PT87224B

PT87224B - Metodo para detectar a expressao de genes biorregulares em microculturas de celulas eucarioticas

Info

Publication number: PT87224B
Application number: PT87224A
Authority: PT
Inventors: Raymond Kaempfer; Gila Arrad; Lisya Gerez
Original assignee: Yissum Res Dev Co
Priority date: 1987-04-15
Filing date: 1988-04-12
Publication date: 1992-08-31
Also published as: DE3852004D1; ATE113665T1; EP0309558A4; EP0309558A1; WO1988008038A1; JPH01503598A; PT87224A; DE3852004T2; EP0309558B1; ES2009261A6

Description

A presente invenção refere-se a um método para de tectar a expressão de genes biorreguladores em microculturas de células eucarióticas. A presente invenção é particularmente útil no diagnóstico, sendo também um avanço do conhecimento de génese e dinâmica de doenças bacterianas, virais fúngicas, oncogénicas ou imunorregulatérias. * também útil para o controlo da eficiência das terapias aplicadas. Os instrumentos de diagnóstico para levar a cabo o método da invenção são também desenvolvidos.

As citoquinas, produtos solúveis nas células, que se comportam como hormonas locais, regulando o crescimento e o comportamento de outras células, estão envolvidas no próprio funcionamento fisiológico.

As citoquinas compreendem interferões, interleucinas, factores de necrose de tumores e substâncias semelhan tes e factores de crescimento.

estudo das citoquinas conduziu a um importante desenvolvimento médico da bioterapia. A bioterapia das citoquinas oferece um aperfeiçoamento ao tratamento existente para neoplassias, doenças bacterianas, virais, fúngicas e imunorregulatórias.

As células encarióticas, tais como linfócitos, monócitos, fibroblastos, queratinócitos, astrócitos, células endoteliais, células gliais e plaquetas, produzem citoçui nas em resposta a várias necessidades e funçóes biológicas.

Nas células eucarióticas, a expressão dos genes

envolve a formação de RKA mensageiro durante o processo de síntese das proteínas. Portanto, é possível medir a expressão de genes por determinação quantitativa da extensão da presença de RNAm específico para várias citoquinas.

Correntemente, não existe um método directo de acesso à dinâmica de resposta de imunidade num dado paciente, podendo no entanto esta informação ter uma grande impor tância clínica no diagnóstico e condução da terapia em vá rias doenças, incluindo neoplasias, doenças de autoimunidade e síndromas de imunodificiência. Os anticorpos monoclonais podem ser usados para conter subconjuntos de células T, mas são deficientes na informação no que respeita à função e dinâmica do sistema imune. Três genes humanos são de importância chave na determinação do poder de resposta imunitária. Eles são: interleucina-2 (IL-2) ou factor de cresci mento de células-T, o receptor para IL-2 (IL-2R) e o interferão imune ou o interferão gamma (LFN-y). A expressão destes genes, provocada por um estímulo imune, é normalmente severamente regulada para baixo até 99%) por mecanismo mole culares recentes [Êfrat, 3. e Kaempfer, R. Proc. Natl. Acad. Sei. Usa 81. 2601-2605 (1984); Efrat, 3., Zelig, 3., Xagen, B.^e Kaempfer, R. Biochem. Biophys Res. Commun. 123, 842-848 (1984); Kaempfer, R. e Afrat, S. Oellular and Molecular Bioss logy of £7»ρίιοΚίη68 (C. Sorg e A. Schimp. eds.) Academic ire

Orlando, Fia., pp. 605-618 (1985); Kaempfer, R., JSfrat, 8. ei

Marsh, S. Molecular Oloning and analysis of Ι^αιρηοΑίπ^β (D. R. Webb e D. Coeddel, ets.) Academic Press, Orlando, Fia., pp 59-72 (1987); Lebendiker, Μ. A., Tal, ç<, Sayar, i)., Pilo, S. Rilon, A., Banai, Ϊ. e Kaempfer, R. -^iBO J. o, 585-589 (1987)] deduzidos, em parte, por interaeção entre um conjunto de células no sistema imunitário [Kaempfer, R., e Efrat, S. Leukocytes and tlost Befense (J. J. Oppenhein e B.

M. Jacobs, eds.) Alan R. Liss, Inc., NI, pp. 57-68 (1986);

Lebendiker, á. k,^ Tal, C., Sauar, D., Pilo, 3., Bilon, A., Banal, Y. e Kaempfer, R. MBO J. 6, 585-589 (1987); Kaempfer, R., Sayar, D., Bfrat, 3., Lebendiker, M·, Ketzinel, k. e Tal, G. Lymphokine Research 6, Vol. 1 5th Xnternational Lymphokine Workshop Abstr. 1640 (1987)]·

Além disso, a expressão destes três genes é funcio nalmente ligada, criando uma rede de genes interactuantes que são expressos em diferentes linfócitos.

Métodos convencionais para a recuperação cLe das células, geralmente incluem a lise das células e a ultra centrifugação, através de um gradiente de cloreto de césio, são demorados e incómodos requerendo um grande número de cê lulas e equipamento pesado. Os procedimentos conhecidos conhecidos como adequados para um pequeno número de células, quando aplicados em células de sangue periférico, originam dificiências de tal modo que a determinação quantitativa do RKA codificado por um gene específico não é suficientemente rigorosa para permitir que se faça uma medida precisa da ex pressão do gene.

Os métodos convencionais BBS e KP-40 de extracção do RRAm (white, B. A., S. Bancroft F. C. J. Biol. Chem. 257; :8569 (1982) são imprÓpiras para a detecção de citoquinas, porque a presença de proteínas contaminantes mascaram a pre sença do RKA e ocorre uma certa degradação de algum RUA durm te os passos envolvidos nestes processos.

método da mancha Directa com tiocinato de _ouanidínio (GCN) [Latsuyama ii, Sugamura K, Kawade !♦ e Hinuma í. J., Imunulogia, 129:450 (1982)] é inapropriado porque a vis cosidade do DNA interfere com o processamento das fracçôes de RKA. Esta técnica tem como limitação o facto de não mais de 10^y células poderem ser analisadas, sendo em número demasiadamente pequeno para a detecção da expressão de genes de citoquinas ο qual se encontra a níveis mais baixos do que a maioria de outros genes.

Outros métodos para recuperação de RNA baseado nos sais de guanidínio, tal como GCN-Li Cl (Cathala G. Savouret J. I. Mendez B. West B. L., Karin M», Martial J. A. e Baxte:? J. ^D· DKA 2; 239, 1985) originam um BNAm puro mas envolvem demasiados passos e causam alguma perda de RNA para permiti;? o processamento conveniente de grande número de amostras.

Um método baseado no cloridrato de guanidínio [õhe ley S. e Anderson R. Anal. Biochem. 137:15 - (1984)] tem si·· do usado para detectar ΒΙΆ virai expresso em situaçBes de infecçóes virais crónicas. Os presentes inventores descobriram que uma adaptação deste método pode ser usada para detec tar a expressão de genes biorreguladores em células eucarió·· ticas desde que se utilizem os passos apropriados no sentido de provocar a expressão de gene ou genes biorreguladores0 método de acordo com a presente invenção pode ser usado no sentido de identificar e quantificar de maneira digna de confiança e repetidamente a expressão de genes biorreguladores em apenas alguns mililitros de sangue periférico retirado de um dado paciente. Além disso, os presentes inventores descobriram que, usando uma pluralidade de processos de indução com amostras separadas de células euca rióticas, é possível a obtenção de uma muito melhor e completa compreensão da dinâmica do funcionamento dos genes na amostra de células, do que a que é possível segundo qualquer das técnicas já conhecidas.

Nesse sentido, os presentes inventores seleccionaram e proporcionaram um método que elimina os inconvenientes das técnicas anteriores, para a medição da expressão dos genes nas células produtoras de citoquinas, induzindo a exprer são de células contendo citoquinas e detectando tal expressão num menor número de células do que até ao presente era ΐ

possível, eu condições de cultura definidas que são capazes de proporcionar a medição não apenas de expressão actual de genes de citoquinas mas também da integridade funcional dos mecanismos regulatórios que controlam a expressão destes ge nes e as suas perturbações em situações patológicas. 0 objec tivo da invenção é proporcionar um método altamente eficien te de extracção de EMm a partir de populações de células mononucleares de sangue periférico humano apropriadamente desenvolvida, que aumenta a sensibilidade paru detectar a expressão dos genes de citoquina e evitar os artefactos de combinação criados pelo uso das análises de manchamento de Northern correntes, no sentido de avaliar a expressão normal ou anormal de genes de citoquinas e fazer a sua regulação.

Sumário da Invenção

Os presentes inventores conseguiram agora proporcionar um método que permite uma detecção exacta e sensível de uma expressão transitória de genes biorreguiadores em si tuações em que tal expressão é normalmente muito baixa e quase não detectável e em que apenas se dispõe de pequenas amostras de células.

A técnica de acordo com esta invenção pode, em formas de realização preferidas controlar com exactiião a extensão da expressão de genes em amostras tão pequenas como as de meio milhão de células ou até 50C vezes menos células, do que as requeridas pelos métodos correntes até ago ra usados para detectar a expressão de tais genes. Isso per mite assim o estudo da expressão de vários genes biorregula dores em apenas poucos mililitros de sangue periférico, o qual é fácil de retirar de um paciente e expressa vários ge nes de importância biorregulatória chave.

É um dos objectivos da presente invenção propor-

cionar um método geral para detectar a expressão de geres biorreguladores em microculturas de células eucarióticas, tendo um valor importante no diagnóstico e terapia, compreendendo os seguintes passos:

a) isolar-se e cultivar-se as referidas células em condições que provocam a expressão de, pelo menos, um dos mencionados genes;

b) efectuar-se a lise das citadas culturas cultivadas com cloridrato de guanidínio;

c) precipitar-se selectivamente ácido ribonucleico por adição, à preparação de células homogeneizada, de solução de acetato de sódio ou de acetato de potássio seguida por etanol absoluto;

d) recuperar-se a provocar-se a formação de manchas de nlíA numa metriz de suporte;

e) hibridar-se o RNÀ recuperado e maucnado com uma riboamosí tra específica radioactivamente marcada, com pelo menos um dos referidos genes; e

f) determinar-se quantitativamente a extensão da libação da mencionada riboamostra marcada, com o citado BKA manchado.

Kuma outra forma de realização preferida, a referida operação de lise (b), é realizada com adição de tiocia nato de guanidínio e a mencionada precipitação selectiva no passo (c) efectua-se por adição de cloreto de lítio, seguido por solução de acetato de sódio ou acetato de potássio e etanol absoluto.

O método de acordo com a presente invenção I preferivelmente realizado para detectar a expressão de genes biorreguladores, seleccionados do grupo que compreende interferóes, interleucinas, factores de necrose de tumores e

factores de crescimento, sendo as células encarióticas esco lhidas do grupo que compreende linfócitos, monécitos, quera tinécitos, fibroblastos, astrécitos, células endoteliais, células gliais e plaquetas.

composto usado para provocar a expressão dos ge nes biorreguiadores é escolhido do grupo que compreende fito-hemaglutinina ou concavalina A, com ou sem ciclo-heximida e irradiações com raios gama ou as suas combinações apro priadas. A irradiação com raios gama é um exemplo de um tra tamento que previne a activação de células T supressoras (Gullberg M., Larsson i. L., J. Immunol. 128:746 - 1932), que afecta a expressão de gene [lebendiker, m. A., Jal

C., Sayer D., Pilo 3., Danai I., jiilon A. < Kaempfer <? * 6:658 (1987)] . A ciclo-heximida é um agente que conduz a uma expressão anormal de gene IL-2 jjírat S. e Kaempfer R. Proc. Matl. Acad. Sei. Usa 81:2601 (1984)] e o gene [bebendiker, Μ. A., Tal C., Sayar D., Pilo 3., Banal Ϊ., nilon A.

& Kaempfer R. LmBO 6:585 (1987)] · processo de acordo com a presente invenção é le vado a cabo, de preferência, em duas alíquotas separadas de uma amostra única. Uma alíquota é ensaiada sem que se adicic ne um composto indutor para se obter uma leitura representativa do nível de base da expressão, enquanto a segunda alíquota é submetida à indução por um indutor adequado, tal co mo fito-hemaglutinina.

quociente entre o nível de expressão provocado e o nível de base indica se a regulação do gene é normal ou não. Se se desejar, a indução pode ser levada a cabo em alí quotas separadas da amostra de células para se obter informação cinética sobre o processo de indução.

De acordo com uma posterior preferência de acordo com esta invenção, adicionam-se indutons adicionais ou alter

nativos, como por exemplo ciclo-heximida, àa alíquotas adicionais de amostra de células com o fim de super-induzir as células. Tal super indução pode indicar o potencial máximo para a expressão dos genes. .Este facto, por sua vez, propor ciona uma guia no que respeita à extensão à qual o nível de expressão de base se aproxima do potencial máximo de expres são do gene.

Descobriu-se que as células T supressoras abaixo-regulam pelo menos alguns genes de citoquinas. A irradiação- previne a activação das células T supressoras. Assim, vantajosamente, uma aiíquota da amostra de células é submetida a super-indução e irradiações-^. Tal amostra indica a extensão à qual as células T supressoras abaixo-regulam a expressão do gene de interesse.

método de acordo com esta invenção requer que a mencionada riboamostra seja marcada com um grupo químico is6 tépico ou não isotópico detectável.

A invenção oferece análises adequadas de muitas amostras (48 e mais) sem que se use equipamento pesado e umn quantificação de dados sob a forma numérica.

C método de acordo com esta invenção pode ser levado a cabo convenientemente e sem requerer o uso de uma ul tracentrifuga, fazendo a análise rápida de grande número de amostras praticáveis; além disso, a sua reprodutibilidade detecta a expressão de genes acima de pelo menos cerca de 20C. 0 equipamento necessário é o corrente e de natureza sim pies; micréfuga, centrífuga de células, incubador em aparelho de manchamento, banho maria.

Uma amostra de 10 ml de sangue compreende geralmex. te 10? células, permitindo análises múltiplas de expressão de gene (vários genes, várias condições de indução). A possibilidade de realizar várias medições em uma única amostra

- 10 de sangue permite refinamentos sob várias condições de indu ç&o para medir a integridade do mecanismo regulatério do ge ne na presença da doença.

A resposta é linear com o aumento do Ri;A introduzido. A resposta aumenta linearmente tanto com o número das células como com a quantidade de RXA. Um número, três vezes superior de células geram um sinal igual ao de três vezes mais RIJA, isto é, três vezes ciais forte. 0 sinal de expressão do gene é linear ao longo de, pelo menoe, cerca de 2CC vezes. Logo, tanto a hibridação como o escurecimento da película constituem uma medição quantitativa, dstas proprieda dea tornam o método altamente reprodutível e informativo.

resultado é o facto de a totalidade do i A e RNAm das células permanecer intacto, a percentagem de con taminante não ser superior a sendo mesmo inferior no que se refere à proteína.

Kão há interferências, por parte da proteína, no sinal de hibridização, que é igualmente tão forte como o obii do com RNA puro, preparado por lise e com tiocianato de gua nidínio e ultracentrifugação com adição de CsCl, cuja técni ca é morosa e enfadonha.

Um sinal de um RKAm específico, por exemplo, para a interleucina-2 (IL-2) ou interferão-gama pode ser detectado numa amostra com apenas 5· 10^ células, com urna exposição de película de 24 horas. São necessárias apenas 20 a 1CC menos vezes células para a obtenção de um sinal do que as necessárias para um manchamento de ”Iíorthern” corren te.

Descrição dos Desenhos

Fig. 1 representa um diagrama esquemático da técnica de aco. ’ do com a invenção.

i*

Tig.

Hg.

fig ?ig>

demonstra o uso do ensaio para a medição de expressãt· de gene IfS-Induziram-se 4 χ 10& células mononuclea res do sangue periférico humano para a expressão do geme 0 RNA extraído das células foi analisado quafro diluições em série (0,125; 0,25; 0,5 e 1) usajt de um aparelho de manchamonto de manchas múltiplas. 0 filtro de nitrocelulose foi hibridizado para a ribc amostra do INP-^.

A irradiação gama foi realizada antes de 0,4% (v/v) do fito-hemaglutinina (PHA), dese um valor de 1500 rad.

A ciclo-hoximida (CHX) foi adicionada culturas depois da adição do referido PHA.

foi exposto à película apés hibridação e o autorradic grama está representado.

é um gráfico, representativo da Lineariedade do ensaio da adição tendo a a várias filtro deacordo com esta invenção. Analisaram-se amostras expressando diferentes índicos de BI4A IL-2 ou RNA 1»-^, em quatro séries de diluições, usando um aparelho de manchamonto de manchas múltiplas. Após a hl bridação de riboamostras específicas e a autorradiografia dos filtros do nitrocelulose, mediu-se a absor vtncia de manchas individuais a 650 nm num autoleitor de mioro-lLISA (ensaio de imuno-adsorção por ligação ensimática) · é um gráfico representativo de lineariedade e a resposta equivalente do ensaio em função do número cres cento do células ou do aumento da quantidade introdu sida do RNA. Diluiram-se em série 4x1Οθ células, induslndo-as para expressão do gene IL-2 e o RNA foi então extraído (▲). Alternativamente, o RNA foi extraído de 4x10 células e então diluído em série (o)<

é um gráfico representativo da cinética dos níveis d<

4’

Hr-2 SMAa on linfócitos d· sangue humano periférico indasidos com fito-hemaglutinina (PHA). As células fora* indusidas com PHA (0,4# ▼/▼) a 0 horas. Amostras do 4xl0⁶ células for·· extraídas em cada insta· to de tempo indicado, e o RNA foi extraído. Adieionou—se ciclo-heximida (0ΗΣ; 20 g/ml) As 21h e o RSA fo:. analisado As 24h (A).

fig· 6 representa ua gráfico de barras da quantificação de expressão de genes Hr-2 e IFI-y em PBL de nove doadores de sangue. De cada doador retirou-se uma amostro de 10 ml de sangue periférico. As células de cadu doador foram incubadas com:

1) sem adiçdes (ensaio em branco, ensaio do ruído de fundo BKG);

2) adição de 0,4# (▼/▼) de PHA;

3) adição de PHA depois de irradiação com radiações (1500 rad) das células;

4) adição de PHA. seguida As 16 horas pela adição de CHI (20 uit/al).

BKA foi extraído de todas as amostras 20 horan apés a adição de PHA · os filtros das manchas foram hibridisados separadaaente com ribo-amostraa para IL--2 e As barras indica* a densidade da película para os respoctivos ensaios, determinada num auto-le.. tor do tipo micro-ELISA.

Fig. 7 é *i> gráfico de barras mostrando a distribuição dos níveis de expressão dos genes IL-2 e INF-J* nas célula* dos novos doadores, descritos na Fig. 6, expressos ea absorvtncia da película a 630 na, a qual reflecte a quantidade do BBA hibridisado.

Exemplo 1 - Cultura de Linfócitos

1. Faz-se una tona de 10 ml de sangue periférico de um dado paciente nua tubo tratado com heparina.

2. Dilui-se para o dobro coa solução salina (PBS) contendo tampão de fosfato (PBS).

3· Adiciona-se 2 vol. de Ficoll (Farmácia).

4. SObaete-se a rotação durante 30 minutos a 200 g na centrífuga de células.

3. Lava-se duas vezes coa meio RPM 1 1640 sem soro.

6« Roasuspendem-se as células a uma densidade de 4x10 em tubos de cultura do plástico de fundo redondo de 10 ml (Oel-Cult.) de tampa roscada contendo meio BBí 1 1640 coa a composição seguinte glutamina: 2 milimolar;

aminoácidos não essenciais em MEN; 10 milimolar; piruvato de sádio em MUI; 100 milimolar HIPES de pH 7,2: 10 milimolar;

penicilina: 100 unidades/nl; estreptomicina: 100 microgramas/ml gontamicina: 40 microgramas/ml; 2-mercaptoetanol: 5*10~^ molar; soro do feto de novilho: 2%;

nistatlna: 5 /^/ml.

7.Incuba-se durante a noite a 57°C numa atmosfera de C0_P.

C·»

Saomplo 2 - Condições de incubação .

Células de cada doador foram incubadas com as seguintes condições:

1· som adições (ensaio em branco, BKG)

2. adição de 0,4% (v/v) de KU

3· adição do PHA depois de submeter as células a irra-

diação^ (1500 rad);

4. adição d· PHA, seguida, * 16h, por adição de 20 ^g/iil de CHI.

KM foi extraído do todas as amostras 20 horas após a adição do PHA.

gxemplo 3 — Técnica Analítica. Sxtracção do RRA

Todos os passos foram executados num tubo de mioroGontrifugação simples de 1,5 mililitros usando uma micro centrífuga (gppendorf) usual de colocação sobre a bancada.

1. A suspensão de 1 ml de células é submetida a centri fUgação a de 500 rpm durante 5 minutos na centrífuga.

2. Adiciona-se 0,4 ml de tiocianato de guanídinio (GTC/ 7,5 molar, podendo usar-se 0 modo operatório descri to no gxemplo 4.

3· Hamogeneisa-se agitando fortemente o tubo durante polo menos 30 segundos até completa dissolução.

4. Adiciona-se 20 μΐ de KQAc 231 de pH 5,1· Mistura-se 0 então adiciona-se 250 jul de etanol absoluto. Torna-se a misturar.

5· Deixa-se em repouso durante a noite a -20°C.

6. Centrifuga-se a 15 000 rpm durante 30 minutos a 4°C num centrífuga Eppendorf.

7· Rejeite-se o sobrenadante.

8. Dissolvem-se a pelete em 50 μΧ de formaldeido a 57%· Agita-ae num agitador até dissolução. Adiciona-se então 50 μΐ de NaCl 3Me citrato de sódio 0,3 à,.

9· OOloca-se em estufa a 60°C durante 15 minutos.

10· Raalisa-se a técnica de manchamento. A amostra I pi

4—petada para uma única depressio de uma placa de mi crotítuléaçio de 96 · diluída em série de proporção de 1:2 com BaCl 1,5 M · citrato de sédio 0,15 X (lOxSSC) e pipetada para depressão adjacentes. Apés todas as amostra· terem sido diluídas, o conteúdo de cada depresa&o originou uma mancha num en •aio múltiplo de 96 lugares (Scheicher & Schuell) •ob vácuo, contendo una folha de papel de hitrocelulose com 9x13 cm (Scheicher & Schuell GB003) para manchamento do filtro.

▲ lâmina de hitrocelulose e o filtro manchado foram previamente embebidos em água destilada e en tio em lOxSSC. Cada depressio foi levada uma vez com 100 jã. de lOxSSC. A nitrocelulose é aquecida a 80°C durante 2h sob vácuo e é ensaiada com a desejada riboamostra do gene, como se descreveu nos exemplos 5 ou 6.

11. Quantificam-se as mancha· da película escurecida meando um autoleito do tipo micro-ELISA. Para fina lidado, a película exposta a raios-l e revelada é •ortada

ma referida placa de tal forma que as manchas fiquem alinhadas com as depressdes. Introduz-se no autoleitor (por exemplo, tech). Faz-se o varrimento a um comprimento de onda de 630 nm.

Sxemplo 4 - Técnica Alternativa de Extracqão de RKA

- Submete-se 1 ml de cultura de células i centrífuga çáo sob 500 rpm durante 5 minutos numa centrífuga de Ippendorf.

- Pejeita-se o sobrenadante e escorre-se a pelete.

- Adicionam-se 100 yul de tampio de lise, consistindo em GTC 5 molar, 10 milimolar, EDTA Tris-HG1 pH 7,5

ailiaolar s 8% (v/v) · mercaptoetanol (adiciona Ao de fresco).

4.- Agita-se fortemente durante 10 segundo» por três Vexes. Adicionam-se 700 pl do 4 M d· LiCl e deixa-se durante 20 h (durante a noite) a 4°G.

J. - Gentrifuga-se a 12000 rpm numa centrífuga Eppendor. durante 20 minutos a 4°G.

6. - fieJeita-se 0 sobrenadante, seca-se a pelete e adicionam-se >0 de tampão solubilizante do REA; do docilsulfato de sódio 0,1% (SDS), lmM EDTA, lOmM fris-HGl pH 7,5.

7· “ Mistura-se através de forte agitação durante 20 se gundos. Bepete-se de 10 em 10 minutos durante 40 minutos. Este paaao é executado à temperatura ambi ente.

8. - £xtrai-se a solução através de forte agitação da aesaa com um volume igual de fenol/clorofÓrmio (1: il)j coleta-se a camada superior.

9. - Adiciona-se 1/10 vol. do KaQAc 5 molar de pH 5,1, mistura-··, adicionam-se 2,5 vol. deetanol absoluto e deixa-se repousar a 20°G durante 20 horas.

10. - Precipitai-se 0 BUA a 4°C por centrifugação durante ainutos à rotação de 15 000 rpm numa centrífuga Ippendorf.

11. - Lava-se a pelete com etanol a 70%

12. - Bejeita-se 0 sobrenadante e seca-se a pelete.

13. - Seguem-se os passos 8 a 11 do Exemplo 3.

Exemplo 5.... - Preparação da Biboamostra de IIr-2

A riboaaostra é sintetisada usando um estojo de

“ riboamostras Bromega-Biotec. 0 IL-2 cDM foi extraído do plasmídio p 3-16 (Taniguchi T., Matsui, xl., Fujita, Γ., Takaoka, CL, Kashima, N., loshimoto, R., hamuro, J. Sature 3,02 (198?) p.305) com Pst I e introduzido num pGM-3 (Promega-Biotec) no sítio do Pst I. Escolheu-a a orientação em que a transcrição do promotor 17 origina a selecçâo do desejado cordão de RNA.

a) A transcrição foi feita tal como * descrita abaixo:

t 1) 4 de tampão de transcrição

2) 2 jjl de ditiotreitol (£)ΰΤ) (100 som)

3) 0,6 pX RKasin (350 u/ml)

4) 1 /0. de cada nucleótido UTP, Ci'P, GTF (0,5 ^-)

5) 1 ^1 de T7 RNApolimerase (15 u/ml)

6) 10 >1 de plasmídio compreendendo 0 IL-2 cDI.À (1 ug/ynl)

7) 10 /1 £<-32_p] ATP (10 mCi/ml)

8) 10 pX de [>6-35| ATP (10 mCi/ml) A^ersham podem ser substituído por E^“52pJ ATP no passo prévio.

b) A mistura é incubada durante 1 hora a 37° 3·

c) 1 Jíl de DNase (livre de RNasej 1 /i/ml) é adicionado js e continua-se a incubação durante 15 minutos a 57°C·

d) RHà é extraído como abaixo se descreve:

;3.' < ¹ t'r

1) 20 /il de fenol clorofórmio (1;1) são adicionados, seguidos da operação de mistura através de forte agitação e centrifugação, durante 2 minutos numa centrífuga Eppedorf.

2) A fase (aquosa) superior é cuidadosamente recolhi da.

3) A fase inferior de fenol clorofórmio é lavada com

^jil de tampão Th: lOmM Tris-HCl pH 7,6, lmdí EDTA.

4) Apôs agitação forte a centrifugação durante 2 mi nu toa em uma centrífuga Eppendorf, a fase superior e recolhida e adiciona-se à fase aquosa pre ▼lamente recolhida.

5) Adicionam-se 40 1 de clorofórmio 'as fases aquo sas combinadas.

6) Após forte agitação e centrifugação durante 2 mi nutoa numa centrífuga Eppendorf, a fase superior é recolhida.

7) A fase inferior e extraída com 40 de tacpão TE, como se descreveu nas operações 5) e 4) acima referidas.

8) 8 jaI de NaOAc 3 ii de pH 5»1 e adiciona-se 2,5 voJ de etanol absoluto à fase aquosa combinada.

9) A solução é deixada durante 20h (sem luz) a -2C°C e durante 2h a -70°C.

10) Centrifuga-se durante 30 minutos a 4°d numa centrífuga Eppendorf à rotação de 15 COO rpm.

11) Lava-se a pelete com 1 ml de etanol a 70/·

12) Seca-se a pelete em vácuo.

13) Bessuspende-se a pelete em 100 yil de tampêo nd compreendendo: 10 mM Tris-HCl, pH 7«6, 1 nu ^UTA, 0,1 MNaCl e 20 _/og/ml RKA de h. coli kRE 60C (Boet ringer).

14) Aplica-se a uma coluna com 1 ml de Sephaaex G-50 feita com uma seringa de 2 ml e equilibrada com tampão T4N.

15) Oentrifuga-se o conteúdo da coluna durante 5 mi nu

tos 1 000 rpm buba centrífuga de células e reco lhe-ae o líquido num tubo.

16) Faz-se uma toma de 1 p. (amostra) para ácido tri cloroacético a 10% arrefecido com gelo e determina-se a radioactividade precipitável.

17) Uma boa preparação origina 3 - 10 x 10^ cpm/ 1.

Exemplo 6 - Preparação da ribo-amostra para IFiHí

A riboamostra de expressão de genes de IFN-}f foi sintetizada seguindo a técnica descrita no Exemplo 5· 0 IFN-ft cDNA foi extraído do plasmídio plill-SV-y com Bam il (Devos, R., Cheroutre, H., Taya, Y., Degrave, Λ ., KeuverswyxL, Η. Ϊ., Fiers, W. Nucl. Acids Res. 10 (1982) p. 248?) e inse rido num pGíia-3 no sítio de BAíá Hl.

A orientação em que a transcrição feita a partir do promotor T? origina a selecção do desejado cordão de ια-,Α, foi a escolhida.

Exemplo 7 ~ Hibridização do filtro de nitrocelulose

1) Os filtros de nitrocelulose são pre-hibridizados nua saco de plástico selado durante 4h a 6O°C. 0 tampão de pre-hibridização compreende:

25% formamido

10% sulfato de dextrano (5,000 mol em peso)

1% SDS i

miá Tris-HCl pH 7,5

100 fâ/nl DRA de esperma de salmão que foi fervido durante 10 minutos e rapidamente arrefecido

100 ^ug/ml de RRAt (E. coli mRE600)

0,7 M NaCl.

2) Para a hibridização adicionam-se:

5x10 cpm/ml da riboamostra (veja acima) x 1

²⁰

Solução de Denhardt: 0,02% (p/v) de Ficoll, 0,02;. (p/v) polivinilo-pirrolidone, 0,02% (p/v) de 33A fracção V (Signa)

100 jÀg/ml RNAt (S. coli MRE600)

Incuba-se durante 16 a 18 horas, mas não mais, a 60°0

3) Após hibridização, os filtros são lavados;

1. Duas vezes com 2 x SSC (500 ml) à temperatura am biente durante 15 minutos

2. Duas vezes com 2 x SSG, 1% SDS (500 ml) a 68° J durante 50 minutos

5. Uma vez com 0,2 x SSO, 0,2% SDS (500 ml) a o8°0 durante 50 minutos.

Os filtros são secos e expostos à película de raios-Σ durante 5 a 25 horas à temperatura de -70°c.

Claims

A expressão transitória destes genes pode atingir o pico ao fim de 16 a 20 horas, dependendo do dador. formal mente estes valores devem ser de 3 a 10; se for inferior, isso quer dizer que os genes estão altamente activAdos ou que falharam a responder à indução. Estas possibilidades po dem ser distinguidas no passo (c) abaixo.

(c) Superindutibilidade por ciclo-heximida:

4A/3A, 4B/3B

A fracção demonstra o potencial da expressão lo gene. Normalmente, esta razão deve ser consideravelmente ma.or do que 1 (1,3 - 5 °^u mais). Se não, isso indica que ou a expressão básica é muito alta, caso em que a razão 4A/1A, 4B/ /1B deve ser próxima de 1, ou, alternativamente, a expressão do gene induzido é muito alta e incontrolado, caso em que a fracção 3A/1A e 3B/1B deve ser elevada.

(d) Superindutibilidade por irradiação-

5A/3A, 5B/3B

Normalmente, (1,5 - 3).

esta fracção deve ser maior do que 1

Normalmente

Estes valores medem a ras T regula para baixo a expressão de genes IL-2 e IFE-Jf: o último gene è mal8 fortemente regulado desta maneira.

to mais elevado forem estas relações, mais intensa e a regu lação para baixo.

a razão 5B/3B excede a razão 3a/3A.

I extensão à qual as células supreâsoqua; 1

I:

ia. - Método para detectar a expressão de genes biorreguladores em microculturas de células eucariéticas, caracterizado pelo facto de compreender as fases que consis tem em:

a) iaolar-se e cultivar-se as referidas células em con dições que provocam a expressão de, pelo mmos, um dos mencionados genes;

b) efectuar-se a lise das citadas culturas com cloridri. to de guanidínio;

c) precipitar-se selectivamente ácido ribonucleico por adição à preparação de células homogeneizadas de solução de acetato de sádio ou de acetato de potássio seguida por etanol absoluto;

d) recuperar-se a provocar-se a formação de manchas de RKA numa matriz de suporte;

e) hibridar-se o RNA. recuperado e manchado com uma riboamostra marca com pelo menos um dos referidos genes; e

f) determinar-se quantitativamente a extensão da ligação da mencionada riboamostra marcada com o citado í?KA manchado.
2ê. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a referida operação de lise b) se realizar por adição de tiocianato de guanidínio e a mencionada precipitação selectiva na operação c) se efectuar por adição de cloreto de lítio seguida por solução de acetato de sódio ou de acetato de potássio e etanol absoluto.
3é. - Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pulo facto de o gene biorregulador ser escolhido do grupo que compreende os genes que codificam para

08 interferães interleucinas, factores de necrose de tumoren e factores de crescimento.
4fl. - Método de acordo com a reivindicação
5, caracterizado pelo facto de as células encariéticas sereia escolhidas do grupo que compreende linfécitos, monécitos, fibroblastoa, astrócitos, células endoteliais, células ?liais, queratinócitos e plaquetas.

- Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de o composto que provoca a citada expressão ser um composto escolhido do grupo que compreende fito-hemaglutinina, concanavalina A, suas combinações apropriadas, com ou gama.

ciclo-heximida ou as sem irradiação co.. raie s
6«. - Método de acordo com a reivindicação 5, caracterisado pelo facto de a referida ribo-amostra ser marca da com um grupo químico isotépico ou não isotópico detectável.
7&. - Método para detectar a presença de x. A trani ladével para pelo menos uma citoquina, caracterizado pelo facto de compreender as operações que consistem em

a) obter-se uma amostra de pelo menos 10 milimetros ue sangue periférico;

b) isolarem-se e desenvolverem-se pelo menos 4 culturas de cerca de 1 x 10 células de linfócitos;

c) Induzir as mencionadas células a produzir pelo menos uma citoquina;

d) realizar-se a lise das células assim induzidas com cloridrato de guanidínio 7,5 molar;

e) precipitar-se o RKA do lisado de células homogenei- 24 - zado, à temperatura de -20°C, adicionando sais até s· obter a concentração final 0,1 molar de acetato de sódio ou de acetato de potássio seguidos por eta nol absoluto;

f) centrifugar-ee e recuperar-se RKA sob a forma essen cialmente purificada;

g) realizar-se o manchamento de KRA numa matriz de suporte;

h) hibridar-se RM com uma ribo-amostra marcada especí fica para, pelo menos, uma citoquina; e

i) medir-se num autoleitor a absorvância de película escurecida por manchas individuais dos filtros de nitrocelulose para determinar a presença e quantifi car a quantidade do referido RKA.
8®. - Létodo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de a lise das mencionadas células in duzidas na operação d) se fazer com tiocianato de guanicínio 5 molar e a precipitação do citado RKA. da operação e) se efectuar por adição de solução de cloreto de lítio 5»5 molar seguida por acetato de sódio ou acetato de potássio 0,3 molar e por etanol absoluto.
9®. - .'étodo de acordo com as reivindicações 7,ou 8, caracterizado pelo facto de a referida citoquina ser um polipáptido escolhido do grupo que compreende IL-2 e IFN-y.
10®. - Método de acordo com a reivindicação >, ca racterizado pelo facto de, na fase c), as mencionadas células serem incubadas com 0,4% (em volume/'volume) de fito-hemaglutinina (PTLA) durante cerca de 16 horas, depois do que se adicionam 20 ^g/ml de ciclo-heximida e se continua a incubação durante mais 4 horas.
11®. - método de acordo com a reivindicação 9» ca racterizado pelo facto de, na fase c), as citadas células serem incubadas com 0,4% (em volume/volume) de PIIA sozinha ou seguida da irradiação por 1500 rad de radiação das referidas células para provocar a produção d.;, pelo menos, uma citoquina.
12®. - Método de acordo com as reivindicações 7 ou 8, caracterizado pelo facto de a mencionada ribo-umostra Ser marcada com um grupo químico isotépico ou não ijotópico detectével.
13®. - Método de acordo com as reivindicações 7 ou 8, caracterizado pelo facto de a detecção da citada cito quina permitir diagnosticar doenças virais, bacterianas, fún gicas, oncogenicas ou imunorregulatôrias.
14®. - Estojo de diagnóstico, caracterizado pelo facto de permitir realizar o método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 13·
15®. - Estojo para seguir a evolução de doenças, caracterizado pelo facto de permitir realizar o método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 13·