PT863912E - Novos suportes de polimero para a sintese do acido nucleico - Google Patents
Novos suportes de polimero para a sintese do acido nucleico Download PDFInfo
- Publication number
- PT863912E PT863912E PT96941507T PT96941507T PT863912E PT 863912 E PT863912 E PT 863912E PT 96941507 T PT96941507 T PT 96941507T PT 96941507 T PT96941507 T PT 96941507T PT 863912 E PT863912 E PT 863912E
- Authority
- PT
- Portugal
- Prior art keywords
- synthesis
- oligonucleotides
- amino
- organic polymer
- particles
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
- Polyoxymethylene Polymers And Polymers With Carbon-To-Carbon Bonds (AREA)
Description
DESCRICÀO “Novos suportes de polímero para a síntese do ácido nucleico”
Antecedentes do invento
Campo do invento O invento refere-se à síntese química de oligonucleótidos e a materiais e processos que são úteis nesta síntese.
Sumário da arte relacionada
Os oligonucleótidos tomaram-se ferramentas indispensáveis na biologia molecular moderna, sendo utilizados numa grande variedade de técnicas que vão desde os métodos de sondagem diagnóstica até PCR para inibição anti-sentido de expressão de gene. Esta ampla utilização dos oligonucleótidos deu lugar a uma procura crescente de métodos rápidos, baratos e eficazes para sintetizar oligonucleótidos. A síntese de oligonucleótidos para aplicação de anti-sentido e diagnóstico pode agora ser realizada rotineiramente. Ver, e.g., Methods in Molecular Biology. Vol. 20: Protocols for Oligonucleotides and Analoes. págs. 165-189 (S. Agrawal, Ed., Humana Press, 1993); Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach. págs. 87-108 (F.Eckstein, Ed., 1991); e Uhlmann e Peyman, supra. Agrawal e Iyer, Curr. Op. in Biotech. 6: 12 (1995); e Antisense Research and Applications (Crooke and Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, 1993). Os primeiros ensaios de síntese incluem as químicas do fosfodiéster e do fosfotriéster. Khorana et al., J. Molec. Biol. 72: 209 (1972) descrevem a química do fosfodiéster para a síntese de oligonucleótidos. Reese, Tetrahedron Lett. 34: 3143-3179 (1978), descreve a química do fosfotriéster para a síntese de oligonucleótidos e polinucleótidos. Estes primeiros ensaios abriram largamente o caminho para os ensaios mais eficazes da fosforamidita e do H-fosfonato para realizar a síntese. Beaucage e Caruthers, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862 (1981) descrevem o uso de fosforamiditas de desoxinucleósido na síntese de polinucleótidos. Agrawal e Zamecnik, patente U.S. N° 5,149,798 (1992), descrevem a síntese optimizada de oligonucleótidos pelo ensaio do H-fosfonato.
85 476
ΕΡ Ο 863 912/PT 2
Ambos estes ensaios modernos têm sido usados para sintetizar oligonucieótidos que têm uma diversidade de ligações intemucleótido modificadas. Agrawal e Goodchild, Tetrahedron Lett. 28: 3539-3542 (1987), ensinam a síntese de metilfosfonatos de oligonucleótido usando a química da fosforamidita. Connolly et al, Biochemistry 23: 3443 (1984), descrevem a síntese de fosforotioatos de oligonucleótido usando a química da fosforamidita. Jager et al, Biochemistty 27: 7237 (1988), descrevem a síntese de fosforamidatos de oligonucleótido usando a química da fosforamidita. Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 7079-7083 (1988), descrevem a síntese de fosforamidatos e fosforotioatos de oligonucleótido usando a química do H-fosfonato. A síntese em fase sólida de oligonucieótidos por qualquer dos ensaios conhecidos envolve correntemente o mesmo protocolo generalizado. Em resumo, este ensaio compreende a ancoragem do 3’-mais nucleósido num suporte sólido funcionalizado com partes amino e/ou hidroxilo e a subsequente adição dos nucleósidos adicionais de maneira escalonada. As ligações intemucleótido desejadas são formadas entre o grupo funcional 3’ (e.g., grupo fosforamidita) do nucleósido que entra e o grupo hidroxilo 5’ do nucleósido 5’-mais do oligonucleótido nascente unido ao suporte.
Porém, é ainda necessário um refinamento das metodologias, particularmente quando se faz a transição para uma síntese em grande escala (10 μηιοίε para 1 mmole e mais). Ver Padmapriya et al, Antisense Res. Dev. 4: 185 (1994). Já foram relatadas diversas modificações dos métodos normais da fosforamidita para facilitar a síntese e o isolamento de oligonucieótidos. Ver, e.g., Padmapriya et al, supra-, Ravikumar et al, Tetrahedron 50: 9255 (1994); Theisen et al, Nucleosides & Nucleotides 12: 43 (1994); e Iyer et al, Nucleosides & Nucleotides 14: 1349 (1995) (Kuijpers et al, Nucl. Acids Res. 18: 5197 (1990); e Reddy et al., Tetrahedron Lett. 35: 4311 (1994).
Uma limitação da síntese em fase sólida reside na natureza do suporte em fase sólida sobre o qual o oligonucleótido é sintetizado. Tem sido descrita uma diversidade de materiais de suporte sólidos para a síntese de oligonucieótidos em fase sólida dos quais o mais importante é o vidro de poro controlado (CPG). (Ver, e.g., Pon, Methods in Molec. Biol 20: 465 (1993)). Infelizmente o CPG apresenta certas limitações que o impedem de ser um material de suporte ideal. Ver, e.g., Ron et al., Biotechniques 6: 768 (1988); McCollum et al., Nucleosides and Nucleotides 6: 821 (1987); Bardella et al., Tetrahedron Lett. 3U 6231-6234 (1990). Por exemplo, o CPG é instável sob o procedimento do hidróxido de amónio normal que é usado para desproteger o oligonucleótido e separar o mesmo do suporte
85 476
ΕΡΟ 863 912/PT sólido. Além disso a síntese de oligonucleótidos em que se utiliza o CPG como suporte sólido tem como resultado elevados níveis de contaminantes n-1 no produto de síntese.
Para resolver estes problemas foram feitas várias tentativas para desenvolver suportes de polímero para substituir o CPG. Ver, e.g., Gao et al., Tetrahedron Lett. 32: 5477-5479 (1991); The Gene Assembler™, A Fullv Automated DNA Svnthesizer. Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suécia (1986). A utilização de suportes orgânicos neste contexto foi explorada. Reddy et al., Tetrahedron Lett. 35: 5771-5774 (1994) descreve um suporte orgânico baseado em Fractogel® (“Toyopearl”, TosoHaas, Philadelphia, PA). O Fractogel, porém tem limitações inerentes como suporte para a síntese de oligonucleótidos, devido à sua densidade baixa quando acamado em acetonitrilo e ao seu limitado volume de poro por unidade de volume do leito. Embora seja desejável substituir o CPG por um suporte que não tenha as suas limitações, nenhum dos suportes de polímero desenvolvidos até agora proporcionar a eficácia que é proporcionada pelo CPG.
Existe, portanto, a necessidade de suporte de polímero para síntese de oligonucleótidos que proporcionem a eficácia do CPG mas que não apresentem os problemas de instabilidade ou de contaminação n-1 inerentes ao CPG.
Breve sumário do invento O invento proporciona suportes de polímero orgânico passivado, processos para a sua preparação e processos para a sua utilização na síntese de oligonucleótidos que permitem a síntese em fase sólida altamente eficaz de oligonucleótidos. A eficácia da síntese proporcionada quando se utilizam os suportes de polímero orgânico de acordo com o invento é pelo menos tão boa como a proporcionada pelo vidro de poro controlado (CPG). Ao contrário do CPG, os suportes de polímero orgânico de acordo com o invento são altamente estáveis sob as condições do hidróxido de amónio normais utilizadas para desproteger os oligonucleótidos e separá-los do suporte sólido. Além disso, a síntese de oligonucleótido usando o suporte de polímero orgânico de acordo com o invento tem como resultado uma produção muito reduzida de oligonucleótido com contaminante n-1.
Num primeiro aspecto o invento proporciona um suporte de polímero orgânico passivado para a síntese em fase sólida de oligonucleótidos. O suporte de polímero orgânico passivado de acordo com o invento compreende uma pluralidade de partículas microscópicas. Cada partícula tem grupos amino e/ou hidroxilo unidos covalentemente à partícula. Cada partícula tem ainda nucleósidos unidos covalentemente a alguns dos grupos
85 476 ΕΡ Ο 863 912 /PT 4
amino e/ou hidroxilo. Pelo menos alguns dos grupos amino e/ou hidroxilo que não estão ligados covalentemente a nucleósidos estão unidos a grupos aroílo passivadores e hidrófobos.
Num segundo aspecto, o invento proporciona um processo para passivar um suporte de polímero orgânico para a síntese de oligonucleótidos. O processo de acordo com o invento inclui a introdução de grupos aroílo passivadores e hidrófobos no local dos grupos amino e/ou hidroxilo livres que estão unidos covalentemente às partículas que constituem o suporte de polímero orgânico. Os suportes de polímero orgânico para a síntese de oligonucleótido têm grupos amino e/ou hidroxilo unidos covalentemente às partículas que constituem o suporte. Alguns dos grupos amino e/ou hidroxilo estão unidos covalentemente a nucleósidos ao passo que outros permanecem como grupos amino e/ou hidroxilo livres. A presença destes grupos amino e/ou hidroxilo empresta em caracter hidrófilo às partículas. No processo de acordo com o invento, o caracter hidrófilo das partículas é diminuído ligando covalentemente grupos aroílo passivadores e hidrófobos aos grupos amino e/ou hidroxilo. A passivação das partículas desta maneira tem como resultado uma eficácia muito melhorada da síntese de oligonucleótidos.
Num terceiro aspecto, o invento proporciona um processo aperfeiçoado para a síntese de oligonucleótidos em fase sólida. Neste processo aperfeiçoado de acordo com o invento, o aperfeiçoamento consiste em realizar a síntese em fase sólida no suporte de polímero orgânico passivado de acordo com o invento. Este processo de síntese de oligonucleótidos de acordo com o invento produz oligonucleótidos pelo menos tão eficazmente como os processos que utilizam o CPG, mas com contaminação por n-1 muito reduzida e sem quebra química do suporte sólido.
Os suportes de polímero orgânico e o processo para a sua utilização de acordo com o invento são úteis para sintetizar oligonucleótidos numa escala que vai desde a pequena escala laboratorial até à grande escala industrial. Como tal, os suportes de polímero orgânico e o processo para a sua utilização de acordo com o invento podem ser usados para fornecer oligonucleótidos para fins de investigação, para fins de diagnóstico e para fins terapêuticos usando o ensaio anti-sentido.
Breve descrição dos desenhos
A Figura 1 mostra a área superficial dentro de um poro de uma partícula que é compreendida por um suporte de polímero orgânico de acordo com o invento. O painel A
85 476 ΕΡ Ο 863 912/PT 5
mostra a superfície antes da adição dos nucleósidos. O painel B mostra a superfície depois da adição dos nucleósidos. O painel C mostra a superfície após passivação com grupos benzoílo. DMT representa um grupo dimetoxitritilo.
Descrição detalhada de concretizações preferidas O invento refere-se à síntese química de oligonucleótidos e a materiais e processos que são úteis nesta síntese. As patentes e publicações identificadas nesta especificação estão dentro dos conhecimentos dos peritos neste domínio. O invento proporciona suportes de polímero orgânico passivado, processos para a sua preparação e processos para a sua utilização na síntese de oligonucleótidos para permitir uma síntese em fase sólida altamente eficaz de oligonucleótidos. A eficácia da síntese proporcionada quando se utilizam os suportes de polímero orgânico de acordo com o invento é pelo menos tão boa como a proporcionada pelo vidro de poro controlado (CPG). Ao contrário do CPG, os suportes de polímero orgânico de acordo com o invento são altamente estáveis nas condições de hidróxido de amónio normais usadas para desproteger os oligonucleótidos e separar os mesmos do suporte sólido. Além disso, a síntese de oligonucleótidos em fase sólida utilizando os suportes de polímero orgânico de acordo com o invento tem como resultado uma produção muito reduzida de oligonucleótido com contaminante n-1.
Num primeiro aspecto, o invento proporciona um suporte de polímero orgânico para a síntese em fase sólida de oligonucleótidos. O suporte de polímero orgânico de acordo com o invento compreende uma pluralidade de partículas microscópicas de polímero orgânico passivado. Preferivelmente as partículas são geralmente esféricas e têm cerca de 10 microns a cerca de 100 microns de diâmetro. Numa concretização particularmente preferida, as partículas têm cerca de 20 a cerca de 60 microns de diâmetro. Preferivelmente, as partículas são porosas para aumentar a área da superfície disponível para ligação e síntese do oligonucleótido. Preferivelmente, o tamanho dos poros vai de cerca de 50 a cerca de 4000 angstrom medidos por porosimetria de mercúrio. Mais preferivelmente, o tamanho dos poros vai de cerca de 200 a cerca de 500 angstrom. Um exemplo de uma partícula de pré-passivação particularmente preferida é a partícula Toyopearl® AF AMINO-550F, produzida por TosoHaas (Philadelphia, PA). Esta partícula é um copolímero de metacrilato e etilenoglicol, tem um tamanho de poro de cerca de 300 angstrom, um diâmetro médio de
85 476 ΕΡ Ο 863 912/PT 6
20-60 microns, uma densidade de 0,36 g/ml após embebimento em acetonitrilo e um volume de poro de 0,54 ml/1 ml de volume de leito. O material para a partícula base é preferivelmente um polímero ou copolímero que compreende acrilato, metacrilato ou poliestireno. Os copolímeros preferidos incluem, mas não se limitam a, metacrilato/etilenoglicol (Toyopearl, TosoHaas, Philadelphia, PA), dimetacrilato/pentaeritritol, poliestireno/divinilbenzeno, copolímeros de dimetacrilato de pentaeritritol e um monómero de metacrilato, copolímeros de um monómero hidrófilo escolhido num grupo constituído por metacrilatos de hidroxialquilo, metacrilatos de aminoalquilo, N-vinilpirrolidona, acrilonitrilo, metacrilonitrilo, ácido acrílico, ácido metacrílico e suas misturas, com um monómero essencialmente hidrófilo escolhido no grupo constituído por dimetacrilato de etileno, diacrilato de etileno, metilenobisacrilamida, dietilenoglicolmetacrilamida, poli(etilenoglicol)metacrilamida, diacrilato de neopentilglicol, dimetacrilato de neopentilglicol, trimetacrilato de trimetilolpropano, divinilbenzeno e suas misturas, copolímeros de monómeros polares tais como acrilatos de hidroxialquilo e metacrilatos de hidroxialquilo, com monómeros não polares tais como acrilatos e metacrilatos de alquilo, juntamente com agentes de reticulação tais como diacrilatos e metacrilatos de alquileno e homopolímeros de dimetacrilato de pentaeritritol. Estes e outros polímeros orgânicos apropriados são conhecidos na arte e podem ser sintetizados por técnicas reconhecidas da arte, tais como as ensinadas pelas patentes U.S. Nos 4,224,415, 4,256,840, 4,297,220, 4,501,816, 4,246,362, 4,184,020, 4,135,892 e 3,925,267.
Cada partícula tem grupos amino e/ou grupos hidroxilo unidos covalentemente à superfície da partícula, incluindo áreas de superfície dentro dos poros. Para as finalidades do invento, qualquer área que esteja nos, ligada aos, ou dentro dos limites da partícula e em comunicação fluida com uma área extrapartícula é considerada como fazendo parte da superfície da partícula. A funcionalização de partículas de polímero orgânico com grupos amino e/ou hidroxilo é bem conhecida na arte e está descrita, por exemplo, nas patentes U.S. Nos 4,425,005 e 5,030,352. Além disso, estas partículas funcionalizadas com amino e/ou hidroxilo estão disponíveis no comércio, provenientes de várias fontes que incluem a TosoHaas (Philadelphia, PA) e a Merck (Darmstadt, Alemanha).
Cada partícula tem também nucleósidos unidos covalentemente a alguns dos grupos amino e/ou hidroxilo. O carregamento dos nucleósidos sobre as partículas pode ser realizado como aqui se descreve ou por qualquer dos procedimentos que são bem conhecidos na arte (ver, e.g., Reddy et al., Tetrahedron Lett. 35: 5771-5774 (1994); Bhongle et al, Synthetic Communications 25: 3671-3679 (1995)). Contudo, com densidade de carregamento de
85 476
ΕΡ Ο 863 912/PT nucleósidos elevadas, não é possível ter cada grupo amino e/ou hidroxilo ligado a um nucleósido. Consequentemente, alguns dos grupos amino e/ou hidroxilo permanecerão livres, o que confere um caracter hidrófilo à superfície da partícula. Um exemplo disto está ilustrado na figura 1B.
Uma característica única das partículas de polímero orgânico de acordo com o invento é que são passivadas, i.e., pelo menos alguns dos grupos amino e/ou hidroxilo que não estão unidos covalentemente aos nucleósidos estão unidos covalentemente a grupos aroílo passivadores e hidrófobos. Os grupos aroílo preferidos para suportes de polímero de acordo com este aspecto do invento incluem os que têm a estrutura I: em que existem 0 a 3 grupos R, e cada grupo R é independentemente um grupo alquilo inferior, um grupo fenilo, um halogéneo ou um grupo nitro. A passivação com tal estrutura reduz o caracter hidrófilo da superfície da partícula. A superfície de uma concretização de tal partícula está ilustrada na figura 1C. Preferivelmente, dos grupos amino e/ou hidroxilo que não estão unidos covalentemente a nucleósidos, cerca de 50% a cerca de todos estes grupos estão unidos covalentemente a um grupo aroílo passivador e hidrófobo e, mais preferivelmente, cerca de 90% a cerca de todos.
Num segundo aspecto, o invento proporciona um processo para passivar um suporte de polímero orgânico para a síntese de nucleósidos. O processo de acordo com o invento inclui a introdução de grupos aroílo passivadores e hidrófobos no local dos grupos amino e/ou hidroxilo livres que estão unidos covalentemente às partículas que constituem o suporte de polímero orgânico. Os grupos aroílo preferidos para o processo de acordo com este aspecto do invento incluem os que têm a estrutura I:
O
85 476 ΕΡ Ο 863 912/ΡΤ 8 na qual existem Ο a 3 grupos R, e cada grupo R é independentemente um grupo alquilo inferior, um grupo fenilo, um halogéneo ou um grupo nitro.
Os suportes de polímero orgânico para a síntese de oligonucleótidos têm grupos e/ou hidroxilo unidos covalentemente às partículas que constituem o suporte. Alguns dos grupos amino e/ou hidroxilo estão unidos covalentemente a nucleósidos, ao passo que outros permanecem como grupos amino e/ou hidroxilo livres. A presença destes grupos amino e/ou hidroxilo confere um carácter hidrófilo às partículas. No processo de acordo com o invento o caracter hidrófilo das partículas é reduzido ligando covalentemente grupos aroílo passivadores e hidrófobos aos grupos amino e/ou hidroxilo. Preferivelmente cerca de 50% a cerca de todos estes grupos amino e/ou hidroxilo são unidos covalentemente a um grupo aroílo passivador e hidrófobo e, mais preferivelmente, cerca de 90% a cerca de todos. A passivação das partículas desta maneira tem como resultado uma eficácia muito melhorada da síntese de oligonucleótidos. O processo de acordo com este aspecto do invento compreende o contacto de um agente passivador apropriado com uma partícula de suporte de polímero orgânico que tem uma superfície que tem, simultaneamente, nucleósidos unidos covalentemente e grupos amino e/ou hidroxilo unidos covalentemente. Um reagente passivador apropriado é um reagente que é capaz de fazer com que um grupo aroílo passivador e hidrófobo fique ligado covalentemente a grupos amino e/ou hidroxilo livres na superfície da partícula. Os reagentes passivadores preferidos incluem anidridos ácidos de grupos aroílo ou cloretos de aroílo, incluindo anidridos ácidos ou cloretos de aroílo de grupos aroílo que possuem a estrutura I:
O
na qual existem 0 a 3 grupos R, e cada grupo R é independentemente um grupo alquilo inferior, um grupo fenilo, um halogéneo ou um grupo nitro. Numa concretização particularmente preferida do processo de acordo com este aspecto do invento, o reagente passivador é uma mistura compreendendo anidrido benzóico e dimetilaminopiridina.
85 476 ΕΡ Ο 863 912/PT 9
Num terceiro aspecto, o invento proporciona um processo aperfeiçoado para a síntese de oligonucleótidos em fase sólida. Neste processo aperfeiçoado de acordo com o invento, o aperfeiçoamento consiste em realizar a síntese em fase sólida sobre o suporte de polímero orgânico passivado de acordo com o invento. Em certas concretizações preferidas do processo de acordo com este aspecto do invento, esta síntese é realizada usando os ensaios da fosforamidita, H-fosfonato ou fosfotriéster. Este processo de síntese de oligonucleótidos de acordo com o invento produz oligonucleótidos pelo menos tão eficazmente como os processos que utilizam o CPG, mas com uma contaminação pelo subproduto n-1 muito reduzida e sem quebra química do suporte sólido.
Os suportes de polímero orgânico e o processo para a sua utilização de acordo com o invento são úteis para sintetizar oligonucleótidos numa escala que vai desde a pequena escala laboratorial até à grande escala industrial. Assim, os suportes de polímero orgânico e o processo para a sua utilização de acordo com o invento podem ser utilizados para fornecer oligonucleótidos para fins de pesquisa, para fins de diagnóstico e para fins terapêuticos utilizando o ensaio anti-sentido.
Os exemplos seguintes destinam-se a ilustrar mais certas concretizações preferidas do invento e não pretendem ter natureza limitativa.
Exemplo 1
Derivação do nucleósido e passivacão de suportes sólidos de polímero orgânico
Uma mistura de hidroxibenzotriazolo (0,1 g), 1,3-diisopropilcarbodiimida (1 ml) e piridina/acetonitrilo a 5% (100 ml) foi agitada manualmente até se obter uma solução transparente. À solução foram adicionados 20 g de contas secas de polímero orgânico AF AMINO-550F, derivadas com grupos amino até uma densidade de grupos de 244-400 micromoles/g (Toyopearl, TosoHaas, Philadelphia, PA). Depois, adicionaram-se 1,5 g de ácido DMT-timidina-succínico e a mistura foi agitada num agitador orbital a 170 rpm durante cerca de seis horas à temperatura ambiente. A mistura foi depois filtrada com um funil de Buchner e as contas foram lavadas cinco vezes com piridina/acetonitrilo a 5%. Foi adicionada uma solução de 15 g de anidrido benzóico e 3 g de dimetilaminopiridina em 100 ml de piridina/acetonitrilo a 20%, e a mistura foi agitada num agitador orbital a 170 rpm durante a noite à temperatura ambiente. A mistura foi depois filtrada num funil Buchner e lavada cinco vezes com 100 ml de 5% de piridina/acetonitrilo. A seguir, as contas foram tratadas com uma solução de anidrido acético a 10%, N-metilimidazolo a 10%, 20% de piridina em tetra-hidrofurano durante a noite à temperatura ambiente. A mistura foi filtrada
85 476
ΕΡ Ο 863 912/PT 10 num funil Buchner e lavada cinco vezes em 100 ml de acetonitrilo + 100 ml de cloreto de metileno, e depois as contas foram secas sob vácuo durante a noite. O nível de carregamento de nucleósido foi determinado usando um ensaio convencional de catião de DMT (Gait, Oligonucleotide Svnthesis, A Practical Approach, pág. 107, IRL Press (1984). Após embebimento em acetonitrilo, verificou-se que as contas passivadas eram aproximadamente 10% mais densas que as contas preparadas de acordo com o Exemplo 2 a seguir.
Exemplo 2
Derivatizacão do nucleósido de suportes sólidos de polímero orgânico sem passivacão
Para preparar suportes sólidos de polímero orgânico não passivados, foi realizado o procedimento do Exemplo 1, exceptuando o passo de adicionar anidrido benzóico e dimetilaminopiridina e a subsequente agitação, que foram omitidos.
Exemplo 3 Síntese de oligonucleótidos
Para testar a eficácia de vários materiais sólidos de suporte para a síntese de oligonucleótidos, foram executadas as sínteses seguintes. Em cada síntese, foi preparado o mesmo fosforotioato de oligonucleótido. O oligonucleótido escolhido para a síntese foi o GEM®-91, um oligonucleótido bem caracterizado, complementar da região de iniciação de translação do gene gag do vírus da imunodeficiência humana (ver Agrawal e Tang, Antisense Research and Development 2: 261-266 (1992)). Todas as sínteses foram realizadas num sintetizador OligoPilot™ II (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia) com uma coluna de camada fixa de 12 ml. Em todas as sínteses, foram usadas fosforamiditas de cianoetilo normais num excesso de 1,5 vezes. Todas as sínteses foram realizadas na escala de 300 a 400 micromoles.
Os produtos de síntese foram ensaiados quanto à pureza por cromatografia de" permuta iónica (Metelev e Agrawal, Anal. Biochem. 200: 342-346 (1992)) e electroforese capilar em gel (Andrus, In Methods in Molecular Biology, Vol. 26, Agrawal (Ed.), 1994, págs. 277-300). O teor de fosfato foi determinado por cromatografia de permuta iónica (Bergot e Egan, J. Chromatog. 35: 599 (1992)).
Os resultados estão expostos na seguinte Tabela I. 11 85 476
ΕΡ Ο 863 912/PT
Tabela I Síntese do GEM91 utilizando suporte de polímero Síntese n° Carregamento ‘BA’ Tratado IEX (%) PO (%) CE(n)(%) CE(n-l)(%) 134-48 98,6 pmole/g Não 39,0% 1,0% 38,0% 5,4% 134-91 77,3 pmole/g Não 25,7% 1,3% NA NA 134-64 74,4 pmole/g Sim 78,1% 0,4% 80,0% 1,8% 134-44 88,2 μηιοίε^ Sim 78,7% 0,46% 79,7% 1,8% 134-50 88,2 pmole/g Sim 79,4% 0,36% 77,5% 3,3% 134-62 134,4 pmole/g Sim 67,4% 0,33% 73,5% 2,1% 134-33(CPG) 82,0 pmole/g NA 78,8% 0,40% 66,8% 5,2%
Estes resultados demonstram que a níveis semelhantes de carregamento de nucleósido, a síntese de oligonucleótido realizada em suportes de polímero orgânico de acordo com o invento é pelo menos tão eficaz como a síntese semelhante realizada sobre CPG. Além disso, estes resultados mostram que a síntese realizada sobre suportes de polímero orgânico de acordo com o invento tem como resultado uma contaminação muito reduzida com o subproduto n-1. Mais, estes resultados mostram que a síntese usando partículas de suporte passivadas de acordo com o invento é muito mais eficaz que a síntese semelhante usando partículas de suporte de polímero orgânico não passivadas.
Os peritos na arte reconhecerão que muitos equivalentes dos produtos e processos de acordo com invento podem ser conseguidos, introduzindo alterações não essenciais nestes produtos e processos. As reivindicações seguintes são destinadas a abranger tais equivalentes.
Lisboa, ,25. Ή 2000
Por HYBRTOON, INC. O AGENTE OFICIAL -
CUMHÁ FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. fes Flores, 74-4.® leoo LISBOA mo
Claims (9)
- 1 - Suporte de polímero para a síntese em fase sólida de oligonucleótidos, compreendendo este suporte uma pluralidade de partículas microscópicas de polímero orgânico passivadas, no qual cada partícula tem grupos amino e/ou grupos hidroxilo covalentemente unidos à superfície da partícula, no qual cada partícula tem ainda nucleósidos unidos covalentemente a alguns grupos amino e/ou hidroxilo e no qual pelo menos alguns dos grupos amino e/ou hidroxilo que não estão unidos covalentemente a nucleósidos estão unidos covalentemente a grupos aroílo passivadores e hidrófobos.
- 2 - Suporte de polímero de acordo com a reivindicação 1, no qual as partículas têm um diâmetro de cerca de 10 microns a cerca de 100 microns.
- 3 - Suporte de polímero de acordo com a reivindicação 2, no qual as partículas são porosas, tendo um tamanho de poro da ordem de cerca de 50 a cerca de 4000 angstrom.
- 4 - Suporte de polímero de acordo com a reivindicação 3, no qual as partículas têm cerca de 20 a cerca de 60 microns de diâmetro, e um tamanho de poro da ordem de cerca de 200 a cerca de 500 angstrom.
- 5 - Suporte de polímero de acordo com a reivindicação 4, no qual o grupo aroílo é um grupo benzoílo.
- 6 - Suporte de polímero de acordo com a reivindicação 5, no qual as partículas são de um copolímero de metacrilato e etilenoglicol.
- 7 - Processo para passivar um suporte de polímero orgânico para a síntese de oligonucleótidos, compreendendo este processo o contacto de um agente de passivação apropriado com uma partícula de suporte de polímero orgânico, que tem uma superfície que tem, simultaneamente, nucleósidos unidos covalentemente e grupos livres amino e/ou hidroxilo unidos covalentemente, introduzindo assim grupos aroílo passivadores e hidrófobos no local dos grupos livres amino ou hidroxilo.
- 8 - Processo de acordo com a reivindicação 7, no qual o agente passivador é um anidrido ácido de um grupo aroílo ou um cloreto de aroílo. 85 476 ΕΡ Ο 863 912/PT 2/2
- 9 - Processo aperfeiçoado para a síntese de oligonucleótidos em fase sólida, consistindo o aperfeiçoamento em realizar a síntese de oligonucleótidos em fase sólida sobre um suporte de polímero orgânico passivado de acordo com a reivindicação 1. Lisboa, 25. 5EI 2GuO Por HYBRIDON, INC. - O AGENTE OFICIAL - EMG.· ANTÓNIO I0Â0 KA CUNHA FERREIRA Δ§. Of. Pr. Ind. Boo d©s Flores, 74-4.® 1600 LISBOA
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/562,841 US5668268A (en) | 1995-11-27 | 1995-11-27 | Passivated polymer supports for nucleic acid synthesis |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PT863912E true PT863912E (pt) | 2000-12-29 |
Family
ID=24248010
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PT96941507T PT863912E (pt) | 1995-11-27 | 1996-11-27 | Novos suportes de polimero para a sintese do acido nucleico |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5668268A (pt) |
| EP (1) | EP0863912B1 (pt) |
| AT (1) | ATE195320T1 (pt) |
| AU (1) | AU1062997A (pt) |
| CA (1) | CA2238865A1 (pt) |
| DE (1) | DE69609725T2 (pt) |
| DK (1) | DK0863912T3 (pt) |
| ES (1) | ES2150702T3 (pt) |
| GR (1) | GR3034534T3 (pt) |
| PT (1) | PT863912E (pt) |
| WO (1) | WO1997019951A1 (pt) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5668268A (en) * | 1995-11-27 | 1997-09-16 | Hybridon, Inc. | Passivated polymer supports for nucleic acid synthesis |
| DE19943374A1 (de) * | 1999-09-10 | 2001-03-29 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zum Anbinden von Nukleinsäuren an eine Festphase |
| WO2001094366A1 (en) * | 2000-06-02 | 2001-12-13 | Blue Heron Biotechnology, Inc. | Methods for improving the sequence fidelity of synthetic double-stranded oligonucleotides |
| EP1322710B2 (en) * | 2000-09-29 | 2015-02-18 | Life Technologies Corporation | Modified carbocyanine dyes and their conjugates |
| US6932943B1 (en) | 2001-01-26 | 2005-08-23 | Third Wave Technologies | Nucleic acid synthesizers |
| US7435390B2 (en) * | 2001-01-26 | 2008-10-14 | Third Wave Technologies, Inc. | Nucleic acid synthesizers |
| US20030072689A1 (en) * | 2001-08-15 | 2003-04-17 | Third Wave Technologies, Inc. | Polymer synthesizer |
| US7709544B2 (en) * | 2005-10-25 | 2010-05-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Microstructure synthesis by flow lithography and polymerization |
| KR101556798B1 (ko) | 2006-10-05 | 2015-10-01 | 메사츄세츠 인스티튜트 어브 테크놀로지 | 고성능 분석을 위한 다중기능성 인코딩된 입자 |
| JP2009280544A (ja) * | 2008-05-26 | 2009-12-03 | Nitto Denko Corp | 核酸固相合成用担体 |
| US8431416B2 (en) | 2009-04-01 | 2013-04-30 | Becton, Dickinson And Company | Reactive heterocycle-substituted 7-hydroxycoumarins and their conjugates |
| JP5730311B2 (ja) | 2009-08-31 | 2015-06-10 | プロメガ コーポレイションＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | 反応性シアニン化合物 |
| CA2802059C (en) | 2010-06-07 | 2020-05-12 | Firefly Bioworks, Inc. | Nucleic acid detection and quantification by post-hybridization labeling and universal encoding |
| US8623324B2 (en) | 2010-07-21 | 2014-01-07 | Aat Bioquest Inc. | Luminescent dyes with a water-soluble intramolecular bridge and their biological conjugates |
| US9051441B2 (en) | 2012-03-29 | 2015-06-09 | Xerox Corporation | Process for chemical passivation of polymer surfaces |
| CN107873054B (zh) * | 2014-09-09 | 2022-07-12 | 博德研究所 | 用于复合单细胞核酸分析的基于微滴的方法和设备 |
| WO2017172608A1 (en) | 2016-03-28 | 2017-10-05 | Aat Bioquest, Inc. | Polyfluoreno[4,5-cde]oxepine conjugates and their use in methods of analyte detection |
| US11220628B2 (en) | 2019-02-20 | 2022-01-11 | Aat Bioquest, Inc. | Condensed polycyclic conjugated polymers and their use for biological detection |
| CN115280147A (zh) | 2020-01-30 | 2022-11-01 | 阿特生物探索公司 | 可紫外激发的基于聚芴的缀合物及其在分析物检测方法中的用途 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4458066A (en) * | 1980-02-29 | 1984-07-03 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
| US4638032A (en) * | 1983-12-12 | 1987-01-20 | Genetics Institute, Inc. | Magnetic particles as supports for organic synthesis |
| US5049656A (en) * | 1988-12-21 | 1991-09-17 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Sequential peptide and oligonucleotide syntheses using immunoaffinity techniques |
| US5262530A (en) * | 1988-12-21 | 1993-11-16 | Applied Biosystems, Inc. | Automated system for polynucleotide synthesis and purification |
| US5112962A (en) * | 1989-04-19 | 1992-05-12 | Northwestern University | Labile anchors for solid phase polynucleotide synthesis |
| US5204455A (en) * | 1989-06-15 | 1993-04-20 | Froehler Brian C | Monomethoxytrityl protected oligonucleotides bound to a solid support |
| US5470463A (en) * | 1992-06-19 | 1995-11-28 | Sepracor Inc. | Passivated porous supports and methods for the preparation and use of same |
| US5668268A (en) * | 1995-11-27 | 1997-09-16 | Hybridon, Inc. | Passivated polymer supports for nucleic acid synthesis |
-
1995
- 1995-11-27 US US08/562,841 patent/US5668268A/en not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-11-27 WO PCT/US1996/019050 patent/WO1997019951A1/en active IP Right Grant
- 1996-11-27 AT AT96941507T patent/ATE195320T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-11-27 DE DE69609725T patent/DE69609725T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1996-11-27 PT PT96941507T patent/PT863912E/pt unknown
- 1996-11-27 DK DK96941507T patent/DK0863912T3/da active
- 1996-11-27 AU AU10629/97A patent/AU1062997A/en not_active Abandoned
- 1996-11-27 EP EP96941507A patent/EP0863912B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-27 ES ES96941507T patent/ES2150702T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-27 CA CA002238865A patent/CA2238865A1/en not_active Abandoned
-
1997
- 1997-09-10 US US08/926,755 patent/US6392031B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-10-02 GR GR20000402224T patent/GR3034534T3/el not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK0863912T3 (da) | 2000-11-06 |
| EP0863912B1 (en) | 2000-08-09 |
| US6392031B1 (en) | 2002-05-21 |
| DE69609725T2 (de) | 2001-04-05 |
| WO1997019951A1 (en) | 1997-06-05 |
| ES2150702T3 (es) | 2000-12-01 |
| GR3034534T3 (en) | 2001-01-31 |
| ATE195320T1 (de) | 2000-08-15 |
| US5668268A (en) | 1997-09-16 |
| DE69609725D1 (de) | 2000-09-14 |
| AU1062997A (en) | 1997-06-19 |
| EP0863912A1 (en) | 1998-09-16 |
| CA2238865A1 (en) | 1997-06-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PT863912E (pt) | Novos suportes de polimero para a sintese do acido nucleico | |
| US5256775A (en) | Exonuclease-resistant oligonucleotides | |
| US6180770B1 (en) | Nucleic acid-containing polymerizable complex | |
| KR101221186B1 (ko) | 올리고머 합성용 중합체성 비드 | |
| US6140482A (en) | Primary phosphoramidate internucleoside linkages and oligonucleotides containing the same | |
| US5955599A (en) | Process for making oligonucleotides containing o- and s- methylphosphotriester internucleoside linkages | |
| US5554744A (en) | Method for loading solid supports for nucleic acid synthesis | |
| Scaringe | RNA oligonucleotide synthesis via 5′-silyl-2′-orthoester chemistry | |
| EP0925306B1 (en) | Solid phase synthesis | |
| US6692912B1 (en) | Nucleic acid-containing polymerizable complex | |
| EP0514513B1 (en) | Method and means for oligonucleotide synthesis | |
| WO1990015065A1 (en) | Exonuclease-resistant oligonucleotides and methods for preparing the same | |
| Muller et al. | Current strategies for the synthesis of RNA | |
| Beijer et al. | Synthesis and applications of oligoribonucleotides with selected 2′-O-methylation using the 2′-O-[1-(2-fluorophenyl)-4-methoxypiperidin-4-yl] protecting group | |
| WO2005077966A1 (en) | Substituted pixyl protecting groups for oligonucleotide synthesis | |
| JPH10508827A (ja) | ３’窒素含有ポリヌクレオチドの合成のための固体支持体試薬 | |
| Montserrat et al. | Criteria for the economic large scale solid-phase synthesis of oligonucleotides | |
| US6538128B1 (en) | Detritylation solvents for nucleic acid synthesis | |
| WO1994001446A2 (en) | Derivatized organic solid support for nucleic acid synthesis | |
| US5164491A (en) | Large scale synthesis of oligonucleotides and their associated analogs | |
| WO1994015946A1 (en) | Synthesis of dimmer blocks and their use in assembling oligonucleotides | |
| EP3262181A1 (en) | Method for solution phase detritylation of oligomeric compounds | |
| EP0898575B1 (en) | A combinatorial protecting group strategy for multifunctional molecules | |
| EP1404695A2 (en) | Universal supports for oligonucleotide synthesis | |
| RU2175972C2 (ru) | Способ иммобилизации олигонуклеотидов, содержащих непредельные группы, в полимерных гидрогелях при формировании микрочипа |