PT94458B - Processo para a preparacao de moleculas de adn que originam regioes vp1/p2a modificadas do sistema rinoviral - Google Patents

Description

MEMÓRIA DBSCRITIVA

DA

PATENTE DE INVENÇÃO NC94 458 NOME: BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GMBH, alemã, com sede em D-6507 Ingelheim am Rhein, República Federal Alemã EPÍGRAFE:"PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE MOLÉCULAS DE ADN QUE ORIGINAM REGIÕES VP1/P2A MODIFICADAS DO SISTEMA RINOVIRAL" INVENTORES:Dr. Wolfgang Sommergruber, Dr. Peter Volkmann, Dipl. Ing. Friederike Fessl, Dr. Ingrid Maurer--Fogy, Dr. Erbst Kuechler, Dipl. Ing. Dr. Dieter Blaas, Dr. Timothy Skern, Mag. Manfred Zorn e Ing. Herbert Auer, residentes na Áustria

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo dp artigo 4Q da Convenção da União de Paris de 20 de Março de 1883.

República Federal Alemã - 25 de Junho de 1989 e 8 de Junho de 1990, sob os nQS. P 39 20 860. 5 e P 40 18 376.9.

Descrição referente à patente de invenção de BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GMBH, alemã, industrial e comercial, com sede em D-6507 Ingelheim am Rhein, República Federal Alemã, (inventores: Dr. Wolfgang Sommergruber, Dr. Pe-ter Volkmann, Dipl. Ing. Friederi-ke Fessl, Dr. Ingrid Maurer-Fogy, Dr. Erbst Kuechler, Dipl. Ing. Dr. Dieter Blaas, Dr. Timothy Skern, Mag. Manfred Zorn e Ing. Herbert Auer, residentes na Áustria) para "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE MOLÉCULAS DE ADN QUE ORIGINAM REGIÕES VP1/P2A MODIFICADAS DO SISTEMA RI-NOVIRAL".

Descrição São objecto da presente invenção sistemas que possibilitam introduzir mutações na região VP1/2A e na região de codificação total da protease 2A, sistemas de ensaio com os quais se pode investigar a actividade "cis" e "trans", os oligonucleó-tidos que codificam as mutações, assim como oligopéptidos deles derivados e a sua utilização. São ainda objecto da presente invenção os oligopéptidos que são eliminados pela protease 2A in trans com eficiência diferente, assim como a sua utilização.

Os rinovírus são vírus ss(+)ARN e representam uma classe dentro dos picornavirídios (P. D. Cooper e col., 1978, Inter-virology 10^, 165 - 180; M. R. MacNaughton, Current Top. Microbiol. Immunol. 9_7, 1 - 26).

Eles estão largamente difundidos, atacam as vias respi-

anaI - 1 -

ratórias superiores do homem e originam infecções agudas que originam constipações, tosse, rouquidão, etc, que geralmente se designam como resfriados (E. J. Stott e R. A. Killington, 1972, Ann. Rev. Microbiol, 26^ 503 - 524).

As infecções por rinovírus contam-se entre as doenças mais frequentes do homem. A doença evolui, na realidade, na maior parte das vezes de maneira inofensiva, entanto, origina - condicionadas por enfraquecimento passageiro do organismo -infecções secundárias por outros vírus ou bactérias que têm como consequência estados de doença graves.

Dos cerca de cento e quinze sorotipos conhecidos diferentes de rinovírus humanos, clonaram-se até agora e sequencia-ram-se completamente quatro sorotipos (HRV 1B, 2, 14 e 89): Pedido de Patente de Invenção Alemã P 35 05 148.5; T. Skern e col. 1985, Nucleic Acids Res. 13_, 2111 - 2126; M. Duchler e col., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84^, 2605 - 2609; G. Stanway e col., 1984, Nucleic Acids Res. _12, 7859 - 7877; P. L. Callahan e col., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82^, 732 - 736; R. Hughes e col., 1988, J. Gen. Virol. 69_, 49 - 58).

Dificilmente um outro sistema de vírus é, na sua regulação do avanço da infecção, tão dependente de uma proteólise controladamente limitada como o dos picornavirídios. O (+)ARN de cadeia única genómica dos rinovírus é, pouco tempo depois da infecção, modificado por eliminação do oligopéptido VPg ligado à extremidade 5' e serve como nARN para a síntese de uma poli-proteína que abrange toda a zona de leitura contínua da sequência do ácido nucleico (B. E. Butterworth, 1973, Virology 56, 439 - 453; C. McLean e R. R. Rueckert, 1973, J. Virol. 11, 341--344; C. McLean e col., 1976 , J. Virol. _19, 903 - 914).

As proteínas maduras dos vírus obtêm-se exclusivamente por eliminação proteolítica a partir desta poliproteína, em que as proteases activas são elas próprias componentes desta poliproteína. A primeira fase neste processamento é a libertação dos precursores das proteínas de revestimento, que é realizada pela protease p2A. Na ordem de sequência dos genes, a sequência da protease p2A fica imediatamente depois da porção que codifica 2 as proteínas do revestimento. A p2A é, por consequência, a primeira função do vírus que é detectável enzimaticamente por cause, da sua localização na poliproteína. Ela separa-se mesmo do precursor das proteínas de revestimento e é responsável pela separação do precursor das cápsides pl do resto da poliproteína (actividade "cis"). A separação da região da proteína do revestimento do troço responsável pela replicação realiza-se já durante a translação da poliproteína. No poliovírus, esta separação primária pode ser realizada "in vitro" na região P1-P2 intei-molecular, isto é, "in trans" pela protease 2A madura (H.-G. Kráusslich e E. Wimmer, 1988# Ann. Rev. Biochem. 57, 701 - 754).

Esta fase é essencial para o posterior desenvolvimento da infecção por vírus (compartimentação da replicação e conjunto do vírus). No caso dos cardiovírus e dos afto-vírus, ao contrário do que acontece com os poliovírus, esta separação é catalisada pela protease 3C (H.-G. Kráusslich e E. Wimmer, 1988, loc. cit.).

No sistema dos poliovírus sabe-se que, realmente, todas as enzimas que participam nesta eliminação de amadurecimento são viralmente codificadas (H. Toyoda e col.,1986 Cell 45 , 761 - 770). Nos poliovírus encontram-se três tipos de sinais de separação; os sítios Q-G utilizados na maior parte dos casos que são conhecidos pela protease dos vírus p3C e o sítio Y-G que é utilizado como sinal de reconhecimento de P2A.

Em primeiro lugar, a protease p3C moveu-se para o ponto médio de interesse no esclarecimento do processamei to proteólítico de picornavírus. Já muito prematuramento, se pode descrever uma actividade proteolítica equivalente a p3C em EMC (H.R.B. Pelham, 1978, Eur. J. Biochem. 8j>, 457 - 461; A. C. Palmenberg e col., 1979, J. Virol. 32, 770 - 778).

No decurso de outros ensaios, verificou-se que o péptido principal (L) do cardiovírus (por exemplo, EMCV) e de aftovirus (por exemplo, FMDV), que não existe nos rinovírus e nos enterovírus, toma parte no processamento proteolítico de EMCV (A.C. Palmenberg, 1987, J. Cell. Biochem, .33, 1191 - 1198). 3

Em outra série de ensaios, pôde verificar-se, pelo isolamento de polio P3C e com auxílio de métodos imunológicos, que P3C se corta a si própria autocataliticamente a partir da poli-proteína para, em seguida, atacar "in trans" todos os sítios potenciais de eliminação Q-G. A inserção de sistemas recombinantes que, entre outras representavam a região de P3C, possibilitou a expressão de P3C por alguns enterovírus e rinovírus (G. Werner e col., 1986, J. Virol. 5_7, 1084 - 1093) e a caracterização exacta do P3C de poliovírus (R. Hanecak e col., 1984, Cell 3_7, 1037 - 1073; B. D. Korant e T. Towatari, 1986, Biomed. Biochim. Acta 45_, 1529 -- 1535), assim como a função proteolítica equivalente em FMDV (W. Klump e col., 1984 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8_1, 3351-3355; J. N. Burroughs e col., 1984, J. Virol. 50_, 878 - 883).

Por estudos de mutagénese realizados "in vitro", pôde verificar-se que a troca da cisteína dos aminoácidos altamente conservados (posição 47) e histidina (posição 161) em P3C de poliovírus origina uma enzima inactiva, enquanto a mutação da cisteína não conservada (posição 153) não tem qualquer influência digna de menção sobre a actividade proteolítica de polio--P3C. Esta mutagénese realizada por oligonucleótidos de P3C recombinante e os estudos de inibição realizados adicionalmente permitem chegar à conclusão de que a polio-P3C pertence à classe das cisteíno-proteases (L. A. Ivanoff e col., 1986, Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 83, 5392 - 5396).

De igual forma, por mutagénese realizada "in vitro" de polio-P3C (e, na realidade, por troca da valina conservada por alanina na posição 54 da protease), pôde verificar-se que esta mutação no cADN de "tamanho completo" ("full size") de polio depois da transfecção em células COS 1 origina um vírus deficiente em polimerase (P. G. Dewalt e B. L. Semler, 1987, J. Virol. 61, 2162 - 2170).

Na verdade, anticorpos que foram desenvolvidos contra polio-P3C ligaram-se nitidamente na parte inferior em todas as separações realizadas em Q-G, mas não à eliminação entre Y-G (R. Hanecak e col., 1982, Proc. Natl, Acad. Sei. USA _79, 3973- 4

'mC ,Γ - 3977). Esta observação permitiu chegar à conclusão de que o processamento prbteolítico em sítios Y-G necessita uma protease apropriada. 0 sítio desta segunda actividade proteolítica foi possível ser colocada nitidamente em P2A no poliovírus. Foi interessante a descoberta de que P2A realiza uma separação alternativa na região de protease-polimerase (3CD), que, igualmente, tem lugar no sítio Y-G e origina as enzimas inactivas 3C e 3D. Esta separação serve possivelmente para a regulação quantitativa das enzimas 3C e 3D (C. K. Lee e E. Wimmer, 1988, Virol. 166, 1435 - 1441).

Como, durante a infecção com poliovírus em células HeLa, sechega muito rapidamente a uma interrupção da síntese da proteína activa, a translação do ARN do poliovírus pode, no entanto, realizar-se sem quaisquer impedimento, chegou-se à conclusão de que um ou mais factores de regulação da translação se alteram durante a infecção.

Com efeito, as experiências mostram que o factor de iniciação eucariótico 4F é alterado por separação proteolítica dos componentes p220 durante a infecção com poliovírus nas células HeLa (D. Etchison e col. , 1984, J. Virol. 51^ 832 - 837; D. Etchison e col., 1982, J. Biol. Chem. 257, 14806 - 14810). Em seguida, foi possível verificar que P2A é indirectamente responsável por esta modificação de p220 em células infectadas (H. G. Krausslich e col., 1987, J. Virol. 61, 2711 - 2718; R. E. Lloyd e col., 1986, Virol 150, 299 - 303; R. E. Lloyd e col., 1987, J. Virol 61, 2450 - 2488). Só recentemente se pôde confirmar que nas células infectadas por rinovírus se realiza igualmente a degradação de p220 (H.-G. Krausslich, dados ainda não publicados). Foi possível responder positivamente à pergunta sobre a actividade "trans" da protease P2A no sistema de poliovírus, segundo a qual, por inserções e eliminações em P2A, se pôde exprimir uma região Pl--P2 não processada em E. coli, que foram expressas por P2A a partir de células infectadas com poliovírus (M. J. H. Nicklin e col., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1987, 84, 4002 - 4006), P2A que foi transladado "in vitro" (H.-G. Krausslich e col., 1987, J. Virol. _61, 2711 - 2718) ou expresso em E. coli ou pôde ser 5 separado com uma proteína 2A de poliovírus (Konig e B. Rosenwirth, 1988, J. Virol. S2_, 1243 - 1250). Por produção em larga escala de polio 3C recombinante em E. coli e purificação desta protea-se, pôde ser demonstrada a eficiência específica de separação com utilização de substratos naturais e sintéticos "in vitro" (M. J. H. Nicklin e col., 1988, J. Virol. 62_, 4586 - 4593).

Juntamente com a actividade "cis", foi também demonstrada num sistema de rinovírus uma actividade "trans" da protea-se 2A por separação específica de um substrato de péptido que representa a região de separação natural entre VP1 e 2A (W. Som-mergruber e col., 1989, Virol. 169, 68 - 77). Ainda foi possível verificar-se por clonação e expressão da protease 3C de HRV14 num sistema de células maxi e E. coli que o rino 3C em sistemas recombinantes é proteoliticamente activo, um precursor de 3C "in trans" é responsável pela libertação de 3C e que ZnC^ inibe especificamente o processamento das formas precursoras 3C (K. C. Cheah e col., 1988, Gene 69^, 265 - 274). Ainda foi possível demonstrar em extractos de E. coli que continham a protease 3C de HRV14, a libertação específica de um substrato de péptido (R. T. Libby e col., 1988, 2_7, 6262 - 6268). A protease 3C, tal como 2A, está em posição de se eliminar autocataliticamente da poliproteína (R. Hanecak e col., 1984, loc. cit.). Neste caso, prefere-se nitidamente a posição de eliminação da extremidade amino em relação à extremidade car-boxi. Ainda se pode observar uma afinidade diferente para outros sítios de separação. Para a separação do precursor da proteína capsídica PI em 1ABC e 10 chega 3C; a posterior separação em 1AB e 1C necessita o complexo 3CD, a protease com a replicase da extremidade carboxi. Em poliovírus, a especificidade do substrato da protease 3C possivelmente modula por meio da polimerase 3D através de alterações estruturais (J. Jore e col., 1988, J.

Gen. Virol. 69^, 1627 - 1636; M. F. Ypma-Wong e col., 1988, Virol. 166, 265 - 270).

Uma comparação das sequências de aminoácidos das proteínas individuais mostra que as enzimas do vírus são conservadas de maneira especial. Assim verifica-se aproximadamente uma homologia entre a protease P2A de HRV89 e HRV2 igual a cerca de 6

85%; na protease p3C, são idênticos 75% dos aminoácidos (M. Du-chler e col., 1987, loc. cit.)· Estes valores são nitidamente superiores às percentagens observadas em média na proteína totaL. Pode concluir-se, portanto, que exactamente as enzimas do vírus são especialmente bem conservadas durante a evolução e são semef lhantes, no que diz respeito às suas propriedades, a diversos rinovírus. são também interessantes as descobertas de que duas das proteínas semelhantes às proteases de picornavírus p3C e P2A se encontraram no sistema de vírus de plantas dos comovirí-dios (Vírus do Mosaico do feijão da China) (J. A. Garcia e col. > 1987, Virology 159, 67 - 75; J. Verver e col., 1987, EMBO, J5, 549 - 554).

Estas duas proteínas de vírus são participadas no processamento proteolítico das duas moléculas de ss(+)ARN empacotadas separadamente (ARN B e M) de proteínas codificadas, em que se garante uma grande semelhança das duas proteases de Mosaico de feijão da china na sequência e na espcificidade de separação com os picornavírus. Esta homologia notável de proteínas não estruturais entre picornavírus e comovírus aponta não só para num parentesco genético entre estas duas famílias de vírus, mas também mostra como é essencial o processamento proteolítico dos vírus para estas duas famílias de vírus. 0 terceiro tipo da separação por amadurecimento dos vírus, nomeadamente a de VPO (proteína precursora de VP2 e de VP4), pode ser descrita, no caso dos mengovírus e dos rinovírus, com o auxílio dos dados da estrutura de raios X. Este último acontecimento proteolítico na maturação do vírus parece dever--se a um tipo de protease invulgarmente autocatalítica em que grupos básicos do ARN de vírus são participados na formação do centro catalítico em que estes grupos básicos funcionam como aceitadores de protões (EArnold e col., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 21 - 25). No caso do FMDV (R. Acharya e col., 1989. Nature 337, 709 - 716), a estrutura cristalina, no entanto, não dá quaisquer indicações sobre tal mecanismo nos aftovírus.

As posições de separação das proteases de vírus foram 7

determinadas no sistema de poliovírus por sequenciamento da extremidade N da maior parte das proteínas de poliovírus (Μ. A. Pallansch e col. , 1984, J. Virol. A9_, 873 - 880). A posição dos sítios de corte de HRV2 entre VP4/VP2, VP2/VP3, assim como VP3/VP1 pôde ser determinada por sequenciamento da extremidade N de VP2, VP3 e VPl. O sinal de separação entre VP1 e P2A foi determinado, por um lado, por sequenciamento da extremidade C de VPl (H. Kowalski e col., 1987, J. Gen. Virol. 8_6, 3197 - 3200) e, por outro lado, por análise de sequenciamento da extremidade N de P2A (W. Sommergruber e col., 1989, loc. cit.).

Além disso, foi possível, por clonação e sequenciamento de HRV2 (T. Skern e col., 1985, Nucleic Acids Res. 1_3, 2111-- 2126) e com base nas comparações de sequências com poliovírus e HRV14, derivar a maior parte dos sítios de separação. Assim, em HRV2, foi possível encontrar cinco sinais diferentes de separação : Q-S, Q-G, Q-N, A-G e E-S.

As proteases de cisteína estão largamente expandidas na Natureza (por exemplo, papaína, catepsina B, H e S) e a sua caracterização e inibição são de grande importância económica e terapêutica (para um resumo global, veja-se V. Turk, 1986, Cysteine Proteinases and their Inhibitors, Walter de Gruyter; A. J. Barrett e G. Salvesen, 1986, Proteinase Inhibitors, Else-vier). A importância geral da inibição de proteases de vírus que codificam não foi afastada nos últimos tempos por trabalhos com a protease do vírus 1 da imunodeficiência humana (HIV I) como de novo tendo importância do ponto de vista da terapia anti-vírus.

Por mutações de eliminações e de pontos na região de protease de retrovírus deste tipo, foi possível conhecer o papel essencial da protease no amadurecimento desta classe de vírus (I. Katoh e col., 1985, Virol., 145, 280 - 292; N. E. Kohl e col., 1988, Proc. Ntl. Acad. Sei. USA 85^, 4686 - 4690; S. Crow-ford e S. P. Gof f, 1985, J. Virol. 53, 899 - 907).

Por análise de estrutura com raios X e estudos de bio-• logia molecular, foi possível descobrir ainda que a protease de 8

HIV I humano pertence ao tipo de Asp, que pode ser processada por si própria na proteína do precursor (também em sistemas pro-carióticos recombinantes), pode separar péptidos específicos "in trans" e existir sob a forma de protease activa como forma homodimérica (Μ. A. Navia e col., 1989, Nature 337, 615 - 620; T. D. Meek e col, 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA £6, 1841 -- 1845; I. Katoh e col., 1985, loc. cit.).

Também no sistema de picornavírus, são actualmente conhecidos diferentes compostos inorgânicos e orgânicos, assim como derivados de péptidos e proteínas que possuem acção de inibição sobre o processamento proteolítico destes vírus. O efeito destas substâncias refere-se à acção directa de metabolismo com proteases (C. A. Kettner e col., 1987, Patente de Invenção Norte-Americana Número 4 652 552; B. D. Korant e col., 1986, J. Cell. Biochem. _32, 91 - 95) e/ou à via indirecta da acção de metabolismo com substratos destas proteases (F. C. Geist e col., 1987, Antimicrob. Agentes Chemother. 622 - 624; D. D. Perrin e H. Stunzi, 1984, Virai Chemotherapy _1, 288 - 289). O problema com a maior parte destas substâncias reside na relativamente elevada concentração que é necessária à inibição e a em parte na grande toxicidade destes compostos.

Como já foi demonstrado, o decurso da infecção por acção de licornavírus depende das enzimas dos vírus de maneira } decisiva. Porque estas enzimas precisamente se conservam de maneira especialmente boa e pelas suas propriedades são muito semelhantes nos diferentes rinovírus, elas constituem exactamen-te o objectivo de um tratamento quimioterapêutico, como por exemplo a enzima P2A dos vírus. O princípio do tratamento quimioterapêutico é a inibição da actividade enzimática por meio de inibidores específicos.

Se se inibir a primeira actividade proteolítica, a actividade de P2A inibe o sistema virai de cada processo de amadurecimento posterior. Com base na homologia excelente da região de P2A de HRV2, não apenas em relação a outros rinovírus, mas também em relação a outros representantes de grupos dos pi-. cornarivídios (A. Palmenberg, dados não publicados), é inteira-* mente pensável que se possa utilizar o inibidor contra HRV2-P2A 9

também para outros picornavírus.

Foi possível estabelecer um sistema de ensaio para inibidores da primeira actividade proteolítica (W. Sommergruber e col., loc. cit.).

Por meio deste sistema, foi possível verificar-se que: o polipéptido 2A de HRV2 é uma protease que, na expressão como enzima de substrato em E. coli que consiste numa parte de fusão da polimerase MS2 (noventa e oito aminoácidos), conhece a região para a proteína de revestimento do vírus VP1 e da protease 2A do seu próprio extremidade N e se elimina do precursor; podem separar-se extractos de E. coli, que contêm a protease activa 2A, especificamente um péptido com dezasseis aminoácidos de comprimento, que constitui a região natural de separação entre PI e P2 de maneira simétrica; por eliminação dos últimos dez aminoácidos da extremidade C da protease 2A, destroi-se a função proteolítica; por troca da Arg 134 altamente conservada por Gin da extremidade C de 2A, igualmente se inibe a função proteolítica; os estudos de anulação e de mutação no centro provavelmente activo de 2A inibem a actividade proteolítica.

Os dados experimentais sobre o mecanismo catalítico dos poliovírus 3C mostraram que a protease 3C pode ser bloqueada por inibidores de tiol-proteases, como, por exemplo, N-etil--maleimida ou iodo-acetamida (H. R. B. Pelham, 1978, Eur. J. Biochem. ^5, 457 - 462). Com base nas comparações das sequências 3C de picornavírus (P. Argos e col., 1984, Nucleic Acids Res. 12, 7251 - 7267) e em experiências de mutações pontuais (L. Iva-noff e col., 1986, loc. cit.), definiu-se um par cisteína-histi-dina como um centro activo provável para a protease da cisteína.

Por comparação com outros picornavírus e outros estudos de inibidores (G. D. Parks e col., 1986, J. Virol. _60, 376-- 384; H: Konig e B. Rosenwirth, 1988, J. Virol. 62_, 1243 - 1250), assim como por mutagénese directa do centro activo provável da protease 2A de HRV2 (W. Sommergruber e col., 1989, Virol 169, 10

68 - 77), é muito provável que também 2A possua a cisteina como nucleófilo. Uma troca da cisteina 106 de HRV2-2A por uma serina no provável centro activo da enzima, destrói a actividade (W. Sommergruber e col., loc. cit.). A comparação dos últimos cinquenta aminoácidos com o centro activo de A2 de acordo com o banco de dados da sequência SWISSPROT, proporciona grande semelhança da proteína 2A com pro-teases de serina e não com proteases de cisteina. A cisteina actua, tal como se espera, no centro activo de uma protease de serina. A troca da serina por uma cisteina em subtilisina (M. Philipp e col., 1971, Methods in Enzymology _19, "Proteolitic Enzymes", S. P. Colowick e N. O. Kaplan) para obtenção de tio--subtilisina por modificação química permite obter a actividade de esterase, na tripsina é diminuída de um factor igual a 100.000 por mutagénese controlada da serina numa cisteina (J. N. Higaki e col., 1987, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. ,52, 615 -- 621) . A comparação da proteína 3C com outras proteases conduz a um resultado semelhante, se bem que também menos significativo (A. E. Gorbalenya e col., 1986, FEBS Lett., 194, 253 --257). Postula-se mesmo um precursor comum da protease de serina e de cisteina, ao qual as proteases dos vírus são muito semelhantes (A. E. Gorbalenya e col., 1989, FEBS Lett. 243, 103 --114) .

Bazan e Fletterick encontram uma diferença nítida entre as duas proteases de vírus 2A e 3C. Eles encontram uma forte homologia estrutural das proteases 3C de diferentes picorna-vírus e vírus de plantas empregados com a família da quimotripsi-na das proteases de serina em comparação com estruturas cristalinas de quimotripsina com previsões da estrutura secundárias das enzimas de vírus. Conservam-se as conformações beta de folha dobrada decisivas para a estrutura, as inserções e as eliminações verificam-se apenas nas tiras de ligação (J. F. Bazan e R. J. Fletterick, 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85^, 7872 -* - 7876). A proteína 2A possui pontos comuns estruturais com a 11

família de subtilisina das proteases de serina. Com base nestas comparações, conclui-se que os aminoácidos His 18, Asp 35 e Cys 106 formam provavelmente o centro activo de HRV2-2A.

As proteínas com a semelhança máxima com os últimos aminoácidos de 2A são a taumatina I e II de Thaumatococcus da-niellii benth do fruto de uma planta monocotiledónea arbustiva da África Ocidental (H. Van der Wel, 1972, FEBS Lett. _21, 88 -- 90; R. B. Iyengar e col. , 1979, Eur. J. Biochem. 9Q_, 195 - 204) dos quais se conhece na literatura a sua extraordinária capacidade edulcorante.

Na purificação de uma proteína utilizada, monelina, descreve-se uma actividade proteolítica (J. A. Morris e R. H. Cagan, 1972, Biochem. Biophys. Acta 261, 114 - 122; H. Van der Wel, 1972, Eur. J. Biochem. J31_, 221 - 225), que possivelmente é um componente integral destas proteínas doces. Recentemente, foi descrita a extraordinária semelhança destas proteínas com um inibidor de protease (M. Richadson e col., 1987, Nature 327, 432 - 434) que pertence a um grupo de proteínas que é induzido pelo ataque de uma planta por insectos, microrganismos ou vírus. Algumas destas proteínas induzidas em plantas têm igualmente a função de um inibidor de proteína ou de uma protease (B. J. C. Cornelissen e col., 1986, Nature, 321, 531 - 532).

Um objectivo da presente invenção consiste em proporcionar sistemas que possibilitam, na região de codificação total, especialmente na região de separação da protease 2A, introduzir algumas mutações pontuais ou supressões.

Este objectivo foi atingido mediante a preparação de sistemas de expressão que, não tendo a sequência natural de aminoácidos, apresentam sequências de nucleótidos modificados. A partir do vector de expressão pEx2A, estabeleceram-se plasmídeos modificados. Estes sistemas de expressão modificados, mantendo a sequência de aminoácidos natural, possuem sequências de sinal singulares para as enzimas de restrição que foram introduzidos com o auxílio de oligonucleótidos de cadeia dupla sintéticos. Obtiveram-se os sistemas pEx2A/21, assim como pEx2A/II, cujos produtos de expressão se completarem de maneira idêntica aos do 12

ρΕχ2Α (veja-se Figura 5, mancha 2 e 3).

Estes novos sistemas de expressão possibilitam, mediante a utilização dos sítios de restrição gerados de novo, construir oligonucleótidos de mutação que, por um lado, foram utilizados para a análise fina dos sítios de separação e, por outro lado, puderam ser empregados para estudos de supressão para determinar ainda a mais pequena região proteoliticamente activa de HRV2-2A.

Estes sistemas, especialmente os sistemas que sofreram mutação, podem ainda ser utilizados como sistemas de ensaio para investigar a actividade intramolecular da protease, isto é, a actividade "cis", em que podem ser determinadas directamente as acções das mutações inseridas sobre a actividade "cis". Simultaneamente, podem ser determinadas as acções destas mutações sobre a actividade "trans".

As mutações da posição do sítio de separação da protease 2A de HRV2 (daqui por diante designada por HRV2-2A) realizaram-se ou no sistema de vector de expressão pExl8521 ou pEx2A ou no seu derivado pEx2A/21.

Em primeiro lugar, trocou-se a alanina da posição em HRV2 por uma tirosina. Esta mutação originou um par de amino-ácidos, Y/G, na posição de separação 2A, como acontece nos polio-vírus (H. Toyoda e col., 1986, Cell 45, 761 - 770). Para o efeito, utilizou-se o fragmento Psti/HindIII que contém a mutação (Ala - Tyr) para substituir o fragmento do tipo natural de pExl8521. Utilizou-se o pEx2A/21 para inserir outras mutações com o auxílio de oligonucleótidos de cadeia dupla (veja-se Figura 1) em e em volta do sítio de separação. Neste caso, por exemplo, o oligonucleótido de cadeia dupla cada aminoácido na posição P^ ^ e P 4, como se encontrou previamente no serotipo HRV89 (veja-se Figura 1).

As construções que possuem os aminoácidos glutamina, leucina, metionina, fenil-alanina e tirosina na posição P^ foram separados de maneira igualmente eficiente como do tipo natural, o que se atribui à falta das bandas do material separado a 65 Kd . (no caso da mutação da tirosina, a 75 kd). 13

Os mutantes que possuem valina ou isoleucina na posição não foram no entanto, completamente processados. Quando se utiliza uma construção que contém valina, não se processou 25% da proteína induzida; se se encontra o radical de isoleucina nesta posição, então, na realidade, não se separa 50% do material induzido. Encontra-se uma redução nítida de eficiência de separação também se se utilizarem aqueles aminoácidos na posição P^_^ e como se encontram nos serotipos HRV89 (cerca de 65 a 70% da proteína induzida não é processada).

Como resumo, pode dizer-se que os aminoácidos isoleucina e valina, evidentemente, não se adaptam muito bem no centro activo dos HRV2-2A; isto é tanto mais digno de nota quanto a valina é o aminoácido que se encontra na posição P^ de HRV89.

Possivelmente, o grupo metilo do átomo de carbono na posição beta prejudica a topografia do centro activo ou uma alteração estrutural do substrato necessária para a separação pro-teolítica. Deve concluir-se, portanto, que as diferenças nas estruturas do centro activo de 2A existem entre os sorotipos HRV2 e HRV89.

Por consequência, trocou-se o radical de alanina por um radical de treonina, porque a treonina possui um grupo hidro-xilo no átomo de C na posição beta. O produto de expressão da construção com a troca Ala—*Thr na posição P^ foi bem separado: o grupo hidroxilo no átomo de carbono da posição beta não é, evidentemente, ao contrário do grupo metilo da valina e da isoleucina, suficientemente grande para influenciar a eficiência da separação.

Para investigar a influência das mutações nas posições ,, P2,/ , e Pg, sobre a eficiência da separação, inseriram- -se os oligonucleótidos representados na Figura 20 e na Figura 21 nas respectivas posições. As construções que possuem os aminoácidos triptofano, lisina, treonina e ácido glutâmico na posição ,, não foram separadas, o que é devido à falta das bandas correspondentes ao material separado a 50 KD. Uma construção, em que a glicina foi suprimida na posição P^,, igualmente não • se separou. 14

A partir destes resultados, pode concluir-se que, ao contrário da posição P^,as alterações na posição P originam um polipéptido que não pode ser separado. A construção que possui uma supressão do radical pro-lina na posição P2 , não foi separada. A troca do radical de valina na posição Pg, por ácido asparagínico originou uma redução de 30% da eficiência da separação; pelo contrário, no caso da treonina, a eficiência não é influenciada. A presença de um radical de treonina na posição P^, não mostrou qualquer influência sobre a actividade da protease do HRV2-2A.

Estes resultados demonstram que a carga negativa do ácido asparagínico na posição P^, não é essencial para a actividade da protease mas que uma carga negativa na posição Pg, prejudica a separação proteolítica. Uma troca valina/treonina na posição Pg, não influencia a actividade.

Além disso, utilizou-se este sistema para investigar a influência da sequência entre P^, e Pg , sobre a actividade proteolítica de HRV2-2A.

Como base de troca, serviram as sequências naturais que existem em HRV14 e em poliovírus (as sequências de polioví-rus de sorotipos 1, 2 e 3 (estirpes Sabin) são idênticas nesta região). As sequências para a mutagénese estão indicadas na Figura 22. Reconhece-se assim uma muito grande variabilidade nesta região; portanto, investigou-se se o HRV2-2A pode reconhecer esses sítios de separação. A proteína expressa da construção com a sequência P^, - Pg, (P2, Leu-*Pro) de HRV14 não foi processada. Uma separação da proteína expressa não foi observada na construção que possui a sequência P^, - Pg, de poliovírus nem numa construção muito semelhante que constitui uma variante da polio-sequência P^, - Pg , (P^, His - Met, Pg, Asn

Tyr) .

Como se pôde verificar, a proteína expressa de uma construção com valina na posição Pj ou os aminoácidos que se encontram em HRV89 entre Ρι_4/Ρι·_4' , é apenas separada em 50% (Exemplo 6).

Esta descoberta foi generalizada pela troca de amino- 15

ácidos em outras posições do sinal de separação para investigar a influência dos aminoácidos individuais nesta região. Na Figura 23, vê-se uma comparação das sequências de aminoácidos dos dois sorotipos de HRV. A partir da separação das proteínas exprimidas, conclui-se claramente que a protease HRV2-2A não pode reconhecer bem os sítios de separação que apresentam os aminoáci-· dos de HRV89. Para esse efeito é principalmente responsável a presença de valina na posição P^, como se pode ver pela diferença das mutações HRV89 P^ 5 e p^^ . Por exemplo, nota-se uma redução da separação de cerca de 30% devido à troca de alanina - valina. Para alicerçar este resultado, construiu-se uma sequência que corresponde à região do sítio de separação do soro-tipo 18 de rinovírus humano:

Arg-Pro-Ile-Ile-Thr-Thr-Ala-Gly-Pro-Ser-Asp-Met-Tyr-Val-His-Val por

Arg-Ala-Ser-Met-Lys-Thr-Val-Gly-Pro-Ser-Asp-Leu-Tyr-Val-His-Val. A sequência tem, na posição P^, um radical de valina; o produto da expressão foi separado apenas em 65%, como se vê na Figura 26. São também objecto da presente invenção, portanto, oligonucleótidos que codificam uma região VP1/P2A modificada, em que as modificações estão presentes, de preferência, na posição de separação ou na região de separação da protease 2A e influenciam a actividade "cis". São também objecto da presente invenção os oligopépti-dos que derivam dos oligonucleótidos; estes oligopéptidos apresentam mutações que se adaptam bem ao centro activo da protease 2A.

As mutações preferidas são os aminoácidos valina ou isoleucina na posição P^ e Val-Thr-Asn-Val-Gly-Pro-Ser-Ser na posição P1_4/P1,_4I · São também objecto da presente invenção os peptidomi-méticos derivados destes péptidos que, por exemplo, possuem ligações éter, péptidos que são dotados de marcadores ou, por exemplo, possuem D-aminoácidos. Estes compostos são especialmente 16

apropriados como substâncias condutoras na determinação das substâncias activas para influenciarem a actividade "cis" da protease 2A, especialmente como substâncias condutoras para ini-bidores.

Para demonstrar que o gene 2A de HRV89 (Patente de Invenção Europeia EPA 261 403) também codifica uma protease, preparou-se uma construção de ADN, na qual se ligou um fragmento de ADN que corresponde à região do gene 2A num fragmento que codifica HRV2-VP1. Depois da expressão deste híbrido no sistema pEx, pode concluir-se a partir do comprimento da proteína de fusão que é a proteína 2A de HRV89 funciona como protease. As diferenças no gene 2A entre HRV2 e HRV89 estão indicadas na Figura 28. Além disso, construíram-se dois mutantes para provar a influência dos aminoácidos individuais sobre a eficiência da separação. A análise dos produtos da expressão das três construções com a HRV89-2A encontra-se representada na Figura 31. A proteína de fusão dos mutantes, que possui o sítio de separação de HRV2 (pEx2A/S2/89), é quase completamente separada; a enzima HRV89-2A pode, portanto, reconhecer o sítio de separação de HRV2 tão eficientemente como a enzima HRV2-2A. O produto não separado na construção com o HRV89-2A modifica-se ligeiramente de maneira mais lenta não obstante as duas proteínas 2A possuirem o ' mesmo número de aminoácidos. Possivelmente, as treze diferenças na sequência de aminoácidos têm influência sobre a mobilidade do polipéptido 2A. A interpretação dos resultados com as outras duas construções com o HRV89-2A (pEx2A/S89/89 e pEx2A/S891/89) foi dificultada pelo facto de adicionalmente aos produtos esperados com 65 kD e 50 kD se terem encontrado outras duas bandas com pesos moleculares de 62 kD e 60kD. 0 ensaio rigoroso das bandas dos mutantes pEx2A/S2/89 com a posição de separação de HRV2, mostrou que estas bandas também existiam nesta construção. Estas bandas não foram reconhecidas por anti-PC20 e não possuem, portanto, a extremidade terminal C da proteína 2A; no entanto, pa-. rece possível que as bandas sejam provocadas por uma pausa dos \ ribossomas ou por uma interrupção da cadeia na região da extre- 17

_ midade C do polipéptido. Não obstante existirem apenas quatro diferenças nesta região entre os polipéptidos 2A do HRV2 e do HRV89 no plano das proteínas, a "utilização dos codões" é muito diferente. A análise dos produtos de expressão da construção intermediária pEx2A/S89"/C89 mostrou também um produto ligeiramente maior não separado e a presença de duas bandas adicionais, o que demonstra que as razões para isto acontecer estão ligadas com o domínio dos últimos vinte aminoácidos. Não obstante a presença das duas bandas adicionais, é evidente que, no sistema de expressão aqui descrito, a HRV89- ; -2A pode reconhecer melhor os sítios de separação de HRV2-2A do que os seus próprios, o que se reconhece pela maior proporção de produtos não separados nas construções pEx2A/s89'/89 e pEx2A/ /S89/89. É evidente, neste caso, a presença de alanina na posição , que é decisiva para a separação por meio de HRV2-2A.

Na HRV89-2A, pelo contrário, a situação é ligeiramente diferente: a enzima HRV89-2A demonstra que não reconhece especialmente bem os seus próprios sítios de separação. É possível que partes in vivo de 2B sejam necessárias para a actividade de HRV89-2A e que tenham, possivelmente, certa influência sobre a conformação do polipéptido 2A. Também a conformação das proteínas da cápside de HRV89 pôde desempenhar ) um papel importante na separação. Pode pensar-se que a lenta separação se deva a uma função biológica, por exemplo, durante a replicação do vírus; no entanto, é um facto que o sorotipo HRV89 cresce mais lentamente do que o sorotipo HRV2.

Como já se mencionou, a P2A do sistema de poliovírus é responsável pelo facto de um ou mais factores de regulação da translação das células do leospedeiro se alterem durante a in-fecção. Estes resultados também se podem transferir para o sistema de rinovírus (D. Etchison e S. Foud (1985) J. Virol. 54, páginas 634-638). A actividade "trans" responsável por esta alteração do processo de regulação da P2A também foi evidenciada no sistema de rinovírus para a protease 2A. . A influência ou a inibição deste processo tem um inte- 18 resse terapeuticamente positivo quando também se utiliza o efeito subordinado sobre o sucesso do vírus.

Um outro objectivo da presente invenção consistiu, portanto, em determinar os parâmetros necessários para a activi-dade "trans".

Este objectivo foi atingido pela preparação de diferentes substratos de péptidos e pela determinação das diferentes condições de incubação.

Os ensaios mostram que a eficiência de separação do HRV2-2A "in trans" depende essencialmente do comprimento do pép-tido de separação utilizado e a especificidade da eliminação é determinada em menor proporção pelo sinal de separação próprio do que a sequência de aminoácidos da região de separação realiza uma influência essencial sobre a "capacidade de reconhecimento" de um sítio de separação. São, portanto, também objecto da presente invenção os oligopéptidos que são separados pela protease 2A com uma eficiência diferente. São especialmente preferidos os oligopéptidos que, pelo menos, possuem cinco aminoácidos da região da extremidade C de VPl e oito aminoácidos da extremidade N da protease 2A ou respectivamente seis aminoácidos destas regiões.

Eles podem ser ensaiados relativamente à sua possibilidade como inibidores competitivos da actividade "trans" e são eventualmente empregados terapeuticamente no caso de infecções por rinovírus. Estes compostos, no entanto, são especialmente apropriados como substâncias condutoras na determinação da substância activa para influenciar a actividade "trans" da protease 2A, especialmente, como substâncias condutoras para inibidores.

Os presentes resultados fornecem valiosos pontos de fundamento para os ensaios relativamente à estrutura/actividade de acordo com as substâncias activas que influenciam de maneira terapeuticamente activa a actividade "cis" e/ou "trans" das pro-teases dos rinovírus.

Nos ensaios das diferentes condições de incubação, foi possível verificar que, em presença de NaCl 2,5 molar num tampão 19

| de actividade "trans" (veja-se Tabela 1), se realiza uma separação completa do substrato de péptido por HRV2-2A e não se detec-ta qualquer degradação não específica dos substratos de pépti-dos e dos seus produtos de separação (veja-se, por exemplo a trans-separação do péptido K; veja-se Figura 8). Foram indicadas três razões para este efeito do sal:

a) influência da solubilidade ou da estabilização dos substratos de péptidos, seus produtos de separação e do HRV2-2A no extracto de células a elevadas concentrações de sal; b) supressão da degradação não específica dos péptidos, seus produtos de separação e da HRV2-2A por inibição das protea-ses de E. coli específicas das células hospedeiras no extracto de células; c) exigência de uma estrutura apropriada da HRV2-2A que favorece a actividade "trans" ou facilita a ligação do substrato.

Para posterior caracterização da HRV2-2A, investigou--se a influência de diferentes detergentes, agentes dissolventes e agentes desnaturantes sobre a eficiência da actividade "trans" de HRV2-2A. Nesses ensaios, verificou-se que todos os detergentes utilizados e também a glicerina exercem uma influência drasticamente negativa sobre a actividade "trans" de HRV2-2A (Tabela 1) .

Mesmo nas fases de diluição de concentrações mínimas, foi verificada uma inibição de cerca de 30% - com excepção de DMSO. Substâncias como sulfato de amónio, cloridrato de guanidi-na e ureia, pelo contrário, demonstraram uma influência comparativamente essencialmente menor sobre a actividade "trans". A utilização de elevadas concentrações de iões não inibiu a actividade "trans", mas, pelo contrário, originou uma elevada eficiência da actividade "trans" (100% de separação do substrato do péptido, supressão da degradação não específica dos produtos de separação do péptido, etc.).

Estes resultados podem fornecer uma primeira indicação sobre o mecanismo da actividade "trans" de HRV2-2A e permitem uma confirmação sobre uma possível natureza estrutural da protea- 20

. se 2A durante a separação de péptidos in trans. - Por um lado, sabe-se que a presença de elevadas concentrações de sal (NaCl 2,5 M) facilita a formação de estruturas não monoméricas (por exemplo, estruturas diméricas), mas que, - por outro lado, os detergentes fracos evitam esta estrutura (por exemplo, Tween, NP40, glicerina, etc), o que se

I manifesta na redução da actividade "trans" no caso acima mencionado. A possibilidade de que o HRV2-2A exista sob uma forma multimérica é alicerçada pelo facto de, numa separação de extrac-tos de células de E. coli que contêm HRV2-2A num gel de proteínas não desnaturante e na subsequente mancha de imunidade com anti-PC20, a protease de aqui em diante poder ser evidenciada com uma massa molecular que corresponde a uma massa molecular superior correspondente à forma de dímero (ver Figura 9).

Como se pode verificar por estudos de supressão e de Smutagénese in vitro da extremidade C terminal da protease 2A, j esta região é essencial para a actividade "cis" (W. Sommergruber e col., loc. cit.). O anti-PC20, um anti-soro policlonal que é dirigido contra os vinte últimos aminoácidos da protease 2A natural, não exerce, todavia, qualquer influência sobre a actividade "trans" de 2A. Isto significa que a) ou a extremidade C de HRV2-2A não é essencial para a actividade "trans" ! b) ou que a zona C-terminal nestas condições não é acessível ao anti-soro; isto é, os anticorpos não podem ligar-se nos sítios do antigene por razões estruturais.

Os presentes resultados originam valiosos pontos de vista para os ensaios relativamente à actividade estrutural de acordo com as substâncias activas que influenciam activamente, do ponto de vista terapêutico, a actividade "trans" das protea-ses de vírus, especialmente das proteases de rinovírus. São ainda objecto da presente invenção, de maneira es- • pecial 21

um sistema de vírus caracterizado pelo facto de possuir mutações na ou perto da posição P^ da protease 2A de renovírus que influenciam a actividade "eis" da protease; um sistema de vírus que é caracterizado pelo facto de possuir mutações que originam uma perturbação do centro activo da protease 2A de rinovírus; um sistema de vírus em que as mutações codificam os aminoáci-dos Tyr, Gin, Leu, Met, Phe, Vai, Ile, especialmente valina ou isoleucina na posição P^; um sistema de vírus em que a região (P1_4/P1_4.) de HRV2 foi trocado pela região de HRV89; a utilização dos sistemas de vírus para a descoberta de compostos terapeuticamente relevantes; a utilização das sequências de aminoácidos derivadas destes sistemas de' vírus para a preparação de composições farmacêuticas que influenciam negativamente o processamento proteolí-tico de rinovírus.

Pela expressão "sistema de vírus", entendem-se sistemas de expressão recombinantes e sistemas de ensaio in vitro que, por um lado, podem ser utilizados para a produção de HRV2--2A de tipo natural e seus mutantes (em especial, mutantes do centro activo e da região da posição de separação) e, por outro lado, como sistemas de ensaio para a descoberta de inibidores apropriados, em que as sequências parciais destes sistemas servem de base para a síntese de oligonucleótidos e de oligopéptidos terapeuticamente activos.

Legendas das Figuras

Nas Figuras, utiliza-se o seguinte "código de uma única letra" para os aminoácidos: A, alanina; D, ácidos aspártico; E, ácido glutâmico; F, fenilal-anina; G, glicina; H, histidina; I, isoleucina; K, lisina; L, leucina; M, metionina; N, asparagina; P, prolina; Q, glutamina; R, arginina; S, serina; T, treonina; V, valina; W, triptofano; Y, tirosina. 22 .^.RFVW.^H,.......Ml--^ r^ tv?i k.„ ^

Se não se indica outra coisa, na indicação das mutações na região da posição de separação esta refere-se ao tipo natural do HRV2 ou do HRV89 (HRV2 : P^Ala; Ρχι = Gly; HRV89 : Ρχ = Vai; Plt = Gly). A FIGURA 1 representa a sequência de oligonucleótidos como se utiliza para a mutagénese da região da posição de separação de HRV2-2A.

As letras minúsculas fornecem a sequência original do cADN de HRV2 de novo ou a sequência do plasmídio de expressão pEx2A/21 de uma variante modificada com enzima de restrição de pEx2A (veja-se Exemplo 2).

As letras maiusculas referem-se à respectiva mutação; wt significa tipo natural; HRV89 P^ 4, corresponde à região da posição de separação como se encontra no rinovírus humano do sorotipo 89. A FIGURA 2A representa os produtos de expressão da mutagénese da extremidade C de VP1; troca de Ala por Vai, Leu, Phe, Gin e Tyr na posição P^. GRAVURA A : gel de poliacrilamida - 12,5% de SDS corado com'azul de Coomassie.

0 pEx2A

Tyr

75 kD 65 kD pEx2A/21 não induzido. plasmídio de partida pEx2A/21 induzido; Vai, Leu, Phe, Gin : mutantes de pEx2A/21 com aminoácidos trocados na posição P^ (Ala Vai, Leu, Phe e Gin). mutante de pExl8521 (Ala-* Tyr na posição P^); esta construção do vactor apresenta uma parte de 2B que estorva o reconhecimento por anti-PC20. produto da expressão de pExl8521 não processado. produto da expressão de pEx2A não processado e mutantes . 50 kD : produto da expressão de pExl8521, pEx2A processado e mutantes; corresponde à parte de fusão (noventa e oito aminoácidos da MS2-polimerase), à extremidade do terminal C do VP3 e ao VP1 total. 23 24 kD : produto da separação de pExl8521, que consiste em HRV2-2A e ao corte N-terminal de 2B. 15 kD : HRV2-2A. tagénese A FIGURA 2B representa os produtos da expressão da mu-do sinal de separação de 2A; troca de Ala por Met e Ile na posição Pl, assim como troca da região de separação de HRV2 (Ile-Thr-Thr-Ala-Gly-Pro-Ser-Ser-Asp) pela região de separação de HRV89 (Val-Thr-Asn-Val-Gly-Pro-Ser-Ser); referem-se as posi- Ções Pi_4/Pi1-4·* a : gel de poliacrilamida com 10% de SDS corado com azul de Coomassie. b : mancha de Western de um gel idêntico com anti-MS2--Pol. c : mancha de Western de um gel de poliacrilamida com 15% de SDS com anti-PC20. Pista m : proteínas do marcador. Pista 1 : pVP2D2 (proteína de fusão MS2Pol-VP2 como controlo positivo para os anticorpos anti-MS2-Pol). Pista 2 : pEx2A/21 não induzido. Pista 3 : pEx2A/21 induzido. Pista 4 : pEx2A/21 com mutação AlaMet na posição Pl. Pista 5 : pEx2A/21 com mutação Ala Ile na posição Pl. Pista 6 : pEx2A/21 com troca da região de separação de HRV2 por HRV89; (ITTAGPSD -d VTNVGPSS) nas posições Ρχ 4/P1( 4, (para descrição pormenorizada, ver Figura 1 e o Exemplo 1) . 65 kD : produto de expressão não.processado de pEx2A/21 e mu-tantes de pEx2A/21. 50 kD : produto de expressão processado de pEx2A/21 e mutan-tes. 15 kD : HRV2-2A. A FIGURA 3 mostra esquematicamente a recriação das po- 24 sições de reconhecimento para as enzimas de restrição em volta do sítio de separação de HRV2-2A e na parte que codifica de HRV2-2A.

As enzimas de restrição não impressas em negro dão de novo as sequências de reconhecimento já existentes originalmente em pEx2A; as expressões enquadradas impressas a negro indicam as novas sequências de reconhecimento introduzidas em pEx2A/21 e pEx2A/II. AS significa aminoácido. A FIGURA 4 representa o oligonucleótido de cadeia dupla para a preparação de pEx2A/21, uma variante de pEx2A modificada por restrição. 0 oligonucleótido é flanqueado por uma posição Acc I ou um sítio BstE; os sítios de restrição impressos a negro foram inseridos com o auxílio da sequência de nucleótidos alterada do oligómero de mutação com conservação da sequência original de aminoácidos do ADN.

As letras minúsculas indicam a sequência original do HRV2-cADN; as letras maiúsculas indicam a sequência modificada; os nucleótidos assinalados com um traço indicam a sequência de reconhecimento para a respectiva enzima de restrição. A FIGURA 5 mostra a mancha de Western de um gel de poliacrilami-da com 15% de SDS com utilização de anti-PC20.

Pista 1 : produto de expressão de pEx2A.

Pista 2 : produto de expressão de pEx2A/21, de um mutante de pEx2A com novas posições de restrição singulares em e em volta da região de separação de HRV2-2A.

Pista 3 : produto de expressão de pEx2A/II de um mutante de pEx2A que possui novas posições de restrição singulares no interior da região de codificação de HRV-2A. A seta da esquerda a 15 kD indica o produto de expressão (HRV2-2A) evidenciado especificamente pelos anticorpos do péptido. A direita, estão indicados os marcadores do valor do peso molecular (em kD). Em todos os três casos, a HRV2-2A é 25

reconhecida por anti-PC20 como um sítio anteriormente proteoli-ticamente activo e indica um produto de expressão com o mesmo tamanho. A FIGURA 6 representa três oligonucleótidos de cadeia dupla para a preparação de pEx2A/II, de um mutante com dois novos sítios de restrição singulares dentro da região que codifica a HRV2-2A.

Os três oligonucleótidos de mutação foram ligados uns aos outros por meio de extremidades que se sobrepõem (representadas por * ou por #) , que não significam regiões de restrição. Depois de realizada a ligação, pode cortar-se o fragmento com cerca de 270 pb de comprimento com as enzimas de restrição BstEII e Apal.

As letras minúsculas referem a sequência original do nucleótido do HRV2-cADN; as letras maiusculas indicam a sequência mutada. As posições de restrição impressas a preto correspondem às novas sequências de reconhecimento geradas. A FIGURA 7 representa os diferentes substratos de pép-tidos e a sua influência sobre a eficiência da actividade "trans" de HRV2-2A. + : separação com grande eficiência e cinética comparável. : o péptido não pode ser separado nas condições normais (veja-se o Exemplo 3). +/- : o péptido é separado apenas com pequena eficiência. O péptido Polio 2A/I representa o sítio de separação VP1/2A para as proteases 2A de poliovírus do tipo 1 e 2A/II representa os sítios de separação alternativos para a protease 2A em 3CD para poliovírus do tipo 1. A FIGURA 8 representa o perfil do cromatograma em fase líquida de elevado rendimento (HPLC) do péptido K (TRPIITTYGPSD-MYVH, tR = 21,6) e dos seus produtos de separação TRPIITTY (tR = = 18,6) e GPSDMYVH (tR = 12,2) depois da incubação em sobrenadan-tes de ρΕχ2Α; o ensaio de actividade "trans" foi realizado como . se descreve no Exemplo 3, sendo utilizadas as seguintes concen-• trações de NaCl: 26 1 NaCl 2,5 M 2 NaCl 0,5 M 3 : NaCl 50 mM 4 : NaCl 5 mM 5 NaCl 0,5 mM. A linha senta o substrato A FIGURA 9 representa a mancha de imunidade de um gel de proteína que desnatura e de um gel de proteína que não desna tura de fracções solúveis de pEx2A e pEx34b. FIGURA 9A : mancha de imunidade de um gel de acrilamida a 15% desnaturante com o auxílio do anticorpo do péptido PC20. FIGURA 9B : mancha de imunidade de um gel de acrilamida a 15% que não desnatura com o auxílio do péptido do anticorpo PC20.

Pista 1 : componente solúvel do extracto de pEx2A de E. coli.

Pista 2 : componente solúvel do extracto de pEx34b de E. coli (controlo negativo para PC20). A pequena seta fina indica a posição do marcador de tamanho molecular.

As setas grossas a 15 Kd no gel de proteína que desnatura (forma de monómero) ou a 30 kD num gel de proteína que não desnatura (possível forma dimérica) indicam a posição de bandas específicas de HRV2-2A na mancha de Western. A FIGURA 10 representa os perfis dos ensaios de croma-tografia em fase líquida de elevado rendimento (HPLC) do péptido K (TRPIITTYGPSDMYVH, tR = 21,5) e dos seus produtos de separação TRPIITTY (tR = 18,6) e GPSDMYVH (tR = 12,2). O ensaio da actividade "trans" realizou-se como se descreve no Exemplo 3, com a diferença de se ter utilizado NaCl 150 mM no tampão de actividade "trans" e uma pré-incubação durante trinta minutos do extracto de células de pEx2A em presença de diferentes concentrações de anti-PC20. Para o efeito, utili- 27

-jj zaram-se as seguintes diluições de PC20:

I

Pista 1 : 1/1 PC20

Pista 2 : 1/10 PC20

Pista 3 : 1/100 PC20 Pista 4 : 1/1.000 PC20 Pista 5 : 1/10.000 PC20. A FIGURA 11 representa a construção de pEx34c x 18521 A FIGURA 12 representa a construção do plasmídio de expressão pEx34c x 18521. A FIGURA 13 representa a separação por eletroforese jdos produtos de expressão de pEx34c x 18521 (Pista 1) e de pEx34c x 18731 (Pista 2), assim como das proteínas de revestimento dos vírus de HRV2 (Pista HRV2) num gel de poliacrilamida contendo 10% de SDS e com coloração com azul brilhante de Coomassie. A FIGURA 14 representa a mancha de Western dos produtos de expressão de pEx34c x 18521 ou 18731 com um soro anti-VPl policlonal; nas Pistas 1 a 3, separa-se o produto da expressão de três clones diferentes de 18521 e, na Pista 4, de 18731. As bandas de maiores pesos moleculares apenas ligeiramente reconhecíveis nas Pistas la 3 representam o produto da expressão de 18521 ainda não processado. A FIGURA 15 representa a sequência dos aminoácidos da região da protease 2A de HRV2 (letras negras). As letras maiús-culas designam os aminoácidos idênticos entre rinovírus, polioví-rus e vírus da varíola. As setas duplas mostram a posição e o tipo da troca ou da supressão que foram realizadas para a caracterização do centro provavelmente activo e da extremidade C da protease 2A de HRV2. i

I A FIGURA 16 representa a cassete de oligonucleótidos para a mutagénese do centro provavelmente activo da protease 2A de HRV2. Por combinação dos dois oligonucleótidos de cadeia dupla WT12 + WT34, obtém-se a região de codificação da protease . 2A do tipo natural. Depois do último aminoácido de 2A (glutamina [ 142), foram adicionados dois codões de interrupção. Se se combi- 28

na o oligonucleótido de cadeia dupla WT34, em vez de WT12, com o oligonucleótido que possui uma mutação ou uma supressão apropriadas em virtude da sua sequência de base alterada» pode-se provocar cada alteração pretendida na sequência de aminoácidos desta região (neste caso, indica-se o exemplo para a construção do tipo natural 2A e as mutações para Cys 106 * Ser, Cys 112 Ser e Bis 114 -* Gly). A FIGURA 17 mostra o modelo de proteínas de pEx34c (controlo negativo), pExl8521, pExl8731, pEx2A e de todos os mutantes de pEx2A no centro de 2A provavelmente activo.

Banda A: corresponde ao produto de expressão não processado (65 K) de pEx2A ou dos mutantes de pEx2A.

Banda B: corresponde ao produto de expressão (58 K) de pExl8731.

Banda C: corresponde ao produto de expressão processado (50K; parte da MS2-polimerase + parte terminal C de VP3 + + VP1 total) de pExl8521, pEx2A e pEx2A (Pro 103 -Gly).

Banda D: corresponde à protease madura 2A (15K). FIGURA 18; azul de Coomassie: gel de proteína corado com azul de Coomassie. FIGURA 17a ; anti-HRV2; mancha de Western do mesmo gel com um anti-soro policlonal contra HRV2. A FIGURA 17 b ; anti-PC20; representa a mancha de Western do mesmo gel com um anti-soro policlonal contra PC20 (o peja tido é constituído pelos últimos vinte minoácidos de 2A? veja--se o Exemplo 7). A FIGURA 19 representa a sequência dos oligonucleóti-dos como foram utilizados para a mutagénese do sítio Ρχ de HRV2- -2A. As letras minúsculas indicam novamente a sequência inicial do CADN HRV2 com a sequência do plasmídio de expressão pEx2A/ 21, de uma variante modificada com a enzima de restrição de pEx2A (veja-se Exemplo 2).

As letras maiúsculas indicam a respectiva mutação. Wt significa tipo natural. 29

A FIGURA 20 representa a sequência dos oligonucleóti-dos como foram utilizados na mutagénese do sítio , de HRV2-2A.

As letras minúsculas dão novamente a sequência original do cADN de HRV2 ou a sequência do plasmídio de expressão pEx2A/21 de uma variante de pEx2A modificada com enzima de restrição (veja-se Exemplo 2).

As letras maiusculas referem a respectiva mutação que referem pontos para a supressão do aminoácido. wt significa "tipo natural". A FIGURA 21 representa a sequência dos oligonucleóti-dos tal como foi utilizada para a mutagénese dos sítios P2,, P^, Pg, de HRV2-2A. As letras minúsculas indicam a sequência inicial de cADN de HRV2 de novo ou a sequência do plasmídio de expressão pEx2A/21 de uma variante de pEx2A modificada com enzima de restrição (veja-se Exemplo 2).

As letras maiúsculas referem-se na respectiva mutação aos pontos para a supressão de um aminoácido. wt significa "tipo natural". A FIGURA 22 representa a sequência dos oligonucleóti-dos como foram utilizados para a mutagénese da região P’ e das regiões P e P' de HRV2-2A. As letras minúsculas referem-se de novo à sequência inicial do cADN de HRV2 ou à sequência do plasmídio de expressão pEx2A/21, de uma variante de pEx2A modificada com enzima de restrição (veja-se Exemplo 2).

As letras maiúsculas referem-se à respectiva mutação, wt significa "tipo natural". Poliovírus P^, g, corresponde à região P' como se encontra em todos os três tipos de poliovírus (estirpes Sabin). Poliovírus p1,_g, , p4, His ->Met, Pg , Asn —>

Tyr corresponde à sequência de poliovírus modificados com as duas mutações. HRV14 P^,_g,, P2, Leu Pro corresponde à sequência da região P' como se encontra no serotipo 14 humano de rinovírus com uma mutação. HRV1B P^ g, corresponde à sequência dos sítios de separação tal como acontece no sorotipo 1B do rinovírus humano . 30 κ scnSS^sS^wáSPís: A FIGURA 23 representa a sequência dos oligonucleóti-dos como se utilizou para a mutagénese da região dos sítios de separação de HRV2-2A. As letras minúsculas indicam de novo a sequência original do cADN de HRV2 ou a sequência do plasmídio de expressão pEx2A/21 de uma variante de pEx2A modificada com enzima de restrição (veja-se o Exemplo 2).

As letras maiusculas indicam a respectiva mutação, wt significa "tipo natural". Os aminoácidos que correspondem à sequência mutada de HRV2-2A são indicados. A FIGURA 24 representa os produtos de expressão da mutagénese do sítio do sítio de separação de HRV2-2A (isto é, o último aminoácido de VP1). A (Ala) encontra-se no pEx2A/21 de tipo natural : as substituições de Ala por Tyr, Phe, Gin,

Met, Leu, Ile e Vai são descritas no Exemplo 6 e a substituição de Ala por Thr é descrita no Exemplo 8.

Figura A : gel de poliacrilamida contendo 10% de SDS corada com azul de Coomassie. 65 kD : produto da expressão dos mutantes não processado. 50 kD : produto da expressão dos mutantes processado; corres ponde à parte de fusão (noventa e oito aminoácidos da MS2-polimerase), à extremidade terminal C de VP3 e a VPl total. 15 kD : HRV2-2A. A percentagem de produto não separado foi determinada por densitometria e é indicada pela proporção entre a figura A e a Figura B.

Figura B : mancha de Western de um gel de poliacrilamida a 15% incubado com o anticorpo anti-PC20. A FIGURA 25 mostra os produtos de expressão da mutagénese dos sítios P^, , · » P4, e P9« P°sição de separação de HRV2-2A (isto é, a extremidade N de 2A propriamente dita). A troca de Gly por Glu, Lys, Thr e Trp no sítio P^, de Asp por Thr no sítio P^,e de Vai por Asp e Thr na posição P^,; as supressões de Gly no sítio P^i e de pro na posição P2'. 31 Jà c: Íty.attathuÍna -

Jà c: Íty.attathuÍna - Figura A gel de poliacrilamida contendo 10% de SDS corado com azul de Coomassie. 65 kD : produto da expressão dos mutantes não processado. 50 kD : produto de expressão dos mutantes não processado; corresponde à parte de fusão (noventa e oito aminoá-cidos da MS2-polimerase), à extremidade C-terminal de VP3 e a todo o VP1. 15 kD : HRV2-2A. A percentagem de produto não separado foi determinada por densitometria.

Figura B : mancha de Western de um gel de poliacrilamida a 15% incubado com o anticorpo anti-PC20. A FIGURA 26 mostra os produtos de expressão da mutagé-nese das regiões P' ou das regiões P e P' de HRV2-2A; troca da região P' de HRV2 pela região P1 de poliovírus; pela região P' de poliovírus com uma troca na posição P^, (His -> Met) e com uma troca na posição Pg, (Asn —> Tyr); pela região P' de HRV14 troca na posição (Leu -> Pro), assim como a troca das regiões P e P' pelas de HRV1B.

Tabela A : sequência das mutações comparadas com a posição de separação de HRV2-2A.

Pista 1 : pEx2A/21 com a região plt_7i de sorotipo 1 de polio vírus .

Pista 2 : pEx2A/21 com a região P^,_7, (p4, H^s Met, Pg ,

Asn -> Tyr) de sorotipo 1 de poliovírus.

Pista 3 : pEx2A/21 com a região P^, η, (ρ2· Leu —> pro) de HRV14.

Pista 4 : pEx2A/21 com a região P^^ 7^1 >_8' de HRVÍB*

Os aminoácidos sublinhados nas variantes 2 e 3t mostram que se trata de diferenças em relação ao sorotipo 1 de poliovírus do tipo natural e à sequência do tipo natural de HRV14. O aminoácido sublinhado na variante 4 mostra uma diferença nesta . posição em relação à sequência de HRV2. A diminuição de eficiên- 32 1

cia de separação ( em percentagem) que foi determinada por den-sitometria é respectivamente indicada.

Figura B : gel de poliacrilamida contendo 10% em SDS tingido com azul de Coomassie. A percentagem de produto não separado foi determinada por densitometria.

Figura C : mancha de Western de um gel de poliacrilamida a 15% incubado com anticorpo anti-PC20. 65 kD : produto de expressão dos mutantes não processado. 50 kD : produto de expressão dos mutantes processado; corres ponde à parte de fusão (noventa e oito aminoácidos da MS2-polimerase), à extremidade C-terminal de VP3 e a todo o VP1. 15 kD : HRV2-2A. A FIGURA 27 representa os produtos de expressão da mu-tagénese da região P de HRV2-2A; troca por cada um dos aminoácidos que existem na região P de HRV89. As alterações exactas podem ver-se na Figura 22.

Tabela A : sequência das mutações comparada com os sítios de separação de HRV2-2A.

Pista 1 Pista 2 Pista 3 Pista 4 Pista 5 pEx2A/21 com a troca Thr Asn na posição P^. pEx2A/21 com a região P2 5 de HRV89. pEx2A/21 com a região ΡΊ e de HRV89.

X —D pEx2A/21 com a região Ρη _ de HRV89. pEx2A/21 com a região p1_4/P1,_4, de HRV89 (veja-se Exemplo 6). A redução de eficiência de separação (em percentagem) que foi determinada por densitometria é respectivamente indicada .

Figura B : gel de poliacrilamida contendo 10% de SDS corada com azul de Coomassie. 33

A redução da eficiência de separação foi determinada por densitomatria e é indicada (em percentagem).

Figura C : mancha de Western de um gel de poliacrilamida a 15% incubado com o anticorpo anti-PC20. 55 kD : produto da expressão dos mutantes não processado. 50 kD : produto da expressão dos mutantes processado; corres ponde à zona da fusão (noventa e oito aminoácidos da MS2-polimerase), a extremidade C-terminal de VP3 e a todo o VP1. 15 kD : HRV2-2A. A FIGURA 28 mostra as diferenças de aminoácidos entre HRV2-2A e HRV89-2A. As letras minúsculas indicam a sequência de aminoácidos dos oito últimos radicais de VP1 de HRV2 e a sequência total de HRV2-2A. Os aminoácidos que são diferentes em HRV89-2A são indicados em letras grandes por baixo da sequência de HRV2. O sítio de separação é designado com uma seta. A FIGURA 29 mostra a sequência dos oligonucleótidos que foram usados no Exemplo 9. A. cassete de oligonucleótidos PvulI/HindIII para a substituição dos vinte e um aminoácidos da extremidade C de pEx2A/ /P^ 4/^1 4·/®® pelos aminoácidos de 2A do sorotipo 89 de HRV. Depois do último aminoácido de 2A, foi inserido um codão de interrupção (designado com um asterisco). B. cassete de oligonucleótidos Mlul/Nsp (7524)1 para inserção do fragmento de Nsp(7524)I/PvuII ADN com 0,342 hb no plasmí-dio pEx2A/S89"/C89 cortado com MluI e PvuII. C. oligonucleótidos como foram utilizados para a mutagénese do sítio de separação no plasmídio pEx2A/S89/89. As letras minúsculas correspondem de novo à sequência original do cADN de HRV89 e a sequência das variantes de restrição de pEx2A/ /S89/89.

As letras maiúsculas designam a respectiva mutação que significa os pontos para a supressão de um aminoácido. wt significa "tipo natural". 34

A FIGURA 30 mostra os sítios de corte de restrição que foram utilizados para construir o plasmídio pEx2A/S89/89. Utilizaram-se as seguintes abreviaturas das enzimas de restri ção: A, Aval· Ac, Accl; B, BstEII; C, Ciai; HindIII; MluI; N; Nsp (7524)1; P, PstII; Pv, PvuII. A FIGURA 31 mostra os produtos de expressão dos plas-mídios pEx2A/S89/89 e pEx2A/S89"/C89 e dos dois mutantes da posição de separação do plasmídio pEx2A/S89/89 (pEx2A/S2/89 e pEx2A/S89’/89).

Tabela A : indica a sequência das mutações comparadas com os sítios de separação de HRV2-2A. Indicam-se os res-pectivos sítios de separação e a enzima nas construções. 89' e 89" mostram que os sítios de separação nestas construções apresentam mutações em comparação com o tipo natural de HRV89.

Pista 1 Pista 2 Pista 3 Pista 4 Pista 5

Figura B

Figura C pEx2A/21. pEx2A/S2/89 com a sequência dos sítios de separação de HRV2 e a sequência 2A de HRV89. pEx2A/S89'/89 com a alteração no sítio Pl Vai —> Ala. pEx2A/S89/89 com a sequência de sítios de separação de HRV89 e a sequência 2A de HRV89. pEx2A/S89"/C89. gel de poliacrilamida com 10% de SDS corado com azul de Coomassie. mancha de Western de um gel de poliacrilamida com 10% incubado com o anticorpo anti-MS2-Pol.

Figura D : mancha de Western de um gel de poliacrilamida com 15% incubado com o anticorpo anti-PC20.

Figura E : mancha de Western de um gel de poliacrilamida contendo 10% incubado com o anticorpo anti-MS2-Pol. 35

TABELA 1 EMPIGEN (Sal de alquil-dimetilamónio de betaína) 50% 5% 0,5% 0,05% 0,005% 100% 100% 100% 45% 35% NP40 (Octilfenol/óxido de etileno) 50% 5% 0,5% 0,05% 0,005% 100% 50% 45% 45% 45% Tween 20 (Monolaurato de polioxieti-leno-sorbitano) / 5% 0,5% 0,05% 0,005% / 55% 45% 40% 30% Glicerina 40% 4% 0,4% 0,04% 0,004% 80% 35% 35% 35% 35% Sulfato de amónio 1,9 M 0,4 M 40 mM 4 mM 0,4 mM 10% 0% 0% 0% 0% Cloridrato de guanidínio 3,5 M 0,7 M 70 mM 7 mM 0,7 mM 100% 90% 50% 0% 0% Noreia 3,5 M 0,7 M 70 mM 7 mM 0,7 mM 100% 20% 5% 0% 0% DMSO i | (Sulfóxido de dimetilo) 10% 1% 0,1% 0,01% 0,001% 25% 10% >5% >5% >5% NaCl 2,5 M 0,5 M 50 mM 5 mM 0,5 mM 0% 0% 0-5% 5% 5-20%

Demonstra-se a influência de diversos materiais de desnaturação e de solubilização sobre a actividade "trans" de HRV2-* -2A no "ensaio de transclivagem" com utilização de péptido K . (veja-se o texto) como substrata. Os números indicados na parte 36 -

superior de cada coluna referem a concentração da respectiva substância (em molaridade ou em percentagem em volume/volume). A parte inferior mostra o respectivo grau de adição calculado relativamente à proporção da superfície do pico do substrato de péptido para os produtos de separação do péptido (para pormenores do método, veja-se o texto). 0% significa que não é detectável qualquer substrato do péptido não separado.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Preparação de um Substrato de Enzima P2A Activo e Inactivo de HRV2 para Expressão em E. coli A partir de pUC9 e dos clones de cADN de HRV2 (Figura 11), construíu-se um sistema de expressão para P2A.

Em primeiro lugar, abriram-se cerca de 10 microgramas de pUC9 por digestão dupla com BamHI e PstI na região de polili-gação. Separou-se a forma linearizada de pUC9 de vestígios do plasmídio não cortado com o auxílio de papel Whatman DE81 (G. M. Dretzen, P. Bellard, Sassone-Corsi e P. Chambon, 1981, Anal. Biochem. 112, 295 - 298).

Para o efeito, cortou-se uma ranhura depois da separação de fragmentos de ADN num gel de agarose e por baixo das bandas de ADN que se pretende isolar, nos quais se inseriu uma tira de papel DE81. A electroforese prosseguiu (o gel não deve ser recoberto com tampão) até o fragmento de ADN pretendido estar completamente ligado às tiras de DE81 anteriores. As tiras de DE81 posteriores evitam a impurificação dos fragmentos de ADN maiores. O papel DE81 com o fragmento de ADN ligado foi transferido para um tubo de Eppendorf de 1,5 ml (com abertura de saída no fundo e lã de um polialómero colocada por cima) e lavou--se duas vezes durante cinco minutos com 400 microlitros de cada vez de tampão de lavagem (0,2 M de NaCl, 25 mM de Tris-HCl, pH = =8,0, 1 mM de EDTA), depois de que, por ultracentrifugação (durante cerca de 1 segundo) a solução de lavagem foi recolhida num segundo vaso de Eppendorf, que se encontra por baixo. Em 37

seguida, lavou-se o ADN ligado duas vezes por incubações com a duração de quinze minutos com 200 microlitros de cada vez de tampão de eluição (1 M de NaCl, 25 mM de Tris-HCl pH = 7,5, 1 mM de EDTA) do papel DE81.

Os 400 microlitros eluídos foram centrifugados durante dez minutos numa centrífuga de Eppendorf (15000 g) para eliminar os bocados de papel. O sobrenadante foi cuidadosamente transferido para um novo vaso de Eppendorf, misturado com 800 microlitros de etanol a 96%, precipitado a -20°C (cerca de duas horas), lavado por duas vezes com etanol a 70% e seco.

Paralelamente a esta operação, digeriu-se o plasmídio do clone 719 com BglII e PstI e o plasmídio do clone 107 com PstI (Figura 11). Estes dois plasmídios são vectores pBR322 e contêm fragmentos HRV2-CADN, que foram inseridos em regiões G-C homopoliméricas em pBR322. O fragmento BglII/PstI do clone 719 representava a região HRV2-CADN de 2145 - 2421 (veja-se Figura 11). O fragmento PstI/PstI do clone 107 recobre a região seguinte, 2421 - 3100. Estes dois fragmentos foram inseridos nos sítios de BamHI e PstI de pUC9, em que ambos os sítios de corte (BglII e BamHI) foram destruídos. Esta construção foi designada pl8 (veja-se Figura 11).

Para se obter a transformação de células competentes, utilizou-se uma maneira de proceder de Mandei e Higa modificada ' (M. Mandei e A. Higa, 1970, J. Mol. Biol. 53, 159 - 162).

Para o efeito, vacinou-se 0,5 ml de uma "cultura durante a noite" da estirpe de E. coli HB101 em 50 ml de meio LB (10 gramas/litro de triptona, 5 gramas/litro de extracto de levedura, 10 gramas/litro de NaCl), cultivou-se até se obter uma densidade óptica a 600 nm igual a cerca de 0,4 e, em seguida, peletizou-se durante cinco minutos com 5 k e 4°C. Em seguida, ressuspenderam-se as bactérias cuidadosamente em 25 ml de MgC^ 0,1 molar (arrefecido com gelo), conservou-se durante cinco minutos em gelo e centrifugou-se durante cinco minutos a 5 k e 4° C. Ressuspendeu-se o pelete em 25 ml de CaC^ 0,1 molar (arrefecido com gelo), manteve-se durante quatro horas em banho de gelo e centrifugou-se durante cinco minutos a 5 k e 4o C. As 38 células foram retomadas em 2,5 ml de tampão de armazenagem 1 x (0,1 M de CaCl2/glicerina = 4/1% em volume/volume), manteve-se durante vinte minutos em gelo, dividiu-se em porções alíquotas de 100 microlitros e congelou-se por choque em azoto líquido e guardou-se a -80° C. A 100 microlitros da competente suspensão de células descongelada em gelo, adicionaram-se 5 microlitros da mistura de ligação acima descrita, incubaram-se as células durante uma hora em banho de gelo e durante dois minutos a 42° C e, em seguida, colocaram-se em gelo durante cinco minutos. Antes da placa-gem das células, adicionaram-se 900 microlitros de meio LB, incubou-se a 37° C durante dez minutos e colocaram-se cada uma em 200 microlitros de suspensão de células em placas de agar--agar (agar a 1,5% em meio de LB com 100 mg/litro de ampicilina) e incubou-se durante a noite. Transformaram-se as células competentes JM101 com o plasmídio pl8.

Alguns dos clones Amp assim obtidos foram submetidos a análise de restrição e a partir de um dos clones positivos (18/1) recuperou-se um plasmídio-ADN em larga medida (T. Mania-tis e col, 1982, Molecular Cloning: a Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, página 86 e seguintes).

Purificou-se em seguida o plasmídio por passagem através de uma coluna de Sephacryl-S-1000 (diâmetro = 0,9 cm; comprimento = 20 cm). Como tampão de eluição, utilizou-se um tampão TE. Separou-se o eluído em fracções com cerca de 0,5 ml e determinou-se o teor das fracções individuais a 260 nm (geralmente, o pico do plasmídio aparece entre a fracção 9 e a fracção 14). O início do pico de ARN é de se esperar a partir da fracção 17 (DO superior a 3,0).

Reuniram-se as fracções que interessavam, liofilizaram--se, retomou-se o plasmídio em 0,5 ml de tampão TE, incubou-se a 65° c durante cinco minutos, extraíu-se com fenol/clorofórmio e clorofórmio, precipitou-se, centrifugou-se, secou-se e dissolveu-se em 100 microlitros de tampão TE.

Cortaram-se cerca de 10 microgramas de plasmídio 18/1 com Accl e HindIII (os sítios de Accl derivam do HRV2-CADN, os 39 sítios de HindIII da região de poliligações de pUC9).

Paralelamente a isso, digeriu-se o clone 521 com Accl e HindIII. O fragmento AccI/HindIII do clone 521 abrange o HRV2-CADN dos nucleótidos dos números 3075 - 3698 (Figura 11). O fragmento de AccI/HindIII de 521 foi ligado em 18/1 (Accl/-HindlII) e transformou-se JM101 competente como se descreveu acima.

Ensaiaram-se as colónias assim obtidas por análise de restrição (EcoRI, PstI, Accl e HindIII) e sequenciou-se o plasmídio do ADN de alguns clones. Um clone que possuía a sequência HRV2 de 2145 - 3689 e os quadros de leitura correctos foram designados 18521 e escolhidos para expressão. Na construção 18521, estão existentes as regiões G-C homopoliméricas que derivam ainda da clonação em pBR322 do lado 5' do sítio de HindIII. Cortou-se pl8521 com EcoRI e HindIII, isolou-se o fragmento com papel DE81 e inseriu-se por ligação em pEx34c (EcoRI/HindIII). pEx34 é um vector de expressão com 3,0 kb (um derivado de pPLc24; E. Remault, P. Stanssens e W. Fiers, 1981, Gene 1_5, 81 - 93) que contém os seguintes cortes: o sítio de ligação ribossómico procariótico; uma parte da região de codificação dos primeiros noventa e oito aminoácidos N-terminais da MS2-polimerase; esta porção da fusão possui aminoácidos hidrofóbicos e básicos e origina a diminuição de solubilidade da proteína de fusão e aumenta a estabilidade do produto exprimido nas células; i - a proteína de fusão está sob o controlo do lambda-promotor | da esquerda; uma pequena região de poliligação em três quadros de leitura diferentes (pExa, b e c) com sítios de corte para EcoRI,

BamHI e HindIII possibilita a introdução de fragmentos de ADN apropriados na fase por baixo da parte da proteína de fusão; - a região "ori" e a de resistência à ampicilina do pBR322. E. coli W6 (lambda) exprimiu constitutivamente o gene * . para o lambda-repressor do tipo natural e é apropriado para a 40 possui um novo cultura do pEx-plasmídio. E. coli 537, pelo contrário, a mutação cl 853-lambda-repressor (inactiva a 42° C) de j plasmídio que também possui o gene de resistência a canamicina ; (K. Strebel, E. Beck, K. Strohmaier e H. Schaller, 1986, J. Vi- rol. 57, 983 - 991).

Por inserção do fragmento EcoRI/HindIII de pl8521 em pEx34c, pôde obter-se um sistema de expressão que abrange a | região (VP3)-VP1-P"A-(P2B) de HRV2 (2145 - 3689; veja-se Figura 12) .

Este sistema de expressão produziu um polipéptido do vírus que serve de substrato o qual possui simultaneamente acti-vidade de P2A-protease.

Para se obter agora um substrato de enzima inactivo para P2A, cultivou-se o vector de expressão pEx34c x 18521 em E. coli W6(lambda). Como se descreveu acima, isolou-se o vector de acordo com a técnica de preparação em larga escala, a partir de 500 ml de uma cultura durante a noite. Digeriram-se 2 micro-gramas de pEx34c x 18521 com HindIII e purificou-se com o auxílio de DE81, como se descreveu acima. Em seguida, digeriu-se o vector linearizado com Bal31-nuclease, procedendo como se indi ca seguidamente.

Incubou-se cerca de 1 micrograma do vector linearizado com HindIII com 1 U de Bal31-nuclease (Biolabs) em 20 mM de Tris-HCl pH = 8, 600 mM de NaCl, 12 mM de MgC^ e 1 mM de EDTA. Retiraram-se amostras alíquotas ao fim del, 2, 3, 4, 5, 6e8 minutos e interrompeu-se a digestão por adição de EDTA (concentração final 30 mM). 0 ADN foi de novo recuperado por precipi-

I tação com etanol e incubaram-se 100 nanogramas de plasmídio com 100 U de T4-ligase em 10 mM de Tris-HCl pH = 7,5, 6 mM de MgC^, 6 mM de BME e 1 mM de ATP, durante a noite a 15° C. A mistura de T4-ADN-ligase foi directamente ligada para a transformação de E. coli W6(lambda). Alguns dos clones foram picados e o respec-tivo plasmídio de ADN foi sequenciado de acordo com Maxam e Gil-bert (A. Maxam e W. Gilbert, 1980, Nucleic Acids Res. 6_5, 499 -560). O clone cujo cADN termina com o nucleótido de HRV2 número ‘ 3321 (veja-se T. Skern e col. , 1985, Nucleic Acids Res. 13i, 2111 41

j- 2126) foi designado 18731. Desenvolveu-se este mutante de supressão de 18521 como substrato da enzima P2A inactivo para estudos de expressão.

Exemplo 2

Expressão e Detecção de Proteínas de Fusão 0 plasmídio pEx34c x 18521 e os plasmídios dos clones da digestão de Bal31 de pEx34c x 18521 foram transferidos para células de E. coli. As células foram cultivadas durante a noite a 28° C em meio de LB (+ 100 mg de ampicilina/litro e 25 mg de canamicina/litro).

As culturas foram em seguida diluídas na proporção de 1 : 5 com meio de LB previamente aquecido (42° C) sem antibiótico (indução de promotor-lambda-PL) e incubou-se durante duas horas, sob intensa agitação por sacudidelas, a 42° C. Depois de duas horas, colheram-se as células de 1 ml da cultura (dois minutos na centrífuga de Eppendorf, 4o C) e ressuspenderam-se em 500 microlitros de tampão para tratamento com ultra-sons a frio (150 mM de NaCl, 50 mM de Tris-HCl pH = 8 e 1 mM de EDTA). Realizou-se a ruptura das células com o auxílio de um aparelho de ultra-sons de potência M. S. E. (três vezes durante cinco segundos de cada vez; 1,7 amperes), tendo-se empregado entre os tratamentos individuais com ultra-sons um intervalo de quarenta e cinco segundos para evitar o sobre-aquecimento das amostras. Seguidamente, recuperou-se o material insolúvel por centrifugação durante dois minutos na centrífuga de Eppendorf e dissolveu-se o pelete em 200 microlitros de tampão de amostra (4% de SDS, 125 mM de Tris-HCl pH = 6,8, 10% de BME, 10% de glicerina e 0,02% de azul de bromofenol). Depois de se aquecer a 95°C durante quatro minutos, separaram-se 10 microlitros das amostras num gel de 10% de SDS-PAA (U. K. Lammli, 1970, Nature 227, 680 - 685).

As experiências de controlo mostraram que todas as proteínas exprimidas no tampão de tratamento com ultra-sons são insolúveis. Os geles foram seguidamente corandos com azul brilhante de Coomassie, procedendo da seguinte maneira: - 42 -

Coloração:

Descoloração: 30 a 60 minutos em 50% de metanol, 10% de ácido acético e 0,1% de azul brilhante de Coomassie. durante a noite, em 5% de metanol e 10% de ácido acético.

Banho de glicerina: 30 minutos em 7% de ácido acético e 2% de glicerina.

Banho de etanol: 1 a 2 minutos em etanol a 96%.

Secagem: em papel 3MM; 2 a 3 horas a 80° C em secador de gel (Hoefer, SE 1160).

Na Figura 13, está representada uma fotografia típica do tingimento com azul brilhante de Coomassie de uma expressão de pEx34c x 18521 em 537. Separaram-se igualmente os mutantes de supressão 18731 (veja-se Figura 13). pEx34c x 18731 termina no nucleótido número 3321 e, por consequência, não possui o provável centro activo de P2A.

Para verificar a especificidade antigénica dessas formas exprimidas de 18521 e 18731, realizou-se uma mancha de Western com o auxílio de um soro policlonal contra VP1 (ATCC-VR--1112 AS/GP; VP1 é o componente integral dos dois plasmídios de expressão pEx34c χ 18521 e 18731). Realizou-se a mancha de Western procedendo da seguinte maneira:

Para electrotransferência das proteínas separadas do gel para a nitrocelulose, utilizaram-se quatro camadas de papel 3MM (Whatman) e uma camada de nitrocelulose (Schleicher e Schuell, BA85, 0,45 micrómetro) exactamente com as dimensões do gel de separação cortadas correspondentemente e pré-incubaram-se em tampão de transferência: 20 mM 150 mM 20% (pH = 8,8

Tris-base glicina de metanol p. a. não precisa de ser titulado) A composição da "sanduíche de transferência" realizou- . -se de acordo com o esquema indicado em seguida (evitar as bolhas * de ar): 43 15

C7T - Pol —> scotch brite —> 2 camadas de 3MM —> gel —>nitroce-lulose —> 2 camadas de 3MM —> scotch brite —> + Pol. 0 gel de proteína foi igualmente equilibrado antes da utilização durante dois minutos em tampão de transferência. O tampão de transferência pode também preparar-se sob a forma de uma solução 10 x (24,2 gramas de Tris e 112,6 gramas de glicina por litro sem metanol). A transferência realizou-se em tampão de transferência a cerca de 1 ampere, durante duas horas, num aparelho de mancha de proteína em presença de 0,1% de Empigen BB (sal de alquil--dimetilamónio de betaína; Número 62 852 Marchon France S. A.) (R. E. Mandrell e col., J. Immunol. Meth. 6_7, página 1 (1984)). A eficiência da transferência realizou-se por meio do ensaio das proteínas de marcação previamente coradas.

Os filtros com as proteínas a eles ligadas foram banhados durante a noite à temperatura ambiente com 50 ml de "solução de bloqueio", que é PBS:

137,0 mM 2,7 mM 8.0 mM 1,5 mM 0,5 mM 1.0 mM

NaCl KC1

Na-HPO. 2 4 KH„PO. 2 4

MgCl2.6H20

CaCl2.2H20. com 1% de BSA, 1% de Tween 20 (polioxietileno (20)-monolaurato de sorbitano) e 10% de soro de feto de vitela inactivado por calor (HIFKS).

Pré-incubou-se o anti-soro policlonal contra VP1 (ATCC VR-1112 AS/GP) com o lisato de E. coli antes da utilização para Seliminar os anticorpos específicos de E. coli. Para este efeito, 'misturaram-se volumes iguais de anti-soro e de lisato de células de E. coli, incubou-se à temperatura ambiente durante duas horas e durante a noite a 4o C. Separaram-se as proteínas de E. coli que reagiram cruzadamente como imunoprecipitado por centrifugação (cinco minutos, centrífuga de Eppendorf) do sobrenadante. | Em seguida, incubou-se o filtro de nitrocelulose durante três 44

horas em "solução de bloqueio"("Blocking Solution") com um anticorpo policlonal (antissoro policlonal pré-rucubado diluído 1/500 a 1/1000 com "solução de bloqueio") numa caixa de plexiglas numa instalação com movimento de vai-vem. Em seguida, lavou-se bem o filtro com água da torneira (cerca de quinze minutos) e lavou-se por três vezes durante quinze minutos de cada vez com 50 ml de PBS (+ 1% de Tween 20). Na última operação, incubou--se o filtro com cerca de 50 ml de "solução de bloqueio" com anti-anticorpos de coelho conjugados com fosfatase alcalina (1/5000 a 1/7500 em "solução de bloqueio), durante três horas à temperatura ambiente. Lavou-se de novo cuidadosamente sob uma corrente de água da torneira (quinze minutos) e por três vezes como se mencionou acima com 50 ml de cada vez de PBS (+ 1% de Tween 20). A ligação realizou-se em 10 ml de tampão de fosfatase : 100 mM de Tris-HCl, pH = 9,5 100 mM de NaCl 5 mM de MgC^. em presença do corante azul de nitrotetrazólio (NBT; 165 micro-gramas/mililitro) e fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP; 82,5 microgramas/mililitro). A anti-coelho-IgG (Fc) conjugada com fosfatase alcalina, assim como os corantes NBT e BCIP foram adquiridos na firma Promega Biotec (Protoblot TM-System). A reacção de coloração foi igualmente interrompida por lavagem depois de cerca de um minuto com uma corrente de água da torneira. Na Figura 14 está representada uma fotografia típica de mancha de Western de pEx34c x 18521 e 18731.

Exemplo 3

Estabelecimento de um Sistema de Expressão para a Preparação de Protease 2A Original, assim como Análise dos Mutantes Pontuais no Provável Centro Activo de 2A

Para investigar o papel de alguns aminoácidos muito conservados na região do provável centro activo (veja-se Figura 15), realizou-se a mutagénese in vitro com utilização de uma cassete de oligonucleótidos e a supressão de alguns aminoácidos 45

K c; nesta região.

Paralelamente a este processamento, utilizou-se este método para exprimir a protease 2A original. A partir de pExl8521, obteve-se por digestão com Apal (nucleótido número 3458 de cADN de HRV2) e HindIII (sítio de corte de restrição que deriva da região de poliligação do vector; veja-se Exemplo 1) procedendo de acordo com as indicações do fabricante (Biolabs), um fragmento de ADN com o comprimento de 264 pb, que foi substituído por dois oligonucleótidos de cadeia dupla, WT12 e WT34 com "extremidades pegajosas" Apal/HindIII (veja-se Figura 16).

Em primeiro lugar, tratou-se com quinase um micrograma dos oligonucleótidos de uma única cadeia WT1, WT2, WT3 e WT4 em respectivamente 10 microlitros (20 mM de Tris-HCl, pH = 7,5, 10 mM de MgC^, 20 mM de DTT e 1 mM de ATP) com 2 unidades de T4-polinucleótido quinase (Biolabs), durante trinta minutos a 37° C. Em seguida, reuniram-se as misturas de quinase de WT1 e WT2 e de WT3 e WT4, e incubaram-se durante dez minutos a 68°c, trinta minutos a 45° C e dez minutos à temperatura ambiente e, em seguida, durante curto intervalo de tempo em banho de gelo.

Os oligonucleótidos quinasados e hibridizados desta forma foram reunidos, diluídos até à concentração de 1 mM com uma solução 10 mM de ATP e mistura-se com 28 unidades de T4-ADN--ligase (Boehringer Nannheim) para ligação. A ligação propriamente realizou-se em primeiro lugar a 20° C durante duas horas e depois adicionaram-se ainda mais 7 unidades de T4-ADN-ligase e incubou-se a mistura de ligação durante quarenta horas a 14°C. Seguidamente, incubou-se a mistura de ligação a 70° C durante dez minutos, diluíu-se a 100 mM com uma solução 1 M de NaCl e as formas multiméricas do oligonucleótido foram "cortadas pos-teriormente',' com 50 unidades de Apal e 20 U de HindIII. A purificação e o isolamento do fragmento correcto de cadeia dupla Apal/HindIIE, assim como a clonação deste fragmento em pExl8521 (cortado com Apal e HindIII) e a identificação realizou-se por sequenciamento, como se descreveu no Exemplo 1.

Escolheu-se um clone positivo e recorreu-se a ele para 46

estudos de expressão, assim como para o ensaio de "trans"-acti-vidade. Desta forma, obtiveram-se os clones pEx2A; pEx2A Cys 106 —> Ser, - Cys 112 —> Ser e -His 114 —> Gly. A indução da expressão realizou-se exactamente como se descreveu no Exemplo 2 e obteve-se o resultado representado nas Figuras 17 e 18.

Exemplo 4

Produção do Anticorpo Peptídico PC20

Os últimos vinte aminoácidos da protease 2A representam um determinante antigénico potencial. Sintetizou-se um péptido (PC20), que apresenta exactamente esta sequência de aminoácidos e utilizou-se para a indução de anticorpos em coelhos .

Recolheram-se 570 microgramas desse péptido em 0,4 ml de solução de PBS e utilizou-se numa injecção de 5 ml. Numa segunda injecção de 5 ml, utilizou-se 0,5 ml de adjuvante de Freund (CAF; GIBCO) e misturaram-se os dois componentes em seguida com o auxílio duma válvula de macho de três vias, até se ter formado uma emulsão. O coelho foi puncionado numa artéria da orelha para se obter um pré-soro para controlo negativo. A imunização realizou-se por injecção subcutânea da mistura de péptido/CFA em quatro sítios diferentes (0,2 ml/local de injecção) da zona das costas. Depois de cinco semanas, "reforçou-se" com 1,2 ml de solução de péptido por injecção intramuscular de, respectiva-mente, 0,2 ml na parte das costas. Oito dias depois, retirou-se uma amostra de sangue por punctura no coração. O sangue foi deixado à temperatura ambiente, eliminou--se a fibrina e os componentes formados com uma vareta esterilizada e centrifugou-se o sangue a 2000 rotações por minuto. O soro foi dividido em partes alíquotas e armazenado a -18° C.

Exemplo 5

Introdução de Novas Sequências de Reconhecimentos Singulares para as Enzimas de Restrição no Segmento do Vector de Expressão 47

ρΕχ2Α que Codifica a Região da Extremidade C de VP1 e de HRV2-2A

Com a finalidade da análise de especificidade da separação e para a introdução de omissões na zona de codificação de HRV2-2A, estabeleceu-se um plasmídio modificado a partir do vec-tor de expressão pEx2A (veja-se Exemplo 3), o qual, na região de codificação em volta da posição de separação e na zona para a protease 2A, possui novas sequências de reconhecimento singulares para as enzimas de restrição. Estes sistema de expressão modificado com conservação das sequências de aminoácidos naturais possui uma sequência de nucleótidos alterada que foi introduzida com o auxílio de oligonucleótidos de cadeia dupla sintéticos (Figura 3). 1. A partir do plasmídio de expressão pEx2A, isolou-se um fragmento de Accl (cerca de 700 pb) em condições usuais. Este fragmento abrange a extremidade C de VP1, toda a região de codificação de HRV2-2A (incluindo o codão de interrupção depois do último aminoácido para o HRV2-2A), assim como parte do vector de ADN (ver Figura 11). O fragmento Accl purificado de pEx2A foi em seguida cortado com BstEII. O fragmento maior de BstEII/AccI (cerca de 635 pares de bases) foi separado do fragmento de AccI/BstEII mais pequeno (cerca de 115 pb), purificado e ligado em condições usuais com um oligonucleótido de cadeia dupla sintético (cerca | de 115 pares de bases; veja-se Figura 4), que corresponde ao fragmento de pequenas dimensões de AccI/BstEII, mas possui uma sequência de ácidos nucleicos modificada. O novo fragmento Accl recombinado foi cortado com Accl para se obterem formas multímeras e ligado ao vector pEx2A linearizado originalmente com Accl e transformado em células de E. coli W6 (1) competentes. Obtiveram-se cem clones resistentes a ampicilina e escolheram-se e sequenciaram-se três clones com base na análise com enzimas de restrição. Um clone pEx2A/21 foi transformado e expresso em E. coli 537, como se descreveu acima, em que o produto da expressão de pEx2A/21 mostra um comportamento idêntico relativamente à mancha de Western que ρΕχ2Α (veja-se Figura 5, pista 2.) 48

2. Para se obterem novos sítios de corte de restrição singulares apropriados na parte central de pEx2A que cofifica HRV2 -2A, digeriu-se primeiramente o vector de ADN de pEx2A com BstEII e Apal e separou-se do fragmento BstEIl/Apal assim obtido (com cerca de 270 pb) em gel de agarose. Tanto Apal como também BstEII são sequências de reconhecimento para enzimas de restrição que originalmente se encontram no cADN de HRV2 (número de posição 3458 para Apal e 3188 para BstEII, veja-se Pedido de Patente de Invenção Alemã P 35 05 148.5).

Paralelamente a esta operação, lugaram-se três oligo-nucleótidos de cadeia dupla (2A-1512AB, 2A-1600AB e 2A-1728AB) que representam a região entre os sítios de Apal e BstEII de HRV2-2A (veja-se Figura 6), cortaram-se com Apal/BstEII e inse-riram-seno vector pEx2A linearizado com Apal e BstEII. Utili-zou-se este vector pEx2A modificado para transformar células de E. coli W6(l) competentes.

De alguns dos cem clones, escolheram-se quatro com base no seu modelo de restrição, sequenciaram-se e transformaram-se com eles microorganismos E. coli 537 competentes. 0 modelo de expressão de um clone (pEx2A/II, veja-se Figura 5, pista 3) apresenta vim comportamento idêntico ao de pEx2A (veja-se Figura 5, pista 1). Como se mostara na Figura 3, o novo fragmento BstEII/Apal introduzido possui sítios de corte singulares para BglII e SnaBI.

Estes dois novos vectores de expressão, pEx2A/21 e pEx2A/II, possibilitam, com utilização dos novos sítios de restrição assim gerados, a constituição de oligonucleótidos de mutação que, por um lado, foram utilizados para a análise fina dos sítios de seapração (veja-se Exemplo 6) e, por outro lado, podem ser empregados para os estudos de omissões para determinar ainda uma região proteoliticamente activa mais pequena de HRV2-2A.

Exemplo 6

Análise de Mutação do Sítio PI da Protease 2A de HRV2

As mutações da posição PI do sítio de separação da 49 protease 2A de HRV2 {seguidamente designada HRV2-2A) foram realizadas no sistema de vector de expressão ρΕχ18521 ou pEx2A. 1. Mutação Ala —> Tyr no Sítio de Separação de HRV2-2A com Utilização do Sistema de Vector de Expressão ρΕχ!8521

Em primeiro lugar, substituíu-se a alanina da posição PI em HRV2 por tirosina. Esta mutação origina um par de amino-ácidos Y/G na posição de separação 2A, como acontece em polio-vírus (H. Toyoda e col., 1986, Cell 45, 761 - 770). A partir do fragmento PstI/HindIII de 1,3 kb isolado do vector de expressão pExl8521, inseriu-se este fragmento num vector Bluescript (sistema de clonação de estratagenes). A partir deste novo plasmídio recombinado, isolou-se a forma com cadeia única com o auxílio dos métodos habituais ou de acordo com a prescrição do fabricante (estojo Amarsham : Oligonucleotide--directed in vitro mutagenesis System). Realizou-se a mutação pontual da forma de cadeia única com o auxílio do oligonucleó-tido EBI 936 (veja-se Figura 1), de acordo com as prescrições do fabricante (estojo Amersham : "Oligonucleotide-directed in vitro mutagenesis kit").

Verificaram-se os plasmídios recombinantes que continham a mutação por sequenciamento. Isolou-se o fragmento Pstl/-HindlII que contém a mutação (Ala —> Tyr) e utilizou-se para substituir o fragmento do tipo natural de pExl8521.

2. Mutações no Sítio de Separação de HRV2-2A com Utilização do Vector de Expressão pEx2A

Utilizou-se um derivado do vector pEx2A, nomeadamente pEx2A/21, que contém, entre outras, uma sequência de reconhecimento MluI novamente gerada na posição 3137 do HRV2-cADN (veja--se Exemplo 5), para introduzir outras mutações em e em volta do sítio de separação com o auxílio de oligonucleótidos de cadeia dupla (veja-se Figura 1) em que o novo sítio de restrição procurado MluI e o sítio de BstEII originalmente existente em HRV2-cADN foram utilizados. Neste caso, por exemplo, predeter-minou-se um oligonucleótido de cadeia dupla de cada um dos ami-noácidos nas posições Pl - 4 e Pl1 -4', como se encontra no sorotipo HRV89 (ver Figura 1). 50 A preparação do vector de ADN, a integração do oligo-nucleótido de cadeia dupla e o sequenciamento de ADN realizaram--se de acordo com os processos usuais. A expressão da proteína mudada realizou-se em E. coli 537 ou AR58, como se descreveu.

Os produtos da expressão foram analisados em geles de poliacrilamida contendo SDS (veja-se Figura 2A e Figura 2B). Submeteram-se idênticos geles de poliacrilamida a análise de manchamento de Western, em que, por um lado, se utilizou um anticorpo de rato monoclonal que se dirige contra a parte da extremidade N da MS2-polimerase (por exemplo, a anti-MS2-Pol; J. Hansen e col., Embo Journal, Vol. 7, 1785 - 1791 (1988)); por outro lado, introduziu-se um anti-soro de coelho policlonal que reconhece um péptido que consiste nos últimos vinte aminoá-cidos do HRV2-2A original (daqui por diante designado como anti--PC20).

Separaram-se igualmente de maneira eficiente as construções que possuem os aminoácidos glutamina, leucina, metioni-na, fenilalanina e tirosina na posição PI como o tipo natural, o que é originado pela falta das bandas do material não separado a 65 KD (no caso da mutação da tirosina a 75 kD). No entanto, não foram processados completamente os mutantes que possuem valina ou isoleucina na posição Pl. Quando se processou a construção que contém valina, não se processou 25% da proteína produzida; se, nesta posição, se encontra um radical de isoleucina, então, na realidade, não se separou 50% do material induzido. Encontra-se também uma nítida redução da eficiência de separação quando se utilizam aqueles aminoácidos na posição Pl - 4 e Pl' -- 4' como se encontra no sorotipo HRV89 (não se processa cerca de 65 - 70% da proteína induzida).

Resumidamente, pode dizer-se que os aminoácidos isoleucina e valina, como é de esperar, não se adaptam muito bem no centro activo de HRV2-2H; isto é tanto mais importante quanto a valina é o aminoácido que se encontra normalmente na posição Pl de HRV89.

Possivelmente, o grupo metilo do átomo de C na posição beta prejudica a topografia do centro activo ou uma alteração estrutural do substrato necessária à separação proteolítica. 51 1 f’* ·~~?Ε53®Μ8e

Deve concluir-se, portanto, que existem diferenças nas estruturas dos centros activos do 2A entre os sorotipos HRV2 e HRV89.

Exemplo 7

Influência de Diferentes Substratos de Péptidos e de Diferentes Condições de Incubação sobre a Eficiência da Actividade "Trans" de HRV2-2A in Vitro

Os péptidos utilizados neste Exemplo foram adquiridos parcialmente à firma "Multiple Peptide Systems" (San Diego, Califórnia, EUA) ou foram sintetizados de acordo com o método de "fase sólida" (R. B. Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc., 85, 2149 - 2154).

Os péptidos foram em seguida purificados por cromato-grafia em fase líquida de alta pressão de "fase inversa" (0,1% de ácido triflúor-acético e acetonitrilo com fase móvel) e identificados com auxílio de análise de cromatografia em fase líquida sob alta pressão, espectrometria de massa com bombardeamento de átomos rápidos (FAB-MS) e por sequenciamento de aminoácidos (M. W. Hunkapiller e L. E. Hood, 1983, Science 219, 650 - 659).

Se não se indica o contrário, todos os péptidos utilizados, por razões de estabilidade, possuem uma extremidade N bloqueada por um grupo acetilo e a extremidade C é sempre uma amida de ácido.

A indução do sistema de expressão 2A na estirpe E. coli 537 realizou-se como se descreveu no Exemplo 2. Depois de duas horas de incubação a 42° C, recolheram-se as células de 1 ml de cultura (trinta segundos na centrífuga de Eppendorf, 4° C) e ressuspenderam-se em 500 microlitros de tampão de actividade "trans" (50 mM de Tris-HCl, pH = 8,0, 2,5 mM de NaCl e 1 mM de EDTA). A ruptura das células realizou-se com o auxílio de um aparelho de ultra-sons M. S. E. Ultrasonic Power (trinta segundos; em banho-maria). O material insolúvel, foi separado por centrifugação a 100.000 g (4o C, trinta minutos na ultracen-trífuga; Rotortype Ti 50, Beckmann) e misturaram-se 100 microlitros deste sobrenadante respectivamente com 5 microlitros de uma solução aquosa do péptido (4 mg/ml) e incubou-se a 37° C 52 durante trinta minutos.

Interrompeu-se a reacção por adição

do mesmo volume de HCIO^ 1 M

Em seguida, incubaram-se as amostras durante vinte minutos sob gelo, centrifugou-se durante dez minutos a 4° C (centrífuga de Eppendorf), misturou-se com o mesmo volume de K2HPO^ 1,4 M, incubou-se à temperatura ambiente durante cinco minutos e separou-se o precipitado assim obtido por centrifugação (cinco minutos na centrífuga de Eppendorf). 0 sobrenadante que contém o péptido foi em seguida separado por cromatografia em fase líquida sob alta pressão em "fase inversa".

Em seguida, encontra-se uma lista dos dados importantes para a análise de cromatografia em fase líquida sob alta pressão para a análise de péptidos :

Instalação para Cromatografia em Fase Líquida sob Alta Pressão

Injector automático :

Bomba de cromatografia em fase líquida sob alta pressão

Controlo do gradiente :

Controlador de temperatura Waters (30° C)

Integrador :

Waters WISP 710 A

Waters modelo 510 (duas bombas para mistura no lado de alta pressão)

Detector de absorvância a 214 nm, módulo estendido : 280 nm (aparelho de filtro)

Waters QA 1 Data System (idêntico ao integrador 3390 A de Hewlett Packard).

Condições de Realização da Cromatografia em Fase Líquida sob Alta Pressão

Coluna : Bakerbond C18 5 mm 4,6 x 250 mm, sensibilidade do fotómetro :

214 nm : 0,5 AUFS 280 nm : 0,05 AUFS

[ Impressor : sensibilidade 10 mV, avanço 1 • cm/minuto 53

Caudal : 1 ml/minuto

Temperatura da coluna :

Quantidade de amostra utilizada :

Agente eluente A :

Agente eluente B :

Condições do gradiente : isocrático gradiente linear j gradiente linear isocrático

Regulações do integrador : atenuação : valor limiar : velocidade do papel ;

30° C 150 microlitros água destilada + 0,1% de ácido triflúor-acético acetonitrilo + 0,1% de ácido triflúor-acético

1 minuto 90% A 10% B 27 minutos 60% A 40% B 1 minuto 20% A 00 o B 5 minutos 20% A 00 o B 8 7 0,5 cm/minuto (de 8-30 minutos, só 0,2 cm/minuto).

Preparação Prévia das Amostras para Cromatografia em Fase Líquida sob Alta Pressão

As amostras foram submetidas a sacudimento, tratadas durante dez segundos num banho de ultra-sons, centrifugadas (centrífuga de Eppendorf) e o sobrenadante injectado. A identificação dos péptidos e dos seus produtos de separação realizou-se utilizando o substrato original do pépti-do com dezasseis aminoácidos (Ac-TRPIITTAGPSDMYVH-NH^, péptido H) por meio de um péptido de referência (GPSDMYVH-NH2), que representa o produto da separação da extremidade C. A separação do péptido H que se realiza especificamente entre alanina e gli-cina serviu em todos os ensaios como sistema de referência. No caso de se utilizarem substratos de péptido modificados, identificaram-se os produtos de separação da extremidade C por se-quenciamento da extremidade N (M. W. Hunkapiller e L. E. Hood, loc. cit.) e identificou-se a extremidade N com um grupo aceti- 54

lo nos produtos da extremidade N por análise de aminoácidos de Beckman. 1. A partir do péptido padrão H, investigou-se em primeiro lugar a questão do comprimento do péptido e a sua influência sobre a eficiência da actividade "trans". Um encurtamento assimétrico dos péptidos na extremidade N (veja-se Figura 7; péptidos Η, A, B, C, DeE) mostrou que pelo menos cinco aminoácidos da região P (que correspondem aos últimos aminoácidos da extremidade C de VP1) têm de existir para se realizar uma separação in trans.

No caso de um encurtamento simétrico dos péptidos de separação (veja-se Figura 7; péptidos G, I e J); no caso do comprimento dos péptidos de 7 e 10 aminoácidos (péptidos J e I) não se verificou nenhuma separação; no caso de se utilizar um substrato de péptido com doze aminoácidos de comprimento (péptido G) , observou-se apenas uma separação insignificante. 2. A separação realizada em poliovírus entre VP1 e 2A de Polio---2A realiza-se entre a tirosina e a glicina. Realiza-se uma outra separação no poliovírus na região 3CD entre tirosina e glicina (H. Toyoda e col. , loc., cit.). A questão se HRV2-2A aceita o sinal de separação de polio foi respondida com o auxílio de outro substrato de péptido (veja-se Figura 7; péptidos F e K). Se se substituir o sinal de separação Ala/Gly para o HRV2-2A por troca de polio-2A (Tyr/Gly) sem todos os outros aminoácidos, então podem separar--se estes dois péptidos com a mesma eficiência do substrato de péptido natural com comprimento comparável de HRV2-2A.

Se, no entanto, se utilizarem péptidos (veja-se Figura 7; péptidos polio-2A/I e 2A/II), que representam não só o sinal de separação mas também toda a região original de separação de poliovírus, então não se realiza qualquer separação por HRV2-2A. O péptido polio 2A/I representa o sítio de separação VP1/2A para a protease 2A de poliovírus do tipo 1 e 2A/II representa o sítio de separação alternativo para a protease 2A em 3CD para poliovírus do tipo 1. 55 3.

Mediante o ensaio das diferentes condições de incubação, pode verificar-se que, em presença de NaCl 2,5 M no tampão de actividade "trans" (ver Tabela 1), realiza-se uma sepa ração completa do substrato do péptido e nenhuma degradação não específica do substrato de péptido e do seu produto de separação (mencionado no Exemplo da eliminação trans do péptido K; veja-se Figura 8).

Nestes ensaios, por razões de melhor estabilidade ou de melhores rendimentos da síntese dos péptidos, em vez do péptido original H, empregou-se o péptido K. Todos os resultados abaixo mencionados no caso do péptido K, podem no entanto reproduzir-se com a mesma eficiência utilizando o péptido H. 4. Para posterior caracterização de HRV2-2A, ensaiou-se a influência de diferentes detergentes, agentes dissolventes e agentes desnaturantes sobre a eficiência da actividade "trans" de HRV2-2A. 0 ensaio da actividade "trans", realizou--se nas condições usuais acima mencionadas (com a excepção de se usar NaCl apenas 0,5 M no tampão de actividade "trans").

Como substrato dessa série de ensaios, empregou-se o péptido K. Verificou-se que todos os detergentes empregados, tais como Empigen (sal de alquil-dimetilamónio de betaína), NP40 (octil--fenol-óxido de etileno), Tween 20 (monolaurato de polioxietile-no-sorbitano), DMSO (sulfóxido de dimetilo) e igualmente a glicerina realizam uma influência negativa drástica na actividade "trans" de HRV2-2A (Tabela 1).

Mesmo no caso de diluições para concentrações mínimas - com excepção de DMSO - verificou-se uma inibição igual a 30%. Substâncias como sulfato de amónio, cloridrato de guanidínio e ureia demonstraram, pelo contrário, uma influência comparativamente muito menor sobre a actividade "trans". A utilização de elevadas forças iónicas (NaCl até 2,5 M), não inibem a actividade "trans". A presença de elevadas concentrações de NaCl originou pelo contrário uma maior eficiência da actividade "trans" (100% de separação do substrato de péptido, diminuição da degradação não específica do produto de separação de. péptidos, etc.). • 5. O anti-soro policlonal anti-PC20, que é dirigido contra os últimos vinte aminoácidos da protease original 2A, reconhe- 56

ce HRV2-2A nas manchas de Western (W. Sommergruber e col., loc. cit. ) .

Para estabelecer bem a influência de anti-PC20 sobre a eficiência da actividade "trans", adicionaram-se quantidades crescentes de anti-PC20 no ensaio de actividade "trans" usado nas condições usuais (com excepção de se ter usado NaCl com a concentração de apenas 150 mM) (ver Figura 10).. Este ensaio, em que se utilizou o péptido K como substrato de péptido, mostrou que anti-PC20 não tem qualquer influência sobre a actividade "trans" de 2A.

Exemplo 8 í

Análise de Mutação do Sítio de Separação da Protease 2A de HRV2.

1. Mutações do Sítio PI da Protease 2A de HRV2 (seguidamente designada como HRV2-2A j Trocou-se o radical de alanina por um radical de tre- ! onina porque a treonina possui um grupo hidroxilo no átomo de

I C beta.

Utilizou-se um derivado do vector pEx2A, nomeadamente pEx2A/21, que, entre outros, contém uma sequência de reconhecimento MluI gerada na posição 3137 do HRV2-CADN e contém um novo sítio de Aval introduzido (posição 3163, veja-se Figura 4) para ser inserido com o auxílio de um oligonucleótido de cadeia dupla (veja-se Figura 19) na posição PI que origina a mutação Ala —> Thr, em que se utilizaram os sítios de restrição MluI e Aval recentemente incorporados. Para as construções, ligou--se o oligonucleótido da Figura 19 com o fragmento MluI/HindlII com 0,45 kb e com o fragmento Aval/HindIII de pEx2A/21 com 3,7 kb. A preparação do vector de ADN, a construção do oligonucleótido de dupla cadeia e o sequenciamènto de ADN realizaram--se de acordo com os métodos correntes. A expressão da proteína ligada realizou-se como se 57

descreveu, em E. coli 537 e AR58. Os produtos da expressão foram analisados em geles de poliacrilamida contendo SDS (veja-se Figura 24); a acção das mutações sobre a separação foi determinada por densitometria, tendo-se assim medido a proporção entre o polipéptido separado e não separado.

Também os mutantes Pl indicados no Exemplo 6 foram ensaiados de acordo com este método (veja-se Figura 24).

Para a densitometria, colocou-se o gel de poliacrilamida entre duas folhas de celofane previamente cosidas (bio--Rad) e secou-se. Os polipéptidos presentes como vestígios foram avaliados quantitativamente depois de coloração com Azul--de-Coomassie num espectrofotómetro Beckmann DU8 ou de um Den-sitómetro Sebia Preference Ecran.

Submeteram-se geles de poliacrilamida idênticos a uma análise de manchamento de Western, em que se empregaram, por um lado, um anticorpo de rato monoclonal que é dirigido contra a parte da extremidade N da MS2-polimerase (anti-MS2-Pol; J. Hansen e col., EMBO Journal, Vol. 7, 1785 - 1791 (1988)) e, por outro lado, por um anti-soro de coelho policlonal que reconhece um péptido, que consiste nos últimos vinte aminoácidos de HRV2-2A inicial (seguidamente designado como anti-PC20; W. Sommergruber e col., loc. cit.). 0 produto da expressão da construção foi bem separado com a permuta Ala —> Thr na posição Pl. 2. Mutações da Posição Pl' da Protease 2A de HRV2

Utilizou-se um derivado do vector pEx2A, nomeadamente pEx2A/21, que contém, entre outras, uma sequência de reconhecimento de MluI novamente gerada na posição 3137 do HRV2-cADN, para realizar mutações no sítio P^, com o auxílio de oligonucle-ótidos de cadeia dupla (veja-se Figura 20), em que se utilizaram os sítios de restrição novamente procurados MluI e os sítios BstEII originalmente existentes no HRV2-cADN. A construção e a análise das mutações realizou-se como se descreveu acima; a análise dos resultados obtidos com geles de poliacrilamida é representada na Figura 25. 58

As construções que possuem os aminoácidos triptofano, lisina, treonina e ácido glutâmico na posição , não foram separados, o que se atribui à falta das correspondentes bandas no material separado a 50 kD. Uma construção, em que a glicina na posição P^, foi omitida, igualmente não foi separada.

Além disso, o derivado do vector pEx2A/21 foi utilizado para introduzir mutações com o auxílio de oligonucleótidos de cadeia dupla (veja-se Figura 21) nos sítios P^,, P^, e Pg dos sítios de separação da protease 2A. Utilizaram-se novamente os novos sítios pretendidos MluI e o sítio BstEll existente originalmente em HRV2-cADN. A construção e a análise das mutações realizou-se como se descreveu acima; a análise dos resultados de geles de poliacrilamida é representada na Figura 25. A construção que possui uma omissão do radical de prolina no sítio . n^° f°i separada. A troca do radical de valina na posição P^, por ácido aspártico originou uma redução de 30% da eficiência da separação; pelo contrário, a substituição por treonina no mesmo sítio não influenciou a eficiência. A presença de um radical de treonina na posição P4, também não mostrou qualquer influência sobre a actividade da HRV2-2A protease.

Além disso, utilizou-se este sistema para investigar a influência da sequência entre P^, e Pg, sobre a actividade proteolítica de HRV2-2A. Como base de partida, serviram as sequências naturais que existem em HRV14 e no poliovírus (as sequências de poliovírus do sorotipo 1, 2 e 3 (estirpes Sabin) são idênticas nesta região). As sequências para a mutagénese estão representadas na Figura 22. Os oligonucleótidos da Figura 22 foram introduzidos no vector pEx2A/21 como se descreveu acima e as proteínas exprimidas foram analisadas (veja-se Figura 26) . A proteína expremida da construção com a sequência P11 ” P9' ^P2' Leu —> Pro^ de HRVÍ4 não processada. Não se observou uma separação da proteína exprimida na construção que possui a sequência P^, -Pg, de poliovírus nem numa construção muito semelhante que representa uma variante da poli-sequên- 59

cia P

!. ~ P9. (p4, His —> 3. Separação da Protease 2A de HRV2 no Sítio de Separação de HRV89

Mais uma vez, separaram-se mutantes com o auxílio do vector pEx2A/21, em que, em vez do sítio de BstEII, tem os novos sítios Aval introduzidos (posição 3163, veja-se Figura 4).

Para as construções, ligaram-se os oligonucleótidos da Figura 23 com o fragmento Mlu/HindlII de 0,45 kb e com o fragmento Aval/HindIII com 3,7 kb de pEx2A/21. A construção e a análise das mutações realizou-se como se descreveu acima; os geles de poliacrilamida resultantes estão representados na Figura 27. A partir da separação das proteínas exprimidas, conclui--se evidentemente que a protease HRV2-2A não pode reconhecer bem os sítios de separação que apresentam os aminoácidos de HRV89.

Para alicerçar este resultado, construiu-se cada sequência que corresponde à região do sítio de separação do soro-tipo 1B de Rhinovirus humanos:

Arg-Pro-Ile-Ile-Thr-Thr-Ala-Gly-Pro-Ser-Asp-Met-Tyr-Val-His- -Val por

Arg-Ala-Ser-Met-Lys-Thr-Val-Gly-Pro-Ser-Asp-Leu-Tyr-Val-His--Val. A sequência tem, na posição P^, um radical de valina; o produto de expressão foi apenas separado em 65%, como se vê claramente na Figura 26.

Exemplo 9

Expressão da Protease 2A de HRV89 e Ensaio da Especificidade da Separação 1. Expressão da Protease 2A de HRV89 (seguidamente designada como HRV89-2A) 60

;'^uuk*w

Para mostrar que também o gene 2A de HRV89 (EPA 261 403) codifica uma protease, preparou-se uma construção de ADN em que um fragmento de ADN que corresponde à região do gene 2A foi ligado ao fragmento de ADN que codifica HRV2-VP1. Depois da expressão deste híbrido no sistema pEx, pode verificar-se, a partir do comprimento da proteína de fusão, se a proteína 2A de HRV89 funciona como protease. As diferenças no gene 2A entre HRV2 a HRV89 são evidenciadas na Figura 28.

Para se obter esta construção, utilizou-se o seguinte processo. Como plasmídio de partida, utilizou-se o derivado de pEx 2A/21 descrito no Exemplo 6, que codifica na zona do sítio de separação nas posições P^ 4/P^, 4, uma sequência de aminoá-cidos como existe no sorotipo HRV89 seguidamente designado como PEx2A/P1_4/Pll_4,/89).

Em primeiro lugar, substituíu-se o fragmento pvull/-HindlII na extremidade C de HRV2-2A (veja-se Figura 30) por um oligonucleótido sintético que possui a sequência do HRV89-2A (veja-se Figura 29). O plasmídio assim obtido (designado por pEx2A/S89"/C89) foi em seguida digerido com MluI e PvuII e ligado com um oligonucleótido sintético I, Mlul/Nsp(7524) (veja-se Figura 29) e com um fragmento Nsp(7524)Ι/PvuII, como se representa na Figura 30. O oligonucleótido sintético codifica os sítios de separação como se encontrou previamente no sorotipo HRV89 e o fragmento Nsp(7524)Ι/PvuII codifica o HRV89-2A do aminoácidos 9 a 121. Este fragmento pode por exemplo obter-se a partir do clone HRV89/68, que foi descrito na Patente Europeia EPA 261 403.

Obteve-se dessa forma um plasmídio que foi designado como pEx2A/S89/89 (veja-se Figura 29 e Figura 30). Construiram--se outros dois mutantes de pEx2A/S89/89 para ensaiar a influência dos aminoácidos residuais sobre a eficiência da separação.

De novo, obtiveram-se os mutantes por construção de oligonucle-ótidos de cadeia dupla, em que se utilizou o sítio de restrição MluI acima mencionado e um novo sítio de restrição Ciai existente no oligonucleótido Mlul/Nsp(7524)I.

Numa mutação (seguidamente designada pEx2A/S2/89), preparou-se de novo o sítio de eliminação de HRV2; no segundo 61 (em seguida designado pE valina por alanina na posição PI (v λ ί,η/ k/vw'

) realizou-se eja-se Figura uma permuta de 29) . A preparação do vector de ADN, a construção dos oli-gonucleótidos de cadeia dupla e o sequenciamento de ADN reali-zaram-se de acordo com os processos correntes. A expressão da proteína mutada teve lugar em E. coli 537 ou AR58, como se descreveu acima.

Os produtos da expressão foram separados em geles de poliacrilamida com SDS e corados com azul-de-coomassie (Figura 31). Geles de poliacrilamida idênticos foram submetidos a análise de manchamento de Western, em que, por um lado, se empregou um anticorpo de rato monoclonal que é dirigido contra a parte da extremidade N da MS2-polimerase (anti-MS2-Pol; J. Han-sen e col., EMBO Journal, Vol. 7, 1785 - 1791 (1988)) de controlos; e, por outro lado, introduziu-se um anti-soro de coelho policlonal (anti-PC20). A análise dos produtos da expressão das três construções com o HRV89-2A pode ver-se na Figura 31. A proteína de fusão do mutante que possui o sítio de separação de HRV2 (pEx2A/-· S2/89) é separada quase completamente; a enzima HRV89-2A pode, portanto, reconhecer o sítio de separação de HRV2 de maneira exactamente tão eficiente como a enzima HRV2-2A. 0 produto não separado altera-se durante a construção com o HRV89-2A de maneira ligeiramente mais lenta, não obstante as duas proteínas 2A possuírem o mesmo número de aminoácidos. Possivelmente, as treze diferenças da sequência de aminoácidos tem uma certa influência sobre a mobilidade do péptido 2A. A interpretação dos resultados com as outras duas construções com o HRV89-2A (pEx2A/S89/89 e pEx2A/S891/89) foi dificultada pelo facto de, adicionalmente aos produtos com 65 kD e 50 kD esperados, se terem encontrado outras duas bandas com pesos moleculares de 62 kD e 60kD. Um ensaio mais exacto das bandas da mutante pEx2A/S2/89 com o sítio de HRV2 de separação mostrou que estas bandas também existiam nesta construção. Estas bandas não foram reconhecidas por anti-PC20 e, portanto, * não possuem a extremidade do terminal C da proteína 2A; parece . possível, portanto, que as bandas sejam provocadas por uma pausa 62

dos ribossomas ou uma interrupção das cadeias da região antes da extremidade C do polipéptido. Não obstante haver apenas quatro diferenças nesta região entre os polipéptidos 2A do HRV2 e de HRV89 no plano da proteína, a "utilização dos codões" é muito diferente. A análise dos produtos de expressão da construção intermediária pEx2A/S89"/C89 mostrou também um produto não esperado ligeiramente maior e a presença de duas bandas adicionais, o que demonstra que os fundamentos para isso se baseiam na zona dos últimos vinte aminoácidos. Não obstante a presença das duas bandas adicionais, é de esperar que num sistema de expressão referido na presente memória descritiva o HRV89-2A pode reconhecer melhor o sítio de separação do que o HRV2-2A do que o seu próprio produto não separado pela sua maior proporção nas construções pEx2A/S89’/89 e pEx2A/S89/89. Espera-se que neste caso a presença de alanina na posição PI prejudica a eliminação por HRV2-2A.

Pelo contrário, no caso do HRV89-2A, a situação é bastante diferente : a enzima HRV89-2A mostra que o seu sítio de separação não é especialmente bom para reconhecer. É possível que em perte in vivo de 2B seja necessário para a actividade de HRV89-2A, possivelmente tenham uma certa influência na conformação do polipéptido 2A.

Também a conformação das proteínas da cápside de HRV89 pode desempenhar certo papel importante na separação. Poderia pensar-se que a eliminação mais lenta seja provocada por uma função biológica, por exemplo, pela replicação do vírus, mas no entanto é conhecido que o sorotipo HRV89 se desenvolve de maneira nitidamente mais lenta que o sorotipo HRV2. REIVINDICAÇÕES - lâ - 63

Claims (1)

1. Processo para a preparação de moléculas de ADN que originam regiões VP1/P2A modificadas do sistema rinoviral, caracterizado por se obterem moléculas de ADN que codificam a região de VP1/P2A do sistema rinoviral e que, na zona da pro-tease 2A, não possuem as sequências de sinal singulares do tipo natural para as enzimas de restrição. - 2ã - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizar o tipo de soro HRV2 ou HRV89 como sistema rinoviral. - 3§ - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por reconhecerem as sequências de sinal para as enzimas de restrição Xmal, Smal, XmalII, Aval, Nael, MluI, EagI, BglII ou SnaBI. - 4§ - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a molécula de ADN ser o plasmídio de expressão pEx2A/21. - 5§ - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a molécula de ADN ser o plasmídio de expressão pEx2A/II. - 6â - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a molécula de ADN ser o plasmídio de expressão pEx2A/P^_4y , _4 ,/89. 64

   - 7§ - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a molécula de ADN ser o plasmídio de expressão pEx2A/S89"/C89. - 8ã - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a molécula de ADN ser o plasmídio de expressão pEx2A/S89/89. - 9ã - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a molécula de ADN ser o plasmídio de expressão pEx2A/S2/89. - 10S - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a molécula de ADN ser o plasmídio de expressão pEx2A/S89/89. - lis - Processo para a preparação de oligonucleóti-dos, caracterizado por se proceder de maneira a obterem-se nu-cleótidos que codificam uma região VP1/P2A do sistema rinoviral modificada, em que as modificações na região de codificação total se encontram de preferência na posição de cisão ou na região de cisão de protease 2A e influenciam de preferência a sua acti-vidade "cis". - 12S - .! Processo de acordo com a reivindicação 11, • caracterizado pelo facto de as modificações originarem uma per- 65

   Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de as modificações codificarem£Pro, Asp, Thr, especialmente a omissão de prolina ou de ácido aspár-tico perto da posição P^( da Protease HRV2-2A. - 169 - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de as modificações codificarem os ami-noácidos V-T-N-V-G-P-S-S na posição P^ ^/P^, 4· da Protease HRV2-2A. - 17ã - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de as modificações codificarem os amino-ácidos G-F-G-H-Q-N-K-A na posição P^,_g, da Protease HRV2-2A. - 18â - 66 Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de as modificações codificarem os ami-noácidos G-F-G-M-Q-Y-K-A na posição , g, da Protease HRV2-2A. - 19â - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de as modificações codificarem os ami-I noácidos G-P-G-P-R-Y-G-G- na posição P^, g, da Protease HRV2-2A. - 20i - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de as modificações codificarem os ami-noácidos R-A-S-M-K-T-V-G-P-S-D-L-Y-V-H- na posição P^ g( da Protease HRV2-2A. i - 21ã - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de a modificação codificar o aminoáci-do asparagina na posição P2 da Protease HRV2-2A. - 22â - caracterizado pelo noácidos T-V-T-N-A Processo de acordo com a reivindicação 11, facto de as modificações codificarem os ami-na posição P^ ^ da Protease HRV2-2A. - 23§ - caracterizado pelo noácidos T-V-T-N-V Processo de acordo com a reivindicação 11, facto de as modificações codificarem os ami-na posição P1 ^ da Protease HRV2-2A. - 24â - Processo de acordo com a reivindicação 11, 1 j ! Ί il 67

   caracterizado pelo facto de as modificações codificarem os ami-noácidos D-V-F-T-V-T-N-V na posição g da protease HRV2-2A. - 25§ - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de as modificações codificarem o ami-noácido alanina na posição da protease HRV89-2A. - 26a _ Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de as modificações codificarem os ami-noácidos A-T-T-I-I na posição P^ g da protease HRV89-2A. - 271 - Processo para a preparação de um sistema de ensaio, caracterizado por, num sistema de expressão apropriado, se inserir a molécula de ADN de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2. - 28ã - Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo facto de o plasmídio de expressão ser pEx2A/-21. - 291 - Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo facto de o plasmídio de expressão ser pEx2A/-II. - 301 - Processo de acordo com a reivindicação 27, • caracterizado pelo facto de o plasmídio de expressão ser pEx2A/ 68 ,/89. 31i Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo facto de o plasmídio de expressão ser pEx2A/ /S89"/C89. - 32ã - Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo facto de o plasmídio de expressão ser pEx2A/ /S89/89. - 33ã - Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo facto de o plasmídio de expressão ser pEx2A/ /S2/89. - 34ã - Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo facto de o plasmídio de expressão ser pEx2A/ /S89/89. - 35ã - Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo facto de o sistema de ensaio possuir um oli-gonucleótido de acordo com uma das reivindicações 11 a 26. - 3 6 â - Processo para a preparação de um oligopépti-do, caracterizado por este ser codificado por um dos oligonucle-ótidos de acordo com uma das reivindicações 11 a 26 assim como peptidomiméticos deles derivados. 69 371 Processo de acordo com a reivindicação 36, caracterizado por ser cindido pela protease 2A em trans. - 381 - Processo de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo facto de o oligopéptido obtido possuir pelo menos cinco aminoácidos da região da extremidade C de VP1 e oito aminoácidos da extremidade N da protease HRV2-2A ou respectiva-mente seis aminoácidos destas regiões. - 391 - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por ser o péptido Η, A, B, C, G, F ou K. - 401 - Processo para a preparação de composições farmacêuticas para o tratamento profiláctico, caracterizado por se incorporar pelo menos um oligopéptido quando preparado pelo processo de acordo com uma das reivindicações 36 a 39 ou um pep-tidomimético dele derivado numa mistura veicular farmaceutica-mente aceitável. A requerente reivindica as prioridades dos pedidos alemães apresentados em 25 de Junho de 1989 e em 8 de Junho de 1990, sob os nQs. P 39 20 860.5 e P 40 18 376.9, res-pectivamente. Lisboa, 22 de Junho de 1990 0 AGESIE OFICIAL Iía PKOPLJLEOAiíE JUOCSIIUaL

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