PT934069E - Método e composição para o tratamento de perturbações do metabolismo dos lípidos e glucose - Google Patents

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DESCRIÇÃO "MÉTODO E COMPOSIÇÃO PARA O TRATAMENTO DE PERTURBAÇÕES DO METABOLISMO DOS LÍPIDOS E GLUCOSE" Âmbito da invenção A presente invenção refere-se à utilização do agonista Dl da dopamina SKF38393 e um alcaloide ergot agonista D2 da dopamina para a preparação de uma preparação combinada para utilização simultânea, separada ou seguencial para modificar ou regular pelo menos uma das perturbações do metabolismo da glucose ou lipidos.

Antecedentes da invenção

Obesidade e Perturbações do Metabolismo dos Lipidos - Perda de Gordura Corporal.

Em seres humanos a obesidade pode ser definida como um peso corporal que excede em 20% o peso corporal desejável para indivíduos do mesmo sexo, altura e estrutura (Salans, L.B., in Endocrinology & Metabolism, 2a Ed., McGraw-Hill, Nova Iorque 1987, pp. 1203-1244; ver também, R.H. Williams,

Textbook of Endocrinology, 1974, pp. 904-916). Noutros animais (ou mesmo em seres humanos) a obesidade pode ser determinada por padrões do peso corporal relacionados com perfis de prolactina, dado que os membros de uma espécie que são jovens, esguios e "saudáveis" (isto é, sem quaisquer perturbações sem ser apenas perturbações metabólicas) têm perfis do nivel diário de prolactina no plasma que obedecem a um padrão caracteristico da espécie. Este padrão é muito reproduzível com um pequeno desvio padrão. No entanto, os membros ou espécies que sofrem de pelo menos uma perturbação de lipidos e metabolismo têm 2 perfis de prolactina aberrantes que se afastam do padrão normal (ou sujeitos saudáveis) em pelo menos 1 SEM em pelo menos dois momentos distanciados ou em pelo menos 1 SEM (erro padrão da média) em pelo menos um momento. A obesidade, ou excesso de depósitos de gordura, está relacionada com e pode desencadear o inicio de várias perturbações do metabolismo dos lipidos e/ou glucose, por exemplo hipertensão, diabetes tipo II, aterosclerose, etc.

Mesmo na ausência de obesidade clinica (de acordo com a definição anterior) a redução dos depósitos de gordura corporal (especialmente os depósitos de gordura visceral) num indivíduo, em especial a longo prazo ou permanentemente, seria um benefício significativo, tanto do ponto de vista cosmético como fisiológico. A redução dos depósitos de gordura corporal em animais domésticos (bem como animais de companhia), especialmente a longo prazo ou permanentemente revestir-se-ia também obviamente, de uma considerável vantagem económica para o homem, em particular uma vez que animais de quinta constituem a principal porção de uma dieta humana e a gordura animal pode acabar por constituir os depósitos mais recentes de gordura no ser humano.

Enquanto que dieta controlada e exercício podem dar resultados modestos na redução dos depósitos de gordura corporal antes do trabalho cumulativo da presente invenção (incluindo os pedidos de patente pendentes e patente norte-americana publicados, referida em seguida) não se encontrou nenhum tratamento eficaz ou prático para controlar a 3 obesidade ou outras perturbações do metabolismo dos lipidos. A hiperlipoproteinemia é um estado em que a concentração de uma ou várias lipoproteinas portadoras de colesterol ou triglicéridos (tal como quilomicrons, lipoproteinas de muito baixa densidade ou VLDL e lipoproteinas de baixa densidade ou LDL) no plasma excede um limite normal. Este limite máximo é geralmente definido como nonagésimo quinto percentil de uma população aleatória. Niveis elevados destas substâncias têm também sido positivamente relacionados com a aterosclerose e o enfarte cardíaco ou "ataque cardíaco" frequentemente consequente, responsável por aproximadamente metade de todas as mortes nos Estados Unidos. Têm sido apresentadas fortes provas clínicas que relacionam uma redução na concentração de lipoproteinas no plasma com um risco reduzido de aterosclerose (Noma, A., et al., Atherosclerosis 49:1, 1983; Illingworth, D. and

Conner, W., in Endocrinology & Metabolism, McGraw-Hill, Nova Iorque, 1987). Assim, uma quantidade significativa de investigação devotada a encontrar métodos de tratamento que reduzem os níveis de colesterol e triglicéridos no plasma. Níveis de LDL e/ou VLDL acompanhados por níveis elevados de triglicéridos no sangue constituem os factores de risco mais importantes para a aterosclerose. A redução das lipoproteinas e/ou triglicéridos no sangue iria reduzir o risco de aterosclerose e parar ou atrasar o seu desenvolvimento. Outro subconjunto das lipoproteinas no plasma encontrados nos vertebrados são lipoproteinas de alta densidade ou HDL 0 HDL serve para remover o colesterol livre do plasma. Uma concentração de HDL elevada, como percentagem do colesterol total no plasma tem sido associada a um risco reduzido de aterosclerose e doenças 4 cardíacas. Assim, o HDL é conhecido nas publicações laicas como "bom" colesterol. Por conseguinte, as estratégias terapêuticas envolvem tentativas tanto para reduzir o teor de LDL como VLDL no plasma (isto é reduzir o colesterol total no plasma) e aumentar a fracção de HDL no colesterol total no plasma. Várias orientações de investigação indicam que o simples aumento do HDL é benéfico, mesmo na ausência de redução de LDL ou VLDL: Bell, G.P. et al., Atherosclerosis 36:47-54, 1980; Fears, R., Biochem.

Pharmacol. 33:219-228, 1984; Thompson, G., Br. Heart J. 51: 585-588, 1989; Blackburn, H. N.E.J.M. 309:426-428, 1983.

As terapias actuais para as hiperlipoproteinemias incluem uma dieta de baixo teor de gorduras e eliminação de factores agravantes tais como um estilo de vida sedentário. Se a hiperlipoproteinemia é secundária (isto é acidental devido a por exemplo deficiência do receptor da lipoproteína lipase ou LDL, várias patologias endócrinas, alcoolismo, perturbações renais, perturbações hepáticas) então o controlo da doença subjacente é também central para o tratamento. As hiperlipoproteinemias são também tratadas com medicamentos que normalmente alteram os níveis de componentes particulares do colesterol total no plasma, bem como reduzem o componente lípido total no plasma. Entre os medicamentos introduzidos mais recentemente para tratar a hiperlipoproteinemia está a lovastatina (MEVACOR®) que inibe selectivamente uma enzima envolvida na produção do colesterol, a redutase da 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA). Este medicamento reduz especificamente o colesterol total e pode provocar um modesto aumento (5 a 10 %) nas concentrações de HDL. No entanto, as vantagens destas terapias variam de indivíduo para indivíduo. 5

Além disso, a utilização do inibidor da enzima HMG-CoA é por vezes acompanhada de efeitos secundários tais como toxicidade hepática, mioglobinúria, falha renal e opacidade lenticular. 0 risco destes efeitos secundários necessita de um acompanhamento apertado dos pacientes (por exemplo a função renal é testada mensalmente).

Outro medicamento receitado contra a hiperlipoproteinemia é o clofibrato. A eficácia do clofibrato varia também de indivíduo para indivíduo e o seu uso é frequentemente acompanhado por efeitos secundários tais como síndromas nefróticos, mialgia, náusea e dor abdominal.

Diabetes e perturbações do metabolismo da glucose A diabetes, uma das mais insidiosas das principais doenças, pode atacar subitamente ou permanecer por diagnosticas durante anos, enquanto ataca os vasos sanguíneos e nervos. Os diabéticos, enquanto grupo, sofrem com muito mais frequência de cegueira, doenças do coração, acidentes vasculares, perda de audição, gangrena e impotência. Um terço de todas as consultas médicas são ocasionadas por esta doença e suas complicações e a diabetes e as suas complicações são uma das principais causas de morte precoce nos Estados Unidos e no mundo Ocidental. A diabetes afecta negativamente a forma como o corpo utiliza os açúcares e amidos que, durante a digestão são convertidos em glucose. A insulina, uma hormona produzida pelo pâncreas, torna a glucose disponível para as células do corpo para produzirem energia. Nos músculos, nos tecidos adiposo (gordura) e conjuntivo a insulina facilita a entrada de glucose nas células ao agir nas membranas celulares. A glucose ingerida é normalmente convertida no 6 fígado em CO2 e H20 (50 %) , em glicogénio (5 %) e gordura (30 a 40 %) , sendo esta última armazenada em depósitos de gordura. Os álcoois gordos dos tecidos adiposos circulam, retornam ao fígado para serem ressintetizados do triacilglicerol e metabolizados em corpos cetónicos para utilização pelos tecidos. Os ácidos gordos são também metabolizados por outros órgãos. A formação de gordura é uma via principal de utilização dos hidratos de carbono. O restante efeito da insulina consiste em promover a armazenagem e utilização dos hidratos de carbono, proteínas e gordura. A deficiência de insulina é um estado patológico comum e grave no ser humano. Na diabetes insulino-dependente (DMID ou tipo I) o pâncreas produz pouca ou nenhuma insulina e é necessário injectar diariamente insulina para a sobrevivências do diabético. Na diabetes não insulino-dependente (DMNID ou tipo II), o pâncreas retém a capacidade de produzir insulina e de facto pode produzir quantidades superiores ao normal de insulina mas a quantidade de insulina é relativamente insuficiente ou não é totalmente eficaz devido a resistência celular à insulina.

Em qualquer uma das duas formas de diabetes existem anomalias disseminadas. Na maioria dos sujeitos DMNID, os defeitos fundamentais a que estão na origem das anomalias são (1) uma entrada reduzida de glucose em vários tecidos "periféricos" e (2) uma libertação maior de glucose para a circulação a partir do fígado. Existe por conseguinte um excesso extra celular de glucose e uma deficiência intracelular de glucose. Existe também uma diminuição da entrada de aminoácidos nos músculos e um aumento da lipólise. A hiperlipoproteinemia é também uma complicação 7 da diabetes. 0 efeito acumulativo destas anomalias associadas a diabetes consiste em lesões graves dos vasos sanguíneos e dos nervos.

Sem contar com a presente invenção e trabalho anterior dos autores da presente invenção (discutido em seguida), não foi encontrado tratamento eficaz para controlar tanto a hiperinsulinemia ou a resistência à insulina. A hiperinsulinemia é um nível superior ao normal da insulina no sangue. A resistência à insulina pode ser definida como um estado em que a quantidade normal de insulina produz uma resposta biológica sub normal. Em pacientes com diabetes tratados com insulina, considera-se que a resistência à insulina está presente quando a dose terapêutica de insulina excede a taxa de secreção de insulina em indivíduos normais. A resistência à insulina está também associada a níveis superiores ao normal de insulina, isto é hiperinsulinemia, quando estão presentes níveis normais ou elevados de glicemia.

Trabalhos anteriores neste âmbito um

Os estudos pelos autores da presente invenção e outros indicaram que o ciclo anual, natural do nível de acumulação de gordura corporal, difusa entre vertebrados selvagens, reflecte as actividades de um metabolismo central ajustável que é constituído por componentes neurais hipotalâmicos circadianos. Alterações nas relações de fase das actividades dopaminérgicas e serotonérgicas circadianas induz alterações sazonais no metabolismo e estas actividades circadianas podem ser ajustadas por meio de tratamentos adequadamente cronometrados com hormonas ou medicamentos que afectam os neurotransmissores. Neste contexto, tem-se demonstrado que a bromocriptina, agonista do D2 da dopamina simpatolítico com actividades agonistas a2 e antagonistas al bem como actividades inibidoras da serotonina, reduz os niveis de depósitos de gordura corporal numa variedade de animais, incluindo seres humanos, sem reduzir o consumo de alimentos e também reduz a hiperinsulinemia, a hiperlipidemia e a intolerância à glucose.

Os autores da presente invenção e sem colaboradores descobriram anteriormente que a administração de certos agonistas da dopamina (D2) redutores da prolactina, tais como bromocriptina e/ou (ii) substâncias intensificadoras da prolactina, tais como antagonistas da dopamina, tais como metoclopramida, e agonistas e precursores da serotonina, tais como 5-hidroxitriptofano, reduzem os depósitos de gordura corporal, obesidade, triglicéridos e colesterol no plasma, bem como hiperglicemia, hiperinsulinemia e resistência à insulina: patentes norte-americanas 4 659 715; 4 749 709, 4 783 469; 5 006 526. É preferida a administração de substâncias redutoras da prolactina num primeiro momento, pré determinado, para provocar uma diminuição dos niveis de prolactina em circulação do sujeito em tratamento durante um intervalo limitado pelo ciclo ou ritmo da prolactina diário do sujeito quando os niveis de prolactina em circulação (sangue) são baixos em sujeitos da mesma espécie novos, saudáveis, fazendo assim com que o ritmo da prolactina dos que estão em tratamento se aproximem ou se adeqúem ao ritmo da prolactina de sujeitos padrão ou saudáveis. É preferida a administração de substâncias redutoras da prolactina num primeiro momento, pré determinado, para provocar uma diminuição dos niveis de prolactina em circulação do 9 sujeito em tratamento durante um intervalo limitado pelo ciclo ou ritmo da prolactina diário do sujeito quando os niveis de prolactina em circulação (sangue) são baixos em sujeitos da mesma espécie novos, saudáveis, fazendo assim com que o ritmo da prolactina dos que estão em tratamento se aproximem ou se adeqúem ao ritmo da prolactina de sujeitos padrão ou saudáveis. Patentes norte-americanas n°. 5,468,755; 5,496,803; 5,344,832, patente norte-americana 5,585,347 e pedido de patente norte-americana 08/456,952 e pedidos de PCT US93/12701 e US95/09061.

Sabe-se também na técnica que alguns dos efeitos da bromocriptina são suportados pela dopamina endógena. (Ergot Compounds and Brain Functions Neuropsychiatric Aspects: Advances in Biochemical Psychopharmacology. M. Goldstein et al., Eds. (Raven Press, Nova Iorque, 1980) vol. 23). Especificamente, revelou-se que a estimulação locomotora e respostas comportamentais estereotipadas à bromocriptina são bloqueadas pela carência de dopamina endógena em roedores. No entanto, se um agonista de Dl é subsequentemente oferecido a animais com falta de dopamina a resposta à bromocriptina é restaurada. Jackson, D.M. et al., Psychopharmacology 94:321 (1988)). Foi demonstrada uma interacção D2:D1 dopaminérgica semelhante na inibição dopaminérgica do comportamento alimentar. Apesar de estes estudos confirmarem a importância de uma interacção D2:D1 na activação de actividades dopaminérgicas, o aumento da actividade locomotora e diminuição da resposta alimentar aos agonistas D2:D1 é aguda e de curta duração, durando apenas algumas horas. (Cooper, S.J. et al., in D1:D2 Dopamine Receptor Interactions, J. Waddington, Ed. (Academic Press, London, 1993) pp. 203-234) . 10 O trabalho anterior por parte de terceiros com agonistas de Dl e D2 da dopamina em combinação não demonstrou quaisquer efeitos em lípidos e metabolismo da glucose e não apresentou respostas a longo prazo de actividades dopaminérgicas. Significativamente, os autores da presente invenção descobriram agora que a administração conjunta de um agonista de Dl e um agonista de D2 da dopamina (ou pelo menos um de um antagonista al adrenérgico, um agonista a2 adrenérgico e um inibidor serotonérgico) tem como resultado uma melhoria inesperada e surpreendente de um ou vários índices metabólicos relacionados com o metabolismo dos lípidos e glucose quando comparados com a melhoria (se houver) proporcionada pela administração de um agonista de D2 da dopamina, tal como bromocriptina administrada isoladamente.

Objectos da invenção

Um dos objectivos da presente invenção proporcionar meios para reduzir em sujeitos vertebrados (incluindo seres humanos) necessitados desse tratamento pelo menos um de consumo de alimentos. Peso corporal, gordura corporal, glicemia e insulina no plasma ou sangue.

Outro objectivo da presente invenção consiste em proporcionar meios para reduzir pelo menos um de resistência à insulina (tolerância à glucose deficiente), hiperinsulinemia e hiperglicemia e hemoglobina glicosilada (incluindo A1C) e diminuir diabetes tipo II.

Um outro objectivo consiste em proporcionar meios para reduzir ou retardar ou travar a aterosclerose por meio da redução de pelo menos um de hiporlipoproteinemia e triglicéridos no sangue elevados. 11

Um outro objectivo da presente invenção consiste em proporcionar meios para modificar e regular o metabolismo dos lipidos e glucose de uma forma benéfica para o sujeito. É ainda um outro objectivo da presente invenção proporcionar meios para modificar e regular o metabolismo, para proporcionar tratamentos eficazes para a obesidade.

Resumo da invenção A presente invenção refere-se à utilização do agonista de Dl da dopamina SKF38393 e um alcaloide ergot agonista de D2 da dopamina para a preparação de uma preparação combinada, para utilização simultânea, separada ou sequencial destinada a modificar ou regular pelo menos uma das perturbações do metabolismo da glucose ou lipidos.

Numa concretização da presente invenção, a preparação mencionada é eficaz para melhorar pelo menos um dos seguintes índices do metabolismo dos lipidos e glucose: peso corporal, gordura corporal, insulina no plasma, glucose no plasma, lipidos no plasma e proteína lípido no plasma.

Noutra concretização da presente invenção, a preparação mencionada destina-se ao tratamento de hiperglicemia associada aa diabetes tipo II.

Em mais uma concretização da presente invenção, a preparação mencionada destina-se a tratar a obesidade. Noutra concretização da presente invenção, a preparação mencionada destina-se a tratar a hiperlipidemia. 12

Numa concretização da presente invenção o alcaloide ergot agonista de D2 da dopamina destina-se a administração diária num momento entre 5:00 e 13:00.

Numa outra concretização da presente invenção, o agonista de Dl SKF38393 destina-se à administração aproximadamente em simultâneo que o agonista de D2.

Em mais outra concretização da presente invenção o alcaloide ergot do agonista de D2 da dopamina é seleccionado do grupo constituido por 2-bromo-alfa-ergocriptina, 6-metil 8 beta-carbobenziloxiaminoetil-10-alfa-ergoline, 8-acilaminoergolina, pergolida, lisurida, 6-metil-8-alfa-(N-acil)amino-9-ergolina, 6-metil-8-alfa-(N-fenilacetil)amino-9-ergolina, ergocomina, 9,10-di-hidroergocomina e ergolinas substituídas por D-2-halo-6-alquil-8, D-2-bromo-6-metil-8-cianometilergolina.

Numa outra concretização da presente invenção o alcaloide ergot inclui bromocriptina.

Breve descrição das figuras A fig. 1 é um gráfico de barras que ilustra a perda de peso (barras negativas) ou ganho (barras positivas) obtidos no grupo experimental a que foi administrado tanto bromocriptina (BC) e SKF 38393 (SKF) em comparação com os animais a quem foi administrado só SKF ou só BC ou nada (controlos negativos). A fig. 2 é um gráfico de consumo de alimento (g/rato/dia) por dias de tratamento de ratinhos experimentais ob/ob com bromocriptina e SKF (círculos escuros) ou sem medicamento (círculos abertos) ou animais esguios de controlo que não 13 receberam qualquer medicamento (triângulos a escuro). As figs. 3A e 3B são gráficos de barras que medem a massa de gordura corporal medido em glicerol (em g/rato) (fig. 3a) ou massa corporal magra (proteína em g/rato) (fig. 3B) para animais ob/ob que não receberam medicamento (controlo) ou só bromocriptina (segunda barra da esquerda) ou só SKF (terceira barra da esquerda) ou BC e SKF (quarta barra) . 0 asterisco indica uma diferença significativa em comparação com a barra de controlo.

As figs. 4A e 4B são gráficos de barras da glicemia (mg/dl) de animais ob/ob (fig. 4A) ou insulina no soro (ng/ml) de animais ob/ob (fig. 4B) a quem não foi administrado medicamento (controlo; barra mais à esquerda); só BC (segunda barra a contar da esquerda); só SKF (terceira barra a contar da esquerda) ou BC e SKF (quarta barra). Os asteriscos têm o mesmo significado que em fig. 3A. As figs. 5A e 5B são gráficos de barras dos níveis de triglicéridos no soro (TG) em ng/dl (fig. 5A) ou níveis de ácidos gordos livres no soro (AGL) em mmol/1 (fig. 5B) de animais a quem não foi administrado medicamento (controlo; barra mais à esquerda); só BC (segunda barra a contar da esquerda); só SKF (terceira barra a contar da esquerda) ou BC e SKF (quarta barra). Os asteriscos têm o mesmo significado que na fig. 3A. As figs. 6A A 6C são gráficos de barras dos níveis de glicemia em mg/dl (fig. 6A) níveis de triglicéridos no soro em mg/dl (fig. 6B) e AGL no soro em mmol/1 (fig. 6C) para animais a quem não foi administrado medicamento (barra da esquerda) ou BC e SKF (barra da direita). Os asteriscos têm o mesmo significado que na fig. 3A. Os animais foram sacrificados em 3 halo o pico da lipogénese para ratinhos. 14

As figs. 7A a 7C são gráficos de barras da actividade enzimática do fígado (em milimoles de ácido gordo por mg de proteína por minuto) para as enzimas envolvidas na síntese do ácido gordo no fígado: sintase de ácidos gordos (fig. 7A) , enzima málica (fig. 7B) ou glucose-6-fosfatase (fig. 7C) que ilustram a diferença nas actividades mencionadas entre animais a quem não foi administrado medicamento (barra da esquerda) ou BC e SKF (barra da direita) . Os asteriscos têm o mesmo significado que na fig. 3A.

As figs. 8A e 8B são gráficos de barras semelhantes aos das figs. 7A a 7B para as enzimas hepáticas PEPCK (fosfoenolpiruvato carboxiquinase) e glucose-6-fosfato desidrogenase.

As figs. 9A-9C são gráficos de barras semelhantes às das figs. 7A a 7C mas para as enzimas envolvidas na síntese de ácidos gordos em tecido adiposo: sintase de ácidos gordos (fig. 9A) enzima málica (fig. 9B) e glucose-6-fosfato desidrogenase (fig. 9C).

As figs. 10A e 10B são gráficos de barras do transporte de glucose (em amoles/célula/minuto) (fig. 10A) e oxidação da glucose em CO2 (em amoles/célula/minuto) (fig. 10B) medido para ratinhos tratados com BC + SKF e "sem medicamento" na ausência (barras brancas) e presença (barras escuras) de insulina em adipócitos isolados. A fig. 11 é u gráfico de barras da lipólise medida como libertação de glicerol (pmoles/célula/minuto) em adipócitos isolados para ratinhos tratados com BC + SKF e "sem medicamento". 15

As figs. 12A é um gráfico da lipogénese adiposa medida como a taxa de incorporação de glicerol em lipidos (mg/minuto/grama de gordura) como função do tempo de sacrifício dos ratinhos (em HALO) tratados com BC + SKF (círculos abertos) ou não tratados (círculos a escuro) . A fig. 12B é um gráfico de barras da actividade da lipoproteína lipase (LPL) (em mmol de ácido gordo livre/106 células/hora para ratinhos tratados com SKB + BC ou "sem medicamento". A fig. 13A e 13B são f otomicrograf ias de adipócitos de animais tratados com BC + SKF (fig. 13B) e não tratados (fig. 13A) . As quantidades de lipidos por célula (em pg de lípido/célula) são indicadas depois de cada figura.

As figs. 14A a 14C são fotomicrografias de núcleos arcuados de ratinhos de controlo ob/ob (fig. 14A), ratinhos tratados com BC + SKF ob/ob (fig. 14B) e controlos magros (57 BL/6J) (fig. 14C) que mostra grandes quantidades de neuropeptídeos Y (NPY) mARN nos controlos ob/ob e quantidades significativamente menores de NPY mARN nos ratinhos tratados ob/ob. A fig. 15 é um gráfico de barras de NPY mARN no núcleo arcuado de ratinhos ob/ob tratados com BC + SKF (barra do meio) ou ratinhos ob/ob não tratados (Barra da esquerda) ou controlos magros não tratados (barra da direita).

A figura 16 é um gráfico do peso corporal por dia de tratamento só com um agonista de D2 ou só com um agonista de Dl ou com uma combinação de D1/D2 de acordo com a presente invenção. Injecção de BC (10 mg/kg), BC mais SKF 16 38393 ou veiculo em peso corporal em ratinhos ob/ob C57BL/6J durante duas semanas de tratamento diário 1 hora depois de ligar a luz. Um asterisco indica uma diferença significativa na alteração do peso corporal relativamente a todos os outros grupos de tratamento (P<0,02).

Descrição pormenorizada da presente invenção

Numa concretização da utilização da presente invenção, o agonista de Dl da dopamina SKF 38393 é administrado em conjunto com um segundo agente, um alcaloide ergot agonista de D2, de preferência num momento especifico do dia ao sujeito que necessita de tratamento.

Tal como presentemente utilizado e aplicado à administração de mais do que um ingrediente activo, os termos "conjunto" ou "em conjunto" significam que o sujeito em tratamento recebe um primeiro agente activo e também pelo menos um outro agente activo, mas não necessariamente dentro da mesma formulação ou forma de dosagem e não necessariamente no mesmo momento de administração. Por exemplo, o agonista Dl e o agonista D2 podem ser administrados ao mesmo tempo (na mesma forma de dosagem ou em duas ou mais formas de dosagem divididas) ou sequencialmente em diferentes momentos e em formas de dosagem diferentes.

Os agonistas D2 do alcaloide ergot incluem 2-bromo-alfa-ergocriptina (bromocriptina) , 6-metil 8 beta-carbobenziloxi-aminoetil-10-alfa-ergolina, 8-acilaminoergolina, 6-metil-8-alfa-(N-acil)amino-9-ergolina, pergolida, lisurida, 6-metil-8-alfa-(N-fenil-acetil)amino-9-ergolina, ergocornina, 9,10-di-hidroergocornina, qualquer ergolina substituída por D-2-halo-6-alquil 8 e D-2-bromo-6- 17 metil-8-cianometilergolina. Destes a bromocriptina é o mais preferido.

Quantidades eficazes do alcaloide ergot para seres humanos e vertebrados, quando administradas isoladamente (sem ser em conjunto com um agonista Dl) situam-se tipicamente dentro dos limites de 5,0 ug/kg/dia a 0,2 mg/kg/dia.

Em geral, quantidades eficazes do agonista D2 para seres humanos e vertebrados situa-se entre 5 ug/kg/dia a 3,5 mg/kg/dia.

Quando são administrados dois (ou mais) agentes juntos, tal como apresentado no resumo da presente invenção, a quantidade de um ou outro pode ser menor do que o indicado anteriormente e podem mesmo ser empregues quantidades abaixo do limite inferior (quando é utilizado um agente só) . O agonista Dl da dopamina e o agonista D2 da dopamina podem ser administrados a um sujeito, de preferência por via oral ou por meio de injecção subcutânea, intravenosa ou intramuscular. Os sistemas de distribuição dérmicos, por exemplo pensos dérmicos, bem como supositórios e outros sistemas bem conhecidos para a administração de agentes farmacêuticos podem também ser empregues. São também contemplados os modos de administração sublingual, nasal ou transmucosa. São preferidas as composições de libertação acelerada, tais como as apresentadas no pedido de patente norte-americana n° 08/459,021.

Cada um dos agonistas D2 é administrado de preferência num momento pré determinado. A razão deve-se ao efeito de cada 18 um destes agentes no metabolismo dos lípidos e/ou glucose varia no tempo, tal como é explicado de forma mais detalhada para os agonistas D2 na patente norte-americana 5.585.347 e pedido de patente norte-americana 08/456 952. O momento preferido de administração situa-se dentro de um intervalo que tem como resultado niveis sanguíneos eficazes do agente (s) num intervalo de tempo em que os níveis de prolactina padrão em sujeitos saudáveis da espécie em tratamento são baixos. Por exemplo, em seres humanos os níveis de prolactina padrão são baixos entre as 9:00 e as 22:00 horas. Assim, o momento pré determinado de administração de um ou mais dos agentes anteriores situa-se entre as 5:00 e as 13:00 horas, de preferência 7:00 e 12:00 horas. Podem ser administradas doses divididas e o horário de administração pode ser variado para ter em conta as propriedades farmacocinéticas de cada agente activo. Os pormenores da administração são indicados na patente norte-americana 5 585 347 e no pedido de patente norte-americana 08/456 952 para a bromocriptina.

Para ratinhos, a hora preferida de administração do agente activo situa-se no espaço de 1 hora depois do acender da luz. É também preferido que a administração tenha lugar quando o sujeito não está nem activo nem a alimentar-se.

Para outros animais vertebrados, o momento preferido de administração pode ser determinado por meio da consulta do ritmo da prolactina padrão para a espécie de animal em tratamento. A curva de prolactina pode ser gerada por meio da medição da prolactina em membros juvenis, saudáveis da espécie ao longo de um período de 24 horas. Consultar a patente norte-americana 5 585 347 e o pedido de patente norte-americana 5,830,895 19

De preferência, administração do agonista Dl é também cronometrada, isto é o agonista Dl é também administrado num momento pré determinado. Porque o agonista Dl amplifica o efeito do agente conjunto, é vantajoso administrar o agonista Dl no momento ou próximo do momento da administração dos agente(s) conjuntos, de forma que o periodo de actividade do agonista Dl na corrente sanguínea do sujeito tratado se sobreponha (na realidade, de preferência, se sobreponha o máximo possível) com o período de actividade do agente conjunto. Por conveniência da administração e de forma a promover a colaboração do sujeito, o agonista Dl pode ser administrado ao mesmo tempo que o(s) agente(s) conjunto(s). 0 agonista Dl pode mas não tem de estar na mesma formulação ou forma de dosagem (ou fazer parte da mesma composição) que o(s) agente (s) conjunto. Se for administrado mais do que um agente conjunto, os agentes conjuntos podem mas não têm de estar na mesma formulação ou forma de dosagem ou fazer parte da mesma composição.

No tratamento de vertebrados, em geral, as dosagens do agonista Dl e agente(s) conjunto(s) são administradas tipicamente ao longo de um período entre cerca de 10 dias e cerca de 180 dias ou mais. Alguns pacientes (por exemplo pacientes em condições físicas particularmente fracas ou de idade avançada) podem necessitar de um tratamento mais longo ou mesmo contínuo. Uma duração de tratamento que exceda seis meses ou mesmo um tratamento contínuo poderá ser desejável mesmo se não for necessário.

Pelo menos um de depósitos de gordura corporal, peso corporal, glicemia no sangue ou no plasma, insulina 20 circulante, triglicéridos (TG) no plasma, ácidos gordos livres (AGL) no plasma e consumo de alimento do sujeito será reduzido em resultado do tratamento. As perturbações do metabolismo dos lipidos e glucose são tratadas e os sujeitos que sofrem destas patologias, tais como hiperfagia, obesidade, resistência à insulina (tolerância deficiente à glucose), hiperlipidemia, hiperinsulinemia e hiperglicemia irão apresentar melhorias nos indices metabólicos correspondentes.

Enquanto que uma administração adequadamente temporizada só de certos agonistas D2 (isto é bromocriptina) irá produzir os efeitos descritos anteriormente até um certo nivel, estes efeitos são amplificados (potenciados) pela administração conjunta dos agentes agonistas Dl. Por outras palavras, o efeito sinergético da administração conjunta do agonista Dl e do agente conjunto (isto é agonista D2) produz resultados que são superiores aos experimentados ao longo da administração da mesma quantidade só de um agonista D2. Deve-se ter em atenção que a presente invenção permite mas não exige que cada agente seja administrado numa quantidade maior que a quantidade limite (na ausência de um agente conjunto) para melhorar um ou mais indices metabólicos, precisamente devido ao efeito aumentado nestes indices, atingido pela administração conjunta de acordo com a presente invenção.

As vantagens da presente invenção são se limitam à modificação e regulação do metabolismo dos lipidos e glucose. Outras funções corporais, tais como pressão sanguinea, podem ser vantajosamente modificados e regulados pela administração programada de um agonista D2 (como monoterapia) numa dosagem dentro dos limites apresentados 21 anteriormente. Por exemplo, o autor da presente invenção verificou que o agonista D2 bromocriptina, administrado numa dose dentro dos limites indicados anteriormente (4,8 mg/dia às 8:00) diminui significativamente a pressão sanguinea diastólica em seres humanos.

Esta e outras caracteristicas da presente invenção serão melhor esclarecidas a partir das experiências descritas nos exemplos seguintes.

Exemplo 1

Ratinhos ob/ob fêmea (40 a 70g de peso corporal) foram tratados durante duas semanas ou com 1) bromocriptina (11 mg/kg) ao acender da luz, 2) SFK 38393 (20 mg/kg) ao acender da luz, 3) bromocriptina mais SKF 38393 ao acender da luz ou 4) veiculo ao acender da luz. A bromocriptina ou SKF 38393 isolados produziram reduções moderadas na hiperfagia, ganho de peso corporal e obesidade. No entanto, o tratamento com bromocriptina mais SKF produziu reduções significativas na hiperfagia (50 a 60% p<0,01), tendo como resultado uma perda de peso dramática (21 %, p<0,001, em comparação com os controlos). A análise da composição corporal de carcaças tratadas com KOH/EtOH não revelaram uma diminuição significativa da massa proteica e revelaram uma diminuição de 22% (p<0,05) da massa adiposa em ratinhos tratados com bromocriptina mais SKF, em comparação com os controlos. Além disso, o tratamento com bromocriptina mais SKF diminuiu muito mais do que só a bromocriptina ou só SKF os ácidos gordos livres (AGL) no plasma (44%, p<0,001), os triglicéridos (TG (50%, p<0,05) e glucose (57%, p<0,01). Os niveis de insulina tiveram tendência para diminuir (em 50%; p<0,09) e o 22 colesterol total manteve-se inalterado com a terapia com medicamentos combinados.

Animais maiores (65 a 75 g) tratados com bromocriptina mais SKF38393 demonstraram uma perda ainda mais dramática de peso corporal em relação aos controlos (10 + lg em 10 dias; p<0,01). Os niveis de mARN do neuropeptideo arcuado Y (NPY) mantêm-se inalterados depois do tratamento com bromocriptina mais SKF, em comparação com os controlos.

Ratinhos obesos fêmeas C57BL/6J com 40 a 45 g de peso corporal foram tratados com injecções diárias (a 1 HALO) de bromocriptina (BC a 10 mg/dia) e/ou SKF 38393 (SKF a 20 mg/kg). Os animais foram mantidos em fotoperiodos diários de 12 horas e alimentados ad libidum. O consumo de alimento foi controlado diariamente e os pesos corporais foram controlados nos dias 0, 7 e 14 do tratamento. Os animais foram sacrificados 1 e/ou 4 horas depois de ligar a luz ("HALO") (excepto como descrito na fig. 12A) e recolheu-se sangue, tecido hepático e adiposo. As carcaças foram digeridas em KOH etanólico e analisadas quanto ao teor proteico e de lípidos. A glicemia foi medida com um medidor de glucose Accu-Chek Advantage (Boehringer). A insulina no soro foi medida com um conjunto de radioimunoanálise (Linco Research) com padrões de insulina de rato. Os niveis de triglicéridos total e ácidos gordos livres foram medidos com conjuntos da Sigma Diagnostics, St. Louis, Mo and Wako Chemicals respectivamente. A actividade enzimática da sintase de ácidos gordos, enzima málica e glucose-6-fosfato desidrogenase foi medida em fracção citosolica isolada por meio de métodos espectrofotométricos. O fosfoenolpiruvato carboxiquinase 23 (PEPCK) no citosol hepático foi analisado por meio de incorporação de H14C03 em fosfoenolpiruvato. A actividade de glucose-6-fosfatase foi determinada por espectrofotometria em microssomas hepáticos isolados.

Os adipócitos foram isolados a partir de gordura perigonadal por digestão da colagenase e o seu tamanho foi determinado por meio da combinação de medições microscópicas do seu diâmetro e extracção de lipidos do seu teor de lipidos. 0 transporte de glucose e o metabolismo da glucose foram medidos por meio de glucose U-14C na ausência e na presença de insulina e a lipólise basal foi analisada por meio da medição da libertação de glicerol com um 32P-g-ATP. Os níveis de mARN no neuropeptídeo Y (NPY) foram medidos nos núcleos arcuados dos ratos recorrendo a hibridação in situ.

Em resumo, o tratamento com bromocriptina (BC) mais SKF383893 (SKF) de ratinhos ob/ob C57 BL/6 produz as seguintes alterações na fisiologia metabólica: (1) Uma redução de 42% na hiperfagia, reduzindo os niveis de alimentação diários para menos ou igual a controlos (+/+) magros, (fig. 2) (2) Uma perda de 3,67g de peso corporal em comparação com um ganho de 4,3 g de peso corporal em controlos obesos, (fig. 1) (3) Uma redução de 27 % de massa de gordura corporal (fig. 3A) sem qualquer perda proteica (fig. 3B) apesar da redução substancial em consumo de alimentos. (4) Uma redução de 57 e 41 % da hiperglicemia (fig. 4A) e hiperinsulinemia (fig. 4B) respectivamente. (5) Uma redução de 44 e 50% da concentração de AGL no soro (fig. 5B) e TG (fig. 5A). 24 (6) Uma redução de 27 a 78 % nas enzimas da lipogénese no fígado e tecido adiposo (figs. 7A a 7C, 8A a 8B, 9A a 9C) . (7) Uma redução de 64 % da actividade da glucose-6-fosfatase no fígado e aumento de 80 % da actividade de G6P desidrogenase no fígado (fig. 8B) bem como uma redução significativa na sintase de ácidos gordos (fig. 7A) e enzima málica (fig. 7B). (8) Uma redução de 42 % na lipólise basal de adipócitos isolados (fig. 11) de ratinhos tratados in vivo, sem alteração no transporte da glucose (fig. 10A) ou oxidação (fig. 10B) ou expressão de GLUT4 (dados não apresentados) bem como uma redução significativa no tamanho dos adipócitos (comparar figs. 13B e 13A). (9) Uma redução de 50 % na actividade lipase de lipoproteína do tecido adiposo (LPL) e um bloqueio da lipogénese (figs. 12B e 12A, respectivamente). (10) As alterações metabólicas observadas, induzidas por BC + SKF são associadas com uma redução de 30 % no nível de mARN NPY dentro dos núcleos arcuados, tendo como resultado níveis ainda duas vezes maiores do que nos equivalentes ( + / + ) magros (fig. 15) . Foi observado qualitativamente um resultado semelhante nas figs. 14A a 14C. (11) A redução da glicemia, triglicéridos e ácidos gordos livres é mais pronunciada em 4 HALO (pico da lipólise no rato). Consultar a fig. 6 e comparar a fig. 6A com a fig. 4A, fig. 6B com a fig. 5A e fig. 6C com a fig. 5B. O tratamento de ratinhos geneticamente obesos c57 BL/6J com bromocriptina (agonista D2) mais SKF 38393 (Agonista Dl) induziu uma redução do peso corporal associado a uma marcada (42 %) redução da hiperfagia. A perda de peso 25 resultante foi atribuída quase exclusivamente à perda de gordura com a massa proteica mantendo-se inalterada ou mesmo aumentando. A perda de gordura pode ser atribuída a uma ingestão de calorias menor, bem como uma lipogénese menor uma vez que as actividades enzimáticas lipogénicas tanto hepática como adiposa, foram reduzidas pelo tratamento. A redução substancial na ingestão de calorias, induzida pelo tratamento foi associada a uma grande redução dos ácidos gordos livres (AGL) circulantes. Isto é, o tamanho da célula gorda (teor de lípidos) diminuiu apreciavelmente enquanto que a lipogénese e mobilização de lípidos diminuiu simultaneamente. Aparentemente, a diminuição da mobilização está associada a uma diminuição ainda maior na acumulação dos lípidos. Uma conclusão destas é apoiada pelas descobertas LPL adiposo diminuído e total e VLDL-TG (very low density lipoprotein/triglicéridos) no soro. A marcada redução da glucose no soro, induzida pelo tratamento está associada a uma forte redução da actividade glucose-6-fosfatase hepática e uma diminuição um pouco menos dramática na actividade fosfoenolpiruvato carboxiquinase. Curiosamente, a redução da actividade G-6-fosfatase hepática e o aumento simultâneo da actividade G-6-P desidrogenase sugerem uma distribuição de canais metabólica, específica para a utilização da glucose no fígado em vez de libertação ou produção de glucose. Estas alterações no metabolismo hepático facilitam o aumento da síntese de HADPH hepático, ácido nucleico e proteína. As descobertas anteriores podem ser aplicadas no tratamento de seres humanos que sofrem de obesidade e outras perturbações lipídicas.

Exemplo 2 26

Grupos diferentes de ratinhos ob/ob de seis semanas C57BL/6 (com falta de um proteina de leptina funcional) foram tratados ou com bromocriptina ("BC") (10 mg/kg PC), ou SKF383893 ("SKF") (10 mg/kg PC) ou ambos os medicamentos ou veiculo durante duas semanas, 1 hora depois do acender da luz (HALO). Os animais foram mantidos em fotoperiodos diários de 12 horas e alimentados ad libitum. O consumo de alimento foi controlado diariamente durante 3 dias antes do inicio do tratamento, ao longo de um periodo de tratamento de 14 dias. Os animais foram sacrificados entre 1 e 3 HALO no dia seguinte ao tratamento final (isto é 24 a 26 horas depois da última injecção) e o plasma foi recolhido para análise da insulina, glucose e lipidos, enquanto que as carcaças foram solubilizadas em KOH etanólico e analisadas quanto ao teor de proteina e lipidos. A bromocriptina e SKF38393 individualmente eram ineficazes na redução do aumento do peso corporal, enquanto que SKF, mas não BC, reduziu o consumo de alimento (19 %, P<0,01). No entanto, o tratamento combinado da bromocriptina e SKF38393 (BC/SKF) diminuiu o consumo de alimento em 46 % (desde 4,8 ± 0,2 a 2,6 ± g/dia; P<0,001) e peso corporal em 15 % (desde 3,2 g de aumento em controlos até 4,3 g de diminuição: P<0,005) em 14 dias de tratamento (fig. 16). Relativamente aos controlos, em termos absolutos, o teor de lipidos de animais tratados com BC/SKF diminuiu em 40 % (desde 4,2 ± 0,2 a 2,5 ± 0,3 g de glicerol/animal; P<0,0003) enquanto que o teor de proteina aumentou 8 5 (desde 3,7 ± 0,08 a 4,0 ± 0,08 g/animal; P<0,05). Por conseguinte, relativamente aos ratinhos de controlo, os animais tratados com BC/SKF consumiram menos comida mas aumentaram de facto a massa proteica enquanto perdiam peso e gordura. Este efeito na composição corporal foi só observado em tratamentos com SKF (P<0,003) ou BC (P<0,04) apesar de numa menor escala do que 27 na combinação BC/SKF (P<0,05) . Apesar de só BC e Só SKF terem reduzido significativamente a concentração de glucose no plasma (em 31 %: P<0,02 e 43 %; P<0,004, respectivamente), a combinação BC/SKF reduziu a glucose no plasma (em 60 %; P<0, 0004) substancialmente mais do que qualquer um dos medicamentos isolado (P<0,03) para valores equivalentes aos valores descritos para ratinhos C57BL/6 euglicémicos magros ( + / + ) (1) . O nivel de insulina no plasma foi também reduzido pelo tratamento BC e BC/SKF (50 %; P<0,04) mas não foi afectado pelo SKF isolado. BC/SKF, mas nem BC nem SKF reduziram os niveis de triglicéridos e ácidos gordos livres (em 36 %; P<0,05 e 44 % P<0,007), (quadro 1, abaixo). Estes dados indicam que os efeitos interactivos de BC e SKF reduziram efectivamente a hiperfagia, a obesidade, resistência à insulina, hiperglicemia, hiperinsulinemia e hiperlipidemia no ratinho ob/ob. buadro 1. Efeitos de injecções de BC (10 mg/kg), SKF (10 mg/kg), BC mais SKF ou veículo a 1 HALO no peso corporal, composição da carcaça, consumo de alimento e níveis de glucose no plasma, insulina e lipidos de ratinhos ob/ob na sequência de duas semanas de tratamento. Os animais foram sacrificados 24 a 26 horas depois do último tratamento. Dentro dos parâmetros, os valores com expoentes semelhantes designam uma diferença significativa entre tratamentos (P<0,05 a <0,0001).

Peso Lipidosglicerol Proteína Glucose Insulina TG no AGL no Consumo de corporal corporal total corporal total no plasma no plasma plasma plasma alimento final (g) (g) (% pc) (g) (¾ pc) (mg/dl) (ng/ml) (mg/dl) (uM) (g/dia) controlo 54+11 4,2+0,21 3,7+0,11,2,3 380+391,2 59+121,2 313+491 825+831 48+0,2U 7,9+0,31 6,9 +0,21 BC 53+0,72 3,7+0,11 4,0+0,11 262+251 30+42 405+101 818+642 4,5+0,22,3 7,0+0,21 7,5+0,11 SKF 52+0,72 3,1 +0,11 4,1 +0,042 218±2 50+13 234+2 671+3 3,9+0,073 6,0+0,21 7,9+0,11 22 21 63 4,5 BC/SKF 45+21'2'3 2,5+0,31 4,0+0,13 154+151,2 30+91 199+18 461+631'2'3 2,6+4-0,21,2,3 5,4+0,51 8,8+0,0,41

Os valores diferem significativamente destes controlos obesos (a=P<0,05; b = P<0,01; c=P<0,001). 29

Exemplo 3

Os efeitos do tratamento com BC/SKF nos ritmos circadianos das actividades enzimáticas metabólicas chave, metabolitos no soro e hormonal que regulam o metabolismo foram examinados. Ratinhos obesos C57BL/6J foram tratados durante 2 semanas, 1 hora depois de ligar a luz com BC (10 mg/kg PC) e SKF (20 mg/kg PC) ou veículo. Foram sacrificados ratinhos a cada 4 horas ao longo de um período de 24 hr para as análises das hormonas e metabolitos no soro e

actividades enzimáticas hepáticas. A actividade da glucose no soro, ácidos gordos livres (AGL) e glucose-6-fosfatase (G6Pase) hepática foram maiores durante o período de luz do dia, revelando que este período de tempo é o pico diário para a lipólise e produção de glucose hepática. O tratamento BC/SKF reduziu significativamente a glicemia (51 %) , AGL (56 %) e a actividade G6Pase (38 %) durante este período de luz. Além disso, os níveis de soro das hormonas lipolíticas e gluconeogénicas tiroxina e corticosterona foram também maiores durante o período de luz e os seus níveis diminuíram significativamente em 51 % e 53 %, respectivamente com o tratamento BC/SKF. O tratamento BD7SKF diminuiu também o pico diário de actividade fosfoenolpiruvato carboxiquinase no fígado em 27 % e aumentou o pico diário de glucose-6-fosfato desidrogenase no fígado (em 32 %) (potenciando a glicólise através da produção de xilose-5-fosfato). Os níveis de insulina no soro e enzima málica no fígado foram maiores durante o período de escuridão (tempo de alimentação) do dia, ilustrando o aumento da lipogénese durante este tempo em ratinhos. Durante este período de escuridão, o tratamento reduziu significativamente a insulina no soro, isto é em 42 % e a enzima málica no fígado em 26 %. O tratamento com BC/SKF diminuiu também a actividade de sintase dos ácidos 30 gordos em 30 a 50 %, normalizando o ritmo circadiano. Estes efeitos demonstram o envolvimento tanto dos sistemas circadianos e a influência de BC/SKF nestes sistemas na regulação do metabolismo.

Exemplo 4 O efeito in vivo do tratamento BC/SKF na libertação de insulina induzida pela glucose foi estudado in vitro. Ratinhos obesos (ob/ob) e magros (+/+) C57BL/6J foram tratados diariamente durante 2 semanas com BC (10 mg/kg) mais SKF (20 mg/kg) ou só veiculo. Os ratinhos foram sacrificados 25 horas depois do tratamento final e as ilhotas foram isoladas para incubação estática com glucose. O tratamento com BC/SKF de ratinhos obesos reduziu a glicemia (173 ± 14 mg/dl, P <0.01), o glicerol total no plasma 162 ± 9 em comparação com 386 ± 33 mg/dl, P<0.01) e colesterol total no plasma (143 ± 5 em comparação com 184 ± 5 mg/dl, P<0.01) relativamente aos controlos obesos. O ácido gordo livre e niveis de insulina no plasma dos ratinhos tratados foram também reduzidos em 20 a 30 %, em comparação com os dos controlos obesos. Em ratinhos ob/ob de controlo, a libertação de insulina das ilhotas isoladas, estimuladas por 10 mM de glucose foi igual à obtida com 8 mM de glucose (1,6 ± 0,2 em comparação com 1,9 ± 0,5 ng/ilhota/h) , enquanto que em ratinhos ob/ob tratados com BC/SKF, 15 mM de glucose induziu um aumento significativo da libertação de insulina, em comparação com 8 mM de glucose (4,1 ± 0,8 em comparação com 1,8 ± 0,4 ng/ilhotas/h, P<0.05). Este aumento é comparável ao observado em ratinhos magros, que exibiam um aumento para o dobro da libertação de insulina em resposta a 15 mM em comparação com 8 mM de glucose. Um tratamento semelhante com BC/SKF de ratinhos magros não mostrou qualquer efeito 31 na libertação de insulina estimulada pela glucose a partir das ilhotas isoladas, em comparação com controlos magros. 0 tratamento com BC/SKF inverteu a sensibilidade deficiente à glucose das ilhotas em ratinhos ob/ob provavelmente devido me parte à melhoria da hiperglicemia e hiperlipidemia com este tratamento.

Uma vez que a hiperglicemia e a hiperlipidemia podem induzir a dessensibilização das ilhotas à glucose, que é um síndroma comum em DMNID associado à obesidade em seres humanos, a descoberta anterior pode ser aplicada à terapia de DMNID em seres humanos.

Exemplo 5

As alterações metabólicas resultantes do tratamento com agonista D1/D2 foram avaliadas em ratinhos para determinar se foram acompanhados por diminuições na densidade da imunoreactividade NPY em núcleos hipotalâmicos discretos. Ratinhos ob/ob fêmea (30 a 35 g) foram tratados diariamente, 1 h depois de ligar a luz com SKF38393 (20 mg/kg) e bromocriptina (15 mg/kg) ou veículo. Os ratinhos magros (C57BL/6J; 18 a 21 g) tratados com veículo serviram também como controlo. A seguir ao tratamento durante 12 dias, os ratinhos foram sacrificados e os seus cérebros foram processados quanto a imunorreactividade NPY. O tratamento (resumido no quadro 2, em seguida) revelou um significativo declínio nos níveis de NPY no SCN (38,5 % P<0,01), nos núcleos arcuados (41 %; P<0,005) e PVN (31,4 %, P<0,05) em comparação com os controlos obesos. Para além disso, durante o estudo os pesos corporais aumentaram nos controlos obesos (8,3 ± 0,9 g) enquanto que diminuiu nos animais tratados (-1,1 ± -2 g) (P<0,0001). Estes resultados indicam que a coactivação D1/D2 32 dopaminérgica dependente do tempo reforça a hiperfagia, hiperglicemia e obesidade nos ratinhos ob/ob, em parte pela redução dos níveis elevados da NPY hipotalâmico em comparação com a de animais magros.

Quadro 2

Tipo Alimento consumido (g/dia) Glicemia (mg/dl) Densidade NPY (unidades arbitrárias) SCN Arcuado PVN Magros 3.1 ± 0.1 133 ± 5 39.8 ± 3 54 ± 4 49 ± 5 Obesos 6.1 ± 0.1 216 ± 16 55.2 ± 4 95 ± 10 52 + 6 Tratados O \—1 o +1 00 ^r1 136 ± 9a 34 ± 4b 56 ± 8b 36 + 3a

Exemplo 6

Foi examinada a influência do tratamento BC/SKF no metabolismo hepático da glucose. Ratinhos (ob/ob) obesos C57BL/6J fêmeas (PC = 46 ± lg) foram tratados diariamente durante 2 sms com BC (12,5 mg/kg) e SKF (20 mg/kg) ou veículo (n = 8 a 12/grupo) 1 hr depois de acender a luz e depois foram sacrificados nas 24 a 26 hrs seguintes ao dia final de tratamento e o tecido hepático foi removido e analisado quanto às actividades de glucose-6-fosfataase (G6Pase) e glucose 6 fosfatase desidrogenase (G6Pdase) e concentração de xilose-5-fosfato (X5P) hepática. Os níveis de glucose e de insulina no soro foram também determinados. O tratamento com BC/SKF reduziu significativamente (P<0,01) a glucose no soro em 57 % (desde 435 ± 21 a 185 ± 8 mg/dl), insulina no soro em 44 % (desde 25 ± 2 a 14 ± 3 ng/ml) , actividade G6Pase hepática 67 % (desde 1,5 ± 0,3 a 0,5 ± 0,07 Amoles/min/mg) e aumentou a actividade G6PDase hepática em 73 % (desde 11 ± 1 a 19 ± 3 nmoles/min/mg) e a concentração de X5P em 73 % (desde 166 ± 10 a 287 ± 30nmoles/g) relativamente ao controlo. O tratamento com 33 BC/SKF teve como resultado um substrato gluconeogénico que é afastado da via da glucose para a via pentose fosfato devido à inibição simultânea da glucose 6-fosfatase (G6Pase) e estimulação de glucose-6-fosfato desidrogenase (G6Pdase) bloqueando assim respectivamente a produção de glucose hepática e transferindo glucose-6-fosfato para a produção de xilose-5-fosfato (X5P) um potente activador da glicólise. Este é o primeiro estudo a identificar a existência desta deslocação bioquímica no metabolismo hepático da glucose e sua regulação na activação dopaminérgica. Além disso, a deslocação regulada dopaminergicamente da gluconeogénese hepática para a potenciação da glicólise poderia contribuir para a normalização de hiperglicemias graves nestes animais e pode ter significado tanto no desenvolvimento como no tratamento de DMNID em seres humanos. As provas existentes sugerem que BC/SKF actua em parte no hipotálamo ventromedial para produzir estes efeitos.

Exemplo 7 A combinação de hiperglicemia e hipertrigliceridemia tem sido implicada como factor de risco para doenças cardiovasculares e DMNID. Provou-se que a co-activação do receptor D1/D2 dopaminérgico com SKF38393 (SKF), um agonista do receptor Dl, mais bromocriptina (BC), um agonista do receptor D2, age de forma sinergética para reduzir a obesidade. Os seus efeitos na hiperglicemia, dislipidemia e dinâmica das lipoproteínas no plasma foram testados em ratinhos ob/ob. Ratinhos (ob/ob) C57BL/6J obesos (PC 44,5 ± 0,5 g) foram tratados diariamente ao ligar da luz com veiculo (controlo) ou SKF (20 mg/kg/PC) mais BC (16 mg/kg PC) durante 14 dias. 25 a 28 hrs depois do tratamento final, os animais foram sacrificados e o 34 sangue foi recolhido para fraccionação e análise da lipoproteina. Mediram-se a lipoproteina e triglicéridos no soro (TG), colesterol (CH), fosfolipidos (PL) e glucose, insulina e ácidos gordos livres (AGL) no soro. Foram recolhidos tecido adiposo branco, músculo esquelético e cardiaco para análise da actividade da lipase da lipoproteina (LPL). Um segundo grupo de animais tratados de forma semelhante foi utilizado para a determinação da sintese de triacilglicerol hepática obedecendo a incorporação de 3H-glicerol nos triglicéridos do fígado 30 mins depois da sua administração in vivo. 14 dias de tratamento com BC/SKF reduziram significativamente a glicemia (390 ± 17 a 168 ± 6 mg/dl) , TG no soro (397 ± 22 a 153 ± 7 mg/dl), CH (178 ± 4 a 139 ± 4 mg/dl), PL (380 ± 7 a 263 ± 11 mg/dl) e AGL (1,1 ± 0,1 a 0,7 ± 0,1 mmol/1) (P<0.01) . A insulina foi também reduzida desde 40 ± 5 a 28 ± 4 ng/ml (P=0,058) . Quilomicron-TG e VÇDG-TG foram

reduzidos desde 228 ± 2 para 45 ± 6 mg/dl e 169 ± 7 a 110 ± 4 mg/dl, respectivamente (P<0.01). A síntese de triacilglicerol hepático foi reduzida em 47 % (P<0,01). A actividade LPL manteve-se inalterada no tecido do músculo esquelético e cardíaco mas sofreu uma abrupta redução (67 %) no tecido adiposo (P<0,01) . O nível de colesterol LDL foi reduzida em 31 % (P<0,01) . Estes dados indicam que BC/SKF normalizou a hipertrigliceridemia através de 1) diminuição do nível de quilomicron-TG e 2) diminuição da síntese de VLDL-TG e secreção. A marcada diminuição da actividade LPL adiposa apoia ainda a conclusão de que o VLDL-TG no soro é reduzido pela diminuição da síntese hepática em vez da maior remoção da circulação e pode também contribuir para a diminuição do nível de AGL no soro. Além disso, a redução de AGL no soro pode contribuir para a diminuição da hiperglicemia. 35

Exemplo 8

Um tratamento de 2 semanas com SKF38393 (SKF), um agonista do receptor Dl, e bromocriptina (BC), um agonista do receptor D2 age de forma sinergética para reduzir a gordura corporal e hiperglicemia em ratinhos ob/ob de uma forma independente do consumo de alimento. Os mecanismos bioquímicos responsáveis por este efeito foram avaliados pela medição do dispêndio de energia e utilização do substrato metabólico, determinada a partir do quociente respiratório (QR) de ratinhos tratados em comparação com ratinhos de controlo. Os níveis de ácidos gordos livres (AGL) representam o principal factor de limitação da oxidação da gordura e AGL elevado potenciam também a hiperglicemia em estados resistentes à insulina. Foi testada a influência de tratamento in vivo com SKF38393 (SKF), um agonista do receptor Dl de dopamina, e bromocriptina (BC, um agonista do receptor D2 de dopamina no nível de AGL no soro e lipólise in vivo em adipócitos isolados. Ratinhos (ob/ob) C57BL/6J obesos fêmeas foram tratados ao com veículo (controlo) ou SKF (20 mg/kg/PC) mais BC (10 mg/kg PC) durante 14 dias. O tratamento BC/SKF aumentou o consumo de O2 e produção de CO2 em 143 % e 90 % respectivamente (P<0, 0001) . Além disso, os valores QR foram deslocados pelo tratamento de 1,55 ± 0,35 para 1,03 ± 0,11, indicando uma diminuição na conversão nova de glucose em lípidos (lipogénese) e utilização quase exclusiva da glucose como fonte de energia (isto é pouca oxidação da gordura). Estas descobertas estão de acordo com a substancial diminuição induzida por medicamentos do nível de glucose no soro (489 ± 25 para 135 ± 10 mg/dl, P<0.0001). Estas conclusões tiradas a partir dos dados QR são apoiadas ainda pela dramática diminuição no tamanho das células gordas (de 0,722 ± 0,095 para 0,352 ± 0,03 yg de 36 lípidos/célula, P <0.02) e marcada redução nos níveis de AGL no soro (de 1,06 ± 0,1 para 0,32 ± 0,02 mM, P<0.001) e lipólise estimulada pelo isoproterenol in vitro (de 16,4 ± 2,4 para 5 ± 0,6 pmoles de libertação de glicerol/célula/20 min, P < 0.005) . Por conseguinte, o dramático aumento na produção de Cç e CO2 (e menor tamanho de célula gorda) não podem ser explicados pelo aumento da mobilização da gordura e oxidação. Estes dados indicam que a coactivação do receptor D1.D2 dopaminérgico desloca o metabolismo da glucose da lipogénese para a oxidação com uma diminuição concorrente da mobilização da gordura e oxidação (melhorando assim possivelmente a sensibilidade à insulina). Estas descobertas revestem-se de significado para o tratamento da obesidade e hipertrigliceridemia associados a DMNID.

Exemplo 9 A eficácia combinada de SKF38393 (SKF), um agonista do receptor Dl, e bromocriptina (BC), um agonista do receptor D2, foi examinada no tratamento da obesidade e diabetes em ratinhos ob/ob (ratinhos com falta do gene da proteína leptina) e ratinhos db/db (ratinhos com falta do gene do receptor leptina). Injecções diárias do medicamento foram administradas a ratinhos C57BL/6J ob/ob e C57BL/KJ db/db, 1 hr depois de acender da luz durante 14 dias. Os grupos tratados com o medicamento receberam BC (16 mg/kg) mais SKF (20 mg/kg), enquanto que grupos alimentados a par (alimento ajustado à ingestão dos grupos tratados com medicamento) e grupos de controlo receberam o veículo. O consumo de oxigénio foi medido em gaiolas metabólicas no dia 11 ou 12 do tratamento. Mediram-se os níveis de glucose no plasma, AGL e insulina no dia 14. Nos ratinhos ob/ob os resultados estatisticamente significativos incluíam: Os controlos 37 ganharam 6,9 ± 1,3 g de peso corporal, enquanto que os ratinhos tratados perderam 7,4 ± 0,4 g. O consumo médio diário de alimento dos controlos foi de 6 ± 0,2 g contra 2,8 ± 0,1 g dos tratados. O consumo de oxigénio dos controlos e tratados foi de 1277 ± 240 ml/kg/hr e 1623 ± 230 respectivamente. Os níveis de glucose no plasma eram 471 ± 42 mg/dl em controlos e 164 ± 33, 02 cm em tratados. Os níveis de k AGL eram 1,27 ±0,1 mM em controlos e 0,37 ± 1,27 mm em tratados. A insulina no plasma era de 63,5 ± 17 ng/ml em controlos e 37,3 ± 6,6 em tratados. Foram observados resultados estatisticamente significativos semelhantes em ratinhos db/db: Os controlos ganharam 6,6 ± 0,4 g de peso corporal contra 3,4 ± 1,3 g nos tratados. O bom consumo médio diário de alimento dos controlos foi de 10,7 ± 2,8 g contra 5,9 ± 0,5 g dos tratados. O consumo de oxigénio para os controlos e tratados foi de 898 ± 2.150 ml/kg/hr e 2322 ± 283, respectivamente. Os níveis de glucose no plasma foram 485 ± 29 mg/dl em controlos e 390 ± 55 nos tratados. Os níveis de AGL eram de 1,49 ± 0,2 mM em controlos e 0,45 ± 0,04 em tratados. O plasma de animais alimentados par (tanto em ratinhos ob/ob como db/db) indicou que as alterações metabólicas induzidas pelo medicamento não são principalmente consequência do consumo diminuído de alimento. Estes resultados sugerem fortemente que a hiperfagia, hiperglicemia e hiperlipidemia em animais com falta ou de leptina (ob/ob) ou receptor funcional de leptina (db/db) podem ser tratados com a administração combinada de agonistas do receptor Dl e D2.

Exemplo 10 A intervenção farmacológica com bromocriptina melhora o metabolismo da glucose e lípidos em animais e pacientes com DMNID. Foi investigada a influência deste tratamento nas na 38 função das ilhotas do pâncreas. Foi avaliado o efeito dos agonistas do receptor D1/D2 - bromocriptina/SKF38393 (BC/SKF) na função das ilhotas num modelo de rato diabético. Ratinhos db/db fêmeas (30 ± 1 g) foram tratados diariamente, durante 2 semanas, 1 hr depois de acender da luz com 1) BC (16 mg/kg) , 2) só veiculo (controlos) ou 3) veiculo mais restrição alimentar para equiparar o menor consumo de alimento dos ratinhos tratados (alimentação a par). O tratamento com BC/SKF reduziu a glicemia (347 ± 28 contra 606 ± 31 mg/dl em controlos, P<0,01) e niveis de ácidos gordos livres no plasma (0,6 ± 0,1 contra 1,1 k ± 0,1 mM em controlos, P<0,01) e nivel 3 vezes superior de insulina no plasma em comparação com o de controlos (49 ± 5 contra 16 ± 2 ng/ml, P<0,01). Nos ratinhos com alimentação a par houve uma redução mais modesta (30 %) (P<0,01) de glicemia mas ; não houve alteração na insulina no plasma e um aumento de 20 % nos ácidos gordos livres no plasma, em comparação com os niveis dos controlos. A resposta de libertação de insulina das ilhotas do pâncreas ao secretagogue foi testada in vitro. A libertação de insulina de ilhotas incubadas, estimuladas por glucose (8 e 15 mM) , arginina (10 mM) e acetilcolina (10 μΜ) foi, para cada um, 3 a 4 vezes superior no grupo tratados em comparação com o dos controlos (P<0,05). Pelo contrário, a libertação de insulina induzida por secretagogue a partir de ilhotas incubadas de ratinhos com alimentação a par foi semelhante à dos controlos. Além disso, um tratamento com BC/SKF semelhante não teve qualquer efeito em ratinhos normais. A adição de BC/SKF directamente no tampão de incubação da ilhota não intensificou a libertação de insulina das ilhotas de ratinho db/db. Estes resultados demonstram que o BC/SKF dado in vivo intensifica marcadamente a função das ilhotas em db/db mas não no ratinho normal. Este efeito não 39 pode ser atribuído nem à acção directa na função das ilhotas bem à inibição da alimentação.

Lisboa, 30 de Janeiro de 2007

Claims (9)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização do agonista Dl da dopamina SKF38393 e um alcaloide de ergot agonista D2 da dopamina para a preparação de uma preparação combinada para utilização simultânea, separada ou sequencial para modificar ou regular pelo menos uma das perturbações do metabolismo da glucose ou lípidos.

2. Utilização da reivindicação 1, em que a preparação mencionada é eficaz para melhorar pelo menos um dos seguintes índices do metabolismo dos lípidos e glucose: peso corporal, gordura corporal, insulina no plasma, glucose no plasma, lípidos no plasma e lípidos proteínas no plasma.

3. A utilização da reivindicação 1 ou 2, em que a preparação mencionada se destina ao tratamento da hiperglicemia associada a diabetes tipo 2.

4. A utilização da reivindicação 1 ou 2, em que a preparação mencionada se destina ao tratamento da obesidade.

5. A utilização da reivindicação 1 ou 2, em que a preparação mencionada se destina ao tratamento da hiperlipidemia.

6. Utilização de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o alcaloide ergot, agonista de D2 da dopamina mencionado se destina a administração diária, num momento entre 5:00 e 13:00. 2

7. Utilização de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o agonista Dl SKF38393 se destina à administração por volta do mesmo momento que o agonista D2.

8. Utilização de qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o agonista de D2 da dopamina alcaloide ergot é seleccionado do grupo constituído por 2-bromo-alfa-ergocriptina, 6-metil 8 beta-carbobenziloxiaminoetil-10-alfa-ergolina, 8-acilaminoergolina, pergolida, lisurida, 6-metil-8-alfa-(N-acil)amino-9-ergolina, 6-metil-8-alfa-(N-fenil-acetil)amino-9-ergolina, ergocornina, 9,10-di-hidroergocornina e ergolinas substituídas D-2-halo-6-alquil-8, D-2-bromo-6-metil-8-cianometilergolina.

9. Utilização da reivindicação 8, em que o alcaloide ergot inclui bromocriptina. Lisboa, 30 de Janeiro de 2007