PT93439A - Processo para a preparacao de mutantes do activador de plasminigenio urinario - Google Patents

Description

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Descrição referente à patente de invei. Ção de EEHBINGWERKE AKTIENGESELLSGHAJ'!] í, alemã, industrial e comercial, com se-· de em D-3550 Marburg, Alemanha Ocidental, (inventor: Dr. Eric Paul Pagues, residente na Alemanha Ocidental), para "PRQOEBSO PARA A PBEPARAQlO DE MU-PANIES DO AOIIYADOR DE PLASMINIGÉNI0 URINÁRIO"

DESCEIÇlO

Sumário Aa invenção São proporcionados polipeptideos que possuem actividade de activador de plasminogánio por introdução de supressões ou de substituições, individualmente ou em combinação, na mollcula do activador de plasminogenio urinário (u-PA). Este processo implica uma alteração do padrão de gli-cosilação, um truncamento da extremidade N-terminal e uma modi ficação do local de corte. Estes polipeptideos são produzidos por expressão de genes mutados criados por mutagánese dirigida, Tanto a forma de cadeia simples como a forma activada de duas cadeias dos referidos polipeptideos são úteis na prevenção da formação de coágulos e na dissolução da trombina.

Domínio da invenção ps. ; 0 activador de plasminogenio urinário - 1 -

(u-PA) 4 uma protease de serina que intervim na dissolução de coágulos sanguíneos. A molécula possui um número distinto de regiões que apresentam homologia das sequências de ácidos aminados com outros polipeptídeos de ocorrência natural. Com início na extremidade H-terminal existe uma região homologa de vários factores de crescimento. Â região do factor de cres cimento está seguida por uma região em olhai. 0 local activo 4 análogo ao de outras proteases de serina. Há pelo menos duas propriedades diferentes associadas com o activador de plasminoglnio urinário e com a sua capacidade para lisar in vivo coágulos sanguíneos. A primeira 4 a actividade específica da função de protease em cortar o plasminoglnio para dar origem a plasmina a qual por sua vez se degrada em fibrina. A segunda propriedade 4 a sen sibili&ade à inibição pelo inibidor de activador de plasminoglnio. Ao contrário do que se passa com o activador de plas-minogenio de tecido (t-PA), o u-PA não possui afinidade para com a fibrina e a sua actividade plasminogenolítica 4 muito pouco dependente da fibrina em comparação com o t-PA. Cada uma destas propriedades desempanha um papel na rapidez e na especificidade com a qual o activador de plasminoglnio cortará o plasminigénio dando origem a plasmina na presença de coágulos sanguíneos. Será por conseguinte bastante interessante ter a capacidade de produzir polipeptídeos que possuem actividade de activador de plasminoglnio urinário que poderão proporcionar propriedades melhoradas numa ou em várias destas categorias.

Breve descrição da literatura relevante

Husain et al.» (PHÁS (1981) ?8: A265-4-269) } dão conta da existência de uma forma proenzimática da uroquinase. Steffens et al., (Hoppe-Seyler * s Z. Physiol. Chem. (1982) 363: 1043-1058 e 1155-1165), dão conta da se quência de ácidos aminados da uroquinase. Ratzkin et al., 2 (PHAS (1981) 2§L: 5513-3317)» descrevem a expressão da uroqui-nase em E. coli. Pannell e Gurewich, (Blood (198?) 1: 22-26), referem que ê necessário um recorte no local de corte da prou-roquinase para a actividade de protease. Gurewich e Pannell, (Blood, (1987) 3: 769-722), referem que a trombina inactiva a prouroquinase. Stump et al., (JBC (1986) 261: 17120-17126), referem a existência de uma forma de baixo peso molecular da uroquinase. Lijnen et «al., (JBO (1988) 265 i 5594-5598) dão conta do efeito da remoção do polipeptídeo Ser^ a Glu·^ nas propriedades trombolíticas da prouroquinase.

Descrição das formas de concretização especificas São proporcionados novos polipeptídeos que possuam propriedades melhoradas como activâdores de plasmi nogénio incluindo 0 ADH que codifica para estes polipeptídeos , blocos integrados ("cassettes") de expressão que contêm estas sequências para a expressão num hospedeiro apropriado, hospedeiros com capacidade para expressar os novos polipeptídeos e métodos para a produção dos novos polipeptídeos. Os novos polipeptídeos implicam (1) alterações no local de glicosila-ção, (2) pelo menos uma alteração no local de corte na região entre 155 © 162, em especial entre 159 e 162, (3) truncamento na extremidade Π-terminal da molécula e/ou (4) substituição da His^g e/ou da Ala^ por Ser ou Thr. Quando a modificação ocorre num local de glicosilação, o local de glicosilação a 3 302-304 será modificado, seja no resíduo 302 seja no resíduo 304. (A numeração dos ácidos aminados que se utiliza baseia--se na relatada em EP 0 092 182). Por introdução de cada uma destas alterações isoladamente ou em combinação em polipeptídeos que possuem actividade de activador de plasminogénio e derivados do activador de plasminogénio humano conseguem-se propriedades fisiológicas melhoradas. Os novos polipeptídeos apresentam uma das seguintes propriedades ou uma combinação destas: actividade proteolíti&a e plasminogenolítica melhorada, sensibilidade reduzida à inibição de activador de plasminogénio e resistência aumentada perante a inactivação-pela trombina, - 3 - \

A primeira alteração de interesse e a modificação do local de glicosilação nos ácidos aminados 302 a 304, em que a asparagina e alterada, de modo eonservativo ou não eonservativo, ou a treonina ê alterada de modo não con-servativo, especialmente por Gly, Ala ou Vai. As mutações de interesse incluem a substituição de asxDaragina por outros ácidos aminados, de preferencia por glutamina, valina, leucina, isoleucina, alanina ou glicina, de modo especialmente preferível por glutamina, ou a substituição de serina ou de treonina por outros ácidos aminados, de preferencia por alanina, valina ou metionina, isto ê, ácidos aminados alifáticos de 3 a 5 átomos de carbono que não possuam como substituintes mer capto ou hidrosilo neutro. Ã substituição de asparagina por glutamina no local de glicosilação em 302 e especialmente preferida.

As alterações conservativas sao indica das por ácidos aminados indicados entre sinais de ponto de vír gula. G, A; V, I, L; D, E; E, E; 1T, Qj .8, 1; e F, W, X; quando um ácido aminado de um agrupamento e substituído por um ácido aminado de um outro agrupamento ou por um ácido aminado que não se encontra indicado acima, esta alteração e considera da não conservativa. Do mesmo modo várias lesões podem ser introduzidas nos loçais de glicosilação, como supressões, subs tituiçoes, inserções ou outras a fim de alterar a tríade do lo cal de glicosilação a fim de destruir o local de glicosilação. À segunda área de interesse é uma modificação do local de corte que ocorre nos ácidos aminados 155 a 162. São de especial interesse as alterações não conser vativas, como a substituição de por Arg ou Lys. Outras substituições incluem a troca de isoleucina de 139· Verificou -se que uma modificação específica no local de corte reduz a sensibilidade â inibição do activador de plasminoglnio, de tal modo que in vivo 0 polipeptídeo terá uma actividade aumen tada em comparação com o activador de plasminogenio de tipo ϊ τ selvagem na presença de uma quantidade que iniba naturalmente o inibidor de activador de plasminoglnio. A terceira alteração de interesse ê a supressão de pelo menos 1 ácido aminado e um máximo de 157 ácidos aminados na região entre a Ser^ e Lys^g, normalmente dos polipeptídeos entre Cys^ e G-lu^ e Lys-^ ou Oys^. a L7si35· A quarta área de interesse e a modifi-nação dos ácidos aminados 56 e/ou 77. São de particular interesse as alterações de tal modo que se geram novos locais de glioosilação. Este ob<jectivo e alcançado por mudança dos ácidos aminados 56 e/ou 77 por Ser ou Thr,

Os novos polipeptídeos da presente invenção são produzidos por combinação de duas, três ou mais alterações descritas acima. Por exemplo, para além da substituição de asparagina por glutamina num local de glisolilação, em 502, um exemplo de uma alteração do primeiro tipo, o local de corte em 160 pode ser modificado por substituição da isoleuci-na por arginina ou lisina e/ou a sequência de ácidos aminados N-terminal pode ser truncada.

Em alguns casos a cadeia do u-PA pode ser prolongada em vez de truncada ou podem ser adicionados ácidos aminados, geralmente de 1 a 12 ácidos aminados tanto na extremidade H-terminal como na extremidade C-terminal. Os ácidos aminados adicionados podem servir de adaptadores, proporcio nar uma resposta imune particular, modificar as propriedades fisicas da molécula ou outras funções semelhantes. As sequências de APÍT que codificam para os polipeptídeos em questão po-iem ser preparadas de várias modos, usando AD1T cromossomico incluindo intrões, ADHc, ADE sintético ou combinações destes. As mutações pretendidas podem ser conseguidas por clonagem do gene □um hospedeiro bacteriano apropriado usando um veotor bacterio- - 5 - i

fago de cadeia simples ou um vector plasmídico de cadeia dupla e usando uma sequência desemparelhada substâncialmente complementar da sequência do tipo selvagem, mas que inclui as mutações pretendidas, tais como supressões ou inserções. Em alter nativa, quando existem locais de restrição convenientes é possível retirar uma sequência particular e introduzir uma sequên cia sintética que contém as mutações. Outras técnicas que podem ser utilizadas incluem digestão exonucleolítica parcial de um molde de dupla cadeia ou formação heteroduplex in vitro para expor regiões parcialmente de cadeia simples a mutagénese dirigida a um oligonucleótido. 0 método preferido neste caso é a mutagénese dirigida a um oligonucleótico. (Zoller e Smitli, iletliods Enzymol. (1983) 100 i 4-68-500). Preparam-se sequências oligonucleotídicas apropriadas que contêm os desemparelhamen-tos, surpressões ou inserções geralmente com cerca de 20 a 100 nucleotidos (nt), mais habitualmente de 20 a 60 nt. As sequências podem ser facilmente preparadas por síntese e clo-nadas num vector de clonagem apropriado. Os oligonucleótidos são temperados para um molde purificado d.o gene do u-PA ou de um análogo do u-PA para mutagénese dirigida a um local. Ê possível introduzi!? mutações em locais diferentes numa única fase ou em fases sucessivas, estabelecendo depois de cada mutação a existência da mutação e o seu efeito sobre a activi-dade do análogo de u-PA.

De modo conveniente, o vector usado para a mutação é um virus de ADH circular de cadeia simples, por exemplo M13 , especialmente quando modificado, como por exemplo M13mp9 · 0 iniciador de mutagénese é combinado com o molde e o vector em condições de têmpera na presença de uma po limerase apropriada sem capacidade de correcção, tal como o fragmento de Iílenow ou polimerase de ADN na presença dos nuoleétidos necessários e de ligase T4, sendo o vector cíclico que serve de veículo ao gene replicativo a fim de proporcionar a forma de replicação de dupla cadeia. 0 ADH de dupla cadeia pode ser introduzido numa oêlula apropriada. Por meio de um - 6 -

vector lítico, obtêm-se placas que podem ser seleccionadas com um iniciador para detectar a presença do u-PA mutagenizado ou do análogo de u-PA. Habitualmente, serão necessárias pelo menos duas selecções repetitivas a fim de aumentar a probabili dade de ter a sequência correcta para o produto mutagenizado.

Os clones presumivelmente positivos são em- seguida purificados, por exemplo purificados em placas, purificados por electrofo-rese ou por métodos semelhantes e em seguida são sequenciados.

Uma vez obtido o gene mutagenizado correctamente, este ê isolado e inserido num vector de expres são apropriado para expressão num hospedeiro apropriado· Exis te uma ampla variedade de vectores de expressão para uso em mamíferos, insectos ou aves hospedeiros. São de particular interesse os vectores de expressão de mamíferos que utilizam replicões virais, como virus de simina, virus de papiloma bovina, adenovírus ou semelhantes. As regiões de regulação de inicio e de terminação de transcrição e de tradução são de preferencia as regiões naturalmente associadas com o gene do u-PA ou regiões derivadas de genes estruturais virais ou regiões derivadas de genes do hospedeiro. Podem ser utilizados promotores de entre uma ampla variedade, como os promotores 3Y40 precoce e tardio, o promotor tardio maior de adenovirus, o promotor de /3-actina, o promotor imediato precoce (immediate early = ΙΞ) de CMV humano, etc.. É desejável que os promotores sejam usados com intensificadores a fim de proporcionar uma expressão melhorada. Em muitos casos sera desejável ampli ficar a construção de expressão de u-PA.

Para amplificação ou por outras razões pode ser desejável ter a construção de expressão integrada no genoma. Para este fim a construção deve ser ligada a um sistema de replicação instável, por exemplo arsl de levedura, ou deve não possuir um sistema de replicação. Para a integração veja-se por exemplo Axel e Wigler, Patente U.S. He. . A 399 216. Normalmente deve haver uma construção de expressão - 7 -

de marcação em série com a construção de expressão principal, podendo este marcador aer igual ou diferente do gene a amplificar. Esta situação pode ser consequida tendo o u-PÂ em série com unia construção de expressão e codificando genes amplificáveis como DHFR (redutase de di-lxidrofoliato) , TE (quinase de timidina), MT-I e MT-II (metalotioneína, por exemplo humana), OCD (decárboxilase de ornitina) ou GS (sin-tetase de glutamina). Provocando tensão sobre o hospedeiro de acordo com o gene amplificável, por exemplo metionina-sul-foximina com GS, é possível amplificar as construções de expressão pretendidas. Em função dos hospedeiros e das sequências de sinal particulares utilizados, o análogo de u-PA que e expressão é retido na célula hospedeira no citoplasma ou é segregado. Quando é retido no citoplasma, o análogo de u-PA é isolado por lise àa célula hospedeira usando métodos correntes e é purificado por extracção e purificação , de preferência usando electroforese, cromatografia ou técnicas semelhantes. Quando o u-PA é segregado, isola-se o u-PA segregado a partir do sobrenadante de acordo com técnicas habi tuais incluindo cromatografia de afinidade.

As propriedades dos polipeptídeos mu-tantes descritos na patente de invenção são superiores às do activador de plasminogénio u-PA de ocorrência natural. Os compostos em questão são superiores ao u-PA de tipo selvagem pelo menos num dos seguintes aspectos: a) maior actividade especifica, b) menor susceptibilidade a inibição por plasminogénio humano, (c) menor susceptibilidade a inibição por trombina, (d) maior semi-vida in vivo. (Yer exemplos para métodos de análise).

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser usados de vários modos com fins profiláticos ou terapêuticos para várias condições ou doenças vasculares especialmente para proteger um mamífero, particularmente um hos- - 8 - -4¾

peaeiro humano da formação de trombos. Estes polipeptídeos podem por conseguinte ser administrados durante operações quando o hospedeiro pode ser susceptível a coagulação do sangue ou para o tratamento de doentes trombóticos, para dissolver coágulos sanguíneos que se podem ter formado em tromboses das veias profundas, em embolia pulmonar, ou em tromboses craniais ou coronárias.

Os compostos da presente invenção podem ser administrados por via antérica ou parentêrica, especialmente por injecção ou por perfusão. Estes composto podem ser administrados numa quantidade eficaz numa substancia veicular fisiologicamente aceitável, tal como água, salina ou sistemas tampões apropriados na presença de substâncias de estabilização de proteínas selecionadas do grupo formado por gelatina, derivados da geletina, proteinas protectoras como albumina, açúcares, açúcares-álcoois ou ácidos aminados, isoladamente ou em combinação com outras substâncias terapêuticas , especialmente para doenças vasculares. Ê evidente a partir dos resultados anteriores que podem ser obtidas vantagens substanciais introduzindo alterações no sequencia de ácidos aminados do u-PA de tipo selvagem. Deste modo, não apenas á possível aumentar a resistência à inactivação pela trombina mas ao mesmo tempo é possivel diminuir a sensibilidade ao inibiclor de activador de plasminogénio , de tal modo que se pode conseguir um aumento substancial na actividade efectiva in vivo. Deste modo, é possível administrar menores quantidades destes peptideos com actividade de activador de plasminogénio de modo a minimizar o nível da proteína (ou enzima) na corrente danguínea e a diminuir substâncialmente os efeitos secundários indesejáveis do u-PÃ, proporcionando simul taneamente uma actividade mais elevada contra os coágulos.

Se bem que a presente invenção seja descrita com algum pormenor por meio de ilustração e de exemplos com a finalidade de clareza e de elucidação, é obvio que - 9 -

será possível introduzir algumas alterações e modificações respeitando o âmbito das reivindicações em anexo que definem também a presente invenção.

Exemplos

Exemplo 1; Procedimentos gerais de mutagénese

Projectaram-se iniciadores de sequên ciação para a sequenciação pelo método cie terminação de cadeia de didesoxinucleótidos no bacterióf&go Hl3 (F.Sanger, S. líi-clcLen e A.S. Coulson, Proc. Natl.Âcad. Sei, USA (1977) 3463). Os iniciadores de sequenciação foram projectados de modo a que fossem complementares de moldes recombinantes de M13mp8, de 19 ou 20 bases de comprimento e que se temperassem numa posição de pelo menos 50 bases de afastamento do local da mutação. 0 vector usado para todos os procedimentos de mutagénese foi um plasmídeo com capacidade de expressar u-PA em células de mamífero, pEE7 pUK apresentado na Figura 1. 0 vector pEE7 pUK foi preparado do modo seguinte; Subclonou-se um fragmento HindIII-.StuI de 1,5 kb de um clone fágico lambdagtlO recombinante , Hl.2, que continha um ADNc de u-PÂ parcial (Figura a) em pSP64 (Melton et al. Nucleic Acids. Ees. 12ί 7035 (1984) digerido com HindlII-Smal a fim de dar origem ao plasmídeo p.SP64 Hl.2. E£ te plasmídeo foi digerido com EindIII e Seal e o maior dos frs gmentos resultantes foi ligado a um oligonucleótido sintetizado quimicamente dando origem ao plasmídeo pSP64.pUK. Este plasmídeo contém um quadro de leitura livre completo de prl--pro-uroquinase e uma sequência 5* &ão traduzida curta que proporciona o sinal de início de tradução de consenso para células de mamífero e lociais de reconhecimento para as en-donucleases de restrição HidIII e Pst-1 na extremidade 5’ para inserção conveniente em vectores de expressão. - 10 - a A sequência do quadro de leitura livre da prá-pro-uroquinase é apresentada em EP-A2- 0 092 182. 0 fragmento HindIII-Saci'de 1,5 Kb de pSP64.pUIí (que inolui a sequência integral apresentada no Quadro 4Ã ibidem) foi inserido entre os locais HidIII e Saci do plasmi.deo pEE7 a fim de d.ar origem ao plasmídeo pEE7.pUK. 0 plasmídea PEE7 foi derivado por inserção do fragmento PvuII-HindIII de 542 pb de SV40, (ST40 nucleótidos 5171-270) que contêiá a origem de replicação no local HindIII de pEE6 de tal modo que o promotor tardio de SV40 dirige a transcrição para o poliadaptador de pSE6. p'£E6 ê um vector bacteriano de que foram removidas as sequências inibidoras para a replicação em células de mamíferos (ver Eigura 5)· Este vector contém a porção de Imnl a Bell do plasmídeo p0T5^ (Emtage et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, 5671-3675) com um poliadaptador pSP64 (Mel-ton et al. (1984) Eucleic Ac. Ses. 12, .7035) inserido entre os locais HindIII e EcoEI. Os locais BamHI e Sall foram removidos do poliadaptador por digestão, preenchimento com poli-merase de Klenow e religaçao. 0 f ragmento Bell a BamHT ê um sinal de poliadenilação precoce de 8740 de 237 pb (S749 2770 a 2533)* 0 fragmento BarnBI a Bgll deriva do plasmídeo pBH328 (375 a 2422) com uma supressão adicional entre os locais Sall e Aval (651 a 1425) após a adição de um adaptador Sall ao lo-. cal Aval. A sequência do local Bgll é originária, do gene de -lactamase do plasmídeo pSP64.

Exemplo 2; mutante pUK-GK (supressão dos ácidos aminados 11 a 135)

Oonstruiu-se o mutante pUE-G-E (supressão dos ácidos aminados 11 a 135) por remoção em primeiro lugar da região entre o local BssHII e o local Bali (ácidos aminados 3 a 149) do plasmídeo pEE7.pUK e subsequente inserção de oligonucleótidos apropriados para construir o gene mutante. Os oligonucleótidos apresentados em seguida foram tenperaros em conjunto e o fragmento de ADH de dupla cadeia 11

resultante foi isolado a partir de um. gel de agarose e ligado ao fragmento BssEII-BalI do plasmídeo pEE7.pUK de modo a dar origem ao plasmídeo pEE7 .pUIf-GIÍ»

Qligonucleótidos de cadeia em sentido direoto (de 5' para 5*)

1. CGCGGGfGGTlGTCTGGGTGGTGGTGGTGAGGGAG

2. TOGAAAGGCAGGAÂTGAAGTfCAfGAAGTTGGAT

3. GG.AAGAAGGOGIGCTGTGOTGOAGMGAÂTTAAAASTSCAGIGSGG

Oligonucleótidos de cadeia em sentido inverso (de 3* para 5*) n.

5. GGG-GTTGTTOGÃTGGAÁGTTGATGAAGTTOATT

6. GGTGGGTTEGGAGfGGGTGAGGAGOAGGAGGGASIGAAGGAGG

Exemplo 3: Síntese de mutantes PUK-GÂR, PTJE-DEGAR e P13K-G8

Efeito da mutação Designação 2. HiSpjg Ser, Ala^,-, Ser PUIÍ-CAR 3. Asn^Q2 Gin PUK-DECAR 4. Ile160 Lys PUK-OS do "mutante

Para as outras proteínas de u-PA modificadas descritas acima, efectuou-se mutagánese utilizando o procedimento descrito por Eramer et al. ((1984) Oell 38: 879-887). 0 quadro seguinte indica os oligómeros utilizados para a mutagénese e a sequenciação. - 12 -

Uuoagénese de inicis.cLores de 5* para 31

Hia^6 para Ser; 216GGGGA1TGGTAG0TTTTACCG.ã.G2^8 para Ser; 2^8

OTGGAACTOTTCCACTGTCOTTC 301

Asn302 para Glní ^CIITGGAÂAA&AGOÂGTCTÂCOGAOTATO97^

Ile160 para LjBi 528gtttmgâttaaggggggagmtto552

Efectuou-se a mutagénese de recombi-nsjites M13)u-PA usando moldes purificados por têmpera e prolongamento do iniciador apropriado com enzima de Klenow ou polimerase de ADN T4, A seguir a transfecção de células BB2154/2151 (Zoller e Smitb., supra) cultivaram-se placas até uma densidade de 200 a 500 por cápsula,colocaram-se sobre filtros e seleccionaram-se por hibridação com i iniciador ou sonda de mutagénese apropriado. Para cada mutante, identifi-caram-se inicialmente entre 20 e 60 por cento das placas como clones presumivelmente positivos. Determinou-se a sequência de ADN de vários destes clones usando iniciadores e preparações de moldes adequados.

Exemplo 4: Transfecção de células de mamifero

Transfectaram-se células COS-1 (Gluz-man, Gell (1981) 23: 174) com os plasmídeos de expressão de u-PA usando uma modificação do procedimento descrito por Lopafoa et al. (Hucleic Acids Kes. (1984) 12: 5707-5717)*

Usaram-se as seguintes soluções:

Meio águia de Dulbecco modificado (DMEM( j tris.HOl 0,25 M (PH 7,5); TBS (tris.01 0,025 M pH 7,4, BaOl 0,1375 M, EG1 5 mM, Ca012 0,7 mM, Mg012 0,5 mM, la^HPO^ 0,6 mM) ; HBS (HaOl 137 mM, E01 5 mM, Ha^O^ 0,7 mM, glucose 9 mM, Hepes--NaOH 21 mM, pH 7,1); 1 mg/ml de DEAE-dextrano em TBS*, e DEAE-tris preparado a partir de 20 ml de DMEM e 5 ml de tris 0,25 M de pH 7,5* -13

Lavaram-se duas vezes aproximadamen-te 6 x 10^ células por cápsula de Petri de 1J?0 mm em DMEM e transfectaram-se com 35 jug de 1M plasmídico super-hélise por incubação durante 6 a 8 horas a 37°0 eiri 6,5 ml de solução de dextrano. A solução de dextrano é uma mistura 1:4 de 1 mg/ml de DEAE-dextrano em TBS e DMEM-tris. A solução que contém AM foi em segui da removida e as células foram submetidas a um choque de DMSO por incubação a 37°0 durante 2 min em DMSO a 10 % em HBS. Em seguida lavaram-se as células em DMEM e cultivaram-se durante 2 a 3 dias em DMEM. + 10 % de soro fetal de vitela.

Em seguida, segundo uma alternativa, lavaram-se as células em meio isento de soro e incubaram-se em 25 ml de meio isento de soro durante aproximadamente 21 horas ou, numa outra alternativa, conservaram-se em meio contendo soro durante mais 21 horas. Reuniu-se o meio usado de mais do que uma cápsula de Petri para cada tratamento e analisou-se para detectar o u-PA.

A fim de gerar linhas de células mu-tantes permanentes que expressam a proteína u-PA inseriu-se em primeiro lugar o promotor intensificador de HOMV-IE (0 fragmer to Pst-1 M de HCMY) no local Pst-1 a montante do quadro de leitura livre de u-PA no plasmídeo pEE7pUK a fim de formar o plasmídeo pEETKCMYpuK. Introduziu—se também um gene de sin— tetase de glutamina (GS) em cada plasmídeo de expressão de u-PA a fim de actuar como marcador seleccionavel dominante em células de mamífero em cultura. Inseriu-se especificamente um fragmento Pvul-BamHl de 5,5 kb do plasmídeo pSYLGS.l (Bebbington e Hentschel em DNA Cloning Yol. III, Capitulo e, ed. D. Glover (1987)) que contém o gene de GS no local BamHI imediatamente a jusante do sinal de poliadenilação precoce de 8740 em pEETSCMYpUK e cada plasmídeo derivado mutante, após adição de um adaptador oligonucleótido sintético BamHI - 14 -

ao local Pvul, usando técnicas normais. 0 plasmídeo de expres são representativo pEETHOMVpUE.GS que contém as sequências de codificação para o u-PÁ de tipo selvagem e ap)resentado na Figura 5»

Introduziram-se plasmídeos que contêm GS em células GH0-E1 por um procedimento de transfecção mediada por fosfato de cálcio essencialmente conforme descrito por Gorman (DM Gloning Vol. II, (Gapítulo 6) ed. D. Glover, (1985)).

As soluções usadas sao OaOlp 2 M, 2 x HBS (contendo HaCl 290 nM, Hepes 50 mM e Ha^HPQ^ 2,8 mi) e 15 % de glicerol em HBS.

Inocularam-se 1 a 2 x 10^ células por cápsula de Petri de 90 mm no dia anterior ao da transfee-ção no meio de cultura não selectivo GMEM-S descrito por Bebbington e Hentschel (supra). No dia da transfecção, misturaram-se as seguintes soluções num tubo de plástico estéril (os volumes referem-se a cápsula transfectada)s 62 ul deOaGl^» 10 ug de ADN e água destilada até 0,5 ml.

Adicionou-se lentamente esta mistura a 0,5 ml de 2 x HBS num segundo tubo a fim de formar um co-precipitado de OaPO^-ÃDN que foi em seguida misturado vigorosamente por agitação num córtex.

Lavaram-se as células uma vez com meio GMEíi-S isento de soro e adicionou-se o co-precipitado de CaPQ^-AM às células juntamente com 1 ml de meio isento de soro e incubaram-se durante 3,5 a 4 horas a 37°G. Após remoção do ADN, submeteram-se as células a um choque de glicerol por adição de 3 ml de glicerol a 15 % em HBS durante 1,5 minutos, lavaram-se em meio isento de soro e deixaram-se recuperar durante 24 horas em meio GMEM-S contendo soro. Apli- - 15 -

cou-se em seguida a selecção para a expressão do gene de G-3 introduzido por adição de metionina-sulfoximina (ΙνΙ.οΣ*, Sigma) 25 jM· Isolaram-se as colonias resistentes a HaX após 2 a 3 semanas, transferiram-se para placas de 24 alvéolos e analisaram-se para. defectar ma.terial que tivesse reacção cruzada com u-PÂ por ELISA.

Cultivaram-se em cultura de massa as linhas de células que segregavam altos níveis de activador de plasminogenio. Ho Quadro 1 apresentara-se as taxas de secreção das linhas de células melhores produtoras para cada prc teína mutante, estimadas por análise de ELISA (ou por análise amidolítica para pTJK-G-K) .

Qp.a5.ro 1

Proteína mutante laxa de secreção (pg/cllula/dia) PM 5 PUIÍ-DECÃE 6 PUIÍ-CAR 10 PUE-C3 9,3 PTJK-GE 11

Exemplo 3 : Preparação de proteína mutante com actividade de activador de plasminogenio s

Análise prévia: Todos os sohrenadante CD3 isentos de soro foram ajustados a concentrações 0,01 % em Tv/een 80 TM e 0,01 % em UaM e foram congels.dos em alíquo-tas de 1 ml a -25 0. A forma de cadeia simples da molécula foi analisada por electoforese em gel de poliacrilamida 3D.8.

Exemplo 6: Comparaçao dos mutantes (1) a (4) com o u-PA de tipo selvagem - 16 -

Ensaio de li se de coágulo (CL·!1)

Os ensaios de lise de coágulos foram efectnados usando um "KC 10-Koagulometer" (Anielung, RIA) que tinha sido modificado a fim. de registar o tempo de lise em vez do tempo de coagulação.

Todos os reagentes foram pré-incuba-dos a 37°C. Diluiram-se o padrão de u-PA (WHO 66/46), as amos tras de ensaio de polipeptídeos e fibrinogénio até as concentrações requeridas num tampão de tris (0 ,50 M6 que continha 1 % de Haemaccel TM (pH 7,4). Misturaram-se 0,2 ml do padrão de u-PÁ ou das amostras com 0,2 ml de plasminogénio humano (10 CTA/ml), 0,5 ml de fibrinogénio de bovino (0,20 %) e por fim 0,1 ml de trombina (10 UI/ml). 0 tempo de lise foi regis tado e expresso em unidades de u-PA usando uma curva de cali-bração. Analisou-se a actividade de cada proteína mutante pelo menos três vezes e calculou-se a média. Usaram-se quatro diluições do padrão de u-PÂ com cada uma das amostras a analisar, Realizou-se a mesma análise com as proteínas de cadeia simples mutantes apos conversão na forma de duas cadeias por incubação durante 2 min com 1 OTA de plasmina/ml. lez-se parar a reacção por adição de 50 ml de aprotinina-Sepharose/ml. Incubou-se a mistura durante 15 min e depois de completada a reacção desprezou-se a aprotinina-Sepharose e analisaram-se as amostras activadas no CLT. (Quadro 2)

Quadro 2 CLT (1) antes de tratamento com plasmina UI/ml + sigma (%) PUK-C-K 51,6 + 8,4% CLT (2) Proporção g/l depois de tra tamento com plasmina UI)ml + sigma (%) 215,0 + 11,3 % 4,2 - 17 -

PUE-CAR 15,0 + 12,1 % 60,2 ± 1,4 % 4,0 PUK-DEOAR 19,1 ± 7,4 % 19,2 ± 8,1 % 1,0 PTJK-CS 12,8 + 14,3 % 21,0 ± 2,7 % 1,6 UK 985 + 13,2 % 950 ± 15,9 % 0,97

Padrão »750

Análise amidolítica

Todos os reagentes foram pre-incuba-dos a 37°0. Quando indicado, as proteínas mutantes de cadeia simples (0,7 ml) foram convertidas na forma de duas cadeias por incubação durante 2 min com plasmina (0,1 ml de uma solução de plasmina que continha 10 OTA/ml) . A reacção foi feita parar por adição de 0,1 ml de uma solução de aprotinina que continha 500 UI/ml. A actividade de uroquinase gerada foi medida depois da adição do substrato cromogenico S-2444 (0,1 ml de uma solução 3 ml em água) a 405 um. Analisou-se a actividade de cada proteína mutante antes e depois do tratamento com plasmina pelo menos tres vezes e comparou-se com a actividade do padrão de uroquinase. (Quadro 3).

Quadro 5 I II Proporção UI/ml + sigma (%) UI/ml + sigma (%) II/1 antes de depois de tratamento tratamento com plasmina com plasmina PUX-GK 7,0 ± 10,0 °/o 291 + 3,1 % 41,6 PUX-CAR 3,3 ± 13,2 % 61,7 ±3,7 % 18,7 PUX-DECAR 4,1 + 7,0 % 35,3 ± 6,5 % 8,1 PUIÍ-06 2,5 + 14,2 % 11,9 ± 9,3 % 4,8 UX Padrão VJHO 1273 +2,6 % 1280 + 2,6 % 1,0

Ensaio de inibição

Analisou-se a susceptibilidade da proteína mutante âer inibida pelo inibidor de aotivador de plasminogénio tipo 2 (PAI-2) do modo seguinte: Misturaram--se 0,8 ml das proteínas mutantes activadas (ver análise ami-dolítica) contendo 6,25 unidades, de acordo com a determinação da análise amidolítica, com uma solução (0,2 ml) contendo 3-2444 e ραι_2. Testou-se a susceptibilidade à inibição de cada proteína mutante a concentrações finais do substrato de 0,1$ 0,2 e 0,3 mM e a concentrações finais de PAI-2 de 10, 20, 40, 80 e 160 unidades de inibição de uroquinase. A constante de inibição (K^) tinha sido calculada para cada mutante supondo que 1 mg de PAI-2 corresponde a 100 000 unidades de inibição de uroquinase. 0 valor de obtido para cada mutante representa a média de pelo menos três medições independentes :

Mutante K1 PUK-GE 2,12 ίο’? PUK-CÂR 1,06 10 PUK-DECÂR 3.71 io-9 PUK-CS 18,9 H O 1 vQ Tipo selvagem 1,31 10 "9 Análise de inactivação da trombina

Misturou-se 0,1 ml das proteínas mutantes de cadeia simples contendo 10 UI/ml de acordo com a análise amidolítica com urna solução de trombina contendo 0,5 UI/ml e incubou-se durante 0, 50, 70, 120, 200 Br 300 min a 37°0. Depois de adição de uma solução tampão (0,5 ml) contendo tris 0,1 M, 0,1 % de Tween 80^ a pH 7»5 as proteínas de cadeia simples foram convertidas na forme, de duas cadeias por - 19 -

adição de 0,1 ml de plasmina (10) CTÂ/ml, período de incubação de 2 min a 37°0). Antes do ensaio neutralisou-se a acti-vidade de plasmina por adição de 0,1 ml de aprobinina (500 UIK/ml) e incubação durante 2 min a 37°C. Por fim adicionou--se 0,1 ml de ,3-2444 (3 mM) e determinou-se a actividade de uro ciuinas e re s i dual.

Mutante PUIC-G-E PUS-OÂR PUIÍ-DEOÃE PITE-OS Tipo selvagem t^Q °/o de inactivação 65 min 20 min 22 min 65 min 20 min

Legenda ffigura 1:

Mapa de restrição do plasmídeo pEE7 pUK

Apresentam-se todos os locais reconhecidos por enzimas que cortam uma ou duas vezes. pA - sinal de poliadenilação de >3740 3V0HI - origem de replicação de SV40 Higura 2:

Mapa de restrição de um ADNc de pUE parcial em lambdagt 10 vector de clonagem (clone Hl.2)

As flechas indicam os fragmentos de ADIT sequenciados em Ml3 ou em vectores plasmídicos e a di-recção da sequenciaçao. Os números indicam as dimensões dos fragmentos em pares de bases. - - 20 -

Claims (1)

1. Figura 3 s ue.pa de restrição de pEE6 0 plasmídeo pEE6 ê o plasmídeo bási_ oo usado para reunir os vectores de expressão de u-PA. Figura 4-; mapa de restrição do plasmídeo pEE7 hOMY pUKG-B usado para a expressão de u-PA e de proteína mutante de linhas de células transfectadas permanentes CEO-EI. Os locais Pst-1 e BamHI são apresei, tados para -proporcionar pontos de referência. beitiudigaoCes - lâ - Processo para a prepa.ração de um mutante do activador de plasminogénio urinário humano que possui pelo menos uma das seguintes mutações ou uma combinação destas ou todas: alteração do local de glicosilação de ocorrência natural a fim de evitar a glicosilação, de preferência de Asiij02 para Gin supressão de partes ou da totalidade dos ácidos aai-nados de 1 a 135» de preferência supressão dos ácidos azoinados de 11 a 135 substituição conservativa ou não conservativa do Ile160 ? de preferência por Lys ou Árg substituição de pelo menos um ácido aminado a fim de crear um novo local ou novos locais de glicosila- (i) (ii) (iii) - 21 (iiii) ção, de preferência a substituição de His^g por Ser e/ou de Ala^ por Ser, caracterizado por se transformar um hospedeiro adequado procariótico ou eucario-tico com uma construção de expressão que contém a sequência de ÂDHc do referido mutante, induzir a expressão da referida sequência de ADNc e purificar o produto da expressão a partir das proteínas celulares - 2a - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o mutante obtido possuir pelo menos uma substituição de um ácido aminado no local de glicosilação de ocorrência natural representado por Asn-Ser-Thr de modo e evitar a glicosilação. _ já - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por no mutante obtido se ter procedido à substituição de Asη^02 de modo a evitar a glicosilação. - - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1, 2 ou 3; caracterizado por no mutante obtido se ter procedido à substituição de Ásn^02 por Glu de modo a evitar a glicosilação. - - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por no mutante obtido áe ter procedido à substituição de Ile16Q por Arg ou Lys. - 22 - 4

   - 6a - Processo de acordo com a reivindicação lj caracterizado por no mutante obtido se ter procedido à substituição de por um ácido aminado não conservativo, - 7a - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por no mutante obtido se ter procedido à substituição de Tlir^ por G-ly ou Ala ou Vai. - 8a - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7? caracterizado por no mutante obtido se ter procedido a uma ou várias substituições no local de cisão na região dos ácidos aminados 155 a 162 ou na região dos ácidos aminados 159 a 162. - 9& - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por no mutante obtido se ter procedido à substituição de Ile^gQ de preferência por Arg ou Lys. - 10 a - Processo de acordo com qualquer das rei vindicações 1 a 9( caracterizado por no mutante obtido se ter procedido à supressão de parte ou de todas as sequências Lysu aLys1?5. A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente europeia apresentado em 17 de Março de 1989, sob ο H2. 89104762.5. - 25 - Lisboa, 15 de Março de 1990 4Λ©3ΙΪΚ3 SKClz.1, TjjL ΈΖ:Ζ'ΞΕΣΙ'^Μ OfcUSr

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