PT766682E

PT766682E - Inibidores da proteina-cinase c

Info

Publication number: PT766682E
Application number: PT95923985T
Authority: PT
Inventors: James Ronald Gillig; Michael Robert Jirousek
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1994-06-22
Filing date: 1995-06-19
Publication date: 2001-11-30
Also published as: DE69522109T2; EP0766682A1; US5491242A; AU2866995A; DE69522109D1; ATE203991T1; EP0766682A4; DK0766682T3; ES2159318T3; JPH10502910A; GR3037074T3; WO1995035294A1; EP0766682B1

Description

~ψ£> <b é>% 2 - 1-

Λ **· DESCRIÇÃO ”INIBIDORES DA PROTEÍNA-CINASE C" A proteína-cinase C (PCC) corresponde a uma família de enzimas intimamente relacionadas que actuam como cinases da serina/treonina. A proteína-cinase C desempenha um papel importante na sinalização intercelular, na expressão de genes e no controlo da diferenciação e crescimento celular. Presentemente, são conhecidas, pelo menos, dez isoenzimas de PCC, que diferem entre si na respectiva distribuição no tecido, especificidade enzimática e regulação. Nishizuka Y. Annu. Rev. Biochem. 58: 31-44 (1989); Nishizuka Y. Science 258: 607-614 (1992).

As isoenzimas da proteína-cinase C são constituídas por cadeias polipeptídicas simples com uma dimensão que varia entre os 592 e os 737 aminoácidos. As isoenzimas possuem uma subunidade reguladora e uma subunidade catalítica conectadas através de um péptido de ligação. As subunidades reguladoras e catalíticas podem estar ainda subdivididas em zonas constantes e variáveis. A subunidade catalítica da proteína-cinase C é muito semelhante à observada em outras proteína-cinases, ao passo que a subunidade reguladora é única às isoenzimas da PCC. As isoenzimas da PCC exibem uma homologia ao nível dos aminoácidos entre 40-80%, dentro do grupo. No entanto, a homologia de uma única isoenzima entre espécies diferentes é geralmente superior a 97%. A proteína-cinase C é uma enzima relacionada com a membrana, sendo regulada alostericamente por vários factores, incluindo pelos fosfolípidos

da membrana, cálcio e determinados lípidos da membrana, tais como diacilgliceróis, que são libertados em resposta à actividade de fosfolipases. Bell, R.M. e Bums, D .J., J. Biol. Chem. 266:4661-4664 (1991); Nishizuka, Y. Science 258. 607-614 (1992). As isoenzimas da proteína-cinase C, alfa, beta-1, beta-2 e gama, requerem fosfolípidos da membrana, cálcio e ésteres de diacilglicerol/forbol para a respectiva activação plena. As formas delta, epsilon, eta e teta da PCC são independentes de cálcio no seu modo de activação. As formas zeta e lambda da PCC são independentes de cálcio e diacilglicerol e crê-se que necessitem apenas de fosfolípidos da membrana para a respectiva activação.

Numa determinada doença podem estar envolvidas apenas uma ou duas isoenzimas da proteína-cinase C. Por exemplo, os elevados níveis de glucose encontrados na diabetes originam um aumento específico da isoenzima beta-2 nos tecidos vasculares. Inoguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:11059-11065 (1992). O aumento, relacionado com a diabetes, da isoenzima beta nas plaquetas humanas tem sido correlacionado com a alteração da resposta destas na presença de agonistas. Bastyr III, E.J. e Lu, J. Diabetes 42: (Suplemento 1) 97A (1993). Tem-se demonstrado que o receptor humano da vitamina D é selectivamente fosforilado pela proteína-cinase C beta. Esta fosforilação tem sido relacionada com alterações no funcionamento do receptor. Hsieh et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 9315-9319 (1991); Hsieh et al., J. Biol. Chem. 268: 15118-15126 (1193). Além disso, trabalho recente demonstrou que a isoenzima beta-2 é responsável pela proliferação celular na eritroleucemia enquanto que a isoenzima alfa está envolvida na diferenciação megacariocitária nestas mesmas células. Murray et al., J. Biol. Chem. 268: 15847-15853 (1993). A natureza ubíqua das isoenzimas da proteína-cinase C e os seus papéis importantes na fisiologia constituem incentivos para produzir inibidores de PCC altamente selectivos para determinadas isoenzimas. Dada a evidência que demonstra a ligação de determinadas isoenzimas com condições médicas, é razoável assumir que os compostos inibitórios que sejam selectivos para uma ou duas isoenzimas da proteína-cinase C relativamente às outras isoenzimas da PCC são agentes terapêuticos superiores. Tais compostos deverão exibir uma maior eficácia e uma menor toxicidade devido à sua especificidade. A arte identifica como já conhecidas várias classes de compostos como inibidores da proteína-cinase C. Sabe-se também que alguns destes compostos possuem especificidade para a proteína-cinase C. No entanto, muito pouco se sabe no que se refere à selectividade para a isoenzima. Estudos efectuados sobre o composto selectivo para a PCC, 3-[l-(3-dimetilaminopropil)-indol-3-il]-4-(lH-indol-3-il)-lH-pirrolo-2,5-diona, sugerem uma ligeira selectividade para as isoenzimas dependentes de cálcio, mas não encontram qualquer selectividade entre as isoenzimas alfa, beta-1, beta-2 e gama. Toullec et al., J. Biol. Chem. 266: 15771-15781 (1991). Martiny-Baron, et al., J. Biol. Chem. 268: 9194-9197 (1993) testaram o mesmo composto e encontraram uma ligeira selectividade para as isoenzimas alfa e beta versus delta, epsilon e zeta. Martiny-Baron não observou quaisquer diferenças na selectividade entre as isoenzimas alfa e beta-1. Wilkinson et al., Biochem. J. 294: 335-337 (1993) não conseguiu observar qualquer grau elevado de selectividade para as isoenzimas e sugere apenas ligeiras selectividades para a isoenzima alfa e uma inibição idêntica das isoenzimas beta, gama e epsilon para várias espécies de bis-indolomaleimidas. Consequentemente, apesar de anos de investigação, existe uma necessidade de inibidores terapeuticamente eficazes que sejam selectivos para determinadas isoenzimas. A US-A-5.380.766 divulga alguns derivados de bis-(lH-indol-3-il)maleinimida, os quais são inibidores da proteína-cinase C. -4-

A presente invenção proporciona compostos que são altamente selectivos para as isoenzimas. Os compostos inibem selectivamente as isoenzimas beta-1 e beta-2 da proteína-cinase C. Por consequência, a presente invenção proporciona também um método para inibir selectivamente as isoenzimas beta-1 e beta-2 da proteína-cinase C. Como inibidores selectivos das isoenzimas beta-1 e beta-2, os compostos são terapeuticamente proveitosos para tratar condições associadas com a diabetes mellitus e as suas complicações, assim como outras condições médicas associadas com um aumento das isoenzimas beta-1 e beta-2. A presente invenção proporciona compostos, que inibem selectivamente as isoenzimas beta-1 e beta-2 da proteína-cinase C, da Fórmula I:

(I) em que: R] é da Fórmula II: x

NKP, (II) R2 é hidrogénio, alquilo, acilo, alcoxialquilo, hidroxialquilo, -5- /<$. ^^ aminoalquilo, monoalquilaminoalquilo, dialquilaminoalquilo, acilaminoalquilo, N3-alquilo ou um aminoácido da Fórmula (III):

R3 é H ou CH3; R4 é uma cadeia lateral de aminoácido; X é -(CH2)n-NH-, -(CH2)n-0-, fenileno-NH-, fenileno-O- ou uma ligação;

Pi é H, alquilo ou um grupo de protecção de amino; e n é 1, 2 ou 3. A invenção proporciona ainda um método para inibir selectivamente as isoenzimas beta-1 e beta-2 da proteína-cinase C, o qual compreende a administração a um mamífero necessitado de tal tratamento de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um composto da Fórmula I. Na sua condição de inibidores selectivos, a invenção proporciona ainda um método para tratar a diabetes mellitus, que compreende a administração a um mamífero necessitado de tal tratamento de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um composto da Fórmula I. A invenção proporciona também formulações farmacêuticas compreendendo um composto da Fórmula I associado com um ou mais excipientes, veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.

Como assinalado acima, a invenção proporciona compostos da Fórmula I que inibem selectivamente isoenzimas da proteína-cinase C. em que: Ri é

Os compostos preferidos são os compostos da Fórmula Ia:

; e R2 é aminoalquilo, monoalquilaminoalquilo ou dialquilamino- alquilo.

Os compostos particularmente preferidos são aqueles em que R4 é H, CH3, CH2CH(CH3)2 ou

/ e Pi é t-butoxicarbonilo (BOC) ou benziloxicarbonilo (CBZ).

Tal como aqui utilizado, o termo "alquil", sozinho ou em -7- combinações, significa um grupo alquilo de cadeia linear ou ramificada contendo de um a sete, preferencialmente de um a quatro, átomos de carbono, tais como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, sec-butilo, t-butilo e pentilo. O termo "alquilo Q.4" é um alquilo limitado à cadeia de um a quatro átomos de carbono. O termo "alcoxi", sozinho ou em combinações, é um alquilo ligado covalentemente à parte principal através de uma ligação -0-. São exemplos de grupos alcoxilo o metoxilo, etoxilo, propoxilo, isopropoxilo, butoxilo e t-butoxilo. Um alcoxialquilo é, por exemplo, CH3(CH2)z-0-(CH2)z- em que z é de um a sete ou, preferencialmente, de um a quatro. A parte de acilo, sozinha ou em combinação, é derivada de um ácido alcanóico contendo um máximo de sete, preferencialmente um máximo de quatro, átomos de carbono (e.g. acetilo, propionilo ou butirilo) ou de um ácido carboxílico aromático (e.g. benzoílo). Um acilamino é, por exemplo, CH3(C=0)NH- (acetilamino). De forma semelhante, um acilaminoalquilo é CH3(C=0)NH(CH2)z- em que z é de um a sete ou preferencialmente de um a quatro. O termo "cadeia lateral de aminoácido" representa a zona variável dos aminoácidos de ocorrência natural, os quais são das fórmulas: ch3 ch3 >- \ ^CH—CH2- CH3—CH2—CH— 1 ch3 ch3-, ch3 t ch3 t (Ala) (Vai) (Leu) (Ile) -8- 4 ν> η \ ¢.-

CH3-S-CH2-CH2-, Η—, HO-CH2, H2N-CH2-CH2-CH2-CH2- (Met) (Gli) (Ser) (Lis) OH 1 ch3—ç— H , hs-ch2-, HO^ $ nh2 0 (Tre) (Cis) (Tir) (Asn) H2N—C--NH—CH2—CH2—CH2— I! NH í HC-C—CH->— 1 1 m S h2n^ ^c-ch2-ch2 0 (Arg) (His) (Gin) H°\ 0 HO \ ,c-ch2-ch2 , OU 0 (Asp) (Glu) Ο termo "grupo de protecção de amino", tal como aqui utilizado, refere-se aos substituintes habitualmente utilizados para bloquear ou proteger 0 grupo funcional amino. Os grupos de protecção de amino preferidos são o -9-

t-butoxicarbonilo e o benziloxicarbonilo. Outros grupos de protecção de amino podem ser encontrados em J. W. Barton, Protective Groups in Organic Chemistrv, J.G.W. McOmie, Ed, Plenum Press, Nova Iorque, 1973, Capítulo 2 e T. W. Greene, Protective Groups in Organic Svnthesis. John Wiley and Sons, Nova Iorque, 1981, Capítulo 7, aqui incorporados por referência. O termo relacionado "amino protegido" define um grupo amino substituído com um grupo de protecção de amino, como discutido previamente. O termo "quantidade farmaceuticamente eficaz", tal como aqui utilizado, representa uma quantidade de um composto da invenção que é capaz de inibir selectivamente a actividade das isoenzimas da PCC em mamíferos. A dose específica do composto administrado de acordo com a presente invenção será, evidentemente, determinada por um médico nas circunstâncias particulares que envolvem o caso, incluindo o composto administrado, a via de administração, o estado particular a ser tratado e considerações semelhantes. Os compostos podem ser administrados por uma diversidade de vias incluindo as vias oral, rectal, transdérmica, subcutânea, tópica, intravenosa, intramuscular ou intranasal. O termo "tratar", tal com aqui utilizado, descreve a gestão e o acolhimento de um paciente para o propósito de combater a doença, condição ou perturbação e inclui a administração de um composto da presente invenção para prevenir o começo dos sintomas ou complicações, para aliviar os sintomas ou complicações ou para eliminar a doença, condição ou perturbação. O termo "selectivo para a isoenzima" significa a inibição preferencial das isoenzimas beta-1 e beta-2 da proteína-cinase C relativamente ás isoenzimas da proteína-cinase C, alfa, gama, delta, epsilon, zeta e eta. Em geral, os compostos exibem, no mínimo, um diferencial de oito vezes, preferencialmente um diferencial de dez vezes, na dosagem requerida para inibir a isoenzima beta-1 ou beta-2 da PCC relativamente à dosagem requerida para -10-

originar uma inibição idêntica da isoenzima alfa da proteína-cinase C, como determinado através do ensaio de PCC. Os compostos exibem este diferencial ao longo da gama de inibição e são exemplificados pelo valor de IC50, i.e. uma inibição de 50%. Consequentemente, a invenção proporciona um método para inibir selectivamente a isoenzima beta-1 ou beta-2 da proteína-cinase C. Uma frase relacionada é "inibindo selectivamente as isoenzimas beta-1 e beta-2 da proteína-cinase C", a qual se refere à inibição selectiva de isoenzimas. Deste modo, devido ao facto de se necessitar de uma concentração de composto substancialmente mais elevada para inibir as outras isoenzimas da proteína-cinase C (e.g., o Exemplo 1 divulga uma inibição de 50% à concentração de 0,031 pmole/L para a isoenzima beta-2, enquanto que o IC50 relativamente à isoenzima alfa da proteína-cinase C é de 1,4 pmol/L), uma dosagem farmaceuticamente eficaz do composto inibe as isoenzimas beta-1 e beta-2 da proteína-cinase C com uma baixa toxicidade em virtude de provocar uma inibição mínima das outras isoenzimas. Surpreendentemente, as bis-indolilmaleimidas contendo dois aminoácidos (i.e., Ri é da Fórmula II e R2 é da Fórmula III) têm uma aparência amarela. Isto constitui uma vantagem acentuada já que um composto amarelo não interfere com a realização de ensaios ou monitorização da urina de pacientes que tomem o fármaco. A preparação de bis-indolilmaleimidas da Fórmula:

Ri' R2* (IV)

em que R,' é hidrogénio e R2' é hidrogénio, alquilo, alcoxialquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, monoalquilaminoalquilo, dialquilaminoalquilo ou acilami-noalquilo, está divulgada na Patente dos Estados Unidos 5.057.614 e é conhecida na arte como está evidenciado pela EPO 397 060 (1990) e por Bit et al., J. Med. Chem. 36: 21-29 (1993). A Patente dos Estados Unidos 5.057.614 é aqui incorporada por referência.

Os compostos de Fórmula I são preparados fazendo reagir um composto de fórmula IV com um aminoácido activado da Fórmula V:

(V) em que P2 é um grupo de protecção de amino; e R* é uma cadeia lateral de aminoácido. A acilação do Composto IV com o aminoácido activado (Composto V) é levada a cabo em acetonitrilo na presença de 18-coroa-6 e de anião fluoreto, sob condições básicas. Os compostos contendo uma amina (e.g. Exemplo 2) são preferencialmente preparados com piridina como base, por razões de solubilidade. A base preferida quando a solubilidade do substrato não é importante é a diisopropiletilamina. As condições reaccionais e outros solventes aceitáveis são conhecidos na arte e estão descritos em Klausner, et al., J. Chem. Soe. Perkin I: 607-631 (1977); e Nakagawa, et al., J, Am. Chem. Soc.. 105: 3709-3710(1983).

Os compostos de Fórmula V estão comercialmente disponíveis ou -12-podem ser preparados por metodologias conhecidas, e.g., Wolmay Y et al., J. Chem. Soc. C: 689 (1967); Bodanszky M et al., J. Amer. Chem. Soc.. 81: 2504 (1959); Sakakibara S et al., Buli. Chem. Soc. Jpn., 37: 1231 (1964).

Quando se preparam compostos de Fórmula I, em que X é -(CH2)n-NH-, -(CH2)n-0-, fenileno-NH- ou fenileno-O-, a espécie de ligação, X, é acrescentada à bis-indolilmaleimida antes do acoplamento. Assim, por exemplo, quando Ri é

Ri' é aminoalquilo. De forma semelhante, quando Ri é

Rj' é hidroxialquilo. Quando X é -(CH2)n-0- ou fenileno-O-, a reacção de acoplamento pode ser, altemativamente, levada a cabo com diciclo-hexilcarbodiimida e 4-dimetilaminopiridina, sob condições de acoplamento padronizadas, conhecidas na arte.

Em consequência das suas partes ácidas, os compostos de Fórmula I incluem os seus sais de adição de base farmaceuticamente aceitáveis. Tais sais incluem aqueles que são derivados de bases inorgânicas tais como hidróxidos de amónio e de metais alcalinos e alcalino-terrosos, carbonatos, bicarbonatos e -13- semelhantes, assim como os sais derivados de aminas orgânicas básicas tais como as aminas alifáticas e aromáticas, diaminas alifáticas, hidroxialcaminas e semelhantes. As bases proveitosas na preparação de sais da presente invenção incluem, desta forma, hidróxido de amónio, carbonato de potássio, bicarbonato de sódio, hidróxido de cálcio, metilamina, dietilamina, etilenodiamina, ciclo-hexilamina, etanolamina e semelhantes.

Devido à parte básica, os compostos de Fórmula I podem também existir como sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis. Os ácidos habitualmente utilizados para formar tais sais incluem ácidos inorgânicos tais como os ácidos clorídrico, bromídrico, iodídrico, sulfurico e fosfórico, assim como ácidos orgânicos tais como os ácidos para-toluenossulfónico, metanos-sulfónico, oxálico, para-bromofenilsulfónico, carbónico, succínico, cítrico, ben-zóico, acético e os ácidos inorgânicos e orgânicos relacionados. Tais sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de sulfato, pirossulfato, bissulfato, sulfito, bissulfito, fosfato, mono-hidrogenofosfato, di-hidrogenofosfato, metafos-fato, pirofosfato, cloreto, brometo, iodeto, acetato, propionato, decanoato, caprilato, acrilato, formato, isobutirato, caproato, heptanoato, propiolato, oxalato, malonato, succinato, suberato, sebacato, fumarato, maleato, 2-butin-l,4-dioato, 3-hexin-2,5-dioato, benzoato, clorobenzoato, hidroxibenzoato, metoxibenzoato, fíalato, xilenossulfonato, fenilacetato, fenilpropionato, fenilbutirato, citrato, lactato, hipurato, β-hidroxibutirato, glicolato, maleato, tartrato, metanossulfonato, propanossulfonato, naftaleno-l-sulfonato, naftaleno-2-sulfonato, mandelato e semelhantes.

Para além dos sais farmaceuticamente aceitáveis, a invenção inclui também outros sais. Estes podem servir como intermediários na purificação de - 14- .sQi h^rh

I compostos ou na preparação de outros sais, ou são proveitosos para a identificação, caracterização ou purificação.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos de Fórmula I podem também surgir na forma de vários solvatos, tais como os solvatos com água, metanol, etanol, dimetilformamida, acetato de etilo e semelhantes. Podem ser também preparadas misturas destes solvatos. A fonte deste solvato poderá ser o solvente de cristalização, inerente ao solvente de preparação ou cristalização, ou extrínseca a este solvente. Estes solvatos estão dentro do âmbito da presente invenção.

Reconhece-se que podem existir várias formas estereoisoméricas dos compostos de Fórmula I; por exemplo, Ri introduz um átomo de carbono quiral. Os compostos são normalmente preparados como racematos e podem ser convenientemente utilizados como tal. No entanto, se for desejado, podem ser isolados ou sintetizados enantiómeros particulares utilizando técnicas convencionais. Estes racematos e enantiómeros particulares e as misturas destes constituem parte da presente invenção.

Os exemplos que se seguem são proporcionados meramente para ilustrar ainda mais a presente invenção. O âmbito da invenção não se interpreta como consistindo meramente dos exemplos que se seguem. Nos exemplos e preparações seguintes o ponto de fusão, espectro de ressonância magnética nuclear, espectro de massa, cromatografia líquida de alta eficiência, N,N-dimetilformamida, paládio sobre carbono, hidreto de diisobutilalumínio, acetonitrilo e tetra-hidrofurano estão abreviados como p.f., RMN, MS, HPLC, DMF, Pd/C, DIBAL, ACN e THF, respectivamente. Os termos "RMN" e "MS" indicam que o espectro foi consistente com a estrutura desejada.

Exemplo 1 3-[ 1 -(3-azidopropil)-3-indolil]-4-[( 1 -N^BOCj-glicina-S-indolil]-1 H-pirrol-2,5-diona

Transferiu-se 3-[ 1 -(3-azidopropil)-3-indolil]-4-[3-indolil]- lH-pir-rol-2,5-diona (0,20 g, 0,49 moles, 1 eq.) para um balão de fundo redondo, seco em estufa, com 50 ml de capacidade, munido de barra de agitação, septo e balão de N2. Dissolveu-se o sólido vermelho em cerca de 25 mL de acetonitrilo anidro (transferido através de uma cânula) e iniciou-se a agitação. À solução vermelha, juntou-se o éster />-nitrofenílico da (N^BOCj-glicina (0,22 g, 0,74 mmoles, 1,5 eq.), 18-coroa-6 (0,13 g, 0,49 mmoles, 1 eq.) e N,N-diisopropiletilamina (0,08 g, 0,61 mmoles, 1,25 eq., 0,11 mL) e fluoreto de potássio (0,06 g, 0,98 mmoles, 2 eq.) sob agitação vigorosa. Esta solução vermelha foi mantida em agitação sob atmosfera de N2 durante 5 dias. A análise da reacção por ccf (50% de AcOEt em hexanos) revelou o desaparecimento total dos materiais de partida. Diluiu-se a reacção com 100 mL de AcOEt, transferiu-se para uma ampola de decantação, e lavou-se, primeiro, com água e depois com uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio. A camada orgânica foi seca sobre MgS04. O solvente foi removido in vacuo obtendo-se um óleo vermelho. Este óleo foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica utilizando como fase móvel 37,5% de AcOEt em hexanos, para proporcionar 0,2055 g de um sólido laranja. RMN, MS Análise Elementar: -16- -16- i ! í>~ ^

Teórico: C 63,48 N 17,27 H5,15

Experimental: C 63,53 N 16,28 H 5,64

Exemplo 2 3-[ 1 -(3-N,N'-dimetilaminopropil)-3-indolil]-4-[(l -N-tB0C)-glicina-3-indolil]-1 H-pirrol-2,5-diona

Transferiu-se 3-[ 1 -(3-N,N'-dimetilaminopropil)-3-indolil]-4-[3- indolil]-lH-pirrol-2,5-diona (0,05 g, 0,12 mmoles, 1 eq.) para um balão de fundo redondo, com 100 ml de capacidade, munido de barra de agitação, septo e balão de N2. Juntou-se acetonitrilo anidro (70 mL) através de uma cânula, seguida de piridina (0,05 g, 0,62 mmoles, 5 eq., 0,05 mL) através de uma seringa. A suspensão laranja resultante foi aquecida a 50°C durante 60 minutos para auxiliar a solubilização dos compostos. Após 60 minutos, adicionou-se, sob agitação vigorosa e na forma de sólidos, o éster p-nitrofenílico da (N-lBOC)-glicina (0,07 g, 0,24 mmoles, 2 eq.), a 18-coroa-6 (0,06 g, 0,24 mmoles, 2 eq.) e o fluoreto de potássio seco (0,03 g, 0,48 mmoles, 4 eq.). A solução amarela/laranja resultante foi mantida em agitação à temperatura ambiente, sob atmosfera de N2 durante 48 horas. MS. RMN de protão (300 MHz em CDCI3): 1,48 (s, 9H, grupo t-butilo do BOC), 2,4 (2H, NCH2Ctf2CH2N(CH3)2), 2,95 (6H, -N(CH3)2), 3,25 (2H, CH2N(CH3)2), 3,7 (2H, C(=0)Ctf2NHBOC), 4,55 (2H, NC/72CH2CH2N(CH3)2), 5,18 (1H, NtfBOC), 6,57-7,4 (10H, aromáticos), 8,2 (d, J=9 Hz, 1H, protão C2’ do indolo acetilado), 8,6 (1H, NH da maleimida).

Exemplo 3 3,4-Bis[(l -N^BOQ-fenilalanina-S-indolil]-1 H-pirrol-2,5-diona

Transferiu-se 3,4-Bis[3-indolil]-lH-pirrol-2,5-diona (0,165 g,

0,5 mmoles, 2 eq.) para um balão de fundo redondo, seco em estufa, com 50 mL de capacidade, munido de barra de agitação, septo e balão de N2. Juntou-se acetonitrilo anidro (25 mL) através de uma cânula e iniciou-se a agitação \ produzindo-se uma solução vermelha. A solução, adicionou-se em seguida o éster p-nitrofenílico da (N-lBOC)-fenilalanina (0,67 g, 1,75 mmoles, 3,5 eq.), 18-coroa-6 (0,13 g, 0,5 mmoles, 2 eq.) e diisopropiletilamina (0,16 g, 1,25 mmoles, 2,5 eq., 0,22 mL), mantendo-se sob agitação vigorosa. Após dissolução total, juntou-se fluoreto de potássio anidro (0,12 g, 2 mmoles, 4 eq) sob a forma dum sólido. Esta solução foi mantida em agitação sob atmosfera de N2, à temperatura ambiente durante a noite.

Após 16 horas de agitação, a análise por ccf (50% de AcOEt em hexanos) revelou o desaparecimento do material de partida. Transferiu-se a solução amarela para uma ampola de decantação contendo 150 mL de AcOEt. Esta solução foi lavada, primeiro, com água e depois com uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio. A fase orgânica foi recolhida e depois seca sobre MgS04. O solvente foi eliminado para originar um resíduo amarelo/laranja brilhante. Este resíduo foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica utilizando como fase móvel 37,5% de AcOEt em hexanos, para originar um filme amarelo brilhante, após a remoção do solvente. O HPLC deste sólido continuou a revelar algumas impurezas, pelo que o produto foi purificado utilizando colunas hidrofóbicas de permeação de gel usando clorofórmio como fase móvel, para proporcionar 229 mg de um sólido amarelo brilhante. RMN, MS (FD (em MeOH): PM 821,94; m/z 822 (MH4).

Exemplo 4 3-[ 1 -(3-acetamidopropil)-3-indolil]-4-[(l -N-tB0C)-glicina-3-indolil]-1 H-pirrol-2,5-diona

Num balão de fundo redondo, com 100 ml de capacidade, munido de barra de agitação e de um adaptador 14/22, dissolveu-se 3-[l-(3-azidopropil)-3-mdolil]-4-[(l-N-tBOC)-glicina-3-indolil]-lH-pirrol-2,5-diona (80 mg, 0,14mmoles, 1 eq.) em acetato de etilo. Juntou-se, sob agitação vigorosa, catalisador de Lindlar (quantidade catalítica, 8 mg) e anidrido acético (40 mg, 0,39 mmoles, 3 eq) até se obter uma solução vermelha. Colocou-se um balão de hidrogénio no topo do balão. O balão foi em seguida evacuado e enchido 3 vezes com hidrogénio para remover o oxigénio dissolvido na solução. Manteve-se a solução sob agitação à temperatura ambiente, sob atmosfera de hidrogénio, durante a noite.

Após agitação durante a noite, a análise da reacção por ccf (50% de - 19-

AcOEt em hexanos) revelou o desaparecimento do material de partida. Filtrou-se a reacção através de uma almofada de Celite para remover o catalisador de hidrogenação. Transferiu-se a solução vermelha para uma ampola de decantação e diluiu-se com 100 mL de AcOEt. A fase orgânica foi lavada, primeiro, com água e depois com uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio, e em seguida recolhida e seca sobre MgS04. O solvente foi eliminado para originar um resíduo laranja. O resíduo foi purificado utilizando colunas de cromatografia de permeação de gel de exclusão molecular usando clorofórmio como fase móvel, para proporcionar 52,4 mg dum resíduo laranja. MS (FD (em MeOH): PM 583,65; m/z 584 (MH"), 426 (M+-aminoácÍdo).

Exemplo 5 3 - [ 1 -(3-azidopropil)-3-indolil]-4-[( 1 -N-lBOC)-alanina-3 -indolil]-1 H-pirrol-2,5-diona

Transferiu-se a azida (0,36 g, 0,88 mmoles, 1 eq.) para um balão de fundo redondo, seco, com 100 ml de capacidade, munido de barra de agitação, septo e balão de N2. Transferiu-se acetonitrilo anidro para o balão através de uma cânula e iniciou-se a agitação. À solução vermelha, mantida sob agitação vigorosa, juntou-se, sob a forma de sólidos, a 18-coroa-6 (0,23 g, 0,88 mmoles, 1 -20- -20-

r eq.) e o éster /?-nitrofenílico da (N^BOQ-alanina (0,48 g, 1,54 mmoles, 1,75 eq) e, através de seringa, a diisopropiletilamina (0,14 g, 1,10 mmoles, 1,25 eq). A solução vermelha foi mantida em agitação sob atmosfera de N2 durante a noite.

Após 16 horas de agitação, a ccf (37,5% de AcOEt em hexanos) revelou o desaparecimento do material de partida. A solução foi diluída com AcOEt, transferida para uma ampola de decantação e lavada, primeiro, com água e depois com uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio. A camada orgânica foi recolhida, seca sobre MgSC>4 e o solvente eliminado. O óleo laranja resultante foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica usando 37,5% de AcOEt em hexanos como fase móvel, para proporcionar 0,42 g (82% de rendimento) de um sólido vermelho/laranja. (300 MHz em CDC13): 1,42 (d, J=6 Hz, 3H, grupo metilo da cadeia lateral de alanina), 1,5 (s, 9H, grupo t-butilo do grupo de protecção BOC), 2,0 (m, 2H, NCH2CH2CH2N3), 3,2 (m, 2H, NCH2CH2CH2N3), 4,2 (m, 2H, NCH2CH2CH2N3), 5,13 (m, 1H, protão α da alanina), 6,8-8,4 (m, 10H, aromáticos).

Exemplo 6 3-[ 1 -(3-N,N'-dimetilaminopropil)-3-indolil]-4-[3-indolil]- lH-pirrol-2,5-diona

H H N N

CH3 -21 - c

Transferiu-se 3-[l-(3-N,N'-dimetilaminopropil)-3-indolil]-4-[3-indolil]-lH-pirrol-2,5-diona (0,11 g, 0,27 mmoles, 1 eq.) para um balão de fundo redondo, seco, com 100 ml de capacidade, munido de barra de agitação, septo e balão de N2. Transferiu-se acetonitrilo anidro (25 mL) para o balão através de uma cânula e iniciou-se a agitação. A suspensão vermelha/laranja adicionou-se piridina (0,11 g, 1,35 mmoles, 5 eq) através de uma seringa. Em seguida, juntou-se à suspensão 18-coroa-6 (0,14 g, 0,54 mmoles, 2 eq.) e o éster p-nitrofenílico da (N-BOC)-leucina (0,19 g, 0,54 mmoles, 2 eq) na forma sólida. Em seguida, adicionou-se, rapidamente e sob agitação vigorosa, KF seco (0,06 g, 1,08 mmoles, 4 eq) na forma sólida. A agitação vigorosa foi mantida sob N2, a 50°C, utilizando um banho-maria. (Após cerca de 3 horas, a suspensão transformou-se numa solução vermelha/laranja.)

Após 3 dias, a ccf (10% de MeOH em acetona) revelou o desaparecimento do material de partida. A reacção foi diluída com AcOEt e lavada, primeiro, com água e depois com uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio. A camada orgânica foi recolhida, seca sobre MgS04 e o solvente eliminado para originar um óleo vermelho/laranja. O óleo foi purificado por cromatografía em coluna (gel de sílica) usando 10% de MeOH em acetona como fase móvel, para proporcionar 0,11 g de um sólido avermelhado. MS. RMN de protão (300 MHz em DMSO-d$): 0,70 e 0,76 (d, 3H cada, J=6,6 Hz, grupos -CH3 da cadeia lateral de leucina), 0,83 (t, J=7,2 Hz, 1H, CH da cadeia lateral de leucina), 1,17 (s, 6H, -N(CH3)2), 1,39 (s, 9H, grupo BOC), 1,59 (m, 2H, hidrogénios beta na cadeia lateral de leucina), 1,84 (m, 2H, NCH2CH2CH2N), 2,17 (m, 2H, NCH2CH2CH2N(CH3)2), 4,28 (m, 2H, NCH2CH2CH2N(CH3)2), 4,56 (largo, 1H, NHBOC), 4,77 (m, 1H, protão alfa da cadeia lateral de leucina), 6,6-8,2 (m, 10H, protões aromáticos), 11,2 (s, 1H, NH da maleimida).

Exemplo 7

Cloridrato de 3-[l-(3-N,N'-dimetilaminopropil)-3-indolil]-4-[3-indolil]-1 H-pirrol-2,5-diona

Num balão de fundo redondo, seco, com 100 ml de capacidade, munido de barra de agitação, septo e balão de N2, suspendeu-se cloridrato de 3-[ 1 -(3-N,N'-dimetilaminopropil)-3-indolil]-4-[3-indolil]-lH-pirrol-2,5-diona (0,25 g, 0,56 mmoles, 1 eq.) em 25 mL de acetonitrilo anidro. Adicionou-se 18-coroa-6 (0,30 g, 1,12 mmoles, 2 eq.) e o éster p-nitrofenílico da (N-BOC)-fenilalanina (0,43 g, 1,12 mmoles, 2 eq) na forma de sólidos, seguido de piridina (0,27 g, 3,36 mmoles, 6 eq) através de uma seringa. Juntou-se, à suspensão mantida sob agitação vigorosa, KF anidro na forma dum sólido. A temperatura do balão foi aumentada para 55°C utilizando um banho-maria e a suspensão foi mantida sob agitação durante a noite, sob atmosfera de azoto, a 55°C (após cerca de 3 horas, a suspensão transformou-se numa solução.)

Após 36 horas de agitação a 55°C, a reacção foi diluída com -23-

300 mL de acetato de etilo, transferida para uma ampola de decantação e lavada, primeiro, com água e depois com uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio. A camada orgânica foi recolhida, seca sobre MgS04 e o solvente foi removido no evaporador rotativo. O óleo laranja foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica utilizando 10% de MeOH em acetona como fase móvel. A remoção do solvente originou 0,13 g (39%) de um sólido laranja. MS. RMN de carbono (75 MHz em CDC13): 26,4, 28,3, 28,5, 29,3, 31,7,

129,5,133,0,133,3,135,2,135,6,136,3,170,2,171,6,172,0.

Exemplo 8

Cloridrato de 3-[l-(3-N,N'-dimetilaminopropil)-3-indolil]-4-[3-indolil]-lH-pirrol-2,5-diona

H E

Transferiu-se cloridrato de 3-[l-(3-N,N'-dimetilaminopropil)-3-indolil]-4-[3-indolil]-lH-pirrol-2,5-diona (0,25 g, 0,56mmoles, 1 eq.) para um balão de fundo redondo, seco, com 100 ml de capacidade, munido de barra de -24- 'ν frVW- γ% Μ *

agitação, septo e balão de N2. Transferiu-se acetonitrilo anidro (25 mL) para o balão de fundo redondo através de uma cânula, seguido de piridina (0,27 g, 3,36 mmoles, 6 eq) através de uma seringa. A suspensão vigorosamente agitada, adicionou-se 18-coroa-6 (0,30 g, 1,12 mmoles, 2 eq.), o éster /?-nitrofenílico da (N-CBZ)fenilalanina (0,47 g, 1,12 mmoles, 2 eq) e KF (0,13 g, 2,24 mmoles, 4 eq) sob a forma de sólidos. A suspensão foi aquecida a 50°C utilizando um banho-maria. (Após cerca de 3 horas de agitação, a suspensão transformou-se numa solução vermelha/laranja.) A solução foi mantida sob agitação a 50°C, durante 4 dias.

Após 4 dias, a ccf (10% de MeOH em acetona) não revelou a presença de qualquer material de partida. A reacção foi diluída com AcOEt e transferida para uma ampola de decantação. Aquela foi lavada, primeiro, com água e depois com uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio. A camada orgânica foi recolhida, seca sobre MgSC>4 e o solvente removido para originar um óleo laranja. O óleo foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica usando 10% de MeOH em acetona como fase móvel. O sólido cor de laranja resultante continha ainda algumas impurezas, pelo que foi purificado por cromatografia de filtração de gel utilizando CHC13 como fase móvel. MS. RMN de carbono (75 MHz em CDC13): 24,7,43,4,43,7, 45,8, 55,2, 66,8, 110,1, 113,3, 133,4, 116,4, 121,2, 121,7, 122,0, 122,8, 123,9, 125,7, 126,6, 127,0, 127,6, 127,7,127,8,127,9, 128,0, 128,1, 128,3, 128,4, 128,6, 129,6, 129,8, 134,4,134,6, 135,0, 136,0,154,9, 172,0.

Como foi anteriormente assinalado, os compostos da presente invenção são inibidores selectivos, potentes das isoenzimas beta-1 e beta-2 da PCC. Como tal, eles são proveitosos no tratamento de condições associadas com a diabetes mellitus e com as suas complicações, assim como no tratamento de outras condições médicas associadas com um aumento das isoenzimas beta-1 e beta-2. -25-

rO c. A proteína-cinase C beta-1 e beta-2 tem sido relacionada com a diabetes. Inoguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 11059-11065 (1992). A actividade excessiva da proteína-cinase C tem sido relacionada com defeitos de sinalização da insulina e, consequentemente, com a resistência à insulina observada na diabetes do Tipo II. Karasik, A. et al., J. Biol. Chem. 265: 10226-10231 (1990); Chen, K.S. et al., Trans. Assoe. Am. Phvsicians 104: 206-212 (1991); Chin, J.E. et al., J. Biol. Chem. 268: 6338-6347 (1993). Para além disso, estudos realizados têm mostrado um aumento acentuado da actividade da proteína-cinase C em tecidos que são susceptíveis a complicações diabéticas quando expostos a condições hiperglicémicas. Lee, T.-S. et al., J. Clin. Invest. 83: 90-94 (1989); Lee, T.-S. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 5141-5145 (1989); Craven, P.A. e DeRubertis, F.R. J. Clin. Invest. 83: 1667-1675 (1989); Wolf, B.A. et al., J. Clin. Invest. 87: 31-18 (1991); Tesfamariam, B. et al., J. Clin. Invest. 87: 1643-1648 (1991); Bastyr III, E.J. e Lu, J., Diabetes 42: (Suplemento 1) 97A (1993). A capacidade dos compostos da presente invenção para inibir selectivamente as isoenzimas beta-1 e beta-2 da proteína-cinase C foi determinada no Ensaio de Enzima PCC.

Ensaio de Enzima PCC

Enzimas PCC = alfa, beta I, beta II, gama, delta, epsilon, eta e zeta.

Os componentes de ensaio num volume total de 250 pL são os seguintes:

Vesículas consistindo de 120 pg/mL de fosfatidilserina (Avanti Polar Lipids) e de uma quantidade de diacilglicerol (Avanti Polar Lipids) suficiente para activar a -26-

At í^.kí'' £- enzima para a sua máxima actividade em tampão de HEPES 20 mM (Sigma,, St. Louis, Missouri), pH 7,5, cloreto de cálcio 940 μΜ (Sigma, St. Louis, Missouri) apenas para os ensaios com as enzimas alfa, beta I, beta II e gama, EGTA 1 mM para todas as enzimas, cloreto de magnésio 10 mM (Sigma, St. Louis, Missouri) e ATP (gama-32P) 30 μΜ (DuPont). Histona tipo HL (Worthington) ou proteína básica mielina é utilizada como substrato para todas as enzimas. O ensaio é iniciado através da adição da enzima proteína-cinase C incubada a 30°C durante 10 minutos e parado através da adição de 0,5 mL de ácido tricloroacético frio (Amresco) seguido de 100 pL de albumina de soro de bovino 1 mg/ml (Sigma, St. Louis, Missouri). O precipitado é recolhido por filtração em vácuo, sobre filtros de fibra de vidro, empregando um sistema de filtração TOMTEC™ e quantificado por contagem num contador de cintilação beta.

Utilizando a metodologia descrita, compostos representativos foram avaliados, tendo-se observado valores de IC50 relativamente às isoenzimas beta-1 e beta-2 inferiores a 10 pm. Os compostos são selectivos para as isoenzimas, i.e., os compostos inibem preferencialmente as isoenzimas beta-1 e beta-2 da proteína-cinase C relativamente às isoenzimas da proteína-cinase C, alfa, gama, delta, epsilon, zeta e eta. Em geral, os compostos exibem, neste ensaio, um diferencial mínimo de oito vezes na dosagem requerida para inibir a isoenzima beta-1 ou beta-2 da PCC relativamente à dosagem requerida para uma inibição igual da isoenzima alfa da proteína-cinase C. Consequentemente, como inibidores selectivos da isoenzima beta-1 e beta-2 da PCC, os compostos são proveitosos no tratamento de condições nas quais a beta PCC tem mostrado possuir um papel na respectiva patologia, em particular, a diabetes mellitus e as suas complicações. O Quadro 1 mostra a actividade de vários compostos representativos. -27-

Quadro 1 IC50 (μηι)

Ex. α pi β2 y δ ε ζ η 1 1,4 0,26 0,031 19 4,6 ΝΑ 100 2,6 2 2,3 0,15 0,04 2,6 2,9 6,1 45 0,37 3 83 8 2,6 >100 >100 ΝΑ >100 ΝΑ ΝΑ - dados não disponíveis.

Os compostos de Fórmula I são formulados antes da respectiva administração. Uma formulação farmacêutica compreende um composto da Fórmula I com um ou mais excipientes, veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis. As formulações farmacêuticas são preparadas por procedimentos conhecidos utilizando ingredientes bem conhecidos e facilmente disponíveis. Na produção de formulações, o ingrediente activo será habitualmente misturado com um veículo, ou diluído por um veículo, ou encerrado dentro de um veículo, que pode estar na forma de cápsula, saqueta, papel ou outro recipiente. Quando o veículo é utilizado como diluente, este pode ser um material sólido, semi-sólido ou líquido que actua como um veículo, excipiente ou meio para o ingrediente activo. Assim, as formulações podem surgir na forma de comprimidos, pílulas, pós, pastilhas, saquetas, hóstias, elixires, suspensões, emulsões, soluções, xaropes, aerossóis (na forma de sólido ou num meio líquido), cápsulas de gelatina macia e dura, supositórios, soluções estéreis injectáveis e pós estéreis embalados.

Alguns exemplos de veículos, excipientes e diluentes apropriados incluem a lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, amidos, goma-arábica, fosfato de cálcio, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de cálcio, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, celulose, xarope, metilcelulose, metil e propil-hidroxibenzoatos, talco, estearato de magnésio e óleo mineral. As -28-

*·Ί formulações podem incluir adicionalmente agentes lubrificantes, agentes humectantes, emulsionantes e agentes de suspensão, conservantes, edulcorantes ou aromatizantes. As formulações da invenção podem ser formuladas para proporcionar uma libertação rápida, sustentada ou retardada do ingrediente activo, após administração ao paciente. As formulações são preferencialmente formuladas numa forma de dosagem unitária, contendo cada dose de cerca de 5 a cerca de 500 mg, mais habitualmente de cerca de 25 a cerca de 300 mg, do ingrediente activo. No entanto, deverá entender-se que a dosagem terapêutica administrada será determinada pelo médico tendo em consideração as circunstâncias relevantes, as quais incluem a condição a ser tratada, a selecção do composto a ser administrado e a via de administração escolhida e, consequentemente, as gamas de dosagem acima descritas não têm a intenção de limitar, de forma alguma, o âmbito da invenção. O termo "forma de dosagem unitária" refere-se a unidades físicamente discretas apropriadas como dosagens unitárias para pacientes humanos e outros mamíferos, contendo cada unidade uma quantidade pré-determinada de material activo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com um veículo farmacêutico apropriado.

Para além das formulações acima descritas, os compostos da presente invenção podem ser administrados por via tópica. As formulações tópicas são pomadas, cremes e geles.

Em geral, as pomadas são preparadas utilizando (1) uma base oleaginosa, i.e., consistindo de óleos ou hidrocarbonetos fixos, tais como petrolatum branco ou óleo mineral, ou (2) uma base absorvente, i.e., consistindo de uma substância anidra ou substâncias que podem absorver água, por exemplo, lanolina anidra. Habitualmente, após a formação da base, seja ela oleaginosa ou absorvente, o ingrediente activo (composto) é adicionado numa quantidade que proporcione a concentração desejada.

Os cremes são emulsões óleo/água. Eles consistem de uma fase oleosa (fase interna), compreendendo óleos e hidrocarbonetos tipicamente fixados e semelhantes, tais como ceras, petrolatum, óleo mineral e semelhantes, e uma fase aquosa (fase contínua), compreendendo água e quaisquer substâncias solúveis em água, tais como sais adicionados. As duas fases são estabilizadas através da utilização de um emulsionante, por exemplo, um tensioactivo, tal como laurilsulfato de sódio; colóides hidrofílicos, tais como argilas coloidais de goma-arábica, silicato de alumínio magnésio coloidal (veegum) e semelhantes. Uma vez obtida a emulsão, o ingrediente activo (composto) é habitualmente adicionado numa quantidade que proporcione a concentração desejada.

Os geles compreendem uma selecção da base a partir de uma base oleaginosa, água ou uma base emulsão-suspensão, tais como as supradescritas. À base é adicionado um agente de gelificação que forma uma matriz na base aumentando a sua viscosidade. São exemplos de agentes de gelificação a hidroxipropilcelulose, os polímeros de ácido acrílico e semelhantes. Habitualmente, o ingrediente activo (composto) é adicionado à formulação na concentração desejada no momento precedente à adição do agente de gelificação. A quantidade de composto incorporado numa formulação tópica da invenção não é crítica; a concentração deverá apenas estar numa gama suficiente para permitir a aplicação fácil da formulação à área de tecido afectado, numa quantidade que proporcione a quantidade desejada de composto. A quantidade habitual de formulação tópica a ser aplicada a um tecido afectado dependerá da dimensão do tecido afectado e da concentração de composto na formulação. De um modo geral, a formulação será aplicada a um tecido afectado numa quantidade que proporcione de cerca de 1 a cerca de 500 pg de composto por cm -30- /4rC I?*. rl"1 de tecido afectado. Preferencialmente, a quantidade de composto aplicado variará de cerca de 30 a cerca de 300 pg/cm2, mais preferencialmente, de cerca de 50 a cerca de 200 pg/cm e, nos mais preferidos de todos, de cerca de 60 a cerca de 100 pg/cm2.

Os seguintes exemplos de formulações são apenas ilustrativos e não tencionam, de forma alguma, limitar o âmbito da invenção.

Formulação 1 Cápsulas de gelatina dura são preparadas utilizando os seguintes ingredientes:

Quantidade (mg/cápsula)

Ingrediente activo 250

Amido, seco 200

Estearato de magnésio 10

Total 460 mg

Os ingredientes acima são misturados e enchidos em cápsulas de gelatina dura, em quantidades de 460 mg.

Formulação 2

Um comprimido é preparado utilizando os seguintes ingredientes: -31- ^ \

Quantidade (mg/comprimido)

Ingrediente activo 250

Celulose, microcristalina 400

Dióxido de silício, fumado 10 Ácido esteárico 5

Total 665 mg

Os componentes são misturados e prensados para formar comprimidos, pesando cada um 665 mg.

Formulação 3 É preparada uma solução de aerossol contendo os seguintes componentes:

Quantidade (mg/cápsula)

Ingrediente activo 0,25

Etanol 29,75

Propulsor 22 70,00 (clorodifluorometano)

Total 100,00 O composto activo é misturado com etanol. A mistura é adicionada a uma porção do propulsor 22, arrefecida a -30°C e transferida para um dispositivo de enchimento. A quantidade requerida é em seguida transferida para um recipiente de aço inoxidável e diluída com o remanescente do propulsor. As válvulas são em seguida adaptadas aos recipientes. -32- \

ο c

Formulação 4

Comprimidos contendo cada um 60 mg de ingrediente activo são preparados da seguinte forma:

Quantidade (mg/ comprimido) Ingrediente activo 60 mg Amido 45 mg Celulose, microcristalina 35 mg Polivinilpirrolidona 4 mg (solução a 10% em água) Carboximetil amido de sódio 4,5 mg Estearato de magnésio 0,5 mg Talco 1 mg

Total 150 mg O ingrediente activo, o amido e a celulose são passados através de um peneiro de malha N° 45 (Estados Unidos) e misturados vigorosamente. A solução de polivinilpirrolidona é misturada com os pós resultantes, os quais são depois passados através de um peneiro de malha N° 14 (Estados Unidos). O granulado produzido desta forma é seco a 50°C e passado através de um peneiro de malha N° 18 (Estados Unidos). O carboximetil amido de sódio, o estearato de magnésio e o talco, previamente passados através de um peneiro de malha N° 60 (Estados Unidos), são em seguida adicionados ao granulado, o qual, após ser misturado, é prensado numa máquina para produzir comprimidos pesando cada um 150 mg.

Formulação 5 Cápsulas contendo cada uma 80 mg de medicamento são preparadas da seguinte forma:

Ingrediente activo Quantidade (mg/cápsula) 80 mg Amido 59 mg Celulose microcristalina 59 mg Estearato de magnésio 2 mg Total 200 mg O ingrediente activo, a celulose, o amido e o estearato de magnésio são misturados, passados através de um peneiro de malha N° 45 (Estados Unidos) e enchidos em cápsulas de gelatina dura em quantidades de 200 mg.

Formulação 6

Supositórios contendo cada um 225 mg de ingrediente activo podem ser preparados da seguinte forma: Ingrediente activo Quantidade (mg/cápsula) 225 mg Glicéridos de ácidos gordos saturados 2,000 mg Total 2,225 mg I -34-

&

<-ν\ Ο ingrediente activo é passado através de um peneiro de malha N° 60 (Estados Unidos) e suspendido nos glicéridos de ácidos gordos saturados previamente fundidos através da aplicação do calor necessário. A mistura é em seguida vertida para dentro de moldes de supositório de capacidade nominal 2 g e deixada a arrefecer.

Formulação 7

Suspensões, contendo cada uma 50 mg de medicamento por dose de 5 mL, são preparadas da seguinte forma:

Quantidade (mg/cápsula) Ingrediente activo 50 mg Carboximetilcelulose de sódio 50 mg Xarope 1,25 mL Solução de ácido benzóico 0,10 mL Aroma q.b. Corante q.b. Água purificada q.b.p. 5 mL O medicamento é passado através de um peneiro de malha N° 45 (Estados Unidos) e misturado com a carboximetilcelulose de sódio e o xarope para formar uma pasta macia. A solução de ácido benzóico, aroma e corante são diluídos com um pouco de água e adicionados mantendo sob agitação. Em seguida, é adicionada a quantidade suficiente de água para perfazer ao volume requerido. -35-

Formulacão 8

Uma formulação intravenosa pode ser preparada da seguinte forma:

Quantidade (mg/cápsula)

Ingrediente activo 250 mg

Solução salina isotónica 1000 mg A solução dos ingredientes anteriores é administrada por via intravenosa a uma velocidade de 1 mL por minuto a um paciente necessitado de tal tratamento.

Lisboa, 27 de Agosto de 2001

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA i

Claims

- 1 -

ί REIVINDICAÇÕES 1. Um composto da fórmula: em que:

/ x

R2 é hidrogénio, alquiloCi.7, aciloCi_7, alcoxiCi_7-alquiloCi„7, hidroxialquiloCi.7, aminoalquiloCi.7, monoalquilCi_7aminoalquiloCi_7, dial-quilCi.7aminoalquiloCi.7, acilCi.7aminoalquiloCi.7, N3-alquiloCi.7 ou um aminoácido da fórmula:

R3 é H ou CH3; η -2-

pi*.rV R4 é independentemente uma cadeia lateral de aminoácido, sendo a citada cadeia lateral de aminoácido o local variável de um aminoácido de ocorrência natural; X é -(CH2)n-NH-, -(CH2)n-0-, fenileno-NH-, fenileno-O- ou uma ligação; Pi é independentemente H, alquiloCi_7 ou um grupo de protecção de amino; e n é independentemente 1,2 ou 3; ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável.
2. Um composto da Reivindicação 1, em que R2 é alquilo, acilo, alcoxialquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, monoalquilaminoalquilo, dialquilaminoalquilo, acilaminoalquilo, N3-alquilo de C5-C7 ou um aminoácido da fórmula:
-3-

em que: R.2 é aminoalquilo, monoalquilaminoalquilo, dialquilaminoalquilo;

Pi é H, t-butoxicarbonilo ou benziloxicarbonilo.

3. Um composto da Reivindicação 2 da fórmula:
4. Um composto da Reivindicação 3 da fórmula:

em que: R4 é independentemente uma cadeia lateral de aminoácido; e Pi é independentemente H, t-butoxicarbonilo ou benziloxicarbonilo.
5. Um composto da fórmula:

Ri R2 -4-

•-i em que: Ri é da fórmula: / x

R2 é hidrogénio, alquiloCi.7, aciloCi.7, alcoxiCi.7-alquiloCi_7, hidroxialquiloCi.7, aminoalquiloCi.7, monoalquilCiJ/aminoalquiloCi^, dialquilCi. 7aminoalquiloC1.7, acilCi.7aminoalquiloCi.7, N3-alquiloCi_7 ou um aminoácido da fórmula:

R3 é H ou CH3; R4 é uma cadeia lateral de aminoácido, sendo a citada cadeia lateral de aminoácido o local variável de um aminoácido de ocorrência natural; X é -(CH2)n-NH-, -(CH2)n-0-, fenileno-NH-, fenileno-O- ou uma ligação; Pi é H, alquiloCi_7 ou um grupo de protecção de amino; e né 1,2 ou 3; ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável.
6. Um composto como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 para ser utilizado como um farmacêutico.
7. Uma formulação farmacêutica compreendendo como ingrediente activo um composto como reivindicado em qualquer uma das -5- reivindicações 1 a 5, associado com um ou mais excipientes, veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.
8. Um processo para preparar um composto como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, o qual compreende a reacção de um composto da fórmula:

em que: R2 é hidrogénio, alquilo, acilo, alcoxialquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, monoalquilaminoalquilo, dialquilaminoalquilo, acilaminoalquilo ou N3-alquilo; com um aminoácido activado da fórmula:

em que P2 é um grupo de protecção de amino; e R4 é uma cadeia lateral de aminoácido. Lisboa, 27 de Agosto de 2001 ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industriai RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA