PT786083E - Processo de diagnostico e de vigilancia e medicamentos para a terapia de estados de choque em seres humanos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "PROCESSO DE DIAGNÓTISCO E DE VIGILÂNCIA E MEDICAMENTOS PARA A TERAPIA DE ESTADOS DE CHOQUE EM SERES HUMANOS" O objecto do presente invento é um novo processo para a avaliação do diagnóstico e vigilância, assim como um medicamento para a terapia de estados de choque em seres humanos.

Nas nações industriais do Ocidente, todos os anos morrem milhares de pessoas directamente de várias formas de choque, ou como consequência imediata do choque. Entende-se por choque a ocorrência de uma falha aguda de regulação do fornecimento de sangue de órgãos vitais devido à diminuição da pressão sanguínea. A partir desta ocorrência de falha aguda de regulação, desenvolvem-se frequentemente danos difusos ou selectivos em órgãos e uma falha prolongada em órgãos que, em cerca de 10% a 30% de casos, conduz à morte (cfr., por exemplo, Pschyrembel, Klin. Wõrterbuch, de Gruyter, Berlin, 1992). Essas reacções ao choque podem ocorrer com base em infecções crónicas e agudas, no caso de pacientes com danos anteriores (pós-operatórios). tratamento com citostáticos etc., ou também sem causa reconhecível, na maioria das vezes como um resultado de infecções bacterianas que de outro modo seriam inofensivas. Existem diferenças entre as formas de choque anafilático, bacteriano, séptico, pós- traumático, cardiogénico, hemorrágico, hipovolémico, neurogénico e as formas tóxicas de choque. Parece existir um factor comum na coexistência de um comportamento defensivo alterado do corpo no que se refere a micróbios frequentemente inofensivos na base de danos traumáticos, cirúrgicos, imunológicos, medicamentosos ou tóxicos, simultâneos e que ocorreram pouco tempo antes dos danos provocados no organismo, (cfr., poe exemplo, Bochner, B.S. et al., N. Engl. J. Med., 1991, 3241 1785). Até à data não existia um processo de terapia uniforme e seguro, especialmente para o choque tóxico ou séptico pós-traumático, pósoperatório (Barron, R.L., Clin. Pharm., 1993, 12, 829). Não existem critérios seguros para a avaliação do §

Plí prognóstico e do sucesso da terapia no caso de doenças resultantes de estados de choque. Portanto não foram desenvolvidos conceitos terapêuticos específicos, reconhecidos e racionalmente fundados, presumivelmente devido à ausência de parâmetros de prognóstico.

Impõe-se, portanto, a tarefa de encontrar um novo processo para a avaliação do diagnóstico e vigilância, assim como um medicamento para a terapia de estados de choque em seres humanos.

Surpreendentemente, no caso das análises ao sangue de pacientes em estado de choque, verificou-se que algumas delas, pouco tempo depois do início ou no decurso da doença resultante do choque, mostraram uma considerável quantidade de ciclofilinas no soro do sangue dos pacientes. Os pacientes que, em qualquer momento durante a doença resultante do choque (entre o primeiro e o décimo quinto dia) mostraram ciclofilinas no soro, morreram com grande regularidade em quantidades claramente mensuráveis, apesar dos esforços terapêuticos intensivos do médico assistente. Os pacientes que sobreviveram não mostraram, até à cura, e em nenhum momento, uma quantidade mensurável de ciclofilinas nas partes do seu sangue isentas de células (soro, plasma, fracções de plasma, etc).

De acordo com o actual estado do conhecimento, todas as células do organismo dos seres humanos e dos animais, mas também de muitas bactérias, células de plantas, etc., contêm um grupo especial de proteínas citoplásmicas, as ciclofilinas (Galat. A.. Eur. J. Biochem. 1993, 216, 689). Elas servem para a regularização do envolvimento da proteína, da estabilidade da proteína e da liberação da proteína, mas também para a formação de proteína em conexão com a regulação das funções de células no estado normal ou em “stress” tais como, por exemplo, infecções, rejeições de transplantes, etc. (Galat, vidé supra). As ciclofilinas têm sido determinadas não apenas no citoplasma mas também no núcleo de células eucarióticas (Galat, vidé supra). Contudo elas não ocorrem normalmente no meio extracelular e não lhes têm sido atribuídos efeitos extracelulares importantes.

Através da patente EP 0 326 067 - A2, é conhecido o uso de ciclofilina em mamíferos como anti-inflamatório e agente imuno-modulador para o tratamento de reacções inflamatórias crónicas e doenças autoimunes. A sequência amino-ácido do porco e a ciclofilina humana são descritas neste pedido.

Na patente EP 0 285 603 - A2 é descrito um processo para a determinação de ciclosporina A no sangue, através do qual à amostra de sangue a ser investigada é adicionada uma quantidade definida de ciclofilina e uma quantidade definida de substância titulada de ligação à ciclofilina e a quantidade de substância titulada de ligação à ciclofilina é medida por comparação com padrões do nível de ciclosporina A ou com imunosupressores relacionados. A ciclosporina A é usada como agente para a supressão de reacções de rejeição imunológica após o transplante de órgãos.

Na patente WO 83/00930 é descrita uma determinação de choque por supressão da lipase lipo-proteica por mediadores induzidos por endotoxina. As ciclofilinas não são descritas como mediadores.

Na patente WO 92/14455 é descrito um processo para a verificação de concentrações anormais de TNF-α em tecidos humanos que podem surgir como resultado de um choque séptico agudo. Os agentes preferidos são ftalimido-bipiridinas. O NF-α (factor de necrose do tumor) é atribuído ao grupo das citoquinas. Não é mencionado nesta literatura de referência que as ciclofilinas também desempenhem um papel no caso de estados de choque. A observação aqui relatada contradiz o estado de conhecimento na medida em que é aqui referido pela primeira vez que em ligação com a doença que provocou o choque no caso de pacientes em que a ocorrência de choque conduziu finalmente à morte, já muito antes da sua morte (dias a semanas) eram dectáveis consideráveis quantidades de ciclofilinas no sangue. Embora tenham sido encontrados os mais diversos mediadores no caso de choque apontado como exemplo (de BOER, J.P. Immunopharmacology, 1922, 24, 135), as ciclofilinas não foram associadas à ocorrência de choque. Λν! tr*:

ρ 4 - ><* Ο aparecimento de ciclofilinas no plasma ou no soro de pacientes em estado de choque é assim um sinal patognomonicamente desfavorável. Através da vigilância deste parâmetro no soro. podem ser feitos os prognósticos e a terapia pode ver vigiada. Uma diminuição da concentração de ciclofilina deverá ser vista como um sinal do possível sucesso da terapia, um aumento como um sinal de aviso para um resultado fatal iminente. Além disso, no caso de estados de choque induzidos experimentalmente. a concentração de ciclofilina pode ser usada como uma variável mensurável para a verificação da acção de novas formas de terapia.

Além disso, a descoberta surpreendente aqui descrita torna óbvio que, como mediadores, as ciclofilinas são, elas próprias, negativamente activas nas ocorrências de choque.

As ciclofilinas têm semelhanças com as citoquinas (Bang et al.. Experiência, 1993, 49. 533), um grupo de substâncias que participam substancialmente na preparação da defesa do organismo humano e animal. Portanto, o seu aparecimento inesperado fora dos limites da célula poderia provocar uma falha massiva de regulação ou regulação da preparação da defesa do organismo humano, que são responsáveis pelos resultados imediatos dos estados de choque. Para a terapia, portanto, é necessário inactivar, antagonizar ou remover as ciclofilinas que ocorrem no caso de pacientes em estado de choque. Para este fim, em princípio estão disponíveis as seguintes possibilidades: a) bloqueio ou antagonizaão da ocorrência de ciclofilinas no plasma de sangue através de produtos farmacêuticos de bloqueio ou antagonização, b) bloqueio e antagonização das ciclofilinas que ocorrem através de materiais biologicamente activos, tais como anticorpos específicos, anti-enzimas, etc., c) remoção e destruição das ciclofilinas que ocorrem no plasma ou no soro de sangue por processos físicos e químicos, tais como depuração do sangue, etc. A detecção das ciclofilinas no soro pode ser feita por diferentes processos, por exemplo, por métodos enzimológicos, métodos radioquímicos, métodos imunológicos e métodos bio-químicos de proteína clássicos.

Os processos de diagnóstico mencionados são em parte conhecidos para a detecção das ciclofilinas em células; estão disponíveis outros processos para outras indicações e podem ser adaptados às situações aqui descritas.

Por exemplo, a concentração de ciclofilina pode ser levada a cabo através da medição da actividade rotamase (peptidil-prolina-cis-trans-isomerase) de acordo com a seguinte descrição (H. Bang, Dissertation, Halle, 1986, Wissenschaftsbereich Biochemie, Galat, vidé supra e Fischer, G. et al., Biomed. Biochim. Acta, 1984, 43, 1101):

Determinação de actividades de isomerase em fluidos corporais: - o sistema de análise depende do princípio do teste acoplado de enzima espectroscópica, isto é, utiliza-se a reacção de uma enzima auxiliar (quimotripsina) para a detecção de isomerases, - por meio de uma proteinase (quimotripsina) a reacção de conformação específica de um substrato peptídico cromofórmico é levada a cabo e vigiada espectroscopicamente, - numa primeira reacção, muito rápida, a proteinase divide selectivamente a conformação trans-, -numa segunda fase, mais lenta, a conformação eis-muda. o não catalisado na forma trans- e pode, a seguir, ser dividido pela proteinase, - isomerases, tais como ciclofilinas, aceleram selectivamente esta conversão cis-trans, - assim, nos fluidos corporais isentos de células as isomerases podem ser analisadas por meio desta detecção espectroscópica, - limite de detecção: nM de isomerase.

De um modo semelhante, com o auxílio de anticorpos específicos presentes contra as ciclofllinas, de acordo com a técnica anterior, podem também ser desenvolvidos processos imunológicos, rádio-químicos e outros.

Em princípio, como processo terapêutico, é clinicamente utilizável um bloqueio da ciclofilina, por exemplo, com ciclosporina A, um agente já utilizado em medicina de transplantes, terapia do reumatismo, terapia da asma e terapia, por exemplo, da psoríase. A sua acção bloqueadora em ciclofllinas pode ser verificada in vitro.

No caso do animal da experiência (rato), a administração de ciclospirina A (CsA) pode suprimir o estado de choque letal iniciado pela injecção de lipopolisacarídio bacteríano (LPS) ou TNFa (factor da necrose do tumor a). A deficiência do fígado foi quantificada nesta experiência por meio da detecção de enzimas típicas de fígado, tais como ALT (GPT), AST (GOT) e ISDH (desidrogenase de sorbitol). Os resultados são mostrados no Quadro 1. Os dados foram medidos 8 horas após o tratamento. O CsA injectado em cada caso foi 50mg/kg i.v. 15 horas e 1 hora antes do tratamento.

Quadro 1

Protecção pela ciclosporina A contra deficiência do fígado induzida por endotoxina ou TNFa séptico em ratos sensibilizados com galactosamina. ALT [U/l] AST [U/l] SDH [U/l] Controlo de não tratados 40 ±4 70 ± 8 40 ± 5 LPS (5 pg/kg) 1500±1025 1044 ±620 544 ± 340 CsA + LPS 86 ±61 160 ± 83 25 ±20 TNF (15 pg/kg) 2650 ±730 2190 ±920 1345 ±370 CsA + TNF-a 260±134 210 ± 68 71 ±49 í ,. 7 U |.Sf

Resultados de investigações clínicas:

Na Figura são mostradas as medições de concentração de ciclofilinas no soro de seis pacientes com doença provocada por choque. Mostra-se que, no caso da medição de ciclofilinas, se se utilizar o processo da detecção enzimática (peptidilo-prolina-cis-trans-isomerase, teste PPlase) as mesmas eram detectáveis apenas no caso de pacientes que tinham quantidades aumentadas ou a aumentar de ciclofilinas no plasma. Surpreendentemente, estas proteínas intracelulares ocorreram numa clara medida já até uma semana antes da morte. Aumentaram consideravelmente pouco tempo antes da morte. Ao contrário, os três pacientes que sobreviveram à doença provocada pelo choque não revelaram um aumento mensurável da concentração de ciclofilina no soro.

Parece, portanto, que as concentrações de ciclofilina superiores a 50 U/ml apontam para um fim letal da situação de choque, representando as concentrações superiores a 20 U/ml um claro sinal de aviso. Método de quantificação e de determinação: O teste PPlase é um processo variável dentro de limites com referência à estrutura molecular do substrato utilizado e a sensibilidade proteolíptica dos PPlases, com as quais mesmo as actividades PPlase podem ser determinadas quantitativamente apenas em materiais biológicos vulgarmente preparados. Para o ser humano recombinar ciclofilinas, a concentração de enzima ainda detectável que pode ser detectada situa-se em cerca de 0,5 ng de ciclofilina por ml de soro. Numa aproximação grosseira, cerca de lnM de ciclofilina corresponde a uma relação de concentração de 1 U/ml. Em ligação com o que acima fica dito, segue-se que um aumento de 5 U/ml representa, assim, um aumento significativo da concentração de ciclofilina e é claramente diferenciável de um valor de 0 U/ml.

Além disso, no soro de doentes de septicemia, não só são claramente quantificáveis quantidades de ciclofilinas verificadas (corresponde a valores positivos), como também moduladores de ciclofilinas. No caso de uma relação negativa (- 40 U/ml), é uma

questão de inibidores. Estes valores foram determinados por exame da influência de sangue septicémico nas ciclofilinas dadas extemamente ao teste PPlase.

Exemplos para a determinação da actividade isomerase: - disponibilização de soro isento de células: - uso de espectrofotómetro UV/VIS com contentor de cadinho ajustável (ajuste a 10°C) - 1 ml de neutralizador hepes é previamente incubado com 1 - 20 μΐ de soro durante 30 segundos, após o que são adicionados 200 μΐ da solução de quimotripsina e imediatamente iniciada com 5 μΐ de uma solução de substrato; - a reacção é continuamente vigiada durante 3 minutos a um comprimento de onda de 390 nm; - as constantes de velocidade da reacção observada de Ia ordem é determinada com o auxílio de um programa de avaliação e corresponde ao U/ml utilizado no gráfico; - uma medição com avaliação requer cerca de 10 minutos no caso do presente processo.

Claims (6)

1. J a. - & /' λ ·* REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a detecção in vitro de estados de choque e de vigilância terapêutica em pacientes em estado de choque, caracterizado pelo facto de se determinar a concentração em ciclofilinas em amostras de sangue dos pacientes com o auxilio de: a) métodos enzimológicos b) métodos de detecção imunológicos com o auxilio de anticorpos específicos; c) processos que utilizam a química dos péptidos; d) processos rádioquimícos; e caracterizado pelo facto de esta concentração servir para a avaliação da importância do choque.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar: a) como método enzimológico, a medição da actividade rotamase ou, b) como método de detecção imunológica, rádio-imuno-ensaios, ensaio ELISA (enzyme linked imuno-sorban) ou c) como processo da química dos péptidos, a cromotografia de afinidade ou d) a ligação de ciclosporina radioactiva sob condições de reacção fisicoquímicas especiais.
3. 3. Uso de medicamentos e de princípios activos biológicos que reduzem a concentração das ciclofilinas activas no sangue de pacientes em estado de choque, para a preparação D de medicamentos para a terapia do choque, em particular do choque séptico, do choque pós-operatório e do choque tóxico.
4. 4. Uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de se utilizar: a) ciclosporinas ou princípios activos aparentados com a ciclosporina e que inactivam as ciclofilinas, b) produtos farmacêuticos que se ligam de maneira específica ou não específica às ciclofilinas e que apresentam características de inactivação, c) inactivadores biológicos das ciclofilinas, anticorpos, fragmentos de anticorpos, enzimas destruidoras de ciclofilinas.
5. 5. Uso de substâncias que ligam ou destroem a ciclofilina para a preparação de agentes de depuração do sangue em pacientes em estado de choque.
6. 6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de estas substâncias serem anticorpos de ciclofilinas, fragmentos de anticorpos de ciclofilina, ou enzimas que destroem as ciclofilinas. Lisboa, 1 o OUT. 2000