PT84969B - Processo para a preparacao de esteres de 4-oxo-3,4-di-hidro-1,2,3-benzotriazina-3-iloxi, de acidos aminados e de peptideos por utilizacao desses esteres - Google Patents

Description

Memória descritiva

Para a síntese de peptídeos, quer se utilize o mé todo clássico em solução quer, especialmente, se siga o método ein fase sólida (B.Merrifield, Adv. Enzymol. 32 L 196^7 221 296) é oportuno utilizar para a rea.cção de acoplamento uma espécie activa, como seja um anidrido simétrico ou um éster acti vo, de preferencia a efectuar-se uma activação in situ por uri reagente de activação, como por exemplo uma carbodiimidaoDeste modo evita-se, especialmente, na síntese em fase sólida, o con tacto do grupo amina do ácido aminado ligado à resina de supor te com o reagente de activação. A utilização de anidridos simétricos apresenta no entanto o inconveniente de não serem em mui tos casos isoláveis e de se ter de utilizar para os outros des de o inicio uma quantidade dupla do derivado de ácido aminado_o A utilização de esteres de X-hidroxisuccinimida, de triolorofer

I — nilo e de nitrofenilo já é conhecida desde há muito.

Os ésteres de hidroxisuccinimida não são suficien temente reactivos para a síntese em fase sólida, resultando ciclos de reacção demasiadamente demorados, os ésteres de triclo rofenilo são pouco convenientes por causa do problema da dioxina e os ésteres de nitrofenilo são particularmente dificeis de isolar e podem provocar racemizações.

Mais recentemente passaram a usar-se mais frequen temente os ésteres de pentafluorofenilo, que são porém difil ceis de purificar. Para a utilização em síntese em fase sólida é, além disso, indispensável a adição de HOBt para se conseguir uma reacção rápida.

Descobriram-se agora novos ésteres de HOObt que são extraordinariamente adequados à síntese do peptídeos por acoplamento de fragmentos especialmente pelo método em fase sólida.

A presente infenção refere-se a um processo para a preparação de derivados de ácidos aminados da fórmula

X - A - OObt ►

na qual

X significa um grupo protector de uretano,

A significa Gly, Ala, Vai, Leu, Xle, Cys (tBu), Cys (Acm), Met, Pro, Lys (Boc), Asp (OtBu), Glu (OtBu), Phe, Tyr (tBLí) Trp, Lys (z), Lys (Bzl) ou

Cys (4-MeOBzl), podendo qualquer destes ácidos aminados ou derivados apresentar-se sob a forma de L ou D, e

OObt significa 4-oxo-3,4-di-hidro-l,2,3-benzotriazina-3-iloxi.

Considera-se preferida a preparação destes ésteres sob a forma pura.

—

Os novos ésteres de HOObt aqui descritos oferecem a vantagem de se poderem obter com alta pureza e de apresentarem boa estabilidade na conservação. A HOObt libertada durante a reacção pode servir de indicador do avanço da reacção em virtude de ser corada. Além disso, os novos ésteres obtidos de acoj do com o processo da presente invenção são muito solúveis nos solventes habitualmente usados na síntese em fase sólida (dimetilformamida (DMF), dimetilacetamida (dMâ) e N-metilpirrolidona (NMP) ao contrário dos ácidos aminados Fmoc livres, o que favorece a sua utilização na síntese automática de peptídeos.

Consideram-se apropriados os grupos protectores de uretano descritos na publicação Hubbuch, Kontakte Merck 1979 No. 3, pag. 11 ff. Consideram-se preferidos os grupos Fmoc e Boc e especialmente preferido o grupo Fmoc.

processo da presente invenção para a preparação de compostos da fórmula X - A - OObt caracteriza-se por se faser reagir um composto da fórmula X - A - OH, na qual X e A possuem os significados anteriormente definidos, com 3-hidroxi-A-oxo-3,4-di-hidro-l,2,3-benzotriazina (HOObt) na presença de uma carbodiimida. A reacção pode ser realizada num solvente inerte, como THF, DMF, clorofórmio, diclorometano, acetonitrilã ou misturas destes; preferem-se como solventes os ésteres, como o THF, A reacção pode ser efectuada a uma temperatura entre -20 e +5θ C, de preferencia entre -10°C e uma temperatura próxima da temperatura ambiente.

Considera-se ainda abrangido no âmbito da presen te invenção um processo para a preparação de peptídeos por acoplamento de fragmentos caracterizado por se utilizarem para o acoplamento os novos derivados de ácidos aminados da fórmula X A - OObt, especialmente quando se utiliza o método de síntese em fase sólida.

No método de síntese por acoplamento de fragmentos em solução faz-se reagir um fragmento eventualmente protegido na presença de HOObt com um composto da fórmula X - A - OObt num solvente inerte apropriado a uma temperatura entre -20 e +50°C, de preferencia entre 0°C e a temperatura ambiente□ Os solventes anteriormente mencionados, por exemplo, são apropriados, de preferencia DMF. Os fragmentos contendo arginina podem ser utilizados sob a forma dos respectivos percloratos solúveis, os 'quais podem ser obtidos in situ de modo convenien te por adição de perclorato de piridfnio à mistura reaccionalo Após terminada a reacção os grupos protectores introduzidos temporariamente podem ser opcionalmente aliminados de acordo com métodos conhecidos.

A síntese em fase sólida é iniciada a partir da extremidade C-terminal do peptideo com o acoplamento de um áci do aminado protegido a uma resina apropriada. Deste modo é po_s sível preparar o composto de partida por reacção dum ácido aminado protegido com uma resina de polistireno ou de poliacrilamida modificada por meio da introdução de grugos clorometilo, hidroximetilo, benzidrilamino (BHA) ou metilbenzidrilamino (MBHA) por formação de uma ligação de éster ou de amida. As re sinas utilizadas como material suporte são obteníveis comercialmente· Habitualmente utilizam-se resinas com grupos BHA ou MBHA quando se pretende obter um grupo amida livre na extremidade C-terminal do peptideo sintetizado. No caso de se pretender sintetizar um peptideo contendo uma amida secundária na ex tremidade C-terminal, utiliza-se uma resina com grupos clorometilo ou hidroximetilo e realiza-se a hidrólise com a amina correspondente. Se se pretende deixar ficar no peptideo o grupo protector b-butilo das cadeias laterais dos ácidos aminados, realiza-se a síntese com o grupo protector Fmoc para bloqueieo temporário do grupo <X -amina dos ácidos aminados de acordo, por exemplo, com o método descrito em R.C. Sheppard, J.Chem. Soe. Chem. Comm. 1982, 587, protegendo a função guanidina da arginina de preferencia por protonação com perclorato de piridínio e efectuando a protecção dos restantes ácidos aminados funcionali zados da cadeia lateral com grupos protectores benzilo, por serem elimináveis por transfer-hidrogenação (A. Felix et al_o J_o Org. Chem. V5, 4194 (1978) ou por tratamento com sódio em amónia co liquido (W.Roberts, J.Am.Chem.Soc. 76 62O3 (1954)).

- 4 Após eliminação dos grupos protectores das aminas dos ácidos aminados acoplados à resina, por meio de um reagente adequado, como por exemplo acido trifluoroacético em diclorometano no ctxso do grupo protector Boc ou uma solução a 20 de piperidina em dimetilformamida no caso do grupo protector Fmoc, efectua-se o acoplamento dos ácidos aminados seguintes, devidamente protegidos, um após outro de acordo com a ordem pretendida.

peptídeo intermediário resultante protegido na extremidade N-terminal e ligado à resina é desbloqueado com um i dos reagentes anteriormente mencionados antes da reacção com o

I derivado do ácido aminado seguinte.

Para a pré-activação .in situ dos derivados dos ácidos aminados podem ser utilizados todos os possíveis reagen tes de activação usados na síntese de peptídeos, como os descri tos em Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, ^uand 15/2 especialmente ast carbodiimidas, como por exemplo, N,N’-diciclo -hexilcarbodiimida, N,N’-diisopropilcarbodiimida ou N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-carbodiiííiida. 0 acoplamento pode, neste caso, ser efectuado directamente por adição à resina de um derivado de um ácido aminado da fórmula X - A - 00bt ou de um derivado de um ácido aminado pré-activado in situ e eventualmen| te de um aditivo redutor de racemização, como por exemplo, 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) (W.Konig, R.Geiger, Chem. Ber₀ 103 708 (1970)) ou 3-hidroxi-&-oxo-3/ί—di-hidrobenzotriazina (iíOObt^ (W.Kõnig, R.Geiger, Chem. Ber. 103« 2054 (1970)).

acoplamento ou, consoante o caso, a activação do derivado do ácido aminado com um dos reagentes de activação anteriormente mencionados pode ser efectuado nos solventes já citados, de preferencia em dimetilfonnamida ou em diclorometano ou numa mistura de ambos. A temperatura da reacção pode ser —20 a +50 C, de preferencia de 0°C até à temperatura ambiente_o Habitualmente utiliza-se um excesso de 1,5 a 4 vezes do deriva do activado do ácido aminado. No caso de resultar uma reacção * de acoplamento incompleta, repete-se a reacção sem efectuar pri

- 5 meiro o desbloqueamento do grupo CX -amina do peptideo ligado à resina, como seriei necessário para o acoplamento do ácido arainado seguinte.

E possível confirmar a correc ão do decurso da reacção de acoplamento por exemplo por reacção com anidrina, por exemplo pelo método descrito em E.Xaiser et al.Analo Bio— chem. 34 595 (1970). Também é possível realizar a sintese de modo automático, por exemplo com um sintetizador de peptídeos modelo 43OA da companhia Applied Biosystems, podendo utilizar -se tanto o programa de síntese pelo fabricante do aparelho como um programa preparado pelo próprio utilizador. Neste último caso utilizam-se em especial derivados de ácidos aminados 1 protegidos pelo grupo Finoc.

Após síntese dos peptídeos do modo anteriormente descrito, pode retirar-se o peptídeo da resina por meio de rea gentes como sejam, por exemplo, fluoreto de hidrogénio líquido (preferido para os peptídeos preparados de acordo com o método Boc) ou ácido trifluoroacético (preferido para os peptídeos sintetizados de acordo com o método Fmoc.) Estes reagentes não só cindem a ligação entre o peptídeo e a resina como também eliminam os restantes grupos protectores das cadeias laterais dos derivados dos ácidos aminados. Deste modo obtóm-se, excepto se a resina usada for BHA. ou 14BHA, o peptídeo sob a forma de ácido livre. Com a resina BHA ou MBI-IA obtém-se o peptídeo sob a forma de amida após hidrólise com fluoreto de hidrogénio₀ Se se pretender obter o peptídeo sob a forma de etilamida, então pode efectuar-se a hidrólise do peptídeo ligado à resina por meio de etilamina, devendo então efectuar-se em seguida a eliminação dos grupos protectores das cadeias laterais por meio de outros reagentes apropriados, como por exemplo os anteriormente mencionados.

Quando se efectua a hidrólise com fluoreto de hidrogénio ou com ácido trifluoroacético adiciona-se para a captura de catiões uma substância como as normalmente usadas para essa finalidade, por exemplo fenol, cresol, tiocresol, tioanisol, sulfureto de dimetilo, sulfureto de etilo e metilo ou uma

- 6 i

I , I _ mistura de dois um mais reagentes. Também é possível utilizar o ácido trifluoroacético em diluição num solvente apropriado como por exemplo em diclorometano.

No caso de se pretender obter o peptídeo contendo ainda os grupos t-butilo ou benzilo protegendo as cadeias laterais, efectua-se a síntese do peptídeo utilizando uma resina suporte especialmente modificada c hidroliza-se com ácido trifluoroacético a 1 % em diclorometano, de acordo com o método descrito por R.C.Sheppard, J.Chem.Soc. ,OhBim. Comm. 1982. 587o Se se pretender deixar nas cadeias laterais como grupos protec I tores unicamente os grupos t-butilo ou benzilo, utiliza-se uma combinação apropriada de métodos de síntese e de hidrólise₀

Para a síntese de peptídeos com um agrupamento aisii da na posição C-terminal ou com um agrupamento OJ-amino ou -guanidino, utiliza-se igualmente a resina suporte modificada descrita por Sheppard. Após a síntese retira-se da resina o pejo tídeo mantendo as protecções nas cadeias laterais e em seguida faz-se reagir com a amina com a -aminoalcjuilamina ou com a -guanidinoalquilamina correspondente, podendo durante esta reacção proteger-se de modo habitual temporariamente outros gru pos funcionais eventualmente existentes.

Os exemplos aj*resentados seguidamente destinam-se a elucidar a invenção sem de qualquer modo restringir o respectivo âmbito.

A. Preparação do éster de OObt

Exemplo 1:

Fmoc-Ile-OObt

Dissolvem-se ou suspendem-se 5θ mmol de Fmoc-Ile-OH juntamente com 50 mmol de HOObt em 100 ml de THF seco e a 0°C juntam-se 55 mmol de diciclo-hexilcarbodiimida»

- 7 Deixa-se reagir durante a noite, em seguida filtra-se a diciclo-hexilureia precipitada e elimina-se o solvente sob vácuo. Dissolve-se o resíduo em diclorometano e arrefece-se em banho de gelo. Nesta operação precipita novamente mais ureia. Filtra-se novamente e elimina-se o solvente restante sob alto vácuo. Tritura-se o resíduo com éter de petróleo filtra-se e seca-se sob alto vácuo»

Verifica-se a pureza do éster activo obtido por meio de CCF (gel de silica, usando acetato de etilo como eluente) e de HPLC (coluna ^^Vydac θ18 ^{com 11111} S^rat^i^en^^e de 40 ^c/o de A 80 % de acetonitrilo/água com 0,1 % de ácido trifluo ro ac é t ic o7 a 90 0 de A em 0,1 γό de ácido trifluoroacético no decurso de 3θ minutos).

Rendimento: 15,5 g, ZX.7 f° = -93,5° (C = 1, DMF)

De modo análogo foram obtidos os seguintes ester activos:

Exemplo 2

Fmo c-Leu-00b t

Z#_7 p° = -127,2° (C = 1, DMF)

Exemplo 3

Fmoc-Asp (OtBu)-OObt

ZA.7 = “61,5° (C = 1, DldF)

Exemplo 4

Fmo c-Pro-00b t

P.F. 159 - 161°C (recristalização a partir de éter diisopropílico com pequena quantidade de isopropanol)

Z~C*l7 = -144,5° (0=1, O®)

- 8 Exemplo 5

Fmoc-Glu (OtBu)-OObt

P.F. superior a 95°C (decomposição; recristalizado a pafctir de isopropanol)

ZoC7 D° - 9*,5° (0=1, ^DMF')

Exemplo 6

Fmo c-Gly-00 bt

P.F. 149 - 151°G (recristalizado a partir de éter isopropílico com pequena quantidade de isopropanol)

Exemplo 7

Fmo c-Ala-OOb t

P.F. 152 - 154°C Z“o^_7 q° =-158° (C = 1, DMF)

Exemplo 8

Fmoc-Cys(tBu)-OObt

P.F. superior a 98°C (decomposição; recristalizado a partir de OHgCl^/éter dietílico/éter diisooropilico) = -150,2° (C = 1, DMF)

Exemplo 9

Fmo c-Val-OObt <

P.F. 114 - 116°C, Z“c<_7 |° = -136,9^o (c = 1, DMF)

- 9 Exemplo 10

Fmoc-Lys(Bqç)-00bt

P.F. superior a 150°C (decomposição; recristalizado a partir de acetato de etilo/éter diisopropilico)

Z“<7 d° = “37,1° (C = 1, DMF)

Exemplo 11

Fmoc-Phe-OObt

P.F. 187 - 189°C (recristalizado a partir de CH^Cl^/éter dietílico)

Z °L7 D° = -113,7° (c = 1, DMF)

Exemplo 12

Fmoc-Tyr(tBu)~00bt

Γ o° = “85° (C = 1, DMF)

Exemplo 13

Fmoc-Cys(4-Me0BzL)-00bt

P.F. 98 - 101°C (recristalizado a partir de CH^Cl^/éter de petróleo)

Z“^_7 p° = -75,5° (C = 1, DMF)

B. Utilização dos éster activos de HOObt

B^ Síntese em solução

Exemplo

Fm o c-Leu-Arg-OH

Adicionam-se à temperatura ambiente 5 g cie Fmoc-Leu-OObt a uma mistura de 1,74 g de L-arginina, 1,63 g de IÍOObt e 1,79 g de perclorato de piridinio em 5° ml de dimetilformamida. Agita-se durante 3 horas à temperatura ambiente e deixa-se reioousar durante a noite à temperatura, ambiente. Concentra-se a. secura a solução limpida. resultan te e trata-se o residuo com água. Ajusta-se o pH a 7 com uma solução aquosa de NaHCO^. Filtra-se o precipitado, lava -se com água e seca-se.

^Rendimento: 4,7 g, P.F. 145 - 155° 0 (com decomposição)

L °^.7 - “18,5° (C = 1, metanol)

B_o Síntese em fase sólida

Exemplo 15

H-Val-Gln-Ala-Ala-Ilc-Asp-Tyr-Ile-Asn-Glv-OH

A síntese do decapeptídeo em epígrafe (ACP 65-74) é efectuada numa resina Pam da companhia Applied Biosystems carregada com glicina por meio dos ésteres de HOObt preparados de acordo com o processo da presente invenção_o A síntese foi levada a efeito com o sintetizador de peptídeos modelo 43OA da companhia Apjâlied Biosystems. Carregou-se em cada um dos cartridges fornecidos com o sintetizador 1 mmol de um dos ésteres Fmoc-Val-OObt, Fmoc-Ala-OObt, Fmoc-Ile-OObt, Fmoc-Àsp(OtBu)-OObt e Fmoc-Tyr(tBu)-00bt_o Nos dois cartridges em que se carregaram cada um dos ácidos aminados Fmoc—Gln-OH e Fmoc—Asn-OH carregou-se juntamente em cada um 1,5 nmol de HOBT. A pré-activação destes ácidos aminados foi realizada directamente nos cartridges por dissolução em 4 ml de DMF e adição de 2 ml de uma solução 0,55 M de diisopropilcarbodiimida em D®, Dissolveram-se os éste· res de HOObt em 6 ml de DMF e bombearam-se as soluções assim obtidas para a resina previamente tratada com piperidi na a 20 $ era DMF, procedendo-se do mesmo modo com os ácidos aminados glutamina e asparagina pré-activados in situ_o Para a síntese utilizou-se 0,5 mmol de resina-Gly e a glutamina e a asparagina foram acopladas em duplo. Após ternii nada a síntese retirou-se o peptídeo da resina com uraa uris tura 10:1 de ácido trifluoroacético e de ácido trifluorome tanossulfónico com adição de m-cresol e de tioanisol para a captura de catiões. 0 oeptídeo impuro foi isolado em (r) ' 'Sephadex G25 com ácido acético a 10 $ com eluente₀ As fraeções contendo o peptídeo foram reunidas e a pureza e a identidade do produto foram verificadas por HPLC.

Claims (4)

1. Reivindicações

   - !§· Processo para a preparação de um derivado de um ácido aminado da fórmula

   X - A - OObt na qual

   X significa um grupo protector de uretano,

   A significa Gly, Ala, Vai, Leu, Ile, Cys(tBu), Cys(Acm), Met, Pro, Lys(Boc), Asp(OtBu), Glu(OtBu), Phe, Tyr(tBu), Trp, Lys(z), Lys(Bzl) ou

   Cys(4-MeOBzl), podendo qualquer destes ácidos aminados ou derivados apresentar-se sob a forma L ou D e

   12 OObt significa 4-oxo-3,4-di-h.idro-l,
2. 2,3-benzotriazina-3-iloxi, caracterizado por se fazer reagir um composto da fórmula X-A-OH, na qual X e A possuem os significados anteriormente definidos, com 3-hidroxi-4-oxo~3,4-di-hidro-1,2,3-benzotriazina (HOObt) na presença duma carbodiimida_o

   Μ O §· _M

   Processo para a preparação de um peptídeo por aco plamento de fragmentos caracterizado por se utilizar como com ponente para o acoplamento pelo menos um composto da fórmula X-A-OObt, na qual X, A e OObt possuem os significados definindo s na reivindicação 1.

   _ 2 - —

   Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se manter durante o decurso da síntese um fragmento ligado por uma ligação covalente a um corpo sólido.

   - 4& Processo de acordo com qualquer das reivindicações 2 ou 3 caracterizado por o composto X-A-OObt ter sido obti do de acordo com a reivindicação 1.

   A requerente declara que o primeiro pedido desta

   - 13 Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a
3. 3, caracterizado pelo facto de o polímero adicionado às composições farmacêuticas líquidas para o controlo da espuma ser polietileno-polipropilenoglicol 1800.

   - 53 Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a
4. 4, caracterizado pelo facto de as composições farmacêuticas conterem um derivado de cefalosporina, em especial, Cefpirom, ou um derivado de penicilina, em especial, procaína-benzilpenicilina.

   A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi depositado na República Federal Alemã em 30 de Maio de 1986, sob o n2. P 36 18 217.6.