g., na forma não glicosilada, a proteínas de glicosilação apropriadas introduzidas num sistema de expressão heterólogo. Por exemplo, pode co-transf ormar-se um gene de monócito com um ou mais genes que codificam enzimas de glicosilação de mamífero ou outras. Entende-se adicionalmente que a glicosilação em excesso pode ser prejudicial para a actividade biológica da proteína de monócito e que o especialista pode efectuar experimentação rotineira para optimizar o grau de glicosilação que confere actividade biológica óptima.

Uma proteína de monócito ou um seu fragmento pode ser concebida racionalmente para se ligar através de fosfatidilinositol (PI) a uma membrana celular mas pode ser removida das membranas por tratamento com uma enzima de clivagem de fosfatidilinositol, e.g., fosfatidilinositol fosfolipase-C. Tal tratamento liberta o antigénio numa forma biologicamente activa e permite purificação por procedimentos padrão de química de proteínas. Consultar, e.g., Low (1989) Biochem. Biophys, Acta 988:427-454; Tse, et al. (1985) Science 230:1003-1008; Brunner, et al. (1991) J. Cell Biol. 114:1275-1283; e Coligan, et al. (ed.) (1996 e suplementos periódicos) 24 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, New York, NY.

Agora que estas proteínas de monócitos foram caracterizadas, os seus fragmentos ou derivados podem ser preparados por processos convencionais de síntese peptídica. Estes incluem processos tais como os descritos em Stewart e Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky e Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Syntheses Springer-Verlag, New York, NY; e Bodanszky (1984) The Principies of Peptide Synthesis Springer-Verlag, New York, NY. Consultar também Merrifield (1986) Science 232:341-347; e Dawson, et al. (1994) Science 266:776- 779. Por exemplo, pode utilizar-se um processo azida, um processo de cloreto ácido, um processo de anidrido ácido, um processo de anidrido misto, um processo de éster activo (por exemplo, éster p-nitrofenílico, éster N-hidroxissuccinimídico, ou éster cianometílico), um processo carbodiimidazole, um processo de oxidação-redução ou um processo diciclo-hexilcarbodiimida (DCCD)/aditivo. As sínteses em fase sólida e em fase de solução são ambas aplicáveis aos processos anteriormente enumerados. A proteína e seus fragmentos preparados podem ser isolados e purificados a partir da mistura reaccional através de separação de péptidos, por exemplo, por extracção, precipitação, electroforese e várias formas de cromatografia e semelhantes. As proteínas de monócitos deste invento podem obter-se com diferentes graus de pureza dependendo do uso pretendido. A purificação pode ser efectuada por utilização de técnicas conhecidas de purificação de proteína ou pela utilização de anticorpos ou parceiros de ligação aqui descritos, e.g., em cromatografia de afinidade por imunoabsorção. Esta cromatografia de afinidade por imunoabsorção é efectuada ligando primeiramente os anticorpos a um suporte sólido e pondo em contacto os anticorpos ligados com lisados solubilizados de células com a origem apropriada, lisados de outras células que expressam a proteína ou lisados ou sobrenadantes de células que produzem as proteínas em resultado de técnicas de ADN, consultar seguidamente. 25 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Podem rastrear-se várias linhas celulares na procura daquela que expressa a referida proteína a um nível elevado comparativamente com outras células. Rastreiam-se várias linhas celulares, e.g., uma linha celular de estroma de timo de ratinho TA4 e selecciona-se para as suas propriedades de manipulação favoráveis. Podem isolar-se proteínas de células monócitos naturais a partir de fontes naturais ou por expressão a partir de uma célula transformada utilizando um vector de expressão adequado. Consegue-se purificação da proteína expressa por procedimentos padrão ou pode combinar-se com meios de engenharia para purificação eficaz com eficiência elevada a partir de lisados ou sobrenadantes de células. Podem utilizar-se segmentos FLAG ou His6 para tais características de purificação. V. Anticorpos

Podem criar-se anticorpos contra estas diferentes proteínas de monócitos, incluindo variantes individuais, polimórficas, alélicas, de estirpe ou de espécie e seus fragmentos, tanto nas suas formas de ocorrência natural (tamanho completo) como nas suas formas recombinantes. Adicionalmente, podem criar-se anticorpos contra proteínas de monócitos nas suas formas activas ou nas suas formas inactivas. Podem também utilizar-se anticorpos anti-idiotípicos. a. Produção de anticorpos

Podem utilizar-se vários imunogénios para produzir anticorpos que reagem especificamente com estas proteínas de monócitos. 0 imunogénio preferido para a produção de anticorpos monoclonais ou policlonais é a proteína recombinante. A proteína de ocorrência natural pode também ser utilizada na forma pura ou impura. Podem também utilizar-se péptidos sintéticos utilizando sequências da proteína de monócito humana aqui descrita, como um imunogénio para a produção de anticorpos contra a proteína de monócito. A proteína recombinante pode ser expressa em células eucarióticas ou procarióticas tal como aqui descrito e purificada como descrito. 0 produto é então injectado num animal capaz de produzir anticorpos. Podem gerar-se anticorpos 26 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ monoclonais ou policlonais para utilização subsequente em imunoensaios para medir a proteína.

Os peritos na especialidade conhecem métodos de produção de anticorpos policlonais. Sucintamente, mistura-se um imunogénio, de preferência uma proteína purificada com um adjuvante e imunizam-se animais com a mistura. Monitoriza-se a resposta imunitária do animal à preparação de imunogénio efectuando sangramentos de ensaio e determinando o título de reactividade contra a proteína de monócito de interesse. Quando se obtêm títulos de anticorpo contra o imunogénio adequadamente elevados, recolhe-se sangue do animal e preparam-se anti-soros. Pode efectuar-se, caso se pretenda, fraccionamento adicional dos anti-soros para enriquecer em anticorpos reactivos contra a proteína. Consultar, e.g., Harlow e Lane.

Podem obter-se anticorpos monoclonais por várias técnicas conhecidas dos peritos na especialidade. Sucintamente, imortalizam-se células de baço de um animal imunizado com um antigénio pretendido, habitualmente por fusão com uma célula de mieloma. Consultar, e.g., Kohler e Milstein (1976) Eur.J. Immunol. 6:511-519, que é aqui incorporada por referência. Métodos alternativos de imortalização incluem transformação com vírus de Epstein Barr, oncogenes ou retrovírus ou outros métodos conhecidos na especialidade. Rastreiam-se colónias provenientes de células imortalizadas únicas relativamente a produção de anticorpos com a especificidade e afinidade para o antigénio pretendidas e o rendimento dos anticorpos monoclonais produzidos por tais células pode ser aumentado por várias técnicas, incluindo injecção na cavidade peritoneal de um hospedeiro vertebrado. Alternativamente, podem isolar-se sequências de ADN que codificam um anticorpo monoclonal ou um seu fragmento de ligação por rastreio de uma biblioteca de ADN de células B humanas de acordo com o protocolo descrito na generalidade por Huse, et al. (1989) Science 246:1275-1281.

Podem desenvolver-se anticorpos, incluindo fragmentos de ligação e versões em cadeia simples, contra fragmentos predeterminados dessas proteínas de monócitos por imunização de animais com conjugados dos fragmentos com proteínas de transportador tal como descrito anteriormente. Preparam-se 27 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ anticorpos monoclonais a partir de células que excretam o anticorpo pretendido. Estes anticorpos podem ser rastreados por ligação a proteínas de monócitos normais ou defeituosas ou podem ser rastreados para actividade de agonista ou de antagonista. Estes anticorpos monoclonais ligar-se-ão habitualmente com uma KD de pelo menos cerca de 1 mM, mais habitualmente pelo menos cerca de 300 μΜ, tipicamente pelo menos cerca de 100 μΜ, mais tipicamente pelo menos cerca de 30 μΜ, de preferência pelo menos cerca de 10 μΜ e com maior preferência pelo menos cerca de 3 μΜ ou melhor. Estão disponíveis métodos padrão para selecção de preparações de anticorpo selectivos e com afinidade elevada.

Nalgumas circunstâncias é desejável preparar anticorpos monoclonais a partir de vários hospedeiros mamíferos, tais como ratinhos, roedores, primatas, humanos, etc. A descrição de técnicas para preparar tais anticorpos monoclonais pode encontrar-se em, e.g., Stites, et al. (ed.) Basic and Clinicai Immunology (4a ed.) Lange Medicai Publications, Los Altos, CA e referências aí citadas; Harlow e Lane (1988) Antibodies; A Laboratory Manual CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (2a ed.) Academic Press, New York, NY; e particularmente em Kohler e Milstein (1975) Nature 256:495-497, que discutem um método de gerar anticorpos monoclonais. Resumindo sucintamente, este método envolve injectar num animal um imunogénio para iniciar uma resposta imunitária humoral. Sacrifica-se então o animal e retiram-se células do seu baço, que são então fundidas com células de mieloma. O resultado é uma célula híbrida ou "hibridoma" que é capaz de se reproduzir in vitro. Rastreia-se então a população de hibridomas para isolar clones individuais cada um deles excretando uma única espécie de anticorpo contra o imunogénio. Deste modo, as espécies individuais de anticorpo obtidas são os produtos de células B únicas imortalizadas e clonadas a partir de um animal imunizado e geradas em resposta ao local específico reconhecido na substância imunogénica.

Outras técnicas adequadas envolvem selecção de bibliotecas de anticorpos em fagos ou vectores semelhantes. Consultar, Huse, et al. (1989) "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda", Science 246:1275-1281; e Ward, et al. (1989) Nature 341:544- 28 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ 546. Os polipéptidos e anticorpos do presente invento podem ser utilizados com ou sem modificação incluindo anticorpos quiméricos ou humanizados. Frequentemente, os polipéptidos e anticorpos serão marcados por ligação covalente ou não covalente de uma substância que proporciona um sinal detectável. Conhece-se uma vasta gama de marcadores e de técnicas de conjugação e são extensivamente descritos na literatura científica e de patentes. Marcadores adequados incluem radionuclídeos, enzimas, substratos, cofactores, inibidores, partes fluorescentes, partes quimioluminescentes, partículas magnéticas e semelhantes. As patentes que descrevem a utilização de tais marcadores incluem as patentes U.S. 3 817 837; 3 850 752; 3 939 350; 3 996 345; 4 277 437; 4 275 149; e 4 366 241. Podem igualmente produzir-se imunoglobulinas recombinantes. Consultar, Cabilly, patente U.S. 4 816 567; e Queen, et al. (1989) Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 86:10029-10033.

Os anticorpos deste invento podem também ser utilizados para cromatografia de afinidade no isolamento de cada proteína de monócito. Podem preparar-se colunas nas quais os anticorpos estão ligados a um suporte sólido, e.g., partículas, tais como agarose, SEPHADEX ou semelhantes nas quais se pode passar o lisado celular através de uma coluna, lavar a coluna, seguido de concentrações crescentes de um agente desnaturante suave para o qual se libertará proteína de monócito purificada.

Podem também utilizar-se os anticorpos para rastrear bibliotecas de expressão para produtos de expressão específicos. Habitualmente os anticorpos utilizados em tal procedimentos serão marcados com uma parte que permita detecção fácil da presença de antigénio por ligação de anticorpo.

Podem utilizar-se anticorpos contra proteínas de monócitos para a análise ou identificação de componentes de populações de células específicas que expressem a proteína respectiva. Por ensaio dos produtos de expressão de células que expressam proteínas de monócitos é possível diagnosticar doenças, e.g., doenças com compromisso imunitário, doenças com empobrecimento de monócitos ou superprodução de monócitos. 29 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Os anticorpos criados contra cada monócito serão também úteis para desenvolver anticorpos anti-idiotipicos. Estes serão úteis na detecção ou diagnóstico de várias doenças imunitárias relacionadas com a expressão dos antigénios respectivos. b. Imunoensaios

Pode medir-se uma proteína específica por vários métodos de imunoensaio. Para uma revisão de procedimentos imunológicos e de imunoensaios na generalidade consultar Stites e Terr (ed.) 1991 Basic and Clinicai Immunology (7a ed.). Além disso, os imunoensaios do presente invento podem efectuar-se em qualquer uma de diferentes configurações, que são extensivamente revistas em Maggio (ed.) (1980) Enzyme

Immunoassay CRC Press, Boca Raton, Florida; Tijan (1985) "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays," Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Elsevier Science Publishers B.V., Amesterdão; e Harlow e Lane Antibodies. A Laboratory Manual, supra, sendo cada um aqui incorporado por referência. Consultar igualmente Chan (ed.) (1987) Immunoassay: A Practical Guide Academic Press, Orlando, FL; Price e Newman (ed.) (1991) Principies and Practice of

Immunoassays Stockton Press, NY; e Ngo (ed.) (1988) Non-isotopic Immunoassays Plenum Press, NY.

Podem efectuar-se imunoensaios para medir estas proteínas de monócitos através de vários métodos conhecidos dos peritos na especialidade. Sucintamente, os imunoensaios para medir a proteína podem ser ensaios de ligação competitivos ou não competitivos. Nos ensaios de ligação competitivos a amostra a ser analisada compete com um analito marcado para locais de ligação específicos num agente de captura ligado a uma superfície sólida. Preferentemente o agente de captura é um anticorpo que reage especificamente com a proteína de monócito produzida como anteriormente descrito. A concentração de analito marcado ligado ao agente de captura é inversamente proporcional à quantidade de analito livre presente na amostra.

Num imunoensaio de ligação competitivo, a proteína de monócito presente na amostra compete com proteína marcada para 30 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ a ligação a um agente de ligação específico, por exemplo, um anticorpo que reage especificamente com a proteína de monócito. Pode ligar-se o agente de ligação a uma superfície sólida para efectuar separação entre proteína marcada ligada e proteína marcada não ligada. Alternativamente, o ensaio de ligação competitivo pode ser efectuado em fase líquida e podem utilizar-se qualquer uma de entre várias técnicas conhecidas na especialidade para separar a proteína marcada ligada da proteína marcada não ligada. Após separação, determina-se a quantidade de proteína marcada ligada. A quantidade de proteína presente na amostra é inversamente proporcional à quantidade de ligação de proteína marcada.

Alternativamente, pode efectuar-se um imunoensaio homogéneo no qual a etapa de separação não é necessária. Nesses imunoensaios, a marcação da proteína é alterada pela ligação da proteína ao seu agente de ligação específico. Esta alteração na proteína marcada resulta numa diminuição ou num aumento do sinal emitido pelo marcador, de modo a que a medição do marcador no final do imunoensaio permita detecção ou quantificação da proteína.

Estas proteínas de monócitos podem também ser determinadas quantitativamente por vários métodos de imunoensaio não competitivos. Por exemplo, pode utilizar-se um imunoensaio em sanduíche de fase sólida com dois locais. Neste tipo de ensaio, liga-se um agente de ligação para a proteína, por exemplo um anticorpo, a um suporte sólido. Marca-se um segundo agente de ligação de proteína, que também pode ser um anticorpo e que liga a proteína num local diferente. Após ocorrer ligação em ambos os locais da proteína, remove-se o agente de ligação não marcado e mede-se a quantidade de agente de ligação marcado ligado à fase sólida. A quantidade de agente de ligação marcado ligado é directamente proporcional à quantidade de proteína na amostra.

Pode utilizar-se análise de transferência de "Western" para determinar a presença de proteínas de monócitos numa amostra. Efectua-se electroforese, e.g., numa amostra de tecido que se suspeita que contenha a proteína. Após electroforese para separar as proteínas e transferência das proteínas para um suporte sólido adequado tal como filtro de 31 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ nitrocelulose, incuba-se ο suporte sólido com um anticorpo reactivo com a proteína desnaturada. Este anticorpo pode ser marcado ou alternativamente pode ser detectado por incubação subsequente com um segundo anticorpo marcado que se liga ao anticorpo primário.

Os formatos de imunoensaio anteriormente descritos utilizam componentes de ensaio marcados. 0 marcador pode estar em várias formas. 0 marcador pode ser acoplado directa ou indirectamente à componente de ensaio pretendida de acordo com métodos bem conhecidos na especialidade. Pode utilizar-se uma grande variedade de marcadores. A componente pode ser marcada por qualquer um de vários métodos. Tradicionalmente utiliza-se um marcador radioactivo com incorporação de 3H, 125I, 35S, 14C ou 32P. Marcadores não radioactivos incluem ligandos que se ligam a anticorpos marcados, fluoróforos, agentes quimioluminescentes, enzimas e anticorpos que podem servir como membros de par de ligação específicos para uma proteína marcada. A escolha do marcador depende da sensibilidade necessária, da facilidade de conjugação com o composto, das necessidades de estabilidade e da instrumentação disponível. Para uma revisão dos diferentes sistemas de marcação ou de produção de sinal que podem ser utilizados, consultar a patente U.S. n° 4 391 904, que é aqui incorporada por referência.

Podem também medir-se anticorpos reactivos com uma proteína especifica através de vários métodos de imunoensaio. Para revisões de procedimentos imunológicos e de imunoensaio aplicáveis à medição de anticorpos por técnicas de imunoensaio, consultar, e.g., Stites e Terr (ed.) Basic and Clinicai Immunology (7a ed.) supra; Maggio (ed.) Enzyme Immunoassay, supra; e Harlow e Lane Antibodies. A Laboratory Manual, supra.

Podem também utilizar-se vários formatos diferentes de imunoensaio, técnicas de separação e marcadores semelhantes aos anteriormente descritos para a medição de proteínas específicas. Além disso, conhecem-se muitos métodos para avaliar a selectividade de ligação para proteínas específicas ou estritamente relacionadas. 32 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ VI. Proteínas de monócitos purificadas

Proporciona-se a sequência de aminoácidos da proteína FDF03 de monócitos humana em SEQ ID NO:2. Proporciona-se a sequência parcial de ratinho em SEQ ID NO:4. Proporcionam-se sequências de aminoácidos e de nucleótidos de YE01 humana para o membro da família Ig, em SEQ ID NO:5-10. Descrevem-se os membros da família de receptor, designados KTE03 em SEQ ID NO:11-22.

As sequências peptídica permitem preparação de péptidos para gerar anticorpos para reconhecer tais segmentos e permitem preparação de oligonucleótidos que codificam tais sequências. Além disso, os reagentes de afinidade permitem detecção e purificação de mais proteína incluindo formas completas ou recombinantes. As sequências de oligonucleótidos permitem detecção dos ADNc que as codificam ou que estão estritamente relacionadas com estas. VII. Variantes físicas

Este invento também abrange proteínas ou péptidos apresentando semelhanças substanciais de sequências de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos de uma SEQ ID NO:6 ou 10 tal como definido nas reivindicações anexas, especialmente variantes de splicing. Permitem-se igualmente variantes apresentando substituições, e.g., 20 ou menos, de preferência 10 ou menos e com maior preferência 5 ou menos substituições. Quando as substituições são substituições conservativas, as variantes partilharão semelhança ou reactividade cruzada imunogénica ou antigénica com uma proteína de sequência natural correspondente. As variantes naturais incluem variantes individuais, alélicas, polimórficas, de estirpe ou de espécie. A semelhança de sequência de aminoácidos ou a identidade de sequência é determinada por emparelhamento optimizado de resíduos, caso necessário, por introdução de falhas tal como necessário. Estas alterações são emparelhamentos quando se consideram substituições conservativas. As substituições conservativas incluem tipicamente substituições dentro dos seguintes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, 33 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ leucina; ácido aspártico, ácido glutâmico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; e fenilalanina, tirosina. As sequências de aminoácidos homólogas incluem variações alélicas naturais e interespécies em cada sequência de proteína respectiva. Proteínas ou péptidos homólogos típicos apresentarão 50-100% de semelhança (caso se tenham introduzido falhas), a 75-100% de semelhança (caso se tenham incluído substituições conservativas) com a sequência de aminoácidos da proteína de monócito relevante. Tal como definido nas reivindicações anexas, as medidas de identidade são pelo menos 80% e com maior preferência pelo menos 80% e em concretizações especialmente preferidas, pelo menos 85% ou mais. Consultar igualmente Needleham, et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; Sankoff, et al. (1983) Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison a Chapter One, Addison-Wesley, Reading, MA; e pacotes de software da IntelliGenetics, Mountain View, CA; e do grupo de genética computacional (GCG) da University of Wisconsin, Madison.

Os ácidos nucleicos que codificam as proteínas de monócitos de mamífero correspondentes hibridarão tipicamente, e.g., com SEQ ID NO 5, 7 e/ou 9; sob condições rigorosas. Por exemplo, os ácidos nucleicos que codificam as respectivas proteínas de monócitos hibridarão tipicamente com o ácido nucleico adequado sob condições de hibridação rigorosas, proporcionando poucos sinais de falsos positivos de hibridação. De um modo geral, seleccionam-se condições rigorosas para serem cerca de 10°C abaixo do ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência com a qual vão hibridar a uma força iónica e pH definidos. A Tm é a temperatura (sob condições definidas de força iónica e pH) à qual 50% da sequência alvo híbrida com uma sonda perfeitamente complementar. Tipicamente, as condições rigorosas serão aquelas nas quais a concentração de sal na lavagem é de cerca de 0,02 molar a pH 7 e a temperatura é de pelo menos cerca de 50°C. Outros factores podem afectar significativamente o rigor da hibridação, incluindo, entre outros, composição de bases e tamanho das cadeias complementares, a presença de solventes orgânicos tais como formamida e a extensão de não emparelhamento de bases. Uma concretização preferida incluirá ácidos nucleicos que se ligarão a sequências reveladas em 34 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ formamida a 50% NaCl 20-50 mM a 42°C. Em determinados casos, o rigor pode ser relaxado para detectar outros ácidos nucleicos apresentando menor identidade de sequência do que a identidade de sequência completa. O ADN de um gene de monócito isolado pode ser facilmente modificado por substituições de nucleótido, deleções de nucleótido, inserções de nucleótido e inversões de partes de nucleótidos. Estas modificações resultam em novas sequências de ADN que codificam esses antigénios de monócito, os seus derivados ou proteínas com actividades altamente semelhantes dos pontos de vista fisiológico, imunogénico ou antigénico.

Podem utilizar-se sequências modificadas para produzir antigénios mutantes ou para aumentar a expressão. O aumento da expressão pode envolver amplificação génica, transcrição aumentada, tradução aumentada e outros mecanismos. Tais derivados de proteína de monócito mutante incluem mutações predeterminadas ou mutações específicas do local da proteína respectiva ou dos seus fragmentos. "Proteína de monócito mutante" abrange um polipéptido incluído nas definições de homologia de proteína de monócito tal como anteriormente estabelecidas, mas com uma sequência de aminoácidos que é diferente da apresentada pela proteína de monócito tal como encontrada na natureza, devido a deleção, substituição ou inserção. Nomeadamente, "mutantes específicos do local de proteínas de monócitos" inclui geralmente proteínas apresentando semelhança significativa com uma proteína com uma sequência de SEQ ID NO:6 ou 10. Geralmente, as variantes terão em comum muitas actividades físico-químicas e biológicas, e.g., antigénicas ou imunogénicas, com essas sequências e em concretizações preferidas contêm a maioria ou todas as apresentadas pela sequência revelada. Aplicam-se conceitos semelhantes a essas várias proteínas de monócitos, nomeadamente as que se encontram em diferentes animais de sangue quente, e.g., primatas e mamíferos.

Apesar dos locais de mutação específicos do local serem predeterminados, os mutantes não têm que específicos do local. Pode efectuar-se mutagénese de proteína de monócito fazendo inserções ou deleções de aminoácidos. Podem gerar-se substituições, deleções, inserções ou quaisquer combinações 35 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ para obter uma construção final. As inserções incluem fusões nos terminais amino ou carboxilo. Pode efectuar-se mutagénese aleatória num codão alvo e os mutantes expressos podem ser então rastreados para a actividade pretendida. São bem conhecidos na especialidade métodos para fazer mutações por substituição em locais predeterminados no ADN apresentando uma sequência conhecida, e.g., por técnicas de mutagénese com iniciador M13 ou reacção de polimerização em cadeia (PCR). Consultar igualmente, Sambrook, et al. (1989) e Ausubel, et al. (1987 e suplementos). As mutações do ADN não deveriam normalmente colocar sequências de codificação fora de quadro de leitura e de preferência não criarão regiões complementares que poderiam hibridar para produzir estruturas secundárias de ARNm tais como estruturas em ansa e gancho de cabelo. 0 presente invento também proporciona proteínas recombinantes, e.g., proteínas de fusão heterólogas utilizando segmentos dessas proteínas. Uma proteína de fusão heteróloga é uma fusão de proteínas ou segmentos que não estão naturalmente fundidas da mesma forma. Assim, o produto de fusão de uma imunoglobulina com um polipéptido de monócito respectivo é uma molécula de proteína contínua com sequências fundidas numa ligação peptídica típica, tipicamente produzida como um produto de tradução único e apresentando propriedades derivadas de cada péptido de origem. Aplica-se um conceito semelhante a sequências de ácido nucleico heterólogas.

Além disso, podem produzir-se novas construções a partir da combinação de domínios funcionais semelhantes de outras proteínas. Por exemplo, podem "permutar-se" domínios ou outros segmentos entre polipéptidos ou fragmentos de fusão novos diferentes, tipicamente com proteínas relacionadas, e.g., dentro da família Ig ou da família de receptores Fc. Preferentemente, utilizar-se-ão domínios estruturais intactos, e.g., partes de Ig intactas. Consultar, e.g., Cunningham, et al. (1989) Science 243:1330-1336; e 0'Dowd, et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:15985-15992. Assim, da ligação funcional de especificidades de ligação de proteína e outros domínios funcionais, resultarão novos polipéptidos quiméricos apresentando novas combinações de especificidades. Igualmente, pode aplicar-se mutagénese por rastreio de alanina, de preferência a resíduos que estão estruturalmente no exterior 36 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ da estrutura secundária, ο que evitará a maioria dos resíduos críticos que geralmente desfazem a estrutura terciária. "Derivados" destes antigénios de monócito incluem mutantes de sequências de aminoácidos, variantes de glicosilação e conjugados covalentes ou agregados com outras partes químicas. Podem preparar-se derivados covalentes pela ligação de funcionalidades a grupos que se encontram nas cadeias laterais ou nos terminais C e N dos aminoácidos dessas proteínas de monócitos utilizando meios bem conhecidos na especialidade. Esses derivados podem incluir, sem limitação, ésteres alifáticos ou amidas do terminal carboxilo ou de resíduos contendo cadeias laterais carboxilo, derivados de O-acilo de resíduos contendo grupos hidroxilo e derivados N-acilo do aminoácido amino terminal ou de resíduos contendo grupos amino, e.g., lisina ou arginina. Seleccionam-se grupos acilo a partir do grupo de partes de alquilo incluindo alquilos normais de C3 a C18, formando assim espécies alcanoílo, aroílo. A ligação covalente a proteínas transportadoras pode ser importante quando partes imunogénicas são haptenos.

Nomeadamente, incluem-se alterações de glicosilação, e.g., efectuadas por modificação dos padrões de glicosilação de um polipéptido durante a sua síntese e processamento ou nas etapas de processamento subsequentes. Os meios especialmente preferidos para efectuar tais alterações são por exposição do polipéptido a enzimas de glicosilação derivadas de células que normalmente proporcionam tal processamento, e.g., enzimas de glicosilação de mamífero. Abrangem-se igualmente enzimas de desglicosilação. Também se abrangem versões da mesma sequência de aminoácidos primária que têm outras pequenas modificações, incluindo resíduos de aminoácido fosforilados, e.g., fosfotirosina, fosfosserina ou fosfotreonina; ou outras partes, incluindo grupos ribosilo ou reagentes de ligação cruzada. Abrangem-se igualmente proteínas compreendendo substituições, que manterão imunogenicidade substancial, para produzir anticorpos que reconhecem uma proteína de SEQ ID NO:6 ou 10. Alternativamente, pode pretender-se produzir anticorpos que reconhecem SEQ ID NO:10. Tipicamente, estas proteínas conterão menos de 20 substituições de resíduos da sequência revelada, mais tipicamente menos de 10 substituições, de preferência menos de 5 e com maior preferência menos de 3. 37 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Alternativamente, as proteínas que iniciam e finalizam em domínios estruturais reterão habitualmente antigenicidade e imunogenicidade cruzadas.

Os conjugados covalentes são um grupo principal de derivados de proteínas de monócitos ou seus fragmentos com outras proteínas ou polipéptidos. Estes derivados podem ser sintetizados em cultura recombinante tal como fusões de terminal N ou C ou pela utilização de agentes conhecidos na especialidade pela sua utilidade em proteínas de ligação cruzada através de grupos laterais reactivos. Os locais preferidos de derivatização de proteína com agentes de reticulação são em grupos amino livres, partes de hidrato de carbono e resíduos de cisteína.

Proporcionam-se igualmente polipéptidos de fusão entre estas proteínas de monócitos e outras proteínas homólogas ou heterólogas. Os polipéptidos heterólogos podem ser fusões entre diferentes marcadores de superfície resultando em, e.g., uma proteína híbrida. Igualmente, podem construir-se fusões heterólogas que apresentariam uma combinação de propriedades ou actividades das proteínas derivadas. Exemplos típicos são as fusões de um polipéptido repórter, e.g., luciferase, com um segmento ou domínio de uma proteína, e.g., um segmento de ligação a receptor, de modo que a presença ou localização da proteína fundida possa ser facilmente determinada. Consultar, e.g., Dull, et al., patente U.S. 4 859 609 . Outros parceiros de fusão de genes incluem β-galactosidase bacteriana, trpE, proteína A, β-lactamase, alfa-amilase, álcool desidrogenase e factor alfa de acasalamento de levedura. Consultar, e.g., Godowski, et al. (1988) Science 241:812-816.

Tais polipéptidos podem também apresentar resíduos de aminoácido que foram modificados quimicamente por fosforilação, sulfonação, biotinilação ou a adição ou remoção de outras partes, nomeadamente aquelas que têm formas moleculares semelhantes a grupos fosfato. Nalgumas concretizações as modificações serão reagentes de marcação úteis ou servem com alvos de purificação, e.g., ligandos de afinidade. 38 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Este invento também abrange a utilização de derivados dessas proteínas de monócitos que não sejam variações de sequência de aminoácidos ou de glicosilação. Tais derivados podem envolver associação covalente ou de agregação com partes químicas. Estes derivados incluem-se geralmente em três classes: (1) sais, (2) modificações covalentes de cadeia lateral de resíduos e de resíduos terminais, e (3) complexos de adsorção, por exemplo com membranas celulares. Tais derivados covalentes ou de agregação são úteis como imunogénios, como reagentes em imunoensaios ou em métodos de purificação tais como para purificação por afinidade de ligandos ou outros ligandos de ligação. Por exemplo, pode imobilizar-se um antigénio de proteína de monócito por ligação covalente a um suporte sólido tal como Sepharose activada por brometo de cianogénio por métodos que são bem conhecidos na especialidade, ou adsorver-se em superfícies de poliolefina com ou sem reticulação por glutaraldeído, para utilização no ensaio ou purificação de anticorpos anti-proteína de monócito. As proteínas de monócitos podem também ser marcadas com um grupo detectável, e.g., iodo radioactivo pelo procedimento de cloramina T, ligadas covalentemente a quelatos de metais raros ou conjugadas com outra parte fluorescente para utilização em ensaios de diagnóstico. A purificação destas proteínas de monócitos pode ser efectuada por anticorpos imobilizados.

Os genes isolados de proteínas de monócitos permitirão transformação de células que não apresentem expressão de uma proteína de monócito correspondente, e.g., tipos de espécies ou células que estão isentas das proteínas correspondentes e apresentam actividade basal negativa. A expressão de genes transformados permitirá isolamento de linhas celulares antigenicamente puras com variantes definidos ou de espécie única. Esta abordagem permitirá detecção e discriminação mais sensíveis dos efeitos fisiológicos destas proteínas de monócitos. Podem isolar-se e utilizar-se fragmentos subcelulares, e.g., citoplastos ou fragmentos de membrana. VII. Complexos agente de ligaçãotproteína de monócito

Determina-se num imunoensaio uma proteína de monócito que se liga especif icamente a, ou que é especif icamente imunorreactiva com um anticorpo gerado contra um imunogénio 39 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

definido, tal como um imunogénio que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou 10. O imunoensaio utiliza um anti-soro policlonal que foi criado contra a proteína de SEQ ID NO:6, 10 ou combinação adequada. Este anti-soro é seleccionado de modo a apresentar reactividade cruzada reduzida contra outros membros das famílias relacionados e qualquer de tais reactividades cruzadas é ou pode ser removida por imunoabsorção antes de se utilizar no imunoensaio.

De modo a produzir anti-soros para utilização num imunoensaio, isola-se a proteína de SEQ ID NO:6, 10 como aqui descrito. Por exemplo, pode produzir-se proteína recombinante numa linha celular de mamífero. Imuniza-se uma estirpe de ratinhos consanguínea tal como Balb/c com a proteína adequada utilizando um adjuvante padrão tal como adjuvante de Freund e um protocolo padrão de imunização de ratinhos (consultar Harlow e Lane, supra). Alternativamente, pode utilizar-se como imunogénio um péptido sintético derivado das sequências aqui reveladas e conjugado com uma proteína transportadora. Recolhem-se soros policlonais e titulam-se contra a proteína imunogénica num imunoensaio, e.g., um imunoensaio em fase sólida com o imunogénio imobilizado num suporte sólido. Seleccionam-se anti-soros policlonais com um título de 104 ou superior e ensaiam-se para a sua reactividade cruzada contra outras proteínas relacionadas utilizando um imunoensaio de ligação competitiva tal como o descrito em Harlow e Lane, supra, nas páginas 570-573. Consultar igualmente Hertzenberg, et al. (ed. 1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology vol. 1-4, Blackwell Science; e Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY. Preferentemente utilizam-se duas proteínas relacionadas diferentes nesta determinação em conjunto com determinada proteína de monócito. Por exemplo, com uma proteína da família Ig; utilizam-se pelo menos dois outros membros da família para absorver epítopos comuns. Em conjunto com o membro da família Fc utilizam-se dois outros membros da família. Estes outros membros da família podem ser produzidos como proteínas recombinantes e isolados utilizando técnicas padrão de biologia molecular e química de proteína tal como aqui descritas.

Podem utilizar-se imunoensaios no formato de ligação competitiva para as determinações de reactividade cruzada. Por 40 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ exemplo, a proteína pode ser imobilizada num suporte sólido. As proteínas adicionadas ao ensaio competem com a ligação dos anti-soros ao antigénio imobilizado. Compara-se a capacidade das proteínas anteriores competirem para a ligação dos anti-soros à proteína imobilizada com a proteína de SEQ ID NO 6 ou 10. A percentagem de reactividade cruzada para as proteínas anteriores é calculada utilizando cálculos padrão. Os anti-soros com menos de 10% de reactividade cruzada com cada uma das proteínas anteriormente listadas são seleccionados e recolhidos conjuntamente. Removem-se então os anticorpos com reactividade cruzada dos conjuntos de anti-soros por imunoabsorção com as proteínas anteriormente listadas.

Utilizam-se então os anti-soros imunoabsorvidos e recolhidos conjuntamente num imunoensaio de ligação competitiva tal como anteriormente descrito para comparar uma segunda proteína com a proteína imunogénica (e.g., a proteína de monócito de SEQ ID NO:6, 10). De modo a fazer esta comparação, ensaiam-se cada uma das duas proteínas numa vasta gama de concentrações e determina-se a quantidade de cada proteína necessária para inibir 50% da ligação dos anti-soros com a proteína imobilizada. Se a quantidade da segunda proteína necessária for menor do que o dobro da quantidade da proteína, e.g., de SEQ ID NO:2, que é necessária, então diz-se que a segunda proteína se liga especificamente a um anticorpo gerado contra o imunogénio.

Considera-se que cada uma das proteínas de monócitos é uma família de proteínas homólogas que compreende dois ou mais genes. Para um produto génico específico, tal como uma proteína membro da família Ig humana, o invento abrange não apenas as sequências de aminoácidos aqui reveladas mas também outras proteínas que são variantes alélicas, polimórficas, não alélicas ou de espécie. Considera-se também que a expressão "proteína de monócito humana" inclui mutações não naturais introduzidas por mutação deliberada utilizando tecnologia recombinante convencional tal como mutação de sítio único ou por excisão de secções curtas de ADN que codificam essas proteínas ou variantes de splicing do gene ou por substituição ou adição de pequenas quantidades de novos aminoácidos. Tais pequenas alterações têm que manter substancialmente a imunoidentidade da molécula original e/ou a sua actividade 41 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ biológica. Assim, estas alterações incluem proteínas que são especificamente imunorreactivas com uma proteína de monócito respectiva de ocorrência natural designada. As modificações de proteína gue se consideram pouco importantes incluiriam a substituição conservativa de aminoácidos com propriedades guímicas semelhantes, tal como descrito anteriormente para cada família de proteínas na sua globalidade. Podem determinar-se as composições de proteína aqui reveladas por alinhamento óptimo de uma proteína com a proteína de SEQ ID NO: 6 e 10 e utilizando os imunoensaios convencionais agui descritos para determinar imunoidentidade. IX. Utilizações O presente invento proporciona reagentes que terão utilização em aplicações de diagnóstico tal como descrito aqui noutro local, e.g., na descrição geral para anomalias de desenvolvimento ou seguidamente na descrição de kits para diagnóstico.

Podem utilizar-se genes de monócito, e.g., ADN ou ARN como uma componente num ensaio forense. Por exemplo, as sequências de nucleótidos proporcionadas podem ser marcadas utilizando, e.g., 32P ou biotina e utilizadas para sondar transferências de polimorfismos de fragmentos de restrição padrão, proporcionando uma característica mensurável para ajudar à distinção entre indivíduos. Podem utilizar-se tais sondas em técnicas forenses bem conhecidas tais como impressão digital genética. Além disso, podem utilizar-se sondas de nucleótido produzidas a partir de sequências de monócito em ensaios in situ para detectar anomalias cromossómicas.

Podem utilizar-se anticorpos e outros agentes de ligação dirigidos contra proteínas de monócitos ou ácidos nucleicos para purificar a molécula de proteína de monócito correspondente. Tal como descrito nos exemplos seguintes, a purificação de proteínas de monócitos recorrendo a anticorpos é possível e praticável. Podem também utilizar-se anticorpos e outros agentes de ligação de um modo diagnóstico para determinar se as componentes de monócito estão presentes numa amostra de tecido ou população de células utilizando técnicas bem conhecidas aqui descritas. A capacidade de ligar um agente 42 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ de ligação a uma proteína de monócito proporciona um meio de diagnosticar doenças associadas com desregulação de expressão. Os anticorpos e outros agentes de ligação de proteínas de monócitos podem também ser úteis como marcadores histológicos. Tal como descrito nos exemplos seguintes, a expressão de cada uma destas proteínas limita-se a tipos de tecido específicos. Dirigindo uma sonda, tal como um anticorpo ou ácido nucleico, para a proteína de monócito respectiva, é possível utilizar a sonda para distinguir tipos de tecidos e de células in situ ou in vitro.

Este invento também se refere a reagentes gue podem apresentar valor terapêutico significativo. As proteínas de monócitos (de ocorrência natural ou recombinantes), os seus fragmentos e os anticorpos contra estas, conjuntamente com compostos identificados como tendo afinidade de ligação para a proteína de monócito, podem ser úteis no tratamento de doenças associadas com fisiologia ou desenvolvimento anómalos, incluindo proliferação anómala, e.g., doenças cancerosas ou doenças degenerativas. A proliferação anómala, regeneração, degenerescência e atrofia pode modular-se por tratamento terapêutico adequado utilizando as composições aqui proporcionadas. Por exemplo, uma doença associada com expressão anómala ou sinalização anómala por um monócito, e.g., como uma célula apresentadora de antigénio é um alvo para um agonista ou antagonista da proteína. As proteínas desempenham provavelmente um papel na regulação ou desenvolvimento de células hematopoiéticas, e.g., células linfóides, que afectam respostas imunitárias, e.g., apresentação de antigénio e as funções efectoras resultantes.

Por exemplo, o anticorpo DX26 prova que os anticorpos inibidores serão úteis na modulação das funções de células NK ou T, e.g., assassínio. Tal modulação terá tipicamente um efeito de 20%, positivo ou negativo, e.g., o efeito de assassínio, mas em concretizações preferidas terão 30%, 40%, 50% ou mais. Devido à distribuição ser também em monócitos, a molécula afectará provavelmente a regulação de funções efectoras iniciadas ou mediadas por monócitos do sistema imunitário, e.g., auto-respostas imunitárias, rejeição de transplante, doença do transplante contra o hospedeiro, doenças inflamatórias, etc. Estas moléculas podem também 43 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ afectar eliminação de condições neoplásicas, e.g., rejeição de tumor.

Conhecem-se outras doenças de desenvolvimento anómalo em tipos de células que se sabe apresentarem ARNm de proteína de monócito por análise de hibridação de "Northern". Consultar Berkow (ed.) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy. Merck & Co., Rahway, NJ; e Thorn, et al. Harrison's Principies of Internai Medicine, McGraw-Hill, NY. As anomalias de desenvolvimento ou funcionais, e.g., do sistema imunitário, provocam anomalias e doenças médicas significativas que podem ser susceptíveis de prevenção ou tratamento utilizando composições aqui proporcionadas.

As proteínas de monócitos ou anticorpos recombinantes podem ser purificadas e seguidamente administradas a um doente. Estes reagentes podem ser combinados para utilização terapêutica com ingredientes activos ou inertes adicionais, e.g., em transportadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis convencionais, e.g., adjuvantes imunogénicos, conjuntamente com estabilizantes e excipientes fisiologicamente inócuos. Nomeadamente, estes podem úteis num contexto de vacina, em que o antigénio é combinado com uma destas versões terapêuticas de agonistas ou antagonistas. Estas combinações podem ser esterilizadas por filtração e colocadas sob formas de dosagem tal como por liofilização em frascos de dosagem ou armazenamento em preparações aquosas estabilizadas. Este invento também abrange utilização de anticorpos ou seus fragmentos de ligação, incluindo formas que não ligam complemento. 0 rastreio de fármacos utilizando anticorpos ou seus receptores ou fragmentos pode identificar compostos apresentando afinidade de ligação com essas proteínas de monócitos, incluindo isolamento de componentes associadas. Podem então utilizar-se ensaios biológicos subsequentes para determinar se o composto tem actividade de estimulação intrínseca e é consequentemente um bloqueador ou antagonista na medida em que bloqueia a actividade da proteína. Igualmente, um composto com actividade estimulante intrínseca pode activar a célula através da proteína e é assim um agonista na medida em que estimula a célula. Este invento 44 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ abrange adicionalmente a utilização terapêutica de anticorpos para as proteínas como antagonistas.

As quantidades de reagentes necessários para terapia eficaz dependerão de muitos factores diferentes, incluindo meios de administração, local de alvo, estado fisiológico do doente e outros medicamentos administrados. Assim, as dosagens de tratamento devem ser tituladas para optimizar segurança e eficácia. Tipicamente, as dosagens utilizadas in vitro podem proporcionar orientação útil sobre as quantidades úteis para administração in situ desses reagentes. O ensaio animal de doses eficazes para tratamento de doenças específicas proporcionará indicação de previsão adicional da dosagem humana. Descrevem-se várias considerações, e.g., em Gilman, et al. (ed.) (1990) Goodman e Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8a ed.) Pergamon Press; e (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences (17a ed.) Mack Publishing Co., Easton, PA. Discutem-se aí e seguidamente métodos para administração, e.g., para administração oral, intravenosa, intraperitoneal ou intramuscular, difusão transdérmica e outras. Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluirão água, solução salina, tampões e outros compostos descritos, e.g., em Merck Index. Merck & Co., Rahway, NJ. Espera-se que as gamas de dosagem sejam habitualmente em quantidades inferiores a concentrações de 1 mM, tipicamente concentrações menores que cerca de 10 μΜ, habitualmente menos que cerca de 100 nM, de preferência menos que cerca de 10 pM (picomolar) e com a maior preferência inferiores a cerca de 1 fM (fentomolar), com um transportador adequado. Serão muitas vezes utilizadas para administração contínua formulações de libertação lenta ou um aparelho de libertação lenta.

As proteínas de monócitos, seus fragmentos e seus anticorpos ou os seus fragmentos, antagonistas e agonistas, podem ser administrados directamente ao hospedeiro a ser tratado ou, dependendo do tamanho dos compostos, pode ser desejável conjugá-los a proteínas transportadoras tais como ovalbumina ou albumina de soro antes da sua administração. Podem administrar-se formulações terapêuticas sob muitas formulações de dosagem convencionais. Apesar de ser possível administrar o ingrediente activo sozinho, é preferível apresentá-lo como uma formulação farmacêutica. As formulações 45 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ compreendem tipicamente pelo menos um ingrediente activo, tal como definido anteriormente, conjuntamente com um ou mais seus transportadores aceitáveis. Cada transportador deve ser farmacêutica e fisiologicamente aceitável no sentido de ser compatível com os outros ingredientes e não causar dano ao doente. As formulações incluem as que são adequadas para administração oral, rectal, nasal ou parentérica (incluindo administração subcutânea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). As formulações podem ser convenientemente apresentadas em forma de unidade de dosagem e podem ser preparadas por quaisquer métodos bem conhecidos na especialidade farmacêutica. Consultar, e.g., Gilman, et al. (ed.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8a ed.) Pergamon Press; e (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences (17a ed.) Mack Publishing Co., Easton, PA; Avis, et a. (ed.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, NY; Lieberman, et al. (ed.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, NY; e Lieberman, et al. (ed.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, NY. A terapia deste invento pode ser combinada com outros agentes quimioterapêuticos ou quimioprofilácticos ou utilizada em associação com estes. São particularmente úteis as formas de ocorrência natural e recombinante das proteínas de monócitos deste invento em kits e métodos de ensaio que são capazes de rastrear compostos para actividade de ligação às proteínas. Nos últimos anos têm sido desenvolvidos vários métodos para automatizar os ensaios de modo a permitir rastrear dezenas de milhar de compostos num período curto. Consultar, e.g., Fodor, et al. (1991) Science 251:767-773 e outras descrições de bibliotecas de diversidade química, que descrevem meios de ensaiar afinidade de ligação por uma pluralidade de compostos. O desenvolvimento de ensaios adequados pode ser muito facilitado pela disponibilidade de grandes quantidades de versões purificadas, e.g., solúveis de proteína de monócito tal como proporcionada por este invento.

Por exemplo, podem muitas vezes encontrar-se antagonistas uma vez que a proteína tenha sido definida estruturalmente. É agora possível ensaiar análogos de proteína potenciais com base no desenvolvimento de métodos de ensaio altamente automatizados utilizando uma proteína de superfície 46 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ purificada. Nomeadamente, descobrir-se-ão novos agonistas e antagonistas utilizando técnicas de rastreio agui descritas. São de especial importância os compostos gue revelaram uma afinidade de ligação combinada para múltiplos antigénios de superfície celular relacionados, e.g., compostos gue podem servir como antagonistas para variantes de espécie de uma proteina de monócito.

Este invento é especialmente útil para rastrear compostos utilizando proteina recombinante de monócito em várias técnicas de rastreio de fármacos. As vantagens da utilização de uma proteina recombinante no rastreio de ligandos específicos incluem: (a) fonte renovável melhorada da proteina a partir de uma fonte especifica; (b) número de antigénios por célula potencialmente maior proporcionando melhor razão sinal/ruido nos ensaios; e (c) especificidade para variantes de espécie (proporcionando teoricamente maior especificidade de doença e biológica).

Um método de rastreio de fármacos utiliza células hospedeiras eucarióticas ou procarióticas gue são transformadas de forma estável com moléculas de ADN recombinante gue expressam uma proteina de monócito. Podem isolar-se células gue expressam essa proteina isoladamente de quaisquer outras. Tais células, nas formas viável ou fixada, podem ser utilizadas para ensaios de ligação padrão de proteínas de superfície. Consultar igualmente, Parce, et al. (1989) Science 246:243-247; e Owicki, et al. (1990) Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 87:4007-4011, que descrevem métodos sensíveis para detectar respostas celulares. Os ensaios competitivos são especialmente úteis em que as células (fonte de proteína de monócito) são postas em contacto e incubadas com um anticorpo com afinidade de ligação conhecida para o antigénio, tal como 125I-anticorpo e uma amostra de ensaio para a qual se está a medir afinidade de ligação para a composição de ligação. As composições de ligação marcadas ligadas e livres são então separadas para avaliar o grau de ligação de proteína. A quantidade de composto de ensaio ligado é inversamente proporcional à quantidade de ligação à fonte conhecida de anticorpo marcado. Podem utilizar-se muitas técnicas para separar reagente ligado de reagente livre para avaliar o grau de ligação. Esta etapa de separação poderia 47 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ envolver tipicamente um procedimento tal como adesão a filtros seguida de lavagem, adesão a plástico seguido de lavagem ou centrifugação das membranas celulares. Poderiam também utilizar-se células viáveis para rastrear os efeitos de fármacos nessas funções mediadas por proteína de monócito, e.g., apresentação de antigénio ou função auxiliadora.

Outro método utiliza membranas de células hospedeiras eucarióticas ou procarióticas transformadas como a fonte de uma proteína de monócito. Essas células são transformadas de modo estável com vectores de ADN que dirigem a expressão da proteína adequada, e.g., uma forma ligada à membrana e concebida racionalmente. Essencialmente, preparar-se-iam as membranas a partir das células e seriam utilizadas em ensaios de ligação tal como o ensaio competitivo estabelecido anteriormente.

Ainda outra abordagem é a utilização de proteína de monócito solubilizada, não purificada ou solubilizada, purificada a partir de células hospedeiras eucarióticas ou procarióticas transformadas. Tal permite um ensaio de ligação “molecular" com as vantagens de especificidade aumentada, capacidade de automatização e alta rentabilidade de ensaios de fármacos.

Outra técnica para rastreio de fármacos envolve uma abordagem que proporciona rastreio com alta rentabilidade para compostos com afinidade de ligação adequada para a proteína de monócito respectiva e descreve-se detalhadamente em Geysen, Pedido de Patente Europeia 84/03564, publicado a 13 de Setembro de 1984. Primeiramente, sintetizam-se números elevados de compostos de ensaio de péptidos pequenos num suporte sólido, e.g., pinos de plástico ou alguma outra superfície adequada, consultar Fodor, et al., supra. Seguidamente faz-se reagir todos os pinos com proteína de monócito solubilizada, não purificada ou solubilizada, purificada e lava-se. A próxima etapa envolve detecção de reagente marcado, e.g., anticorpo.

Um dos modos para determinar quais os locais que interagem com outras proteínas específicas é uma determinação da estrutura física, e.g., técnicas de cristalografia de raios-X 48 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ ou de RMN bidimensional. Tal proporcionará uma orientação dos resíduos de aminoácido que formam regiões de contacto molecular. Para uma descrição detalhada de determinação estrutural de proteínas, consultar, e.g., Blundell e Johnson (1976) Protein Crystallography Academic Press, NY. X. Kits

Este invento também se refere à utilização destas proteínas de monócitos, seus fragmentos, péptidos e seus produtos de fusão numa variedade de kits e métodos de diagnóstico para detectar a presença de uma proteína de monócito ou mensagem. Tipicamente o kit terá um compartimento contendo quer um péptido de monócito ou segmento de gene definidos, quer um reagente que reconhece um deles, e.g., anticorpos.

Um kit para determinar a afinidade de ligação de um composto de ensaio para a proteína de monócito respectiva compreenderia tipicamente um composto de ensaio; um composto marcado, por exemplo um anticorpo com afinidade de ligação conhecida para a proteína; uma fonte da proteína de monócito (de ocorrência natural ou recombinante); e um meio para separar composto marcado ligado e livre, tal como uma fase sólida para imobilizar a proteína de monócito. Após rastreio dos compostos, podem avaliar-se em ensaios biológicos adequados os que apresentarem afinidade de ligação adequada para a proteína, tal como é bem conhecido na especialidade, para determinar se estes actuam como agonistas ou antagonistas para regular a função de monócitos. A disponibilidade de polipéptidos de monócitos recombinantes também proporciona padrões bem definidos para a calibração de tais ensaios.

Um kit preferido para a determinação da concentração de, por exemplo, uma proteína de monócito numa amostra compreenderia tipicamente um composto marcado, e.g., anticorpo, com afinidade de ligação conhecida para a proteína de monócito, uma fonte de proteína de monócito (de ocorrência natural ou recombinante) e um meio para separar composto marcado ligado e livre, por exemplo, uma fase sólida para imobilizar a proteína de monócito. Serão normalmente proporcionados compartimentos contendo reagentes e instruções. 49 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Os anticorpos, incluindo fragmentos de ligação ao antigénio, específicos para o respectivo monócito ou seus fragmentos são úteis em aplicações de diagnóstico para detectar a presença de níveis elevados da proteína e/ou dos seus fragmentos. Tais ensaios de diagnóstico podem utilizar lisados, células vivas, células fixadas, imunofluorescência, culturas de células, fluidos corporais e podem envolver adicionalmente a detecção de antigénios em soro ou semelhantes. Os ensaios de diagnóstico podem ser homogéneos (sem uma etapa de separação entre reagente livre e complexo antigénio-proteína de monócito) ou heterogéneos (com uma etapa de separação). Existem vários ensaios comerciais, tais como radioimunoensaio (RIA), ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), imunoensaio enzimático (EIA), técnica de imunoensaio multiplicada por enzima (EMIT), imunoensaio fluorescente com substrato marcado (SLFIA) e semelhantes. Por exemplo, podem utilizar-se anticorpos não marcados utilizando um segundo anticorpo que é marcado e que reconhece o anticorpo para a proteína de monócito ou para um seu fragmento em particular. Têm sido igualmente amplamente discutidos na literatura ensaios semelhantes. Consultar, e.g., Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual. CSH Press, NY; Chan (ed.) (1987) Immunoassay: A Practical Guide Academic Press, Orlando, FL; Price e Newman (ed.) (1991) Principies and Practice of Immunoassay Stockton Press, NY; e Ngo (ed.) (1988) Nonisotopic Immunoassay Plenum Press, NY. Nomeadamente, os reagentes podem ser úteis para diagnosticar populações de monócitos em amostras biológicas, para detectar um excesso ou deficiência de monócito numa amostra. 0 ensaio pode ser dirigido à análise histológica de uma biopsia ou à avaliação de números de monócitos em amostras de sangue ou de tecido.

Os anticorpos anti-idiotípicos podem ter utilização semelhante para diagnosticar a presença de anticorpos contra uma proteína de monócito dado que tal pode ser um diagnóstico de vários estados anómalos. Por exemplo, a superprodução da proteína de monócito pode resultar em várias reacções imunológicas que podem diagnosticar estados fisiológicos anómalos, nomeadamente em doenças de proliferação celular tais como cancro ou diferenciação anómala. 50 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Frequentemente, os reagentes para ensaios de diagnóstico são fornecidos em kits de modo a optimizar a sensibilidade do ensaio. Em relação ao invento em causa, dependendo da natureza do ensaio, proporcionam-se o protocolo e o marcador, anticorpo ou receptor marcado ou não marcado ou proteína de monócito marcada. Tal efectua-se habitualmente em conjunção com outros aditivos, tais como tampões, estabilizantes, materiais necessários para produção de sinal tal como substratos para enzimas e semelhantes. O kit conterá igualmente instruções para utilização e eliminação adequada dos conteúdos após utilização. Tipicamente o kit tem compartimentos para cada reagente útil. Idealmente, proporcionam-se os reagentes como um pó liofilizado seco em que os reagentes podem ser reconstituídos num meio aquoso proporcionando concentrações adequadas de reagentes para efectuar o ensaio.

Muitos dos constituintes anteriormente mencionados para rastreio de fármacos e para os ensaios de diagnóstico podem ser utilizados sem modificação ou podem ser modificados de várias formas. Por exemplo, pode obter-se marcação pela ligação covalente ou não covalente de uma parte que proporciona directa ou indirectamente um sinal detectável. Em muitos destes ensaios, a proteína, composto de ensaio, proteína de monócito ou anticorpos contra estes podem ser directa ou indirectamente marcados. As possibilidades de marcação directa incluem grupos de marcador: radiomarcadores tais como 125I, enzimas (patente U.S. 3 645 090) tal como peroxidase e fosfatase alcalina e marcadores fluorescentes (patente U.S. 3 940 475) capazes de monitorizar a alteração em intensidade de fluorescência, desvio de comprimento de onda ou polarização de fluorescência. As possibilidades de marcação indirecta incluem biotinilação de um constituinte seguido de ligação a avidina acoplada a um dos grupos marcadores anteriormente enumerados.

Existem igualmente vários métodos de separar proteína ligada de proteína livre ou alternativamente o composto de ensaio ligado do livre. A proteína de monócito pode ser imobilizada em diferentes matrizes seguido de lavagem. As matrizes adequadas incluem plástico tal como uma placa de ELISA, filtros e pérolas. Os métodos de imobilização de proteína de monócito a uma matriz incluem, entre outros, 51 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ adesão directa a plástico, utilização de um anticorpo de captura, acoplamento químico e biotina-avidina. A última etapa nesta abordagem envolve a precipitação de complexo proteína/anticorpo por um de vários métodos incluindo os que utilizam, e.g., um solvente orgânico tal como polietilenoglicol ou um sal tal como sulfato de amónio. Outras técnicas de separação adequadas incluem, entre outras, o método de partícula magnetizável de anticorpo fluoresceína descrito em Rattle, et al. (1984) Clin. Chem. 30:1457-1461 e a separação por partícula magnética e anticorpo duplo como descrito em patente U.S. 4 659 678.

Os métodos para ligar proteínas ou seus fragmentos aos diferentes marcadores têm sido amplamente reportados na literatura e não necessitam de uma discussão detalhada aqui. Muitas das técnicas envolvem a utilização de grupos carboxilo activados através da utilização de carbodiimida ou ésteres activos para formar ligações peptídicas, a formação de tioéteres por reacção de um grupo mercapto com um halogéneo activado tal como cloroacetilo ou uma olefina activada tal como maleimida para ligação ou semelhante. As proteínas de fusão encontrarão igualmente utilização nessas aplicações.

Outro aspecto de diagnóstico aqui revelado envolve a utilização de sequências de oligonucleótido ou polinucleótido retiradas da sequência de uma proteína de monócito respectiva. Podem utilizar-se essas sequências como sondas para detectar níveis da mensagem em amostras de doentes que se suspeita apresentarem uma condição anómala, e.g., cancro ou problema imunitário. A preparação de sequências de nucleótidos de ARN e de ADN, a marcação das sequências e o tamanho preferido das sequências têm sido objecto de ampla descrição e discussão na literatura. Normalmente uma sonda de oligonucleótido deve ter pelo menos cerca de 14 nucleótidos, habitualmente pelo menos cerca de 18 nucleótidos e as sondas de polinucleótidos podem ter até várias quilobases. Podem utilizar-se vários marcadores, mais habitualmente radionuclídeos, nomeadamente 32P. Contudo, podem também utilizar-se outras técnicas, tal como utilizando nucleótidos modificados com biotina para introdução num polinucleótido. A biotina serve então como um local para ligação a avidina ou anticorpos, que podem ser marcados com uma grande variedade de marcadores tais como 52 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ radionuclídeos, fluoróforos, enzimas ou semelhantes. Alternativamente, podem utilizar-se anticorpos que podem reconhecer cadeias duplas especificas incluindo cadeias duplas de ADN, cadeias duplas de ARN, cadeias duplas híbridas ADN-ARN ou cadeias duplas ADN-proteína. Por sua vez os anticorpos podem ser marcados e o ensaio pode ser efectuado no local em que a cadeia dupla está ligada a uma superfície, de modo que após formação da cadeia dupla à superfície se possa detectar a presença de anticorpo ligado à cadeia dupla. A utilização de sondas para o novo ARN anti-sentido pode ser efectuada por quaisquer técnicas convencionais tais como hibridação de ácido nucleico, rastreio mais e menos, sondagem de recombinação, tradução com libertação de híbrido (HRT) e tradução parada por híbrido (HART). Tal também inclui técnicas de amplificação tal como reacção de polimerização em cadeia (PCR).

Também se abrangem kits de diagnóstico que também ensaiam a presença qualitativa ou quantitativa de outros marcadores. 0 diagnóstico ou prognóstico pode depender da combinação de indicações múltiplas utilizadas com marcadores. Assim, os kits podem ensaiar combinações de marcadores. Consultar, e.g., Viallet, et al. (1989) Progress in Growth Factor Res. 1:89-97. XI. Isolamento de parceiro de ligação

Após isolamento de um membro de um parceiro de ligação de uma interacção específica, existem métodos para isolar o outro parceiro. Consultar, Gearing, et al. (1989) EMBO J. 8:3667-3676. Por exemplo, podem determinar-se meios para marcar uma proteína de superfície de monócito sem interferir com a ligação do seu receptor. Por exemplo, pode fundir-se um marcador de afinidade com o terminal amino ou carboxilo do ligando. Pode rastrear-se uma biblioteca de expressão para ligação específica à proteína de monócito, e.g., por separação de células ou outro rastreio para detectar subpopulações que expressam tal componente de ligação. Consultar, e.g., Ho, et al. (1993) Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 90:11267-11271. Alternativamente, pode utilizar-se um método de ciclos de selecção. Consultar, e.g., Seed e Aruffo (1987) Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 84:3365-3369. Pode também aplicar-se um sistema de selecção de dois híbridos produzindo construções adequadas 53 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ com as sequências de proteínas de monócitos disponíveis. Consultar, e.g., Fields e Song (1989) Nature 340:245-246.

As técnicas de reticulação de proteína com marcador podem ser aplicadas para isolar parceiros de ligação de uma proteína de monócito. Tal permitirá identificação de proteínas que interagem especificamente com a proteína de monócito apropriada. O âmbito abrangente deste invento é mais bem compreendido com referência aos exemplos seguintes, que não se pretende que limitem o invento a concretizações específicas.

EXEMPLOS I. Métodos gerais

Muitos dos métodos padrão referidos seguidamente encontram-se descritos ou referenciados, e.g., em Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning. A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY; Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed.) Vol. 1-3, CSH Press, NY; Ausubel, et al., Biology Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; ou Ausubel, et al. (1987 e Suplementos) Current Protocols in Molecular Biology

Wiley/Greene, NY; Innis, et al. (ed.) (1990) PCR Protocols: A Guide to Method and Applications Academic Press, NY.

Os métodos para purificação de proteínas incluem métodos tais como precipitação com sulfato de amónio, cromatografia em coluna, electroforese, centrifugação, cristalização e outros. Consultar, e.g., Ausubel, et al. (1987 e suplementos periódicos); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification" Methods in Enzymology vol. 182 e outros volumes nesta série; Coligan, et al. (1996 e suplementos periódicos) Current Protocols in Protein Science Wiley/Greene, NY; e literatura do fabricante na utilização de produtos de purificação de proteína, e.g., Pharmacia, Piscataway, NJ, ou Bio-Rad, Richmond, CA. A combinação com técnicas recombinantes permite fusão com segmentos adequados, e.g., com uma sequência FLAG ou uma equivalente que pode ser fundida através de uma sequência removível com protease. Consultar, e.g., Hochuli (1989) 54 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Chemische Industrie 12:69-70; Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" em Setlow (ed.) Genetic Engineering. Principie and Methods 12:87-98, Plenum Press, NY; e Crowe, et ai. (1992) OIAexpress: The High Levei Expression & Protein Purification System QUIAGEN, inc., Chatsworth, CA.

Descrevem-se técnicas imunológicas padrão, e.g., em Hertzenberg, et al. (ed. 1996) Weir's Handbook of Experimental immunology vol. 1-4, Blackwell Science; Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; e Methods in Enzymology volumes 70, 73, 74, 84, 92, 93, 108, 116, 121, 132, 150, 162 e 163. Consultar também, e.g., Paul (ed.) (1993)

Fundamental Immunology (3a ed.) Raven Press, N.Y.

Descreve-se análise FACS em Melamed, et al. (1990) Flow Cytometry and Sorting Wiley-Liss, Inc., New York, NY; Shapiro (1988) Practical Flow Cytometry Liss, New York, NY; e Robinson, et ai. (1993) Handbook of Flow Cytometry Methods Wiley-Liss, New York, NY. II. Isolamento de monócitos humanos

Sujeitaram-se dadores saudáveis a leucoforese. Utilizaram-se gradientes de Percoll para isolar células mononucleares que foram então sujeitas a elutriação em centrífuga. Consultar, Figdor, et al. (1982) Blood 60:46-53; e Pias, et al. (1988) ExptΊ. Hematol. 16:355-359. Esta fracção altamente enriquecida em monócitos foi cultivada durante 5-7 dias na presença de GM-CSF (800 U/ml) e IL-4 (500 U/ml), tal como descrito em Romani, et al. (1994) L Exp. Med. 180:83-93; e Sallusto, et al. (1994) J. Exp. Med. 179:1109-1118.

Para preparar células dendríticas, obtiveram-se células CD34+ humanas da seguinte forma. Consultar, e.g., Caux, et al. (1995) páginas 1-5 em Banchereau e Schmitt Dendritic Cells in Fundamental and Clinicai Immunology Plenum Press, NY. Cultivaram-se células de sangue periférico ou do cordão umbilical, por vezes seleccionadas com CD34+, na presença de factor de células estaminais (SCF), GM-CSF e TNF-a em meio RPMI 1640 isento de endotoxinas (GIBCO, Grand Island, NY) suplementado com soro bovino fetal inactivado por calor (FBS; 55 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Flow Laboratories, Irvine, CA) a 10% (v/v) , HEPES 10 mM, L- glutamina 2 mM, 2-mercaptoetanol 5 X 10”5 M, penicilina (100 mg/ml). Este é denominado meio completo.

Inocularam-se células CD34+ para expansão em frascos de 25 a 75 cm2 (Corning, NY) a 2 x 104 células/ml. Mantiveram-se condições óptimas por desdobramento destas culturas no dia 5 e no dia 10 com meio fresco contendo GM-CSF e TNF-a (concentração de células: 1-3 x 105 células/ml). Em determinados casos, as células foram separadas por FACS relativamente a expressão de CDla cerca do dia 6.

Em determinadas situações, as células foram recolhidas rotineiramente após 12 dias de cultura, eventualmente recuperaram-se células aderentes com uma solução de EDTA 5 mM. Noutras situações, as células CDla+ foram activadas por ressuspensão em meio completo a 5 x 106 células/ml e activadas durante um período de tempo adequado (e.g., 1 ou 6 h) com 12- miristato-13-acetato de forbol (PMA, Sigma) a 1 mg/ml e ionomicina (Calbiochem, La Jolla, CA) a 100 ng/ml. Estas células foram expandidas durante mais 6 dias e isolou-se ARN para preparação da biblioteca de ADN. III. Isolamento de ARN e construção de biblioteca

Isola-se ARN total utilizando, e.g., o procedimento de gradiente de tiocianato de guanidina/CsCl tal como descrito por Chirgwin, et al. (1978) Biochem. 18:5294-5299.

Alternativamente, isola-se ARN poli(A)+ utilizando o kit de isolamento de ARNm OLIGOTEX (QIAGEN). Gera-se ADNc em cadeia dupla utilizando, e.g., o sistema de plasmídeo SUPERSCRIPT (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) para síntese de ADNc e clonagem de plasmídeo. O ADNc em cadeia dupla resultante é clonado unidireccionalmente, e.g., para pSportl e transfectado por electroporação para células ELECTROMAX DH10BTM (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). IV. Sequenciação

Sujeitou-se ADN isolado de clones seleccionado aleatoriamente, ou após hibridação subtractiva utilizando células inactivadas, a análise de sequência de nucleótidos 56 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ utilizando técnicas padrão. Pode utilizar-se um kit de sequenciação de ciclo Taq DiDeoxy Terminator (Applied Biosystems, Foster City, CA) . Separam-se os fragmentos de ADN marcados utilizando um gel de sequenciação de ADN de um sequenciador automatizado adequado. Alternativamente, o clone isolado é sequenciado tal como descrito em, e.g., Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (2a ed.), vol. 1-3, CSH Press, NY; Ausubel, et al., Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; ou Ausubel, et al. (1987 e suplementos) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York. Encontram-se também disponíveis métodos de sequenciação químicos, e.g., utilizando as técnicas de sequenciação de Maxam e Gilbert. V. Isolamento de proteína humana de genes de monócito

Sequenciou-se o clone YE01 e analisaram-se os quadros de leitura aberta. 0 clone foi analisado adicionalmente para extensão da sequência de ácido nucleico até um quadro de leitura aberta completo ou praticamente completo.

Preparou-se ARNm a partir de populações celulares adequadas pelo kit FastTrack (Invitrogen) a partir do qual se gerou ADNc utilizando, e.g., sistema de plasmídeo SuperScript para síntese de ADNc de GIBCO-BRL (Gaithersburg, MD) essencialmente como descrito pelo fabricante. As modificações ao procedimento podem incluir a substituição dos adaptadores Sall proporcionados pelo kit por outros adaptadores de clonagem. 0 ADNc resultante destas células é utilizado para gerar bibliotecas, e.g., no plasmídeo PCDNA II (Invitrogen). 0 ADNc é clonado para o poliligante e é utilizado para transformar uma estirpe adequada, e.g., DH10B de E. coli. 0 plasmídeo é isolado e purificado, e.g., com o sistema Qiagen (Chatsworth, CA) que é utilizado para gerar sondas de ARN a partir de, e.g., promotor SP6.

Marcam-se as sondas de ARN, e.g., utilizando o sistema Genius (Boehringer-Mannheim) tal como descrito pelo fabricante. As transferências de filtro da biblioteca de ADNc podem ser pré-hibridadas, e.g., a 42 °C durante 3-6 horas em tampão Church (formamida a 50%, 6X SSPE, NaHP04 50 mM pH 7,2, 57 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ SDS a 7%, N-Laurilsarcosina a 0,1%, agente de bloqueio de Boehringer-Mannheim a 2%). Sondam-se os filtros, e.g., durante a noite no mesmo tampão contendo as sondas adequadas. Lavam-se os filtros, e.g., tal como descrito pelo sistema Genius. Seleccionam-se as colónias que hibridam.

Sequencia-se o ADNc completo de proteínas de monócitos humanos, e.g., pelo método de terminação de cadeia de didesoxinucleótidos com polimerase de T7 (U.S. Biochemicals, Cleveland, OH) utilizando ADN em cadeia dupla como molde. Efectua-se busca de base de dados e análise de sequências utilizando programas IntelliGenetics (Mountain View, CA) para determinar se existe homologia entre os clones reportados anteriormente.

As SEQ ID NO:1-4 revelam sequências relativas ao gene FDF03 humano e as sequências correspondentes de ratinho. De igual modo, as SEQ ID NO:5-10 apresentam sequências relativas a produtos do gene YE01 humano, incluindo uma variante de splicing e um produto de transcrição que codifica um produto solúvel. As SEQ ID NO:11-22 proporcionam sequências de concretizações dos produtos do gene KTE03 e apresentam evidências de variantes de splicing. VI. Construções de gene de monócito recombinante

Isola-se ARN poli(A)+ de populações celulares adequadas, e.g., utilizando o kit de ARNm FastTrack (Invitrogen, San Diego, CA). Sujeitam-se as amostras de electroforese, e.g., num gel de agarose a 1% contendo formaldeído e transferem-se para uma membrana GeneScreen (NEN Research Products, Boston, MA) . Efectua-se hibridação, e.g., a 65 °C em NaHP04 0,5 M pH 7,2, SDS a 7%, EDTA 1 mM e BSA a 1% (fracção V) com ADNc de gene de monócito marcado com 32P-dCTP a 107 cpm/ml. Após hibridação, lavam-se os filtros três vezes a 50 °C em 0,2X SSC, SDS a 0,1% e expõe-se a película durante 24 h. A construção de gene recombinante pode ser utilizada para gerar sondas para detectar a mensagem. A inserção pode ser excisada e utilizada nos métodos de detecção descritos anteriormente. 58 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ VII. Expressão de proteína de gene de monócito em E. coli.

Utiliza-se PCR para preparar uma construção incluindo o quadro de leitura aberta, de preferência em associação operacional com as sequências de promotor, selecção e de regulação adequadas. 0 plasmídeo de expressão resultante é transformado para uma estirpe de E. coli adequada, e.g., Topp5 (Stratagene, La Jolla, CA) . Cultivam-se os produtos de transformação resistentes a ampicilina (50 pg/ml) em meio Luria (Gibco) a 37 °C até uma densidade óptica a 550 nm de 0,7. Induz-se a proteína recombinante com isopropil-bD-tiogalacto-piranósido (Sigma, St. Louis, MO) 0,4 mM e continua-se a incubação das células a 20 °C durante 18 horas adicionais. Recolhem-se por centrifugação as células de 1 litro de cultura e ressuspendem-se, e.g., em 200 ml de solução de sacarose a 30%, Tris HC1 50 mM, pH 8,0, ácido etilenodiaminotetra-acético 1 mM gelado. Após 10 min em gelo, adiciona-se água gelada até um volume total de 2 litros. Após 20 min em gelo, removem-se as células por centrifugação e clarifica-se o sobrenadante por filtração através de

Millipak 60 de 5 μΜ (Millipore Corp., Bedford, MA). A proteína recombinante é purificada através de métodos de purificação padrão, e.g., vários métodos de cromatografia iónica. Podem também utilizar-se os métodos de imunoafinidade utilizando anticorpos descritos seguidamente. Podem ser utilizados métodos de afinidade em que se concebe racionalmente um marcador de epítopo para uma construção de expressão. VIII. Mapeamento de genes de monócito humano

Efectua-se isolamento de ADN, digestão com enzima de restrição, electroforese em gel de agarose, transferência de hibridação de "Southern" e hibridação de acordo com técnicas padrão. Consultar Jenkins, et al. (1982) J. Virol, 43:26-36. Podem preparar-se transferências com membrana de nylon Hybond-N (Amersham). Marca-se a sonda com 32P-dCTP; a lavagem é efectuada até um grau de rigor final, e.g., 0,1X SSC, SDS a 0,1%, 65 °C. 59 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Alternativamente, pode combinar-se um painel híbrido de células somáticas de ratinho de BIOS Laboratories (New Haven, CT) com métodos de PCR. IX. Análise de variação individual

Selecciona-se um tipo celular abundante e facilmente acessível para amostragem de indivíduos a partir dos dados de distribuição. Utilizando técnicas de PCR, analisa-se uma grande população de indivíduos relativamente a este gene. Utilizam-se ADNc ou outros métodos de PCR para a sequência do gene correspondente nos diferentes indivíduos e comparam-se as suas sequências. Tal indica tanto a extensão de divergência entre populações de diferentes raças ou outras, como determina quais os resíduos que provavelmente serão modificáveis sem efeitos drásticos na função. X. Preparação de anticorpos

Gera-se proteína recombinante de monócitos por expressão em E. coli tal como apresentado anteriormente e ensaia-se para actividade biológica. Podem utilizar-se proteínas activas ou desnaturadas para imunização de mamíferos adequados quer para produção de soros policlonais, quer para produção de anticorpo monoclonal. Seleccionam-se anticorpos para utilização em transferências de "Western", contra antigénio nativo ou desnaturado e para os que modulam uma actividade biológica. XI. Isolamento de genes correspondentes de monócitos de primatas

Utilizam-se como sondas clones de ADNc humano que codificam esses genes ou para conceber iniciadores de PCR para encontrar genes correspondentes em várias espécies de primatas, e.g., chimpanzés. XII. Utilização de reagentes para analisar populações celulares A detecção do nível de células monócitos presente numa amostra é importante para o diagnóstico de determinadas condições de doença aberrantes. Por exemplo, um aumento do número de monócitos num tecido ou no sistema linfático pode 60 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ ser indicativo da presença de uma hiperplasia dos monócitos, rejeição de tecido ou enxerto ou inflamação. Uma população de monócitos baixa pode indicar uma reacção anómala a, e.g., uma infecção bacteriana ou virai, que pode necessitar de um tratamento adequado para normalizar a resposta de monócitos.

Utiliza-se análise FACS utilizando um agente de ligação marcado especifico para uma proteína de monócito de superfície celular, consultar, e.g., Melamed, et al. (1990) Flow Cytometry and Sorting Wiley-Liss, Inc., New York, NY; Shapiro (1988) Practical Flow Cytometry Liss, New York, NY; e Robinson, et al. (1993) Handbook of Flow Cytometry Methods Wiley-Liss, New York, NY, na determinação do número monócitos presentes numa mistura celular, e.g., PBMC, células aderentes, etc. O agente de ligação é também utilizado para análise histológica de amostras de tecidos, quer frescos, quer fixados, para analisar a infiltração de monócitos. Podem avaliar-se também várias populações celulares, quer num ensaio destrutivo de células, quer em determinados ensaios em que as células mantêm a viabilidade. A análise da presença de moléculas intracelulares solúveis é efectuada, e.g., com um agente de ligação fluorescente específico para um monócito, tal como descrito em Openshaw, et al. (1995) J. Exp. Med. 182:1357-1367. Alternativamente, podem utilizar-se métodos de fixação de tecidos ou células.

Quantificam-se os níveis de produtos de transcrição de monócitos, e.g., utilizando PCR semiquantitativo tal como descrito em Murphy, et al. (1993) J. Immunol. Methods 162:211-223. Concebem-se iniciadores de modo que não se detecte o ADN genómico.

Foi também avaliada a distribuição de concretizações YE01. A mensagem parece ser específica de monócito e é uma mensagem de baixa abundância. É detectável em transferências de “Southern" de ADNc em monócitos em repouso e em monócitos activados. Verificou-se a sua expressão mais elevada em monócitos estimulados com LPS durante 6 horas. Também é detectável em PBMC activado com anti-CD3 e PMA. Pode ser fracamente detectável em células dendríticas, mas também pode ser devido a contaminação da população de células dendríticas 61 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ com monócitos residuais. A esse nível de sensibilidade, não é detectável em células NK, células B ou T ou quaisquer das células fetais analisadas. No entanto, o produto qénico de YE01 é reconhecido especificamente por um anticorpo monoclonal DX26. Este anticorpo, quando reticulado, pode inibir a morte de determinados alvos mediada por células NK. 0 anticorpo reconhece proteína expressa em células T, células B, células NK e monócitos. 0 qene que codifica o antiqénio reconhecido por DX26, que é aparentemente uma variante polimórfica do isolado YE01, foi clonado. XIII. Isolamento de um parceiro de ligação

Pode utilizar-se uma proteína de monócito como um reagente de ligação específica, tirando partido da sua especificidade de ligação, de uma forma semelhante à da utilização de um anticorpo. Um reagente de ligação deve ser marcado tal como descrito anteriormente, e.g., por fluorescência ou de outro modo, ou imobilizado a um substrato para métodos de ciclos de selecção. A proteína de monócito é utilizada para rastrear em busca de uma linha celular que apresente ligação. Utilizam-se técnicas de coloração padrão para detectar ou separar ligando intracelular ou expresso à superfície, ou rastreiam-se células transformadas que expressam à superfície através de ciclos de selecção. 0 rastreio de expressão intracelular efectua-se por vários procedimentos de coloração ou imunofluorescência. Consultar também McMahan, et al. (1991) EMBO I. 10:2821-2832.

Por exemplo, no dia 0, efectua-se um pré-revestimento de lâminas permanox de 2 câmaras com 1 ml por câmara de fibronectina a 10 ng/ml em PBS, durante 30 min à temperatura ambiente. Lava-se uma vez com PBS. Seguidamente plaqueiam-se células COS a 2-3 x 105 células por câmara em 1,5 ml de meio de cultura. Incuba-se durante a noite a 37°C.

No dia 1, para cada amostra, prepara-se 0,5 ml de uma solução de DEAE-dextrano a 66 mg/ml, cloroquina 66 mM e 4 mg de ADN em DME isento de soro. Para cada conjunto prepara-se um controlo positivo, e.g., de ADNc de receptor FLAG humano a uma diluição de 1 e 1/200 e um simulado negativo. Lavam-se as 62 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ células com DME isento de soro. Adiciona-se a solução de ADN e incuba-se durante 5 h a 37°C. Remove-se o meio e adiciona-se 0,5 ml de DMSO a 10% em DME durante 2,5 min. Remove-se e lava-se uma vez com DME. Adiciona-se 1,5 ml de meio de cultura e incuba-se durante a noite.

No dia 2, muda-se o meio. Nos dias 3 ou 4, fixam-se e coram-se as células. Lavam-se as células duas vezes com solução salina tamponada de Hank (HBSS) e fixam-se em paraformaldeido (PFA) a 4% (PFA)/glicose durante 5 min.

Lavam-se 3X com HBSS. As lâminas podem ser armazenadas a -80°C após remoção de todo o líquido. Para cada câmara, efectuam-se incubações de 0,5 ml da seguinte forma. Adiciona-se HBSS/saponina (0,1%) com 32 ml/ml de NaN3 1 M durante 20 min. Lavam-se então as células com HBSS/saponina IX. Adiciona-se proteína ou complexo proteína/anticorpo às células e incubam-se durante 30 min. Lavam-se as células duas vezes com HBSS/saponina. Quando adequado, adiciona-se primeiramente anticorpo durante 30 min. Adiciona-se o segundo anticorpo, e.g., anticorpo anti-ratinho Vector, a uma diluição 1/200 e incuba-se durante 30 min. Prepara-se solução de ELISA, e.g., solução de peroxidase de rábano Vector Elite ABC e pré-incuba-se durante 30 min. Utiliza-se, e.g., 1 gota de solução A (avidina) e 1 gota de solução B (biotina) por 2,5 ml de HBSS/saponina. Lavam-se as células duas vezes com HBSS/saponina. Adiciona-se solução ABC HRP e incuba-se durante 30 min. Lavam-se as células duas vezes com HBSS, em que a segunda lavagem é durante 2 min, o que fecha as células. Adiciona-se então ácido diaminobenzóico (DAB) Vector durante 5 a 10 min. Utilizam-se 2 gotas de tampão mais 4 gotas de DAB mais 2 gotas de Η202 por 5 ml de água destilada em vidro. Remove-se cuidadosamente a câmara e lava-se a lâmina em água. Seca-se ao ar durante alguns minutos, seguidamente adiciona-se 1 gota de Crystal Mount e uma lamela. Cura-se durante 5 min a 85-90 °C.

Alternativamente, utilizam-se outros reagentes de ligação específica a proteína de monócito para purificar por afinidade ou separar células que expressam um receptor. Consultar, e.g., Sambrook, et al. ou Ausubel, et al. 63 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Outra estratégia consiste em rastrear um receptor ligado a membrana por ciclos de selecção. 0 receptor de ADNc é construído como descrito anteriormente. 0 ligando pode ser imobilizado e utilizado para imobilizar células que expressam. A imobilização pode ser conseguida utilizando anticorpos adequados que reconhecem, e.g., uma sequência FLAG de uma construção de fusão de proteína de monócito ou pela utilização de anticorpos criados contra os primeiros anticorpos. A utilização de ciclos de selecção e amplificação repetidos leva a um enriquecimento de clones adequados e eventual isolamento de clones que expressam ligando.

Podem rastrear-se bibliotecas de expressão de fagos para proteína de monócito. As técnicas de marcação adequadas, e.g., anticorpos anti-FLAG, permitirão marcação específica dos clones adequados. XIV. Isolamento de uma YE01 solúvel

Clonou-se um membro adicional da família YE01 previamente descrita, também denominada receptor do tipo imunoglobulina associado a leucócitos DNAX (DLAIR; e actualmente denominado DLAIR-1) por rastreio de uma biblioteca de ADNc de linha de tumor de células T humanas (TcT). Hibridaram-se transferências de membranas de colónias bacterianas com uma sonda DLAIR-1 compreendendo um fragmento de digestão Bglll-Sphl, abrangendo a ansa Ig do domínio extracelular. Isolaram-se e sequenciaram-se dois positivos. A análise de sequência revelou que ambos os clones continham quadros de leitura aberta idênticos de 414 pares de bases, que codificam uma proteína de 135 aminoácidos com uma sequência líder prevista de 21 aminoácidos e um peso molecular previsto de 14,7 kDa. Esta molécula, actualmente denominada DLAIR-2, contém uma ansa Ig. A ansa Ig tem 84% de homologia com DLAIR-1, o que indica que pertence à mesma família, mas é codificada por um gene independente. DLAIR-2 não contém uma região transmembranar, o que sugere que é uma proteína excretada.

Pode utilizar-se DLAIR-2, sendo uma molécula solúvel semelhante a DLAIR-1, como um antagonista para este receptor de inibição. 64 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ XV. Preparação de anticorpo monoclonal DX26

Imunizaram-se ratinhos com clone de células NK humanas e rastrearam-se anticorpos relativamente à sua capacidade de inibir lise mediada por células NK de alvos contendo FcR. Alternativamente, desenvolver-se-ão anticorpos para a proteína purificada.

XVI. A reticulação de DLAIR-1 com anticorpo monoclonal inibe morte mediada por células NK 0 anticorpo monoclonal DX26 não inibiu a morte por clone NK da linha de células B transformada com EBV negativa a HLA 721.221. No entanto, quando se transfectou 721.221 com FcgR-II humano (CD32) e utilizado como um alvo, a citólise mediada por células NK foi inibida pelo anticorpo monoclonal DX26. Tal indica que a sinalização através da molécula reconhecida pelo anticorpo monoclonal DX26 (denominado receptor do tipo imunoglobulina associado a leucócito DNAX (DLAIR)), proporciona um sinal negativo para clones de células NK que evita que estas matem as suas células alvo específicas. Em concordância com tal, a citotoxicidade mediada por células NK contra Colo-205, PA-1 ou FO-1, todas elas uma linha celular humana negativa para FcR, não foi inibida pela adição de anticorpo monoclonal DX26. Além disso, a lise de células P815, uma linha celular de mastocitoma de ratinho que expressa FcR, que é morta in vitro por clones de células NK humanas por reticulação simultânea de CD2, CD16, CD69 ou antigénio DNAM-1, também foi inibida por anticorpo monoclonal DX26. Estes resultados levam à conclusão que DLAIR entrega um forte sinal de inibição às células NK, dado que o sinal positivo proporcionado por indutores potentes de citotoxicidade de células NK é anulado pelo anticorpo monoclonal DX26. XVII. DLAIR-1 é um receptor de inibição de células NK em repouso

Os clones de células NK consistem de populações derivadas por clonagem de células NK activadas. Estas células são fortemente inibidas por sinalização DLAIR. Estudamos se DLAIR também funciona como um receptor de inibição nas células NK que não tinham sido previamente activadas. As células NK em 65 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ repouso, preparadas a partir de esgotamento negativo de sangue periférico utilizando pérolas magnéticas, foram capazes de lisar células alvo P815 quando activadas simultaneamente através de CD16. Esta citotoxicidade mediada por células NK foi inibida pela adição de anticorpo monoclonal DX26. Assim, DLAIR é funcional como um receptor de inibição em células NK tanto activadas como em repouso. XVIII. DLAIR é um antigénio largamente expresso A análise fenotípica de linfócitos de sangue humano demonstrou que DLAIR é uma molécula largamente distribuída. Em PBMC de dadores saudáveis, as células T CD3+CD4+ (70-80%), as células T CD3+CD8+ (80-90%), as células NK CD3-CD56+ (95— 100%), as células B CD3-CD19+ (80-90%) e os monócitos CD3- CD14+ (99-100%) expressaram todas a molécula DLAIR. Os timócitos fetais humanos, tanto células CD4+CD8+ imaturas, como CD4+CD8- maduras ou células unicamente positivas CD4-CD8+ também expressaram DLAIR. Os granulócitos, as plaquetas e os eritrócitos de sangue periférico não expressaram DLAIR.

Os clones de células NK humanas e os clones de células T expressaram todos DLAIR, com a excepção dos clones de NK NKL e NK92 cultivados a longo prazo (consultar a tabela 2). As linhas de células B transformadas com EBV, as células B de tumor Daudi e a linha YT de células de tumor de NK e várias linhas celulares não hematopoiéticas não expressaram DLAIR, enquanto as linhas de células T humanas apresentaram expressão de DLAIR. 66 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Tabela 2: Expressão de DLAIR em linhas de tumor humano1 linha celular tipo IgGl de controlo mAb DX26 (intensidade de fluorescência média) HUT7 8 tumor de células T <5 25, 8 Peer tumor de células T <5 29,1 Molt4 tumor de células T <5 30, 7 CEM tumor de células T <5 92, 7 Jurkat tumor de células T <5 47, 1 HL6 0 tumor pró-mielóide <5 46,9 U937 tumor mielóide <5 49,5 721.221 Células B EBV- <5 <5 JY Células B EBV- <5 <5 Daudi tumor de células B <5 <5 YT tumor de células NK <5 <5 NKL clones de células NK <5 <5 NK92 clones de células NK <5 <5 Colo205 carcinoma do cólon <5 <5 293T rim embrionário <5 <5 PA-1 teratocarcinoma <5 <5 FO-1 Melanoma <5 <5 1Coraram-se ãs células com IgGl de controlo õu anticorpo monoclonal DX26 ê IgG de cabra anti-ratinho conjugado com PE como a segunda etapa. As células foram analisadas num FACScan. XIX. Clonagem de expressão do antigénio DX26 0 anticorpo DX26 foi utilizado para clonagem de expressão do antigénio reconhecido pelo anticorpo. A clonagem de expressão foi efectuada utilizando métodos padrão. Consultar, e.g., Sambrook, et ai. ou Coligan, et al. 0 antigénio DX26 é clonado por expressão, e.g., a partir de uma biblioteca de ADNc de células NK activadas humanas policlonais num vector de expressão pJFE14. Transfectaram-se células C0S7 com a biblioteca e seleccionaram-se células positivas para o antigénio, utilizando ficoeritrina marcada 67 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ com anticorpo monoclonal anti-DX26. Determinou-se a sequência de ADNc e verificou-se que correspondia muito à sequência de YE01. O anticorpo DX26 liga-se especificamente ao produto do produto génico de YE01.

Noutro método, utilizam-se os oligonucleótidos para rastrear uma biblioteca. Utilizam-se oligonucleótidos sintéticos em orientações adequadas como iniciadores para seleccionar clones correctos de uma biblioteca, em combinação com técnicas de reacção de polimerização em cadeia (PCR).

Além disso, o produto génico de YE01 é especificamente reconhecido por um anticorpo monoclonal DX26. Este anticorpo, quando reticulado, pode inibir a morte de determinados alvos mediada por células NK. 0 anticorpo reconhece proteína expressa em células T, células B, células NK e monócitos. 0 gene que codifica o antigénio reconhecido por DX26, que é aparentemente uma variante polimórfica do isolado YE01, foi clonado e tem essencialmente a sequência (consultar SEQ ID NO: 7) . Este isolado tem uma sequência não traduzida a 3' diferente do produto de transcrição YE01 original, aparentemente devido à utilização de um local de poliadenilação alternativo. Foi também detectada uma forma solúvel de DLAIR (consultar SEQ ID N0:9). A análise de distribuição do isolado DX26 determinou, por análise de transferência de “Northern", a seguinte distribuição. A sondagem de ARNm humano de clones de células NK humanas com ADNc de DLAIR, PBMC, a linha Jurkat de células T humanas e a linha Jurkat de células mielóides humanas resulta em duas bandas de aproximadamente 1800 pb e 3000-4000 pb. Tal indica que além do ADNc clonado, existe outro produto de transcrição com similaridade de sequência com DLAIR nestas linhas celulares. Actualmente não se sabe se estes contêm o mesmo quadro de leitura aberta, mas será determinado por clonagem e análise de sequência desse produto de transcrição. A linha JY de células B humanas transformada com EBV não apresentou produtos de transcrição que sondaram positivamente com ADNc de DLAIR. XX. DLAIR liga-se a SHY-1 e SHP-2 68 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ A existência de duas sequências consensuais para ITIM dentro do domínio citoplasmático de DLAIR-1, sugeriu que a geração de um sinal de inibição em células NK foi manifestada pela recruta de SHP-1 e/ou SHP-2. Para determinar se DLAIR-1 foi capaz de se ligar a proteínas tirosina fosfatases, estimulou-se um clone de células NK com pervanadato (um inibidor de proteínas tirosina fosfatases que induz fosforilação de tirosina (0'Shea, et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10306-10310), lisou-se e imunoprecipitou-se com anticorpo monoclonal DX26. Analisaram-se então os imunoprecipitados por transferência "Western" utilizando anticorpos específicos para SHP-1 e SHP-2. Tanto SHP-1, como SHP-2 associaram-se a DLAIR-1 com tirosina fosforilada. Estes resultados sugerem que a recruta de SHP-1 e SHP-2 pode estar envolvida na mediação do sinal negativo transduzido através de envolvimento da molécula DLAIR-1. 69 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

SUBMISSÃO DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (1) REQUERENTE: (A) NOME: Schering Corp. (B) RUA: 2000 Galloping Hill Road (C) CIDADE: Kenilworth (D) ESTADO: New Jersey

(E) PAÍS: USA (F) CÓDIGO POSTAL: 07033 (ii) TÍTULO DO INVENTO: Genes Celulares de Monócitos de Mamífero

Isolados; Reagentes Relacionados (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 22 (v) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete (B) COMPUTADOR: Apple Macintosh (C) SISTEMA OPERATIVO: Macintosh 7.1 (D) SOFTWARE: Microsoft Word 5.1a (v) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (vi) DADOS DE PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 60/032,252 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 06-DEC-1996 (vi) DADOS DE PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 08/762,187 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 09-DEC-1996 (vi) DADOS DE PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 60/033,181 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 16-DEC-1996 (vi) DADOS DE PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 60/041,279 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 21-MAR-1997 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1249 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 154..1062 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: mat_peptide (B) LOCALIZAÇÃO: 211..1062 70 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1: GTTTGGGGAA GGCTCCTGGC CCCCACAGCC CTCTTCGGAG CCTGAGCCCG GCTCTCCTCA 60 CTCACCTCAA CCCCCAGGCG GCCCCTCCAC AGGGCCCCTC TCCTGCCTGG ACGGCTCTGC 120 TGGTCTCCCC GTCCCCTGGA GAAGAACAAG GCC ATG GGT CGG CCC CTG CTG CTG 174

Met Gly Arg Fro Leu Leu Leu -19 -15 CCC CTA CTG CCC CTG CTG CTG CCG CCA GCA TTT CTG CAG CCT AGT GGC 222 Pro Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Pro Ala Phe Leu Gin Pro Ser Gly -10 -5 1 TCC ACA GGA TCT GGT CCA AGC TAC CTT TAT GGG GTC ACT CAA CCA AAA 270 Ser Thr Gly Ser Gly Pro Ser Tyr Leu Tyr Gly Vai Thr Gin Pro Lys 5 10 15 20 CAC CTC TCA GCC TCC ATG GGT GGC TCT GTG GAA ATC CCC TTC TCC TTC 318 HiS Leu Ser Ala Ser Met Gly Gly Ser Vai Glu Ile Pro Phe Ser Phe 25 30 35 TAT TAC CCC TGG GAG TTA GCC ACA GCT CCC GAC GTG AGA ATA TCC TGG 366 Tyr Tyr Pro Trp Glu Leu Ala Thr Ala Pro Asp Vai Arg Ile Ser Trp 40 45 50 AGA CGG GGC CAC TTC CAC GGG CAG TCC TTC TAC AGC ACA AGG CCG CCT 414 Arg Arg Gly His Phe His Gly Gin Ser Phe Tyr Ser Thr Arg Pro Pro 55 60 65 TCC ATT CAC AAG GAT TAT GTG AAC CGG CTC TTT CTG AAC TGG ACA GAG 462 Ser Ile HiS Lys Asp Tyr Vai Asn Arg Leu Phe Leu Asn Trp Thr Glu 70 75 80 GGT CAG AAG AGC GGC TTC CTC AGG ATC TCC AAC CTG CAG AAG CAG GAC 510 Gly Gin Lys Ser Gly Phe Leu Arg Ile Ser Asn Leu Gin Lys Gin Asp B5 90 9S 100 CAG TCT GTG TAT TTC TGC CGA GTT GAG CTG GAC ACA CGG AGC TCA GGG 558 Gin Ser Vai Tyr Phe Cys Arg Vai Glu Leu Asp Thr Arg Ser Ser Gly 105 110 115 AGG CAG CAG TGG CAG TCC ATC GAG GGG ACC AAA CTC TCC ATC ACC CAG 606 Arg Gin Gin Trp Gin ser Ile Glu Gly Thr Lys Leu Ser Ile Thr Gin 120 125 130 GCT GTC ACG ACC ACC ACC CAG AGG CCC AGC AGC ATG ACT ACC ACC TGG 654 Ala Vai Thr Thr Thr Thr Gin Arg Pro Ser Ser Met Thr Thr Thr Trp 135 140 145 AGG CTC AGT AGC ACA ACC ACC ACA ACC GGC CTC AGG GTC ACA CAG GGC 702 Arg Leu Ser Ser Thr Thr Thr Thr Thr Gly Leu Arg Vai Thr Gin Gly 150 155 160 AAA CGA CGC TCA GAC TCT TGG CAC ATA AGT CTG GAG ACT GCT GTG GGG 750 71 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Lys Arg Arg Ser Asp Ser Trp His Xle Ser Leu Glu Thr Ala Vai Gly 165 170 175 180 GTG GCA GTG GCT CTC ACT GTG CTC GGA ATC ATG ATT TTG GGA CTG ATC 798 Vai Ala Vai Ala Vai Thr Vai Leu Gly Xle Met Xle Leu Gly Leu Xle 185 190 195 TGC CTC CTC AGG TGG AGG AGA AGG AAA GGT CAG CAG CGG ACT AAA GCC 846 Cys Leu Leu Arg Trp Arg Arg Arg Lys Gly Gin Gin Arg Thr Lys Ala 200 205 210 ACA ACC CCA GCC AGG GAA CCC TTC CAA AAC ACA GAG GAG CCA TAT GAG 894 Thr Thr Pro Ala Arg Glu Pro Phe Gin Asn Thr Glu Glu Pro Tyr Glu 215 220 225 AAT ATC AGG AAT GAA GGA CAA AAT ACA GAT CCC AAG CTA AAT CCC AAG 942 Asn Xle Arg Asn Glu Gly Gin Asn Thr Asp Pro Lys Leu Asn Pro Lys 230 235 240 GAT GAC GGC ATC GTA TAT GCT TCC CTT GCC CTC TCC AGC TCC ACC TCA 990 Asp Asp Gly Ile Vai Tyr Ala Ser Leu Ala Leu Ser Ser Ser Thr Ser 245 250 255 260 CCC AGA GCA CCT CCC AGC CAC CGT CCC CTC AAG AGC CCC CAG AAC GAG 1038 Pro Arg Ala Pro Pro Ser His Arg Pro Leu Lys Ser Pro Gin Asn Glu 265 270 275 ACC CTG TAC TCT GTC TTA AAG GCC TAACCAATGG ACAGCCCTCT CAAGACTGAA 1092 Thr Leu Tyr Ser Vai Leu Lys Ala 280 TGGTGAGGCC AGGTACAGTG GCGCACACCT GTAATCCCAG CTACTCTGAA GCCTGAGGCA 1152 GAATCAAGTG AGCCCAGGAG TTCAGGGCCA GCTTTGATAA TGGAGCGAGA TGCCATCTCT 1212 AGTTAAAAAT ATATATTAAC AATAAAGTAA CAAATTT 1249 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 303 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGIA: linear (D) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

Met Gly Arg Pro Leu Leu Leu Pro Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Pro -19 -15 -10 -5

Ala Phe Leu Gin Pro Ser Gly Ser Thr Gly Ser Gly Pro Ser Tyr Leu 15 10

Tyr Gly Vai Thr Gin Pro Lys His Leu Ser Ala Ser Met Gly Gly Ser 15 20 25

Vai Glu Xle Pro Phe Ser Phe Tyr Tyr Pro Trp Glu Leu Ala Thr Ala 72 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ 30 35 40 45

Pro Asp Val Arg Ile Ser Trp Aig Arg GIy His Phe His Gly Gin Ser 50 55 60

Phe Tyr Ser Thr Arg Pro Pro Ser i:i His Lys Asp Tyr Val Asn Arg 65 o 75

Leu Phe Leu Asn Trp Thr Glu Gly .ln Lys Ser Gly Phe Leu Arg Ile 80 85 90

Ser Asn Leu Gin Lys Gin Asp Gl· Ser Val Tyr Phe Cys Arg Val Glu 95 100 105

Leu Asp Thr Arg Ser Ser Gly l· .-g Gin Gin Trp Gin Ser Ile Glu Gly 110 115 120 125

Thr Lys Leu Ser Ile Thr Gin Ala Val Thr Thr Thr Thr Gin Arg Pro 130 135 140

Ser Ser Met Thr Thr Thr Τ' p Arg Leu Ser Ser Thr Thr Thr Thr Thr 145 150 155

Gly Leu Arg Val Thr Gin ,ly Lys Arg Arg Ser Asp Ser Trp His Ile 160 165 170

Ser Leu Glu Thr Ala Va Gly Val Ala Val Ala Val Thr Val Leu Gly 175 180 185 •Ile Met Ile Leu Gly I au Ile Cys Leu Leu Arg Trp Arg Arg Arg Lys 190 .95 200 205

Gly Gin Gin Arg Th: L/s Ala Thr Thr Pro Ala Arg Glu Pro Phe Gin 21 215 220

Asn Thr Glu Glu P o Tyr Glu Asn Ile Arg Asn Glu Gly Gin Asn Thr 225 230 ' 23S

Asp Pro Lys Leu *sn Pro Lys Asp Asp Gly Ile Val Tyr Ala Ser Leu 240 245 250

Ala Leu Ser S< Ser Thr Ser Pro Arg Ala Pro Pro Ser His Arg Pro 255 260 265

Leu Lys Ser ro Gin Asn Glu Thr Leu Tyr Ser Val Leu Lys Ala 270 275 280 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 376 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 78..374 73 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3: CCCCAGTGTC CCTAGACAGA GCATCCTTGC CTTCCTGATG GCTTTGCTGA TCTCGCTTCC 60 CTGGAGGGAC TCCAGCC ATG GCT CAG GTC CTG CTT CTG CTC TCA TCA GGC 110

Het Ala Gin Vai Leu Leu Leu Leu Ser Ser Gly 15 10 TGT CTG CAT GCT GGA AAT TCA GAA AGA TAC AAC AGA AAA AAT GGC TTT 158 Cys Leu His Ala Gly Asn Ser Glu Arg Tyr Asn Arg Lys Asn Gly Phe 15 20 25 GGG GTC AAC CAA CCT GAA CGC TGC TCT GGA GTC CAG GGT GGC TCC ATC 206 Gly Vai Asn Gin Pro Glu Arg Cys Ser Gly Vai Gin Gly Gly Ser Xle 30 35 40 GAC ATC CCC TTC TCC TTC TAT TTC CCC TGG AAG TTG GCC AAG GAT CCA 254 Asp Xle Pro Phe Ser Phe Tyr Phe Pro Trp Lys Leu Ala Lys Asp Pro 45 50 55 CAG ATG AGC ATA GCC TGG AAA TGG AAG GAT TTC CAT GGG GAA GTC ATC 302 Gin Met Ser Xle Ala Trp Lys Trp Lys Asp Phe His Gly Glu Vai Xle 60 65 70 75 TAC AAC TCC TCC CTG CCT TTC ATA CAT GAG CAC TTC AAG GGC CGG CTC 350 Tyr Asn Ser Ser Leu Pro Phe Xle His Glu His Phe Lys Gly Arg Leu 80 85 90 ATC CTG AAC TGG ACA CAG GGT CAG AC 376 He Leu Asn Trp Thr Gin Gly Gin 95 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 99 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4:

Met Ala Gin Vai Leu Leu Leu Leu Ser Ser Gly Cys Leu His Ala Gly 1 5 10 15 Asn Ser Glu Arg Tyr Asn Arg Lys Asn Gly Phe Gly Vai Asn Gin Pro 20 2S 30 Glu Arg Cys Ser Gly Vai Gin Gly Gly Ser Xle Asp Ile Pro Phe Ser 35 40 45 Phe Tyr Phe Pro Trp Lys Leu Ala Lys Asp Pw Gin Met Ser Xle Ala 50 SS 60 74 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Trp Lys Trp Lys Asp Phe His Gly Glu Vai Ile Tyr Asn Ser Ser Leu 65 70 75 80

Pro Phe Ile His Glu His Phe Lys Gly Arg Leu Ile Leu Asn Trp Thr 85 90 95

Gin Gly Gin (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1279 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 155..1015 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1247

(D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note= Y no nucleótido 1247 pode ser C ou T (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: mat_peptide (B) LOCALIZAÇÃO: 218..1015 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5: ACCGGTCCGG AATTCCCGGG TCGACCCAC6 CGTCCGGGAA GCCCCATAGG CAGGAGGCCC 60 CCGGGCAGCA CATCCTGTCT GCTTGTGTCT GCTGCAGAGT TCTGTCCTTG CATTGGTGCG 120 CCTCAGGCCA GGCTGCACTG CTGGGACCTG GGCC ATG TCT CCC CAC CCC ACC 172

Met Ser Pro His Pro Thr -21 -20 GCC CTC CTC GGC CTA GTG CTC TGC CTC GCC CAG ACC ATC CAC ACG CAG 220 Ala Leu Leu Gly Leu Vai Leu Cys Leu Ala Gin Thr Ile His Thr Gin -15 -10 -5 1 GAG GAA GAT CTC CCC AGA CCC TCC ATC TCG GCT GAG CCA GGC ACC GTG 268 Glu Glu Asp Leu Pro Arg Pro Ser Ile Ser Ale Glu Pro Gly Thr Vai 5 10 15 ATC CCC CTC GGG AGC CAT GTG ACT TTC GTG TGC GGG GGC CCG GTT GGG 316 Ile Pro Leu Gly Ser His Vai Thr Phe Vai Cys Arg Gly Pro Vai Gly 20 25 30 GTT CAA ACA TTC CGC CTC GAG AGG GAG AGT AGA TCC ACA TAC AAT GAT 364 Vai Gin Thr Phe- Arg Leu Glu Arg Glu Ser Arg Ser Thr Tyr Asn Asp 75 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ 35 40 45 ACT GAA GAT GTG TCT CAA GCT AGT CCA TCT GAG TCA GAG GCC AGA TTC 412 Thr Glu ASP Vai Ser Gin Ala Ser Pro Ser Glu Ser Glu Ala Arg Phe 50 55 60 65 CGC ATT GAC TCA GTA AGT GAA GGA AAT GCC GGG CCT TAT CGC TGC ATC 460 Arg Ile Asp Ser val Ser Glu Gly Asn Ala Gly Pro Tyr Arg cys ile 70 75 80 ΤΑΤ TAT AAG CCC CCT AAA TGG TCT GAG CAG AGT GAC TAC CTG GAG CTG 508 Tyr Tyr Lys Pro Pro Lys Trp Ser Glu Gin Ser Asp Tyr Leu Glu Leu 85 90 95 CTG GTG AAA GAA ACC TCT GGA GGC CCG GAC TCC CCG GAC ACA GAG CCC 556 Leu val Lys Glu Thr Ser Gly Gly Pro Asp Ser Pro Asp Thr Glu Pro 100 105 110 GGC TCC TCA GCT GGA CCC ACG CAG AGG CCG TCG GAC AAC AGT CAC AAT 604 Gly Ser Ser Ala Gly Pro Thr Gin Arg Pro Ser Asp Asn Ser His Asn 115 120 125 GAG CAT GCA CCT GCT TCC CAA GGC CTG AAA GCT GAG CAT CTG TAT ATT 652 Glu His Ala Pro Ala Ser Gin Gly Leu Lys Ala Glu His Leu Tyr Ile 130 135 140 145 CTC ATC GGG GTC TCA GTG GTC TTC CTC TTC TGT CTC CTC CTC CTG GTC 700 Leu Ile Gly Vai Ser Val Val Phe Leu Phe Cys Leu Leu Leu Leu Val 150 155 160 CTC TTC TGC CTC CAT CGC CAG AAT CAG ATA AAG CAG GGG CCC CCC AGA 748 Leu Phe Cys Leu His Arg Gin Asn Gin Ile Lys Gin Gly Pro Pro Arg 165 170 175 AGC AAG GAC GAG GAG CAG AAG CCA CAG CAG AGG CCT GAC CTG GCT GTT 796 Ser Lys Asp Glu Glu Gin Lys Pro Gin Gin Arg Pro Asp Leu Ala Val 180 185 190 GAT GTT CTA GAG agg ACA GCA GAC AAG GCC ACA GTC AAT GGA CTT CCT 844 Αερ Vai Leu Glu Arg Thr Ala Asp Lys Ala Thr Val Asn Gly Leu Pro 195 200 205 GAG AAG GAC AGA GAG ACG GAC ACC TCG GCC CTG GCT GCA GGG AGT TCC 892 Glu Lys ASp Arg Glu Thr Asp Thr ser Ala Leu Ala Ala Gly Ser Ser 210 215 220 225 CAG GAG GTG ACG TAT GCT CAG CTG GAC CAC TGG GCC CTC ACA CAG AGG 940 /»1.. VAil Glu Vai Thr Tyr Ala Gin Leu Asp HiS Trp Ala Leu ml. inr Gin Arg 230 235 240 ACA GCC CGG GCT GTG TCC CCA CAG TCC ACA AAG CCC ATG GCC GAG TCC 988 Thr Ala Arg Ala Val Ser Pro Gin Ser Thr Lys Pro Met Ala Glu Ser 245 250 255 ATC ACG TAT GCA GCC GTT GCC AGA CAC TGACCCCATA CCCACCTGGC 1035 Zle Thr Tyr Ala Ala Val Ala Arg His 260 265 CTCTGCACCT GAGGGTAGAA AGTCACTCTA GGAAAAGCCT GAAGCAGCCA TTTGGAAGGC 1095

TTCCTGTTGG ATTCCTCTTC CTGGAGACTG GAGGTTTCTA ACAATCGGAC AGCTCCTTGG

ATCTAGAAAG CCAGCCAGGC ACCAGCATCC AGAAGGTTCG ACAGACTGTT TYTCAGTTAT

AGCTGTCCTG GAGACAAGAG TTAGCCAGGT GGTCCCTTCT TTCCAAAAAC CCAGCTACAG 1155 1215 1275

TTCC 1279 76 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 287 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6:

Met Ser Pro His Pro Thr Ala Leu Leu Gly Leu Val Leu Cys Leu Ala -21 -20 -15 -10 Gin Thr lie His Thr Gin Glu Glu Asp Leu Pro Arg Pro Ser Ile Ser -5 1 5 10 Ala Glu Pro Gly Thr Val Ile Pro Leu Gly Ser His Val Thr Phe Val 15 20 25 Cys Arg Gly Pro val Gly Val Gin Thr Phe Arg Leu Glu Arg Glu Ser 30 35 40 Arg Ser Thr Tyr Asn Asp Thr Glu Asp Val Ser Gin Ala Ser Pro Ser 45 50 55 Glu Ser Glu Ala Arg Phe Arg Ile Asp Ser Val Ser Glu Gly Asn Ala 60 65 70 75 Gly Pro Tyr Arg Cys Ile Tyr Tyr Lys Pro Pro Lys Trp Ser Glu Gin 80 85 90 Ser Asp Tyr Leu Glu Leu Leu Val Lys Glu Thr Ser Gly Gly Pro Asp 95 100 105 Ser Pro Asp Thr Glu Pro Gly Ser Ser Ala Gly Pro Thr Gin Arg Pro 110 115 120 Ser Asp Asn Ser His Asn Glu His Ala Pro Ala Ser Gin Gly Leu Lys 125 130 135 Ala Glu His Leu Tyr Ile Leu Ile Gly Val Ser Val Val Phe Leu Phe 140 145 150 155 Cys Leu Leu Leu Leu Val Leu Phe Cys Leu His Arg Gin Asn Gin Ile 160 165 170 Lys Gin Gly Pro Pro Arg ser Lys Asp Glu Glu Gin Lys Pro Gin Gin 175 180 185 Arg Pro Asp Leu Ala Val Asp Val Leu Glu Arg Thr Ala Asp Lys Ala 190 195 200 Thr Vai Asn Gly Leu Pro Glu Lys Asp Arg Glu Thr Asp Thr Ser Ala 205 210 215 Leu Ala Ala Gly Ser Ser Gin Glu Val Thr Tyr Ala Gin Leu Asp His 220 225 230 235 Trp Ala Leu Thr Gin Arg Thr Ala Arg Ala Val Ser Pro Gin Ser Thr 240 245 250

Ile Thr Tyr Ala Ala Vai Ala Arg His 260 265

Lys Pro Met Ala Glu Ser 255 77 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1728 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 69..929 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: mat_peptide (B) LOCALIZAÇÃO: 132..929 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7: AAAGGCTGCA GAGTTCTGTC CTTGCATTGG TGCGCCTCAG GCCAGGCTGC .CTGCTGGGA 60 CCTGGGCC ATG TCT CCC CAC CCC ACC GCC CTC CTG GGC CTA t XS CTC TGC 110

Met Ser Pro His Pro Thr Ala Leu Leu Gly Leu al Leu Cys -21 -20 -IS *10 CTG GCC CAG ACC ATC CAC ACG CAG GAG GAA GAT CTG CCC vGA CCC TCC ise Leu Ala Gin Thr lie His Thr Gin Glu Glu Asp Leu Prc Arg Pro Ser -5 1 5 ATC TCG GCT GAG CCA GGC ACC GTG ATC CCC CTG GGG Ar c CAT GTG ACT 206 Ile Ser Ala Glu Pro Gly Thr Vai Ile Pro Leu Gly S Λ His Vai Thr 10 15 20 25 TTC GTG TGC CGG GGC CCG GTT GGG GTT CAA ACA TTC CGC CTG GAG AGG 254 Phe Vai Cys Arg Gly Pro Vai Gly Vai Gin Thr Phe Arg Leu Glu Arg 30 35 40 QAG AGT AGA TCC ACA TAC AAT GAT ACT GAA GAT G G TCT CAA GCT AGT 302 Glu Ser Arg Ser Thr Tyr Asn Asp Thr GlU Asp \ al Ser Gin Ala Ser 4S. 50 55 78 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ CCA TCT GAG TCA GAG GCC AGA TTC CGC ATT GAC TCA GTA AGT GAA GGA aso Pro Ser Glu Ser Glu Ala Arg Phe Arg Ile Asp Ser Vai Ser Glu Gly 60 65 70 ΑΑΤ GCC GGG CCT TAT CGC TGC ATC TAT TAT AAG CCC CCT AAA TGG TCT 398 Asn Ala Gly Pro Tyr Arg cys Ile Tyr Tyr Lys Pro Pro Lys Trp Ser 75 80 85 GAG CAG AGT GAC TAC CTG GAG CTG CTG GTG AAA GAA ACC TCT GGA GGC 446 Glu Gin Ser Asp Tyr Leu Glu Leu Leu Vai Lys Glu Thr Ser Gly Gly 90 95 100 105 CCG GAC TCC CCG GAC ACA GAG CCC GGC TCC TCA GCT GGA CCC ACG CAG 494 Pro Asp Ser Pro Asp Thr Glu Pro Gly Ser Ser Ala Gly Pro Thr Gin 110 115 120 AGG CCG TCG GAC AAC AGT CAC AAT GAG CAT GCA CCT GCT TCC CAA GGC 542 Arg Pro Ser Asp Asn Ser HiS Asn Glu His Ala Pro Ala Ser Gin Gly 125 130 135 CTG AAA GCT GAG CAT CTG TAT ATT CTC ATC GGG GTC TCA GTG GTC TTC 590 Leu Lys Ala Glu His Leu Tyr Ile Leu Ile Gly Vai Ser Vai Vai Phe 140 145 ISO CTC TTC TGT CTC CTC CTC CTG GTC CTC TTC TGC CTC CAT CGC CAG AAT 638 Leu Phe Cys Leu Leu Leu Leu Vai Leu Phe Cys Leu His Arg Gin Asn 155 160 165 CA5 ATA AAG CAG GGG CCC CCC AGA AGC AAG GAC GAG GAG CAG AAG CCA 686 Gin Ile Lys Gin Gly Pro Pro Arg Ser Lys Asp Glu Glu Gin Lys Pro 170 175 180 185 CAG CAG AGG CCT GAC CTG GCT GTT GAT GTT CTA GAG AGG ACA GCA GAC 734 Gin Gin Arg Pro ASP Leu Ala Vai Asp Vai Leu Glu Arg Thr Ala Asp 190 195 200 AAG GCC ACA GTC AAT GGA CTT CCT GAG AAG GAC AGA GAG ACG GAC ACC 782 Lys Ala Thr Vai Asn Gly Leu Pro Glu Lys Asp Arg Glu Thr Asp Thr 205 210 215 TCG GCC CTG GCT GCA GGG AGT TCC CAG GAG GTG ACG TAT GCT CAG CTG 830 Ser Ala Leu Ala Ala Gly Ser Ser Gin Glu Vai Thr Tyr Ala Gin Leu 220 225 230 GAC CAC TGG GCC CTC ACA CAG AGG ACA GCC CGG GCT GTG TCC CCA CAG 878 ASP His Trp Ala Leu Thr Gin Arg Thr Ala Arg Ala Vai Ser Pro Gin 235 240 245 TCC ACA AAG CCC ATG GCC GAG TCC ATC ACG TAT GCA GCC GTT GCC AGA 926 ser Thr Lys Pro Mat Ala Glu Ser Ile Thr Tyr Ala Ala Vai Ala Arg 2S0 2S5 260 265 CAC TGACCCCATA CCCACCTGGC CTCTGCACCT GAGGGTAGAA AGTCACTCTA His 1039

GGAAAAGCCT GAAGCAGCCA TTTGGAAGGC TTCCTGTTGG ATTCCTCTTC ATCTAGAAAG 79 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ CCAGCCAGGC AGCTGTCCTG GAGACAAGAG CTGGAGACTG GAGGTTTCTA ACCAGCATCC 1099 AGAAGGTTCG TTAGCCAGGT GGTCCCTTCT ACAATCGAGC AGCTCCTTGG ACAGACTGTT 1159 TCTCAGTTAT TTCCAGAGAC CCAGCTACAG TTCCCTGGCT GTTTCTAGAG ACCCAGCTTT 1219 ATTCACCTGA CTGTTTCCAG AGACCCAGCT AAAGTCACCT GCCTGTTCTA AAGGCCCAGC 1279 TACAGCCAAT CAGCCGATTT CCTGAGCAGT GATGCCACCT CCAAGCTTGT CCTAGGTGTC 1339 TGCTGTGAAC CTCCAGTGAC CCCAGAGACT TTGCTGTAAT TATCTGCCCT GCTGACCCTA 1399 AAGACCTTCC TAGAAGTCAA GAGCTAGCCT TGAGACTGTG CTATACACAC ACAGCTGAGA 1459 GCCAAGCCCA gttctctggg TTGTGCTTTA CTCCACGCAT CAATAAATAA TTTTGAAGGC 1S19 CTCACATCTG GCAGCCCCAG gcctggtcct GGGTGCATAG GTCTCTCGGA CCCACTCTCT 1579 GCCTTCACAG TTGTTCAAAG CTGAGTGAGG GAAACAGGAC TTACGAAAAC GTGTCAGCGT 1639 TTTCTTTTTA AAATTTAATT GATCAGGATT GTACGTAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1699 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAGG 1728 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 287 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:8:

MeC Ser Pro His Pro Thr Ala Leu Leu Gly Leu Val Leu Cys Leu Ala -21 -20 -15 -10 Gin Thr Ile His Thr Gin Glu Glu Asp Leu Pro Arg Pro Ser Ile Ser -5 1 5 10 Ala Glu Pro Gly Thr Val Xle Pro Leu Gly Ser His Val Thr Phe Val 15 20 25 Cys Arg Gly Pro Vai Gly Val Gin Thr Phe Arg Leu Glu Arg Glu Ser 30 35 40 Arg Ser Thr Tyr Asn Asp Thr Glu Asp Val Ser Gin Ala Ser Pro Ser 45 50 55 Glu Ser Glu Ala Arg Phe «Xy lie Asp Ser Vãl Ser Glu Gly Asn Ala 60 65 70 75 Gly Pro Tyr Arg Cys Ile Tyr Tyr Lys Pro Pro Lys Trp Ser Glu Gin 80 85 90

Ser Asp Tyr Leu Glu Leu Leu Vai Lys Glu Thr Ser Gly Gly Pro Asp 95 100 105 80 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Ser Pro Asp Thr Glu Pro Gly Ser Ser Ala Gly Pro Thr Gin Arg Pro 110 115 120

Ser Asp Asn Ser His Asn Glu His Ala Pro Ala Ser Gin Gly Leu Lys 125 130 135

Ala Glu His Leu Tyr Xle Leu Ile Gly Vai Ser Vai Vai Phe Leu Pbe 140 145 150 155

Cys Leu Leu Leu Leu Vai Leu Phe Cys Leu His Arg Gin Asn Gin Ile 160 165 170

Lys Gin Gly Pro Pro Arg Ser Lys Asp Glu Glu Gin Lys Pro Gin Gin 175 180 185

Arg Pro Asp Leu Ala Vai Asp Vai Leu Glu Arg Thr Ala Asp Lys Ala 190 195 200

Thr Vai Asn Gly Leu Pro 205 Leu Ala Ala Gly Ser Ser 220 225 Trp Ala Leu Thr Gin Arg 240 Lys Pro Met Ala Glu Ser 255

Glu Lys Asp Arg Glu Thr Asp Thr Ser Ala 210 215

Gin Glu Vai Thr Tyr Ala Gin Leu Asp His 230 235

Thr Ala Arg Ala Vai Ser Pro Gin Ser Thr 245 2S0

Ile Thr Tyr Ala Ala Vai Ala Arg His 260 265 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 568 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 24..428 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: mat_peptide (B) LOCALIZAÇÃO: 87..428 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9: CCACGCGTCC GGGGACCGGG GCC ATG TCT CCA CAC CTC ACT GCT CTC CTG 50

Met Ser Pro His Leu Thr Ala Leu Leu -21 -20 -15 GGC CTA GTG CTC TGC CTG GCC CAG ACC ATC CAC ACG CAG GAG GGG GCC 98

Gly Leu Vai Leu Cys Leu Ala Gin Thr Ile His Thr Gin Glu Gly Ala 81 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ -10 -5 1 CTT CCC AGA CCC TCC ATC TCG GCT GAG CCA GGC ACT GTG ATC TCC CCG 146 Leu Pro Arg Pro Ser Xle Ser Ala Glu Pro Gly Thr Vai Ile Ser Pro 5 10 15 20 GGG AGC CAT GTG ACT TTC ATG TGC CGG GGC CCG GTT GGG GTT CAA ACA 194 Gly Ser His Vai Thr Phe Met Cys Arg Gly Pro Vai Gly Vai Gin Thr 25 30 35 TTC CGC CTG GAG AGG GAG GAT AGA GCC AAG TAC AAA GAT AGT TAT AAT 242 Phe Arg Leu Glu Arg Glu Asp Arg Ala Lys Tyr Lys Asp Ser Tyr Asn 40 4S 50 GTG TTT CGA CTT GGT CCA TCT GAG TCA GAG GCC AGA TTC CAC ATT GAC 290 Vai Phe Arg Leu Gly Pro Ser Glu Ser Glu Ala Arg Phe His Ile Asp SS 60 65 TCA GTA AGT GAA GGA AAT GCC GGG CTT TAT CGC TGC CTC TAT TAT AAG 338 Ser Vai Ser Glu Gly Asn Ala Gly Leu Tyr Arg Cys Leu Tyr Tyr Lys 70 75 80 CCC CCT GGA TGG TCT GAG CAC AGT GAC TTC CTG GAG CTG CTG GTG AAA 386 Pro Pro Gly Trp Ser Glu His Ser Asp Phe Leu Glu Leu Leu Vai Lys 85 90 95 100 GGG ACT GTG CCA GGC ACT GAA GCC TCC GGA TTT GAT GCA CCA 428 Gly Thr Vai Pro Gly Thr Glu Ala ser Gly Phe ASP Ala Pro 105 110 TGAATGAGGA GAAATGGCCT CCCGTCTTGT GAACTTCAAT GGGGAGAAAT AATTAGAATG 488 AGCAATAGAA ATGCACAGAT GCCTATACAT ACATATACAA ATAAAAAGAT ACGATTCGCA S48 ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ AAAAAAGGGC S6B (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 135 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:10:

Met Ser Pro His Leu Thr Ala Leu Leu Gly Leu Vai Leu Cys Leu Ala -21 -20 -15 -10 Gin Thr Ile His Thr Gin Glu Gly Ala Leu Pro Arg Pro Ser Ile Ser -5 1 5 10 Ala Glu Pro Gly Thr Vai Ile Ser Pro Gly Ser His Vai Thr Phe Met 15 20 25 Cys Arg Gly Pro Vai Gly Vai Gin Thr Phe Arg Leu Glu Arg Glu Asp 30 35 40 82 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Arg Ala Lys 45 Glu Ser Glu 60 Gly Leu Tyr

Ser Asp Phe

Ala Ser Gly 110

Tyr Lys Asp Ser Tyr Asn Vai Phe Arg Leu Gly Pro Ser 50 55 Ala Arg Phe His Ile Asp Ser Vai Ser Glu Gly Asn Ala 65 70 75 Arg Cys Leu Tyr Tyr Lys Pro Pro Gly Trp Ser Glu His 80 85 90 Leu Glu Leu Leu Vai Lys Gly Thr Vai Pro Gly Thr Glu 95 100 105 Phe Asp Ala Pro (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1620 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 81..1397 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:11: GTCGACCCAC GCGTCCGCCT CTGTCCTGCC AGCACCGAGG GCTCATCCAT CCACAGAGCA 60 GTGCAGTGGG AGGAGACGCC ATG ACC CCC ATC CTC ACG GTC CTG ATC TGT 110

Mec Thr Pro Ile Leu Thr Vai Leu Ile Cys 15 10 CTC GGG CTG AGC CTG GAC CCC AGG ACC CAC GTG CAG GCA GGG CCC CTC 158 Leu Gly Leu Ser Leu Asp Pro Arg Thr His Vai Gin Ala Gly Pro Leu 15 20 25 CCC AAG CCC ACC CTC TGG GCT GAG CCA GGC TCT GTG ATC ACC CAA GGG 206 Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Vai Ile Thr Gin Gly 30 35 40 AGT CCT GTG ACC CTC AGG TGT CAG GGG AGC CTG GAG ACG CAG GAG TAC 254 Ser Pro Vai Thr Leu Arg Cys Gin Gly Ser Leu Glu Thr Gin Glu Tyr 45 50 55 CAT CTA TAT AGA GAA AAG AAA ACA GCA CTC TGG ATT ACA CGG ATC CCA 302 His Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Leu Trp Ile Thr Arg Ile Pro 60 65 70 CAG GAG CTT GTG AAG AAG GGC CAG TTC CCC ATC CTA TCC ATC ACC TGG 350 Gin Glu Leu Vai Lys Lys Gly Gin Phe Pro Ile Leu Ser Ile Thr Trp 75 80 85 90 83 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ GAA CAT GCA GGG CGG TAT TGC TGT ATC TAT Glu His Ala Gly'Arg Tyr Cys Cys Ile Tyr 95 100 CTC TCA GAG AGC AGT GAC CCC CTG GAG CTG Leu Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu 110 115 AGC AAA CCC ACC CTC TCA GCT CTG CCC AGC Ser Lys Pro Thr Leu Ser Ala Leu Pro Ser 125 130 GGG AAT GTG ACC ATC CAG TGT GAC TCA CAG Gly Asn Vai Thr Ile Gin Cys Asp Ser Gin 140 145 ATT CTG TGT AAG GAA GGA GAA GAT GAA CAC Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His 155 160 CAT TCC CAT GCC CGT GGG TCA TCC CGG GCC His Ser His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala 175 180 GTG AGC CCA AGT CGC AGG TGG TCG TAC AGG Vai Ser Pro Ser Arg Arg Trp Ser Tyr Arg 190 195 CGC GCT CCC TAT GTG TGG TCT CTA CCC AGT Arg Ala Pro Tyr Vai Trp Ser Leu Pro Ser 205 210 GTC CCA GGT GTT TCT AAG AAG CCA TCA CTC Vai Pro Gly Vai Ser Lys Lys Pro Ser Leu 220 225 GTC GTG GCC CCT GGG GAG AAG CTG ACC TTC Vai Vai Ala Pro Gly Glu Lys Leu Thr Phe 235 240 GGC TAC GAC AGA TTT GTT CTG TAC AAG GAG >. H O Tyr Asp Arg Phe Vai Leu Tyr Lys Glu 255 260 CAG CGC CCT GGC CGG CAG CCC CAG GCT GGG Gin Arg Pro Gly Arg Gin Pro Gin Ala Gly 270 275 ACC CTG GGC CCT GTG AGC CGC TCC TAC GGG Thr Leu Gly Pro Vai Ser Arg Ser Tyr Gly 285 290 GGT GCA TAC AAC CTC TCC TCC GAG TGG TCG Gly Ala Tyr Asn Leu ser Ser Glu Trp ser 300 30S GAC ATC CTG ATC ACA GGA CAG ATC CGT GCC Asp Ile Leu Ile Thr Gly Gin Ile Arg Ala GGC AGC CAC ACT GCA GGC 398

Gly Ser His Thr Ala Gly 105 GTG GTG ACA GGA GCC TAC 446

Vel Vai Thr Gly Ala Tyr 120 CCT GTG GTG ACC TCA GGA 494

Pro Vai Vai Thr Ser Gly 135 GTG GCA TTT GAT GGC TTC 542

Vai Ala Phe Asp Gly Phe 150 CCA CAA TGC CTG AAC TCC 590

Pro Gin Cys Leu Asn Ser 165 170 ATC TTC TCC GTG GGC CCC 638

Ile Phe Ser Vai Gly Pro 185 TGC TAT GGT TAT GAC TCG 686

Cys Tyr Gly Tyr Asp Ser 200 GAT CTC CTG GGG CTC CTG 734

Asp Leu Leu Gly Leu Leu 215 TCA GTG CAG CCG GGT CCT 782

Ser Vai Gin Pro Gly Pro 230 CAG TGT GGC TCT GAT GCC 830

Gin Cys Gly Ser Asp Ala 245 250 TGG GGA CGT GAC TTC CTC 878

Trp Gly Arg Asp Phe Leu 265 CTC TCC CAG GCC AAC TTC 926

Leu Ser Gin Ala Asn Phe 280 GGC CAG TAC ACA TGC TCC 974

Gly Gin Tyr Thr Cys Ser 29S GCC CCC AGC GAC CCC CTG 102?

Ala Pro Ser Asp Pro Leu 310 AGA CCC TTC CTC TCC GTG 1^70

Arg Pro Phe Leu Ser Vai 84 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ 315 320 325 330 CGG CCG GGC CCC ACA GTG GCC TCA GGA GAG AAC GTG ACC CTG CTG TGT 1118 Arg Pro Gly Pro Thr Val Ala Ser Gly Glu Asn Val Thr Leu Leu Cys 335 340 345 CAG TCA CAG GGA GGG ATO CAC ACT TTC CTT TTG ACC AAG GAG GGG GCA 1166 Gin Ser Gin Gly Gly Met His Thr Phe Leu Leu Thr Lys Glu Gly Ala 350 355 360 GCT GAT TCC CCG CTG CGT CTA AAA TCA AAG CGC CAA TCT CAT AAG TAC 1214 Ala Asp Ser Pro Leu Arg Leu Lys Ser Lys Arg Gin Ser His Lys Tyr 365 370 375 CAG GCT GAA TTC CCC ATG AGT CCT GTG ACC TCG GCC CAC GCG GGG ACC 1262 Gin Ala Glu Phe Pro Met Ser Pro Val Thr Ser Ala His Ala Gly Thr 380 385 390 TAC AGG TGC TAC GGC TCA CTC AGC TCC AAC CCC TAC CTG CTG ACT CAC 1310 Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Leu Ser Ser Asn Pro Tyr Leu Leu Thr His 395 400 405 410 CCC AGT GAC CCC CTG GAG CTC GTG GTC TCA GGA GCA GCT GAG ACC CTC 1358 Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Ser Gly Ala Ala Glu Thr Leu 415 420 425 AGC CCA CCA CAA AAC AAG TCC GAC TCC AAG GCT GGT GAG TGAGGAGATG 1407 Ser Pro Pro Gin Asn Lys Ser Asp Ser Lys Ala Gly Glu 430 435 CTTGCCGTGA TGACGCTGGG CACAGAGGGT CAGGTCCTGT CAAGAGGAGC TGGGTGTCCT 1467 GGGTGGACAT TTGAAGAATT ATATTCATTC CAACTTGAAG AATTATTCAA CACCTTTAAC 1527 AATGTATATG TGAAGTACTT TATTCTTTCA ΤΑΤΤΤΤΑΑΑΑ ATAAAAGATA ATTATCCATG 1587 ΑΑΑΑΑΑΑΑΆΑ ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ AAAGGGCGGC CGC ' 1620 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 439 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:12:

Met Thr Pro Ile Leu Tfar Vai Leu Xle Cys Leu Gly Leu Ser Leu Asp 15 10 IS

Pro Arg Thr His Vai Gin Ala Gly Pro Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp 20 25 30

Thr Leu Arg

Ala Glu Pro Gly Ser Val Ile Thr Gin Gly Ser Pro Vai 35 40 45 85 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Cys Gin Gly Ser Leu Glu Thr Gin SO SS Lys Thr Ala Leu Trp Ile Thr Arg 6S 70 Gly Gin Phe Pro Ile Leu Ser lie 85 Cys Cys Ile Tyr Gly Ser His Thr 100 Pro Leu Glu Leu Vai Vai Thr Gly 115 120 Ala Leu Pro Ser Pro Vai val Thr 130 135 Cys Asp Ser Gin Vai Ala Phe Asp 145 150 Glu Asp Glu His Pro Gin Cys Leu 165 Ser Ser Arg Ala Ile Phe Ser Val 180 Trp Ser Tyr Arg Cys Tyr Gly Tyr 195 200 Ser Leu Pro Ser Asp Leu Leu Gly 210 215 Lys Pro Ser Leu Ser Vai Gin Pro 225 230 Lys Leu Thr Phe Gin Cys Gly Ser 245 Leu Tyr Lya Glu Trp Gly Arg Asp 260 Pro Gin Ala Gly Leu Ser Gin Ala 275 280 Arg Ser Tyr Gly Gly Gin Tyr Thr 290 295 Ser Glu Trp Ser Ala Pro Ser Asp 305 310 Gin Ile Arg Ala Arg Pro Phe Leu 325 Ala Ser Gly Glu Asn Vai Thr Leu 340 His Thr Phe Leu Leu Thr Lys Glu 355 360

Glu Tyr His Leu Tyr Arg Glu Lya 60

Ile Pro Gin Glu Leu Vai Lya Lys 15 80

Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr 90 95

Ala Gly Leu Ser Glu Ser Ser Asp 10S 110

Ala Tyr Ser Lys Pro Thr Leu Ser 12 5

Ser Gly Gly Asn Vai Thr Ile Gin 140

Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly 1SS 160

Asn Ser His Ser His Ala Arg Gly 170 175

Gly Pro Vai Ser Pro Ser Arg Arg 185 190

Asp Ser Arg Ala Pro Tyr Vai Trp 20S

Leu Leu Vai Pro Gly Vai Ser Lys 220

Gly Pro Vai Vai Ala Pro Gly Glu 235 240

Asp Ala Gly Tyr Asp Arg Phe Vai 250 255

Phe Leu Gin Arg Pro Gly Arg Gin 265 270

Asn Phe Thr Leu Gly Pro Vai Ser 285

Cys Ser Gly Ala Tyr Asn Leu Ser 300

Pro Leu Asp Ile Leu Ile Thr Gly 315 320

Ser Vai Arg Pro Gly Pro Thr Vai 330 335

Leu Cys Gin Ser Gin Gly Gly Met 345 350

Gly Ala Ala Asp Ser Pro Leu Arg 365 86 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Leu Lys Ser Lys Arg Gin Ser His Lys Tyr Gin Ala Glu Phe Pro Met 370 375 380 Ser Pro Vai Thr Ser Ala His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser 385 390 395 400 Leu Ser Ser Asn Pro Tyr Leu Leu Thr His Pro Ser Asp Pro Leu Glu 405 410 415 Leu Vai Vai Ser Gly Ala Ala Glu Thr Leu Ser Pro Pro Gin Asn Lys 420 425 430 Ser Asp Ser Lys Ala Gly Glu 435 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2197 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 191..1483 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:13: 60 120 180 229 277 325 373

GTCGACCCAC GCGTCCGGTC AACTTTTCTT CCCCTACTTC CCTGCATTTC TCCTCTGTGC

TCACTGCCAC ACGCAGCTCA ACCTGGACGG CACAGCCAGA TGCGAGATGC GTCTCTGCTG

ATCTGAGTCT GCCTGCAGCA TGGACCTGGG TCTTCCCTGA AGCATCTCCA GGGCTGGAGG GACGACTGCC ATG CAC CGA GGG CTC ATC CAT CCG CAG AGC AGG GCA GTG Met His Arg Gly Leu Ile His Pro Gin Ser Arg Ala Vai 15 10 GGA GGA GAC GCC ATG ACC CCC ATC GTC ACA GTC CTG ATC TGT CTC GGG Gly Gly Asp Ala Met Thr Pro Ile Vai Thr Val Leu Ile Cys Leu Gly IS 20 25 CTG AGT CTG GGC CCC AGG ACC CAC GTG CAG ACA GGG ACC ATC CCC AAG Leu Ser Leu Gly Pro Arg Thr His Vai Gin Thr Gly Thr Ile Pro Lys 30 3S 40 45 CCC ACC CTG TGG GCT GAG CCA GAC TCT GTG ATC ACC CAG GGG AGT CCC Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Asp Ser val Ile Thr Gin Gly Ser Pro 50 55 60 GTC ACC CTC AGT TGT CAG GGG AGC CTT GAA GCC CAG GAG TAC CGT CTA Vai Thr Leu Ser Cys Gin Gly Ser Leu Glu Ala Gin Glu Tyr Arg Leu 65 70 75 421 87 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ ΤΑΤ AGG GAG AAA AAA TCA GCA TCT TGG ATT ACA CGG ATA CGA CCA GAG 469 Ty* Arg Glu Lys Lys Ser Ala Ser Trp Xle Thr Arg Xle Arg Pro Glu eo 85 90 CTT GTG AAG AAC GGC CAG TTC CAC ATC CCA TCC ATC ACC TGG GAA CAC 517 Leu Vai Lys Asn Gly Gin Phe His Xle Pro Ser Ile Thr Trp GlU His 95 100 105 ACA GGG CGA TAT GGC TGT CAG TAT TAC AGC CGC GCT CGG TGG TCT GAG 565 Thr Gly Arg Tyr Gly Cys Gin Tyr Tyr Ser Arg Ala Arg Trp Ser Glu 110 115 120 125 CTC AGT GAC ccc CTG GTG CTG GTG ATG ACA GGA GCC TAC CCA AAA CCC 613 Leu Ser Asp Pro Leu Vai Leu Vai Met Thr Gly Ala Tyr Pro Lys Pro 130 135 140 ACC CTC TCA GCC CAG CCC AGC CCT GTG GTG ACC TCA GGA GGA AGG GTG 661 Thr Leu Ser Ala Gin Pro Ser Pro Val Val Thr Ser Gly Gly Arg Val 145 ISO 155 ACC CTC CAG TGT GAG TCA CAG GTG GCA TTT GGC GGC TTC ATT CTG TGT 709 Thr Leu Gin Cys Glu Ser Gin val Ala Phe Gly Gly Phe Xle Leu Cys 160 165 170 AAG GAA GGA GAA GAT GAA CAC CCA CAA TGC CTG AAC TCC CAG CCC CAT 7S7 Lys Glu Gly Glu Αβρ Glu His Pro Gin Cys Leu Asn Ser Gin Pro His 175 180 185 GCC CGT GGG TCG TCC CGC GCC ATC TTC TCC GTG GGC CCC GTG AGC CCG 805 Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe Ser Val Gly Pro Val Ser Pro 190 195 200 205 AAT CGC AGG TGG TCG CAC AGG TGC TAT GGT TAT GAC TTG AAC TCT CCC 853 Asn Arg Arg Trp Ser His Arg Cys Tyr Gly Tyr Asp Leu Asn Ser Pro 210 21S 220 TAT GTG TGG TCT TCA CCC AGT GAT CTC CTG GAG CTC CTG GTC CCA GGT 901 Tvr Vai Trp Ser Ser Pro Ser Asp Leu Leu Glu Leu Leu Val Pro Gly 225 230 235 GTT TCT AAG AAG CCA TCA CTC TCA GTG CAG CCG GGT CCT GTC GTG GCC 949 Vai Ser Lys Lys Pro Ser Leu Ser Val Gin Pro Gly Pro Val Val Ala 240 245 2S0 CCT GGG GAA AGC CTG ACC CTC CAG TGT GTC TCT GAT GTC GGC TAT GAC 997 Pro Gly Glu Ser Leu Thr Leu Gin Cys Val ser Asp Val Gly Tyr ASP 2S5 260 26S AGA TTT GTT CTG TAC AAG GAG GGG GAA CGT GAC CTT CGC CAG CTC CCT 1045 Arg Phe Vai Leu Tyr Lys Glu Gly Glu Arg Asp Leu Arg Gin Leu Pro 270 275 280 285 GGC CGG CAG CCC CAG GCT GGG CTC TCC CAG GCC AAC TTC ACC CTG GGC 1093 Gly Arg Gin Pro Gin Ala Gly Leu Ser Gin Ala Asn Phe Thr Leu Gly 290 295 300 CCT GTG AGC CGC TCC TAC GGG GGC CAG TAC AGA TGC TAC GGT GCA TAC 1141 Pro Vai Ser Arg Ser Tyr Gly Gly Gin Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala Tyr 88 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ 305 310 315 AAC CTC TCC TCC GAG TGG TCG GCC CCC AGC GAC CCC CTG GAC ATC PTG 1189

Aan Leu Ser Ser Glu Trp Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile ueu 320 325 330 ATC ACA GGA CAG ATC CAT GGC ACA CCC TTC ATC TCA GTG CAG CC i. GGC 1237

Ile Thr Gly Gin Ile His Gly Thr Pro Phe Ile Ser Vai Gin Pi o Gly 335 340 345 CCC ACA GTG GCC TCA GGA GAG AAC GTG ACC CTG CTG TGT CAG PCA TGG 1285

Pro Thr Vai Ala Ser Gly Glu Asn Vai Thr Leu Leu Cys Gin Ser Trp 350 355 360 365 CGG CAG TTC CAC ACT TTC CTT CTG ACC AAG GCG GGA GCA & I GAT GCC 1333

Arg Gin' Phe His Thr Phe Leu Leu Thr Lys Ala Gly Ala P .a Asp Ala 370 375 380

CCA CTC CGT CTA AGA TCA ATA CAC GAA TAT CCT AAG TAC CAG GCT GAA 13 BI

Pro Leu Arg Leu Arg Ser Ile His Glu Tyr Pro Lys Tyr Gin Ala Glu 385 390 395 TTC CCC ATG AGT CCT GTG ACC TCA GCC CAC GCG GGG A C TAC AGG ACC 1429

Phe Pro Het Ser Pro Vai Thr Ser Ala His Ala Gly "ar Tyr Arg Thr 400 405 .10 CTC CAT GGG TTC CAG CCC CCC ACC CAC CGG TCC CAT CTC CAC ACC TGC 1477

Leu His Gly Phe Gin Pro Pro Thr His Arg Ser Hi· Leu His Thr Cys 415 420 42. AGG CCC TGAGGACCAG CCCCTCACCC CCACTGGGTC GGA7 JCCCAA AGTGGTCTGG 1533

Arg Pro 430 GAAGGCACCT GGGGGTTGTG ATCGGCATCT TGGTGGCCG' CGTCCTACTG CTCCTCCTCC 1593 TCCTCCTCCT CTTCCTCATC CTCCGACATC GACGTCAG' 3 CAAACACTGG ACATCGACCC 1653 AGAGAAAGGC TGATTTCCAA CATCCTGCAG GGGCTGTí ÍGG GCCAGAGCCC ACAGACAGAG 1713 GCCTGCAGTG GAGGTCCAGC CCAGCTGCCG ACGCCC..GGA AGAAAACCTC TATGCTGCCG 1773 TGAAGGACAC ACAGCCTGAA GATGGGGTGG AGATGJACAC TCGGGCTGCT GCATCTGAAG 1833 CCCCCCAGGA TGTGACCTAC GCCCAGCTGC ACAGCTTGAC CCTCAGACGG AAGGCAACTG 1893 AGCCTCCTCC ATCCCAGGAA AGGGAACCTC CACCTGAGCC CAGCATTTAC GCCACCCTGG 1953 CCATCCACTA GCCCGGAGGG TACGCAGACT CCACACTCAG TAGAAGGAGA CTCAGGACTG 2013 CTGAAGGCAC GGGAGCTGCC CCCAGTGGAC ACCAATGAAC CCCAGTCAGC CTGGACCCCT 2073 AACAAAGACC ATGAGGAGAT GCTGGGAACT TTGGGACTCA CTTGATTCTG CAGTGGAAAT 2133 AACTAATATC CCTACATTTT TTAATTAAAG CAACAGACTT CTCAATAATC AATGAGTTAA 2193 CCGA 2197 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 431 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGIA: linear (D) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 89 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:14:

Met His Arg Gly Leu Ile His Pro Gin Ser Arg Ala Vai Gly Gly Asp 15 10 15

Ala Met Thr Pro Ile Vai Thr Vai Leu Zle Cys Leu Gly Leu Ser Leu 20 25 30

Gly Pro Arg Thr His Vai Gin Thr Gly Thr lie Pro Lys Pro Thr Leu 35 40 45

Trp Ala Glu Pro Asp Ser Vai Ile Thr Gin Gly Ser Pro Vai Thr Leu 50 55 60

Ser Cys Gin Gly Ser Leu Glu Ala Gin Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu 65 70 75 B0

Lys Lys Ser Ala Ser Trp Ile Thr Arg Ile Arg Pro Glu Leu Vai Lys 85 90 95

Asn Gly Gin Phe His Ile Pro Ser Ile Thr Trp Glu His Thr Gly Arg 100 105 110

Tyr Gly Cys Gin Tyr Tyr Ser Arg Ala Arg Trp Ser Glu Leu Ser Asp 115 120 125

Pro Leu Vai Leu Vai Met Thr Gly Ala Tyr Pro Lys Pro Thr Leu Ser 130 135 140

Ala Gin Pro Ser Pro Vai Vai Thr Ser Gly Gly Arg Vai Thr Leu Gin 145 150 155 160

Cys Glu Ser Gin Vai Ala Phe Gly Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly 165 170 175

Glu Asp Glu His Pro Gin Cys Leu Asn Ser Gin Pro His Ala Arg Gly 180 IBS 190

Ser Ser Arg Ala Ile Phe Ser Vai Gly Pro Vai Ser Pro Asn Arg Arg 195 200 205

Trp Ser His Arg Cys Tyr Gly Tyr Asp Leu Asn Ser Pro Tyr Vai Trp 210 215 220

Ser Ser Pro Ser Asp Leu Leu Glu Leu Leu Vai Pro Gly vai Ser Lys 225 230 235 240

Lys Pro Ser Leu Ser Vai Gin Pro Gly Pro vai Vai Ala Pro Gly Glu 245 250 255 90 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Ser Leu Thr Leu Gin Cys Vai Ser Asp Vai Gly Tyr Asp Arg Phe Vai 260 265 270

Leu Tyr Lys Glu Gly Glu Arg Asp Leu Arg Gin Leu Pro Gly Arg Gin 275 2B0 285

Pro Gin Ala Gly Leu Ser Gin Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Vai Ser 290 295 300

Arg Ser Tyr Gly Gly Gin Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala Tyr Asn Leu Ser 305 310 315 320

Ser Glu Trp Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Thr Gly 325 330 335

Gin Ile His Gly Thr Pro Phe Ile Ser Vai Gin Pro Gly Pro Thr Vai 340 345 350

Ala Ser Gly Glu Asn Vai Thr Leu Leu Cys Gin Ser Trp Arg Gin Phe 355 360 365

His Thr Phe Leu Leu Thr Lys Ala Gly Ala Ala Asp Ala Pro Leu Arg 370 375 380

Leu Arg Ser Ile His Glu Tyr Pro Lys Tyr Gin Ala Glu Phe Pro Met 385 390 395 400

Ser Pro Vai Thr Ser Ala His Ala Gly Thr Tyr Arg Thr Leu His Gly 405 410 415

Phe Gin Pro Pro Thr His Arg Ser His Leu His Thr Cys Arg Pro 420 425 430 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2271 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 191..2035 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:15: 60 120 180

GTCGACCCAC GCGTCCGGTC AACTTTTCTT CCCCTACTTC CCTGCATTTC TCCTCTGTGC

TCACTGCCAC ACGCAGCTCA ACCTGGACGG CACAGCCAGA TGCGAGATGC GTCTCTGCTG

ATCTGAGTCT GCCTGCAGCA TGGACCTGGG TCTTCCCTGA AGCATCTCCA GGGCTGGAGG GACGACTGCC ATG CAC CGA GGG CTC ATC CAT CCG CAG AGC AGG GCA GTG Met.His Arg Gly Leu Ile His Pro Gin Ser Arg Ala Vai 229 91 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ 15 10 GGA GGA GAC GCC ATG ACC CCC ATC GTC ACA GTC CTG ATC TGT CTC GGG 277 Gly Gly Asp Ala Mee Thr Pro Ile Vai Thr Vai Leu Ile Cys Leu Gly 15 20 25 CTG AGT CTG GGC CCC AGG ACC CAC GTG CAG ACA GGG ACC ATC CCC AAG 325 Leu Ser Leu Gly Pro Arg Thr His Vai' Gin Thr Gly Thr Ile Pro Lys 30 35 40 45 CCC ACC CTG TGG GCT GAG CCA GAC TCT GTG ATC ACC CAG GGG AGT CCC 373 Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Asp Ser vai lie Thr Gin Gly Ser rro 50 55 60 GTC ACC CTC AGT TGT CAG GGG AGC CTT GAA GCC CAG GAG TAC CGT CTA 421 Vai Thr Leu Ser Cys Gin Gly Ser Leu Glu Ala Gin Glu Tyr Arg Leu 65 70 75 TAT AGG GAG AAA AAA TCA GCA TCT TGG ATT ACA CGG ATA CGA CCA GAG 469 Tyr Arg Glu Lys Lys Ser Ala Ser Trp Ile Thr Arg Ile Arg Pro Glu 80 85 90 CTT GTG AAG AAC GGC CAG TTC CAC ATC CCA TCC ATC ACC TGG GAA CAC 517 Leu Vai Lys Aen Gly Gin Phe His lie pro Ser Ile Thr Trp Glu His 95 100 105 ACA GGG CGA TAT GGC TGT CAG TAT TAC AGC CGC GCT CGG TGG TCT GAG 565 Thr Gly Arg Tyr Gly Cys Gin Tyr Tyr Ser Arg Ala Arg Trp Ser Glu 110 115 120 125 CTC AGT GAC CCC CTG GTG CTG GTG ATG ACA GGA GCC TAC CCA AAA CCC 613 Leu Ser Asp Pro Leu Vai Leu Vai Het Thr Gly Ala Tyr Pro Lys Pro 130 135 140 ACC CTC TCA GCC CAG CCC AGC CCT GTG GTG ACC TCA GGA GGA AGG GTG 661 Thr Leu Ser Ala Gin Pro Ser Pro Vai Vai Thf Ser Gly Gly Arg Vai 145 150 155 ACC CTC CAG TGT GAG TCA CAG GTG GCA TTT GGC GGC TTC ATT. CTG TGT 709 Thr Leu Gin Cys Glu Ser Gin Vai Ala Phe Gly Gly Phe Ile Leu Cys 160 165 170 AAG GAA GGA GAA GAT GAA CAC CCA CAA TGC CTG AAC TCC CAG CCC CAT 757 Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gin Cys Leu Asn Ser Gin Pro His 175 180 185 GCC CGT GGG TCG TCC CGC GCC ATC TTC TCC GTG GGC CCC GTG AGC CCG 805 Ala Arg Gly ser Ser ÂT9 Ala Zle Phe Ser Vsl Gly Pro Vai Ser Pro 190 195 200 205 AAT CGC AGG TGG TCG CAC AGG TGC TAT GGT TAT GAC TTG AAC TCT CCC 853 Asn Arg Arg Trp Ser His Arg Cys Tyr Gly Tyr Asp Leu Asn Ser Pro 210 215 220 TAT GTG TGG TCT TCA CCC AGT GAT CTC CTG GAG CTC CTG GTC CCA GGT 901 Tyr vai Trp Ser Ser Pro Ser Asp Leu Leu Glu Leu Leu Vai Pro Gly 225 230 235 949

GTT TCT Αλα AAG CCA TCA CTC TCA GTG CAG CCG G6T CCT GTC GTG GCC 92 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Vai Ser Lys Lys Pro Ser Leu Ser Val Gin Pro Gly Pro Val Val Ala 240 245 250 CCT GGG GAA AGC CTG ACC CTC CAG TGT GTC TCT GAT GTC GGC TAT GAC 997 Pro Gly Glu Ser Leu Thr Leu Gin Cys Val Ser Asp val Gly Tyr ASP 255 260 265 AGA TTT GTT CTG TAC AAG GAG GGG GAA CGT GAC CTT CGC CAG CTC CCT 1045 Arg Phe val Leu Tyr Lys Glu Gly Glu Arg Asp Leu Arg Gin Leu Pro 270 275 280 285 GGC CGG CAG CCC CAG GCT GGG CTC TCC CAG GCC AAC TTC ACC CTG GGC 1093 Gly Arg Gin Pro Gin Ala Gly Leu Ser Gin Ala Asn Phe Thr Leu Gly 290 295 300 CCT GTG AGC CGC TCC TAC GGG GGC CAG TAC AGA TGC TAC GGT GCA TAC 1141 Pro Vai Ser Arg Ser Tyr Gly Gly Gin Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala Tyr 305 310 315 AAC CTC TCC TCC GAG TGG TCG GCC CCC AGC GAC CCC CTG GAC ATC CTG 1189 Asn Leu Ser Ser Glu Trp Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu 320 325 330 ATC ACA GGA CAG ATC CAT GGC ACA CCC TTC ATC TCA GTG CAG CCA GGC 1237 Zle Thr Gly Gin Ile His Gly Thr Pro Phe Ile Ser Val Gin Pro Gly 335 340 345 CCC ACA GTG GCC TCA GGA GAG AAC GTG ACC CTG CTG TGT CAG TCA TGG 1285 Pro Thr Val Ala Ser Gly Glu Asn val Thr Leu Leu Cys Gin Ser Trp 3S0 355 360 365 CGG CAG ttc CAC ACT TTC CTT CTG ACC AAG GCG GGA GCA GCT GAT GCC 1333 Arg Gin Phe HÍS Thr Phe Leu Leu Thr Lys Ala Gly Ala Ala Asp Ala 370 375 380 CCA CTC CGT CTA AGA TCA ATA CAC GAA TAT CCT AAG TAC CAG CCT GAA 1381 Pro Leu Arg Leu Arg Ser Ile His Glu Tyr Pro Lys Tyr Gin Ala Glu 385 390 395 TTC CCC ATG AGT CCT GTG ACC TCA GCC CAC GCG GGG ACC TAC AGG TGC 1429 Phe Pro Met Ser Pro Val Thr Ser Ala His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys 400 405 410 TAC GGC TCA CTC AAC TCC GAC CCC TAC CTG CTG TCT CAC CCC AGT GAG 1477 Tyr Gly Ser Leu Asn Ser Asp Pro Tyr Leu Leu Ser His Pro Ser Glu 415 420 425 CCC CTG GAG CTC GTG GTC TCA GGA CCC TCC ATG GGT TCC AGC CCC CCA 1S25 Pro Leu Glu Leu Val Val Ser Gly Pro Ser Met Gly Ser Ser Pro Pro 430 43S 440 44S CCC ACC GGT CCC ATC TCC ACA CCT GCA GGC CCT GAG GAC CAG CCC CTC 1573 Pro Thr Gly Pro Ile Ser Thr Pro Ala Gly Pro Glu Asp Gin Pro Leu 450 455 460 ACC CCC ACT GGG TCG GAT CCC CAA AGT GGT CTG GGA AGG CAC CTG GGG 1621 Thr Pro Thr Gly Ser Asp Pro Gin Ser Gly Leu Gly Arg His Leu Gly 465 470 475 93 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ GTT GTG ATC GGC ATC TTC GTG GCC GTC GTC CTA CTG CTC CTC CTC CTC Vai Vai Ile Gly Ile Le i vai Ala Vai Vai Leu Leu Leu Leu Leu Leu 4.B0 485 490 CTC CTC CTC TTC CTC ATC CTC CGA CAT CGA CGT CAG GGC AAA CAC TGG Leu Leu Leu Phe Leu lie Leu Arg HiS Arg Arg Gin Gly Lys His Trp 495 500 505 ACA TCG ACC CAG AG/. AAG GCT GAT TTC CAA CAT CCT GCA GGG GCT GTG Thr Ser Thr Gin Ar i Lys Ala Asp Phe Gin His Pro Ala Gly Ala Vai 510 SIS 520 525 GGG CCA GAG CCC ACA GAC AGA GGC CTG CAG TGG AGG TCC AGC CCA GCT Gly Pro GlU Pro Thr Asp Arg Gly Leu Gin Trp Arg Ser Ser Pro Ala 530 535 540 GCC GAC GCC CA(í GAA GAA AAC CTC TAT GCT GCC GTG AAG GAC ACA CAG Ala Asp Ala Glu Glu Glu Asn Leu Tyr Ala Ala Vai Lys Asp Thr Gin 5 .5 550 555 CCT GAA GAT GGG GTG GAG ATG GAC ACT CGG GCT GCT GCA TCT GAA GCC Pro Glu Asp Gly Vai Glu Met Asp Thr Arg Ala Ala Ala Ser Glu Ala 560 565 570 CCC CAG GAT GTG ACC TAC GCC CAG CTG CAC AGC TTG ACC CTC AGA CGG Pro Gin A;p Vai Thr Tyr Ala Gin Leu His Ser Leu Thr Leu Arg Arg 575 580 585 AAG GCA ACT GAG CCT CCT CCA TCC CAG GAA AGG GAA CCT CCA GCT GAG Lys Ala Thr Glu Pro Pro Pro Ser Gin Glu Arg Glu Pro Pro Ala Glu 590 S95 600 605 CCC AGC ATT TAC GCC ACC CTG GCC ATC CAC TAGCCCGGAG GGTACGCAGA Pro Sor Ile Tyr Ala Thr Leu Ala Ile His 610 615

CTCCACACTC AGTAGAAGGA GACTCAGGAC TGCTGAAGGC ACGGGAGCTG CCCCCAGTGG

ACACCAATGA ACCCCAGTCA GCCTGGACCC CTAACAAAGA CCATGAGGAG ATGCTGGGAA CTTTGGGACT CACTTGATTC TGCAGTGGAA ATAACTAATA TCCCTACATT ΤΤΤΤΑΑΤΤΑΑ AGCAACAGAC TTCTCAATAA TCAATGAGTT AACCGA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 615 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGIA: linear (D) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:16:

Met His Arg Gly Leu Ile His Pro Gin Ser Arg Ala Vai Gly Gly Asp 15 10 15 1669 1717 1765 1813 1861 1909 1957 2005 2055 2115 2175 2235 2271 94 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Ala Met Thr Pro Ile Vai Thr Vai Leu Ile Cys Leu Gly Leu Ser Leu 20 25 30

Gly Pro Arg Thr Hls Vai Gin Thr Gly Thr Ile Pro Lys Pro Thr Leu 35 40 45

Trp Ala Glu Pro Asp Ser Vai Ile Thr Gin Gly Ser Pro Vai Thr Leu 50 55 60

Ser Cys Gin Gly Ser Leu Glu Ala Gin Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu 65 70 75 80

Lys Lys Ser Ala Ser Trp Ile Thr Arg Ile Arg Pro Glu Leu Vai Lys 85 90 95

Asn Gly Gin Phe His Ile Pro Ser Ile Thr Trp Glu His Thr Gly Arg 100 10S 110

Tyr Gly Cys Gin Tyr Tyr Ser Arg Ala Arg Trp Ser Glu Leu Ser Asp 115 120 125

Pro Leu Vai Leu Vai Met Thr Gly Ala Tyr Pro Lys Pro Thr Leu Ser 130 135 140

Ala Gin Pro Ser Pro Vai Vai Thr Ser Gly Gly Arg Vai Thr Leu Gin 145 ISO 155 1«0

Cys Glu Ser Gin Vai Ala Phe Gly Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly 165 170 175

Glu Asp Glu His Pro Gin Cys Leu Asn Ser Gin Pro His Ala Arg Gly 1B0 185 190

Ser Ser Arg Ala Ile Phe Ser Vai Gly Pro Vai Ser Pro Asn Arg Arg 195 200 205

Trp Ser His Arg Cys Tyr Gly Tyr Asp Leu Asn Ser Pro Tyr Vai Trp 210 215 220

Ser Ser Pro Ser Asp Leu Leu Glu Leu Leu Vai Pro Gly Vai Ser Lys 225 230 235 240

Lys Pro Ser Leu Ser Vai Gin Pro Gly Pro Vai Vai Ala Pro Gly Glu

245 2S0 25S

Ser Leu Thr Leu Gin Cys Vai Ser Asp Vai Gly Tyr Asp Arg Phe Vai 260 265 270

Leu Tyr Lys Glu Gly Glu Arg Asp Leu Arg Gin Leu Pro Gly Arg Gin 275 280 285

Pro Gin Ala Gly Leu Ser Gin Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Vai Ser 290 295 300

Arg Ser Tyr Gly Gly Gin Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala Tyr Asn Leu Ser 305 310 315 320

Ser Glu Trp Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Thr Gly 325 330 335 95 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Gin Ile His Gly Thr Pro Phe Ile Ser Vai Gin Pro Gly Pro Thr Vai 340 345 350

Ala Ser Gly Glu Asn Vai Thr Leu Leu Cys Gin Ser Trp Arg Gin Phe

355 360 36S

His Thr Phe Leu Leu Thr Lys Ala Gly Ala Ala Asp Ala Pro Leu Arg 370 375 380

Leu Arg Ser lie His Glu Tyr Pro Lys Tyr Gin Ala Glu Phe Pro Met 385 390 395 400

Ser Pro Vai Thr Ser Ala His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser 405 410 415

Leu Asn Ser Asp Pro Tyr Leu Leu Ser His Pro Ser Glu Pro Leu Glu 420 425 430

Leu Vai Vai Ser Gly Pro Ser Met Gly Ser Ser Pro Pro Pro Thr Gly 435 440 445

Pro lie Ser Thr Pro Ala Gly Pro Glu Asp Gin Pro Leu Thr Pro Thr 450 4SS 460

Gly Ser Asp Pro Gin Ser Gly Leu Gly Arg His Leu Gly Vai Vai Ile 465 470 475 480

Gly Ile Leu Vai Ala Vai Vai Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 485 490 495

Phe Leu Ile Leu Arg His Arg Arg Gin Gly Lys His Trp Thr Ser Thr 500 505 ' S10

Gin Arg Lys Ala Asp Phe Gin His Pro Ala Gly Ala Vai Gly Pro Glu 515 S20 525

Pro Thr Asp Arg Gly Leu Gin Trp Arg Ser Ser Pro Ala Ala Asp Ala 530 S3S 540

Gin Glu Glu Asn Leu Tyr Ala Ala Vai Lys Asp Thr Gin Pro Glu Asp 545 550 555 560

Gly Vai Glu Met Asp Thr Arg Ala Ala Ala Ser Glu Ala Pro Gin Asp 565 570 575

Vai Thr Tyr Ala Gin Leu His Ser Leu Thr Leu Arg Arg Lys Ala Thr 580 585 590

Glu Pro Pro Pro Ser Gin Glu Arg Glu Pro Pro Ala Glu Pro Ser Ile 595 600 605

Tyr Ala Thr Leu Ala Ile His 610 615 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2388 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc 96 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ (ix) CARACTERÍSTICA:

(Α) ΝΟΜΕ/CHAVE: CDS (Β) LOCALIZAÇÃO: 180..2024 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:17: AAAGAAGTCA ACTTTTCTTC CCCTACTTCC CTGCATTTCT CCTCTGTGCT CACTGCCACA 60 CGCAGCTCAA CCTGGACGGC ACAGCCAGAT GCGAGATGCG TCTCTGCTGA TCTGAGTCTG 120 CCTGCAGCAT GGACCTGGGT CTTCCCTGAA GCATCTCCAG GGCTGGAGGG ACGACTGCC 179 ATG CAC CGA GGG CTC ATC CAT CCG CAG AGC AGG GCA GTG GGA GGA GAC 227 Met Kis Arg Gly Leu Ile His Pro Gin Ser Arg Ala Vai Gly Gly Asp 1 5 10 15 GCC ATG ACC CCC ATC GTC ACA GTC CTG ATC TGT CTC GGG CTG AGT CTG 275 Ala Met Thr Pro Ile Vai Thr Vai Leu Ile Cys Leu Gly Leu Ser Leu 20 25 30 GGC CCC AGG ACC CAC GTG CAG ACA GGG ACC ATC CCC AAG CCC ACC CTG 323 Gly Pro Arg Thr His Vai Gin Thr Gly Thr Ile Pro Lys Pro Thr Leu 35 40 45 TGG GCT GAG CCA GAC TCT GTG ATC ACC CAG GGG AGT CCC GTC ACC CTC 371 Trp Ala Glu Pro Asp Ser Vai Xle Thr Gin Gly Ser Pro Vai Thr Leu 50 55 60 AGT TGT CAG GGG AGC CTT GAA GCC CAG GAG TAC CGT CTA TAT AGG GAG 419 Ser Cys Gin Gly Ser Leu Glu Ala Gin Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu 65 70 75 80 AAA AAA TCA GCA TCT TGG ATT ACA CGG ATA CGA CCA GAG CTT GTG AAG 467 Lys Lys Ser Ala Ser Trp Ile Thr Arg Ile Arg Pro Glu Leu Vai Lys 85 90 95 AAC GGC CAG TTC CAC ATC CCA TCC ATC ACC TGG GAA CAC ACA GGG CGA 515 Asn Gly Gin Phe His Ile Pro Ser Ile Thr Trp Glu His Thr Gly Arg 100 105 110 TAT GGC TGT CAG TAT TAC AGC CGC GCT CGG TGG TCT -GAG CTC AGT GAC 563 Tyr Gly Cys Gin Tyr Tyr Ser Arg Ala Arg Trp Ser Glu Leu Ser Asp 115 120 12S CCC CTG GTG CTG GTG ATG ACA GGA GCC TAC CCA AAA CCC ACC CTC TCA 611 Pro Leu Vai Leu Vai Met Thr Gly Ala Tyr Pro Lys Pro Thr Leu Ser 130 135 140 GCC CAG CCC AGC CCT GTG GTG ACC TCA GGA GGA AGG GTG ACC CTC CAG 659 Ala Gin Pro Ser Pro Vai Vai Thr Ser Gly Gly Arg Vai Thr Leu Gin 145 . 150 155 160 97 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ τατ GAG TCA CAG GTG GCA TTT GGC GGC TTC ATT CTG TGT AAG GAA GGA 707 Cys GlU Ser Gin Vai Ala Phe Gly Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly 165 170 175 GAA GAT GAA CAC CCA CAA TGC CTG AAC TCC CAG CCC CAT GCC CGT GGG 755 Glu Asp Glu His Pro Gin Cys Leu Asn Ser Gin Pro His Ala Arg Gly 180 185 190 TCG TCC CGC GCC ATC TTC TCC GTG GGC CCC GTG AGC CCG ΑΛΤ CGC AGG 303 Ser Ser Arg Ala Ile Phe Ser Vai Gly Pro Vai Ser Pro Asn Arg Arg 195 200 205 TGG TCG CAC AGG TGC TAT GGT TAT GAC TTG AAC TCT CCC TAT GTG TGG 851 Trp Ser His Arg Cys Tyr Gly Tyr Asp Leu Asn Ser Pro Tyr Vai Trp 210 215 220 TCT TCA CCC AGT GAT CTC CTG GAG CTC CTG GTC CCA GGT GTT TCT AAG 899 Ser Ser Pro Ser Asp Leu Leu Glu Leu Leu Vai Pro Gly Vai Ser Lys 225 230 235 240 AAG CCA TCA CTC TCA GTG CAG CCG GGT CCT GTC GTG GCC CCT GGG GAA 947 Lys Pro Ser Leu Ser Vai Gin Pro Gly Pro Vai vai Ala Pro Gly Glu 245 250 255 AGC CTG ACC CTC CAG TGT GTC TCT GAT GTC GGC TAT GAC AGA TTT GTT 995 Ser Leu Thr Leu Gin Cys Vai Ser Asp Vai Gly Tyr Asp Arg Phe Vai 260 265 270 CTG TAC AAG GAG GGG GAA CGT GAC CTT CGC CAG CTC CCT GGC CGG CAG 1043 Leu Tyr Lys Glu Gly Glu Arg Asp Leu Arg Gin Leu Pro Gly Arg Gin 275 280 285 CCC CAG GCT GGG CTC TCC CAG GCC AAC TTC ACC CTG GGC CCT GTG AGC 1091 Pro Gin Ala Gly Leu Ser Gin Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Vai Ser 290 295 300 CGC TCC TAC GGG GGC CAG TAC AGA TGC TAC GGT GCA TAC AAC CTC TCC 1139 Arg Ser Tyr Gly Gly Gin Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala Tyr Asn Leu Ser 305 310 315 320 TCC GAG TGG TCG GCC CCC AGC GAC CCC CTG GAC ATC CTG ATC ACA GGA 1187 Ser Glu Trp Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Thr Gly 325 330 335 CAG ATC CAT GGC ACA CCC TTC ATC TCA GTG CAG CCA GGC CCC ACA GTG 1235 Gin Ile His Gly Thr Pro Phe Ile Ser Vai Gin Pro Gly Pro Thr Vai 340 345 350 GCC TCA GGA GAG AAC GTG ACC CTG CTG TGT CAG TCA TGG CGG CAG TTC 1283 Ala Ser Gly Glu Asn Vai Thr Leu Leu Cys Gin Ser Trp Arg Gin Phe 35S 360 365 CAC ACT TTC CTT CTG ACC AAG GCG GGA GCA GCT GAT GCC CCA CTC CGT 1331 His Thr Fhe Leu Leu Thr Lys Ala Gly Ala Ala Asp Ala Pro Leu Arg 370 375 380 CTA AGA TCA ATA CAC GAA TAT CCT AAG TAC CAG GCT GAA TTC CCC ATO 1379 Leu Arg Ser Xle His Glu Tyr Pro Lys Tyr Gin Ala Glu Phe Pro Met 98 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ 385 390 395 400 AGT CCC GTG ACC TCA GCC CAC GCG GGG ACC TAC AGG TGC TAC GGC TCA 1427

Ser Pro Vai Thr Ser Ala Hia Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser 405 410 415 CTC AAC TCC GAC CCC TAC CTG CTG TCT CAC CCC AGT GAG CCC CTG GAG 1475

Leu Asn Ser Asp Pro Tyr Leu Leu Ser His Pro Ser Glu Pro Leu Glu 420 425 430 CTC GTG GTC TCA GOA CCC TCC ATG GGT TCC AGC CCC CCA CCC ACC GGT 1523

Leu Vai Vai Ser Gly Pro Ser Met Gly Ser Ser Pro Pro Pro Thr Gly 435 440 445 CCC ATC TCC ACA CCT GCA GGC CCT GAG GAC CAG CCC CTC ACC CCC ACT 1571

Pro Ile Ser Thr Pro Ala Gly Pro Glu Asp Gin Pro Leu Thr Pro Thr 450 455 460 GGG TCG GAT CCC CAA AGT GGT CTG GGA AGG CAC CTG GGG GTT GTG ATC 1619

Gly Ser Asp Pro Gin Ser Gly Leu Gly Arg His Leu Gly Vai Vai Ile 465 470 475 480 GGC ATC TTG GTG GCC GTC GTC CTA CTG CTC CTC CTC CTC CTC CTC CTC 1667

Gly Ile Leu Vai Ala Vai Vai Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 485 490 495 TTC CTC ATC CTC CGA CAT CGA CGT CAG GGC AAA CAC TGG ACA TCG ACC 1715

Phe Leu Ile Leu Arg His Arg Arg Gin Gly Lys His Trp Thr Ser Thr SOO 505 510 CAG AGA AAG GCT GAT TTC CAA CAT CCT GCA GGG GCT GTG GGG CCA GAG 1763

Gin Arg Lys Ala Asp Phe Gin His Pro Ala Gly Ala vai Gly Pro Glu 515 520 525 CCC ACA GAC AGA GGC CTG CAG TGG AGG TCC AGC CCA GCT GCC GAC GCC 1811

Pro Thr Asp Arg Gly Leu Gin Trp Arg Ser Ser Pro Ala Ala Asp Ala 530 535 540 CAG GAA GAA AAC CTC TAT GCT GCC GTG AAG GAC ACA CAG CCT GAA GAT 1859

Gin Glu Glu Asn Leu Tyr Ala Ala Vai Lys Asp Thr Gin Pro Glu Asp 545 550 555 560 GGG GTG GAG ATG GAC ACT CGG GCT GCT GCA TCT GAA GCC CCC CAG GAT 1907

Gly Vai Glu Met Asp Thr Arg Ala Ala Ala Ser Glu Ala Pro Gin Asp 565 570 575 GTG ACC TAC GCC CAG CTG CAC AGC TTG ACC CTC AGA CGG AAG GCA ACT 1955

Vai Thr Tyr Ala Gin Leu His Ser Leu Thr Leu Arg Arg Lys Ala Thr 580 585 590 GAG CCT CCT CCA TCC CAG GAA AGG GAA CCT CCA GCT GAG CCC AGC ATC 2003

Glu Pro Pro Pro ser Gin Glu Arg Glu Pro Pro Ala Glu Pro Ser Ile 595 600 605 TAC GCC ACC CTG GCC ATC CAC TAGCCCGGAG GGTACGCAGA CTCCACACTC 2054

Tyr Ale Thr Leu Ala Ile His 610 615 AGTAGAAGGA GACTCAGGAC TGCTGAAGGC ACGGGAGCTG CCCCCAGTGG ACACCAATGA 2114 ACCCCAGTCA GCCTGGACCC CTAACAAAGA CCATGAGGAG ATGCTGGGAA CTTTGGGACT 2174 CACTTGATTC TGCAGTCGAA ATAACTAATA TCCCTACATT TTTTAATTAA AGCAACAGAC 2234 TTCTCAATAA TCAATGAGTT AACCGAGAAA ACTAAAATCA GAAGTAAGAA TGTGCTTTAA 2294 ACTGAATCAC AATATAAATA TTACACATCA CACAATGAAA TTGAAAAAGT ACAAACCACA 2354 AATGAAAAAA GTAGAAACGA AAAAAAAAAA AAAA 2388 99 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 615 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGIA: linear (D) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:18: MeC His Arg Gly Leu ile His Pro Gin Ser Arg Ala Vai Gly Gly Asp 1 S 10 15 Ala Met Thr Pro Ile Vai Thr Vai Leu Ile Cys Leu Gly Leu Ser Leu 20 25 30 Gly Pro Arg Thr His Vai Gin Thr Gly Thr Ile Pro Lys Pro Thr Leu 35 40 45 Trp Ala Glu Pro Asp Ser Vai Ile Thr Gin Gly Ser Pro Vai Thr Leu 50 55 60 Ser Cys Gin Gly Ser Leu Glu Ala Gin Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu 65 70 75 80 Lys Lys Ser Ala Ser Trp Ile Thr Arg Ile Arg Pro Glu Leu Vai Lys 85 90 95 Asn Gly Gin Phe His Ile Pro Ser Ile Thr Trp Glu His Thr Gly Arg 100 10S 110 Tyr Gly Cys Gin Tyr Tyr Ser Arg Ala Arg Trp Ser Glu Leu Ser Asp 115 120 125 Pro Leu Vai Leu Vai Met Thr Gly Ala Tyr Pro Lys Pro Thr Leu Ser 130 135 140 Ala Gin Pro Ser Pro Vai Vai Thr Ser Gly Gly Arg Vai Thr Leu Gin 145 150 155 160 Cys Glu Ser Gin Vai Ala Phe Gly Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly 165 170 175

Arg Gly

Glu Asp Glu His Pro Gin Cys Leu Asn Ser Gin Pro His Ala 180 18S 190 100 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Ser Ser Arg Ala Ile Phe 195 Trp Ser His Arg Cys Tyr 210 Ser Ser Pro ser Asp Leu 22S 230 Lys pro Ser Leu Ser Vai 245 Ser Leu Thr Leu Gin Cys 260 Leu Tyr Lys Glu Gly Glu 275 Pro Gin Ala Gly Leu Ser 290 Arg Ser Tyr Gly Gly Gin 305 310 Ser Glu Trp Ser Ala Pro 325 Gin Ile His Gly Thr Pro 340 Ala Ser Gly Glu Asn Vai 355 His Thr Phe Leu Leu Thr 370 Leu Arg Ser Ile His Glu 385 390 Ser Pro Vai Thr Ser Ala 405 Leu Asn Ser Asp Pro Tyr 420 Leu Vai Vai Ser Gly Pro 435 Pro Ile Ser Thr Pro Ala 450 Gly Ser Asp Pro Gin Ser 465 470 Gly Ile Leu Vai Ala Vai 485 Phe Leu He Leu Arg His 500

Ser Vai Gly Pro Vai Ser Pro Asn Arg Arg 200 205

Gly Tyr Asp Leu Asn Ser Pro Tyr Vai Trp 215 220

Leu Glu Leu Leu Vai Pro Gly Vai Ser Lys 235 240

Gin Pro Gly Pro Vai Vai Ala Pro Gly Glu 250 255

Vai Ser Asp Vai Gly Tyr Asp Arg Phe Vai 265 270

Arg Asp Leu Arg Gin Leu Pro Gly Arg Gin 280 285

Gin Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Vai Ser 295 300

Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala Tyr Asn Leu Ser 315 320

Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Thr Gly 330 335

Phe Ile Ser Vai Gin Pro Gly Pro Thr Vai 345 350

Thr Leu Leu Cys Gin Ser Trp Arg Gin Phe 360 365

Lys Ala Gly Ala Ala Asp Ala Pro Leu Arg 375 380

Tyr Pro Lys. Tyr Gin Ala Glu Phe Pro Met 395 400

His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser 410 41S

Leu Leu Ser His Pro Ser Glu Pro Leu Glu 425 430

Ser Met Gly Ser Ser Pro Pro Pro Thr Gly 440 445

Gly Pro Glu Asp Gin Pro Leu Thr Pro Thr 455 460

Gly Leu Gly Arg His Leu Gly Vai Vai Ile 475 480

Vai Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 490 495

Arg Arg Gin Gly Lys His Trp Thr Ser Thr 505 510 101 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Gin Arg Lys Ala Asp Phe Gin His Pro Ala Gly Ala Vai Gly Pro Glu 515 520 525 Pro Thr Asp Arg Gly Leu Gin Trp Arg Ser Ser Pro Ala Ala Asp Ala 530 535 540 Gin Glu Glu Asn Leu Tyr Ala Ala Vai Lys Asp Thr Gin Pro Glu Asp 545 5S0 555 560 Gly Vai Glu Mec Asp Thr Arg Ala Ala Ala Ser Glu Ala Pro Gin Asp 565 S70 575 Vai Thr Tyr Ala Gin Leu His Ser Leu Thr Leu Arg Arg Lys Ala Thr 580 585 590 Glu Pro Pro Pro Ser Gin Glu Arg Glu Pro Pro Ala Glu Pro Ser Ile 595 600 605 Tyr Ala Thr Leu Ala Zle His 610 615 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2200 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 174..1466 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:19: GTCAACTTTT CTTCCCCTAC TTCCCTGCAT TTCTCCTCTG TGCTCACTGC CACACGCAGC 60 TCAACCTGGA CGGCACAGCC AGATGCGAGA TGCGTCTCTG CTGATCTGAG TCTGCCTGCA 120 GCATGGACCT GGGTCTTCCC TGAAGCATCT CCAGGGCTGG AGGGACGACT GCC ATG 176

Met 1 CAC CGA GGG CTC ATC CAT CCG CAG AGC AGG GCA GTG GGA GGA GAC GCC 224 His Arg Gly Leu lie His Pro Gin Ser Arg Ala Vai Gly Gly Asp Ala S 10 15 ATG ACC CCC ATC GTC ACA GTC CTG ATC TGT CTC GGG CTG AGT CTG GGC 272 Mec Thr Pro Ile Vai Thr Vai Leu Ile Cys Leu Gly Leu Ser Leu Gly 20 25 30 ccc AGG ACC CAC GTG CAG ACA GGG ACC ATC ccc AAG CCC ACC CTG TGG 320 Pro Arg Thr His Vai Gin Thr Gly Thr Ile Pro Lys Pro Thr Leu Trp 35 40 45 102 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ GCT GAG CCA GAC TCT GTG ATC ACC CAG GGG AGT CCC GTC ACC CTC AGT 368 Ala Glu Pro Asp ser Vai Ile Thr Gin Gly Ser Pro Vai Thr Leu Ser 50 55 60 65 TGT CAG GGG AGC CTT GAA GCC CAG GAG TAC CGT CTA TAT AGG GAG AAA 416 cys Gin Gly Ser Leu GlU Ala Gin Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys 70 75 80 ΑΑΑ TCA GCA TCT TGG ATT ACA CGG ATA CGA CCA GAG CTT GTG AAG AAC 464 Lys Ser Ala Ser Trp Ile Thr Arg Ile Arg Pro Glu Leu Vai Lys Asn 85 90 95 GGC CAG TTC CAC ATC CCA TCC ATC ACC TGG GAA CAC ACA GGG CGA TAT 512 Gly Gin Phe His Ile Pro Ser Ile Thr Trp Glu His Thr Gly Arg Tyr 100 105 110 GGC TGT CAG TAT TAC AGC CGC GCT CGG TGG TCT GAG CTC AGT GAC CCC 560 Gly Cys Gin Tyr Tyr Ser Arg Ala Arg Trp Ser Glu Leu Ser Asp Pro 115 120 125 CTG GTG CTG GTG ATG ACA GGA GCC TAC CCA AAA CCC ACC CTC TCA GCC 608 Leu Vai Leu Vai Met Thr Gly Ala Tyr Pro Lys Pro Thr Leu Ser Ala 13C 135 140 145 CAG ccc AGC CCT GTG GTG ACC TCA GGA GGA AGG GTG ACC CTC CAG TGT 656 Gin Pro Ser Pro Vai Vai Thr Ser Gly Gly Arg Vai Thr Leu Gin Cys 150 155 160 GAG TCA CAG GTG GCA TTT GGC GGC TTC ATT CTG TGT AAG GAA GGA GAA 70« Glu Ser Gin Vai Ala Phe Gly Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu 165 170 175 GAT GAA CAC CCA CAA TGC CTG AAC TCC CAG CCC CAT GCC CGT GGG TCG 7S2 Asp Glu His Pro Gin Cys Leu Asn Ser Gin Pro His Ala Arg Gly Ser 180 185 190 TCC CGC GCC ATC TTC TCC GTG GGC CCC GTG AGC CCG AAT CGC AGG TGG 800 Ser Axg Ala ile Phe Ser Vai Gly Pro Vai Ser Pro Asn Arg Arg Trp 195 200 205 TCG CAC AGG TGC TAT GGT TAT GAC TTG AAC TCT CCC TAT GTG TGG TCT 848 Ser His Arg Cys Tyr Gly Tyr Asp Leu Asn ser Pro Tyr Vai Trp Ser 210 215 220 225 TCA CCC AGT GAT CTC CTG GAG CTC CTG GTC CCA GGT GTT TCT AAG AAG 896 Ser Pro Ser Asp Leu Leu Glu Leu Leu Vai Pro Gly Vai Ser Lys Lys 230 235 240 CCA TCA CTC TCA GTG CAG CCS GGT CCT GTC GTG GCC CCT GGG GAA AGC 944 Pro Ser Leu Ser Vai Gin Pro Gly Pro Vai Vai Ala Pro Gly Glu Ser 245 250 255 CTG ACC CTC CAG TGT GTC TCT GAT GTC GGC TAT GAC AGA TTT GTT CTG 992 Leu Thr Leu Gin Cys Vai Ser Asp Vai Gly Tyr Asp Arg Phe Vai Leu 260 265 270 TAC AAG GAG GGG GAA CGT GAC CTT CGC CAG CTC CCT GGC CGG CAG CCC 1040 Tyr Lys Glu Gly Glu Arg Asp Leu Arg Gin Leu Pro Gly Arg Gin Pro 103 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ 275 2Β0 285 CAG GCT GGG CTC TCC CAG GCC AAC TTC ACC CTG GGC CCT GTG AGC CGC 1088 Gin Ala Gly Leu Ser Gin Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Vai Ser Arg 290 295 300 305 TCC TAC GGG GGC CAG TAC AGA TGC TAC GGT GCA TAC AAC CTC TCC TCC 1136 Ser Tyr Gly Gly Gin Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala Tyr Asn Leu Ser Ser 310 315 320 GAG TGG TCG GCC CCC AGC GAC CCC CTG GAC ATC CTG ATC ACA GGA CAG 1184 Giu Trp Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile mk _ U4L Gly VJ4IJ 325 330 335 ATC CAT GGC ACA CCC TTC ATC TCA GTG CAG CCA GGC CCC ACA GTG GCC 1232 Ile His Gly Thr Pro Phe Ile Ser Vai Gin Pro Gly Pro Thr Vai Ala 340 345 350 TCA GGA GAG AAC GTG ACC CTG CTG TGT CAG TCA TGG CGG CAG TTC CAC 1280 Ser Gly Glu Asn Vai Thr Leu Leu Cys Gin Ser Trp Arg Gin Phe His 355 360 365 ACT TTC CTT CTG ACC AAG GCG GGA GCA GCT GAT GCC CCA CTC CGT CTA 1328 Thr Phe Leu Leu Thr Lys Ala Gly Aia Aia Asp Aia pro Leu Arg Leu 370 375 380 385 AGA TCA ATA CAC GAA TAT CCT AAG TAC CAG GCT GAA TTC CCC ATG AGT 1376 Arg Ser Ile His Glu Tyr Pro Lys Tyr Gin Ala Glu Phe Pro MeC Ser 390 395 400 CCT GTG ACC TCA GCC CAC GCG GGG ACC TAC AGG ACC CTC CAT GGG TTC 1424 Pro Vai Thr Ser Ala His Ala Gly Thr Tyr Arg Thr Leu His Gly Phe 40S 410 415 CAG ccc CCC ACC CAC CGG TCC CAT CTC CAC ACC TGC AGG CCC 1466 Gin Pro Pro Thr tfl — (IA» Arg His Leu His 4U4 vjr» Arg Pro 420 425 430 TGAGGACCAG CCCCTCACCC CCACTGGGTC GGATCCCCAA AGTGGTCTGG GAAGGCACCT 1526 GGGGGTTGTG ATCGGCATCT TGGTGGCCGT CGTCCTACTG CTCCTCCTCC TCCTCCTCCT 1586 CTTCCTCATC CTCCGACATC GACGTCAGGG CAAACACTGG ACATCGACCC AGAGAAAGGC 1646 TGATTTCCAA CATCCTGCAG GGGCTGTGGG GCCAGAGCCC ACAGACAGAG GCCTGCAGTG 1706 GAGGTCCAGC CCAGCTGCCG ACGCCCAGGA AGAAAACCTC TATGCTGCCG TGAAGGACAC 1766 ACAGCCTGAA GATGGGGTGG AGATGGACAC TCGGGCTGCT GCATCTGAAG CCCCCCAGGA 1826 TGTGACCTAC GCCCAGCTGC ACAGCTTGAC CCTCAGACGG AAGGCAACTG AGCCTCCTCC 1886 ATCCCAGGAA AGGGAACCTC CAGCTGAGCC CAGCATCTAC GCCACCCTGG CCATCCACTA 1946 GCCCGGAGGG TACGCAGACT CCACACTCAG TAGAAGGAGA CTCAGGACTG CTGAAGGCAC 2006 GGGAGCTGCC CCCAGTGGAC ACCAATGAAC CCCAGTCAGC CTGGACCCCT AACAAAGACC 2066 ATGAGGAGAT GCTGGGAACT TTGGGACTCA CTTGATTCTG CAGTCGAAAT AACTAATATC 2126 CCTACATTTT TTAATTAAAG CAACAGACTT CTCAATAATC AATGAGTTAA CCGAGAAAAC 2186 2200 ΤΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΑΑ 104 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 431 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:20:

Met His Arg Gly Leu Xle His Pro Gin Ser Arg Ala Vai Gly Gly Asp 1 5 10 15 Ala Met Thr Pro Xle Vai Thr Vai Leu Xle Cys Leu Gly Leu Ser Leu 20 25 30 Gly Pro Arg Thr His Vai Gin Thr Gly Thr Ile Pro Lys Pro Thr Leu 35 40 45 Trp Ala Glu Pro Asp Ser Vai Xle Thr Gin Gly Ser Pro Vai Thr Leu 50 55 60 Ser Cys Gin Gly Ser Leu Glu Ala Gin Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu 65 70 75 80 Lys Lys Ser Ala Ser Trp Xle Thr Arg Xle Arg Pro Glu Leu Vai Lys 85 90 95 Asn Gly Gin Phe His Xle Pro Ser Xle Thr Trp Glu His Thr Gly Arg 100 105 110 Tyr Gly Cys Gin Tyr Tyr Ser Arg Ala Arg Trp Ser Glu Leu Ser Asp 115 120 125 Pro Leu Vai Leu Vai Met Thr Gly Ala Tyr Pro Lys Pro Thr Leu Ser 130 135 140 Ala Gin Pro Ser Pro Vai Vai Thr Ser Gly Gly Arg Vai Thr Leu Gin 145 150 155 160 Cys Glu Ser Gin Vai Ala Phe Gly Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly 165 170 175 Glu Asp Glu His Pro Gin Cys Leu Asn ser Gin Pro His Ala Arg Gly ISO 18S 190 Ser Ser Arg Ala Xle Phe Ser Vai Gly Pro Vai Ser Pro Asn Arg Arg 195 200 20S Trp Ser His Arg Cys Tyr Gly Tyr Asp Leu Asn Ser Pro Tyr Vai Trp 210 215 220 105 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Ser Ser Pro Ser Asp Leu Leu Glu Leu Leu Val Pro Gly Val Ser Lys 225 230 235 240 Lys Pro Ser Leu Ser Vai Gin Pro Gly Pro Val Val Ala Pro Gly Glu 245 250 25S Ser Leu Thr Leu Gin Cys Vai Ser Asp Vai Gly Tyr Asp Arg Phe Val 260 265 270 Leu Tyr Lys Glu Gly Glu Arg Asp Leu Arg Gin Leu Pro Gly Arg Gin 275 280 285 Pro Gin Ala Gly Leu Ser Gin Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser 290 295 300

Ser 320 Gly

Arg Ser Tyr Gly Gly Gin Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala Tyz Asn Leu 305 310 315

Ser Glu Trp Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Thr 325 330 335

Gin Ile His Gly Thr Pro Phe Ile Ser Val Gin Pro Gly Pro Thr Val 340 345 350 Ala Ser Gly Glu Asn Val Thr Leu Leu Cys Gin Ser Trp Arg Gin Phe 355 360 365 His Thr Phe Leu Leu Thr Lys Ala Gly Ala Ala Asp Ala Pro Leu Arg 370 375 380 Leu Arg Ser Ile His Glu Tyr Pro Lys Tyr Gin Ala Glu Phe Pro Met 385 390 395 400

Hxs Gly 415 Pro

Ser Pro Vai Thr Ser Ala His Ala Gly Thr Tyr Arg Thr Leu 405 410

Phe Gin Pro Pro Thr His Arg Ser His Leu His Thr Cys Arg 420 425 430 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2790 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 177..2132 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1722 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note= N no nucleótido 1722 pode ser A, C, G, ou T" 106 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:21: GCCACACGCA GCTCAGCCTG GGCGGCACAG CCAGATGCGA GATGCGTCTC TGCTGATCTG 60 AGTCTGCCTG CAGCATGGAC CTGGGTCTTC CCTGAAGCAT CTCCAGGGCT GGAGGGACGA 120 CTGCCATGCA CCGAGGGCTC ATCCATCCAC AGAGCAGGGC AGTGGGAGGA GACGCC 176 ATG ACC CCC ATC o •4 O ACG GTC CTG ATC TGT CTC GGG CTG AGT CTG GGC 224 Met Thr Pro Ile Leu Thr Vai Leu Ile Cys Leu Gly Leu Ser Leu Gly 1 5 10 15 ccc CGG ACC CAC GTG CAG GCA GGG CAC CTC CCC AAG CCC ACC CTC TGG 272 Pro Arg Thr His Vai Gin Ala Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp 20 25 30 GCT GAA CCA GGC TCT GTG ATC ACC CAG GGG AGT CCT GTG ACC CTC AGG 320 Ala GlU Pro Gly Ser Vai Ile Thr Gin Gly Ser Pro Vai Thr Leu Arg 35 40 4S TGT CAG GGG GGC CAG GAG ACC CAG GAG TAC CGT CTA TAT AGA GAA AAG 368 Cys Gin Gly Gly Gin Glu Thr Gin Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys 50 55 60 AAA ACA GCA CCC TGG ATT ACA CGG ATC CCA CAG GAG CTT GTG AAG AAG 416 Lys Thr Ala Pro Trp Ile Thr Arg Ile Pro Gin Glu Leu Vai Lys Lys 65 70 75 80 GGC CAG TTC CCC ATC CCA TCC ATC ACC TGG GAA CAT GCA GGG CGG TAT 464 Gly Gin Phe Pro Ile Pro Ser ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr 85 90 95 CGC TGT TAC TAT GGT AGC GAC ACT GCA GGC CGC TCA GAG AGC AGT GAC 512 Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser Asp Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp 100 105 110 CCC CTG GAG CTG GTG GTG ACA GGA GCC TAC ATC AAA CCC ACC CTC TCA 560 Pro Leu Glu Leu Vai Vai Thr Gly Ala Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser 115 120 125 GCC CAG CCC AGC CCC GTG GTG AAC TCA GGA GGG AAT GTA ACC CTC CAG 608 Ala Gin Pro Ser Pro Vai Vai Asn Ser Gly Gly Asn Vai Thr Leu Gin 130 135 140 TGT GAC TCA CAG GTG GCA TTT GAT GGC TTC ATT CTG TGT AAG GAA GGA 6S6 Cys Asp Ser Gin Vai Ala Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly 145 150 155 160 GAA GAT GAA CAC CCA CAA TGC CTG AAC TCC CAG CCC CAT GCC CGT GGG 704 Glu Asp Glu His Pro Gin Cys Leu Asn Ser Gin Pro His Ala Arg Gly 16S 170 175 TCG TCC CGC GCC ATC TTC TCC GTG GGC CCC GTG AGC CCG AGT CGC AGG 752 Ser Ser Arg Ala Ile Phe Ser Vai Gly Pro Vai Ser Pro Ser Arg Arg 180 185 190 TGG TGG TAC AGG TGC TAT GCT TAT GAC TCG AAC TCT CCC TAT GAG TGG 800 107 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Trp Trp Tyr Arc cya Tyr Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp 195 200 205 TCT CTA CCC Í.JT GAT CTC CTG GAG'CTC CTG GTC CTA GGT GTT TCT AAG 848 Ser Leu Pro er Asp Leu Leu Glu Leu Leu Vai Leu Gly vai ser Lys 210 215 220 AAG CCA tc; CTC TCA GTG CAG CCA GGT CCT ATC GTG GCC CCT GAG GAG 896 Lys Pro Se: Leu ser Vai Gin Pro Gly Pro Ile Vai Ala Pro Glu Glu 225 230 235 240 ACC CTG ;.ct CTG CAG TGT GGC TCT GAT GCT GGC TAC AAC AGA TTT GTT 944 Thr Leu Thr Leu Gin Cys Gly Ser Asp Ala Gly Tyr Asn Arg Phe Vai 245 250 255 CTG TA'. AAG GAC GGG GAA CGT GAC TTC CTT CAG CTC GCT GGC GCA CAG 992 Leu Tyr Lys Asp Gly Glu Arg Asp Phe Leu Gin Leu Ala Gly Ala Gin 260 265 270 CCC CAG GCT GGG CTC TCC CAG GCC AAC TTC ACC CTG GGC CCT GTG AGC 1040 Pro Gin Alá Gly Leu Ser Gin Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Vai Ser 275 280 285 crc TCC TAC GGG GGC CAG TAC AGA TGC TAC GGT GCA CAC AAC CTC TCC 1088 A-g Ser Tyr Gly Gly Gin Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala His Asn Leu Ser 290 295 300 TCC GAG TGG TCG GCC CCC AGC GAC CCC CTG GAC ATC CTG ATC GCA GGA 1136 Ser Glu Trp Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Ala Gly 305 310 315 320 CAG TTC TAT GAC AGA GTC TCC CTC TCG GTG CAG CCG GGC CCC ACG GTG 1184 Gin Phe Tyr Asp Arg Vai Ser Leu Ser Vai Gin Pro Gly Pro Thr Vai 325 330 335 GCC TCA GGA GAG AAC GTG ACC CTG CTG TGT CAG TCA CAG GGA TGG ATS 1232 Ala Ser Gly Glu Asn Vai Thr Leu Leu Cys Gin Ser Gin Gly Trp Met 340 345 350 CAA ACT TTC CTT CTG ACC AAG GAG GGG GCA GCT GAT GAC CCA TGG CGT 1280 Gin Thr Phe Leu Leu Thr Lys Glu Gly Ala Ala Asp Asp Pro Trp Arg 355 360 365 CTA AGA TCA ACG TAC CAA TCT CAA AAA TAC CAG GCT GAA TTC CCC ATG 1328 Leu Arg Ser Thr Tyr Gin Ser Gin Lys Tyr Gin Ala Glu Phe Pro Met 370 375 380 GGT CCT GTG ACC TCA GCC CAT GCG GGG ACC TAC AGG TGC TAC GGC TCA 1376 Gly Pro Vai Thr Ser Ala His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser 385 390 395 400 CAG AGC TCC AAA CCC TAC CTG CTG ACT CAC CCC AGT GAC CCC CTG GAG 1424 Gin Ser Ser Lys Pro Tyr Leu Leu Thr Hls Pro Ser Asp Pro Leu Glu 405 410 415 CTC GTG GTC TCA GGA CCG TCT GGG GGC CCC AGC TCC CCG ACA ACA GGC 1472 Leu Vai Vai Ser Gly Pro Ser Gly Gly Pro Ser Ser Pro Thr Thr Gly 420 425 430 108 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ CCC ACC TCC ACA TCT GGC CCT GAG GAC CAG CCC CTC ACC CCC ACC GGG 1520 pro Thr Ser Thr Ser Gly Pro Glu Asp Gin Pro Leu Thr Pro Thr Gly 435 440 445 TCG GAT CCC CAG AGT GGT CTG GGA AGG CAC CTG GGG GTT GTG ATC GGC 1568 Ser Asp Pro Gin Ser Gly Leu Gly Arg His Leu Gly Vai Vai Ile Gly 450 455 460 ATC TTG GTG GCC GTC ATC CTA CTG CTC CTC CTC CTC CTC CTC CTC TTC 1616 Ile Leu Vai Ala Vai Ile Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe 465 470 475 480 CTC ATC CTC CGA CAT CGA CGT CAG GGC AAA CAC TGG ACA TCG ACC CAG 1664 Leu Ile Leu Arg His Arg Arg Gin Gly Lys His Trp Thr Ser Thr Gin 485 490 495 AGA AAG GCT GAT TTC CAA CAT CCT GCA GGG GCT GTG GGG CCA GAG CCC 1712 Arg Lys Ala Asp Phe Gin His Pro Ala Gly Ala Vai Gly Pro Glu Pro 500 505 510 ACA GAC AGA NGC CTC CAG TGG AGG TCC AGC CCA GCT GCC GAT GCC CAG 1760 Thr Asp Arg Arg Leu Gin Trp Arg Ser Ser Pro Ala Ala Asp Ala Gin 515 520 525 GAA GAA AAC CTC TAT GCT GCC GTG AAG CAC ACA CAG CCT GAG GAT GGG 1808 Glu Glu Asn Leu Tyr Ala Ala Vai Lys His Thr Gin Pro Glu Asp Gly S30 53S 540 GTG GAG ATO GAC ACT CGG CAG AGC CCA CAC GAT GAA GAC CCC CAG GCA 1856 Vai Glu Met Asp Thr Arg Gin Ser Pro His Asp Glu Asp Pro Gin Ala 545 550 555 560 GTG ACG TAT GCC GAG GTG AAA CAC TCC AGA CCT AGG AGA GAA ATG GCT 1904 Vai Thr Tyr Ala Glu Vai Lys His Ser Arg Pro Arg Arg Glu Met Ala 565 570 575 TCT CCT CCT TCC CCA CTG TCT GGG GAA TTC CTG GAC ACA AAG GAC AGA 19S2 Ser Pro Pro Ser Pro Leu Ser Gly Glu Phe Leu Asp Thr Lys Asp Arg 580 585 590 CAG GCG GAA GAG GAC AGG CAG ATG GAC ACT GAG GCT GCT GCA TCT GAA 2000 Gin Ala Glu Glu Asp Arg Gin Met Asp Thr Glu Ala Ala Ala Ser Glu 595 600 605 GCC CCC CAG GAT GTG ACC TAC GCC CAG CTG CAC AGC TTG ACC CTT AGA 2048 Ala Pro Gin Asp Vai Thr Tyr Ala Gin Leu His Ser Leu Thr Leu Arg 610 615 620 CGG AAG GCA ACT GAG CCT CCT CCA TCC CAG GAA GGG CCC TCT CCA GCT 2096 Arg Lys Ala Thr Glu Pro Pro Pro Ser Gin Glu Gly Pro Ser Pro Ala 625 630 635 640 GTG CCC AGC ATC TAC GCC ACT CTG GCC ATC CAC TAG CCCAGGGGGG 2142 Vai Pro Ser Ile Tyr Ala Thr Leu Ala Ile His 645 650 GACGCAGACC CCACACTCCA TGGAGTCTGG AATGCATGGG AGCTGCCCCC CCAGTGGACA 2202 CCATTGGACC CCACCCAGCC TGGATCTACC CCAGGAGACT CTGGGAACTT TTAGGGGTCA 2262 109 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ CTCAATTCTG CAGTATAAAT AACTAATGTC TCTACAATTT TGAAATAAAG CAACAGACTT 2322 CTCAATAATC AATGAAGTAG CTGAGAAAAC TAAGTCAGAA AGTGCATTAA ACTGAATCAC 2382 AATGT ΑΛΑΤΑ TTACACATCA AGCGATGAAA CTGGAAAACT ACAAGCCACG AATGAATGAA 2442 TTAGGAAAGA AAAAAAGTAG GAAATGAATG ATCTTGGCTT TCCTATAAGA AATTTAGGGC 2502 AGGGCACGGT GGCTCACGCC TGTAATTCCA GCACTTTGGG AGGCCGAGGC GGGCAGATCA 2S62 CGAGTTCAGG AGATCGAGAC CATCTTGGCC AACATGGTGA AACCCTGTCT CTCCTAAAAA 2622 TACAAAAATT AGCTGGATGT GGTGGCAGTG CCTGTAATCC CAGCTATTTG GGAGGCTGAG 2682 GCAGGAGAAT CGCTTGAACC AGGGAGTCAG AGGTTTCAGT GAGCCAAGAT CGCACCACTG 2742 CTCTCCAGCC TGGCGACAGA GGGAGACTCC ATCTCAAATT ΑΑΑΑΑΑΑΑ 2790 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 652 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:22:

MeC Thr Pro Xle Leu Thr Vai Leu lie Cys Leu Gly Leu Ser Leu Gly 1 5 10 15

Pro Arg Thr' His Vai Gin Ala Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp 20 25 30

Ala Glu Pro Gly Ser Vai Xle Thr Gin Gly Ser Pro Vai Thr Leu Arg 35 40 45

Cys Gin Gly Gly Gin Glu Thr Gin Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys 50 55 60

Lys Thr Ala Pro Trp Ile Thr Arg Zle Pro Gin Glu Leu Vai Lys Lys 65 70 75 80

Gly Gin Phe Pro Xle Pro Ser Xle Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr 85 90 95

Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser Asp Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp 100 105 110

Pro Leu Glu Leu Vai Vai Thr Gly Ala Tyr Xle Lys Pro Thr Leu Ser 115 120 125

Ala Gin Pro Ser Pro Vai Vai Asn Ser Gly Gly Asn Vai Thr Leu Gin 130 135 140

Cys Asp Ser Gin-Vai Ala Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly 110 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ 145 ISO 155 160 Glu Asp Glu His Pro Gin Cys Leu Asn Ser Gin Pro His Ala Arg Gly 165 170 175 Ser Ser Arg Ala Zle Phe Ser Vai Gly Pro Vai Ser Pro Ser Arg Arg 180 185 190 Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp 195 200 205 Ser Leu Pro Ser Asp Leu Leu Glu Leu Leu Vai Leu Gly Vai Ser Lys 210 215 220 Lys Pro Ser Leu Ser Vai Gin Pro Gly Pro Ile Vai Ala Pro Glu Glu 225 230 235 240 Thr Leu Thr Leu Gin Cys Gly Ser Asp Ala Gly Tyr Asn Arg Phe Vai 245 250 255 Leu Tyr Lys Asp Gly Glu Arg Asp Phe Leu Gin Leu Ala Gly Ala Gin 260 265 270 Pro Gin Ala Gly Leu Ser Gin Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Vai Ser 275 280 285 Ar? Ser Tyr Gly Gly Gin Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala His Asn Leu Ser 290 295 300 Ser Glu Trp Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu ASp Ile Leu Ile Ala Gly 305 310 315 320 Gin Phe Tyr Asp Arg Vai Ser Leu Ser Vai Gin Pro Gly Pro Thr Vai 325 330 335 Ala Ser Gly Glu Asn Vai Thr Leu Leu Cys Gin Ser Gin Gly Trp Met 340 345 350 Gin Thr Phe Leu Leu Thr Lys Glu Gly Ala Ala Asp Asp Pro Trp Arg 355 360 365 Leu Arg Ser Thr Tyr Gin Ser Gin Lys Tyr Gin Ala Glu Phe Pro Met 370 375 380 Gly Pro Vai Thr Ser Ala His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly ser 385 390 395 400 Gin Ser Ser Lys Pro Tyr Leu Leu Thr His Pro Ser Asp Pro Leu Glu 405 410 415 Leu Vai Vai Ser Gly Pro Ser Gly Gly Pro Ser Ser Pro Thr Thr Gly 420 425 430 Pro Thr Ser Thr Ser Gly Pro Glu Asp Gin Pro Leu Thr Pro Thr Gly 435 440 445 Ser Asp Pro Gin Ser Gly Leu Gly Arg His Leu Gly Vai Vai Zle Gly 450 455 460 111 ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ

Xle Leu Vel Ala Vai Ile Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe 465 470 475 4B0

Leu Ile Leu Arg His Arg Arg Gin Gly Lys His Trp Thr Ser Thr Gin 485 490 495

Arg Lys Ala Asp Phe Gin His Pro Ala Gly Ala Vai Gly Pro Glu Pro 500 505 510

Thr Asp Arg Arg Leu Gin Trp Arg Ser Ser Pro Ala Ala Asp Ala Gin 515 520 525

Glu Glu Asn Leu Tyr Ala Ala Vai Lys His Thr Gin Pro Glu Asp Gly 530 535 540

Vai Glu Met Asp Thr Arg Gin Ser Pro His Asp Glu Asp Pro Gin Ala 545 550 55S 560

Vai Thr Tyr Ala Glu Vai Lys His Ser Arg Pro Arg Arg Glu Met Ala 565 570 575

Ser Pro Pro Ser Pro Leu Ser Gly Glu Phe Leu Asp Thr Lys Asp Arg 580 585 590

Gin Ala Glu Glu Asp Arg Gin Met Asp Thr Glu Ala Ala Ala Ser Glu 595 600 605

Ala Pro Gin Asp Vai Thr Tyr Ala Gin Leu His Ser Leu Thr Leu Arg 610 615 620

Arg Lys Ala Thr Glu Pro Pro Pro Ser Gin Glu Gly Pro Ser Pro Ala 625 630 635 640

Vai Pro Ser Ile Tyr Ala Thr Leu Ala Ile His * 645 650

Lisboa, 2010-04-27

Claims (27)

1. ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido substancialmente puro ou recombinante compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos de comprimento completo apresentada em SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 10, caracterizado por partilhar similaridade imunogénica ou antigénica ou reactividade cruzada com uma sequência correspondente em SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:10.
2. 2. Polipéptido substancialmente puro ou recombinante compreendendo a sequência de aminoácidos madura de SEQ ID NO: 6.
3. 3. Polipéptido substancialmente puro ou recombinante compreendendo a sequência de aminoácidos madura de SEQ ID NO:10.
4. 4. Polipéptido substancialmente puro ou recombinante compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 6 .
5. 5. Polipéptido substancialmente puro ou recombinante compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:10.
6. 6. Proteina de fusão compreendendo o polipéptido de qualquer das reivindicações 1-5 e uma proteina heteróloga.
7. 7. Proteina de fusão da reivindicação 6 em que a proteina heteróloga é um marcador de detecção ou de purificação.
8. 8. Composição compreendendo a proteina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5 e um transportador.
9. 9. Ácido nucleico isolado que codifica o polipéptido de qualquer uma das reivindicações 1-5.
10. 10. Ácido nucleico da reivindicação 9 compreendendo uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo que consiste em: ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ 2/4 nucleótidos 155-1015 de SEQ ID NO:5; nucleótidos 69-929 de SEQ ID NO:7; nucleótidos 24-428 de SEQ ID NO:9; e nucleótidos 87-428 de SEQ ID NO:9.
11. 11. Ácido nucleico isolado da reivindicação 9 compreendendo uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:5, 7 e 9.
12. 12. Ácido nucleico isolado que codifica uma proteína de fusão compreendendo um ácido nucleico da reivindicação 9 e um ácido nucleico que codifica uma proteína heteróloga.
13. 13. Ácido nucleico da reivindicação 12 em que a proteína heteróloga é um marcador de detecção ou um marcador de purificação.
14. 14. Vector de expressão compreendendo o ácido nucleico da reivindicação 9.
15. 15. Célula hospedeira compreendendo o vector da reivindicação 14.
16. 16. Anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antigénio que se liga especificamente a um polipéptido de qualquer das reivindicações 1-5.
17. 17. Anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antigénio da reivindicação 16 que é um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:6 e 10.
18. 18. Anticorpo monoclonal isolado da reivindicação 17 que se liga especificamente a um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:6.
19. 19. Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio de qualquer das reivindicações 16 ou 17 e um transportador farmaceuticamente aceitável. ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ 3/4
20. 20. Anticorpo de qualquer das reivindicações 16 ou 17 que compreende um anticorpo monoclonal, um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2 ou um anticorpo de cadeia única.
21. 21. Composição compreendendo: (a) um anticorpo de qualquer das reivindicações 16 ou 17 em forma estéril; ou (b) um anticorpo de qualquer das reivindicações 16 ou 17 e um transportador, em que o referido transportador é água, solução salina ou tampão.
22. 22. Kit compreendendo: (a) um compartimento compreendendo o anticorpo de qualquer das reivindicações 16 ou 17; e (b) instruções para utilização ou para eliminação de reagentes.
23. 23. Anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antigénio que se liga especificamente a um polipéptido de acordo com qualquer das reivindicações 1-5 para tratar uma doença ou condição médica seleccionada entre uma resposta auto-imune, uma rejeição de transplante e uma condição inflamatória.
24. 24. Utilização de um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antigénio que se liga especif icamente a um polipéptido de acordo com qualquer das reivindicações 1-5 para o fabrico de um medicamento para tratar uma doença ou condição médica seleccionada entre uma resposta auto-imune, uma rejeição de transplante e uma condição inflamatória.
25. 25. Processo para produzir recombinantemente um polipéptido compreendendo a cultura da célula hospedeira da reivindicação 15 sob condições nas quais o polipéptido é expresso.
26. 26. Método para inibir a morte celular por uma célula NK in vitro compreendendo pôr em contacto a célula NK com um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio de acordo com qualquer das reivindicações 16 ou 17 em que o referido anticorpo ou fragmento inibe YE01 (DLAIR-1). ΕΡ Ο 948 623/ΡΤ 4/4
27. 27. Método para obter um anticorpo que se liga especificamente a um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO:6 ou 10, compreendendo a imunização de um animal capaz de produzir o referido anticorpo com o referido polipéptido e o isolamento do anticorpo a partir do animal. Lisboa, 2010-04-27