PT92568B - Processo para a preparacao e concentracao do apolipoproteinas - Google Patents

Description

I» . j \ ADAMANTECH INC., CL IFOPROTE i N? "PROCESSO PARA A SEPAAhCaO E CONCENTRACau

MRNLP ' ·- ΟΕΞίΙκΤΤ · V A u pr J e 1. .n vento ? ina; A; PH-PPJL - um p·; 3C CÃ! P l o , '.sangas , per trcceíiãn::' c;ce RFC C per f 1 u.orc-c a rcon-3 :c· > emaiãi-t a. c ad o co:!i f e a; t e 1 £ j. A o e ;;;:ira;a:Q , em aamuda, da. ãcuIãKc cp" tendo as apo 1 i poorotein as.. Estas últimas são rApiajcente ;a carad aa Ia annj. ’ ;Ig . \

ΙνΞΝΤϋ 0 efeito de.s I i pc o ro te i n as no sangue sobre a a ta rose ie— rGS3 é conhecido. Quando o colesterol sanguíneo d elevado., aumentando o risco de ateresc 1 aros , existe usu.a.lmente v.m aumento na 1 ipepra teina. de baixa densidade, LDL, o d nanado colesterol "mau’’ . As 1 i pc- ρ r o te 1 n a s de elevada densidade (HuLQ parece removerem o colesterol em e:.cesso da corrente sanguínea sendo assiu referidas como cclsste:-oi "bom". Trabalhes recentes sugerem que a iío/estige.doree· utilizam s q o ra outra s cihegeriasq 1i poprotairas ssn .ou:, to bai o a densidade '9VLDD , 1 :.pc o/mstai na de densidade i n te nmed o é r i a ( IDL ) , etc . A que st a o· reside em que lipeproteínas diferentes contribuem difsrsnfemente, mesmo fsoendo parte das: suied i visces grosseiras an ter iormen te referida:, para o início e proa naaSo da a te rose is rose . Consequ.en femen te , torne-se vantajoso un método qua idoncioficus -ipidamen te as. proteínas na correr: te a: a o o o j n a a., Η a o i t o e i m ente < donsidede seqv. indo — se e s. a p o i i s o o rcóai o s s s s o . r i e p c i · o. 11 r a o e n t ru g o o d . traocao do solvente oraé isoladas de qradisnt •1· :'Ό do iou'oqo requsoui.de ·.:· r o passo ou lõ : •is seu me d r:Q>J _ Π c?m. , enas P tr (12· d f d: í .o .Τ' ouruiuceo Ou .. .1

par· procasã O 3 ; J 1 .. T o u 1 o - og ic 03 Ou o seu 1. 30 larsntv a partir d -0 outras font es bioléçic -v :: en v ol v eo usu a 1 men te c ·,·; a fsrasntãc Θ. aquosa ou meios de er trac mt a a partir dos quais as prαtin ú. 1:: produz idas devem ser recu peradas . 0 nosso invento é tamb J. — U : 1 ! satisf ater i. amen ts aplic ado cl 0 0· ta siiuaç -v _ •nu b

RFoUriO DQ INVENTO O ncj5SG invsnto pr:par·:iona um aétcd·:· rápido o ·: ; . -·- ;· para separar 1 ipoproteinas das suas solucCes sauosas tais ccíhd o sangue. 0 sangue à primeiro misturado som uma emulsão aquosa de perfluorocarbono (RFC), isto é uma dispersáo de RFC, contendo um eru 1 s i f ecador ds f c-s f o 1 i pi d o As 1 i paz r :::s m as lxqam-ss ao revest. i men to do fosf ol ípicc sobre a suoerf í. o ie das partículas de ~'t u „ η emulsão s então separada do sangue s as a po 11 popro de m as na emulsão sá.o idsntiticadas ocr me.io de umcessos analíticos . _ ' . , . M r: . U _ w 11 _ 1 :* O à. ·.. O O S p r O 1 S 1. O S. S- d a — ;m V l 1 V' S; S “ PGC. Esta técnica de separscao PFC-emul slío oarmi te sue se real. lisura secaracáo total em menos de uma hora,,

DFSCFICAU DETALHADA PC IHLEruC -nbcra,, somo toi ar; tarioonan ta· m ;; i : a ;; o , ;; invento seja g?ra línertts anlicável a solupEes aquosas, ele será descrito eu γιογογόο ao sanuue ou s a .orna visto isso -sons ti tuir uma oa- ; crincipais anlicacSes, A eroress-áo plasma será acu,;, usada m- equivalentes, caso esse em que a diferença será indicada.,

A A emu 1 - .? u o e serf1u or uC S. r bono u.sã.d a η o inv ente é iqusr uma das con hso i ;:ias nesta té c η i o a . Ver, per ξ- rsmp lo, as entes dos E.Lí, A, Nos„ 4„105.79S e 3,911. 13S? qU0 sã O .1 ncαrpa— as como rafar ano o a as emu. 1 a -··. a ( J □ esc r i t a. = com maior detalhe como se seque. ϋ psrfluorocarbcno na =au1sâo é garslments perfluoroci-:locarbono, isto é, um composto cíclico de carbono o qual pode ou. nao conte Γ .IÃU eias 1 ater ais ao ic: liras ou alqu oode ser mor;O * d i ou po 1 icíclico, tal como o or aerLvaoos “ '7 Γ 7: a d r o d 7' 7 '-j. f ta leno · ~enuntv~eno , tem roais d & 4 sueis. d O praãrãncia 2-3 . F'ara. -jUs . j nao 7 Ο Γ.'ΐ O - ·.·. 7 r:· '1 ituto do 7 z‘. Γ'ί 71 71 7 o c i c: 1 U .. 7 ί é.tomos de c a rbono , fV, 3. S V 1 7- to náo u tiliza “is a, esta 11. m i t a:: 7- náo e de impor t 3'.:"·. 7 1 7 bono sion.i fica o ue D 7' 1 O ΓΠ 7' nos 502, de pn 7 0.7 :7. 1 7; Γ 7 Γ 7’ 7 o r d , : 7 1 7 psl o r, e π o s 9 9 2 d foram subs í ί CU i d O s COH: f 1 u Cf") *. o tem usual mente 9—12 a eirn! 1 são para essí 9u dor; átomos de hidrogéni. d e r i v a. dos p e r f 1 u o r o d o t r i m e t i 1 c i c 1 c h e;: a η o , i s o p r cρ ilciclo 1: e v; a η o , te tr ara ti 1 c ::.c 1 orar aro, 1 -me t1 - 4-i sopropi 1 c i c 1 char anc , n-buti Ici-ciofierano, decahidroacensf teno , decaiins, meti lo e d imo ti. I d scs 1 L -a \ : . t e t r a d e c ar i d r o t o o a r t r a r. o,, d "dana t i d rof 1 ur a ·ο· o , e d i i s c p r o -p 11 cicl o be >: ano. 1 a-bo-oo me;s· idos aso d omH estos perflucro Γ; do s rom s 11. o áve i s tendo doira átomos de ca:" bono L· .0·, ligados rr"ran de ura carta _ ... J....... .. -..,i . .vi: i ·.; pelo manos l! í toiTíD H '{> r ·.; i ‘ * j ο Π O d õ:· - ·· - .r ’·.....' - r-' a m é tomo de c a r b o no. A e a o r p c ' td' s i ρ n i f . a a u n a t:: s d .a a: .a r o a r· n .... p a a o a o r - a:· "roo num ccrrooo: ác ríc j. ico rn·· rrz r ou r i ao sue mc , a:, a ' ’ar n a- a t o 'rr.ao ρο1icíc)Lcos na

nCo pede ser' aromatizada sem destruição ias suas I iyvwíds ·_ί;::1ί-c as originais carbono—a—car tono. Estes compostos preferidos. d i sti.ngu.em—se da perfluoro decaiina e de ou ti· :.js rei ;c aonados an teriormen te que podem ser aroma 11zados , Enemplos destes, com.pos- tos proferidos sSo dsrivados jsrr luoro de pospostos

r ‘7 1 Z policíclicGã tais como bic ir: I ononanos 'por' ereoplC:, biciuio-[3 3 ·. 32nonano , 2,6-d ime ti 1 bic ic i o L 3,3 „ 1 3nonano ou. 3-meti 1bic i- c I o s 3.3 „ 1 ] nonano ) adaman taoo , meti Io e d ir a t a I ada.oan taro eisi-adarantano , tetrahiciroc ic loosn tad iene·, me tilo e d i. me tiisici- ~ 1 00c tó-.nes q pinar —· 1 3. r 1 f · i r, 1,4,0,9 - d 1 os t a r o, dez a 1 i n a , bic ir: 1 e f.4 - -3,2 jlíndecano * bic 1(::3:35.,3 = ãldeca-o, etc., ou zoas ff:ic cu :::

Pc:::sm ser produzizfos por meios oonhooidos, Compostos deste t i. po preferido sao descritos· na Patsn te dos E , Lh, A „ No. 4.105,798 .

Certos perf luorooe.rbor, os aziolacco "orno taroèm uii.]. i- z idos , ou. avaliados pa ra u t i I i z aç “So , em apl icações módicas, ma is nctá v e 1 o e r t o p e r f 1u o r c t r i b u t i I a m i π a ,, p e r " 1 a or o o o t a r q , 1 , 1,2 - tri- !':,! i"op'?i'T : ucrc··- í - decano , 1,1,1 2,2— pen ta h i d ro perf 1 u.orcoeoano , ato. 0 sol.! 1 = i ~f i c ador por níã us a do -3 f 03 f C 1 i s i. d o , de pi*efe— rCnoia orna lecitina, sue t um, -artigo comercial f arnaezu r icnrcin ts nc-ctável . Pqí açrcv-ídã por too para. u. til i zaceo com o u.m emulsifi— f osf ol ipido da qema do ovo /Evr ' , e ·, pc·'" ·*β ::3es de conven iene ia , ô emule 3c: do contem, qeralments õ —30 vO P^C, de te inferior a o, 2 mio ror· , de pre f eren-q i n C1 1 , mas Lste pera. utilizações n vivo da orna! zdí·::; e ndo d as amoor tancia oC. C r,= no .-o rornoin na med 1. d -a em p. c ?. ena 1 nCa nej n estava,, furãnta o período da su

A quantidade de fosfolipido à gera 1 nen te 1-1Θ p/vt,, de Ξ—5ρ/v"!., Como é bem conhecido, a quantidade depende de certo modo da quantidade ds RFC e da tamanha das partículas de RFC . É sabida que n uma emuisSo da Pt C o surfactante 5¾ ibui situando-· se uma porção na superfície d as partículas de situando-se a porejo restante,, o ” em asso 11 , na case aquo —· ,9. n ej ável remover e s te 1 eacesso" pele facto de ele c o m p et i :" C Π|ΤΊ ·.e siuua nas pareceu.as : e i - de RFC a o rei ação és apo11Uo que seja c çiinb i n e d a O L atraLd rada no eubeequen te proc es w li Pd 1 -

q,J ’ e::cas-·o " pede ; iSo iir uap our e. no --uu-e-juei t ue pr ao eseanen co envolvido no nosso invento. Qualquer porção dessa apo lipooro ksins "perdida" não euslui uma anális a a 1 11 a t j. a sa. t i e f at.. u=and o o nosso invento, mas spressnta desvantagens para uma ariál is© quao ti. tativa.. G cur íac rjrv m eocesso podo a ar removido cor centr.i- hsqacao para eliminar por ra tapas a fase aquosa. da cuias :s RFC,, e econstituiçi; até

PD

rsuens ti tuindo , ccm fase aquos que oon tom a porpupo de or · a c i c a s nas repetir·, do en ta.o este prccssso de cento 1 fuo o surfactante em "eicesso" ser removid., .H processão 4 descrito com maior detalhe na Recente da Afric

Gul 4 ê/85 ,, 24 j 0 Γ) 0 zeiiib ro, 1 ~ o D e pm f erãno ia a qua.ntiJade cie r act Si. n te n a, f a s e aq uosa n emu 1 são, isto e. crí quantidade que •Oe ser re; η o ·· i d a por ^ cent r 1 ‘d...:; aoã i. ·, r i Γ f O 1 - r •o 3ÕF do co-fa:- n cs to ta [ na emu A - 0 , ç o c:,f-e f ·. ·:· n c i ·.? Ϊ " '>· :Tj » - i —t , · -3 1 5li, com maior e t e rife o i. a infer i. c r a 101 zr ~ . :r: , j A emulsão i- poimeirc mrlstura.de ccm o manque do animal a oestedo , quer ei temam en te com uma accatr? da ianque o:o; ]. lc c.-:icc,

quer por infusão e subsequente colheita do animal do ura .nioiur 7 Ui :·:: US/SÍSU 1 SáC: .

Gara 1men te a quantid quan tidade de sane Lie entendo 22 vu FFC s ser trs.te.oo,, quando se usa uma ,5 p/vh EYF’ s as partículas da emulsSo têm um valor de ,2-,3 micron, Visto que a lipcorotoinu se liga ao EYF' que rsvss' .p ,.r; PFC na aaiÍ_íI -· v - iZ\ d e s t a. s v n riáveis a s s i.m ds-saj a d o remover toda 3 r á o i aí a men t. tr zz 0 ta 1 :?5 ao; partículas relação emu 1 sao: sangue variará denendendo des coro do FFC utilizado, etc, o geral menta desejado 1ipoproteina do sangue e determina-se ráoidamente r s : . i i c o a a n a. ± i s a, r \ u o s a. .. q e ? - — ,; t , A mistura sangue/'emu 1 sSo é errtáo tratada a rim de e FFC que agora contêm as iipoprc" iarar ae particu 1 a =· . 1! : a = „ Tal á feita muito ráoidamen tfs por cen tri fv gaçirn a 3.000-20 . OOO Gs durante 5-10 minutes. rio fim, una smui são gel si tu a-se no fundo om o sangue por cima., emuI ase d um gol uic res tanta parto da úru é ciar-ΞΥη-Ρ'Ό ,-i a, centri f Γ;-·* per cdr. n r τ a r and o rt t: >. _ _.. .>.. i q‘. :·. c: a: s e u t 7‘. ~ en trifu ina e o i" r e em :: amada ue ( por e;u asma , r.; r i t a c a r — s s —5 i- ama 1 ho psirque a. evitado inicialmen te b is pendo em ca.rudac a mistura, sangue/smuloSo numa eoluoSo eunoa. sue rose (por enemplo, 2~3u'·, Esta solução de sucrose restrin— ;.o sue qel da emu! a hemoglobina 3 e a m a d a. d e e a ngue no tubo d -a cer tr ;. tura., s r:,;; d a a n tg f η q a r g r· o tubo ccn te ré a camada. d e sa.r qu e - - · ura amada de suerese que es ene en tra por cima da am:, 1 e ae gs 1 - Durante est r ao Sc i r i o i a 1 a n t s i c Γ' men te d esc ·· i t a , ; a ; 1 i. p í d i. o: a d a e 1 i pop re ta; ir. ;· a fica i se par f í.:: i e .ίο tep O d ã

c a~ a d a da p I a a a -a , Pensa q lí s n t a a a n t a ;i :ii a -as apcl :. p a μr c a a i n a s qv a se encontram ligadas ao reves t imrsn te de EYF: nas partículas de RFC ,, A emul ssío gel é sepa rada _ .1 tr ir de ρ reter a i u_ i a lavada com 2-3 vezes o se u volume de soluç ao sa 1 i na f i s i o 1 ó g I ·- ã . I st o st estua a remoç a o d a ρ r oteina e da. ou tr a ma. teria. retid a r! c interior dos int erstiolos do gel,, A m i s tu ra gssl- soluça o de N ad é ag i. tada ·.; em ssq ui da cent i"ifuqada c orne a n t e r i.CM“m en te, ãpás O q -j 0 α gel lavado à u.··- ,-O Od !' -ui Li L, , v* ale a ρ ene no tar q ue as proi sinas rsoõvidss neste passo de lavagem n Cr — t/ _ lo:· srl L J 1 o :.·:·· potein as par a a a quais a separas3o f ei feita. 0 passo seguinte consiste çra separar as acc1isoprotei— nas da emulsão gel, iste s,, do f 1 uorosar jonoIsto é fác:i Imante realizado lavando ou aiaturando o gel coo um detergente comer- cialmente disponível tal coro s-ulfcrato de 3_. „s alquilo, por ev emp1 o, dodsc:1 sulfona to ds sódio (FOS Reduomq õu " fo:- : ., A ooluoso d a? t a i ~ q a"· a a deve -a ssr -o /•-'1 do pref srsnc i a. 1-5 pi v Da prsfsr iro ia isto 3 realizado a u ma ^ ss τ o a r a t u r a o L evada d Z 30 °C o as--s ase ler a r a dissolução da. preteina no deterá en te , Um

Ovdio dstergorts spropioai: para este fim P NP-4Õ, um oorvJensado de árido de oc ti 1fenol-etileno conercia 1mente disponível, e nesse sísd podendo ssr usada una teoosrstura rrerioq por eienslo, ldf°C, sendo apropriada orna c on esnt r ac 3o inferior de deterqsnie , por ej;er.plo .ôõp/· v,. Para poslquar um dos detergentes d usuelnen-sdéposds. orna rei soído de volumes cs , OOõ i — \ ,t g c: 7_, prsfarsroia

,001-1,0 coo maior- proferi ria ;1p 11 - 01 ; i.trcs da 1::· Li i. Li · C- ό'Λ ·.“ sslsrqsros pc· r grama de gel A o r o t e irid -anc ente-ss na ΕΙ'Ρ'ΞΓΤ* -1 1 .T/ da p.ai-t icu. 1 a de F:‘ F d soro o d esse m c d o rezessária LL7ia pa • “ · ~ d. O 'e 1 ? t: va monts csqu.en e de líquido de ter ς sη oe ,

•v. í ! S J. 1. -\U cr.

A solução BDS das apolipoproteinas é então por slsctroforase coo gel po 1 ia;: r i 1 ami Pa (ccnhscidc csralments por SDS-PAGE) ou por técnicas com anticorpos. Ambos estes processos são conhecidos para esta finai idade. EXEMPLO 1

Um ra to Spraqus-Dae1 sy m a::';..., ~ m n 2a0 q . , foi subsctid a infusão com 20 η; 1 . /kg de uma emulsão de RFC, esses rato con tin ham cerca de 20 ml de sa nque. A emu.ls ãc cantin ha perflucre ·' :·'- !. 1 a ri a m s n t.a η o “ nr O,·' ··.'·. , EVr 2 , A ρ / v 3 , á a u a para equ ilibrar e a sa r ti cu 1 as. t i n h '.z\ ~'i um tamanha medi.o de 0, 25 ± ,03 mia rens , emulsão foi aj Listada com NaCl até uma cressio osmótica de 300 mi. 1 iosmo .1 es „ Π ! v- n u m Gs m 1 .

Após. 3 horas-, removeu-se 0,5 ml. de sangue do rato foi colocado em camada sobre 1 ml. de solução i j s suarose 2M tubo de centrífuga. Seguiu-se então centrifugação a 12.000 durante 3.0 min. a 3°C, 0 gel na funde do tubo foi. separado pinça cara remover. Pesava L5 mg. Foi suspenso· de novo em 1 de solução de NaCL clinica 3,3 pp,. agitado e cen tri. fugada s. 12,,030 Gs durante 10 minutos a 5':‘C, após o que se separou da fase •aguo3a 15 mo., de gel. 0 gol separado foi misturado com 23 de SOS Rsducmp Buffer (Tampão Redutor) a 90'-'2 durante 5—IA minutos, 0 tampão foi predu crido combinando os ingredientes que se seguem nas quantidades indicadas· s ad ic ionand o-ss então 7,1:· mg, por ml, da DDT ( d L ti ot rei to 1 ) mg u. a d a st:.] a d a 5 „ 2 i . ο,η T!"is-·-HC1 , p-H 6,3 1 , O vol „ 1 03 (p/v) SD3 1,6 vol.

y, ΟοΡί (p/v) asui broiTíDhanol β,2 vol , A camada detergente an teriormente, propcrcionando foi centrifugada do mosma modo que um produto flutuante aquoso conten- Ί _/ ·Ι·ϋθ O -·. ίίμΟί IpCprofaina O U 1 O. “ -5; :Ti ϊ d ?. 0 O O 0 1 1 Γ: f 8 Γ ]. G Γ S O > It proteína, h separaçSc levou 4 o minutos* SDS—PA8E o métodos com anticorpos 1 dentiticaram as proteínas que se 0-00:..100, As quantidades do proteínas podem se·' quantificadas analisando o gel BDS-~F‘A3E coo um doo s i. t í 00 tra diencnível come-c 1 a 1 oon to qr

Andiocorotoina

Peso Mal,, d ΑΡΕ) A-II 17,4 c-lI U,n C-IIi 3 „ 3 E 34 , u

Ant icoroo P-otsinas Encontradas r A-II, B-IIA 9--d ,, C - I I : e E A “ d 'J. as proteínas B d m pesos d·!· I d·: u.Iaras acima do na; -iro Oid;':p i solvei der·-- , 0 3 3,(1 300) sara sr .... . r1 ‘nu1..: o is._‘Oi: i vai - cans

Η5 apoi ipGprotai.nís antenor^ente referidas í são as que se sabe encontrar em—se nos ratos testadc demonstra a e;-;actidão do teste. ' ccn Lre.d as ξ , o que 10 m.1 s de uma emulsão da mesma, composição e com partículas com o mesmo tamanha do EXEMF’L.0 1 foram centrifuaados a 12.000 ps durante 15 minutos a 10'·'C 2 produto -lutuante foi eliminado e a emulsão nel (3 ml») foi suseenoa de novo em scIluuío salina taoponada com fosfato 'pH 7,4>, duas vezes a fim de proporcionar um·· livre de surfactante na rasa aquosa.

Este processo ~oi repetida emulsão final cera Imentu

Em seguida, plasma de rato Spraçus—Daw 1 sv feri. centro furado a ln500 ps durante 15 .nirutes a ã : 1; a ~ ...r de rrenever qual··· c: u e r ρ r e c .1 o 11 s d o q u e p a s s a e s t a r e r e s e η t e . E n t a o , c c r c E e s de 0 ,, u "5. aia emulsão anteriormen es referida ãren oortiradae com o pi. asma a. fim de proporcione' taras de emu 1 são n o 1 asma de 1 , 2,, 4 e emação final do oel tal 0 1 - 0 p ?. a s c d a f o r r a : '·:: u t i ] i.::: a d o o o r q u. e o d s r; ovo , taqSo , rec en t r i f uo ar gq 1 cgocj foi. an ter i oiuTien te escrito n — -·, - v · de castad a de sucrose do 2r2hr-'L0 1 não foi saio oeste EXEuPLj 2 en vez aio sano; ti □ e i. s. a o: a r a d o sendo :. : e a u o a : essa d o do mesmo moei; u: mesmas 0 processo descri to a.n teriormsnte no EXEMPLO 1 foi repetida sssenaie. 1 ;T;ente do mesma rodo cor coelhos broncos da Nova Zelândia., ratinhos G3J e um ρ 1 asma bovino ciãnSrico. Us resultados tarar essens ia Isen ts os mesmos. uomo a roac 1i v ideoe cricada destas proteínas do sangue, e o sangue no EXEMPLO 1, são muito próximos do sangue humano, a ap 1 i.oab11 idade do processo ao sangue humano encontra—se muito prováve1mente assegurada.

Encon tráiiios também varies meios sara melhorar a eficácia da entraccao para valores- superiores- aos- obtidos seguindo- os processos descritos anteriormente. Na verdade, podemos frequente-mente utilizar uma ou mais destas técnicas para atingir níveis quantitativas de ertraordo de certas apo 1 i. pepre t-sinas . D primeiro consiste em adicionar um;a pequena quantidade ds surfachante ao sangue, o qual parece tece-- "soltar" as protei-rv;- dos outros cenoonentes do sangue tornando-as ma is sus cep tive is è ex traeq a-c . Fedem ser riti 1 i ea-dos surfaptsnt.es tanto i.ónicos c n-r-e néo tónicos tais oeme qm-sq cc 1 i o r i e t í 1 eno alqui 1 fer-ol) ou d esc x ico 1 a to de sódio- 3 Ao habitua Imente ne : e s sá rias apenas esmuenas cuer-tioades, , çS- 1 d ( n ' -·/ , ras p-ede—se utilicar ate 5/i ss desejado. f A segunda técnica consiste en adicionar ou éc ido bico í I. ; cu. iisofra-tj’ igita íll) d. em;..; 1 sé c SP o aprep ris-i só-meros quer a . '· ·· ouer beta. A adie Ao de I melhore a do pr i. no i pa 1 men te da apo 1 ipoprateina ώ--Ι. enquanto que o si efeito de sdicirrs:“ II consiste em melhorar a e:<trscçâc da e □ o 1 i ρ o p r o t. sins F - 1 õ A „

Quando usados ;i ç; incorporad os na emu. 1 são pel adiciona c fosfoiícido, Ass empurrada para baixe e recons em excesso da fase aquosa lipidos, s'ao também removidos tas mataria.! 3 saa de prsfsrinc j.a a a d i c a. o a τ a a s a. c u o s a q u a. r: d o s ξ· im, quando a emulsão termina is é t i tu i d a , a fim de remover o lípido 1 estes ma ter is is , eles próprios G a. f a S s 3 q U. O S a , u Quadro I mostra as vantagens destas técnicas nas pxpsriincias com soros testemunhas (Sigma Corp. ) contendo qus.nti-j j t x ; : ·: '“-i — j—. x- .10i apo i ipopiotemas , asso Π' i oro c o r e.pol j. οορ roí — C3 .1 Γ: 3 pura. Nas F'ro v 33 l-é , G ·Ξ o r o compra d O f O i d 11 u. H Cl \j\T: água até 25 Ti i “ rog r 3.1’ _ _i _ •rd. d:· _j cd οΟΓ G por ml de âg u.a * N as Pr •3 v 3. ~? .. 1 J. u ·!', p-! mq pura foi d i lu.ida a té 1 ,25 microqra :Ti 3. S per ml de é, qua e na Prova 12 até 1,3 3 m i.crograma s por ml de é OU a. A emu i Γ' FC é igu.a 1 à usada no Exemplo 2. A quantidade d e I , I I e coles c e r o· 1 a d íc ionados a emulsão é ondioada em ρ/v 1 e é tal coma indicada ruo Quadro, D colesterol e adicionado meramen te para determinar a sua eficácia mas cs resultados indicam que rio propu·.: i.oru· quuiqu.e"- vantagem. Qs tampuec usados ode cs indicados, estando o tempão ΐ os te to e um nível Cs d o mmoles/I s estando Ml Po !, ácido mo: ;· o i mo p ropanessu 11 ón icoí a um nível de 1 ã, ã oro los / 1 . safo 1 i. o ido t - 11 s -3 e ?-!fç mas nío A Prova 1 indica sus a ectrecuSo oor f descrita an ter i orm-en te permute a deteccac de A—1 píoporciona uma ertracclo suamt i ta t i v a „ As Prova fi i lo de efeito do colesterol..

As Provas 4, 3 çr .3 ~d ί~33 •3 3; Ara coso : to - - d 3 *J ·“.___T e o ·· h— 1 eu a partir do C C Γ o d c-j /1 d o 3 3 d ’* o ao de Γ n 3 3 Γ; 3 1 7 3 13 f + ) na ú;tima coluna ind i o a O a· d 3 3 gn i o.-sl 1. J n a z : ·:-. d q de :-:--1 em relação ao rE; • : μ -n -- d 3 r 3 O y' 1 ,, m s s o Cie men 3 c d 3 :3337 s s t a n d o ligado„ A Prova J___ V5 O d •3 3 •3 7 u. cio a ci 3 I. 33i a 1 d - '·'· Γ.Τ -.·· ;; 1. P / vlC de NP-40 adicionado dC so fÃJ 9.Γ: t pc d 3. e X t r a, c o v,—.

a;:tra~:: i n d i c a notado pelo o.

As Provas ~-iÍ indicam í :3a da B-iúA das soluçBss a: o mesmo beneficio quando se que as smu1sSes nas provas -ior, lo a adipgo da II os1 hora a nsas da B--1 ·ύ pur -a . i-( r ' O· v a * utiliza soro. Dev e t a n b é π \ s e r 10-12 nSo foram sstari1izadas 15 οο I— I < CQ Q < Ο Μ J <*» Η I < cfl cS 03 Ό CS O Ό 03 O Ό m 0 <1 11 <*> <#> <#» H H iH <L> QJ (D Ό *d Ό CO CO CQ O O O 0 C c C r~ 0> d) 0) + Λ S 2: o ir> o vo o •Xf

O O O o ο ι< α. Σ < Η O O O 0 4J -P -P 6 E -P 03 (TJ 03 D D Π3 <m Ch, <P x: x: Cm CO CQ CO c c CO 0 O O 0) <u O Cx- Ct. Cx-I 2: 2: íu cn CQ CQ CQ CQ cu CU CU CU CU O O 0 0 O 2 2 2 2 2 V0 2a w

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(N n m vo co σι

Claims (2)

1. RE IvIND ICAç3E3 lê, - Pr :: o f o ? ; g a o· a sapararão de 1cpoprotsina presente numa sua solução aquosa, cs.rs.c terisatio por compreender a o 1 atura da solução coo urna sma.Isáo de particular de perf 1 uorocar- boneta efi: água contendo fosfelipido, pelo que a por r Íh ·.?· - — Ce prcitei- na da i "efsrcda 1ipoprotsina aa liga ac fosfelipido na súper f i. Cie das partículas de oerf lo inror arbon.^tn . p* a seoaraclo do per f1uoro — sr; (tendo p; da refarii; =· a - = - ?a _ - Processa d e acordo com a reivindicação 1 „ carac ionizado por o rsferi-dc pari 1uorocarboneto separado s e r a i n d tratado com s urfactante ac ij.csD iónico ou nSo iónico a f i m d e s .aparar proteir í CÍ vJ a r 11 r 3é , rTn· esso de acordo com a r e i. v i n d > r-... — ...,3. ao 1 ou d, c c r ac ter j. cedo per a r-ere rata soiucdo ate. -d " .r. - -r. , ,çue 4o , - Proc a a a r de acordo com a rei.v ind ic a ç. d' o 1, 2 ou 3, r a - a·.z t srczad o por o f luc rccs.rbcnef eepa reco ser a i n d a tratado a fim de identif icar a a r oisenas cole ei stentesu õl ^ - da; arara::; c::;r a r a i / i r i d i r ação 1 ,, 2, 3 ou reter adicionalmente lioofosfoi 4,, carscteriz a d o por a sir-u 1 · pico ou ácido f osf ãt L di c ar coado oor a a mui recesso ce acor'do coei a reivindica i^a- - - ·· -· · - -r; - i 1 :" I C O·,." a ;-ei ; J O, Cã ΓΌΟΙ Í5Cf OSÍO.1 i p i d O„ 7ê„ -- ?roces3 ' i z a d ο ρ o r a e -m u 1 a a ;c tordo com a reivindicação O, ca.ra.c-sdc cicnalaan ts ácido íosfatídico . a dc: i criai me π L i s b 14 He L1 de 1909

   J. PEREIRA DA CRU
2. 2 Agsnts Oficiai da Prsjjr-sdsee lixiustrlal «UA VICTOfl CCftO®N. 10-A. 1.· 1200 USB9A