PT752473E - Clonagem e caracterização do gene flba de h. pylori; produção de estirpes aflageladas - Google Patents

Description

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Descrição "Clonagem e caracterização do gene fIbA de H. pylori; produção de estirpes aflageladas" 0 Helicobacter pylori (igualmente designado pela expressão H. pylori) é uma bactéria gram negativa encontrada até hoje exclusivamente à superfície da mucosa do estômago do ser humano.

Como na maior parte das bactérias, o H. pylori é sensível a um meio de pH ácido, mas pode no entanto tolerar a acidez na presença de teores fisiológicos de ureia (Marshall et al (1990) Gastroenterol. 99: 697-702). Na hidrólise da ureia sob a forma de dióxido de carbono e de amoníaco que são libertadas no microambiente da bactéria, a urease de H. pylori permite a sobrevivência da bactéria no meio ácido do estômago. Recentemente os estudos efectuados sobre os modelos animais forneceram elementos que sugerem que a urease é um factor importante na colonização da mucosa gástrica (Eaton et al. (1991) Infec. Immun. 59: 2470-2475). Suspeita-se igualmente que a urease provoque quer danos directos, quer danos indirectos à mucosa gástrica.

Actualmente o Helicobacter pylori (H. pylori) é reconhecido como agente etiológico das gastrites antrais, e aparece como um dos cofactores necessários para o desenvolvimento de úlceras. Além disso, parece que o desenvolvimento dos carcinomas gástricos possa estar associado à presença de H. pylori.

Com o objectívo de desenvolver meios novos sensíveis e específicos para a detecção in vitro de infecções por bactérias da espécie Helicobacter pylori os inventores interessaram-se no sistema de regulação da mobilidade destas bactérias. 2

Com este objectivo eles interessaram-se em diferentes modificações de estirpes de H. pylori, modificações que não afectaram o reconhecimento destas bactérias pelos soros de doentes infectados, mas que permitem contudo uma reacção do tipo "falso positivo" em particular com as bactérias da familia de Campylobacter e por exemplo, Campylobacter jejuni.

Os inventores constataram além disso que as bactérias modificadas obtidas podiam ser eventualmente utilizadas no âmbito do fabrico de composições imunogénicas ou de vacinas. Neste contexto, a invenção propõe em particular estirpes bacterianas vivas atenuadas.

Numa primeira etapa, os inventores identificaram e isolaram o gene flbA que está implicado na regulação da biossintese dos flagelos de H. pylori e consequentemente, na regulação da mobilidade da bactéria. A biossintese dos flagelos compreende a síntese das flagelinas A e B, e da bainha. 0 gene flbA regula tanto a síntese das flagelinas A e B, e a síntese da bainha contendo estas flagelinas. Os inventores estabeleceram que o gene flbA era igualmente interessante porque regulava a biossintese da proteína de ancoragem da bactéria, ainda chamada "gancho". 0 presente documento descreve por isso uma sequência nucleotidica do gene flbA que regula a biossintese das proteínas dos flagelos de Helicobacter pylori, caracterizada por ser capaz de se hibridizar em condições de elevada severidade com uma sonda correspondente a um fragmento de nucleótidos de H. pylori amplificados com o auxílio de dois nucleótidos que respondem às sequências seguintes:

OLFlbA-1; ATGCCTCGAGGTCGAAAAGCAAGATG 3 OLFlbA-2: GAAATCTTCATACTGGCAGCTCCAGTC, ou capaz de se hibridizar em condições de elevada severidade com os seus nucleótidos.

Uma tal sequência pode ser obtida através das etapas de : -pesquisa de um banco genómico contendo o ADN cromossómico de uma estirpe de H. pylori com uma sonda correspondente a um fragmento de nucleótidos de H. pylori amplificado com o auxilio de dois oligonucleótidos que correspondem às sequências seguintes:

OLFlbA-1; ATGCCTCGAGGTCGAAAAGCAAGATG OLFlbA-2: GAAATCTTCATACTGGCAGCTCCAGTC, ou capaz de se hibridizar em condições de elevada severidade com os seus nucleótidos. -recuperação das sequências de ADN que hibridizam com a dita sonda, -subclonagem das sequências de ADN obtidas num vector adequado do tipo plasmídeo e selecção destes vectores modificados que se hibridizam em condições de elevada severidade com a sonda correspondente ao fragmento de ADN de H, pylori amplificado com o auxilio dos oligonucleótidos OLFlbA-1 e OLFlbA-2 -sequênciação dos fragmentos de ADN contidos nos vectores plasmidicos que se hibridizam com a sonda referida acima e determinação da fase aberta de leitura contida naqueles fragmentos.

De forma vantajosa vai-se utilizar estes fragmentos de ADN para reconstituir a sequência de codificação do gene flbA que corresponde a uma fase aberta de leitura que comporta cerca de 2196 nucleótidos. 4 0 banco genómico contendo ADN cromossómico de H. pylori pode ser obtido a partir de qualquer estirpe de H. pylori. Pode-se também preparar um banco cosmidico a partir do ADN cromossómico de H. pylori.

Uma estirpe utilizável para a realização deste banco é por exemplo a estirpe N6 depositada na NCIMB em 26 de Junho de 1992, sob o número NCIMB40512.

Os dois iniciadores oligonucleótidos utilizados para preparar a sonda destinada à hibridização do ADN investigado presente na banda de ADN de H. pylori são escolhidos entre as regiões conservadas das diferentes proteínas da família LcrD/FlbF.

Os dois iniciadores oligonucleótidos OLFlbA-1 e OLFlbA-2 permitiram amplificar um fragmento utilizável como sonda de 130 pares de bases correspondente à sequência seguinte:

ATG CCA GGA AAG CAA ATG GCG ATT GAT GCÔ GAT TTA AAT TCA GGG CTT ATT GAT GAT AAG GAA GCT AAA AAA CGG CGC GCC GCT CTA AGC CAA GAA GCG GAT TTT TAT GGT GCG ATG GÁT GGC GCG TCT AAA TTT

As condições de severidade elevada de que se fala acima são as seguintes: a hibridação é realizada a 42°C na presença de 50% de formamida num tampão 2XSSC contendo 0,1% de SDS (1XSSC correspondendo a 0,15 M de NaCl mais 15 mM de citrato de sódio - pH 7,0). As lavagens são realizadas com 2XSSC mais 0,1 % de SDS a 68°C por exemplo duas vezes durante uma hora.

Uma sequência nucleótidica particularmente interessante para obter uma estirpe bacteriana recombinante de acordo com a invenção resulta na mutação da sequência do gene flbA correspondente ao encadeamento de nucleótidos representado na figura 2, ou que codifica para a proteína representada na figura 2. 5

Uma sequência nucleótidica descrita no presente documento é caracterizada por codificar para uma proteína correspondente à sequência de aminoácidos representada na figura 2 ou para uma sequência de aminoácidos que possui as mesmas propriedades reguladoras em relação à biossíntese das proteínas dos flagelos de H. pylori que a sequência referida acima. A invenção tem como objectivo a utilização para a detecção in vitro de uma infecção por H. pylori numa amostra de fluido biológico retirada de um doente, de uma estirpe bacteriana recombinante de Helicobacter pylori possuindo um fenótipo aflagelado resultante da mutação por supressão, substituição ou inserção de bases, ou de um fragmento na sequência de nucleótidos do gene flbA que participa na regulação da biossíntese das proteínas dos flagelos de H. pylori, hibridizando-se a dita sequência nucleótidica do gene flbA em condições severas com uma sonda correspondente a um fragmento de nucleótidos de H. pylori amplificado com o auxílio de dois oligonucleótidos OLFlba-1 e OLFlba-2, de modo a que: o gene flbA deixe de ser expresso num hospedeiro celular, a expressão do gene flbA num hospedeiro celular não permita a biossíntese das flagelinas A e B nem da bainha que as contém e eventualmente não permita a síntese da proteína de ancoragem de H. pylori ou de gancho. A modificação sofrida pela sequência nucleótidica utilizada na invenção deve ser tal de modo a ser irreversível e em particular que permaneça irreversível e em particular que ela permaneça irreversível quando esta sequência se recombina com o gene flbA presente numa bactéria que seria transformada com uma sequência 6 nucleotidica modificada deste modo. Esta recombinação é por exemplo do tipo "double Crossing over". De preferência, a modificação da sequência nucleotidica não deve arrastar uma modificação substancial - após a substituição por esta sequência modificada do fragmento correspondente ao gene flbA normal numa determinada estirpe de H. pylori - das funções dos genes vizinhos. 0 documento descreve também sequências nucleotidicas que constituem um fragmento do gene flbA que corresponde aos critérios anteriores. A título de exemplo, os fragmentos comportam pelo menos 6 nucleótidos, de preferência pelo menos 50, ver pelo menos 100 nucleótidos.

Tais fragmentos são por exemplo escolhidos seja devido ao seu carácter específico do gene flbA, seja por pertencerem a regiões conservadas de vários genes que codificam para proteínas da família LcrD/FlbF. O documento descreve também fragmentos do gene flbA limitados pelos locais de restrição presentes sobre o gene. Alguns destes locais são definidos a título de exemplo na figura 1 B.

Um outro fragmento descrito é um fragmento de pelo menos 1000 pb originários duma qualquer região do gene flbA e compreendendo de preferência um local de restrição ou susceptível de acolher um local de restrição.

Outras sequências nucleotidicas descritas são por exemplo os ácidos nucleicos recombinantes compreendendo uma sequência nucleotidica, tal como aquelas que são descritas acima, ela própria modificada por inserção de uma cassette que contém um marcador, por exemplo, um gene de resistência a um antibiótico ou um gene de resistência a um metal pesado, tal como o descrito no pedido de patente de invenção FR 9406202 depositado em 20/05194.

Pode ser assim efectuada uma inserção com uma cassette de resistência à canamicina. Neste contexto podem ser 7 desenvolvidas diferentes técnicas e vai-se referir em particular à publicação de Labigne A. et al (J. of

Bacteriology, vol. 170, 1988, p. 1704-1708) e à publicação de Labigne A. et al (Res. Microbiol 1992, 143, 15-26). 0 pedido de patente de invenção descreve igualmente os oligonucleótidos específicos de uma sequência nucleótidica determinada anteriormente e caracterizados por corresponderem a uma das sequências seguintes:

OLFlbA-1; ATGCCTCGAGGTCGAAAAGCAAGATG OLFlbA-2: GAAATCTTCATACTGGCAGCTCCAGTC OLFlbA-7 CGGGATCCGTGGTTACTAATGGTTCTAC OLFlbA-8: CGGGATCCTCATGGCCTCTTCAGAGACC

De acordo com uma outra variante descrita uma sequência de amínoácidos da proteína FlbA de H. pylori é caracterizada por ser codificada por uma sequência nucleótidica, tal como a determinada anteriormente.

Uma determinada sequência de aminoácidos da proteína FlbA de H. pylori é apresentada na figura 2.

Deste modo, no âmbito da invenção, o gene flbA e a proteína expressa por este gene pode apresentar interesse, em particular para a utilização em composições imunogénicas ou em vacinas. A invenção descreve assim estirpes bacterianas de Helicobacter pylori possuindo um fenótipo aflagelado resultante da mutação por substituição, adição e/ ou da supressão de bases ou de um fragmento nucleótidico da sequência nucleótidica definida acima do gene flbA que participa na regulação da biossíntese das proteínas dos flagelos de H. pylori. A modificação do gene flbA permite a obtenção de uma estirpe do tipo aflagelada i.e. que deixa de exprimir as 8 proteínas FlaA e FlaB e de preferência deixando de exprimir as proteínas da bainha.

De acordo com uma concretização desta estirpe bacteriana, a estirpe obtida estará ainda desprovida da proteína do gancho de H. pylori.

Preferencialmente uma estirpe bacteriana correspondente aos critérios anteriores é caracterizada por ser obtida a partir da estirpe N6 depositada na NCIMB em 26 de Junho de 1992 sob o número NCIMB 40512. A título de exemplo a invenção tem por objectivo uma estirpe aflagelada recombinante de H. pylori designada por N6flbA e depositada na NCIMB a 30 de Junho de 1995 sob o n° NCIMB 40747.

As estirpes aflageladas de H. pylori descritas no documento são particularmente interessantes para utilizações em sorologia e consequentemente para a detecção in vitro de uma infecção por H. pylori. Vantajosamente estas estirpes são do tipo recombinante.

Estas estirpes apresentam em particular a vantagem de permitir uma detecção in vitro específica e sensível da infecção por H. pylori. Noutros termos, a invenção permite vantajosamente detectar especificamente uma infecção por H. pylori evitando em particular os resultados "falsos positivos" por exemplo com a estirpes de bactérias, tal como a Salmonella ou Campylobacter.

Sabendo que as estirpes de H. pylori do tipo aflagelado definidas deste modo podem possuir igualmente outras aplicações e serem por exemplo desenvolvidas no âmbito da preparação de composições de vacinas poder-se-à ter interesse em preparar as estirpes bacterianas recombinantes aflageladas possuindo uma segunda modificação ou mutação e por exemplo poder-se-ia recorrer a uma estirpe bacteriana aflagelada caracterizada por ela ser aléiru disso mutada de modo a produzir uma urease atenuada, isto é a 9 deixar de produzir urease, a mutação consiste por exemplo numa mutação da sequência nucleotidica de um ou vários genes escolhidos entre os genes ureA, ureB, ureC, ureD, ureE, ureF, ureG, ureH ou urel. Os genes de estrutura da urease designados por ureA, ureB, ureC, ureD da urease foram descritos na publicação (Labigne et al. (1991) J. Bacteriol. 173: 1920-1931). Os outros genes foram descritos no pedido de patente de invenção EP 0610322. A invenção tem como objecto estirpes bacterianas recombinantes caracterizadas por elas serem obtidas por mutação, por substituição, adição e/ ou supressão de bases ou de um fragmento nucleotidico na sequência nucleotidica do gene flbA que participa na regulação da biossintese das proteínas dos flagelos de H. pylori a dita sequência hibridiza-se em condições . severas com uma sonda correspondente a um fragmento de nucleótidos de H. pylori amplificado com o auxílio de dois oligonucleótidos degenerados seguintes: OLFlbA-1: ATGCCTCGAGGTCGAAÃAGCAAGATG e OLFlbA-2: GAAATCTTCATACTGGCAGCTCCAGTC sendo a dita mutação tal que tanto o gene flbA deixa de ser expresso na dita estirpe bacteriana recombinante como o gene flbA não permite a síntese dos flagelos de H. pylori, a dita mutação é efectuada na estirpe N6 depositada na NCIMB a 26 de Junho 1992 sob o número NCIMB40512.

As estirpes bacterianas descritas no pedido de patente de invenção podem ser utilizadas tal e qual ou sob a forma de extracto e em particular de um extracto bacteriano total da estirpe obtida a partir das estirpes descritas no pedido de patente de invenção.

Um tal extracto bacteriano pode ser preparado por extracção de N-Octil Glucósido. Neste caso, a técnica de preparação utilizada é a descrita por LELWALA-GURUGE. J. (Scand. J. Infec. Dis. 1992, 24:457-465). 10

Um outro extracto bacteriano pode ser obtido por extracção com PBS ou da glicina de acordo com as técnicas descritas respectivamente por BAZILLOU M. et al. (Clin. Diagn. Lab. Irrtmuno. 1994, 1:310-317) e AGUIRRE P. M. (Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. , 1992, 11:634-639). A invenção diz respeito a um extracto bacteriano obtido a partir de estirpes que são objecto da invenção obtidas a partir da estirpe NCIMB40512 ou da estirpe NCIBMB407 47 . A invenção diz respeito a uma composição para a detecção in vitro de uma infecção por H. pylori numa amostra de fluido biológico num doente, em particular numa amostra de soro, compreendendo como principio activo uma estirpe bacteriana ou um extracto bacteriano de acordo com a descrição fornecida no pedido de patente de invenção.

As amostras biológicas utilizadas podem ser de todos os tipos em particular podem tratar-se de todos os fluidos biológicos como por exemplo o soro, a saliva ou a urina.

De igual forma, as técnicas desenvolvidas para a detecção são todas técnicas que fazem intervir reacções do tipo imunológico e em particular do tipo antigénio -anticorpo. Utiliza-se por exemplo as técnicas do tipo de transferência de Western, ELISA... A invenção diz por isso igualmente respeito a um processo de detecção in vitro de uma infecção por H. pylori numa amostra de fluido biológico num doente, em particular numa amostra de soro, compreendendo as etapas: -fazer contactar uma amostra testada com uma estirpe bacteriana definida no pedido de patente de invenção ou extracto bacteriano definido mais acima. -detecção de uma reacção imunológica entre a dita estirpe bacteriana e anticorpos dirigidos contra H. pylori, presentes numa amostra testada. 11 A título de exemplo uma detecção in vitro numa amostra biológica para pesquisar uma infecção por H. pylori pode ser realizada efectuando as etapas seguintes: as placas são cobertas de antigénio utilizado para a detecção, quer se trate de uma proteína pura ou recombinante, ou ainda de uma estirpe aflagelada ou dum extracto bacteriano em particular extracto de NOG (N-octíl glucosído) da estirpe N6flbA- (a título de exemplo, a quantidade de extracto poderia ser de 3 pg/ml ou a quantidade de antigénio poderia ser de 2 μg/ml), foi utilizada uma gama de controlos negativos e positivos (o controlo positivo foi preparado com diluições diferentes) e em paralelo, testa-se os soros dos doentes diluídas de 1/100 (volume depositado 100 μΐ) r é de seguida efectuada uma etapa de incubação por exemplo durante uma hora a 37°C, etapa seguida de várias lavagens sucessivas e de uma incubação posterior, por exemplo durante 1 hora a 37 °C, com um conjugado monoclonal (do tipo IgG humano marcado com peroxidase) utilizado a diferentes diluições (por exemplo a uma diluição de 1/32000 para um antigénio e a uma diluição de 1/64000 para um extracto bacteriano), o volume depositado é de 100 μΐ, após a incubação com o conjugado monoclonal são praticadas diferentes lavagens (por exemplo 4) e a revelação da reacção enzimática pelo "OPD + substracto" é efectuada durante 30 minutos na obscuridade. A reacção enzimática é de seguida parada por adição de H2SO4 e depois leitura das densidades ópticas DO a 492 nm/620 nm. 12 A invenção tem além disso como objectivo a utilização para obter anticorpos contra H. pylori de uma estirpe bacteriana ou de um extracto desta estirpe bacteriana, definida no pedido de patente de invenção.

De acordo com um modo de realização particular da invenção, uma composição imunogénica para a obtenção de anticorpos contra H. pylori é caracterizada por compreender uma sequência de aminoácidos da proteína FlbA.

Está igualmente incluído no âmbito da presente invenção a utilização para a preparação de uma composição para vacinas através da obtenção de anticorpos protectores contra uma infecção por H. pylori de uma estirpe bacteriana ou de um extracto bacteriano de acordo com as definições do pedido de patente de invenção.

Uma tal utilização para preparar uma composição para vacinas para obter anticorpos contra uma infecção por H. pylori, para preparar o princípio activo, os antigénios do tipo urease, em particular os antigénios codificados pelos genes ureA, ureB, ureC ou ureD e uma proteína que corresponde a uma sequência de aminoácidos definida acima. A invenção tem igualmente como objectivo soros policlonais dirigidos contra uma estirpe de H. pylori obtida a partir da estirpe NCIMB 40512 de acordo com a definição acima, ou contra a estirpe NCIMB 40747.

Estes anticorpos são obtidos através de técnicas conhecidas e em particular, através da imunização de um animal com o antigénio escolhido, seguido da produção e da recuperação dos anticorpos produzidos e da selecção daqueles entre eles que reconhecem especificamente H. pylori.

Outros anticorpos monoclonais ou soros policlonais de acordo com a invenção são dirigidos contra uma estirpe de H. pylori aflagelada, tal como a descrita nas páginas anteriores. 13

Além disso, a invenção diz respeito ainda a uma composição para a detecção in vitro de uma infecção por H. pylori numa amostra biológica compreendendo como principio activo um soro policlonal obtido contra uma estirpe de H. pylori de fenótipo aflagelado descrito no pedido de patente de invenção.

Figura 1 IA: Mapa de restrição do plasmideo plLL570 e do mini transposão Tn3 contendo a cassette do gene de resistência à canamicina. 1B: Mapas de restrição lineares de plasmideos recombinantes pSUS39 e pSUS207. Os números indicados correspondem à dimensão dos fragmentos de restrição expressos em pares de bases. H: HindIII; Bg: BglII. A presença de um asterisco indica que o local de restrição foi modificado no decurso da clonagem e que deixa de ser reconhecido pela enzima de restrição correspondente.

Figura 2: Sequência nucleótidica do gene flbA de H. pylori e sequência de aminoácidos deduzida indicada pelo código de uma letra.

Figura 3: Alinhamento múltiplo da proteína FlbA de H. pylori com cinco outros membros diferentes da família LcrD/FlbF. CjFlbA: Campylobacter jejuni FlbA; CcFlbF: Caulobacter crescentus FlbF; YpLcrD: Yersinia pestis LCrD; StlnvA: Salmonella typhimurium InvA; SfMxiA: Shiqella flexneri MxiA. Os asteriscos indicam a posição dos aminoácidos conservados em todos os homólogos da família LcrD/FlbF; os pontos indicam a posição dos aminoácidos conservados em pelo menos 5 das 6 proteínas homólogas; as sequências de aminoácidos conservados utilizadas para a síntese dos oligonucleótidos degenerados (OLFlbA-1 e OLFlbA-2) encontram-se sublinhadas. De notar em particular 14 o grau de conservação do domínio N-terminal destas proteínas homólogas que contrasta com o grau de variabilidade do domínio hidrófilo da região C-terminal. Figura 4: representação esquemática da árvore filogénica de seis proteínas que pertencem à família LcrD/FlbF. As proteínas implicadas na regulação da expressão da mobilidade, FlbA de H. pylori (HpFlbA) , e de Campylobacter jejuni (Cj FlbA), e FlbF de (Caulobacter crescentus (Cc FlbF) formam um ramo distinto daquele das proteínas implicadas na secreção de proteínas de virulência (InvA, MxiA e LcrD de Salmonella, Shigella e Yersinia, respectivamente). Os números indicados representam a distância evolucionária relativa.

Figura 5:representação esquemática da estratégia seguida para construir os mutantes isogénicos da estirpe de H. pylori N6, mutantes nos quais o gene que codifica para a proteína FlbA foi inactivado por inserção de um gene que codifica para a resistência à canamicina.

Figura 6: análise por imunotransferência (Western blot) das proteínas de um mutante N6-flbA cora o auxílio de um antisoro AK179 (3) dirigido especificamente contra os flagelos purificados de H. pylori:!: mutante N6-flbA:2: mutante duplo flaA/flaB; 3: mutante flaB(8); 4: mutante flaA (8); 5: estirpe selvagem N6.

Figuras 7 a 11: resultados comparativos da serologia realizada por H. pylori. Figuras 12 e 13: Extracções a partir da estirpe aflagelada N6flbA~: as extracções foram realizadas com glicina, ΡΒΞ ou NOG.

Figura 12: as curvas foram construídas a partir dos dados seguintes: 15 NET CALC COEFFS: ABS Desv. Cone 750,0 Cone Diff P2=2,0324 Pl=2,2753 Pad# 1 0,0000 0,0020 -0,008 0,0080 2 0,1660 0,0760 0,1721 -0,006 3 0,3300 0,1400 0,3459 -0,016 4 0,6650 0,2390 0,6474 0,0176 5 1,3300 0,4280 1,3336 -0,004 Média: -1,0356E-07 Desv. 0,0130 Pad.

Figura 13: Dosagens proteicas no método mino (BIO RAD) glicina: diluição a 1/2; glucósido: diluição a 1/10; sobrenadante 1: diluição a 1/4; sobrenadante 2: não diluído.

As curvas foram construídas a partir dos dados seguintes: P0=2,4815 NET ABS CALC Desv. Cone 750,0 Cone Pad# 1 0,0000 -0,003 1,5398 2 25000 0,0600 21,861 3 50000 0,1470 51,810 4 100,00 0,2750 99,855 5 200,00 0,5090 199,94 COEFFS: Diff P2=14 4,63 Pl=314,31 -1,540 3,1392 -1,810 0,1454 -0,0636

Exemplos

Identificação do gene flbA e preparação de estirpes aflageladas 16

Entre as proteínas conhecidas por desempenharem um papel na regulação da expressão da mobilidade nas bactérias as proteínas que pertencem à família LcrD/FlbF recentemente identificada, e que inclui a proteína LcrD das bactérias do género Yersinia (6) , a proteína InvA de Salmonella (2) MxiA de Shigella (1), FlbF de Caulobacter crescentus (7) e FlbA de Campylobacter jejuni (4) são proteínas interessantes. As proteínas LcrD, InvA e Mxia estão implicadas na regulação e/ ou secreção de proteínas associadas à virulência das bactérias que as exprimem, enquanto que as proteínas FlbF de Caulobacter crescentus e FlbA de Campylobacter jejuni estão implicadas na regulação da biossíntese de flagelos e portanto na mobilidade. Os homólogos conhecidos até hoje da família LcrD/FlbF possuem domínios muito conservados sobretudo na parte N-terminal destas proteínas, e duas destas regiões conservadas (MPGKQM, aminoácidos 151 a 156 da proteína de LcrD de Yersinia) e MDGAMKF (aminoácidos 189 a 195 de LcrD) puderam assim ser utilizadas para a definição de dois oligonucleótidos degenerados (OLFlbA-1 e OLFlbA-2, tabela 1) que foram sintetizados e utilizados como iniciadores nucleótidicos em experiências de amplificação génicas realizadas a partir do ADN cromossómico de Helicobacter pylori. Um fragmento de 130’ pares de bases (pb) poude assim ser amplificado e a determinação da sua sequência nucleotídica mostrou que este fragmento codificava para um segmento de uma proteína muito homóloga às proteínas da família LcrD/FlbF. Este fragmento amplificado foi então marcado radioactivamente e utilizado como sonda para pesquisar um banco de cosmídeos de H. pylori.

Este fragmento corresponde à sequência compreendida entre os nucleótidos 575 e 707 da sequência representada na figura 2. 17

Um dos cosmideos da banca genómica foi codificado como codificando para o homólogo LcrD/FlbF de H. pylori e foi de seguido submetido a uma digestão parcial por Sau3A de forma a efectuar um mini banco {200 sub-clones) do cosmídeo no vector pILL570 contendo os fragmentos inseridos possuindo uma dimensão compreendida entre 2 e 5 (kilobases). O vector de pILL570 foi descrito na publicação de Labigne A et al (Institut Pasteur/Elsevier Paris 1992. Res. Microbiol. 1992, 143, 15-26) . O seu mapa de restrição é fornecido na figura IA. Estes 200 clones foram hibridizados com a sonda de 130 pb e os clones que albergavam os plasmideos pSUS39 e PSUS207 deram uma hibridização positiva. A carta de restrição linear destes dois plasmideos recombinantes encontra-se representada na figura 1B e mostra que as duas inserções destes clones possuem sequências de sobreposição. A determinação da sequência nucleótidica destas duas inserções tem revelado que nenhum dos dois continha o gene flbA na sua totalidade. O gene de flbA de H. pylori designado deste modo derivado da sua homologia com o gene flbA de Campylobacter jejuni corresponde a uma fase aberta de leitura de 2196 nucleótidos que codifica para uma proteína de massa molecular calculada de 80,1 kilodaltons. A sequência nucleótidica de flbA e a sequência de aminoácidos de FlbA são fornecidas na figura 2. Não foi detectado a montante nem a jusante da fase aberta de leitura de sequências consensus características de sequências promotoras ou de terminação. A proteina FlbA apresenta semelhanças com as proteínas FlbA de Campylobacter jejuni e de FlbF de Caulobacter crescentus, ambas implicadas na mobilidade (51,7% e 40,4% de identidade respectivamente) enquanto que estas percentagens são menos elevadas com os membros da família proteica LcrD/FlbF que não se encontram implicados na mobilidade: 32,8% de identidade com o LcrD de Yersinia, 18 30,5% com MxiA de Shiqella e 29,3% cora InvA de Salmonella. Uma alinhamento múltiplo da sequência de aminoácidos destas proteínas com a de FlbA de H. pylori é fornecida na figura 3. As regiões mais conservadas dos homólogos da família LcrD/FlbF encontram-se na parte N-terminal das proteínas. A evolução filogenética das proteínas implicadas na mobilidade (FlbA e FlbF) e a das proteínas implicadas na regulação da expressão e/ou na secreção das proteínas associadas à virulência encontra-se representada esquematicamente por uma árvore filogénica (figura 4). São visíveis dois ramos distintos; FlbA de H. pylori que pertence sem ambiguidade ao ramo correspondente às proteínas de regulação implicadas na biossíntese dos flagelos.

Construção e caracterização de mutantes isoqénicos de H. pylori deficientes na síntese da proteína FlbA

Um fragmento de 1600 pares de bases foi amplificado a partir do plasmídeo pSUS39 com o auxílio dos oligonucleótidos OLFlbA-7 e OLFlbA-8 {tabela 1) , contendo cada um na sua extremidade 5'locais de restrição BamHI. Este fragmento amplificado contém na sua região central um local único de restrição pela endonuclease HlndlII e foi clonado no vector pSUS33, um derivado do plasmídeo pUC19 no qual o local situado no local de policlonagem HindIII foi suprimido. Para obter pSUS33, o plasmídeo pUCl9 foi restringido por HindIII; as extremidades colantes resultantes desta restrição foram tratadas com a enzima de Klenow e com o ADN T4 polimerase de forma a produzir extremidades livres; o fragmento resultante foi novamente ligado com a ADN T4 ligase e introduzido em E. coli DH5x para produzir pSUS33. O plasmídeo recombinante resultante da integração do fragmento de 1600 pares de bases em pSUS33 19 foi designado como pSUS42; foi linearizado por HindiII, as suas extremidades foram transformadas em extremidades de terminais livres e a cassette smal-canamicina proveniente do plasmideo pILL600 {Labigne A et al., 1988, J. Bact., 170, 1704-1708) foi clonada neste local único dando origem ao plasmideo pSUS42. O plasmideo pSUS42 foi de seguida introduzido por electroporação na estirpe "N6" de H. pylori. A electroporação foi realizada seguindo a técnica descrita por Ferrero R. L. et al (Journal of Bacteriology, Julho de 1992, p. 4212-4217, vol. 174, n° 13). Os transformantes obtidos após selecção sobre um meio selectivo contendo a canamicina (25 μς/ιηΐ) foi de seguida caracterizado do ponto de vista do seu genótipo e do seu fenótipo. A figura 5 mostra um esquema do procedimento seguido para efectuar a construção de mutantes. A caracterização do genotipo destes mutantes por amplificação génica e hibridização do tipo de Southern mostrou que o genoma dos transformantes resistentes à canamicina continha o gene de resistência inserido no meio do gene f lbA e portanto que teve lugar a substituição alélica por crossing-over duplo da cópia selvagem do gene flbA pelo cópia inactivada de flbA-Km com perda de sequências nucleótidicas dovector pSUS33. A caracterização fenotipica dos mutantes flbA de H. pylori demonstrou que eles não eram móveis; além disso, a sua análise por microscopia electrónica revelou que havia a ausência total dos elementos do flagelo, e a ausência da bainha do flagelo. As experiências de imunotransferência (Western blots) efectuadas com os anticorpos dirigidos contra as proteínas dos flagelos totais de H. pylori (Figura 6) mostrou a ausência de duas bandas peptídicas correspondentes às sub-unidades flagelares FlaA e FlaB, assim como uma banda correspondente a um polipéptido de uma massa aparente de 90 kilodaltons, proteína que foi recentemente identificada 20 como proteína do gancho (ou proteína de ancoragem) do flagelo por Ο'ΤοοΙθ e colaboradores (5). 0 conjunto destes resultados sugere que a proteína FlbA de H. pylori é essencial para a biossíntese de todas as estruturas flagelares e que a activação do gene que codifica para esta proteína resulta na paragem completa da síntese de toda a estrutura que entra na constituição do flagelo e não na interrupção da exportação dos constituintes destas estruturas.

Tabela 1: Oligonucleótidos utilizados neste estudo

Oligonucleó tidos Posição Cadeia Sequência nucleótidica OLFIbA-1 AS 151-156(LcrD) + ATGCCTCGAGGTCGAAAAGCAAGATG OLFIbA-2 AS 189-195 (LcrD) GAAATCTTCATACTGGCAGCTCCAGTC OLFIbA-7 515-534 ‘C + CGGGATCCGTGG7TACTAATGGTTCTAC OLFIbA.3 2092-2111 - CGGGATCCTCATGGCCTCTTGAGAGACC II Soroloqia de H. pylori - modelos estudados 1) HspAmalE proteína recombinante de 47,5 kD (HspA=13 kD). Na população designada como população 1 de soros documentados foram obtidas uma sensibilidade de 41% e uma especificidade de 96%. 2) N6flbA - estirpe aflagelada de Helicobacter pylori foram realizadas 3 extracções: -N-Octil Glucosido

-PBS -Glicina 21 3)~Νβ A extracção com N-octil Glucósido (NOG) parece ser de momento a melhor estirpe selvagem correspondente.

Foi efectuada uma extracção ao N-octil glucósido.

Uma segunda população de soros foi preparada (população II). Trata-se de uma centena de soros bem documentados do ponto de vista clínico, endoscópico, histológico, bacteriológico e anatomopatológico. É graça a esta população II que os desempenhos dos diferentes modelos estudados foram apreciados. Foram testadas cinco populações diferentes. -5 Populações de soros testadas: -300 soros de qualquer proveniência (FNTS) -18 soros positivos por serologia (WHITTAKER (CBMS)

-92 soros bem documentados designados como soros da população II -87 soros documentados do ponto de vista bacteriológico e anatomapatológico, os ditos soros da população I. 23 soros que podem apresentar reacções cruzadas: -10 soros positivos anti-Legionella -10 soros anti-Chlamydia positivos -3 soros anti-Campylobacter positivos

Em paralelo foram testados dois kits concorrentes que de acordo com os estudos bibliográficos apresentam desempenho. -2 kits comerciais testados: -Cobas Core (ROCHE) -Pylori Stat (WHITTAKER) 22 -Resultados

Os soros de qualquer origem (FNTS) (Figuras 8 a 11, tabela 2) . -300 soros foram passados nos modelos seguintes:

-Hsp A malE -N6flBa- -N6

Os estudos epidemiológicos dão prevalências sorológicas em França, entre 20 e 25%. A repartição de 300 soros de doadores de sangue foi estudada e calculou-se a prevalência da positividade para diferentes valores de patamar, de modo a validar o valor do patamar previamente definido na seroteca do CBMS (serologia WHITTAKER) .

Este estudo permite comparar os diferentes testes com a mesma prevalência de soro. -Os primeiros 43 soros foram igualmente passados nos modelos seguintes: -Cobas Core (ROCHE) -Pylori Stat (WHITTAKER) -sorologia dita JLF (teste ELISA, baseado num extracto aquoso de várias estirpes bacterianas)

Os resultados são expressos numa unidade arbitrária, e para diferentes valores de patamar, um resultado positivo é marcado como 1, um resultado negativo é marcado como 0. Comparando estes 43 soros em relação aos diferentes testes pode-se constatar que: 23 -a estirpe aflagelada N6flbA e o teste Cobas Core (ROCHE) possuem prevalências sorologicas comparáveis da ordem de 20%. -HspA possui uma prevalência sérica muito fraca (7%) o que deixa supor uma falta de sensibilidade entrando em linha de conta com os resultados anteriores. -a serologia JLF parece muito especifica, uma vez que a prevalência sérica é só de 14%, tendo em conta os resultados anteriores. -o teste Pylori Stat (Whittaker) dá uma prevalência sorológica elevada (29%) que mostraria uma falta de especificidade, ou um valor de patamar demasiado baixo. 24 Tabela 2A Comparação de 43 soros FNTS em relação

25

Tabela 2B Comparação de 43 soros FNTS em relação

26

Os soros positivos em serologia WHITTAKER (CBMS) (Tabela 3)

Três soros revelaram-se positivos unicamente com o teste Pylori Stat (Whittaker). Eles não foram confirmados por nenhum outro teste.

Pode-se supor que se trata de uma falta de especificidade deste teste. Se se tomar como referência o teste Cobas Core (Roche) que é um dos melhores actualmente no mercado podemos comparar os nossos diferentes modelos em relação a Cobas Core. - A estirpe aflagelada N6flbA encontra-se perfeitamente correlacionada com Cobas Core. - Os 3 soros negativos Cobas Core correlacionam-se igualmente com N6flbA-

Os 15 soros positivos Cobas Core correlacionam-se igualmente com N6flbA- -A estirpe selvagem N6 mostra os mesmos desempenhos que a estirpe aflagelada -A. HspA falta também sensibilidade, uma vez que 9 soros positivos Cobas Core são negativos com HspA.

Os 3 soros negativos Cobas Core também o são com HspA. 27

Tabela 3 19 soros positivos do CBMS positivos por seroloqia WHITTAKER (Pylori Stat) «η ==S*È" N466A- __Τ_ΓΜ_ M· ~1 DO HspA 160 C. COJg i fOS JO N06 60 QLY NQC 108 Μ 1 i.a 0 m 33 1 130 f 269 t 494 830 j| | 2 2.41 607 1 >30 1 4TL 1 3257 1 6507 >92£ 1 3 2.9 671 i Jii 1 30 „ 1 472 1 3253 1 1163 >t2í 1 4 1.4 148 42 1 196 ] 407 625 356 1 S 1 179 44 1 59 9 Q1 1 317 276 1 6 25 193 t >60 1 472 1 3260 t 1054 >926 1 A 0,7 19 4 3Ξ:· 13 8 W 33 12 8 2.6 3 >50 1 471 1 325$ 1 6600 >929 4 C 3,1 1352 1 >50 1 470 1 3246 1 «5*2 >926 Ί D 1.3 a | n 16 1 121 1 SP6 1 44^ >028 1 Ê -fil 7 1 1' 1 Z3 45 m 150 0 F ,2.1', 0 1 15 139 1 325B 1 ,250 >928 i f Q 02 9 wm 6 3 μ- γ·. -3L D H 1.4 2S 1 13 1B 127 [u 170 í 1 143 159 1 1 2.3 wb 1 j >60 t ΓΓΠ 1 J 1.9 5 |fcj 38 i 1 91 1 117 1 57 101 1 K ,1.38 4 1B aí , 1 1 152 1 167, >925 1 L 2.98 655 fi >80 1 471 1 5B6 1 943 >925 1 M 2J8 0 i B SI 1 471 1 3256 1 1200 >626 1

Os soros da polulação II

Foram seleccionados 92 soros e repartem-se por 3 grupos: -34: doentes dispépticos diagnóstico de úlcera (duodenal ou gástrica) por endoscopia e histologia presença de Helicobacter pylori por cultura e/ ou anapat; foi também realizado um teste rápido à ureia.

Este grupo será designado Hp+/U+ -27: doentes dispépticos 28 diagnóstico diferente de úlcera (gastrite...) por endoscopia e histologia presença de Helicobacter pylori por cultura e/ou anapat; foi também realizado um teste rápido à ureia.

Este grupo será designado Ηρ+/ϋ- -31: doentes dispépticos ou não gastro-duodeno normal por endoscopia e histologia ausência de Helicobacter pylori por cultura e/ou anapat; foi também igualmente realizado um teste rápido à ureia. Este grupo será designado Hp-

Para cada doente são indicados os dados clínicos, endoscópicos, histológicos, bacteriológicos e anatomopatológicos.

Esta população bem documentada permitiu definir critérios de Sensibilidade e Especificidade. -HpA: Nota-se sempre uma grande falta de sensibilidade como constatado com a população I. A sensibilidade é de 59% para uma especificidade de 100. -N6flbA-: Observa-se uma sensibilidade de 100% para o extracto de N-Octil Glucosido com uma especificidade de 90%. 0 comportamento é comparável ao teste de Cobas Core da Roche (sensibilidade de 98% para uma especificidade de 94%) . -N6: A estirpe selvagem é exactamente comparável à estirpe aflagelada na população II.

Nenhum dos 31 soros negativos não é positivo com a estirpe selvagem; nenhuma reacção cruzada devido ao flagelo, foi detectada nesta população II. 29

29 Tabela 4: Soros da população II +

D \ + & V)

<D -μ φ % to

EEBEBEEEEBEEEEE =

Is

K 30

30 Tabela 4 (continuação): Soros da população II +

D n +

W

<U

•P a Φ o Ό 'a* n

EEEEBEEEEEIEEEECE irt ^ e ã 1 * 11III JJJJ | "rt| IIII 3 ^1 ·! Sf 3 : £ IW3 31

Tabela 5: Soros da população II

32 Tabela 5 bis: Soros da população II 31 doentes Hp-

nau 33

Tabela 6- Soros da população II em relação à presença de Hp (cultura e/ ou anapat) e úlcera

Sensibilidade Especificidade Em relação a Hp+ e UD/UG ou seja 34Hp+/U+ HspA maíE VS=1<X> VS=5D MS*20 44.1¾ (15/34) 52.9% (18/34) 64.7% (22134) 100% (31/31) 100% (31131) 73.8% (25/31) N6flbA- HOG VS=1G0 VS=80 vs=eo 94-.1% (32*34) 94.1% (32/34) 100% (34/34) 96£%{30/31) 93.8% (2331) $0.3% (28/31) PBS vs=ico vs=so vs=eo 82.4% (2804) 94.1% (3204) 97.1% (33/34) (29/31) 933% 93.$% (29/31) 83.9% (26/31) Sêro JLF VS=0.3O B2.4%(29/34) 963% (30/31) Rylori Stat 94.1% (3204) 90.3% (28/31) CobâÊ Core t06% (34/34) 93.6% (29/31)

Tabela 7- Soros da população II em relação à presença de Hp (cultura e/ ou anapat.)

Sensibilidade Especificidade Em relação a Hp+ 34 UD/UG-27 GNU ou seja 61Hp+ 3lHp- HfipA ffialE VS=100 45.9% (2S/B1) 100 % (31/31) VS=50 59% <38/61 ) 100% (31/31) vs=20 80.7% (45/61) 73.8% (25Í31) N6f I b A- NOS -] i fíí. S S Si 96.1% (58/51) 35,1% (58/61) 100% (61/51) 36.8% (30/31) 93.5% (29/31) $0.$% (28/31) PBS V&=100 VS=8D Vô=60 95.3% (52/61) 93.4% (57/01) 96.7% (50/01) 93.6% (23/31) 93.6% (.2331) 83.9% (26/31) Sêro JLF VS=O-30 79.7% (48/61) 96.8% (30/31) ^ ^ pylorí Stat 03-4-% (57/81) 90,3 % (28/31) Cobas Cpre 93.3% (60/51)* 33.6% (23/31) *Soro=VS 34

Tabela 8- Soros da população II em relação à presença de Hp (cultura e/ ou anapat) e ausência de ulcera 34 Sensibilidade

Especificidade

Em relação a Hp+ e GNU ou seja 27Hp+/U-

HspAmalE VSbIÕÕ VS=5Q V5^2Q 4a.2% (10/27) 86.7% (18/2?) 85.2% (23/27) 100%, (31/31) 100 % (31/31} 733% (25131) NGflb/V NOG VS=100 VS=80 VS=60 96-3% (28/27) 93.6% (28/27) 100% (27/27) (30/31) 93.6% (29/31) 90,3% (28/31) PBS vs=ioo VSs0O vs=eo aa.8% (24/27) 92.6% (25/27) 96.3% (26/27) 93.5% (29/31) 93.6% (29/31) 33.9% (26/31) Séro JLF VS=0.30 74.1% (20/27) 96.8% (90/31) Pylori Siat 92-6% (25(27) 90.3% (28/31) Dobas Core 96.3%(26Í27) 93.6% (29/31) 0 local da soroloqia A sorologia é colocada a dois niveis: -Sorologia muito sensível: com o objectivo de despistar o transporte da bactéria nos indivíduos novos que se queixavam de dores epigástricas. Se se verifica que a sorologia é negativa o sujeito não será submetido a endoscopia nem a biópsia e será pesquisa de outra causa para as suas dores. -Sorologia específica de risco: trata-se de evidenciar o risco de fazer uma infecção grave por Helicobacter pylori, isto é uma úlcera, um cancro, ou um linfoma gástrico (linfoma de MALT). -Seja utilizando uma molécula específica do risco em questão. -Seja utilizando um patamar específico de risco (valor de patamar mais elevado nos sujeitos em risco do que nos sujeitos' que não estão em risco). 35

Esta serologia específica pode ser utilizada para fazer uma pesquisa da população em geral e despistar deste modo, os cancros e os linfomas, ligados a Helicobacter pylori que não seriam despistados por falsos sintomas. (Só os sujeitos que· se queixam de dores é que vão consultar um gastroenterologista). A resposta à questão da sensibilidade é boa.

Tabela 9: Média e desvio padrão das U A nos três grupos de doentes

Hp-(n=31) Hp+/U- (n=27) Hp+/U+(n=34) Hsp A Média Desvio padrão 10,61 8,81 775,72 1312,56 770,32 1666,52 N6flBA Média Desvio padrão 17,16 26,69 895,50 818,57 944,85 915,27 36

Actividade 15 25 12 CJ) o Inflamação o 21 33 Γ" o Atrofia o 10 28 22 i—1 0 «d o rl +> u nj & Φ tó o tH <M ro

Tabela 10: Média e desvio padrao das U. A em função da histologia gástrica d) P. Stat 0,31 00 O o CN CO O o o 0,31 0,07 0,35 .. 0,12 Actividad o o 3 712 089 938 876 σ') r- ro LO 1402; 1174 Hsp A 977 2052 478 ! 1117 733 '1382 1302 1628 Inflamação P. Stat O m o 00 o o 0,31 O o m j oq ^ o a v o [o NOG 677 468 876 780 ! 2176 1132 ' Hsp A 437 688 co co co. Τ—Λ LO LO CO τ—1 CO MO CM CN] sT Γ- · rri Cag. A ' ; r\l co co η—1 200 654 607 Atrofia P. Stat CM < O 0,07 0,30 0,08 0,38 co o s, o NOG 412 390 730 707 1403' 1012 Hsp A O t—1 1004 423 984 1321 2059 Média (Desvio padrão) Médi a {Desvio padrão) (ΰ· rr7 Ti 'Μ s (Desvio padrão) Média (Desvio | padrão) Intensidade o i—1 <N + & 00 37

Correlação entre a intensidade da gastrite e o teor em anticorpos A gastrite é definida por 3 parâmetros:

Atrofia (representada pelo Io número a seguir a G) ; a sua intensidade é indicada de 1 a 4. A inflamação global corresponde à infiltração de neutrófilos polinucleares e de monócitos (representada pelo segundo número a seguir a G). A sua intensidade é indicada de 1 a 3. A actividade corresponde ao número de neutrófilos polinucleares (representada pelo 3o número a seguir a G) ; a sua intensidade é indicada de 0. a 3. Determinadas formas foliculares são indicadas por F.

Normalmente pode-se observar a correlação seguinte: A actividade encontra-se muito bem correlacionada com

Helicobacter pylori. A inflamação encontra-se muito bem correlacionada com

Helicobacter pylori.

Calculou-se assim em função destes 3 parâmetros e da sua intensidade, a média dos títulos observados em cada grupo.

Interpretação dos resultados: A utilização de um teste t permitirá pôr em evidência uma diferença significativa, ou não, entre 2 médias observadas com um risco de 5%. A hipótese sobre a qual é fundada o teste t é a igualdade de variâncias colocada em evidência por um teste F (teste de Fisher). 38

Determinadas variâncias não eram iguais não se poderá portanto comparar todas as médias entre elas. A comparação das médias, quando isso é possível não permite colocar em evidência diferenças significativas, ou não nos diferentes grupos. -Diferença significativa:

No grupo "inflamação", entre as médias dos "2" e "3" de HspA e de NOG. -Diferença não significativa:

Ao nivel da actividade, não se colocou em evidência uma diferença significativa entre os dois níveis de intensidade: -HspA: não existe diferença 0 e 2 significativa entre os dois 0 e 3 níveis 1 e 2 1 e 3 2 e 3 -NOG: não existe diferença 0 e 1 significativa entre os dois 0 e 2 níveis 1 e 2 1 e 3 2 e 3

Pode-se contudo constatar uma tendência de aumento dos teores em função da intensidade da gastrite; -ao „ nível da atrofia, as médias passam para o dobro, quando se passa do nível 1 ao 2 e do nível 2 a 3 para o HspA e para o extracto de NOG da estirpe aflagelada. 39 -ao nível da inflamação,, as médias passam para o dobro, quando se passa do nível 1 ao 2. 0 número de efectivos em cada grupo é relativamente fraco {<30) para se poder concluir que existem diferenças estatisticamente significativas. 'ν' 40 11: Média e desvio padrão das U. A em função da histologia gástrica Actividade -P rC -P 0,32 0,09 0,34 O i—1 s o 0,32 0,09 0,36 0,12 NOG 676 697 1015 1050 827 LO 00 CO 1316 O 0 1 1 Hsp A 1282 2619 599 12 9.8 219 329 911 1502 Inflamação P. Stat O cn o 00 .. O' W; Q/. 00 00 o O • o 0,43 CO o O NOG 511 451 845 813 2184 1006 Hsp A 438 759 586 1820 2133 1889 rd rl 0 M a < P. Stat 0,25 0,05- 0,32 o o 0,41 0,07 NOG 326 !00 : H . CNJ CO χΤ CO 1722 O 00 o t—1 Hsp A 121 118 . 304 507 2004 00 LO 00 CM Em Hp+/U+ Média (Desvio padrão) o -P P Ό) s (Desvio padrão) Média {Desvio padrão) Média (Desvio padrão) Intensidade • o r-f CM 00

+ D + 'a* m 41

Os soros podem apresentar reacções cruzadas Foram utilizados 2 tipos de soros 20 soros (10 anti-Leqionella+ e 10 anti-Chlamydia+) que podem apresentar reacções cruzadas com HspA, uma vez que estas 3 bactérias possuem "Heat shock proteins" numa vizinhança muito próxima umas das outras. 3 soros positivos de anti-Campylobacter com o objectivo de evidenciar reacções cruzadas com a estirpe aflagelada N6 que desapareceria com a estirpe aflagelada N6flbA-. É muito difícil arranjar soros anti-Campylobacter positivos é por isso que só há 3 soros.

HspA não apresenta nenhuma reacção cruzada nem com os 10 soros anti-Legionella positivos nem com os 10 soros anti-Chlamydia positivos.

Alguns destes soros possuem títulos positivos em anticorpos anti-Helicobacter pylori tanto na estirpe flagelada como na estirpe aflagelada, mas o contexto clínico destes soros não é conhecido.

Tabela 12: Soros que podem apresentar reacções cruzadas

Legionel1a+ Título N6 VS=100 VS-60 HspA. VS=100 A P2 P3 =256 0 0 4 Q 47 0 B P4 P5=64 >928 1 6+1 1 42 0 c P2P3=128 212 1 87 1 68 0 D P2 P3=84 70 0 18 0 15 0 E P1s25fi/P2=5l2 >926 1 239 1 258 1 F PZP3P4P5=128 322 1 121 1 41 0 0 P1=512/PS=1024 >928 1 193 1 121 1 H P4P5=64 >923 1 479 1 18 0 ! P2=128/P3=64 33 0 17 0 25 0 J R2=SS6/PS=l2a 16 0 8 0 32 0 42

Chlamydia+ Título N6 VS=100 N6flBA HspA VS=100 A 256 j 6 Q 6 0 Ξ5 0 B 256 \ 7 0 9 0 34 0 C 64 636 1 290 1 39 0 D 256 367 1 225 1 13 0 E 32 >m 1 655 1 13 0 f 123 >938 ~ 1 783 j 1 27 0 <3 32 115 1 55 0 15 0 H Twar 16 19 0 10 0 14 0 1 32 >926 1 592 1 >926 1 JTwar 64 610 . 1 280 1 44 0 Campy tobacter+ N6 VS=100 NatlBA- V$=60 H&pA VS=*100 A 35 0 26 0 17 0 e 13 0 4 0 27 0 c 50 0 58 1 09 0

Conclusão

HspA malE

Esta molécula não pode ser sempre utilizada isoladamente, uma vez que lhe falta também sensibilidade, mas poderá ser interessante se, se associar a outras moléculas. /.

De qualquer maneira -ela apresenta um risco de reacções cuzadas devido à importante. conservação das suas "Heat shock proteins" entre as diferentes espécies bacterianas. N6flbA-

Esta variante aflagelada parece ser muito interessante, a sensibilidade e a especificidade obtidas com a população II de soros mostra um comportamento muito interessante. 43 Ν6

De momento a estirpe flagelada parece interessante. No entanto, as reacções cruzadas relativas ao flagelo foram pouco estudadas devido à dificuldade de arranjar soros bem documentados em serologia Campylobacter.

Teste JLF

Foi desenvolvido um teste sorológico baseado na extracção aquosa com (PBS) de várias estirpes de Helicobacter pylori. Este teste parece ter um desempenho muito bom.

Um extracto NOG da variante aflagelada foi utilizado para testar a população I de soros. 87 soros documentados apenas sob o ponto de vista bacteriológico e anatomopatológico foram testados com o extracto bacteriano aflagelado.

Um soro é positivo se a cultura for positiva, ou se o anapat. e o teste rápido da ureia são positivos.

Um soro é negativo se os 3 testes (cultura, anapat. e o teste rápido da ureia) são negativos.

Encontra-se uma sensibilidade de 90,3% (28/31) para uma especificidade de 71,4% (40/56).

Em 16 soros falsos positivos num primeiro testes, 9 são positivos tanto por serologia JLF, como por Wester Blot JLF, tanto como pelos dois.

Nos 3 soros falsos negativos· num primeiro teste, os três são negativos tanto por serologia JLF, como por Western Blot JLF e um soro é negativo com os dois sistemas. 44

Tabela 13. 87 soros da população I testados com o extracto de N-Octil Glucosido da estirpe aflagelada HípA sértxJLÍ V3« WBJLf Enterp IwB Biíiptirti 1 Hp jNGfIBj Inoa +‘ V3=S0 572 35 0 . "”21 Z 0 — aP - ' + Γο. m 573 11 0 46 1 3p „ + - 1 229 1 S74 ' 11^ 0 3 0 ’ - $ 0 575 0 0 63 eh 3p - 0 166" *j.'í 576 121 0 19 0 3P + 0 246 577 Q 0 1 D 0 - , 0 3 1 0 S7B 6 a 4 0 0 - A LL. 24 0 575 mu i H4 i 3p Ψ - - t >464 1 560 '721 i 125 1 _4p + 1 »464 1 581 0 D 2 D 0 * - 0 í 0 582 9 0 2 0 - 1p - - D e 0 583 0 b 3 0 , *P_ - * 0 0 584 35 D 1 0 _&_ _ α 12 0 585 2114 1 125 f -4p - + 1 >464 1 537 19 9 2 9 ...30 - ' à 11 . 0 533 1368 1 56 .1 _5e_-. + 1 >464 1 589 323 1 3 e . 4p 4 0 >444 ' -vv^í»; rj 591. 4 0 4 0 2p - 4 0 0 0 £92 6 0 0 0 -3P _ - 4 0 9 0 593 44 α 26 0 . . .. 3P - 1 3 ’..0 : 595 76 6 76 1 -*9 + 4 1 »46+ 1 597 ' 0 6 0 0 0 • - à 9 , 0 599 49 0 125 1 4». +· + 1 >46+ 1 6QQ 0 0 3 0 0 - - 0 3 0 601 € 0 0 Q - - 0 i1' 0 (M2 1 b 0 0 0 0 - - 0 0 0 605 ' 11 0 0 0 α - - 0 10 0 608 5 0 5 0 0 - - 0 9 > 0 609 306, 1 * Γ õ 0 - 0 13 ο Ί 01Q 1 111 1 . 4p * - 1 >464 1 a 1-2 *7* 1 34 0 4P £&1'J ♦ 0 422 613 46 0 D 0 P - 9 3 0 616 741, 1... TO 1 4P + + 1 >464 ! i 617 1725 1 125 1 -.4P + : • 1 285 ' 1 61Θ 426 i 101 1 4P.... 4 - 4 t >464' 1 i 621 a 0 32 1 4P- + ; 4 i >464 1 622"" 15 6 6 0 3» - ' T* 0 25 ί α 624 +11 l- ! 110 4P ¥ 0 >464 Uiã ] 626 46 0 n IP....... - * ' 53' ' 627 0 0 48 1 1P vu *·* . 1 27 ' ffisSI 629 6 0 2 0 α ψ - 0 2 ΓΤ 1 631 31 0 21 0 Itt - 'b 92 632 0 0 . 3 6 0 - - D 22 G 633 285 1 104 t 3p 4 4 1 >46+ 1 634 43 0 69 1 4P + # >464 1 1 636 1 33 í 0 ϊ 20 j - _ f"T" rrn 1 45

Tabela 14. 87 soros da população I bestados com o extracto de N-Octil Glucosido da. estirpe aflagelada frseíum pâo· rtspA 0 sOtoJLF VB 35 W8JLF í(«Btp + i ϋ*«Β0Α- |[ 1 fãS- mvm H sâ "T* - ^2--i 4 >464 í- 441 mm 0 6 0 _ΪΕ_ / * 0 8 O ' 4*5 29 0 B 0 — - * 0 29 ' 0 64? 0 D 2 0 1p - - 0 4 ! O ~5%T~ & 6* 5 ' 9 9 « - 0 12 0 650 è 0 0 0 Ϊ * * 0 3 I 0 654 0 0 1 S D - - ò 4 0 «Sã 49 0 59 1 ÍP - 1 229 i 1 656 ó 0 3 0 D - 0 8 5 6S7 1 1« 1 . 4p ♦ 4- 1 >484 1 ssé “0 0 "" è' 0 1p - - 0 6 0 659 0 0 3 D 0 - 0 3 0 6S2 73 é i' 0 —fe--. - 0 40 6 643....... 35 D 21 0 2P - 0 103 TTPTS 46? 86 0 26 0 4d - 0 68 46S 32 D 68 1 . <P + * 1 1 46S 265 1 116 1 30 * ~ + 1 '5484' 1 ¢70 734 1 77 ^§51 Zp * 9 *484 471 " r' 214 1 100 1 —«l- + • 1 *464 t 472 4 D 5 0 0 .0 i -0- 473 1023 1 ' ' 56 1 âp - t >404 1 n 474 12 0 10 ΓΤΓ 0 Τ' ' ™ * 0 < 2í õ | 4?S 9 0 13 0 - * 0 210 ; : 1 j) 476 2611 1 74 _!_ 4p + + t E2I 1 S 0 0 0 Q 0 J * 0 1 0 9 ”.....479 Ϊ75 1 3 0 -4b__. w 0 2MB :wzi <80 1 0* 0 1 » Q »* - 7 a U 401 800 t 32 1 - 3P. + + ‘ 1 425 1 1 4B2 Õ 0 V 0 fi - 0 6 0 n 403 0 0 ÍB 1 ®- . » 4 1 B23 1 9 444 0 '0 3 1 \ 0 e - - 0 2Q 0 i 4BS D 0 1 0 ’ d"' - - « 11 a 9 4B6 0 0 2 1 ov 0 . - 0 6 0" Ί 725 0 a 7 ΓΊΓ 0 - - 0 198 , 730 “iiT 1 45 i£ b> - fi 372 Λ» 3*3 732 0 0 to " 0 ip - 735 0 0 30 0 %_ - Φ ΓΤΤΪ43Π 736 D 0 0 0 0 - - 0 0 0 737 25 0 102 1 4p ’ t 1 15S 1 1 125 1 y , 4 * 1 >4$4 1 l· 739 1 79 0 33 “Ί 0 * - + ti 274 Técnica

Placas revestidas com 2 μ9/ιη1 em antigénio Hsp A 3 μς/πιΐ em extracto NOG de NflbA e N6

Gama 5 pontos da gama controlo negativo controlo positivo utilizado 46

Soro dos doentes

Incubação; 3 lavagens

Conjugado monoclonal (IgG toxo) utilizado em

Volume depositado com 4 diluições Diluição de 1/100 Volume depositado 100 μΐ 1 hora a 37°C 1/32000 para HspA 1/64000 para N6flbA-1/55000 para N6 100 μΐ -Incubação do conjugado durante 1 hora a 37°C -4 lavagens -Revelação da reacção enzimática com o substracto OPD+ durante 30 minutos na obscuridade -Paragem da reacção enzimática por H2SO4” -Leitura das D. 0 a 492 nm/620 nm.

Conversão das D. O em unidades arbitrárias (UA). 47

Tabela 15: Soros documentados da população

Legenda G- Gastrite ; hérnia lateral ;D=úlcera (UD=úlcera duodenal); (UG= úlcera gástrica) D= Duodenite; B/Bulb -= Bulbite; 0= Esofagite 48 Tabela 15 bis: Soros documentados da população

(13 T3 G 0> Cn Φ P I—i ra c <u V o 3 Ό .—, (0 fO u M -1 1 1—1 cu P (0 u -P M 1—1 co (D Ό 'Π3 P II P (fl Q Φ tt) 1—1 P (13 -P -P —- P -H Ή (0 0) G G -H (13 0 (D P G M i—1 PS ca M (L) -G O G Ό U g p π i—i II o Ό O II II II P II U P p — a B/Bulb = Bulbite 0= Esófagite

50

51

Tabela 17: População documentada da população I 55 soros de Hp-42 soros Hp+

Sensibilidade Especificidade Soro JLF 85,7% (36/42) 70,9% (39/55) NOG 60 97,8% (41/42) 61,8% (34/55)

Protocolos de extracção a partir da estirpe aflagelada N6flbA-.

Quantidade fornecida 800 mg de bactérias recolhidas com PBS centrifugadas 3 extracções testadas.

Extracções da estirpe aflagelada

Extracção com Glicina Extracção com N-octil glucosido Extracção com PBS Recuperação PBS PBS 0,01 M PBS pH 7,4 Lavagem 2 vezes em PBS 8000 rpm/12 min '2 vezes em PBS 8000 rpm/12 min Extracção Tampão glicina ácido 0,2 M pH 2,2 15 min. Tp ambiente, agitação suave 100 mg (peso húmido) para 2,5 ml PBS contendo: 1% N-octil glucosido pH 7,2 (Sigma Chemical Co.) 20 min Tp ambiente Colocação em vortex durante 1 min. Centrifugação 11000 g 15 min. 23500 g 20 min. 5000 g 10 min. Neutralização NaOH 1 M Diálise PBS pH 7,2 2 4 h a +4 °C limite de corte 10000 PBS pH 7,2 24 h a +40 C valor de corte 10000 PBS pH 7,2 24 h a +4 °C valor de corte 10000 Conservação Determinação da concentração. Conservação a -20°C Eliminação das partículas insolúveis conservação a -20°C Determinação da concentração. Conservação a -20°C 52 SDS PAGE dos Diferentes Extractos da Estirpe Aflagelada N6 FLBA- N° Poços Tipo de amostra Concentração μg/ml Volume da amostra /Volume de tampão Volume depositado 1 Padrão PM 5+5/190 10 2 Extracto de glicina 202,9 60/60 60 3 4 Extracto de N-octil glucosido 874 51/39 60 5 6 Extracto de PBS 1 539,2 60/20 60 7 8 Extracto de PBS 2 77,9 60/20 60 9 10 Padrão PM 5+5/190 10 11 Resíduo do extracto de glicina 2778,7 20/20 20 12 13 Resíduo do extracto de glucosido 972,9 40/40 60 14 15 Extracto de glicina sedimentado 309,3 60/20 60 53 (continuação} N° Poços Tipo de amostra Concentração μ9/πι1 Volume da amostra /Volume de tampão Volume depositado 16 17 HspA Mal E 3000 20/20 20 18 19 20 Caleidos cópio 20

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Lisboa,27 de Janeiro de 2009

Claims (19)

1 Reivindicações 1. Uso para a detecção in vitro de uma infecção por H. pylori numa amostra de fluido biológico retirado de um doente, de uma estirpe bacteriana recombinante de Helicobacter pylori que possui um fenótipo aflagelado que resulta de uma mutação por substituição, adição e/ou supressão de bases ou de um fragmento nucleótidico na sequência nucleótida do gene flbA que participa na regulação da biossíntese das proteínas dos flagelos de H. pylori, hibridizando a dita sequência nucleótidica do gene flbA sob condições severas com uma amostra que corresponde a um fragmento nucleótidos de H. pylori amplificado utilizando os dois oligonucleótidos degenerados seguintes: OLFlbA-1: ATGCCTCGAGGTCGAAAGCAAAGATG e OLFlbA-2: GAAATCTTCATACTGGCAGCTCCAGTC, e em que a dita mutação é tal que ou o gene flbA deixa de ser expresso na dita estirpe bacteriana recombinante, ou o gene flbA não permite a síntese dos flagelos de H. Pylori.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, em que a estirpe bacteriana recombinante é caracterizada por o fenótipo aflagelado resultar da mutação na sequência nucleótidica do gene flbA, em que a sequência não mutada corresponde à seguinte cadeia nucleótidica ou codifica para a proteína que corresponde à sequência de aminoácidos seguinte: 2 . ftSC ΓΠΓ m.-CTC CCJi IAC TTT TAA SCT TTÍ, tW TfãAX? AM* ASA CSA ACA CAC Μ&Γα3 • ' · . . . ' ‘ ' -ct . · ar - . j»ikmA&Eci:i&mDU3»Tj;»Ga»c qia..ggc tcc aaa ma cet ,ττι'ααα. mc :» & 9 B '* é 'X l a r- k K 121 t 1 151' ’ * «t trc ccí qw? tít *u* esc tíc ττβ cba rcc am &c rtft scç ctr ate otc ϊττ ete * t r-P V F R R p.i '0 S E fl. 1 Jt i . U , V , X V lai. ( . * m ' ; - ΑΪΑ OT5 íjtT ΠΛ SOS Ate ΛΤ? ftTC CTC CCS Ϊ3Α CCS CfJP TTT EtC TTS SAT ΤΓΓ 13» CSC x a i x a ‘ a ·ϊ . z’ y * l b » ΐ v x p * r * * 341 . , 211. - íCÍ ATT 1CS ATC 5&Ç ÇíA SES exS ÍTG ATT MT TTfe ATO GÇG CTt lAX Alt Gftíí AMA CCS : τ I S X Λ £ S V L 3 I -E I Ç x ϊ I h'K'F JOX -.'* V - * .131 ·. «cr gat TTT aec gct ixc cgc acj τον ífta cec axt en. açc. tíA xac-csc ttg <*ct tja t. O - F S.Al-F P Γ ' t. 6 L I- V T 3. X A ϊ, Λ χι ; ’ 361 - · 39£ : ΑΛΤ ârc-Gcc age act asa Atb Asrtm ACC cm esc' ifci juuhãss ccr *GC es ges asc H V A T T R H :.! Ic t a " G X R .. e $ S ‘ AVs ‘ tól . ’ «!,“ : ATT ΛΤΤ AIC ACã SCG TTT GCE GBA tltrABC CTS ABC GQS Aflt CKT CTB ATT BGS GCT &ΤΓ • i-τ ι r a . r · ç t f s. v> * s.. a. 1? ϊ ν τ'.ο a x . ; -w - su . 1 AEG TTT AGI ATT Πλ BXGf CtS «IG JUT t» m GXG GTX ACT DAT COT TCT ACT AEG G3T ‘1 F S I 1, V 1 V IP- Et V‘VTH S Ê‘t k · V ia. · STi . HfíF «4A-C3X.Ase BCG CBE tlT GOC C3A CSC GCT AXG CBt GSft WE» CA& A.TG GCC AXt CST 'X E V R A R F A l ô ' A K T. G ΕΌ' Η ' A I p «ia - · ., '»a *. , i 6CG G3CT 72A ΛΑΤ tat BCB CITiACT βΚΑ'βΒΓ φΰ: VUA GCT AMI ARA CBS ÇGÇ GCC .BCf CXA ' A.B t ' K· 5 G E X B 'B K A* A K » R H A A ’t CG1 - S«, * . I ASC CSA 6AA RE GET VlT Ai GGP Gq3'MS ΕΗΓ TCS AAR T*T tSXC AM $RiC ΒΓ í S Ú Z A P..F T Ip A Hl » GA S R F V B <S B 721 - ' ' 7S3t ' ' GCG ATC GCT TtrT ATC ATT WJC ACC OT ATC ΛΑΓ ATC AtX GCC tot JT5T' TT» GTG CCC GXG ,a'x a s i x - r X ‘t'3 »,r I g g f r. -v e-v ‘731 · - - \ 011 ' - ' txc tSA- ASC CÁT ATS JUSC.TEB ABC TXT.ACr BCP ABC ACT ITC ACT JU(C IX» ADC MT GÇC ‘ F 1 0 - A ‘ B » 3 t·. S X S ή -5 X F T I L T ! « B41 * 371 rax S55 err ra. ggg cm aic ccx gcc λα «rc ias ecs apl cgo ux cot axt gtc qçç 0. G £ V . E a X F' -A- £ l i A T, R X G - T~ V At SOI 931- Λ ' , ACT CSC H£E ACG ^Ul MC GA' BAA G»G OIC T3T GCT-XCX AJU? ClC ATC AO CMS CFC ROÇ -1 A T.T Ú ri E S E P.F‘A-3 R lr 1' I, 5 1 T na 1 -. - 931 * * . AAT.A1» ASC AM ACT IXA Gt& ATT GT5 GC5 CCG AXT Ttó TS5 ITT TGC ACC ATT GCT âdk. Λ K S ' Γ L' V' I V :G 1 ϊ Ϊ - C -P C t I B fi ' 1023 .- ' . " SUtíit CtC CCX ACC TTT XCT HA BGG ΤΓΓ PTA GGe ECT CTC TXT Tni T3C ATC OCA ISG CJG Air t í, í F 3 A F V-σ A t'P £ F -X A“ w fl HlflX ' . « *<3,111 . *· ' AJ2D AEC GAS W3& AAC SAC ÇSÚ TTCí CXC ΑΣ^&ΑΑΤΒί OUt Afit JMl !TQ AGT GtA AM TtC ri ,H‘ 5 G' K G ’ ff £ £ T t S S X- S, â K F nti1 ’ ..kh esc m erur tte abc caa aaa ccc cm asc.^ccma júcc am cçt esc etc ccc acç rcr. G £ B · 3> S E K P D s./s- s r R. F .8' A t t X 1201 123JL AOb.CCT ΑΑΑ ACC ÇAA OiA-ÊAG AXT JUUC ABA GRA. QW SUS CftA GCC AXT CAT GKf. BSG ΪΤΑ A A B -1 β· ' E Έ Γ --k- '-a B 5 ? ‘fl A t 0 B ‘ V L· 3 ; 12 EI ' . ' ΑΛΑ- 5ΓΓ ΟΛΑ rrr TJ^ G» fTC GCtln see JW as HC VUC M3C τη QOS E>UC XTÓ AR* E Ι'β Γ ΐ B t, * £ e Ϊ Q-fc ϊ 3 t.A -S « ' ~JS 1321 . , 13ÇL ;.. ‘ *’ Oft. 6® 6GC l?w ITC.rtA GJA AC3 ftTT AfiS GST MV Í£A MA AAS ÍCÍA. GCG AGC CA.? ΓΑΪ o‘s G D L L'£ & I A S Γ- R' K E I A S D X 13íl· - . . ·' 1<IÍ * «Ϊ ITT MS ATâ cn ΟΛ AW W*· AXT.WB G*TJW THí. çxa ctc £cá CCS ACC CAI TAT $ F.L-B P O I R r &. D » 1. 0 1.7 7 ' T -S * l'í^-2 " * _ --. > iOl Slft me AAS C3T- AM S3C -ΑΪΤ OTJf AÍt GB? SUA SBC AffS ΕΓΒ'Ατε CCS &S ÀAG ΓΓΤ ΪΤΛ. ε-χ r l d c i V I , s e ς h v - tt ΐ d s. p s, 1501- ‘ 1531 . . ' ÇCÇ ATG AkS ACC KÍT TÍT GTG «Λ AAA SAh ATT JftA GBC ATT ÇCl. js£$ ABA GW3 CCC SCT A jf.Br' T Ç F * V R - K È’,*I B θ X 7 T » R 7 ft , isa ' - . * . 1591 ' / . tTT EGA Ata ,GAC’5CV TXA TOÍ. «XT GRA ATT MA AKF ffML ΟΑ^Ί-ΒΑ' GCE MC *Tp C*A 6SC . Γ- ’é « . D A 1 jff I -E -T E' L ,E £ E ff .1 I β -S . 'lffiSfc * . ΊΕΙ , * . EBJ.BCC Att ΛXt GAT q» ftSC ÂCC.GTT ATO CCS ífcS-CAC KCC AttCTGAA ΪΤΛ CTC AÁX AAA ’ ^ t, ί ϊ ,j t -Jf é * .». & ,t V ff ff isto,· - . nu Ώί SCT 3AA- GAT «T ArC AJCX-AAAGW:- &Á GIP AU. WÈ:{3tT MA GWS CSC TXG CCC AJUL' , ΗΪ A t\ D .Γ ff V * D E’ V - K 3 í fc. £ ff £ .A « í ., . . * . ιτη. * ., ; , . cac 'HftT, ecr ACG ATO Í5TA <SkA ®S AST AKA ABA ATC ÒCC ÂCC IÈT GCC.ftTC CGA ISA G7D D.‘fftF ϊ ' X. V'P.3 S K X I * T‘G :·Λ. . I , -ff . S V iBift ^ * -risa . . ^ '** TOG CflA CÓS Tte. TTG CBJ 43UÍ ΛΒΑ JU^C CCC ΜΪ Aí*" GA£ ATS 'MG AÇrff.Rtf TUt ώϊΑ ACE f g . -a &' i ' a e κ i ? i k d a. τ i.

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4. Estirpes bacterianas recombinantes caracterizadas por serem obtidas por mutação, por substituição, adição e/ou 4 supressão de bases de um fragmento nucleótidico na sequência nucleotidica do gene flbA que participa na regulação da biossintese das proteínas dos flagelos de H. pylori, hibridizando a dita sequência em condições severas com uma sonda correspondente a um fragmento de nucleótidos de H. pylori amplificado utilizando dois oligonucleótidos degenerados: OLFlbA-1: ATGCCTCGAGGTCGAAAGCAAGATG e OLFlbA-2: GAAATCTTCATACTGGCAGCTCCAGTC, e em que a dita mutação é tal que ou o gene flbA deixa de ser expresso na dita estirpe bacteriana recombinante, ou o gene flbA não permite a síntese dos flagelos de H. Pylori, sendo a dita mutação efectuada na estirpe N6 depositada no NCIMB a 26 de Junho de 1992 com o número NCIMB 40512.

5. Estirpe bacteriana recombinante de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por ser a estirpe N6flbA-, depositada na NCIMB a 30 de Junho de 1952 com o NCIMB 40747.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 em que a estirpe bacteriana é caracterizada por ser também mutada de modo a produzir uma urease atenuada, ou mesmo até deixar de produzir urease, consistindo a mutação, por exemplo, numa mutação da sequência nucleotidica de um ou vários genes escolhidos a partir dos genes ureA, ureB, ureC, ureD, ureE, ureF, ureG, ureH ou urel.

7. Estirpe bacteriana recombinante de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizada por ser também mutada de modo a produzir uma urease atenuada, ou mesmo até deixar de produzir urease, consistindo a mutação, por exemplo, numa mutação da sequência nucleotidica de um ou vários 5 genes escolhidos a partir dos genes ureA, ureB, ureC, ureD ureE, ureF, ureG, ureH ou urel.

8. Uso para a detecção in vitro de uma infecção por H. pylori numa amostra de fluido biológico retirado de um doente de um extracto bacteriano caracterizado por ser um extracto de uma estirpe bacteriana definida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 6.

9. Uso de acordo com a reivindicação 8 de um extracto bacteriano sendo o dito extracto caracterizado por ser obtido após uma extracção com N-Octil Glucosido.

10. Uso de acordo com a reivindicação 8 de um extracto bacteriano sendo o dito extracto caracterizado por ser obtido após uma extracção com PBS ou com glicina.

11. Extracto bacteriano, caracterizado por ser um extracto de estirpes bacterianas de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 ou 5.

12. Extracto bacteriano de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por ser obtido após uma extracção com N-Octil glucosido.

13. Extracto bacteriano de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por ser obtido após uma extracção com PBS ou com glicina.

14. Método para a detecção in vitro de uma infecção cóm H. pylori numa amostra de um fluido biológico retirado de um doente, em particular numa amostra de soro, compreendendo os passos que consistem em: 6 -colocar a amostra testada em contacto com a estirpe bacteriana definida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou com um extracto bacteriano definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 10, detecção de uma imunoreacção entre a dita estirpe bacteriana e anti-corpos dirigidos contra H. pylori presentes na amostra testada.

15. Uso para obter anticorpos contra H. pylori de uma estirpe bacteriana definida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou de um extracto bacteriano definido de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10.

16. Uso de acordo com a reivindicação 15, para a preparação de uma composição para vacina para obter anticorpos que protegem contra uma infecção por H. pylori.

17. Soro policlonal dirigido contra uma estirpe de H. pylori de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 ou 5.

18. Uso para a detecção in vitro de uma infecção por H. pylori numa amostra biológica de uma composição compreendendo como princípio activo um soro policlonal obtido contra uma estirpe de H. pylori que possui um fenótipo aflagelado definido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

19. Kit para o diagnóstico de anticorpos de doentes infectados com H. pylori, compreendendo uma estirpe bacteriana definida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou um extracto bacteriano definido de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, e 7 reagentes necessários para demonstrar uma reacção do tipo antigénio/anticorpo. Lisboa, 27 de Janeiro de 2009