PT880323E - Microorganismos e sua utilizacao no tratamento de alimentos para animais e silagem - Google Patents
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Description
87 138 ΕΡ Ο 880 323/ΡΤ
DESCRICÃO "Microorganismos e sua utilização no tratamento de alimentos para animais e silagem"
Campo da invenção A presente invenção refere-se a microorganismos e sua utilização no tratamento de silagem.
Antecedentes da invenção A utilização de enzimas e organismos pode melhorar ou aumentar o desempenho de animais e o valor da alimentação que os animais recebem. Por exemplo, em WO-A-9210945 revela-se uma combinação para utilização no melhoramento do valor de silagem preparada, e WO-A-9617525 refere-se ao melhoramento do desempenho de animais utilizando microorganismos. A eficácia da combinação da utilização de enzimas juntamente com organismos que produzem ácidos gordos voláteis (AGV) é também descrita. Neste caso, demonstraram-se melhor conservação da silagem, melhor desempenho do animal e uma redução na produção de efluentes. WO-A-9503396 demonstra que podem acrescer algumas vantagens quando é produzido um perfil de AGV desejado durante a fermentação da silagem; verificou-se também que isto não produz a redução desejada no aquecimento, após a abertura do silo. .. A produção de silagem e a gestão da lavoura associada desenvolveram-se nos últimos anos até um ponto que podem ser definidos vários processos diferentes. Estes são: (i) a ensilagem de gramíneas jovens com um teor de matéria seca particularmente baixo, e.g., menos de 25% (comum no R.U., Irlanda e Escandinávia), (ii) a ensilagem de gramíneas mais maduras com teor de matéria seca superior (R.U.), a ensilagem de matéria seca elevada mas gramíneas jovens conseguida por emurchecimento (Holanda); e (iii) a ensilagem de milho completo incluindo folhagens ("stova") e carolo, usualmente com uma concentração de matéria seca de cerca de 35%, e cereais de safra completos, e.g., trigo, em 45-50% de matéria seca.
Particularmente nos casos (ii) e (iii), um dos principais problemas ocorre numa base regular. Este é o fenómeno conhecido como deterioração aeróbica. Este fenómeno não é bem entendido. Embora existam muitas opiniões 87 138 ΕΡ Ο 880 323/ΡΤ 2 diferentes, ο processo de deterioração aeróbica pode ser dividido em fases. Assim, existe uma fase inicial em que leveduras e por vezes bactérias de ácido acético começam a respirar os ácidos orgânicos conservantes. Após um aumento inicial do pH, há uma fase secundária em que a actividade dos bacilos é evidente, e está associada ao aumento de temperatura. Uma outra fase inclui a actividade de vários microorganismos incluindo fungos.
Nas silagens que contêm um teor substancial de matéria seca, i.e. mais de 30%, o problema de deterioração é particularmente agudo. A deterioração é observada em maior ou menor grau uma vez aberto o silo e exposição ao ar. Em Agricultura! Research 43(6): 17 (1995) revela-se que o crescimento de organismos de deterioração pode ser inibido adicionando uma estirpe de Lactobacillus buchneri.
Sumário da invenção A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na identificação do processo de deterioração aeróbica como estando proximamente relacionado com o aquecimento no silo por exposição à entrada de ar. A subsequente observação destas silagens mostrou uma grande concentração de organismos Gram-positivos termófilos, leveduras e bactérias, incluindo bacilos e fungos. Isto demonstra aparentemente o início de uma fermentação secundária, afim à da compostagem (sendo a fermentação primária o processo de ensilagem). Nesta etapa de fermentação predominam leveduras e bolores. Parece que, para evitar a deterioração, é necessário matar ou suprimir três categorias principais de organismos que são bactérias formadoras de esporos, leveduras e fungos. Eliminar apenas uma categoria pode conduzir à proliferação das categorias restantes, pelo que não é evitada a deterioração.
De acordo com a presente invenção, a utilidade da prevenção de deterioração foi identificada em materiais que, pelo menos à primeira vista, inibem microorganismos que iniciam, a deterioração aeróbica, em particular leveduras e, à superfície da silagem, fungos. Um organismo capaz de fazer isto pode também inibir o desenvolvimento de outros microorganismos de deterioração, e pode ser identificado por pesquisa. 87 138 ΕΡ Ο 880 323/ΡΤ 3
Um organismo da espécie Lactobacillus buchneri, que cumpre este requisito, foi depositado na National Collection of Industrial and Marine Bactéria em 13 de Fevereiro de 1996. O seu número de acesso é 40788.
Tal como explicado com maior detalhe adiante, este organismo tem um efeito surpreendente, diferente e/ou estendendo-se para além do que é devido à sua capacidade para produzir AGV, tais como os ácidos acético, propiónico e láctico, que são normalmente produzidos na fermentação. O organismo produz um metabolito secundário caracterizado pela sua capacidade para inibir o crescimento de uma variedade de organismos de deterioração, e que é estável a 80°C mas inactivado a 120°C. É razoável assumir que uma tal substância (que pode possivelmente ser proteínica) pode ser produzida por outros organismos. Qualquer normal perito na arte, possuidor da informação contida neste fascículo, será capaz de identificar se um dado organismo, que não aquele que foi depositado, produz a mesma substância.
Descrição da Invenção
Com a finalidade de ilustrar a invenção, identificou-se um organismo que é capaz de produzir uma fermentação de silagem aproximadamente normal juntamente com uma substância que pode inibir o outro organismo que se pensa estar associado à deterioração aeróbica. Adicionalmente, quando inoculado em silagem de trigo de safra completo, de milho e de gramíneas, este organismo produz uma silagem que é bem conservada e em que o início de fermentação secundária associada a deterioração aeróbica e aquecimento é reduzido ou eliminado. O organismo parece assim ser capaz de produzir a substância inibidora sob as condições de fermentação encontradas em silagens. Provou-se ser insuficiente um perfil de AGV como é normalmente obtido em silagens bem fermentadas (com ou sem a utilização de inoculantes incluindo Lactobacillus p/antarum) para evitar a ocorrência de deterioração aeróbica. O efeito total dos metabolitos secundários pode não ser observado se, quando utilizado em silagem, essa silagem é aberta demasiado cedo. A silagem é portanto mantida fechada durante pelo menos 30 dias, e mais preferivelmente durante um período mais longo, e.g., pelo menos 45 dias. O período óptimo dependerá, e.g. inter alia, da dimensão da massa de silagem, e da natureza do material ensilado. 4 87 138 ΕΡ Ο 880 323/ΡΤ
Os materiais que são adequados para ensilagem, na presente invenção, são quaisquer susceptíveis a deterioração aeróbica. O material conterá normalmente pelo menos 25% em peso de matéria seca. Estes materiais incluem azevém ou gramíneas tradicionais, milho, Lucerna, gramíneas murchas, trigo, cevada ou outro cereal de safra completo. A silagem pode estar em fardos (uma forma particularmente susceptível a deterioração aeróbica). A actividade associada à presente invenção pode ser encontrada em outras estirpes de L. buchneri, em outras espécies de Lactobacillus, e.g. L. kefir, L. parakefir e L. parabuchneri, e possivelmente também em outros géneros. Isto pode ser estabelecido por experimentação de rotina, com base na informação aqui exposta. A actividade é valiosa na inibição do crescimento de vários organismos de deterioração. Os exemplos destes organismos são organismos Listeria, Bacil/us spp., Guillermondella selenospora, Trichoderma longibrachiatum, Aspergi/lus rtiger, Monascus, Penicfflium roquefortii e Fusarium spp.
Cresceram-se organismos seleccionados em cultura líquida e separou-se o meio de fermentação das células. Este meio foi então utilizado em ensaios para determinar se estava presente uma substância inibidora que pudesse proporcionar o efeito desejado, i.e. silagem termicamente estável.
As experiências foram conduzidas com três organismos típicos que epitomizam o processo de deterioração, i.e. um Baciífus, uma levedura e um fungo. Testaram-se também várias combinações de lactato, acetato, propanoato de AGV. Apenas o extracto de um pequeno número de organismos seleccionados produziu o resultado inibidor desejado. Isto demonstrou que as bactérias eram capazes de produzir uma ou mais substâncias inibidoras para os organismos alvo.
De modo a demonstrar que estes organismos podem de facto evitar deterioração aeróbica, conduziram-se experiências adicionais. Os organismos foram cultivados por meios convencionais e novamente inoculados em gramíneas ou trigo de safra completo, em lotes de c. 10 kg, onde o organismo produziu uma fermentação não diferente da fermentação de ensilagem convencional, típica do material ensilado. A natureza desta fermentação não é 5 87 138 ΕΡ Ο 880 323/ΡΤ completamente compreendida, mas a perda de matéria seca (aprox. 4%) na forma de gás, presumivelmente C02, indica que esta pode bem ser uma fermentação parcialmente heterofermentativa. A silagem preparada desta maneira provou ter um perfil de AGV que se aproxima do de uma silagem normal. Não houve evidência de que silagens preparadas por inoculação com este organismo em combinação com enzimas originariam os resultados desejados. Contudo, silagens preparadas desta maneira foram tomadas e colocadas em grandes caixas de plástico, com aproximadamente 0,5 m x 0,25 m por 0,1 m. As caixas estavam aproximadamente meio-cheias. Colocaram-se termopares nas silagens para registar o início da fase de aquecimento da deterioração aeróbica. Cada caixa foi colocada num laboratório aberto com excelente ventilação.
Os resultados de uma destas experiências são apresentados no Exemplo 1 adiante. Os resultados indicam uma fermentação de silagem aparentemente normal, mas numa notável demonstração dos efeitos da actividade antimicrobiana do organismo, a silagem tratada foi termicamente estável, mantendo temperaturas ambientes (20°C) durante um período de pelo menos dez dias. Nos tratamento de controlo e outros tratamentos, a temperatura aumentou para mais de 35°C.
Experiência 1
Tratou-se trigo de safra completo com uma formulação que consistia em células criodessecadas e enzimas. A formulação compreendia 4,87% de L. buchneri NCIMB 40788, 10,67% de enzimas compreendendo β-glucanase, xilanase e galactomananase, 80,09% de açúcar de sêmola, 3,13% de verde Drimalan BGE e 1,25% de Sipernat 50S. Estes números são baseados numa concentração de células criodessecadas de 3x1011/g de L. buchneri. Esta formulação em pó, de fluidez livre, verde pálido, foi utilizada dissolvendo 150 g em 100 1 de água, para tratar 25 toneladas de forragem, pulverizando a uma taxa de aplicação de 4 litros por tonelada. A contagem de viáveis foi de 5 x 104 ufc/g de trigo de safra completo.
Como controlo, utilizou-se um inoculante de silagem convencional contendo Pediococcus pentosaceus (NCIMB 12455) e Lactobacillus p/antarum (NCIMB 12422). Este é representativo dos organismos convencionalmente
I
I
utilizados no tratamento de silagem e é adiante descrito como "inoculante normal". A formulação foi encerrada em barris de fermentação com ventiladores que permitem o processo de fermentação normal. Os conteúdos foram examinados após uma análise de 130 dias e os testes de estabilidade aeróbica foram então realizados.
Perfis de fermentação
Tratamento DM(%) PH CP(%) ME (MJ/kg) NH3 (%) Não tratado 49,6 4,1 12 10,6 0,11 Inoculante normal 50,3 3,9 10 10,7 0,12 Organismo de teste 51,0 4,0 10,4 10,1 0,11 Perfis do produto lactato acetato propionato etanol Não tratado 41 1 0 6 Inoculante normal 45 5 0 3 Organismo de teste 35 4 0 6 Desenvolvimento da temperatura (°C) Tratamento (horas) 0 50 100 150 200 250 Não tratado 17 17 17 35 34 25 Inoculante normal 17 17 17 25 27 36 Organismo de teste 17 17 17 17 17,5 18
Estes resultados, apesar de em pequena escala, demonstram que o mecanismo não depende dos perfis de AGV ou da concentração de AGV.
Experiência 2
Preparou-se silagem de gramíneas em grandes fardos e tratou-se com uma formulação semelhante à do Exemplo 1, compreendendo adicionalmente amilase, para proporcionar 1 x105ufc/g de gramíneas, com uma taxa de aplicação de 1 x 105 g de forragem. Examinaram-se as silagens de controlo e as silagens tratadas com a estirpe de L. buchneri e analisaram-se após períodos de 28, 63 e 113 dias de ensilagem. A composição da silagem em grandes fardos era a seguinte: 87 138 ΕΡ Ο 880 323/ΡΤ 7
Matéria seca (g/kg) PH Lactato (g/kg DM) Acetato Propionato Etanol NH3-N (%N) Estabilidade aeróbica (h)
Dia 28 Dia 335 373 361 4,48 4,57 4,42 54 54 66 11 13 15 0,7 0,7 0,6 8 8 7 9 8 11 138 178 187 63 Dia 11 3 367 328 337 4,49 4,40 4,47 59 78 71 19 21 27 0,7 0,8 1,0 8 9 10 10 12 12 222 150 >189
Os resultados da Experiência 2 demonstram novamente que as diferenças entre o controlo e a invenção não se devem simplesmente à produção de um perfil particular de AGV. Adicionalmente, existe uma indicação de que a estabilidade da silagem à exposição ao ar aumenta ao longo do tempo. Isto indica um modo específico de acção do organismo L. buchneri e outros com actividades semelhantes.
Dos resultados anteriores, pareceria que o mecanismo de acção é a produção de pelo menos uma substância antimicrobiana pelos microorganismos seleccionados durante o processo de fermentação. De modo a caracterizar a natureza da substância antimicrobiana, realizaram-se experiências que demonstraram que a substância produzida no sobrenadante do caldo de fermentação do organismo seleccionado inibiu uma vasta gama de microorganismos. Foi estável ao tratamento térmico durante 10 min a 80°C, mas foi inactivado pelo calor durante 10 min a 120°C. Os AGV também presentes no caldo de fermentação pareciam ter efeitos desprezáveis ou não ter efeitos sobre o crescimento de organismos de deterioração seleccionados.
Experiência 3 O mecanismo de acção foi adicionalmente demonstrado através de uma série de experiências em que se prepararam sobrenadantes de cultura após 24 e 48 horas de incubação em culturas em frascos. Estes sobrenadantes foram examinados em relação a organismos específicos conhecidos como sendo activos na deterioração aeróbica de fermentações tais como as que ocorrem na silagem. 8 87 138 ΕΡ Ο 880 323/ΡΤ
Nesta experiência, a atenção foi focada nos organismos que caiem nas categorias de levedura ou bolor. Os efeitos do sobrenadante foram examinados nos bolores Fusarium oxysporum (IMI 236441), Mucor racemosus (IMI 103730), Aspergi/lus niger (IMI 096215), Caldosporum herbarum (IMI 096220), Penicillum expansum (IMI 315902) e Trichoderma harzanium (IMI 275950), e nas leveduras Candida krusei (ATCC 62403), Guilliermondella se/enospora (ATCC 10629), Debaryomyces hansenii (ATCC 9364) e Pichia subpel/icosa (ATCC 16766).
Em cada caso, foi demonstrada a inibição do crescimento dos organismos alvo. Em adição, os sobrenadantes que foram preparados a partir do caldo após 48 horas de incubação mostraram geralmente a actividade inibidora superior à dos incubados durante 24 horas. Isto sugere que o efeito antimicrobiano é produzido numa etapa tardia no ciclo de crescimento celular, ou que se acumula ao longo do tempo, ou que ocorrem ambas estas possibilidades. O efeito antimicrobiano pode assim acumular-se a uma taxa crescente, com cada geração. É portanto desejável que, no campo, a fermentação ocorra de uma maneira óptima e que a fermentação continue durante um tempo que proporcione a acumulação máxima do efeito antimicrobiano. O tempo de produção do efeito antimicrobiano no campo variará com as condições e com a natureza da forragem que se está a ensilar.
Experiência 4
Para demonstrar o efeito do tempo sobre a prevenção de deterioração aeróbica, preparou-se silagem de gramíneas como na Experiência 1. A estabilidade aeróbica foi então determinada. Em 7 dias a estabilidade da silagem foi pobre ocorrendo aquecimento em linha com o controlo. Em 100 dias, a estabilidade foi assegurada.
Lisboa,
Por BioTal Limited e Stichting Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid - 0 AGENTE OFICIAL -
Eng.0 ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRA
Ag. 0(. Pr. Ind Rua das Flores, 74-4.“ 1200-195 LISBOA
Claims (13)
- 87 138 ΕΡ Ο 880 323/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Método de tratamento de silagem que compreende a adição à silagem de um microorganismo possuindo a característica de Lactobacillus buchnerí, NCIMB 40788, de produzir um metabolito secundário, em adição aos ácidos gordos normalmente produzidos em fermentação, possuindo o referido metabolito a capacidade de inibir o crescimento de organismos de deterioração seleccionados de entre leveduras, bolores e bactérias formadoras de esporos; e a manutenção da silagem fechada durante um período de pelo menos 30 dias, pelo que é produzido o referido metabolito.
- 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a silagem é de gramíneas tradicionais, e.g. azevém.
- 3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a silagem é de milho.
- 4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a silagem é de Lucerna.
- 5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a silagem é de gramíneas murchas.
- 6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a silagem é de cereal de safra completo, e.g. trigo ou cevada.
- 7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido período é de pelo menos 45 dias.
- 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o microorganismo tem a capacidade de evitar que a temperatura da silagem de trigo de safra completo, teor de matéria seca de 45%, aumente desde 17°C, mais de 4°C ao longo de 200 horas.
- 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o microorganismo é do género Lactobaci/lus. 87 138 ΕΡ Ο 880 323/ΡΤ 2/2
- 10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o microorganismo é L. buchneri, L. parabuchneri, L. kefir ou L. parakefir.
- 11. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o microorganismo é L. buchneri.
- 12. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o microorganismo é Lactobacillus buchneri, NCIMB 40788.
- 13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a silagem possui um teor de matéria seca de pelo menos 25%. Lisboa, Por BioTal Limited e Stichting Instituut voor Dierhouderij en DiergezondheidEng.e ANTÔNIO J' O DA CUNHA FERÍ «A Ag. Of. Pr. Ind Rua das Flores, 7 1200195 LISBí a
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