PT79064B - Process for preparing veccines and compositions against hepatitis b viral infections - Google Patents
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Description
Descrição da Invenção:
A presente invenção resolve os problemas referidos antes proporcionando vacinas e outras composições aceitáveis em farmácia que são caracterizadas por um componente que induz, em um paciente tratado, a formação de anticorpos em relação a antigénios e vírus da hepatite B em um título efectivo para proteger o paciente contra, ou pelo menos reduzir a gravidade de, uma infecção causada pelo vírus da hepatite B. Estas vacinas e composições, assim como os métodos para a sua aplicação, podem ser utilizados no tratamento do ser humano contra infecções pelo vírus da hepatite B e na protec
pníu1 //p
Ρϋιπι.ι6ά'
çã©, durante algum tempo, contra aquelas infecções.
Como resultado da presente invenção, é agora inesperadamente e pela primeira vez possível proteger os seres humanos, pelo menos durante algum tempo, contra a infecção pelo vírus da hepatente B ou, pelo menos, reduzir a gravidade, em termos de tempo e virulência, desta infecção, tratando aqueles, por uma maneira efectiva sob o ponto de vista farmacêutico, com uma vacina ou coa posição caracterizada por um componente que induz a formação de anticorpos em relação à hepatite B virai e antigénios (anti-HBe) em um título eficaz para proteger o ser humano da infecção de HBV. Os métodos e as composições de acordo com a presente invenção podem também ser caracterizados por componentes que induzem, no paciente tratado, a formação de anticorpos em relação aos anti génios do núcleo do vírus da hepatite B assim como os anti-HBes descritos antes. Além disso, constitui uma outra vantagem da pre sente invenção o facto de não ser necessário que esteja presente nenhum HBsAg nestas vacinas e composições.
Descrição Breve dos Desenhos:
I
A figura 1 representa as analises de conversão do soro (HBsAg, HBeAg, anti-HBs, anti-HBe e anti-HBc) em amostras de soro colhidas semanalmente nos chimpanzés Gwen e Rinka, que foram inoculados com uma composição de acordo com a presente invenção e atacados mediante inoculação intravenosa de soro-tipo ayw de HBV.
A figura 2 representa as análises da conversão de soro (HBsAg, HBeAg, anti-HBs, anti-HBe e anti-HBc) em amostras de sor© escolhidas semanalmente nos chimpanzés-testemunha Peter e Frankje, que não foram tratados de acordo com a presente invenção, mas que foram atacados mediante inoculação intravenosa de soro-tipo ayw
de HBV.
A figura 3 representa as análises de conversão de soro (HBeAg, anti-Hrs, anti-H e e anti-HBc) em amostras de soro colhi das semanalmente nos chimpanzés A e B tratados com composições de acordo com a presente invenção e atacados mediante inoculação intravenosa de soro-tipo ayw de HBV.
Melhor Modo de Realização da Invenção:
Com o fim de permitir que a invenção aqui descrita possa ser mais completamente compreendida, apresenta-se a seguinte de^, crição pormenorizada.
Nesta descrição, são utilizados os termos seguintes:
Polipeptido: Uma série linear de aminoácidos ligados uns aos outros por ligações peptídicas entre os grupos <\í-amino e cax boxilo de aminoácidos adjacentes.
Proteína: Um polipeptido com aproximadamente 5θ °u mais aminoácidos.
Anticorpo: Uma proteína produzida pelos animais em resposta à presença de uma proteína estranha. 0 anticorpo liga-se muito fortemente e especificamente à proteína estranha.
Antlgénio: Qualquer polipeptido ou proteína de que alguma(s) parte(s) pode(m) ser ligada(s) por um ou mais anticorpos.
Soro: A fraeção de sangue que permanece após remoção dos glóbulos sanguíneos vermelhos. Contém, entre outros, anticorpos e antigénios.
Sequência de ADN: Uma série linear de nucleotidos ligados uns aos outros pelas ligações fosfodiéster entre os átomos de
• carbono nas posições 3’ θ 5’ de pentoses adjacentes. ''·
Expressão: 0 processo sofrido por um gene para produzir um polipeptido ou uma proteína, ií uma associação de transcrição e transferência.
Sequência de controlo de expressão: Uma sequência de ADN que controla e regula a expressão de genes quando ligados operacionalmente a esses genes.
Veículo de clonagem ou plasmídio: Uma sequência de ADN que é capaz de se reproduzir em uma célula hospedeira, caracterizada por um ou um pequeno número de sítios de reconhecimento de endonuclease em que essas sequências de ADN podem ser cortadas de uma maneira determinável sem perda concomitante de uma função biológica essencial do ADN, e que contém um marcador, ou antes ou depois da transformação, apropriado para utilização na identificação de células transformadas, por ex. resistência à tetraciclina ou resistência à ampicilina.
Molécula de ADN recombinante: Uma sequência de ADN hibrida que contém pelo menos duas sequências de nucleotidos, não se encontran do normalmente a primeira sequência, na natureza, com a segunda.
Como se descreve no presente pedido de patente de invenção, as vacinas, as composições aceitáveis em farmácia e os processos de acordo com a presesente invenção são caracterizados por um componente que induz, em um paciente tratado, a formação de anti-HBe em um título efectivo para proteger esse paciente, durante pelo menos algum tempo, da infecção pelo vírus da hepatite B, ou pelo menos em um título efectivo .para reduzir a gravidade, em termos de tempo e virulência, de qualquer infecção causada por HBV.
Os componentes indutores de anti-HBe, que caracterizam as
vacinas e as composições contendo anti-HBe de acordo com a presen te invenção, podem ser escolhidos entre uma grande variedade de fontes disponíveis. Por exemplo, podem ser escolhidos entre uma grande variedade de composições aceitáveis em farmácia que contém desde 100 % até à concentração mais baixa de qualquer das diversas variantes serológicas de HBeAg que seja efectiva, após um ou mais tratamentos de um paciente, para induzir o título de anti-HBe necessário nesse paciente.
Estes componentes indutores de anti-HBe podem também ser provenientes de composições que contêm precursores de qualquer das variantes serológicas de HBeAg. Neste último caso, deverá entender-se que a conversão do(s) precurso^(es) na quantidade desejada de um HBeAg deve ser feita por uma maneira aceitável em farmácia e sem a produção simultânea de subprodutos inaceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. Deverá entender-se que, embora esta con versão seja efectuada, de preferência, antes do tratamento de um paciente com uma composição ou uma vacina de acordo com a presente invenção, a conversão pode também ser realizada no paciente como resultado de metabolismo ”in vivo". Nesse caso, a composição utilizada actua mais como uma pró-droga para produzir o desejado coai ponente indutor de anti-HBe no paciente, sob a forma de um metabolito.
Entre os processos gerais que podem ser utilizados para a conversão destes precursores de qualquer das variantes serológicas de HBeAg nos desejados componentes de anti-HBe que caracterizam as vacinas e composições de acordo com a presente invenção encontram-se os bem conhecidos processos proteolíticos, dissociativos ou en zimáticos específicos ou inespecíficos. 0 processo especialmente
escolhido depende do precursor e do nível de conversão desejado
para uma determinada composição ->u vacina. 90H
São ilustrativos das composições anteriormente descritas, que são utilizáveis como fontes das composições indutoras de anti-HBe de acordo com a presente invenção, os diversos HBeAgs e HBcAgs isoláveis a partir do soro de pacientes infectados com HBV ou a partir de partículas de Dane isoladas a partir do mesmo so ro. Por exemplo, tem sido referido que os HBeAg são libertados de partículas do núcleo de HBV purificadas do soro /"Takahashi e colab., ”J. Immunol.", 17, pág.102-105 (1976)_/oude partículas similares purificadas do fígado /"Budkoviska e colab., "J.ImmunoL", 123, pág. 1415-1416 (1979); Yoshizawa e colab., "J. Gen. Virol.'*, 42, pág.513-519 (1979)_7 mediante tratamento com pronase /"Budkowska e colab._7, pronase e 2-mereaptoetanol (2KE) /"Takahashi e colab. J ou dodecil-sulfato de sádio (SDS) e 2-mercaptoetanol /"Budkowska e colab.; Takahashi e colab.; Yoshizawa e colab._/ ou mediante dilaceração com ultra-sons e mediante tratamente com agentes caotrrfpicos ou centrifugação em cloreto de césio (Cs Cl) ΖΉ. Ohri e colab., "Antigenic Conversion From HBeAg To HBeAg By Degradation Of Hepatitis B Cone Particles", "Intervirology", 13, pág. 74-82 (1980)/7. No entanto, devido a problemas associados às vacinas derivadas de soro, estas fontes não são preferidas para as vacinas e composições de acordo cem a presente invenção.
As composições utilizáveis na presente invenção são, de preferência, preparadas mediante fermentação de hospedeiros apropriados que foram transformados com e exprimem uma sequência de ADN que codifica um polipeptido que apresenta a antigenicidade de HBeAg /"por ex., Burrell e colab., "Nature", 279, pág. 43-47 (19/9) Pasek e colab., "Nature”, 282, pág. 575-579 (1979)_7 ou de hospe-
deiros transformados com e exprimindo uma sequência de ADN que codifica um polipeptido que apresenta a antigenicidade de um dos HBeAgs [por ex., pedido de patente de invenção europeia N2 75.395]
São também preferidos os hospedeiros transformados por sequências de ADN que codificam HBcAg com o grupo-COOH truncado. Estas composições também contêm actividade de antigénio e. Prefere-se, por último, os peptidos sintéticos que apresentam a antigenicidade de HBeAgs ou que são precursores dessa actividade de HBeAg. Estas
composições são preferidas pois não requerem o isolamento de componentes a partir do soro de pacientes infectados e, por conseguin te, não levam qualquer risco de infecção aos trabalhadores durante a preparação daquelas vacinas ou aos pacientes com elas tratados.
Com maior vantagem, as composições de acordo com a presente invenção são preparadas a partir de extractos de fermentação de
hospedeiros transformados com e exprimindo uma sequência de ADN que codifica pelo menos um polipeptido com a antigenicidade de HBcAg pois aqueles extractos contêm níveis elevados de polipeptidos, que apresentam a antigenicidade de HBcAg e podem ser extraídos fàcilmente.
É preferível que estes extractos contendo HBcAg sejam tratados por um dos processos descritos no pedido de patente de inven ção europeia Ne 75.395 ou por processos similares antes de serem utilizados. Esses processos incluem, por exemplo, a preparação de
um extracto bacteriano de um hospedeiro, caracterizado pela expres^ são de um polipeptido que apresenta a antigenicidade do antigénio do núcleo do vírus da hepatite B,e a digestão do extracto citado com uma protease resistente ao agente de redução na presença de um
agente de redução. Este tratamento converte uma parte ou todo o HBcAg do extracto em polipeptidos com antigenicidade de ABeAg. Em alternativa, com extractos bacterianos mais concentrados e puros,
pode efectuar-se uma conversão similar de pelo menos uma porção dos polipeptidos com antigenicidade de HBcAg em pollpeptidos com antigenicidade de HBeAg, utilizando um agente de redução sob con dições de dissociação, por ex. com dodecilsulfato de sódio, ou em condições similares. Finalmente, o dodecilsulfato de sódio sózinho pode ser utilizado para efectuar a conversão total ou parcial.
Nos processos descritos antes, as proteáses resistentes ao agente de redução podem ser escolhidas entre uma grande variedade dessas proteáses conhecidas, como pronase, subtilisina, papaína, quimotripsina, bromelina, tripsina, termolisina, protease k , carboxipeptidase A ou carboxipeptidase fí . De maneira aná Ioga, os agentes de redução podem ser escolhidos entre quaisquer dos agentes de redução bem conhecidos, como 2-mercaptoetanol (2ME), ditiotreitol (dTT), ditioeritritol, tioglicolato, glutatião, ou boro-hidreto de sódio. As quantidades dos diversos reagentes utilizados para converter os HBcAgs, parcial ou totalmente, em HBeAgs podem ser determinadas por um entendido na matéria mediante ensaios serológicos simples. Admite-se que estes proces sos de conversão podem conduzir à formação de um grande número de produtos de degradação de HBcAg, muitos dos quais apresentam acti vidade de HBeAg. Estes produtos activos podem, portanto, representar as diversas variantes serológicas de HBeAg.
Para ilustrar a grande variedade de composições e tratamentos que produzem outras composições indutoras da formação de anti-HBe, indica-se, no quadro 1, as análises de soro de uma série de coelhos tratados com um grande número dessas composições.
qua
IS
Quadro 1
Coelho1 Anti-HBc2 Anti-HBe^ Composição
| 1:10 | 1:30 | 1:100 | 1^5 | ||
| 21 | 7,2 | 5,4 | 6,0 | 6,3 | Extracto em partículas ob- |
| 22 | 9,2 | 6,9 | 6,6 | 2,7 | tido a partir da estirpe RI-11 (infra) (~80 % de |
| 23 | 5,6 | 6,9 | 6,9 | 10,6 | HBcAg); observou-se alguns produtos de degradação pr® teolítica na composição mediante análise de gel. |
| 24 | 7,0 | 7,6 | 5,8 | 9,9 | 0 mesmo que acima, excep- |
| 25 | 6,5 | 5,9 | 4,6 | ^,3 | to que a composição foi tratada com 1 % de SDS e 20 mm de 2ME |
| 41 | 6,3 | 6,4 | 4,8 | 5/6 | Preparação de HBcAg par- |
| 42 | 6,6 | 6,8 | 5,8 | 5,o | cialmente purificada obti da a partir da estirpe RI-11, tratada com 1 % de SDS e 20 mm de 2ME |
| ^3 | 6,6 | 5,7 | 5,2 | 3,5 | Preparação de HBcAg parcial |
| 44 | 7,9 | 5,o | 2,8 | 3,6 | mente purificada, obtida a partir da estirpe RI-11 di gerida com tripsina |
| ^5 | 8,2 | M | 2,6 | 3,5 | 0 mesmo que com 43-44, ex- |
| 46 | 7,9 | 5,9 | **,3 | 2,1 | cepto que 0 digesto foi tratado com 1 % de SDS e 20 mm de dTT |
| 47 | 11,3 | 6,9 | 5,0 | 3,2 | 0 mesmo que com 43-44,exceg |
| 48 | 7,o | 7,6 | 7,7 | 10,7 | to que 0 digesto foi fraccionado para isolar 0 máxi mo principal de 17K |
| 49 | 6,9 | 6,2 | 4,0 | 5,2 | 0 mesmo que com 47-48, ex- |
| 50 | 7,4 | 6,7 | 5,4 | 9,0 | cepto que 0 máximo princi- |
pal de 17K foi tratado com 1 % de SDS.
1 Cada coelho foi tratado mediante três inoculações de cerca de 200 de composição especificada em adjuvante de Freund in completo. As injecções nos coelhos 21 a 25 foram feitas com três semanas e depois com duas semanas de intervalo. Nos outros coelhos as injecções foram efectuadas com duas semanas e depois com seis semanas de intervalo.
2
Relações negativo/positivo (N/P).
Quadro 1 (Continuação)
| Coelho^- | Anti-HBc2 | 2 Anti-HBe Composição |
| 1:10 | 1:30 1:100 | 1:5 |
| Testemunha 1,0 | — | 1,0 |
| Negativa | ||
| Testemunha 8,6 | — | 10,8 (Soro humano) |
| Positiva |
| 68 | M«r MM | «Η M | 4,2 | HBcAg parcialmente purificado, obtido a partir da estirpe RI-11, tratado com 1 % de SDS, 2ME. |
| 69 | 11,7 | HBcAg do extracto bruto,ob tido a partir da estirpe HBcAg-Tac em 30 % de (NH^SO^ | ||
| 71 | MM MM | Μ M | 8,4 | 0 mesmo que com 69, excepto que foi tratado com 1 $ e SDS e 2ME. |
Cada coelho foi tratado mediante três inoculações de cerca de 200 da composição especificada em adjuvante de Freund incompleto. As injecções nos coelhos 21 a 25 foram efectuadas com três
semanas e depois com duas semanas de intervalo. Nos outros coelhos, as injecções foram aplicadas com 2 semanas e depois com seis semanas de intervalo.
z Relações negativo/positivo (N/P).
Pode utilizar-se uma grande variedade de hospedeiros e vec tores de expressão para produzir os extractos de fermentação descritos antes. Por exemplo, pode utilizar-se qualquer dos vectores de expressão bem conhecidos. Estes incluem vectores derivados de
I segmentos de sequências de ADN cromosónicas, não-cromosónicas ou
z
sintéticas,como os diversos derivados conhecidos de SV40 e os pias mídios bacterianos conhecidos, por ex. plasmídios de "E. coli" com preendendo col El, pCRl, phR3^2, pMB9 e seus derivados, plasmídios de uma série maior de hospedeiros, por ex. RP4, ADNs de fago, a sâ ber o grande número de derivados de fago X, a saber, NM989, β outros fagos de ADN, por ex. fagos M13 θ fagos de ADN de cadeia simples Filamentosa e vectores derivados de associações de plasmídios e ADNs de fago como plasmídios que foram modificados para utilizar
U ADN de fago ou outras sequências de controlo de expressão ou plasmídios de levedura como 0 plasmídio 2/t ou seus derivados.
Estes vectores podem ser caracterizados por várias sequências de controlo de expressão. Estas compreendem, por exemplo, a ligação de operador, promotor e ribosoma e sequências de interacção (incluindo sequências como as sequências de Shine-Dalgarno) do op£ rão de lactose de "E. coli" ("o sistema lac"), as sequências correspondentes do sistema de sintetase de triptofano de "E. coli"
("0 sistema trp"), as regiões de operador principal e de promotor do fagoÀ/(0L?L como se descreveu antes e uma região de contrôlo de fagos de ADN de cadeia simples Filamentosa, ou outras se4OSOO '
quências que controlam a expressão de genes de células procarióti cas ou eucarióticas e seus vírus ou suas associações.
De maneira análoga, pode utilizar-se qualquer dos hospedeiros bem conhecidos. Estes são, por exemplo, hospedeiros bacterianos como "E. coli" HBlOl "E. coli" X1776, "E. coli" X2282,
"E. coli" MRCI e estirpes de "Pseudomonas", "Bacillus subtilis", "Bacillus stearcthermophilus" e outros bacilos, "Streptomyces",
leveduras e outros fungos, hospedeiros animais ou vegetais como k
células animais (incluindo humanas) ou vegetais em cultura ou outros hospedeiros. Ê evidente que nem todas as associações de ho£ pedeiro/vector podem ser igualmente eficientes.
Embora nem todas as associações de hospedeiros/vector possam funcionar com igual eficiência para a expressão de uma determinada sequência de ADN, a escolha específica da associação de hos. pedeiro/veículo de clonagem pode ser feita por um entendido na matéria utilizando princípiosbem reconhecidos sem que se afaste do âmbito da presente invenção.
Deverá também entender-se que as vacinas e as composições
de acordo com a presente invenção podem conter outros componentes além dos componentes indutores de anti-HBe anteriormente descritos. Estes outros componentes, por exemplo, podem induzir a formação de anti-HBc ou anti-HBs, ou de ambos, em pacientes tratados.
Por exemplo, um modo de realização preferido da presente invenção é caracterizado por composições que induzem a formação de anti-HBc, além dos título efectivos, anteriormente descritos, de anti-HBes.
No entanto, constitui um atributo surpreendente e importante da presente invenção o facto de não serem necessários componentes indutores de anti-HBs nas vacinas, composições ou processos de acordo com a presente invenção para proporcionar protecção contra HBV.
Em face da limitada provisão de HBsAg e da insensibilidade de alguns pacientes em relação a HBsAg (supra), isto constitui uma van tagem marcada e muito importante da presente invenção.
As composições de acordo com a presente invenção podem também conter outros componentes ou ser submetidas a outros tratamentos durante a preparação para aumentar o seu carácter imunogénico ou para melhorar a sua tolerância em pacientes. Por exemplo, podem ser utilizados diversos adjuvantes aceitáveis em farmácia e outros compostos habitualmente utilizados em vacinas. Presentemen te, prefere-se o alúmen. Além disso, pode utilizar-se, com vantagem, diversos tratamentos, como os que resultam na formaçao de micelas, juntamente com a preparação das vacinas e composições de acordo com a presente invenção.
As vacinas e as composições de acordo com a presente invenção podem ser administradas mediante injecção subcutânea ou intramuscular. htiliza-se, de preferência, a injecção intramuscular.
A frequência de administração dependerá da composição
específica da vacina e do paciente a ser tratado. No entanto, admite-se que são suficientes uma ou duas doses, com o intervalo de um mês, seguida(s) de um reforço ao fim de seis meses ou um ano.
A dosagem dependerá do tamanho e do estado do paciente tratado.
E a necessidade de qualquer dose subsequente ou reforço dependerá do nível de título anti-HBe que resulta das imunizações iniciais.
Com o fim de tornar mais completamente compreendida a presente invenção, apresenta-se os exemplos seguintes. Estes exemplos e as suas condições e técnicas são apresentados apenas com fins ilustrativos.
ExemExemplo 1
Este é um exemplo da utilização de extractos bacterianos de hospedeiros transformados e exprimindo polipeptidos que apresentam a antigenicidade de HBcAg nas composições de acordo com a presente invenção.
Neste exemplo, utilizou-se "E. coli" K12, estirpe HB101 xfH. Boyer e D. R->ulland-Dussoix, "J. Mol. Biol.", 4l, pág.4-59-72 (1969) J transformado com plasmídio pHBV-RI-11 para produzir um polipeptido que apresenta a antigenicidade de HBcAg. Este polipeptido foi utilizado depois como fonte dos componentes indutores de anti-HBe que caracterizam as vacinas, composições e processos de acordo com a presente invenção.
0 plasmídio pHBV-RI-11, que exprime uma sequência de ADN codificando um polipeptido com a antigenicidade de HBcAg em um hospedeiro apropriado, foi construído pela maneira seguinte: Cultivou-se até uma = 1,0, 11111 litro de uma cultura de "Escherichia
coli" K-12, estirpe HB101 que contém o plasmídio pHBV139A Z"M.
Pasek e colab., "Nature", 282, pág.575-579 (1979) e codifica to do o gene HBcAg sobre um fragmento que pode ser cortado por Pst 1 e isolou-se o plasmídio a partir das células recolhidas pela manei ra descrita por D. Clewell, "J. Bacteriol.", 110, pág, 667-676 (1972). Digeriu-se 60 ytg de pHBVl39A purificado com 5 unidades de Pst I, durante a noite, a 37°C, em 10 mM de tris-HCl (pH 7,6),
5 mM de MgCl^, 1 mM de ditiotreitol (dTT) e .50 mM de NaCl. Submeteu-se o plasmídio digerido a electroforese sobre um gel de poliacrilamida a 8 % preparativo e isolou-se, a partir do gel, o fragmento de ADN cortado que contém a sequência codificadora de HBcAg, mediante "UV-shadowing" e eluição pela maneira descrita por A.
Maxam e W. Gilbert, "Methods Enzymol.", 65, pág. 4 99-560 (1980).
ks extremidades do fragmento de ADN isolado foram digeridas com com exonuclease BAL 31 em 0,6 ml de Tris-HCl 20 mM (pH 8), 12mM de CaC^, 12 mM de MgC^j 60 mM de Nacl e 1 mM de ácido etllenodiamina-tetraacético (EDTA). Interrompeu-se a reacção mediante extracção com um volume igual de fenol. Fosforilou-se 0,2 ycg de ligante %ço RI ou Hind III (que codificam o sítio de reconhecimento dos enzimas de restrição Eco RI ou Hind III, respectivamente) com 1 unidade de polinucleotido-quinase em um volume de 10 yu,l, na presença de trifosfato de adenosina (ATP) e -3^
1-ATP em uma relação de 5:1, pela maneira descrita por A. Maxam e W. Gilbert, "Methods Enzymol." 65, pág. 499-560 (1980).
Os ligantes fosforilados e marcados foram unidos a 0,2^y,g do fragmento digerido por BAL-31 com 1 unidade de ligase durante 1 hora a 15 °C em 20 ml de solução-tampão de ligação: 5θ JnM de Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM de MgCL·, 10 mM de DTT e 1 mM de ATP. Interrompeu-se a ligação mediante extracção com fenol, como se descreveu antes, e digeriu-se o produto durante a noite a 37°C com 10 unidades de Eco RI ou Hind III (como for mais conveniente) e 10 unidades de Bam HI e com adição de 90 yty-1 de solução-tampão: 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM de HaCl, 5 mM de MgC^, 1 mM de dTT e 0,15 % de friton λ-100. Centrifugou-se a amostra durante 1 minuto em uma centrífuga clínica através de 2 uil de Sephadex G-50 em 10 mM de Tris-HCl (pH 8), 1 mM de ácido etilenodiamino-tetraacético (EDTA). Digeriu-se, com 1 unidade de Eco Rl ou Hind III e Bam HI em 10 ytl de solução-tampao, como se descreveu antes, 0,2 ^ag de pExlac 150, um veículo de clonagem com um sítio de restrição Eco RI ou Hind III apropriado para exprimir genes clonados, construído por H. weiher, Dissertação, Dniversidade de Heidelberg (1980) e isolado pela maneira descrita antes
para pHBVl39A. 0 fragmento preparado como se descreveu antes foi depois inserido no veículo de clonagem mediante incubação com 1 unidade de ligase em 20yt 1 de solução-tampão de ligação, durante 4 horas, à temperatura ambiente.
Transformou-se depois "Escherichia coli" K-12, estirpe HB101 com o plasmídio recombinante preparado antes, como descreveram M. Mandei e A. Higa, "J. Mol.Biol.", 53, pag. 159-163(1970). Escolheu-se transformantes sobre placas de agar rico pela resistência a 50^,g/ml de ampicilina e seleccionou-se aqueles para
expressão de polipeptidos que apresentam a antigenicidade de HBeAg pelo método de S. Broome e W. Gilbert, "Proc. Natl. Acad. Sei. (USA)",75, pag. 2746-2749 (1978), descrito por C. Burrell e Colab.,
"Nature", 279, pág.43-48 (1979).
Pôs-se em sequência o plasmídio recombinante contido por um dos hospedeiros que exprimem aqueles polipeptidos, designado pHBV-RI-11 (contém um ligante Eco RI) pelo método de A. Maxam e
W. Gilbert,"Methods Enzymol." 65, pág. 499-560 (1980), na região de fusão entre o ADN de HBV e o gene de [b-galactosidase de pEXlac!50. A sequência do nucleotido demonstra que o aminoãcido 8 da (5-galactosidase está ligado ao aminoãcido 3 de HBcAG por 3 aminoácidos codificados pelo ligante Eco RI.
Os produtos que apresentam a antigenicidade de HBeAg foram depois preparados mediante cultura de "E. coli" K12 HB101 transformado com pHBV-RI-11 para produzir um produto que se agregue para formar pertículas semelhantes às partículas do núcleo de HBV naturais que são isoladas a partir do fígado humano [S. Stahl e colab "Hepatitis B vírus Core Antigen, Its Synthesis In Escherichia coli, And Application in diagnosis", "Proc. Natl. Acad. Sei. (USA)", 79,
pag. 1606-1610(1981) e Richmond e Cohen, "Nature", 296, pag.677-678
(1982)-7.
Utilizou-se depois extractos destas culturas de fermentação para preparar amostras substancialmente homogéneas de polipejj tidos que apresentam a antigenicidade de HBcAg e preparações menos extensivamente purificadas mediante associações de ultra-centrifugação, cromatografia de exclusão e outras fases de purificação. Estas preparações induziram anti-HBe e anti-HBc em coelhos. Vêr, por ex., Quadro 1, supra. Admite-se que a presença de anti-HBe indica que, durante a fermentação ou a purificação, ou tai vez por metabolismo "in vivo", estas preparações de HBcAgs foram convertidas, pelo menos em certo grau, em composições que contêm polipeptidos apresentando antigenicidade de HueAg. Estas preparações mostraram ser isentas de pirogénio mediante o ensaio de limulus.
Para preparar composições de acordo com a presente invenção para inoculação em chimpanzés, o animal de ensaio conveniente para o estudo de HBV e a demonstração de protecção contra a infecção causada por HBV, utili2ou-se uma cultura de fermentação de "E. coli" K12 HB 101 (pHBV-RI-11. Como se descreveu antes, esta estirpe produz um polipeptido que apresenta especificidade de HBcAg.
Para isolar estes polipeptidos a partir da cultura de fer mentação e para os purificar, pode utilizar-se uma grande varieda de de associações de fases de cromatografia, filtração, extracçao e precipitação. São, todas elas, técnicas de purificação bem conhecidas .
Por exemplo, preparou-se uma composição destes polipeptidos a partir de um extracto de fermentação dessa estirpe mediante centrifugação a baixa velocidade para eliminar os detritos célula res (10.000 rpm, 10 minutos), precipitação com (NHi^SQ^ (55 % de
saturação), solubilização do precipitado em solução-tampão de PBS, diálise, fraccionamento sobre uma coluna de Sepharose 4b e isg, lamento das fracções com actividade de HBeAg mediante precipitação com sulfato de amónio, solubilização com PBS e diálise como se referiu antes.
N© entanto, deverá entender-se que podem ser utilizados esquemas de purificação mais ou menos extensivos na preparação das composições de acordo com a presente inven-ão, visto poderem ser utilizados nas composições e métodos de acordo com a presente invenção, preparações substancialmente homogéneas, assim como prepa rações mais impuras de polipeptidos com antigenicidade de HBeAg. Tudo o que é necessário é que exista uma quantidade suficiente de um componente indutor de anti-HBe activo, ou um seu precursor, na preparação, para permitir a formação de um título suficiente de anti-HBe no paciente tratado. A este respeito, pode ser preferível utilizar preparações brutas (impuras) de HBeAg porque estas preparações já contêm, como produtos de degradação, níveis elevados de componentes indutores de anti-HBe.
Para inoculação, utilizou-se diversas preparações obtidas pelos esquemas de purificação mencionados antes (estas continham aproximadamente 8o % de HBeAg), dissolvendo em solução-tampão de PBS e misturando durante a noite com um volume igual de 1K de NHqHCO^ e com um volume igual ao do volume total resultante de alú men a 10 a 4°C. Após centrifugação da suspensão (2000 rpm, 10 min., 4°C), lavou-se as pastilhas com a mesma solução de NH^HCO^ e 10 % de alúmen, descrita antes, centrifugou-se de novo e dispersou -se as pastilhas em PBS até um volume total de 2-^,5 ml. Estas preparações podem ser guardadas a -70°c.
Para inoculação, descongela-se as preparações e amostras
ΪΓ
]
utilizadas descritas antes, que contêm 100 de HBcAg, para inq cular, por via intramuscular, dois chimpanzés:
| Cimpanzés | Sexo Data de nascimento | Peso do corpo |
| Gwen | F 8 de Agosto de 1972 | h7 Kg |
| Rinka | F 27 de Agosto de 1971 | 52 hg |
Gwen recebeu duas inoculações das composições de acordo com a invenção separadas de quatro meses. Rinka recebeu três in jecções das composições de acordo com a presente invenção, es duas primeiras com um intervalo de três semanas e a terceira quatro meses depois da segunda. Cada um dos animais recebeu a mesma composição praticamente ao mesmo tempo.
Utilizou-se também, como testemunhas, dois chimpanzés que não tinham qualquer história de exposição a HBV:
Utilizou-se este teor elevado de HBcAg porque se desejava assegurar que as preparações utilizadas pela Requerente também contivessem HBe suficiente para desenvolver títulos de anti-HBe efectivos. Podem também ser utilizados teores mais baixos que dq pendem da concentração de componentes indutores de anti-HBe presentes. Nao se determinou a verdadeira concentração de HBeAgs nos inóculos utilizados pela Requerente, visto uma tal determinação ser difícil na presença de HBcAg.
Chimpanzés
Sexo
Data de nascimento
Peso do corpo
Peter
26 de Janeiro de 1978 28 Kg
Frankje
F 6 de Abril de 1976
Infectou-se os quatro chimpanzés com uma. inoculação de 5 x 10^ doses infecciosas de serotipo ayw de HBV (uma oferta de R. H. Purcell). Os chimpanzés Gwen e Rinka foram atacados pelos vírus 30 dias depois da última injecção das composições de acordo com a presente invenção.
Com referência às Figuras 1 e 2, apresenta-se nelas as análises de conversão de soro (HBsAg, HBeAg, anti-HBs, anti-HBe e anti-HBc) para amostras de soro colhidas semanalmente a partir dos quatro chimpanzés utilizados neste exemplo.
Como se mostra na Figura 1, os dois chimpanzés inoculados com composições de acordo com a presente invenção, como se descri veu antes, tiveram respostas diferentes. Rinka desenvolveu imediatamente um título anti-HBc observável mas nenhum título anti-HBe observável. Gwen desenvolveu imediatamente um título anti-HBc semelhante ao de Rinka, e um título anti-HBe fraco mas definido. Ambos os animais mantiveram títulos anti-HBc elevados durante vários meses, fístes não aumentaram significativamente com uma inoculação adicional da presente preparação apés um intervalo de 4 meses. 0 título anti-HBe de Gwen aumentou um pouco depois da segunda injecção mas Rinka ainda não apresentava qualquer títu lo anti-HBe observável depois dessa injecção.
Como se mostra também na Figura 1, depois do ataque pelo soro-tipo ayw de HBV, Gwen, o chimpanzé com o título de anti-HBe observável, não apresentou quaisquer sintomas de infecção e nao desenvolveu nem antigenemia nem qualquer alteração significativa
nos níveis de anticorpo . Subsequentemente, Gwen, começou a desenvolver um título de anti-HBs (não indicado na Figura 1).
Após ataque pelo soro-tipo ayw de HBV, Rinka, o chimpan zé sem título de anti-HBe observável, teve uma infecção por HBV muito moderada e passageira. A ausência de virulência e o curto tempo de duração desta infecção indicam que apenas ocorreu, em Rinka, uma breve irupçao de réplica do vírus. Como se mostra na Figura 1, este aparecimento de réplica levou à síntese moderada de HBsAg mas a nenhuma síntese de HBeAg e a uma subida rápida em anti-HBs e, em especial, em anti-HBe. Como se mostra na Figura 2, ambos os chimpanzés-testemunha desenvolveram infecções virulentas por HBV.
Estes resultados demonstram inesperada e surpreendentemen te que o anti-HBe induzido pelas composições de acordo com a presente invenção, mesmo na ausência de anti-HBs, é protector contra a infecção por HBV, ou em níveis mais baixos (Rinka) reduz pelo menos a virulência e o curso da infecção por HBV. Por exemplo, Gwen, que tinha um nível de anti-HBe fraco, mas detectável, apés tratamento com composições de acordo com a presente invenção,foi completamente protegida da infecção por HBV e da réplica virai.
Durante os últimos anos de avaliações de vacina no "Primate Center", TNO, na Holanda, onde estes ensaios foram efectuados, nenhum dos animais-testemunha (23) se manteve não-infectado apés inoculação com HBV.
POBIIGAL
28
«sá
Rinka, por outro lado, após tratamento com as composições de acor do com a presente invenção, não apresentou inicialmente qualquer nível observável de anti-HBe. No entanto, em face do rápido aumento observado no título de anti-HBe em Rinka e a ausência de síntese de HBeAg, depois do ataque, admite-se que Rinka teve ini cialmente um título de anti-HBe fraco, embora não observável, induzido pelas composições de acordo com a presente invenção. Este título fraco, ainda que insuficiente para proteger Rinka, reduziu marcadamerte a gravidade da infecção subsequente por HBV de Rinka.
I
Exemplo 2
Este é um exemplo da utilização de dodecilsulfato de sódio ou dodecilsulfato de sódio (SDS) e 2-mercaptoetanol (2ΜΞ) para aumentar a concentração de componentes indutores de anti-HBe activos em composições de acordo com a presente invenção preparadas a partir de extractos bacterianos de hospedeiros transformados e exprimindo polipetidos que apresentam antigenicidade de HBcAg.
Neste exemplo, utilizou-se preparações de HBcAg de "E. coli” K12 HB101 (pHBV-RI-11) semelhantes às descritas no exemplo 1. No entanto, neste exemplo, tratou-se as preparações (em BBS) ou com 1 % de dodecilsulfato de sódio ou com 1 % de dodecilsulfato de sódio e 1 % de 2-mercaptoetanol, a 37°C, durante algum tempo (2 horas a alguns minutos), para converter pelo menos uma porção das actividades de HBcAg naqueles extractos em actividade de HBeAg /'ver, por ex., pedido de patente de invenção europeia NQ 73«395_JZ A preparação foi depois diluída com PBS atá 0,1 % de dodecilsulfato de sódio antes da inoculação.
29
Para inoculação, utilizou-se novamente preparações que contêm 100 y^g de HBcAg. Nao se utilizou alúmen devido à presença de dodecilsulfato de sódio. Como consequência do tratamento descrito antes, estas amostras continham concentrações relativamente mais elevadas de HBeAg. Os chimpanzés inoculados com estas preparações desenvolveram títulos elevados de anti-HBe. Estes títulos são mais de duas vezes superiores aos observados em Gwen. Devido ao nível destes títulos, é de esperar que os chimpanzés estejam protegidos em relação a HBV.
Em seguida, inoculou-se estes chimpanzés com um reforço (100 ytg HBcAg/alúmen) preparado pela maneira seguinte: Digeriu-se HBcAg, preparado substancialmente como se descreveu antes excepto sob o contrõlo de ura promotor TAC (supra), com tripsina (5 % P/P) em 4,5M úe ureia para converter HBcAg em HBeAg na ausên cia de dodecilsulfato de sódio. Fraccionou-se depois o digesto de reacção mediante filtração sobre gel /'Sephacryl 5200 (Pharmacia) em solução-tampão de bicarbonato (pH 9,4)Após diálise em PBS, precipitou-se a mistura sobre alúmen, como se descreveu antes. Deste "booster” resultaram títulos mais elevados de anti—HBe em ambos os chimpanzés. Estes foram depois atacados, como antes, com o vírus da Hepatite B.
Fazendo agora referência à Figura 3, nela estão indicadas as análises de conversão de soro (HBeAg, anti-Hns, anti-HBe e anti-HBc) para amostras de soro colhidas semanelrnente a partir destes dois animais (A e B) após ataque pelo vírus. Como se mostra na Figura 3, os títulos de anti-HBe e anti-HBe do chimpanzé A diminuíram lentamente durante os vários meses depois do ataque. No entanto, o chimpanzé A nunca desenvolveu títulos de HBsAg (na® in dicado) ou anti-Hbs demonstrando que tinha sido protegido de HBV
pela composição de acordo com a presente invenção. Os títulos de anti-HBc e anti-HBe do chimpanzé B também diminuíram lentamen te após o ataque. No entanto, cerca de 100 dias depois do ataque, houve um "boost" no título de anti-HBe e o aparecimento de um título de HBsAg (não indicado) muito fraco e efémero (cerca de 8 dias). Subsequentemente, não se observou mais qualquer título de HBsAg mas apareceu anti-HBs. Estes resultados, como os de Rinka, referidos antes, demonstram que as composições de acor do com a invenção protegeram parcialmente o chimpanzé B da infec ção pelo vírus da hepatite tí.
Embora tenha sido apresentado antes um grande número de modos de realização da presente invenção, é ábvio que a construção básica da Requerente pode ser alterada para proporcionar outros modos de realização que utilizem o processo de acordo com a presente invenção. Por isso, deverá considerar-se que o âmbito da presente invenção será definido mais pelas reivindicações a ela anexas que pelos modos de realização específicos que foram apresentados antes a título de exemplo.
Rei-
Claims (8)
- Reivindicações1, - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica que compreende um componente característico que elicita em um paciente tratado a formação de anticorpos para hepatite B virai e antigénios com um título efectivo para proteger o paciente durante algum tempo contra infecções virais provocadas por hepatite B ou com um título efectivo para reduzir a gravidade da infecção virai provocada pela hepatite B naquele paciente, caracterizado pelo facto de se cultivar um hospedeiro transformado com e exprimindo uma sequência de ADN que codifica pelo menos um polipeptido que apresenta a antigenicidade do antigénio e do vírus da hepatite B.
- 2. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica que compreende um componente característico que elicita em um paciente tratado a formação de anticorpos para hepatite B virai e antigénios com um título efectivo para proteger o paciente durante algum tempo contra infecções virais provocadas por hepatite B ou com um título efectivo para reduzir a gravidade da infecção virai provocada pela hepatite B naquele paciente, cara^terizado pelo facto:(a) de se cultivar um hospedeiro transformado com eexprimindo uma sequência de ADN que codifica pelo menos um polipeptido que apresenta a antigenicidade do núcleo do antigénio do vírus da hepatite B; e(b) de se converter pelo menos uma parte dos polipeptidos que apresentam a antigenicidade do núcleo do antigênio do vírus da hepatite B em polipeptidos que apresentam a antigenicidade do antigênio e do vírus da hepatite B mediante tratamento do referido extracto por via enzimática, dissociativa ou proteolítica.
- 3. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o referido tratamento ser realizado "in vitro" e ser escolhido no grupo que consiste em tratamentos com proteases resistentes aos agentes redutores, agentes redutores sob condições de dissociação, dodecilsulfato de sódio e suas combinações.
- 4. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a protease resistente aos agentes redutores ser escolhida no grupo que consiste em pronase, subtilisina, papaína, quimotripsina, bromelina, tripsina, termolisina, protease K, carboxipeptidase A e carboxipeptidase B.
- 5. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de se escolher o agente redutor no grupo que consiste em 2-mercaptoetonol, ditiotreitol, ditioeritritol, tioglicolato, glutationa e borohidreto de sódio.
- 6. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo facto de a composição obtida se encontrar isenta do antigênio de superfície do vírus da hepatite B ou dos seus precursores .
- 7. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo facto de o componente que elicita a formação do referido título de anti-HBe ser escolhido no grupo que consiste em compo-33sições aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico que contêm desde 100% até ã concentração mais baixa de qualquer das variantes sorológicas de HBeAg que é eficaz após um ou mais tratamentos de um paciente para elicitar o referido título de anti-HBe.
- 8.- Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de a composição elicitar também a formação de an ticorpos para HBcAg no paciente tratado.►
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