PT91478B - Processo para a producao de preparacoes farmaceuticas contendo extractos de figado de mamifero - Google Patents

Description

Campo du Invento

D presente invento é dirigido a. uma preparação farmacêutica para o tratamento de mamíferos sofrendo de uma infecção a vírus não dermatológica tal como uma infecção· a vírus causada pelo vírus HIV-1, pelo vírus Epstein-Barr ou sofrendo de um síndroma da. fadiga crónica que compreende como agente activo principal um extracto de fígado de mamífero, o qual é estável em relação ao calor, insolúvel em acetona e solúvel na água.

Fundamentos do Invento

Embora as últimas décadas tenham sido marcadas por rápidos progressos no tratamento de infecçSes bacterianas, não se tem verificado progressos comparáveis no tratamento das infecçSes a vírus. Ma verdade, actualmente, existem muito poucos agentes a γί t i vi r ais eficaz es .

Os que são conhecidos ou apresentam uma eficácia restricta ou limitada ou são tóxicos. F’or exemplo, é sabido que a amantidina evita a gripe, mas deve ser administrada antes da infecção para que seja eficaz. 0 aciclovir, embora frequentemente eficaz no tratamento das infecçSes pelo víru.s do herpes, é selectivo em relação às estirpes resistentes do vírus. Também, o scylovir não é eficaz em relação a muitas espécies de vírus, incluindo os retrovirus e mesmo certos vírus do herpes, tal como antivirais, tais us, baseando se a processos virais o vírus de inclusão citomegálica. Outros agentes como 3 -azido-3 -desoxitimidina (A2T>, são tóxic sua actividade sobre uma selectividade para os relativa, mas não absoluta.

Terapêuticas anti—virais actuando indirectamente, incluindo o interferon e os indutores do interferon, aumentam a c e 1 u 1 a r à ifecção a. vírus, permitindo que as células interfiram com o processo infeccioso. Contudo, o interferon não satisfez a promessa das expectativas iniciais e teóricas. Os indutores do interferon sao relativamente novos neste campo e a. sua eficácia permanece não comprovada» síndroma de imu.no deficiência, adquirida. (SIDA) e o complexo relacionada com a SIDA (ARO são causados por víru.s de imuno--def iciência humana (HIV-1 ) , um retrovírus. 0 vírus HIV-1 infecta células do sistema imunitário, do sistema nervoso e outras células do hospedeiro. Eventualmente a maior parte das pessoas infectadas com o HIV-1 tornam-se anormalmente susceptiveis em relação a uma série de doenças oportunistas graves como resultado da deficiência imunitária causada pelo vírus.

As drogas anti-HIV-1 correntes ou não são eficazes ou causam efeitos secundários indesejáveis. Estas drogas incluem AZT, 2 ,3 -didesoxi citidina (ddCyd), interferon (IFM), ARM duplamente espiralado mal particular, AZT, que se tratamento da SIDA, causa como supressão da. medula combinado (dsARN) e revelou de certo efeitos secundários óssea, num grande nú modo promissor no muito graves-, tais mero de doentes. Foi

AZT se esbatiam em feccões ou desenvoltambém referido qu.e os efeitos benéficos do 12-18 meses, apresentando os doentes novas in vendo efeitos secundários tóxicos;„ Chase, LOctors and Ratients

Η o p e	AZT	Wil 1	Help btave Off AIDS,	Wall Street	Journal, April
—\~\ < ,—λ y i-* ui Ο , 1 7 O O	, at	14, c o 1. 1.
		Uma	doença, menciona,da como	síndroma de	fadiga	c r ón i c a

(CFS) tem sido associada a um a infecção pelo vírus Epstein-Barr facto evidenciada por títulos siqnificativamente elevados de anticorpos em relação ao antiqénio capsid (revestimento proteico exterior de uma partícula virai) do vírus Epstein-Barr ou

antigénio primitivo e por unta deficiência de an do posteriormente em muitos doentes sofrendo nalguns doentes, os padrões de anticorpos em Epstein-Barr não são definitivamente anormais.

de CFS. raIação e alquns ρ a r e c e n — Con tudo, doen tes sâo set uneyatiVOs. ConseqUei i teíTifi i te , pudem iTibém estar envolvidos outros agentes na etiologia do CFS. Estas outras causas possíveis do CFS incluem o vírus de inclusão citomegálica, outros vírus, exposição química, defeitos do sistema imunitário, ou. alergias graves. Center for Disease Control, Dept. Health and Human Services, Chronic Fatigue Bvndrome, March 22, 19S8 (aqui a seguir Centers for Disease Control).

Doentes sofrendo de CFS apresentam-se crónicamente, por vezes gravemente, fatigados. Apresentam também evidencia de disfunções neurológicas e imunológicas.

Até hoje, não se conhece qualquer tratamento para o CFS. Centers for Disease Control. Encontram-se em vários estudos terapêuticos usando gama globulina e ac Contudo, um estudo conduzido pelo National Institutes of indica que o acylovir não é mais eficaz que um placebo no m en to d esta doen ç a. Centers for Disease Control.

eficaz ma.rc ha

Hea 1 th trata0 extracto de fígado de mamífero tem sido usado no tratamento de um grande número de afecções dermatológicas não infecciosas e infecciosas, incluindo o acne vulqaris, Journa1 Invest Dermatoloqy, 2:205-216 (1939); queimaduras do primeiro e segunda graus, Mississipi Qalley Medicai Journal, 7ó:199 (1954); queimaduras pelo sol, Clinicai Medicine, 3:245 (1956); dermatite por veneno da hera, C1in Med., 3:425 (1956) e Herpes zoster, Southern Medicai Journal, 50:1524 (1957). Π princípio activo ε o mecanismo não foram descritas. Embora alguns médicos tenham usado extracto de fígado para o tratamento de situações dermatológicas,

ele não é considerado como uai agente antiviral ou iaiuno iTicsdulador mesmo para terapêutica, dermatoiógica.

Tem sido referido que o extracto de fígado de mamíferos possui actividade potenciadora de bradykinin. Tewksbury et ai., fírch. Biocheai. Biophys. (U.S.), 112, 453 ( 1965 ) ; Tewksbury,

Archives Int 1. de Pharmaccdvnamie et de Therapie, 175, 426 (1968); Tewksbury, Dissertation ftbstracts International-Part II, Vo.l. 25/04, p. 2214, (1964). ftlém disso, um extracto de fígado comercializada (vendida sob a marca registada KUTAPRESSIN por Kremers-Urban Co., Milwaukee, Wisconsin) exerce a sua acção, de acordo com a bibliografia sobre o produto, apenas em relação a tecidos que tenham sido lesados e quando estão presentes a inflamação e edema.

Descrição Resumida dos Desenhos

Figura 1

Ilustra os resultados- do teste in vitro da capacidade de um extracto de fígado porcino para reduzir a citolise das células 1 inf oblastoides- MT-2 após infecção com o vírus HIV-1.

Figura 2

Ilustra os resultados do teste in vitro da capacidade do AZT, ampligen, castanospermine e duas preparações de extracto de fígado porcino para reduzir a citolise das células linfoblastoides MT-2 após infecção com o vírus HIV-1.

da I í um e;;trac td dê t íqsdo de insolúvel ne. eceicnê, to que ao calor, tratamento de mamíferoe infectados

Fai actua1mente descoí ro a σι í f e r o e s t á v e 1 e m r e 1 a ç ã o a solúvel na. água é eficaz no com vírus n3o dermatológicos, to de fígado de mamífero <é eficaz no tratamento do síndroma de fadiga crónica (CFS). Por estável em relação ao calor significa-se que o extracto de fígado não perde uma actividade apreciável a temperaturas cie cerca de l'.X>'^:'C em água durante 10 minutos.

Peso rição_Detalhada das Apresentações Presentemente Preferidas

A porção do extracto de fígado de mamíferos que se descobriu ser eficaz no tratamento das infecçSes por vírus é a fracção que é estável em relação ao calor, insolúvel na acetona e solúvel na água. D estracto de fígado preparado de acordo com a apresentação aqui feita encontra—se livre de proteinas de elevado peso molecular, de ácidos gordos, polissacáridos, e vitaminas, e específicamente encontra—se livre da vitamina B-12, uma vitamina que ocorre naturalmente no fígado. 0 mesmo extracto de fíqado tem sido usado até agora no tratamento de afecçSes dermatológicas.

{-'reparação do Extracto de Fíqado extracto de fígado utilizado no presente invento é preparado separando a fracção dos fígados dos mamíferos, de preferência fígado porcino. O material de partida pode ser uma preparação de fíqado tal como foi descrita em Pharmacopeia of the United States, Vol. 15, p. 379 (a qual descreve um extracto de fígado fervido apropriado para utilização parentéricai, em

N a t i ο π a 1 (- ο r m u 1 a r ν

Vol. XII, ρ. termostáve1 ( o q u. a 1 d e s c r e v e u. m a s o 1 u. ç 3 o ígado de mamífero) ou em 94 (o qual descreve várias Alternativamente, o material fígado congelada ou uma aquosa da fracção termostável do f Natior;aI FormuIary, Vol XI, p. 192preparsçõss de fígado termostáveis). de partida pode ser fígado fresco, preparação de fígado comer c i ai i zada.

A fracção insolúvel na acetona, é separada do material de partida. Isto pode ser realizado misturando um grande excesso de acetona com o material de partida o que resulta numa fracção insolúvel na acetona a qual se separa da acetona. D tratamento com acetona pode ser repetido. A tracção insolúvel na acetona, depois de ser separada da acetona, é dissolvida, na água. Qualquer acetona que permaneça é removida por, por exemplo, destilação. 0 material eficaz no tratamento das infecções a vírus e CFS está contida na solução aquosa.

Alternativamente, e de preferencia, antes da extracção de acetona, o material de partida, é suspenso em água e incubado à temperatura ambiente. Após incubação, a suspensão é clarificada por filtração, e a solução έ feita passar sobre uma resina, periautadora de catiSes três vezes.. A solução tratada com resina, resultante é então concentrada por evaporação, diluída com água, e centrifugada„ A fracção insolúvel na água é então separada do produto flutuante adicionando um grande excesso de acetona sendo posteriormente processada tal como foi descrito anteriormente.

A fracção insolúvel na acetona, pode ainda, ser purificada até se remover os pigmentos corados por tratamento com carvão activado. For exemplo, a fracção insolúvel na acetona, pode ser dissolvida em água e feita contactar com carvão activado com amónia..

Adiciona—se usualmente uni preservativo f a rmac ê'u ti cara ente aceitável à solução de água. Por exemplo, pode-se adicionar fenol a de cerca ds 0,05 a cerca de IX, de preferência cerca de extracto de fígado útil no presente invento pode ser preparado de acordo com os exemplos que se seguem.

Exemplo I - Preparação do Extracto de Fígado

A Fracção I do Fígado, descrito em National Formulary XI, página 193, foi suspensa em água até uma concentração de 167. em peso. Adicionou—se fenol até uma concentração final de 17.. A suspensão foi misturada e incubada durante 7 dias à temperatura ambiente. Foi então clarificada por filtração, evaporada até à secura por aquecimento, e diluída até B7. de sólidos em peso em água.

t? Z tã to de por por

Esta solução aquosa foi então feita passar três através de uma resina permutadora de catiSes (sulfonato po .1 isti reno ) . A solução tratada com resina foi clarificada filtração e concentrada até 407 de sólidos totais em peso evaporação sob vácuo a 65 - 7O‘-C. Adicionou-se água fria (5-10*0 (5 volumes de água a 7 volumes de solução de fígado) com mistura. A solução resultante foi então centrifugada e o produto flutuante foi recolhida (centrífuga do tipo Sharples a 1 litro por minuto), Adicionou-se fenol até uma concentração final de 0,5 - 17..

Esta solução foi ajustada até pH 6,0 - 7,0, com HC1 ou NaOH na medida do necessário, clarificada por filtração, e aquecida até 40*0. Adicionou-se então acetona (20 - 30 litros de acetona por litro de solução de fíqado). 0 material precipitável

pela acetona foi deixado repousar e a maior parte da acetona foi separada por decantação. A restante suspensão foi incubada durante a noite è temperatura ambiente, sendo em seguida. a. suspensão diluida até 10 litros com água, e sendo a acetona removida por destilação. Foram então adicionados fenol e água, para dar origem a uma preparação final contendo 0,5% de fenol e com mais de 25 mg de sólidos totais por ml (aqui designada por KU 10., 000).

KU 10.000 foi ajustada até pH 6,0 — 7,0 com HC1 ou NaOH, tal como seja necessário e diluida até 25 mg de sólidos totais por ml com águ.a (isto é, 2,5% em peso de sólidos). A solução foi então tornada estéril por filtração para apropriados para utilização

EI s t a s í rec i pientes olução final é aqui mencionada como ’!<U 10.001

Ej:emp 1 o__I_I___- Preparação de Extracto de Fígado

Um p r e p a r a d o d o um produto de F' h a r m a c o p e j a ad i ci on ou—se extracto de fígado apropriado pode também modo que se seque. Começando com uma preparação )·=> í*” de fígado bruto para injecção tal como é descrito em of the United States. 15ê edição, página 379, um grande excesso de acetona (27 litros de acetona para cada litro de fígado) a fim de precipitar uma fracção insolúvel. A fracção insolúvel na acetona foi separada da acetona, e o passo anterior foi repetido na fracção insolúvel. Isto foi feito num total de trás vezes. A fracção insolúvel foi então recolhida e dissolvida numa quantidade mínima de áqua. A acetona foi retirada da áqua por destilação.

Adicionou-se fenol à solução de água numa quantidade de 0,5% em volume como um preservativo. A solução foi então armazenada em condições refrigeradas durante pelo me e durante esse período de tempo formarem—se algu insolúveis as quais foram separados e removidos por centrifugação e eliminados. A solução foi diluída modo à solução final conter 25 miligramas de de fígado por mililitro de água (isto é, 2 dos). □ pH foi ajustado para cerca de 7, clorídrico ou hidróxido de sódio guando nec foi então introduzida com esterilização recipientes para injecção com 20 cc os quais sólidos de e ,57 em peso de essário. 0 KU nos 30 dias, ns materiais filtração ou com água de trtsL tu

SÓ lião 1 d O

10.001 por filtração para foram então tapados.

A Composição Química do Extracto de Fígado

A composição química completa do extracto de fígado útil no presente inventa ainda não é conhecida. Além disso, a identidade do componente, ou componentes, responsável (veis) pelo tratamento eficaz das infecçSes a vírus e CFS, não é presentemente conhecida. Sabe-se, contudo, que o extracto de fígado KU 10.001 produzido de acordo com o Exemplo I contem cerca de 33 por cento em peso de amino ácidos livres e pelo menos cinco polipep— tidos diferentes.

έ indicada a seguir, no Quadro 1, uma lista dos amino ácidos livres, e das quantidades presentes, em KU 10.001.

QUADRO 1

Amino Ácidos Livres	s Presentes no Extracto de Fíqado
Amιπ o Acid o	pq / m 1
T ri ρtofano	30,3
L. i. s i n a	91,0
Histidina	13,6
Acido aspá.rtico	69,3
T reonina	240
Serina	15S
A s p a r a g i n a	92,5
Ácido glutâmico	347
Fr o1ina	597
G11 c ι n a	133
Alanina	1283
Va1ina	931

Metionina 563

τ so 1 ,=._ic ina	945
Leucina	1979
Tirosina	243
Fen i 1 a. 1 an ina	521 8057

Além dos	amino ácidos, KU 10,001 contem pelo menos
cinco polipeptidos,	um dos qu.a.is foi identificado como sendo
fisiolágicamente ac	:tivo. A separação deste polipetido fisiológi-

camente activo é indicada no Exemplo III

Exemplo III - Separação do Polipeptido Fisicamente Activo

Começando com a preparação de fígado crú tal como foi descrito em Pharmacopeia of the United States, 15õ Ed., p. 379, adicionou-se um grande excesso de acetona para precipitar uma fracção insolúvel a qual foi recolhida e dissolvida numa. quantidade mínima de água.

Dec ml desta solução foram descolorados com 3,0 q de carvão activado com amónia» A solução transparente foi feita passar através de uma coluna com 90 3,5 cm embalada, com uma preparação de poliacrilamida tal como foi descrita por Hjerten and Mosbach, Analvtica 1 Biochemistry, 3, 109-118 (19ó2) e Hjerten, Archives of Biochemistry and Biophysics, Suppl. 1, 147—151 (1962), apropriada, para utilização como um crivo molecular que exclui (não atraca.) moléculas com um peso molecularsuperior a 20.000. A coluna foi eluida com amónia. Foram recolhidas dec fracções, que foram 1iofi1 içadas, sendo determinados os pesos das fra.cçSes secas.

Foram obtidos três picos, aqui a seguir chamados A, B e C, e as fra.cçSes sob cada pico foram combinadas e 1 iof i 1 içadas. Quando testados quanto à potenciação da acçã.o da bradykinin sobre ileo de cobaia isolado, o pico central ίB) apresentava a maior parte da actividade potenciadora da bradykinin.

As fracções combinadas do pico B foram dissolvidas em água e posteriormente purificadas por meio de cromatografia de permuta iónica em colunas de dieti1aminoeti 1 o. Dec mg do produto parcialmente purificado foram aplicados a colunas com 35 x 0,9 cm embaladas com celulose dietilaminoetí1ica (capacidade de 0,9 mi 1.1 i-equ.iv . A coluna foi eluida usando um gradiente que aumentou o pH de um modo linear de pH7 para 9. □ cloreto de sódio

- 13 foi adicionado para aumentar a concentração do cloreto de sódio cie um modo linear até cloreto de sódio 1 molar. Foram isolados três picos (B-l, B-2, B-3> á medida que o pH foi aumentado de 7 ¹ „ Um quarto pico (B-4) foi eluido com gradiente salino até pH 10. As fracções sob cada pico foram recolhidas, 1iofi1 içadas, e testadas quanto à actividade realçadora da bradykinih sobre tiras de íleo de cobaia. Verificou-se que o material no terceiro pico (B-3) pc ;uia uma elevada actividae

;.-itenr iciadora da bradykinin, tal como fo.i demonstrada pelo aumento das contracções induzidas pela brariykinin nas tiras íleo da cobaia. Também

A2u0 do material sob o pico B-3 indicou que se tratava de um ρο1ipeptido.

Testes Físicos e Químicos com FOlipet

F isiolóqicamente

Tamanho Molecular

Uma estimativa do tamanho molecular da tracção B-3 potenciadora da bradykinin foi obtida a partir do seu comportamento em experiências cromatográficas com crivo molecular. 0 material activo não foi retardado numa preparação dc amida (ver Hjerten and Mosbach supra, e Hjerten, exclui, e desse modo não retarda, as moléculas com um peso ρο1iacri 1 upra) que molecular acima de 1.600, sugerindo que o peso molecular era superior a 1.600. O material activo foi retardado numa preparação de poliacri1amida (ver Hjerten e Mosbach, supra„ e Hjerten, supra) que exclui moléculas com um peso molecular superior a 4.000, sugerindo que o peso molecular era inferior a 4.000. Assim, os resultados das experiências com crivo molecular indicam que o peso molecular é inferior a cerca ds 4.000

Assim, o polipeptido fisiologicamente activo pode ser caracterizado pelas suas propriedades físicas e químicas. 0 polipeptido activo é insolúvel em acetona, e solúvel em água. Tem um peso molecular tal como foi determinado pelas experiências de cromatografia com crivo molecular inferior a cerca de 4.000.

Administração de Extracto de Fígado extracto de fígado insolúvel na acetona útil no presente invento é de preferencia administrado por injecção, por exemplo, injecção intramuscular. Contudo, são contempladas outras formas de administração.

extracto de fígado pode ser utilizado sob a forma de sais farmacêuticamente aceitáveis dos componentes, tais como sais de metal alcalino. As amidas framacêuticamente aceitáveis, ésteres de alquilo inferior, derivados protegidos, outros derivados e análogos dos componentes do extracto de fígado são também contemplados.

Embora, tal como foi indicado, o extracto de fígado possa ser usado como uma solução de água, ele pode também ser utilizado em associação com outros veículos farmacêuticos, por exemplo, em solução salina. Em qualquer caso, como o extracto de fígado é de preferência administrado por injecção, considera-se que o extracto esteja contido num veículo à base de águ.a. Um produto preferido é uma solução de água contendo cerca de 2,57. em peso de sólidos do extracto de fígado.

As dosagens podem variar dependendo da condição do doente. Contudo, geralmente, verificou.-se que a administração de 2 mi de KU 10.0Õ1 preparado tal como foi descrito no Exemplo I i n t r a ωu sc u lar men te dia sim d i a irá produzir resu.

pene·' iS num período de tempo tão curto como cerca de 2 semanas,

R ε s u. 11 a d o s d o 7 e s t e

Exemplo IV - Teste In Vitro

KU 10.001 preparado de acorde com o Exemplo I foi testado usando sistema de ensaio de infecção por microtitu1 ação deec ri to em Journa1 1968. Resumidamente, crescimento (REMI 1640 al Microbiology, á-o, t-eD.

1.00 mic rol itros de KU 10.001 em meio de :on tendo

l. /

231· de soro de vitelo fetal e μα de qentamicina por ml)com várias concentrações foram adicionados aos recipientes de uma placa de microtitulação. Foram adicionadas células MT—2 em 100 microlitros de meio de crescimento para dar oriqem a 3-4 x 10 células por incubadas durante 4 horas a 3ó'^:‘C em humidade. Foram então adicionados placas foram incubadas 3 - 5 dias recipiente. As placas foram de CO^ em ar e 1007 de cada recipiente 50 microli4 partículas infecciosas. a 36°C em 57 de CCi em ar e

1007 de humidadi

A linha celular 1 in f ob 1 as to ide? MT1in fob1astoide-T pico da célula-T humana.

transformada pelo vi rus

I é uma linha

I linfotróPara avaliar a viabilidade da cultura e a eficácia do tratamento, 100 microlitros de cada cultura de teste foram transferidos para recipientes revestidos com poli-L-1isina numa nova placa de microtitulação, e 100 microlitros de 0,0147 de vermelho neutro de Finter em meio de crescimento foram adicionados a cada recipiente. As placas foram incubadas durante 1 hora a 36*C, sendo nessa altura o meio removido, e as células aderidas foram lavadas duas vezes com 150 microlitros de solução salina tamponada com fosfato. 0 corante foi extraído das células

aderidas adicionando 100 microlitros de álcool acidificado (507. de etanol em ácido acético a 17) , e a absorvêrtcia da solução de corante extraída a 540 nm foi medida.

Os resultados deste ensaio são indicados na Fiqura 1 que mostra que KU 10.001 produziu até 427. de protecção celular em relação aos efeitos cito tóxicos de HIV-1 no quarto dia após a. adição de HIV-1 ás culturas de MT-2. Isto constitui um efeito anti-HIV significativo do extracto de fígado KU 10.001 e ê comparável ao produzido por outras drogas anti-HIV tais como AZT, ddCyd, rTFM-alfa, rIFN-beta, de-RNA, e anfotericina B.

Exemplo V - Teste In Vitro

Resultados preliminares indicaram que o fencl nas concentrações presentes nos testes in vitro de KU 10.001 descritos; no Exemplo IV apresentava efeitos citotóxicos sobre as células MT-2 e que o fenol não tinha uma actividade antiviral significativa. Para avaliar se esta actividade citotóxica estava obscurecendo a actividade antiviral de KU 10.001, foram preparados e testados os materiais que se sequem no ensaio de infecção por microtitu 1 ação descrito no Exempla IV:

1. KU 10.001 (preparado tal como foi descrito no Exemplo I).

2. KU 10.004-2 que foi preparado diluindo KU.004-1 1:3 com água. KU 10.004—1 foi preparado extraindo KU 10.000 duas vezes com volumes iguais de éter etílica para remover o fenol. A fase aquosa final é KU 10.004-1 que tem uma concentração de 80 mg de sói idos/ird de solução. Assim, KU 10.004-2 tem uma concentração de 26.,7 mg de sólidos por ml.

3. KU 10.006 que foi preparado precipitando KU 10.000 com 3,8 volumes de acetona para remover o fenol, recuperando e secando o precipitado, e dissolvendo o precipitado em água a 5b mg sólidos— / íti 1 d e s o 1 u ç 3. o .

Os resultados do ensaio de microtítulação são indicados no Quadro 2.

QUADRO 2

LU. luição	7. Sobrevivência Células
		KU 10.001	KU 10,004-2 KU	10.006
1 :	40	14,0	55,6	48,7
1 :	60	32,7	73, e	82,0
1 :	160	30,6	77,4	105,7
1. :	Λ 2' t·	14,2	30,1	111,8
1 ϊ	640	0,3	7,4	100,8
1 :	1280	- 7,6	1,6	87,1
1 -	2560	-12,4	-2,0	“7 X. / >| -t..
1 :	5120	-10,7	fl ·- 4 J_.	0,0

Estes resultados indicam que a remoção do fenol aumentou substancialmente a capacidade do ensaio in vitro com MT—2 para detectar a actividade antiviral do extracto de fígado.

Exemplo VI - Teste In Vitro

Foi feita uma comparação das actividades de KU 10.004— 1 ,, KU 10.004—2, AZR, ampligenio e castanospermine no ensaio de infecção por micrititulação descrito no Exemplo IV.

ampliqénio é um ARN duplamente espiralade mal emparelhado que desencadeia a indução do interferon humano e que possui actividade anti-HIV-1. Montefiori and Mitchell, Ρ ι- o c M a t 1 A c a d .

Sei. LÍ.S.h. 84(9), 2985-89 (May 1987)

Castanospermine it extraído das sementes de uma árvore leguminosa, C a s t a η o s pe r m u. m a us t. r a 1 e. Castanospermine tem também actividade anti-HIV-1.

Os; vários materiais anteriormente indicados foram diluídos seriadamente e foram testados no ensaio de infecção por microtitulação descrito no Exemplo IV. A solução (não diluida) de partida, de cada material tinha a. concentração que se seque:

C o n c e n t r .3 ç ã o d 3 So 1 s.j.çSo de P a r t i d a ί μ q / m 1 )

Material ---------------AZT

Amp1igen

Cas tan o s pe rmi n e

O , cô >3 200

1 B

Ku 10.0O4—1 3825

KU 10.004-2 1275 □s resultados do ensaio destes materiais no ensaio de infecção por microtitulação são indicados na Figura 2. Coma é aparente a partir da Figura 2, KU 10.004-1 e KU 10.004-2 proporcionaram uma significativa actividade de protecção celular comparável á do AZT e ampligen e uma melhor protecção celular gue castanospermine.

t.;;emplo VII — Teste In Vivo

Um Cjt-upo de doentes sofrendo de CFS foram tratados com KU 10.001 preparado tal como foi descrito no Exemplo I. Os doentes usados no estudo foram diagnosticados como tendo CFS pelo facto de satisfazerem os critérios descritos em Ann. Int. Medicine, 103:387 (1988).

Antes do início do tratamento, foram realizados numerosos testes incluindo um teste em relação aos anticorpos relativos ao antiqénio precoce (EA) do vírus Epstein-Barr. A presença de anticorpos em relação ao EA indica a presença de uma infecção activa pelo Epstein—Barr. 0 número de doentes no grupo de estudo com teste positivo (isto é, tinham um título de 1:80 ou. maior) para os anticorpos em relação a. EA é indicado no Quadro de KL t r ã d ·:

Os	doen tes	foram injec tsdos
0 01	uia sim	d i a n S o „ D n ú m e r o
cada	doen te	foi variável.

i n t r a m u s c u. 1 a. r men t e total de injecçSes admirsiscom

Π! 1

Pediu-se aos doentes para classificarem as suas melhorias de acordo com 1) nenhuma melhoria; B) ligeira melhoria; 3) moderada melhoria; 4) notável melhoria; ou. 5) acentuada melhoria, □s resultados da.stas avaliações são indicados no Quadro 3. 0 Qudro 3 também indica o número total médio de injecçSes administradas a cada grupo de doentes.

i .···. r\ ,· γί flva1iação

Número de
	Doen tes	Número Total
Número d(2	F'osi ti vos	Médio de
Doen tes	Para EA	I n_i ecçSes

Nen hurna me 1hor ia

L i g eira me1ho r i a

Μo d e rad a melho ri a

Notável melhoria

A ce n tu ad a me1hori a

Tal como é indicado no Quadro 3, o tratamento de doentes diagnosticados com tendo CFS com KU 10.Q01 resultou em pelo menos uma ligeira melhoria da. situação de 947 dos doentes. Um número muito substancial de doentes revelou notável ou a c: e n t u. a d a m e 1 h o r i a .

0bsgr vações Ger a is

A apresentação anterior indica o que os inventores pensam constituir um método único e até agora desconhecido para o lamento de mamíferos inc 1uindo com vírus ou sofrendo de CFE: usando acção do extracto de fígado pode ser o de virucida ou viru.stãtica ou pode se da resposta imunitária.

um extracto resultado de o resultado , infectados de fígado. A uma activida— de modulação

Nesta altura não se tes, no extracto de fígado é, actividade. έ possível que os sabe qual componente, ou componenou são, resposável (veis) pela sua resultados possam ser causados por uma LurabinâLdu de uoiípunentes.

extracto de fígado KU 10.001 do Exemplo I tem uma longa história demonstrando não existência de toxicidade, e uma longa experiência clínica no tratamento de afecçSes dermatológicas. Isto constitui uma nítida vantagem em relação às outras drogas anti—vírus, muitas das quais apresentam toxicidade muito g rave.

Embora o invento tenha sido descrito principalmente em relação com apresentações especiais e preferidas, dever-se-á ter em consideração que é capaz de modificação sem se afastar do âmbito do invento. As reivindicações que se seguem pretendem cobrir todas as variações, utilizações, ou adaptações do invento, seguindo, em geral, os seus princípios e incluindo certos desvios desta apresentação que se incluem na prática conhecida ou habitual da campa ao qual o invento pertence, ou que são óbvios os especialistas nesta técnica.

Claims (6)

1. lê. - Processo para a produção de uma preparação farmacêutica, caracterizado por se extrair uma preparação cie fígado de mamífero, em primeiro lugar com acetona, se separar da acetona a fracção insolúvel em acetona, se extrair um a outra vez, com acetona, o material separado insolúvel em acetona, se extrair com água o material separado resultante, se separar o extracto resultante do material insolúvel e se purificar apropriadamente a solução aquosa resultante.
2. 2ã. - Processo para a produção de uma preparação farmacêutica, caracterizado por, inversamente ao processo da reivindicação 1, se efectuar a extracção com água em primeiro luqar e se efectuar em seguida a extracção com acetona.
3. 3ã. - Processo de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por se efectuarem os passos de extracção à temperatura ambiente ou a uma temperatura ligeiramente mais elevada.

   Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçóe caracterizado por o princípio activo no exiracto de aquoso ser finalmente estabilizada pela adição de? até 27.

   fenol.
4. 5â. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado por se produzir uma preparação farmacêutica para o tratamento de mamíferos sofrendo de uma infecção a. vírus não derroato1ógica tal como uma infecção a vírus causada por um retrovírus, por vírus HIV-1, por vírus Epstein—Barr ou sofrendo de um síndroma de fadiga crónica, que compreende como agente activa principal um extracto de fígado de mamífero, que é estável em relação ao calor, insolúvel em acetona e solúvel na água.

   óâ. - Processa de acordo com a reivindicação 5, ca terisado por o extracto de fígado ser um extracto de fígado po rco.
5. 7í2. — Processo de acordo com a reivindicação 5 ou A, caracterizado o extracto de fígado estar contido num veículo farmacêuticamente aceitável numa concentração de serca de 2,57 em peso de só 1 idos.

   de

   B2·„ — Processo de acordo com qualquer uma cações 5 a 7, caracterizado por o extracto de contido em água.

   das reivindifíqado estar cações
6. 9â„ - Processo de acordo com qualquer uma das reivindia 8, caracterizado por cj extracto de fígado compreender até 27 de fenol como agente de estabilização,