PT782706E

PT782706E - Metodo de teste

Info

Publication number: PT782706E
Application number: PT95932083T
Authority: PT
Inventors: Alan George Deeley; Janys Elizabeth Fletcher
Original assignee: Applied Research Systems
Priority date: 1994-09-21
Filing date: 1995-09-20
Publication date: 2001-06-29
Also published as: ATE199184T1; US6309893B1; DE69520108D1; GB9419001D0; JP3578407B2; AU3527395A; EP0782706B1; WO1996009549A1; AU702173B2; DK0782706T3; DE69520108T2; GR3035839T3; EP0782706A1; JPH11503514A; ES2154736T3

Description

t i. > --r DESCRIÇÃO "MÉTODO DE TESTE" A presente invenção refere-se a um método de teste melhorado e a dispositivos para utilização nesse método. Em particular, a invenção refere-se a métodos de teste, em especial imunoensaios, em que se utilizam reagentes libertáveis solúveis. 0 método e dispositivos são, nalgumas formas de concretização, destinados para utilização em processos de testes de ligação específica, em particular em imunoensaios. Na EP-A-0171148, WO92/09892. W093/25892 e WO93/25908 são referidos exemplos de processos deste tipo, em que se podem utilizar reagentes libertáveis solúveis.

No processos de teste descritos na EP-A-0171148 utilizam-se alguns reagentes auxiliares e estes podem ser na forma de um reagente de revestimento libertável, e.g. um revestimento de antigénio ou anticorpo libertável, ou de um seu derivado. Na WO92/09892, em que se descreve um dispositivo que possui uma ou mais regiões de calibração, para fins de referência interna de um método de teste, descreve-se a utilização de uma camada protectora de álcool polivinilico (PVA) , de modo a atrasar a dissolução do reagente solúvel durante uns segundos após a adição da amostra ao dispositivo. Esta libertação atrasada tem por finalidade evitar o alastramento dos reagentes de uma zona para outra, o que iria impedir um teste preciso. No entanto, embora oc tenha alcançado uma eficácia limitada uti 1 i zando esta 1 camada protectora, persistem os problemas de fraca reprodutibilidade e baixa sensibilidade.

Nos processos de teste descritos na W092/09892, o sucesso do método de teste depende da separação espacial (i.e. não mistura) dos vários reagentes solúveis libertados para a solução da amostra. No entanto, noutras técnicas de teste que envolvem apenas um reagente solúvel, é vantajoso assegurar que uma quantidade máxima de reagente libertado permanece numa determinada área definida, a fim de assegurar uma precisão e sensibilidade do teste elevadas.

Adicionalmente, a WO-A-93/025908 (ARS Holdings NVj refere-se em geral às propriedades de libertação retardada de um suporte revestido e sugere o PVA como material adequado para esse suporte. No entanto, não é feita nenhuma sugestão para a utilização do PVA reticulado, como agente de libertação retardada.

Os requerentes verificaram agora que utilizando reagentes alternativos para retardar a libertação do reagente solúvel nos testes, se podem obter melhorias inesperadas na precisão e sensibilidade do tese, comparando com os métodos existentes utilizados.

Assim, de acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, proporciona-se a utilização de PVA reticulado em testes que utilizam um ou mais reagentes libertáveis solúveis, de modo a se obter a libertação retardada dos referidos reagentes libertáveis solúveis. 2

De acordo com outro aspecto da presente invenção, proporciona-se um método para melhorar a precisão do teste, em testes que utilizam um ou mais reagentes libertáveis solúveis, em que a libertação dos referidos reagentes é retardada por meio de PVA reticulado. A técnica da invenção pode ser utilizada para uma variedade de processos de teste químicos e bioquímicos, mas é especialmente útil em conjunção com processos de teste clínicos, mais especialmente, em imunoensaios.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, proporciona-se um dispositivo sensor para um teste, como acima definido, que transporta numa sua superfície um ou mais reagentes libertáveis solúveis, revestidos com, ou incorporados em PVA reticulado. 0 método da presente invenção é aplicável a uma grande variedade de dispositivos incluindo, por exemplo sensores de vareta de medida ou de tiras de teste, dispositivos que utilizam uma configuração com fluxo de amostra ("sample flow-trough”), ou dispositivos que utilizam a retenção de amostra.

Para realizar o método da invenção, preferem-se dispositivos retenção de amostras, sendo um dispositivo mais preferido um dispositivo de enchimento capilar, especialmente um dispositivo capilar fluorescente, por exemplo o tipo de dispositivo descrito na EP-A-171148 ou na WO-90/14590. Estes dispositivos de enchimento capilar podem ser utilizados por si só, ou num suporte adequado, como o descrito na WO-A-90/11830. 3 r'·····.,.' · * -1.. Ί ·'/ 'V—V\,v\> ^

Tal como descrito na EP-A-171148, um dispositivo de enchimento capilar (daqui para a frente CFD) consiste tipicamente de duas placas de material transparente, e.g. vidro, separadas por um espaço ou cavidade estreita. Uma das placas actua como guia de ondas luminosas e transporta um reagente imobilizado, adequado para o teste a ser realizado no dispositivo. Como descrito na WO-90/14590, a outra placa transparente pode possuir na sua superfície afastada da cavidade, uma camada de um material que absorve luz, ou opaco. Para utilização num teste de competição, o reagente imobilizado pode, por exemplo, ser um parceiro de ligação específica do ligando que se pretende detectar e uma das placas pode transportar um reagente dissolvido que compreende um análogo do ligando, marcado com um corante fluorescente (o reagente auxiliar) . Quando uma amostra se apresenta numa das extremidades do CFD, ela é conduzida para a cavidade por acção capilar e dissolve o reagente auxiliar. Num teste de competição para um antigénio, o análogo de antigénio marcado por fluorescência irá competir com o antigénio da amostra para o número limitado de locais de ligação ao anticorpo imobilizados na guia de ondas. Uma vez que a cavidade capilar é estreita (tipicamente de cerca de 100 pm), a reacção estará normalmente completa num período de tempo curto, possivelmente em menos de 5 minutos, dependendo da matriz de amostra, do tipo de teste (e.g. imunoensaio de sanduíche ou competitivo) e da afinidade do anticorpo. Assim, para um teste de competição, a quantidade de antigénio marcado por fluorescência que fica indirectamente liqada à quia de ondas devido à formação do complexo, será inversamente proporcional à concentração de antigénio na amostra. Num teste sanduíche, a guia de ondas transportará um parceiro de ligação, específico para o ligando que se pretende detectar e uma das placas transportará um reagente dissolvido 4 Γ\

que compreende um outro parceiro de ligação especifica, marcado com um corante fluorescente (o reagente auxiliar) . Num ímunoensaio sanduíche para um antigénio, o antigénio da amostra irá formar um complexo sanduíche com um anticorpo marcado por fluorescência e um anticorpo imobilizado na guia de ondas. Assim, para um ímunoensaio sanduíche, a quantidade de anticorpo marcado por fluorescência que fica indirectamente ligado à guia de ondas, devido à formação de complexo, será directamente proporcional à concentração de antigénio na amostra.

Nas técnicas de teste acima descritas, é importante que o reagente marcado por fluorescência, libertável, não se dissolva instantaneamente e seja arrastado para uma das extremidades do dispositivo, afastada da região de captura do anticorpo durante o enchimento do CFD. Se isto acontecer então obtêm-se sinais de teste fracos com uma grande imprecisão, produzindo um resultado sem significado. 0 método da presente invenção assegura que este arrastamento do reagente solúvel é minimizado.

Assim, de acordo com um outro aspecto da presente invenção, proporciona-se um dispositivo para recolha de amostras e teste especificamente reactivo, que possui uma cavidade ou cavidades, tendo cada uma, uma dimensão suficientemente pequena para permitir que o líquido amostra seja arrastado para a cavidade por acção de capilaridade, e em que uma das superfícies da cavidade transporta um reagente imobilizado adequado para o teste a ser realizado no dispositivo e em que a referida superfície é uma superfície de uma placa sólida transparente que, quando utilizada, actua como uma guia de ondas transmissora de luz e forma uma parede da cavidade e em que a superfície (s) da cavidade tem uma ou mais zonas que compreendem, na forma libertável, um reagente (s) 5 auxiliar adequado para o teste pretendido, sendo o referido reagente(s) auxiliar revestido com, ou incorporado num PVA reticulado. A fim de se obter uma libertação retardada adequada do reagente solúvel, por meio de PVA reticulado, podem-se utilizar dois métodos. Num primeiro método, o reagente solúvel é microdoseado no dispositivo. 0 reagente é dissolvido numa solução tampão que contém PVA. Reveste-se o conjugado impresso com uma nova camada de PVA, de forma adequada por pulverização, sendo esta camada de PVA subsequentemente reticulada, de forma adequada por revestimento por pulverização, com um reagente de reticulação. Num segundo método, o reagente solúvel é microdoseado no dispositivo. 0 reagente é dissolvido numa solução tampão contendo PVA. Aplica-se então um reagente de reticulação, adequadamente por revestimento por pulverização, reticulando o PVA presente na solução inicial.

Ambos os métodos resultam na produção de um filme reticulado de PVA na superfície do dispositivo (revestindo o reagente solúvel ou incorporando-o). Para utilização nas técnicas de teste pode-se aplicar, se desejado, um outro revestimento de umectante, e.g., fazendo um revestimento por pulverização de uma solução de sucrose/lactose. Isto ajuda a humidificar o dispositivo pela amostra, facilita o enchimento de um dispositivo do tipo retenção de amostra e melhora a estabilidade dos reagentes, durante o armazenamento. 0 reagente preferido para a reticulação de PVA é uma solução de tetraborato e.g. tetraborato de sódio, embora se possam utilizar outros reagentes de reticulação. Verificou-se que utilizando uma solução a cerca de 0,5-2% de tetraborato se 6 ί 'Κ

obtêm bons resultados, sendo os melhores resultados obtidos utilizando uma solução a cerca de 1%.

Os reagentes poliméricos deverão ser, desejavelmente, independentes do pH. Alternativamente, particularmente para testes baseados em sangue ou soro, os reagentes poliméricos incham de preferência entre pH 7 e 8. Para amostras de urina há muitas vezes uma grande variação no pH das amostras. A utilização de polímeros que são dependentes do pH, i.e. que incham a vários níveis de pH, permite obter um limite de exclusão de pH para os testes i.e., seleccionar apenas as amostras que têm a gama desejada de pH. 0 método da invenção tem particular aplicação em testes de antigénios e anticorpos, i.e. em imunoensaios, e numa forma de concretização da invenção preferida o ligando em teste é um antigénio e o parceiro de ligação específica compreende um anticorpo contra o referido antigénio. No entanto, a invenção não é limitada a testes de anticorpos e antigénios. Na tabela 1 são dados exemplos de ligandos que podem ser testados pelo método de teste melhorado de acordo com a invenção, juntamente com uma indicação de um parceiro de ligação específica adequado, para cada caso. 7

Tabela 1

Ligando Parceiro de ligação especifica antigénio anticorpo específico anticorpo antigénio hormona receptor de hormona receptor de hormona hormona cadeia de polinucleótido cadeia polinucleotídica complementar avidina biotina biotina avidina proeína A imunoglobulina imunoglobulina proteína A enzima cofactor enzimático (substrato) ou inibidor cofactor enzimáticc enzima (substrato) ou inibidor lectinas hidratos de carbono específicos hidratos de carbono lectinas específicos de lectinas 0 método da invenção tem uma vasta aplicação, mas pode ser utilizado em particular em testes para: hormonas, incluindo hormonas peptídicas (e.g., hormonas estimulantes da tiróide (TSH), hormona luteinizante (LH), gonadotrofina coriónica humana (hCG), hormona estimulante de foliculo (FSH), insulina e prolactina) ou hormonas não peptídicas (e.g. hormonas esteróides como o cortisol, estradiol, progesterona e testoesterona ou hormonas tiróides como a tiroxina (T4) e triiodotironina), proteínas (e.g. antigénio carcinoembriónico (CEA) e anticorpos, alfafetoproteína (AFP) e antigénio 8

Ί especifico da próstata (PSA), medicamentos (e.g digoxina, medicamentos de abuso), açúcares, toxinas, vitaminas, vírus como vírus da gripe, para-gripe, adeno-vírus, vírus da hepatite, vírus respiratório e da SIDA, semelhantes a vírus, partículas ou microorganismos.

Deve entender-se que o termo "anticorpo" aqui utilizado inclui: (a) qualquer das várias classes ou subclasses de imunoglobulinas, e.g. IgG, IgA, IgM ou IgE derivadas a partir de qualquer dos animais convencionalmente utilizados, e.g. ovelhas, coelhos, cabras ou ratinhos, (b) anticorpos monoclonais; (c) moléculas intactas ou "fragmentos" de anticorpos, monoclonais ou policlonais, fragmentos esses que contêm a região ligante do anticorpo, i.e. fragmentos destituídos da porção Fc (e.g. Fab, Fab', F(ab')2), os designados fragmentos "meia-molécula" obtidos por clivagem redutora das ligações dissulfureto que ligam os componentes de cadeia pesada no anticorpo intacto, ou fragmentos obtidos por métodos sintéticos, (d) anticorpos produzidos ou modificados por técnicas de ADN recombinantes, incluindo "anticorpos humanizados”. 0 método de preparação dos fragmentos de anticorpos é bem conhecido na arte e não será aqui descrito.

Deve entender-se que o termo "antigénio", tal como aqui utilizado, inclui quer espécies permanentemente antigénicas (por exemplo proteínas, péptidos, bactérias, fragmentos bacterianos, células, fragmentos de células e vírus) e 9 haptenos, que podem ser tornados antigénicos sob condições adequadas. 0 método da presente invenção é aplicável à gama normal de tipos de amostra e.g. urina, amostras à base de soro e de sangue retal. No entanto, observam-se melhorias particularmente surpreendentes em relação às técnicas da arte anterior, quando se realizam testes em amostras de sangue total.

Para uma melhor compreensão da presente invenção, faz-se referência às figuras anexas, em que: A Figura 1 mostra uma secção diagramática através de um dispositivo capilar de fluorescência (daqui para a frente FCFD) de acordo com uma forma de concretização da presente invenção. A Figura 2 mostra uma secção diagramática através de um FCFD utilizado para ilustrar o método da presente invenção. A Figura 3 ilustra de forma esquemática um exemplo das regiões de um FCFD que possui uma região de calibraçâo de acordo com uma forma de concretização da presente invenção. A Figura 4 mostra uma secção diagramática através de um dispositivo do tipo vareta de medida ilustrando também, de forma esquemática, um exemplo das regiões de um dispositivo deste tipo que possui uma região de calibraçâo de acordo com a presente invenção.

Nas Figuras 3 e 4, os símbolos ilustrados representam as seguintes entidades: 10

ο

-C ou 0-C -< antigénio em estudo

Marcador fluorescente análogo de antigénio marcado por fluorescência anticorpo especifico para o antigénio em estudo anticorpo específico para o anticorpo específico do antigénio em estudo

Relativamente à figura 1, o dispositivo apresentado compreende uma placa superior 2 fabricada num material transparente (e.g. um material de plástico, quartzo, sílica ou vidro) que transporta na sua face externa um revestimento opaco 8 e uma placa inferior 4 fabricada num material transparente, tendo ambas as placas cerca de 1 mm de espessura e estando fixadas uma à outra numa relação substancialmente paralela, afastadas de menos de 1 mm por meio de fiadas de ligação, feitas de uma cola adequada .contendo meios distanciadores (não apresentado) . Na forma de concretização apresentada, a cavidade celular 6 assim formada é aberta para o exterior em ambas as extremidades, de modo que quando a amostra líquida é trazida até uma das aberturas da cavidade, por capilaridade, o ar po‘de escapar pela outra abertura. Na forma de concretização apresentada, as duas placas estão desencontradas. A superfície interior da placa superior 2 contém um retalho de reagente 12, adequado ao teste a ser realizado. 0 reagente está contido no dispositivo numa forma libertável, solúvel, mas esta libertação é retardada de acordo com o método da presente invenção. 11

A superfície interior da placa inferior 4 é um retalho de reagente 10 adequado ao teste a ser realizado, estando o referido retalho 10 directamente abaixo do retalho 12 na placa 2. No caso de um imunoensaio, o retalho 10 terá, por exemplo, uma quantidade de anticorpo, ou antigénio, ou hapteno, relevante, imobilizado.

Em seguida descreve-se a operação de utilização do dispositivo apresentado na Fig.l. Embora a descrição seguinte se refira à utilização de um dispositivo num imunoensaio do tipo competitivo, no formato de antigénio marcado, deve entender-se que os dispositivos de acordo com a invenção também são adequados para utilização em imunoensaios do formato anticorpo marcado (ambos do tipo competitivo e do tipo sanduíche) e noutros tipos de teste (tipo sanduíche ou tipo competitivo), ou noutros tipos de testes químicos ou bioquímicos. O líquido amostra passa para o dispositivo na direcção da seta apresentada na Fig. 1. Um curto período de tempo depois, a cavidade enche-se de líquido amostra, o retalho 12 de material dissolve-se, libertando os reagentes nele contidos, para o líquido.

Como referido anteriormente, o retalho 12 está contido na placa superior 2, por meio de material (ais) solúvel (is) adequado(s). Os materiais solúveis adequados incluem revestimentos humectantes, e.g. à base de sucrose ou sorbitol. O reagente no retalho 12 é revestido com, ou está incorporado em PVA reticulado, para proporcionar a libertação retardada de reagente no retalho. Um revestimento adequado de acordo com a 12

V presente invenção demoraria tipicamente 2-10 segundos para se dissolver, após o contacto inicial com o líquido amostra.

Numa forma de concretização do dispositivo do tipo apresentado na Fig. 1, que é montado para um imunoensaio do tipo competitivo para um antigénio, o retalho 12 pode conter um análogo de antigénio marcado por fluorescência. 0 retalho 10 terá então uma quantidade de parceiro de ligação específica imobilizado, o qual é um anticorpo específico para o antigénio em estudo. Assim, após a introdução do líquido amostra, o retalho 12 dissolve-se, libertando o análogo de antigénio para o líquido amostra. O antigénio introduzido no líquido amostra compete com o análogo de antigénio para os locais de ligação epitópicos no anticorpo específico para o antigénio, contido no retalho 10. A quantidade de material fluorescente que fica ligada ao anticorpo específico imobilizado no .retalho 10 será, assim, uma função da concentração de antigénio no líquido amostra. Os imunoensaios ópticos típicos do tipo competitivo, convencionais, envolvem este tipo de equilíbrio competitivo. A libertação retardada do reagente no retalho 12 assegura que uma quantidade máxima de material fluorescente permanece na região ligada pelos retalhos 10 e 12, após o dispositivo ter sido cheio e esta minimização do arrastamento do reagente proporciona um aumento na precisão e sensibilidade do teste.

Em relação à Figura 2, o dispositivo apresentado não é do tipo que seria utilizado num método de teste, mas é concebido para demonstrar a eficácia da presente invenção. 0 dispositivo é essencíalmente o mesmo que o ilustrado na Figura 1, excepto que o retalho 12 está desencontrado em relação ao retalho 10. Assim, em utilização num processo de teste, ao encher o 13 v ,'v X.*-· dispositivo com amostra e realizando o teste, a quantidade de reagente marcado por fluorescência que fica ligado ao retalho 10 será uma medida do arrastamento de reagente do retalho 12. Comparando os testes existentes, incluindo os que utilizam técnicas de libertação retardada conhecidas, com os de acordo com a presente invenção, pode-se demonstrar as melhorias proporcionadas pela presente invenção.

Na Figura 3, o dispositivo apresentado compreende uma placa superior 2 e uma placa inferior 4, tal como no dispositivo da figura 1. Na superfície interior da placa 2 está contido um retalho 12 e na superfície interna da placa 4 está contido um retalho 10, sendo os retalhos e os reagentes nele contidos como acima descrito, em relação à Figura 1. Os retalhos 9 e 13 contidos nas placas 2 e 4, compreendem uma região de calibração, tal como se mostra. A libertação dos reagentes nos retalhos 12 e 13 em utilização, é retardada de acordo com o método da presente invenção. Em utilização, na região ligada pelo par de retalhos 9 e 13, surgirá um sinal elevado inicial a partir da região 9, devido à ligação do complexo do retalho 13 ao reagente imobilizado no retalho 9. Este sinal irá diminuir ao longo do tempo, à medida que o ligando compete com o análogo de ligando marcado, no complexo do retalho 9. A libertação retardada de reagentes dos retalhos 12 e 13 assegura que é libertada uma quantidade máxima dos reagentes respectivos, para as regiões ligadas pelo par de retalhos 10 e 12 e 9 e 13. Ocorre um arrastamento mínimo do reagente a partir do retalho 13, para a região adjacente. Estes factores maximizam a precisão e sensibilidade do teste.

Na Figura 4, o dispositivo apresentado compreende apenas a placa inferior 4, tal como no dispositivo da Figura 1. A 14

^-Ne superfície da placa 4 contém uma zona 10 que contém um retalho de reagentes adequado para o teste a ser realizado. No caso de um imunoensaio, a zona terá, por exemplo, uma quantidade de anticorpo imobilizado relevante, não marcado, direccionado para um primeiro epítopo do ligando em teste e uma quantidade de um anticorpo marcado, direccionado para um segundo epítopo do ligando em teste, estando o anticorpo marcado presente na forma libertável, solúvel, mas sendo a libertação dos reagentes em uso retardada de acordo com o método da presente invenção. A superfície da placa 4 também contém uma zona de calibração 9, que contém um retalho de reagentes adequado para o teste a ser realizado. No caso de um imunoensaio, a zona conterá, por exemplo, uma quantidade de anticorpo imobilizado relevante, não marcado, direccionado para um primeiro epítopo do ligando em teste, uma quantidade de um anticorpo marcado direccionado para um segundo epítopo do ligando em teste e uma quantidade do antigénio em teste tal, que se forma um complexo 1:1:1 entre o antigénio e os dois anticorpos, no decorrer do teste, estando o anticorpo marcado e o antigénio em teste presentes na forma libertável, solúvel, mas sendo a libertação dos reagentes retardada de acordo com o método da presente invenção.

Em seguida descreve-se a operação de uma forma de concretização do dispositivo apresentado na Figura 4. Embora os exemplos de reagentes e a descrição seguinte se refiram à utilização de um dispositivo de imunoensaio do tipo sanduíche, no formato de anticorpo marcado, deve entender-se que os dispositivos também são adequados para imunoensaios no formato de antigénio marcado e para outros tipos de teste (do tipo competitivo), ou outros tipos de testes químicos ou bioquímicos. 15

0 dispositivo é mergulhado no líquido amostra e um curto espaço de tempo depois, o reagente solúvel nos retalhos 9 e 10 dissolve-se. A libertação retardada destes reagentes de acordo com a presente invenção assegura que os reagentes permanecem substancialmente nas regiões mostradas. Assim, a região 10 constitui a medida de teste e a região 9 constitui a região de calibração, com um sinal inicial elevado. A transferência limitada de reagentes solúveis entre as regiões, maximiza a precisão e sensibilidade do teste.

Os exemplos seguintes têm por finalidade ilustrar a aplicabilidade do método de acordo com a presente invenção, sem, no entanto, a limitar.

Exemplo comparativo 1

Preparação de materiais de partida: 1.1 Fabricação de guias de ondas luminosas revestidas com anticorpo

Os anticorpos monoclonais anti-PSA foram fornecidos pela Serono Diagnostics S A, Coinsins, Suiça. Limpou-se uma folha de vidro Permabloc (Pilkington Glass Ltd., St Helens, UK) com uma espessura de cerca de 1 mm, com detergente (e.g. Tween 20) em água ultra-pura, com agitação ultra-sónica. A superfície do vidro foi activada, incubando-a numa solução a 2% de aminopropiltrimetoxisilano em água (pH 3-4) durante 2 horas a 75 °C. Após lavagem em água, a folha de vidro foi seca a 115 °C durante pelo menos quatro horas. O vidro foi então incubado durante 60 minutos numa solução a 2,5 % de gluteraldeído num tampão fosfato 0,05 M (pH 7) e em seguida foi lavado 16 η η>·ν. / intensivamente com água destilada. O anticorpo anti-PSA foi aplicado no vidro, doseando cuidadosamente uma solução a 1% de anticorpo em tampão fosfato (pH 7) no vidro e incubando durante 2 a 4 horas (para formar o retalho 10), após o que a folha de vidro foi lavada com solução tampão. A proteína adsorvida não desejada, foi removida ensopando com ureia 6 M, de um modo conhecido. Por fim, formou-se uma camada de sucrose/lactose na superfície da folha de vidro por revestimento por centrifugação. Isto originou a placa 4 do dispositivo de teste FCFD, como ilustrado na Figura 1. 1.2 Preparação de anticorpo anti-PSA conjugado com aloficocianina (APC):

Conjugou-se um segundo anticorpo monoclonal anti-PSA, que reconhece um epítopo diferente na molécula PSA do anticorpo utilizado em 1.1 acima, com aloficocianina (Gex=650 nm, Dem=660 nm) da Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA e este foi utilizado tal como fornecido. 1.3 Microdoseamento de reagentes específicos numa zona discreta do anticorpo anti-PSA:

Fez-se uma impressão por crivo, de um revestimento opaco, numa folha limpa de vidro Permabloc, como descrito na W0-90/14590. A zona de medida do dispositivo foi fabricada por microdosagem de uma camada de conjugado alnficocianina/anticorpo anti-PSA em tampão, contendo álcool polivinílico numa área de 3 x 7 mm em cima do vidro, ao longo da zona. Após secagem do conjugado ao ar, colocou-se, por microdosagem, uma camada de álcool polivinílico (4% em tampão) sobre o conjugado (para formar o retalho 12) . Por fim, 17 Γ ! νν- revestiu-se toda a folha de vidro com uma camada de sucrose/lactose por revestimento por pulverização. Formou-se assim a placa 2 do dispositivo de teste FCFD, ilustrado na Fig.l 1.4 Fabricação de dispositivos de teste FCFD:

Os dispositivos de teste FCFD, tais como os descritos na EP-A-0171148 foram fabricados por impressão por crivo na guia de onda resultante de 1.1 acima, de fiadas de ligação de uma cola de cura por ultravioleta (UVS 91, Norland Inc., USA) contendo micros feras de vidro de 100 μτα de diâmetro (Jencons Ltd., UK) num padrão que define as extremidades longas dos dispositivos de células capilares Colocou-se em seguida uma folha de vidro como definido em 1.3 acima, sobre a guia de ondas e aplicou-se vácuo ao laminado. Como resultado do vácuo, a folha superior de vidro foi forçada a comprimir-se sobre a cola, definindo as esferas de vidro um espaço de 100 μια entre as folhas de vidro. O laminado foi exposto em seguida a uma fonte de luz ultravioleta, para curar a cola. Por fim, a folha de laminado foi partida em dispositivos de teste individuais, como descrito na EP-A-0171148. 1.5 Aparelho utilizado para medição no teste PSA:

Utilizou-se um aparelho de fluorimetria simples, como descrito na WO92/09892, para realizar medições de teste adequadas, como descrito na WO-90/14590.

Processo teste para PSA: 18

Adicionaram-se amostras de sangue total heparinizado, contendo quantidades conhecidas de PSA, ao dispositivo FCFD e incubou-se à temperatura ambiente, durante 20 minutos.

Utilizaram-se seis FCFD para produzir uma curva padrão "reduzida" (i.e. 0, 10 e 100 ng/ml de PSA) em que se encheram pares de dispositivos com a mesma concentração de PSA. Os dados apresentados na tabela 1 mostram que se obtêm resultados da curva padrão fracos, existindo um sinal máximo baixo e uma fraca reprodutibilidade entre os pares de dispositivos FCFD. Isto resulta do facto de a amostra de sangue total entrar no dispositivo e dissolver "instantaneamente" o conjugado aloficocianina/anticorpo anti-PSA e o transportar ao longo do dispositivo FCFD, para longe da região em que se localiza o anticorpo de captura.

Exemplo comparativo 2

Teste FCFD de sangue total para PSA, sem utilizar nenhuma química de libertação retardada e sem reagentes de teste microdoseados. 2.1 Fabricação de guias de ondas luminosas revestidas com anticorpo:

Como no exemplo 1. 2.2 Fabricação de anticorpo anti-PSA conjugado com aloficocianina (APC):

Como no exemplo 1. 2.3 Fabricação de dispositivos de teste FCFD: 19

Como no exemplo 1. 2.4 Aparelho utilizado na medição do teste de PSA:

Como no exemplo 1.

Processo de teste para PSA:

Misturaram-se volumes iguais de conjugado aloficocianina/anticorpo anti-PSA, com amostras de sangue total contendo PSA e adicionou-se a FCFD. Os testes foram lidos do mesmo modo que no exemplo 1. Os dados mostram (Tabela 2) que se obtém uma boa curva dose/resposta para o teste de sangue total em FCFD.

Exemplo 3 3.1 Fabricação de guias de ondas luminosas revestidas com anticorpo:

Como no exemplo 1. 3.2 Preparação de anti-PSA conjugado com aloficocianina (APC) :

Como no exemplo 1. 3.3 Microdoseamento de reagentes específicos numa zona discreta do anticorpo anti-PSA: 20

Como no exemplo 1, excepto que após o anticorpo ser microdoseado se revestiu por pulverização no topo do conjugado Eudragit NE 30D (Rohm, Pharma, Alemanha) . 3.4 Fabricação de dispositivos de teste FCFD:

Como no exemplo 1. 3.5 Aparelho utilizado na medição do teste de PSA:

Como no exemplo 1.

Procedimento teste para PSA:

Como para o Exemplo 1, excepto que devido à presença de Eudragit, a dissolução do conjugado anticorpo/f luoróforo foi atrasada até a amostra encher o FCFD. Como consequência, o teste de PSA apresentou uma melhor precisão entre as réplicas e obteve-se um maior sinal máximo.

Exemplo 4 4.1 Fabricação de guias de ondas luminosas revestidas com anticorpo:

Como no exemplo 1. 4.2 Preparação de anti-PSA conjugado com alof icocianina (APC) :

Como no exemplo 1. 21

Τ'7 4.3 Microdoseamento de reagentes específicos numa zona discreta do anticorpo anti-PSA:

Como no exemplo 1, excepto que após o anticorpo ter sido microdoseado se revestiu, por pulverização, no topo do conjugado, uma solução a 0,24% de tetraborato em água, para entrecruzar o álcool polivinílico presente na solução de microdosagem. 4.4 Fabricação de dispositivos de teste FCFD:

Como no exemplo 1. 4.5 Aparelho utilizado na medição do teste de PSA:

Como no exemplo 1.

Procedimento teste para PSA:

Como no exemplo 1, excepto que devido à presença do álcool polivinílico entrecruzado, a dissolução do conjugado anticorpo/fluoróforo foi atrasada até a amostra encher o FCFD. Como consequência, o teste de PSA apresentou uma melhor precisão entre as réplicas e obteve-se um maior sinal máximo (Tabela 3):

Exemplo 5

Optimização da concentração de tetraborato 5.1 Fabricação de guias de ondas luminosas revestidas com anticorpo: 22 Γ v vNf

Como no exemplo 1. 5.2 Preparação de anticorpo anti-PSA conjugado com aloficocianina (APC):

Como no exemplo 1. 5.3 Microdoseamento de reagentes específicos numa zona discreta do anticorpo anti-PSA:

Como no exemplo 1, excepto que após o anticorpo ter sido microdoseado se revestiu, por pulverização, no topo do conjugado, soluções de várias concentrações de tetraborato em água, para reticular o álcool polivinílico presente na solução de microdosagem. 5.4 Fabricação de dispositivos de teste FCFD:

Como no exemplo 1. 5.5 Aparelho utilizado na medição do teste de PSA:

Como no exemplo 1.

Procedimento de teste para PSA:

Como no exemplo 1, excepto que devido à presença do álcool polivinílico entrecruzado, a dissolução do conjugado anticorpo/fluoróforo foi retardada até a amostra encher o FCFD. A libertação retardada óptima obteve-se com tetraborato a 1% (Tabela 4). 23 /'· \

Embora os valores na tabela 4 sugiram que a utilização de tetraborato a 0,5% origina uma maior razão sinal de máximo/sinal de ruído de fundo, a repetição do teste não teve tão boa reprodutibilidade como a que se obtém utilizando tetraborato a 1%. Assim, utilizando tetraborato a 1% obteve-se uma melhor precisão do teste.

Exemplo 6

Teste de sangue total para PSA, utilizando métodos de libertação retardada conhecidos e da presente invenção 6.1 Fabricação de guias de ondas luminosas revestidas com anticorpo:

Como no exemplo 1, excepto que o anticorpo de captura foi imobilizado numa região para formar o retalho 10 de um dispositivo, como ilustrado na figura 2. 6.2 Preparação de um anticorpo anti-PSA conjugado com aloficocianina (APC) :

Como no exemplo 1. 6.3 Microdoseamento de reagentes específicos numa zona discreta do anticorpo anti-PSA:

Como no exemplo 1, excepto que os reagentes específicos foram microdoseados numa região para formar o retalho 12 de um dispositivo ilustrado na figura 2. Após microdoseamento dos reagentes, alguns dispositivos foram tratados com tetraborato, enquanto que outros não. 24 ί f-w

6.4 Fabricação de dispositivos de teste FCFD:

Como no exemplo 1 6.5 Aparelho utilizado na medição do teste de PSA:

Como no exemplo 1 Procedimento de teste para PSA:

Adicionaram-se amostras de sangue total contendo PSA ao FCFD e leu-se o sinal de teste da região 10. No caso de estar presente apenas uma camada de protecção de PVA conhecida, não se observou de facto nenhuma libertação retardada no FCFD e os reagentes solúveis foram arrastados ao longo do dispositivo, originando uma curva dose/resposta para o teste PSA (Tabela 5). Quando se utilizou o método de libertação retardada da presente invenção no FCFD, a quantidade de reagente arrastado ao longo do dispositivo era inferior, obtendo-se uma curva dose/resposta bastante reduzida (Tabela 5). O valor 8,580 a uma concentração de PSA de 50 ng/ml na tabela 5 mostra a imprecisão da técnica existente, de incluir apenas uma camada de protecção de PVA. De modo semelhante, a curva de teste neste método tende a ser desviada, i.e. apresenta um grande sinal de ruído de fundo.

Deve ter-se em conta que nos exemplos dados acima, se utilizaram diferentes conjugados em vários dos exemplos, sendo os conjugados de qualidade variada, i.e., originando um sinal máximo diferente. Alguns exemplos utilizaram um conjugado com uma intensidade de cor menor, outros utilizaram um conjugado 25

I

'V V. com uma intensidade de cor maior. Assim, uma comparação linear dos sinais máximos obtidos nos testes não deve ser, em geral, feita entre os exemplos, uma vez que este factor de variação de intensidade não será tomado em consideração nesta comparação.

Concentração de PSA (ng/ml) Sinal (unidades arbitrárias) Sinal médio (unidades arbitrárias 0, 465 0 0, 384 0,412 0,386 1,259 10 1,458 1,174 0,805 1,430 100 1, 432 1,823 2,607

Tabela 1. Camada de PVA conhecida presente no FCFD 1 Concentração de PSA (ng/ml) Sinal (unidades arbitrárias) Sinal médio (unidades arbi trárias) 0 0,581 0, 545 0, 508 10 1,531 1,506 1,480 100 4,666 4,688 1 4,710

Tabela 2. Caracteristicas dose/resposta para um teste FCFD para PSA em sangue total, utilizando reagentes pré-misturados 26 V ; . ’·- ·

Concentração de PSA (ng/ml) Sinal (unidades arbitrárias) Sinal médio (unidades arbitrárias 0, 665 0 0,561 0, 646 0,713 1,262 10 1,226 1,287 1,373 2,069 100 2,010 2,012 1, 956

Tabela 3. Reagente de libertação retardada de álcool polivinílico entrecruzado presente no FCFD

Concentração de tetraborato (%) concentração de PSA (ng/ml) Sinal (unidades arbitrárias 0 0, 525 0,5 10 2,554 100 6,872 0 0, 479 1,0 10 2,138 100 6, 089 1,5 0 0,481 10 1, 961 100 4,913 0 0,459 100 10 1, 857 100 5,398

Tabela 4. Efeito de variações na concentração de tetraborato 27

Tratamento Concentração de PSA (ng/ml) Sinal I (unidades arbitrárias I camada de protecção 0 1,546 de PVA conhecida 5 2,539 (essencialmente 10 4,086 nenhuma química de 50 8,580 libertação retardada) 100 6,195 PVA mais tetraborato 0 0,514 (método de libertação 5 0,850 retardada da presente 10 1,855 invenção) 50 1,980 100 2,390

Tabela 5. Efeito do método de libertação retardada PVA/tetraborato

Lisboa, 30 de Março de 2001. ..·.. ofícial da ;n:d; i.striaf

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Claims

' * ^Vv'' ""V' REIVINDICAÇÕES 1. Método para melhorar a precisão de teste num teste que utiliza um ou mais reagentes libertáveis solúveis, em que a libertação do referido reagente é retardada por meio de um agente de libertação retardada que compreende PVA reticulado.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido teste é um imunoensaio.
3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o teste é calculado numa amostra de sangue total.
4. Dispositivo sensor para utilização num método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que transporta numa sua superfície um ou mais agentes libertáveis, solúveis, revestido com, ou incorporado num agente de libertação retardada que compreende um PVA reticulado.
5. Dispositivo sensor de acordo com a reivindicação 4, que é um dispositivo de retenção de amostra. 1 7 6.

Dispositivo sensor de acordo com a reivindicação 5 que é um dispositivo de enchimento capilar.
7. Dispositivo sensor de acordo com a reivindicação 6, que é um dispositivo de enchimento capilar, fluorescente.
8. Processo para a preparação de um dispositivo sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, em que o referido agente de libertação retardada compreende um PVA reticulado, incluindo o referido processo os seguintes passos: (a) dissolver o reagente libertável, solúvel numa solução tampão, contendo opcionalmente PVA, (b) microdosear o reagente libertável solúvel numa superfície adequada de um dispositivo sensor, (c) revestir opcionalmente o reagente libertável, solúvel, microdoseado, assim formado, com uma camada de PVA, (d) introduzir um agente de reticulação no agente libertável, solúvel, de modo a reticular o PVA, (e) introduzir opcionalmente um material transportador solúvel, que é um umectante.
9. Processo de acordo com a reivindicação 8, em que a reticulação é realizada por meio de uma solução de tetraborato. 2
10. Processo de acordo com a reivindicação 9, em que a solução de tetraborato é uma solução aproximadamente a 1%.
11. Utilização de um agente de libertação retardada num teste que utiliza um ou mais agentes libertáveis solúveis, revesti aos com, ou incorporados no referido agente de litercacãc retardada, compreendendo PVA reticulado, opc-ouuimente em conjunto com um material transportador soluve i. Lisboa, 30 de Março de 2001.

OFJClAL DA PROPRJEDA

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