PT88198B - Processo para a preparacao de proteinas quimicamente modificadas - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
DESCRIÇÃO
DA
PATENTE DE INVENÇÃO
N.° 88 198
REQUERENTE: LABORATORIO NACIONAL DE ENGENHARIA E TECNOLOGIA INDUSTRIAL PELO DEPARTAMENTO DE TECNO LOGIA DE INDUSTRIAS QUÍMICAS,portuguesa,Organismo Oficial,com sede em Queluz de Baixo, Estrada das Palmeiras.
EPÍGRAFE: ’’ PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PROTEÍNAS QUI
MICAMENTE MODIFICADAS
INVENTORES: Maria Bárbara dos Anjos Figueira Martins e Maria Eugenia Meirinhos da Cruz.
Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.
(NP1 MOG 1« R F 10732
P.I.NS. 88.198
MEMÕRIA DESCRITIVA DO INVENTO para “PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PROTEÍNAS QUÍMICA MENTE MODIFICADAS que apresenta
LABORATORIO NACIONAL LE ENGENHARIA E TECNOLOGIA INDUSTRIALPELO DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE INDUSTRIAS QUÍMICAS, por tuguesa, Organismo Oficial, com sede em
Queluz de Baixo, Estrada das Palmeiras
RESUMO
A invenção refere-se ao processo para a preparação de proteínas quimicamente modificadas, com ou sem actividade catalítica, e efeito terapêutico que disponham de grupos Ç^-N^ ^eactivos, caracterizado por compreender a reacção de ligação covalente desses grupos ao carbono carbonilico de um ou vários agentes acilantes de fórmula
1!
R — C - X em que R β X têm os significados indicados nas reivindicações, um meio micelar contendo o agente acilante e a protei na com uma razão molar compreendida entre 50 e 900, β na presença ou não de agente acilante eventualmente seguida da reacilaçâo realizada em condições semelhantes.
Esta invenção relaciona-se com a produção de promodifi a -, s por via ourmica.
Diversas
i.as arresentam oeuticas limitado pe
rnciali ráveis, porem o seu uso clínico diário é reacções iraunológicas as por via intravenosa, desencadeiam, euan;Ί Pm-θ descrito por
F.'..B. V.ãtts e D. A. C-ibbs in Lysosomal Storage Biseases: Biochsmical and Clinicai Aspects, Taylor à Francis, london and Fhiladelphia, 1936 e por F. Boivin, -J. Boisse, H.
iestraaet e Faris, 1973.
uanoo um ajdos in Fnzymopathies, Faso. V. Fasson, ;rcteína é imobilizada em. vesi:
as /jr iipusaiuas, e pessrvei utilizar as suas capacidades terapêuticas diminuindo consideravelmente as reacções adversas do organismo, s ao mesmo tempo aumentar o seu tempo de circulação e impedir a respectiva degradação.
química de proteínas hidrofílicas grupos hidrofcbicos possibilita uma entre a orofeina e a camada lipídica de lipossornas, tal coso descrito por Y.F. Toschilin e A.F. Klibanov em Bnzyme Ficrob. Technol., 1931; 3,297-364.
A afinidade da proteína modificada para a membrana lipídica á directamente proporcional ao grau de modificação obtido, de acordo com 7.F. Torchilin, V. G. Ornei'Yanenko, A.I. Ylibanov, A. I. Likhailov, V. I. C-ol'Danskii e 7.F. Smirnov em Biochim. Biophys. Acta, 1930, S02, 511-521. Quando a proteína actua como catalisador, como é o caso das enzimas, a eficácia terapêutica do sistema enzima ,/lipossoma é também função da actividade catalítica retida pela enzima modificada.
A modificação de proteínas pela ligação covalente lipidicas, designadas por lipossomas, é possível utili )dificaçao :os reagentes contendo ligaçao termodinamicanente estável
BAD OR/GIMAL sutre os oruoos c-’
Í0;
icira cistentes na -.1 proteina e os residuos de palmitoílo, to de palmitoílo, é descrita por 7. R. Torchilin e colaboradores er 3iochim. Biophys. Acta, 1930, 602, 511-521. C processo de modificação descrito por estes autores consiste em submeter a tratamento com ultrassons uma solução tampão fosfato contendo colato de sódio, à cual foi adicionada uma solução de cloreto de palmitoílo em acetona, a mistura obti
3290 *7931 da é adicionada coteína, incubada, o precipitado formado separado por centrifugação e a proteína modificada recolhida no sobrenadante. Rm particular, os autores do processo descrevem a modificação da enzima quimotripsina, obtendo um molécula modificada em 22 a ou 53 dos grupos amino, com tenção de actividade catalítica de respectivamente 50^
353.
\rn _ utilizando o mesmo processo de modificação, R. Koelch, -J.Lash, A.L. Kibanov e V. ?. Toschilin, em Acta 3iol 3ed. Germ., 1931, 40, 331-335, descrevem a modificação de ptidase e tripsina, tendo de respectivamente 5-123 θ actividade catalítica em ambo processo, 7.3. Goldmacher des , 1933, 32, 1207-1210 uma cocos uma retenção de actividaduas outras enzimas, carboxipe obtido um grau de modificação 7-133, com 303 de retenção da os casos. Recorrendo ao mesmo C279V9 θίΏ 3Í0Cí'!Sn. ^319.27219-001-05^^ dificação de tripsina de 153, de de 63-63a.
A enzima l-asparaginase foi também modificada pelo processo de Toschilin, segundo trabalho de R. Glassen e 7. van Rooijen em Rreparative Biochemistry, 1933, 13, 1-57-174, com perda de 353 de actividade catalítica, mas estes autores não especificam o grau de modificação obtido.
Os resultados de modificação de proteínas pelo pro cesso de Toschilin e colaboradores mostram que o grau de modificação máximo conseguido é de 223 s que todas as modibad original ιi c a ç o e s talítica
'4 <;+θ 111.732102.0 cofsí entais pa;
le proteínas e cue, ex relação ao processo já descrito, fe )ro<
·: r a i 3. F
-q melhorar a modificação ouímicé ctivamente, aumeni.
•r· , ·ο ·>*» grupos £-hh? modificados e consequer.tement > O *» Q θ ·· · O ,7P?1 '* F e afinidade d<
proteina para a caiada lipídio nuir a perda de actividade catalítica resultante da modifi ?m consoou i Í 7Í Fi 3. * 3. o d ( CSiT^S t 2-.
' F. 7 3 FL16
Je acordo com uns variantes do processo .mzerrao, o aumento da osrcenta~en ds -'ruces modi _roteína e conseguido por adição à proteína de uma suspensão de micelas mistas de agente acilante e de um agente tensioactivo, por exemplo colafo de sódio, ec :or acoão de ultrassons. Λ ;ampao, obtidas ustura reacci:
F.3.1. 3.S3Í7 pí? Θ F 2.273.0.3. Q d21X3.-3 CQr f-11 <* a- a. *** ί o '? o o 4~ *,ί * ~
’.ο lenta à f nadante, sendo seguidamente dialisada e liofilisada. A rn octida e tema rre-mo;
1!
| la'1 ão | pedo mesm | o método, |
| ,4 n c 4 n | processo, | pois pero |
| r.úmero | de grupo | s t-fh9 m |
oujsiwi a. nau.ciendo a reacilaoão a etaoa crucia .te aumentar significativamente o dificados reloAi.vamente à modificação conseguida numa única reacção de acilação.
fe acordo com a segunda variante do processo da r.te invenção, a eliminação de perda de actividade cade uma proteína por modificação é conseguida por p-<·Λϋ c; a falífi adiçao a proteina de uma suspensão mit mistaa de agente acilante e de um agente tensioaotivo, por exemplo colato de sódio, em tampão, contendo um agente protector do centro activo da proteína. A mistura reaccional é manti da com agitação lenta à temperatura ambiente, cenfrifugada
BAD ORIGINAL
3. Ό2?θΐθίΐ13, C Ο 2.; idní Í0 S □ΐϊΖΓ^ΠΗά.β,Π'υ0 ^rkr* ~ ,7x — p0 obtém-se uma proteína com retenção total de actividade ca31 f t 5 c a .
Taro, completa elucidação da presente invenção, des ;vem-se de seguida exemplos da forma de realização prenda das duas variantes do processo· de acordo com a precaver e ao tamoer ítulo ilustrat
IV 0.
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A1377171 •ov η’ΊΓ Τ'Γί’ΓΤ'ΤΛ r* O' - •^T*7*7*
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TTAT 37 LOTITIOÂfÀO
Adicionar cloreto de palmitoílc pão de carbonato 50rr.7, pH 9,4, contecdo
-L/uia s o 1 7 7 a ο ΐ ar:de colato de gl2mmoles 1 sodio, de modo a obter uma concentração de agente acilante. Sonicar de imediato e juntar a suspensão obtida a albumina de soro bovino até ~ * -5 à concentração de 1, 52x10 LI na mistura, agitando lentamente à. temoeratura ambiente durante 2 horas. ~ acido pal — mítico formado é separado por centrifugação a 20.00Cxg durante 30 minutes. È obtida uma albumina de soro bovino pré-modificada em 35/ dos grupos £-ΤΉ2·
A proteína pré-modifiçada é separada por diálise contra água em volume 2.0CC vezes superior ao volume da amostra durante 13 horas, congelada em azoto líquido e liofilizada durante 16 horas. 0 produto obtido é sujeito a reaoilação pelo mesmo método até ao passo de centrifugação, recolhendo-se no sobrenadante uma proteína contendo 59/ de grupos é-iTh’2 modificados, tal como determinado pela ligação de uma molécula fluorescente, por exemplo, fluorescamina /4-f enil-espiro/furano-2 ( 3H), 1' (3’H)-isobenzof urano/7ourante uC s;
-untos bad orig'nal
LC 2
S D-ASPARAf-ITAST T-DITTCADA θ'.:. 'ÃO DT ACTIVIDADE CATALÍTICA dicionar cloreto de palmitoílo a uma soluçar pão carbonato zp-i'r τ-λ: q a
2t-- > J “t ?
contendo lí de colato de sódio e D-aspararina 3m'l, de rodo a obter uma concentração de
2, ODumoles.ml de avente adiante. Sonicar de imediato dujuntar à suspensão obtida 1-a:
rante 90 segundos nage (l-asparagina amido-hidrolase TC 3·5.1.1) até à concentração de 4, Slmll na mistura, agitando lentamente à temperatura ambiente durante 2 horas. 0 ácido palrr.itico formado e separado por centrifugação a 2C.0C0xg durante 30 minutos. T obtida uma L-asparaginase modificada em 30/ doí grupos c-TTp e com actividade catalítica igual ã da proteína nativa, isto e, retenção de 100/, determinada pel:
cidade inicial d;
. o rma? ao
Lo retodo descrito por A.l.
J X > í_ , _> ? — _J lt bacn
Clinicai
.....
r bad origina
Ό te mas oui—
trapos reactivos, caracter;
lacto de compreender a reacção de ligação covaler.te d l-?. — ?roc3sso para a prepararão d: nicanente nodifiçadas, com ou sen actividade catalítica, ' US 5.Í S S 3nh.SLC d 3 1 r'^ > — '”T - ri -f- < -m q . ' mrh '-ο Ί _ grupos ao carbono carbonilico de um. ou vários agente: lantes eu. meio nicelar, de acordo con o esruena:
brote ma- p-•o —>mo
1t .τ_π_ό un. grupo alçuilo, amino, tiol ou ou insaturado com 1 uais ato'os de carbono ^ornando uno cadeia ciclica ou aciclica e ;rupo hidroxilo, halogéneo, alcóxi ou acilo, e en que a razão molar o a ver.
te aci ilante e a oro te ina e de 50-931
2\ - Irocesso de : cordo con o. reivindicação 1, ca-> racterizado nelo facto de a modificarão da proteína ce m.lisar ra presença de un agente protector do seu centro .activ para produzir una proteína con retenção de actividade cataca de 35U litica s:
acoruo c<
d 2.S 2?S 2. V l· U—
Licações 1 e 2, caracterizado pelo facto de c a~erte acilant o cloreto de oalritoílo.
| 4- · | . - | Irocesso de acordo con | q malquer das | us i vin— |
| dicações 1, | 2 e | 3, caracterizado pelo | facto de corn | reender |
| a separação | da | proteína, modificada do | neic micelar, | segui— |
da de congelação, liofilização e reacilaoão, para se obte: uma proteína con grau de modificação superior ao obtido con una única reacção de acilação.
SAD ORIGINAL^ aoacterizado melo facto fe ra reaci r: η n 3· r··
ΌΊ
o com a rs.rzm
Claims (1)
- - Ί po 3 ,'-3 7τ·ο rr'H ' ci a~ente acilarte s a rroteína rré-molim te^iZA.do Oêlo ?3.£Ϊ·Ο do Ο Ο'Ό'.'-do Όθϋθ.ΌΪΟ 3 0 O cloreto de palmitoíle.. — Τ2ΓΟΟΟ33Ο do 2.CO2?do 0 0.0 : -''.d. * 0 2? dO.3 XOÍVÍOx” proteína γόο 2? a d a ο το í i po 3 5 o ra 3.dicaçoes 1 a 6, caracterizado pelo facto dS i n η p,S-^p o --< ϊ ν' ,- .tocos :c ore1 cai coes farmacêuticas, caracterizado pelo facto de so misturar colo ?22O3 uTOa Ό22Ο to £ΣΊ3. 3 UÍ32ÍC 0.30ΜΪ ~ rodi^LOada, ordo qualquer das reivindicações la?, com culares e/ou diluentes fisioloqicament substância e aceitáveis.jisboa, 4 de Agosto de 1Aqente Cficiai da Trorriedade IndustrialA-DJ4A81A SILV1NA VIEIRA PEREIRAAdiante gsénco áiSthra Carraft· «quite «fioa da tawfctekB_fogha»3«n-3- Ε--1βΜ ΙΒ80Λ Tètís. 65 1339-&54613
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PT8819888A PT88198B (pt) | 1988-08-04 | 1988-08-04 | Processo para a preparacao de proteinas quimicamente modificadas |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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| PT88198A PT88198A (pt) | 1990-03-08 |
| PT88198B true PT88198B (pt) | 1995-03-01 |
Family
ID=20084293
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|---|---|
| PT (1) | PT88198B (pt) |
-
1988
- 1988-08-04 PT PT8819888A patent/PT88198B/pt not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PT88198A (pt) | 1990-03-08 |
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