PT687300E - Anticorpo lo-cd2a e sua utilizacao para a inibicao da activacao e proliferacao de celulas-t - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "ANTICORPO LO-CD2a E SUA UTILIZAÇÃO PARA A INIBIÇÃO DA ACTIVAÇÃO E PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS-T" [0001] A presente invenção refere-se a um anticorpo (ou um seu fragmento ou derivado) ef de preferência, a um anticorpo (ou um seu fragmento ou derivado) que se liga a linfócitos humanos. Mais particularmente, a presente invenção refere-se à prevenção e/ou inibição de respostas imunitárias em curso, num paciente, através da administração desse anticorpo (ou um seu fragmento ou derivado) a um paciente. De preferência, a presente invenção refere-se à prevenção ou inibição da activação e proliferação de células T, através da administração desse anticorpo, ou de um seu fragmento ou derivado, a um paciente.

[0002] Na arte anterior está descrita a possibilidade de utilizar anticorpos contra o antigénio CD22 para inibir a rejeição de enxertos. Em geral, a arte anterior descreve a utilização de anticorpos que se ligam aos antigénios de CD22, como sendo possivelmente úteis para inibir a rejeição de enxertos, veja-se Ortho Pharmaceutical Corp., Pat. US Nos. 4,364,973; 4,614,720; 4,515,893; 4,743,681) e 4,798,806.

[0003] Estes anticorpos não são conhecidos por serem úteis na inibição da rejeição de enxertos em pacientes humanos, ou em animais. Como exemplificado nas referências seguintes, J.V. Giorgi et ai-, Immunoaupprcooive Effect and Immunogenecity of 1 κ

ΟΚΤΙΙΑ Monoclonal Antibody in Monkey Alloqraft Recipients, Transplantation Proceedings vol. XV No. 1, Março 1983 e P. J. Thurlow et al., A Monoclonal Anti-Pan-T-Cell Antibody, Transplantation , Vol. 36, No. 3, Pg. 293-298.

Descrição detalhada das figuras FIGURA 1 [0004] Coloração de duas cores de células mononucleares de sangue periférico (PBMC), com L0-CD2a biotinilado e Leu-5bPE.

[0005] Para esta coloração seguiram-se os seguintes parâmetros: PARÂMETRO:FLI-H\(LOG) FL2-h(LOG) QUAD LOCALIZAÇÃO: 17.15,9 TOTAL = QUAD 5000 FENÓMENOS SEPARADO POR FENDA = % SEPARADO POR FENDA 1290 % TOTAL MÉDIA DE X MÉDIA DE Y 1UL 299 23.18 3.98 11.41 284.69 1UR 851 65.97 17.02 32.70 630.65 3LL 135 10.47 2.70 4.08 3.31 4 LR 5 0.39 0.10 25.11 6.54

FIGURA 2 [0006] Os PBMC humanos foram corados com LO-CD2a-FITC e em seguida a) corados com Tll-PE (anticorpo contra CD2 Coulter) conjugado com ficoeritrina (PK) ou b) Leu-5B-PE (anticorpo contra CD2, Becton Dickinson) conjugado com ficoeritrina (PE). Em nenhum dos casos, a coloração com o segundo anticorpo foi alterada pelo pré-tratamento com L0-CD2a. 2 FIGURAS 3a e 3b [0007] Efeitos de LO-CD2a em marcadores de membrana. Cultivaram-se células PBMC a 2 x 106 células/ml, na ausência (linhas a cheio), ou na presença (linhas a tracejado) de L0-CD2a (200 ng/ml). Aos tempos indicados nas figuras, as células foram recolhidas e tratadas para análise citofluorimétrica, a) e b); Os PBMC foram marcados com mAcs anti-CD3 (Leu-4a-FITC) , anti-CD4 (T4-RD), anticorpos monoclonais (mAcs) anti-antigénio de classe II (LO-DRa-FITC) ou anti-CD8 (T8-RD). Os controlos negativos para mAcs de ratinho, comerciais, eram aliquotas das mesmas células, coradas com IgG de rato, marcados com FITC ou rodamina. Os controlos negativos para mAcs de rato eram células incubadas com soro de rato normal, seguido de um mAc anti-rato, de ratinho, marcado com FITC (MARK-FITC). Os resultados são expressos como percentagem de células positivas. FIGURAS 4a e 4b [0008] Efeitos de L0-CD2a em marcadores de membrana e cultura de linfócitos de sangue humano, com e sem adição de L0-CD2a. As culturas de linfócitos a 1 x 108 células/ml foram marcadas com (a) mAc anti-CD2 (Leu-5b-FITC), anti-CD4 (T4-RD1), ou mAc anti-CD8 (T8-RD), aos tempos indicados; (b) coraram-se culturas mistas de linfócitos a 1 x 106 células por ml de cada dador com mAc anti-CD2 Leu-5b (marcado com FITC). 0 controlo negativo para mAcs de ratinho, comerciais eram aliquotas das mesmas células coradas com IgG de ratinho marcado com FITC ou rodamina. Os controlos negativos para os mAc de rato eram células incubadas com soro de rato normal, seguido de mAc anti-rato, de ratinho, marcado com FITC (MARK-FITC). Os resultados são expressos como percentagem de células positivas. 3 FIGURAS 5a θ 5b [0009] Efeitos de L0-CD2a e Leu-5b na expressão de CD2. Os PBMC humanos foram incubadas com a) L0-CD2a (200 ng/ml) ou b) Leu-5b (dializado contra PBc, diluído 1:2) aos tempos indicados e a) corados para expressão de CD2 (Leu-5b-FITC e TII-RD1) e para ligação de LO-CD2a (Mark-3-FITC) ou b) CD2 (L0-CD2a-FITC, Tll-RDl) e para a ligação de Leu-5b-de anti-ratinho (GAM-FITC), de cabra. FIGURA 6 [0010] Efeitos de LO-CD2a em MLR. a) inibição de MLR em culturas de linfócitos mistas, incubados durante 6 dias na presença de concentrações crescentes de LO-CD2a, adicionado ao tempo 0. As culturas foram recolhidas ao dia 6; b) inibição de MLR em culturas de linfócitos mistas, incubadas com diferentes concentrações de L0-CD2a adicionado ao tempo 0. As culturas foram recolhidas a intervalos de 24h; c) incorporação de 3H-timidina (3H-T) (cpm) por culturas de linfócitos mistas, na ausência (linha a cheio), ou na presença (linha a tracejado) de L0-CD2a (200 ng/ml); d) inibição de MLR por L0-CD2a (200 ng/ml) adicionado a diferentes tempos, após o início da incubação. As culturas foram recolhidas ao dia 6. Todas as culturas foram feitas em triplicado (1 x 104 células de cada dador/ml) num volume final de 200 μΐ/poço. Adicionou-se 3H-timidina 8 h antes da recolha das culturas. Os resultados em c) são apresentados como cpm x 103 incorporados por célula, recolhidas no tempo indicado. Os resultados em a), b) e d) são expressos como inibição percentual de MLR em culturas em triplicado (média + D.P.), em comparação com culturas controlo (sem L0-CD2a). 4 FIGURA 7 [0011] Fez-se a cultura de células mononucleares de sangue periférico em culturas de linfócitos mistas, com ou sem a adição de 200 ng/ml de L0-CD2a. Nos tempos indicados, as células foram removidas e analisadas por citometria de fluxo, após coloração com anticorpo contra CD2 (Leu5b-FITC). Os blastócitos "gated", por dispersão frontal e lateral e a expressão dos marcadores indicados foi quantificada nos blastócitos. FIGURA 6 [0012] Efeitos de L0-CD2a em blastócitos. Fez-se a cultura de linfócitos humanos, com e sem a adição de L0-CD2a (200 ng/ml). Aos tempos indicados, as células foram removidas e coradas para CD3 (Leu 4a-FITC) , CD4 (T4-RD1) , CD8 (T8-RD1) ou CD25 (L0TACT-1-FITC). Os linfócitos em repouso foram identificados por "gating" diferencial, quanto a tamanho e granulimetria e os resultados são expressos como a percentagem de linfócitos em repouso totais, que coram com o anticorpo indicado. FIGURA 9 [0013] Efeitos de LO-CD2a em linfócitos estimulados com mitogéneos. Os PBMC foram cultivados durante 96 h na ausência (barras riscadas) ou na presença (barras a cheio) de 0KT3 (100 ng/ml), Con-A (10 μg/ml) e FHA (1 pg/ml) . Em culturas paralelas, o L0-CD2a (200 ng/ml) foi adicionado 1 h após os mitogéneos (barras a cinzento) ou 1 h antes dos mitogéneos (barras brancas). As barras quadradas representam culturas 5 realizadas na presença de apenas L0-CD2a. As culturas (em triplicado) foram marcadas por pulsação com 3H-timidina, durante as últimas 8 h de incubação. FIGURAS 10a θ 10b [0014] Inibição da actividade de NK por incubação das células efectoras e células alvo (células K562 marcadas com 51CR) na presença de LO-CD2a. Testaram-se 3 concentrações de LO-CD2a: 5 μς/ιηΐ, 1 μς/πιΐ, 0,5 μg/ml. As células efectoras eram linfócitos de sangue periférico de actividade NK, que é expressa como a percentagem de lise de células alvo marcadas. Testaram-se dois indivíduos normais a 3 razões E/T: 200/1, 100/1, 50/1. FIGURA 11 [0015] Efeitos de LO-CD2a na activação de PBMC induzida por mitogéneos. Fez-se a cultura de PMBC de dois dadores durante 95 h, na presença de 0KT3 (100 ng/ml) , CON-A (10 μg/ml) e PHA (1 μg/ml). Em culturas paralelas, adicionou-se L0-CD2a (200 ng/ml) no dia 0 (Oh) após o início da cultura, dia 1 (24 h) ou dia 2 (48 h). 0 gráfico mostra a percentagem de inibição por LO-CD2a, da proliferação induzida por mitogéneos em cada dador. FIGURA 12 [0016] Linfócitos totais por μΐ de sangue periférico de um macaco cinomólogo que recebeu 20 mg/dia de L0-CD2a durante 10 dias (dias 0-9). 6 FIGURA 13 [0017] As células PBMC do macaco cinomólogo que recebeu LO-CD2a a 20 mg/dia, durante 10 dias (dia 0 a 9), foram coradas com anticorpos monoclonais contra CD2 (Leu-5b), CD4(Leu3a), CD8(Leu2a), células "killer" naturais (CD8 e CDllb) e células B (anti-IgM), nos dias indicados e analisadas por citometria de fluxo. Os resultados são apresentados como a percentagem do número total de células coradas, por microlitro de sangue. FIGURA 14 [0018] Actividade NK de um macaco cinomólogo, que recebeu 20 mg/dia de LO-CD2a durante 10 dias (dia 0-9) . A actividade NK foi testada nos dias 11 e 22 e é apresentada como % de lise a E/T de 25/1, 50/1 e 100/1. FIGURA 15 [0019] Concentração no soro de LO-CD2a de um macaco cinomólogo que recebeu o anticorpo a 20 mg/dia, durante 10 dias (dia 0-9). O anticorpo monoclonal foi medido por ELISA, como descrito no texto, e expresso em μg/ml. FIGURA 16 [0020] Desenvolvimento do anticorpo IgG contra L0-CD2a num macaco cinomólogo que recebeu 20 mg/dia de LO-CD2a, durante 10 dias (dias 0-9). O anticorpo contra o anticorpo monoclonal foi medido em diluições em série de soro, retirado nos dias indicados, por ELISA sanduíche, descrito no texto e é expresso como densidade óptica a 492 nm. 7 FIGURAS 17a e 17b [0021] Efeito de L0-CD2a em linfócitos de babuino. a) Nos dias indicados obteve-se sangue do babuino e as células foram coradas com os anticorpos anti-CD2 TII-RDI e Leu-5b-FITC, L0-CD2a e MARK3-FITC um anticorpo kalpa lb anti-rato, de ratinho, acoplado a fluoresceina, para detectar o L0-CD2a ligado. b) as amostras de soro recolhidas nos dias indicados foram avaliadas quanto aos niveis de L0-CD2a, por ELISA. FIGURAS 18a e 18b [0022] Efeito de LO-CD2a em linfócitos de babuino.

[0023] Nos dias indicados, recolheu-se sangue e as células foram coradas para detectar o L0-CD2a ligado com MARK3-FITC e MARK2b-a-biotina (um anticorpo monoclonal IgG2b anti-rato, de ratinho, acoplado a biotina) detectado com estreptavidina acoplada a PE). a) sem pré-tratamento das células; b) incubação com 2,5 μg/ml de LO-CD2a antes da coloração para detectar quaisquer locais não ocupados por anticorpos circulantes. FIGURA 19 [0024] Efeito de LO-CD2a em linfócitos de babuino.

[0025] Nos dias indicados, recolheram-se amostras de sangue e coraram-se com T4-RD1 (CD4); T8-RD1 (CD8) ou MARK3-FITC (LO-CD2a ligado). 8 FIGURA 20 [0026] Leucócitos, linfócitos e creatinina no paciente #1, tratado com ATG e em seguida L0-CD2a, para rejeição de enxerto. FIGURA 21 [0027] Níveis séricos de L0-CD2a, durante e após o tratamento, no paciente #1. FIGURA 22 [0028] Creatinina no paciente #2 antes, durante e após o tratamento com L0-CD2a. FIGURA 23 [0029] Contagens de leucócitos e linfócitos no paciente #2, antes, durante e após o tratamento com L0-CD2a. FIGURA 24 [0030] Níveis de L0-CD2a no soro no paciente #2, retirado imediatamente antes de, e 2,5 horas após cada injecção. FIGURA 25 [0031] Contagem de leucócitos, contagem de linfócitos e nível de creatinina no soro no paciente #3, que recebeu LO-CD2a para rejeição de aloenxerto renal. 9 FIGURA 26 [0032] Coloração com duas cores com L0-CD2a e (2) Leu5b, (3) Leu 4(CD3), (4) Leu3a(CD4), (5) Leu2b(CD8) e (6) LeuII (anti-CD16), um marcador de células NK. A ligação de LO-CD2a foi detectada com IG-FITC anti-rato, de cabra. O conjunto superior (1-6) dos histogramas de duas cores mostra a coloração dupla. 0 conjunto inferior (7-12) mostra a coloração individual com cada anticorpo. FIGURA 27 [0033] Coloração com duas cores de PBL humano com um controlo de isotipo de rato para LO-CD2a (Pharmigen, IgG2b de rato purificado, kapa) ou LO-CD2a e anticorpos contra CD4 (c,d), Cd8 (e,f), CDl6(g,h), CDl9(i,j) e CD2(k,l), conjugados com ficoeritrina. 0 LO-CD2a e o controlo de isotipo foram detectados com Imunoglobulina F(ab')2 anti-rato, purificada por afinidade, conjugada com FITC (Southern Biotechnology). Os anticorpos contra os antigénios CD eram todos anticorpos conjugados com ficoeritrina, obtidos da Becton-Dickinson [CD4(Leu3a), CD8(Leu2a), CD16(Leu-llb), CD19(Leu 12) e CD2 (Leu 5b) ] . Em cada caso, a coloração com o controlo de isotipo é apresentada no primeiro histograma e o LO-CD2a no segundo histograma. 0 histograma a mostra o padrão com o controlo de isotipo e b com L0-CD2a. FIGURA 28

[0034] Análise citofluorográfica da coloração de células COS transfectadas com CD2 do tipo selvagem. Os painéis da esquerda mostram os histogramas da coloração de uma célula COS 10 transfectada com o vector controlo, não contendo CD2; o conjunto de painéis da direita, mostra a coloração de uma célula COS transfectada de forma transiente, com um vector que contém toda a molécula CD2. Em cada conjunto, o histograma de topo mostra a coloração com W632 de murídeo (anticorpo de classe I, que se sabe ser expresso pelas células COS) e 76-2-11 (um controlo de isotipo para o W632 de murídeo) ; o painel do meio mostra a coloração com Leu5b (anti-CD2 da Becton Dickinson) e 76-2-11, um controlo de isotipo para a coloração com Leu5b, o painel de baixo mostra a coloração com L0-CD2a e um controlo de isotipo, de rato, para L0-CD2a FIGURAS 29a e 29b [0035] Sequências de nucleótidos e aminoácidos da cadeia VL de L0-CD2a. a) com a sequência "leader" do vector MRC, b) com a sequência "leader" do gene L0-CD2a. FIGURAS 30a e 30b [0036] Sequências de nucleótidos e aminoácidos da cadeia VH de L0-CD2a. a) com a sequência "leader" do vector MRC, b) com a sequência "leader" do gene L0-CD2a.

Descrição detalhada [0037] De acordo com um aspecto, a invenção proporciona uma molécula (de preferência um anticorpo monoclonal, ou um seu fragmento) que se liga especificamente ao mesmo epitopo (ou a uma porção sua derivada) em lifócitos humanos, que o anticorpo monoclonal produzido pela linha celular depositada como ATCC No. de depósito HB 11423. O anticorpo que é produzido pela linha celular depositada é, daqui para a frente, referido por vezes como LO-CD2a. O termo "molécula" ou "anticorpo que se liga ao mesmo epitopo que o LO-CD2a" inclui LO-CD2a. 0 termo "LO-CD2a" inclui o anticorpo produzido pela linha celular depositada como ATCC HB 11423 e os idênticos a esta, que podem ser produzidos, por exemplo, por tecnologia recombinante. A presente invenção também se refere à utilização de um anticorpo deste tipo, bem como a uma composição que compreende o mesmo, e um diluente farmaceuticamente aceitável ou transportador farmaceuticamente aceitável.

[0038] As moléculas ou anticorpos da presente invenção inibem a activação e proliferação de células-T humanas e os requerentes verificaram que esta inibição pode ser conseguida quando se adiciona a molécula, ou anticorpo, quer antes, quer depois de um agente que estimula a activação de células-T.

[0039] As moléculas ou anticorpos da presente invenção têm as características de se ligar a um epitopo de um antigénio CD2 (células T humanas positivas para CD2), mas deve entender-se, no entanto, que a capacidade destas moléculas, ou anticorpos, inibirem a activação ou proliferação de células T pode ser, ou não, efectuada através da ligação de células positivas para CD2, embora os requerentes pensem, actualmente, que o mecanismo 12 de acção envolve a ligação da molécula, ou anticorpo, a células positivas para CD2.

[0040] De acordo com outro aspecto da presente invenção, proporciona-se um método para prevenir e/ou inibir uma resposta imunitária em curso, em pacientes humanos, através da administração ao paciente de um anticorpo, daqui para a frente referido como LO-CD2a (ou um seu fragmento, ou derivado) ou qualquer molécula que mimetize este anticorpo ou seu fragmento ou derivado.

[0041] Uma linha celular que produz LO-CD2a, foi depositada em 28 de Julho de 1993 na American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 e foi-lhe atribuído o número de concessão da ATCC, ATCC HB 11423. Este anticorpo é um anticorpo monoclonal de rato.

[0042] Embora os requerentes não pretendam limitar a invenção a nenhuma consideração teórica, pensa-se que o mecanismo que permite que o anticorpo monoclonal da invenção iniba, ou reduza, a gravidade de uma resposta imunitária, e iniba a activação e proliferação de células-T, consiste do facto de o anticorpo L0-CD2a diminuir a densidade de CD2 expressos na superfície das células T, diminuindo desse modo o número de linfócitos T CD2+. Pensa-se que este mecanismo de acção é responsável, não só pela prevenção da resposta imunitária, mas também pela redução da gravidade de respostas imunitárias em curso. Além disso, o anticorpo L0-CD2a inibe a actividade de células "killer" naturais (NK) in vitro, tal como aqui exemplificado. Isto é pertinente para a presente invenção, uma vez que se pensa que um mecanismo citotóxico não restrito a 13 MHC, tal como a actividade de células NK, está implicado na doença de enxerto versus hospedeiro.

[0043] De acordo com um aspecto da presente invenção, proporciona-se um processo para inibir o início ou progressão da activação e proliferação de células T num paciente humano, por administração ao paciente de uma quantidade eficaz de uma molécula (de preferência um anticorpo) , que se liga ao mesmo epítopo (ou a qualquer parte sua derivada) em linfócitos humanos, que o anticorpo LO-CD2a. A molécula preferida é o LO-CD2a ou uma forma quimérica ou humanizada, sua derivada. Esta molécula conteria, por exemplo, a mesma região determinante de complementaridade (CDR) que o anticorpo L0-CD2a.

[0044] O termo "inibe", tal como aqui utilizado significa prevenção, ou inibição, ou redução da gravidade, ou indução de tolerância a, ou reversão da rejeição de um enxerto. 0 termo "enxerto", tal como aqui utilizado para fins da invenção, significa qualquer transplante, incluindo, mas não se limitando a, transplante de aloenxerto e renoenxerto. Estes transplantes podem incluir, por exemplo, mas não se limitam a, transplante de células, medula óssea, tecido, órgão sólido, osso, etc.

[0045] O termo "resposta(s) imunitária(s)", tal como aqui utilizado, refere-se a respostas imunitárias dependentes da activação e proliferação de células T, que incluem tanto efeitos celulares e anticorpo dependentes de células T que podem ser produzidos em resposta a, a título de exemplo e não limitativo: (i) enxertos, (ii) doença de enxerto versus hospedeiro e (iii) auto-antigénios que resultam em doenças auto-imunes, que a título de exemplo, mas não limitativo, 14 incluem artrite reumatóide, lúpus sistémico, esclerose múltipla, diabetes mellitus, etc.

[0046] A molécula utilizada na presente invenção é uma que se liga ao mesmo epitopo (ou a uma parte desse epitopo) que o anticorpo monoclonal LO-CD2a. 0 termo "liga-se ao mesmo epitopo que o anticorpo monoclonal L0-CD2a" pretende descrever não só o anticorpo monoclonal L0-CD2a, mas descreve também outros anticorpos, fragmentos, ou derivados, ou moléculas que se ligam ao mesmo epitopo que o anticorpo monoclonal L0-CD2a.

[0047] Estes outros anticorpos incluem, a titulo de exemplo, e não limitativo, anticorpos de rato, murideo, porcino, bovino, humano, quiméricos, humanizados, ou seus fragmentos, ou derivados.

[0048] 0 termo "derivado", tal como aqui utilizado, significa um anticorpo quimérico ou humanizado, anticorpo de cadeia simples, anticorpo bi-especifico ou outro anticorpo deste tipo, que se liga ao mesmo epitopo (ou a uma porção s,ua derivada), que o reconhecido pelo anticorpo monoclonal L0-CD2a.

[0049] 0 termo "fragmento", tal como aqui utilizado, significa uma porção de uma anticorpo, a titulo de exemplo, que inclui, mas não se limita a, CDR, Fab ou outras porções que se ligam ao mesmo epitopo, ou qualquer porção sua derivada, reconhecida pelo L0-CD2a.

[0050] 0 termo "anticorpo", tal como aqui utilizado, inclui anticorpos policlonais, monoclonais, bem como fragmentos, derivados, bem como anticorpos preparados por técnicas 15 recombinantes, tais como anticorpos quiméricos, ou humanizados, anticorpos de cadeia simples ou bi-especificos, que se ligam ao mesmo epitopo, ou a uma porção sua derivada, tal como reconhecido pelo anticorpo monoclonal L0-CD2a. 0 termo "moléculas" inclui, a titulo de exemplo e não limitativo, péptidos, oligonucleótidos ou outros compostos deste tipo, derivados a partir de qualquer fonte que mimetize o anticorpo, ou se ligue ao mesmo epitopo, ou a uma porção sua derivada, que um fragmento, ou derivado do anticorpo.

[0051] Uma outra forma de concretização da presente invenção proporciona um método para tratar um paciente que irá receber, ou recebeu, um transplante de enxerto com uma quantidade eficaz de pelo menos um membro seleccionado do grupo constituído por anticorpo L0-CD2a, ou um anticorpo, ou um seu derivado ou fragmento, ou moléculas que se liguem ao mesmo epitopo (ou a uma porção sua derivada) que o anticorpo L0-CD2a. 0 tratamento é de preferência realizado com o anticorpo L0-CD2a completo ou intacto.

[0052] Pode-se produzir um anticorpo monoclonal da invenção, como anteriormente descrito, por técnicas conhecidas na arte, tais como as descritas por Kohler e Milstein (Nature 256, pp 495-497, 1975), bem como pelas técnicas aqui descritas. A preparação de um anticorpo monoclonal L0-CD2a é descrita em maior detalhe no Exemplo 1 deste pedido. Como acima indicado, os anticorpos L0-CD2a também podem ser produzidos por técnicas recombinantes, utilizando processos conhecidos na arte. 0 anticorpo recombinante pode ser também na forma de um anticorpo quimérico, em que a região variável ou CDR de um anticorpo L0-CD2a de rato é combinada com a região constante de um anticorpo de outra espécie. Assim, por exemplo, o anticorpo monoclonal 16 pode ser humanizado, combinando a região variável ou CDR de um anticorpo monoclonal L0CD2a de rato com a região constante de um anticorpo humano, para se obter um anticorpo monoclonal humano-rato, quimérico.

[0053] 0 anticorpo ou molécula da invenção de preferência: (i) liga-se a todos os linfócitos T e também a células nulas, mas não a linfócitos B, como se pode ver pela coloração de duas cores de linfócitos, analisados por citometria de fluxo (Figuras 26 e 27); (ii) liga-se a todas as células T (determinado por coloração com anticorpo Leu4 anti-CD3), a todas as células positivas para CD4 e CD8, como definido pelos anticorpos Leu3a e Leu2b, respectivamente, e a alguns linfócitos que são negativos para CD3 (células nulas); (iv) liga-se a células nulas, tal como corroborado pela coloração de células positivas para CD16, tal como detectado por LeuII, um marcador para células NK (Figura 26); coloração de células B, tal como definido pela ligação de anti-CDl9, não se observou com LO-CD2a (figura 27) . O anticorpo LO-CD2a tem também, de preferência, a caracteristica de o anticorpo se ligar a células nulas humanas e, por coloração dupla, tem uma intensidade de coloração maior para células humanas que são tanto CD2+ como CD4+, do que para células humanas que são tanto CD2+ como CD16+ e tem uma intensidade de coloração maior para células humanas que são tanto CD2+ e CD8+, do que para células humanas que são tanto CD2+ e CD16+.

[0054] 0 facto de o Lo-CD2a se ligar a CD2 foi confirmado expressando CD2 de forma transiente, em células COS.

[0055] As células COS foram transfectadas de forma transiente com o plasmideo CDM contendo o gene que codifica 17 para toda a molécula CD2, como descrito em Peterson A. e Seed B., Nature volume 329, 10/29/87, pp 842-846.

[0056] A transfecção foi realizada pelo método de DEAE-dextrano. As células foram recolhidas e coradas com o anticorpo monoclonal anti-CD2 Leu5b (Becton-Dickinson) e LO-CD2a, com W632 de murideo, um anticorpo contra MHC de classe I, como controlo positivo, para a coloração e com os controlos de isotipo correspondentes. A especificidade da reactividade foi confirmada, determinando a ligação do mesmo painel de anticorpos monoclonais a células COS transfectadas com um plasmideo irrelevante.

[0057] O padrão de coloração destes anticorpos monoclonais em CD2 nativo, expresso de forma transiente (Figura 28), indica que a transfecção com CD2 conduziu à ligação de ambos os anticorpos, suportando a capacidade que o L0-CD2a tem de se ligar a CD2.

[0058] A preparação do anticorpo monoclonal L0-CD2a, adequado para os fins da presente invenção, deverá ser evidente para os peritos na arte, a partir dos ensinamentos aqui descritos.

[0059] Um anticorpo ou um seu fragmento ou derivado, ou uma molécula do tipo acima descrito pode ser administrada in vivo, de acordo com a presente invenção, para inibir a activação e proliferação de células-T e diminuir a densidade de expressão de CD2 na superfície celular, reduzindo desse modo o número de linfócitos CD2+. 18 [0060] Assim, por exemplo, num processo in vivo, estes anticorpo L0-CD2a são administrados para prevenir e/ou inibir a resposta imunitária, inibindo desse modo a activação e proliferação de células T.

[0061] Um anticorpo, ou um seu fragmento ou derivado, ou uma molécula do tipo acima descrito, podem ser administrados ex vivo, de acordo com a presente invenção, para diminuir a densidade de expressão de CD2+ na superfície celular, reduzindo assim o número de células CD2+, das células dadoras. A titulo de exemplo e não limitativo, num processo ex vivo, estes anticorpos ou seus fragmentos, ou derivados, ou moléculas, seriam administrados por infusão na medula óssea do dador, antes do transplante, para prevenir o desencadear da doença de enxerto versus hospedeiro, na altura do transplante.

[0062] Numa técnica in vivo, ou ex vivo deste tipo, o anticorpo ou seu fragmento ou derivado, ou molécula será administrado num transportador farmaceuticamente aceitável. Como exemplos representativos destes transportadores, podem-se mencionar a solução salina normal, tampões etc. Estes transportadores farmacêuticos são bem conhecidos na arte e a selecção de um transportador adequado está dentro da competência do perito na arte, a partir dos ensinamentos aqui contidos.

[0063] 0 anticorpo L0-CD2a, ou outra molécula da presente invenção, pode ser administrado in vivo, intravenosamente, ou por administração intramuscular, etc.

[0064] Como acima indicado, o anticorpo L0-CD2a ou outra molécula da presente invenção, é administrado in vivo numa 19 quantidade eficaz para inibir a rejeição de um enxerto. O termo "quantidade eficaz", para os fins deste pedido, significa a quantidade de anticorpo monoclonal que é capaz de produzir o efeito desejado, i.e., a inibição da rejeição do enxerto, ou inibição da activação de células-T. Em geral, este anticorpo é administrado numa quantidade de pelo menos 1 mg. Deve entender-se que se podem utilizar quantidades menores. Adicionalmente, após o tratamento inicial, as quantidades aqui descritas podem ser reduzidas em tratamentos subsequentes, se existentes. Assim, o âmbito da invenção não se limita a estas quantidades.

[0065] De acordo com a presente forma de concretização, estes anticorpos são administrados repetidamente, de modo a manter a inibição da activação de células-T e da rejeição do enxerto. Assim, a título de exemplo e não limitativo, o anticorpo pode ser administrado por infusão intravenosa durante um período de uma a duas horas, numa quantidade de cerca de 1 mg/dose a cerca de 50 mg/dose, numa suspensão de um transportador fisiologicamente aceitável, uma ou duas vezes por dia, durante um período de cerca de oito dias ou mais, como necessário. Este tratamento para rejeição de enxerto tem preferencialmente início, ou é imediatamente antes, ou pouco tempo depois do transplante, ou quando ocorre a rejeição do enxerto. O tratamento poderá ser administrado uma ou duas vezes por dia, durante um mínimo de um ou dois dias, quando iniciado na altura do transplante, para induzir um estado de hiporespota selectiva ao transplante. Este tratamento para doenças auto-imunes, em relação à administração do anticorpo, ou um seu fragmento ou derivado, ou molécula de acordo com a presente invenção, começa quando o médico assistente determinar que é desejável inibir uma resposta imunitária patológica. 20 [0066] As técnicas da presente invenção para inibir a activação de células-T podem ser utilizadas sozinhas ou em combinação com outras técnicas, medicamentos ou compostos, para inibir a activação de células-T ou inibir a rejeição de enxerto, ou a doença de enxerto versus hospedeiro.

[0067] A invenção será agora descrita em relação aos exemplos seguintes, que são ilustrativos e não pretendem limitar o âmbito da invenção.

[0068] As células, culturas, mAcs e mitogéneos, utilizados nos exemplos podem ser preparados e utilizados por processos e procedimentos conhecidos e praticados pelos peritos na arte. A seguir descreve-se um exemplo de um processo, ou procedimento que pode ser utilizado para a preparação e utilização das células, culturas, mAcs e mitogéneos utilizados nos exemplos que se seguem. Células e culturas [0069] Os PBMC foram obtidos por sedimentação em Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Suécia) de sangue heparinizado, obtido no centro local de dadores de sangue. Os PBMC isolados foram ressuspendidos em meio enriquecido: meio RPMI 1640 (Gibco, Bélgica), suplementado com 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina, 20 mM de L-glutamina e 20% de soro AB humano reunido, ou 15% de soro fetal de vitela inactivado pelo calor. Os PRMC foram cultivados a 1 x 105 células/poço em microplacas de 96 poços em U (Falcon), num volume final de 200 μΐ de meio de cultura/poço. Fez-se HLC bidireccional, com 1 x 105 células de cada dador/poço, no mesmo volume de meio de cultura que o indicado acima. Todas as culturas foram feitas em triplicado. 21

Oito horas antes dos tempos indicados nos i resultados , as culturas foram marcadas por pulsação com 2,0 μΟί/ρορο de 3H-T (Amersham, Bélgica) 247,9 GBq/mmol; 6,7 Ci/mmol) e o radioisótopo incorporado nas culturas foi quantificado por cintilação liquida, num contador Beta (Beckman L5 6000 SE) . A percentagem de inibição foi calculada como se segue: % de inibição - [l-(cpm médio da cultura testada/cpm médios da cultura controlo)] x 100. Todos os resultados são expressos como a média de três culturas independentes. O desvio padrão era sempre inferior a 15% da média, excepto nos casos em que estes valores estão indicados nos gráficos.

[0070] As análises citofluorimétricas foram realizadas utilizando um citofluorógrafo FACScan (Becton Dickinson) equipado com hardware da Hewlett-Packard, equipado com o programa Cosort 30. A análise independente da coloração de linfócitos e blastócitos foi possível utilizando "gating" diferencial, definido pelo tamanho e granulimetria. Analisaram-se 25.000 fenómenos para cada amostra. Nestas experiências, a concentração final de LO-CD2a era de 200 ng/ml, excepto quando indicado.

Macs e mitogéneo [0071] O LO-DRA e LO-Tact-1 (ambos marcados com FITC) são mAcs de rato produzidos no laboratório dos requerentes (op. cit. H. Dazin (Ed) 1990 p. 287). O LO-Tact-1 é direccionado contra o cadeia p55 do receptor de IL-2 (op. cit. H. Bazin Immunol. 1984 e Janszen, M., Buck, D. e Maino, V.C., em Leucocyte Typing IV White Cell Differentiation Antigens, W. Knapp (ED), Oxford University Press, 1989, p. 403). Os mAc anti-CD2 e anti-CD3 humano de ratinho (Leu-5b e Leu-4a marcados 22 com FTTC) , foram obtidos da Becton Dickinson (Bélgica). Os mAcs anti-CD4 ou anti-CD8 humano, de ratinho (marcados com ficoeritrina) e IgG de ratinho marcado com FITC ou ficoeritrina (controlos negativos), foram obtidos da Coulter. 0 0KT3 (Ortho-Cilag, Bélgica) foi utilizado a uma concentração final de 100 ng/ml. A fitohemaglutinina A (PHA; Wellcome Labs, UK) e a Concanavalina A (Con A; Calbiochem Co, USA) foram utilizadas a uma concentração final de 1 e 10 μg/ml, respectivamente.

[0072] Biotinilaçâo de LO-CD2a. A concentração de LO-CD2a purificado foi ajustada para 1 mg/ml em tampão bicarbonato de sódio 0,1M, pH 8,4. Dissolveu-se NHS-biotina (Boehringer-Mannheim 100S 960) em DMSO, a uma concentração de 1,5 mg/ml. Para cada MAB, adicionaram-se 0,1 ml de solução de NHS-biotina. A mistura foi agitada por rotação, durante 2 h, à temperatura ambiente. A reacção foi completada por adição de 0,1 ml de tris-HCL 2M, pH 8,0, por cada ml de anticorpo (10 minutos à temperatura ambiente) , seguido de 1 ml de BSA a 1% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por cada ml de anticorpo. Para remover a biotina livre, a solução foi dialisada durante a noite a 4°C, em 1000 volumes de PBS. Tanto a reacção de biotinilaçâo como o mAc conjugado foram protegidos da luz, cobrindo-os com folha de alumínio.

[0073] Lise de glóbulos vermelhos (RBC-^red blod cells”). Os RBC foram removidos do sangue total por lise com cloreto de amónio. Preparou-se uma solução mãe 10X, que consistia de 90 g de NH4CI, 10 g de KHCO3, 370 mg EDTA e H20 até um volume de 100 ml. Adicionaram-se 40 ml de cloreto de amónio IX a cada 10 ml de sangue e incubou-se durante 10 min, à temperatura ambiente. A mistura foi então centrifugada a 1200 rpm durante 10 min e o pelete foi ressuspendido em 10 ml de PBS, com azida a 0,1%. 23 [0074] Coloração de sangue periférico. A coloração foi realizada em placas de 96 poços de fundo redondo (Costar #3790), a 4°C. Para coloração de cor única, diluíram-se adequadamente 10 μΐ de mAc em PBS contendo 0,2 mg de imunoglobulina humana e adicionou-se a cada poço. O sangue depletado de glóbulos vermelhos foi distribuído pelas placas a um volume de 90 μΐ por poço. As células e o mAc foram misturados batendo suavemente, e incubados durante 30 min. Adicionaram-se 50 μΐ de PBS frio, a cada poço e as placas foram centrifugadas a 1900 rpm, durante 2 min. O sobrenadante foi desprezado, invertendo e dando piparotes suaves na placa. As células foram dispersas batendo a placa ao de leve, no contador. O processo de lavagem foi repetido duas vezes, adicionando 200 μΐ de PBS frio. Adicionaram-se 10 μΐ de uma diluição 1/20 de Ig F(ab')2 anti-rato, de cabra, marcado com FITC, às células dispersas, em cada poço e incubou-se durante 30 minutos no escuro. As células foram lavadas por adição de 180 μΐ de PBS frio a cada poço, seguido de centrifugação a 1900 rpm, durante 2 min. O sobrenadante foi desprezado, as células foram dispersas e adicionaram-se 200 μΐ de paraformaldeído a 0,5%, frio, a cada poço. As células foram transferidas para tubos (Falcon #2054) e diluídas para aproximadamente 0,5 ml com paraformaldeído a 0,5%. As amostras foram avaliadas num aparelho Becton-Dickinson FACScan, utilizando o software LYSIS II.

[0075] A coloração de duas cores foi realizada por um protocolo semelhante. Após as células serem incubadas com o mAc primário e o reagente anti-rato conjugado com FITC, adicionou-se uma diluição 1/5 de soro de ratinho normal, para bloquear 24 quaisquer locais remanescentes no reaqente anti-rato. Após uma incubação de 15 min. (sem lavagem) , adicionaram-se 20 μΐ de um mAc marcado com PE, específico para um determinante CD conhecido e incubou-se durante 30 min. As células foram lavadas e fixadas como descrito para a coloração única. EXEMPLO 1 [0076] O LO-CD2a é um anticorpo monoclonal anti-CD2 de rato (IgG2b-Kappa) , produzido e caracterizado no laboratório dos requerentes, como indicado noutras referências (vejam-se as seguintes referências: Xia, H., Ravoet, A.M., Latinne, D. Ninanne, J., De Bruyere, M., Sokal, G. e Bazin, H., in H. Bazin (Ed) , Rat Hybridomas and Rat monoclonal Antibodies, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida 1990, p.309 e Ravoet, A.M., Latinne, D. Seghers, J. Manouvriez, P. Ninanne, J. DeBruyere, M., Bazin, H. e Sokal, G.- em H. Bazin (Ed) Rat Hybridomas and Rat Monoclonal Antibodies, CRC Press Inc., Boca Raton, Florida, 1990, p. 287). 0 L0-CD2a foi purificado a partir do fluido ascítico, por cromatografia de imunoafinidade, tirando vantagem da diferença alotipica existente entre as imunoglobulinas do rato que recebeu o hibridoma produtor e o mAc segregado por este último (Bazin, H. Cormont F. e DeClercq, L. J. Immunol. Method. 1984, 71:9). Este reconhece a população total corada pelo mAc de ratinho Leu-5b (marcado com FITC) Figura 1 e aproximadamente 90% da população marcada pelo mAc Til de ratinho (marcado com Rhodamina) (dados não apresentados) (veja-se Fig. 1)). O epítopo reconhecido pelo Lo-CD2a na molécula CD2, é diferente dos epítopos reconhecidos pelos mAc anti-CD2 de ratinho, Leu-5b e Til (Figura 2). 25 EXEMPLO 2

O LO-CD2a exibe efeitos moduladores, mas não mitogénicos, em PBMC

[0077] De modo a determinar os efeitos do mAc LO-CD2a de rato nos linfócitos em repouso, os PBMC foram incubados na presença de concentrações crescentes deste mAc. Como se pode ver na tabela 1, os PBMC incubados durante 6 dias na presença de L0-CD2a não apresentam variações significativas na taxa de incorporação de 3H-T, em comparação com as culturas controlo. A viabilidade celular no final deste período era variável, mas era em média à volta de 80%, tal como determinado por exclusão com azul de tripano. Quando os PBMC em repouso foram incubados na presença de L0-CD2a, não houve variação significativa na expressão fenotípica de vários marcadores membranares, tal como determinado por citometria de fluxo. Os marcadores celulares de células-T maduras em repouso (tais como CD3, CD4 e CD8) mostram o mesmo padrão de variação durante 6 dias de cultura na presença ou na ausência de LO-CD2a e as moléculas de activação, como CD25 (IL-2R/p55) não são expressas nestas condições experimentais, ou não são modificadas pelo L0-CD2a, como é o caso dos determinantes antigénicos DR (Figura 3).

[0078] Quando os PBMC foram incubados durante 6 dias na presença de L0-CD2a, observou-se um decréscimo significativo na percentagem de linfócitos Leu-5b+ "gated" (Figura 4) . A percentagem de linfócitos CD4- e CD8- não é afectada durante um período de 6 dias de cultura pela presença de L0-CD2a, indicando que o decréscimo observado nos linfócitos com CD2 não pode ser atribuído a uma eliminação destas células, mas antes a um desaparecimento da molécula CD2, ou a uma alteração 26 conformacional nesta glicoproteína, produzida pela ligação de L0-CD2a.

[0079] De modo a verificar se o decréscimo observado nos linfócitos Leu-5b era devido a uma alteração conformacional de CD2, ou ao desaparecimento (internalização ou libertação) desta molécula após a ligação de LO-CD2a, fez-se a cultura dos PBMC na presença de 500 ng/ml de L0-CD2a e analisou-se ao longo de 6 dias por citometria de fluxo, utilizando Leu-5b (marcado com FITC), T11-RD1 (marcado com rodamina) e MARK-3 (marcado com FITC). Como se pode ver na figura 5a, os mAc Leu-5b ou Til não são capazes de se ligar a PBMC após 2 a 4 dias de cultura na presença de LO-CD2a. Nestas condições, o mAc de cadeia kapa anti-rato, de ratinho, MARK-3, marcou 50% das células ao dia 6 de cultura, indicando que apenas 35% das células que continham CD2 originais não apresentam LO-CD2a nas suas superfícies, mas no entanto, a coloração com Leu5b-FITC e T11-RD1 diminuiu marcadamente no dia 2. Isto sugere que ocorre uma alteração conformacional de CD2 em resposta ao Lo-CD2a, tornando o epítopo de Leu5b e Til indisponível para ligação.

[0080] A análise da fluorescência média de células CD2+ indicou que a densidade de expressão deste marcador diminuiu com o tempo, na presença de LO-CD2a. O mesmo fenómeno foi observado, quando se utilizou Leu-5b marcado com FITC, ou Lo-CD2a (revelado por MARK-1 marcado com FITC) para detectar os linfócitos CD2+. Fez-se a cultura de alíquotas dos mesmos PBMC em paralelo, na presença de Leu-5b (mAc comercialmente disponível, dialisado contra PBS, diluição 1:2 final, em meio de cultura). Como se mostra na Figura 6b, nessas condições experimentais, todas as células que contêm CD2 são revestidas pelo mAc Leu-5b (revelado por anti-ratinho -FITC de cabra). A 27 coloração com Tll-RDl era marcadamente reduzida, observando-se um decréscimo menor, mais lento, na percentagem de células que apresentam o epítopo reconhecido pelo mAc L0-CD2a-FITC. Em conjunto, estes resultados indicam que as moléculas de CD2 alteraram parcialmente a sua conformação em resposta a L0-CD2a e que ocorre uma modulação lenta de CD2/LO-CD2a. Tal como determinado por citometria de fluxo, o número de blastócitos presente em PBMC não estimulados no dia 0 de cultura, permaneceu constante (200 a 300 blastócitos em 25.000 fenómenos), ou diminuiu durante o período de estudo (tanto na presença, como na ausência do mAc de rato) , indicando que não foi induzida nenhuma blastogénese pela presença de LO-CD2a. 0 L0-CD2a inibe o MLR [0081] Quando se efectuou a MLC (num período de 6 dias) na presença de concentrações crescentes de mAc de rato, observou-se uma inibição significativa do MLR (medido por incorporação de 3H-timidina (3H-T), a concentrações de mAc tão baixas quanto 125 ng/ml. Na figura 6a, apresenta-se um exemplo típico de uma curva dose-resposta da inibição de MLR por L0-CD2a. Como se pode observar na figura 6a, o L0-CD2a induz 80% de inibição de MLR (6 dias de cultura) a 250 ng/ml e esta percentagem de inibição permanece quase constante ou superior a 80%, numa vasta gama de concentrações (0,25 a 5,0 μg/ml de mAc). A figura 6b mostra a evolução temporal dos efeitos inibitórios de diferentes concentrações de LO-CD2a em MLR, desde o dia 0 ao dia G de cultura. Apresenta-se um exemplo típico da incorporação de 3H-T em MLC (na presença ou na ausência de L0-CD2a) , na figura 6c, em que se adicionou LO-CD2a a uma concentração final de 200 ng/ml. 28 [0082] Na Fiqura 6d, mostram-se os efeitos de LO-CD2a em MLR quando este mAc (a 200 ng/ml) é adicionado a vários tempos após o inicio da MLC. Obtém-se mais de 90% de inibição do MLR (medido por incorporação de 3H-T) quando este mAc é adicionado no dia 0 e este efeito inibitório está ainda presente (45% de inibição neste exemplo) quando o LO-CD2a é adicionado 4 dias após o inicio do MLC. Obtiveram-se resultados semelhantes (não apresentados) com concentrações mais elevadas (de 0,20 a 5,0 μg/ml) de LO-CD2a.

O LO-CD2a bloqueia a via de expressão de IL-2R

[0083] Quando se realizaram análises de citofluorografia no conjunto de linfoblastos de um MLC (Figura 7a e b), fizeram-se as seguintes observações: a) o número de blastócitos (cerca de 300-500 blastócitos de 25.000 fenómenos analisados) já presentes no inicio do MLC aumentou rapidamente do dia 4 ao dia 6 nas culturas controlo (mais de 1200 blastócitos de 25.000 fenómenos analisados); b) no MLC realizado na presença de LO-CD2a, não houve variação significativa no número de blastócitos durante todo o período de cultura e no dia 6, o número de blastócitos é sempre inferior, ou quase o mesmo que o número inicial de blastócitos no dia 0 (Figura 7a) ; c) a percentagem de blastócitos CD25 aumentou rapidamente entre as células incubadas sem LO-CD2a (Figura 7b); d) esta percentagem permanece abaixo dos 20%, no pequeno número de blastócitos do MLC incubados na presença de mAc (Figura 7b) e a fluorescência média (medida como expressão de CD25) decresceu em 75%, comparado com os blastócitos presentes nas culturas controlo (resultados não apresentados); e) na ausência do mAc, a percentagem de blastócitos CD3 permanece constante durante os primeiros 4 dias de cultura (Fiqura 7b) e no dia 6 a 29 percentagem de células CD3- aumentou para 90%, enquanto que na presença de LO-CD2a, a percentagem de CD3- aumenta lentamente, para atingir apenas cerca de 45% no dia 6. Estes resultados indicam que a presença de LO-CD2a inibe a entrada destas células na via de activação, caracterizada pela expressão do receptor de IL-2 (CD25). O número de blastócitos CD2+ permanece constante, ou diminui na presença de LO-CD2a e a densidade de expressão deste marcador de membrana é fortemente diminuida nestas condições (dados não apresentados).

[0084] Quando as análises fenotípicas foram realizadas ao longo de 6 dias, no subconjunto de linfócitos em repouso (não blastócitos) de MLC, obtiveram-se resultados semelhantes aos descritos na Figura 3: na presença de L0-CD2a não foi possível detectar nenhuma variação significativa na percentagem de linfócitos CD3+, CD4+ ou CD8+, em comparação com culturas controlo (Figura 8) . Não foi possível detectar nenhuma expressão de CD25 (marcador de activação) quer na presença, quer na ausência de LO-CD2a, durante 6 dias de cultura. Estes resultados sugerem que o LO-CD2a tem um efeito muito fraco, se algum, no subconjunto em repouso de linfócitos-T, em MLC; isto é, em células T não ligadas ao processo de activação. Ao mesmo tempo, como se mostra na Figura 4b, o LO-CD2a induz um decréscimo significativo na percentagem de linfócitos CD2+, durante o MLC. Este fenómeno é acompanhado por um decréscimo drástico da fluorescência média, tal como detectado pelo mAc Leu-5b.

[0085] O L0-CD2a pode bloquear as vias de activação de células-T dependentes do complexo TcR/CD3, ou dos receptores de mitogéneo. 30 [0086] Quando o Lo-CD2a foi adicionado a PBMC activados por um mitogéneo, observou-se uma inibição significativa da incorporação de 3H-T. Numa de três experiências de PBMC incubados com mitogéneos (0KT3, ConA e PHA), na presença, ou ausência de L0-CD2a, adicionado quer no tempo 0, quer 1 hora após o inicio das culturas. No primeiro caso, os mitogéneos foram adicionados 1 hora mais tarde. Quando o LO-CD2a foi adicionado 1 hora após o início da cultura, os mitogéneos foram adicionados no tempo 0. Isto foi feito para perceber se a pré-incubação dos PBMC com os mitogéneos, ou LO-CD2a, poderia desencadear fenómenos que pudessem ser afectados pela adição do segundo reagente. As culturas foram recolhidas a 96h após marcação por pulsação (6h) com 3H-T. Observou-se mais de 50% de inibição da incorporação de 3H-T, na presença de LO-CD2a, quer este seja adicionado antes, ou depois dos mitogéneos (Figura 9) . 0 mesmo efeito foi observado quando as células foram recolhidas 4 dias após o início do MLC e expostas a mitogéneos (resultados não apresentados) . Observou-se um decréscimo drástico na incorporação de 3H-T, dois dias após o início do MLC nas culturas que receberam ambos, o mitogéneo e o LO-CD2a, em comparação com as mesmas culturas, que receberam apenas mitogéneo (resultados não apresentados). A pré-incubação de MLC com LO-CD2a antes da adição de mitogéneo diminuiu a absorção de 3H-T para valores comparáveis com o MLC, sem OKT3.

[0087] 0 L0-CD2a também foi capaz de inibir a proliferação induzida por mitogéneos, quando adicionado um dia após o início da proliferação induzida por mitogéneos. Os resultados das experiências realizadas com dois dadores, são apresentados na figura 10. Os PBMC foram incubados juntamente com os mitogéneos (0KT3, conA e PHA). Nestas experiências, o LO-CD2a foi adicionado, quer no tempo 0 (dia 0) , 24 h (dia 1) ou 48 h (dia 31 2), após o início das culturas. A inibição da proliferação em resposta a 0KT3 e ConA por L0-CD2a, era significativa, se adicionada 24 horas após a adição de mitogéneo ao tempo 0. EXEMPLO 3 [0088] Inibição da actividade de células "killer" naturais (NK) [0089] Os PBMC foram isolados a partir de sangue heparinizado por sedimentação em Ficoll-Hypaque. Após lavagem, as células efectoras suspendidas em meio enriquecido, foram incubadas durante a noite a uma concentração de 1 x 106/ml numa placa Falcon, para eliminar os monócitos (por aderência).

[0090] As células alvo (linha celular K562) foram marcadas por incubação durante a noite com 51crómio 51Cr (0,9 ml de uma suspensão celular a 3 x 106/ml + 0,02 ml de uma solução de 5mCi/mlslCr, Amersham) .

[0091] Após uma incubação de 16 horas, as células efectoras e alvo foram lavadas quatro vezes, contadas e incubadas numa microplaca de 96 poços de fundo em V, a diferentes razões E/T: 200/1 (100 μΐ de uma suspensão de 4 x 106/ml de células efectoras com 100 μΐ de 2 x 104/ ml de células alvo) 100/1, 50/1 e 25/1.

[0092] Após uma incubação de 4 horas, a libertação de 51Cr foi medida por contagem de 100 μΐ de sobrenadante, de cada poço, num contador gama. 32 [0093] Utilizou-se a libertação máxima (células alvo + HCLIN) e a libertação espontânea (células alvo + meio enriquecido), para calcular a lise especifica. libertação teste-espontânea % lise específica -----------------------------x 100% libertação máxima-espontânea [0094] A inclusão de LO-CD2a a 5, 1 e 0,5 pg/ml no teste NK com dois dadores normais (Figuras 10a e 10b), conduziu a uma inibição da citotoxicídade de aproximadamnete 50%, em todas as concentrações de anticorpo testadas e para todas as razões E/T testadas. Isto em comparação com a inibição essencialmente completa da proliferação em MLR, a doses de, ou acima de, 0,25 pg/ml. EXEMPLO 4

ESTUDOS IN VIVO EM PRIMATAS NÃO HUMANOS MATERIAIS E MÉTODOS

Anticorpos monoclonais [0095] O MARK3-FITC é um mAc de ratinho direccionado contra o alotipo lg kapa lg de rato, conjugado com FITC. O MARG2b-biotina é um mAc de imunoglobulina IgG2b anti-rato, dc ratinho, conjugado com biotina. Estes dois mAc foram produzidos e marcados no laboratório dos requerentes. Para os testes de imunofluorescência, estes foram utilizados a uma concentração final de 2,5 pg/ml. O Leu-5b-FITC (Becton-Dickinson) e TI 1 33 rodamina (COULTER) são dois mAc anti-CD2 humano, de ratinho. 0 T4 e T8 marcados com rodamina (COULTER) são mAc anti-CD4 e anti-CD8 humano, de ratinho, respectivamente.

Análise de fenótipos [0096] Adicionaram-se mAc anti-célula T humana (anti-CD2, -CD4, -CD8, veja-se acima) a amostras de 100 μΐ de sangue total e incubou-se a 4°C, durante 45 minutos. Os glóbulos vermelhos foram lisados com um tampão de lise de cloreto de amónio tamponado com Tris (NH4C1 144 mM/Tris 17 mM, pH 7,2) e os linfócitos foram lavados com PBS/FCS a 2%/NaN3 a 0,2%. Para detecção de mAc não marcados, adicionou-se um segundo mAc (conjugado com FITC ou biotina) a uma concentração final de 2,5 μg/ml. Após 45 minutos de incubação a 4°C, as células foram lavadas com PBS/FCS/NAN3. Para os mAc biotinilados fez-se mais uma incubação (15 min) com conjugado de estreptavidina-ficoeritrina. Os linfócitos humanos, ou de macaco, marcados foram ressuspendidos numa solução de formalina a 2% e analisados num citofluorómetro FACScan (Becton-Dickinson) equipado com o programa lysis II para "gating" de linfócitos, como uma função de tamanho vs granulimetria. Como controlo para a coloração não especifica, incubaram-se alíquotas de células com Igs conjugados com FITC ou ficoeritrina (Coulter).

Nivel de Acs circulantes [0097] O LO-CD2a no soro foi quantificado por ELISA, utilizando um mAc IgG2b anti-rato de ratinho (MARG2b-8, produzido no laboratório dos requerentes) como uma primeira camada (revestimento) e acoplou-se uma cadeia kapa de Ac anti-rato de ratinho (MARK-3) a peroxidase de rábano, para detecção. 34

Em resumo, incubaram-se placas de microtítulo (Falcon) durante a noite com 100 μΐ/poço de MARG2b-8 (5 μς/πιΐ) e os locais não ocupados no plástico foram saturados com PBS contendo 5% de leite em pó desnatado (bovino) . Após 1 h de incubação à temperatura ambiente, as placas foram lavadas com PBS com Tween-20 a 0,1% e incubadas 1 h com 100 μΐ/poço de soro de macaco, ou humano, diluído. Após remoção, por lavagem, do material não ligado, as placas foram incubadas 1 h com 100 μΐ/poço de MARK-3-peroxidase (2 μg/ml em PBS). Após nova lavagem, as placas foram incubadas com OPD (dicloridrato de o-fenilenodiamina, 0,4 mg/ml, Sigma Chemicals), em tampão citrato-fosfato contendo H202 a 0,03%. 0 produto de reacção corado foi detectado a 492 nm. Fez-se uma curva padrão em paralelo com uma concentração conhecida de LO-CD2a purificado, diluído em série num conjunto de soro controlo de macaco, ou humano.

[0098] A detecção de anticorpos anti-L0-CD2a de macaco, ou humanos, foi realizada por ELISA, utilizando microplacas de 96 poços revestidas com L0-CD2a (5 μg/ml). Os anticorpos anti-LO-CD2a de macaco, ou humanos, ligados às placas foram revelados por mAc anti-IgM (LO-HM-7) ou IgG (LO-HG-22) humano, de rato, marcados com peroxidase de rábano.

A. MACACOS CINOMÓLOGOS

[0099] Um macaco cinomólogo recebeu 10 mg/dia de LO-CD2a durante três dias consecutivos. 0 anticorpo monoclonal foi bem tolerado. 35 [0100] Observou-se uma depleção de linfócitos após a primeira injecção, mas obteve-se uma depleção adicional muito baixa, após a 2a e 3a injecções.

[0101] 0 segundo macaco recebeu 20 mg/d durante 10 dias. O mAc também foi bem tolerado. Não se observaram efeitos laterais após o doseamento, estando os animais activos, alerta, a comer bem e sem evidências de náuseas, ou distúrbios gastrointestinais.

[0102] As contagens de linfócitos e populações de células no segundo macaco estão resumidas nas figuras 19 e 20. A actividade de NK estava ligeiramente reduzida após as 10 injecções (Figura 21). Os niveis circulantes de mAc eram muito elevados (Figura 22) e ocorreu imunização no final do tratamento (Figura 23) .

B. BABUÍNO

[0103] A experiência descrita aqui foi realizada para determinar a tolerância de um babuíno a L0-CD2a, para analisar os efeitos deste mAc nalguns dos marcadores de membrana dos linfócitos de babuíno e para determinar a semi-vida do LO-CD2a no soro.

[0104] A coloração das células de babuíno com L0-CD2a resulta em <20% de células positivas a uma intensidade de fluoresrftncia média significativamente inferior à de células humanas coradas, sendo consistente com uma reactividade cruzada baixa com células de babuíno. 36 [0105] O estudo foi realizado num babuíno macho (papio mormon) com 8,8 kg de peso. Antes de cada injecção de L0-CD-2a o macaco foi anestesiado; a primeira vez com Ketaler (2 ml) e Prazine (0,5 ml), a segunda vez apenas com Ketaler e as vezes subsequentes com ketaler e Prazine (0,3 ml). 0 LO-CD2a foi injectado intravenosamente (i.v. em 10 min), diluído em 100 ml de soro fisiológico. Para análise fenotípica de linfócitos e medição de anticorpos circulantes (anticorpos LO-CD-2a injectados e anticorpos anti-Lo-CD2a formados de novo e anticorpos anti-L0-CD2a de babuíno com reacção cruzada, pré-existentes) , recolheram-se amostras de sangue (10 ml) para dois tubos. O tubo para tipagem de linfócitos continha EDTA. Recolheram-se amostras antes do primeiro tratamento, para determinar os níveis de linha de base.

[0106] A primeira dose (10 mg) de L0-CD2a foi administrada no dia 0 do estudo; as quatro doses seguintes (10 mg/ dose) foram administradas nos dias 7, 8, 9 e 10. Recolheram-se amostras de sangue alguns minutos após cada dose de LO-CD2a. Nos dias 7 e 9 recolheu-se uma amostra de sangue complementar (num tubo contendo EDTA), antes das injecções de LO-CD2a. As amostras de sangue foram recolhidas aos dias 1, 2, 11, 12, 13, 16 e 24.

[0107] Não se observaram nenhumas reacções anormais em actividade, ou hábitos alimentares durante as injecções de LO-CD2a ou durante o período de estudo. O peso do animal permaneceu à volta de 8,8 kg, medido no dia 0 (veja-se tabela em baixo). 37

Peso do babuíno (em Kg) desde o dia 0 ao dia 24

Dia 0 7 8 9 10 12 13 16 24 Peso 00 co 9.9 9.1 9.1 00 co 9.0 9.1 CO 00

ANÁLISE DE FENÓTIPO E mAc CIRCULANTES

[0108] A coloração por fluorescência dos linfócitos de sangue periférico deste babuíno, revelaram algumas características interessantes: a) Sob o efeito de L0-CD2a, o subconjunto de linfócitos positivo para CD2, diminuiu significativamente (tal como revelado por dois mAc anti-CD2 diferentes) no final da 5a dose de L0-CD2a, isto é, na altura de uma acumulação máxima de mAc no sangue (veja-se Figuras 17a e 17b) . Tendo em conta que os subconjuntos de linfócitos CD4+ e CD8+ não diminuíram durante este período (Figura 19) e uma vez que as células CD4+ e CD8+ compreendem a maior parte dos linfócitos que contêm CD2, o decréscimo em CD2+ indica que é a expressão do marcador de membrana que está a diminuir e não os linfócitos.

Como se pode ver na (Figura 17a) , observa-se um ligeiro decréscimo nos linfócitos positivos CD2+ (Leu-5b+ ou Tll+) , após a primeira dose de L0-CD2a. Dois dias após esta primeira dose, o nível de células positivas para CD2 (Leu 50* ou Tll+) aumentou para os valores dc partida.

No final das doses de L0-CD2a espaçadas de 24 horas (dias 7 - 10), a percentagem de células positivas para CD2 (Leu5b+ ou Tll+) diminuiu rapidamente e começou a aumentar 38 lentamente, 3 dias após o final da administração de L 0-CD2a. b) ao mesmo tempo, a percentagem de células positivas para L0-CD2a, isto é, a percentagem de células ligadas pelo mAc circulante, aumentou para 22% após a 2a dose de L0-CD2a (dia 7) e diminuiu em seguida, tal como as células CD2+, revelado pelos mAc anti-CD2 Leu-5b e Til (Figura 17) . 0 decréscimo nas células L0-CD2a+ foi revelado pelo mAc MARK-3FITC (Figura 18). 0 decréscimo nas células L0-CD2a foi determinado por detecção do L0-CD2a presente nas células, detectado por mAc MARK3-FITC, ou por MARG2b-8-conjugado com biotina (Figura 18a) . Observou-se o mesmo fenómeno quando as células foram primeiro incubadas com L0-CD2a a 2,5 pg/ml, para saturar todos os locais não ocupados pelo mAc circulante. O L0-CD2a foi detectado por MARK-3-FITC ou MARG2b-8-biotina (Figura 18) . c) Como se pode ver na (Figura 19) , o subconjunto de linfócitos de babuíno positivo para T4, apresentava um aumento moderado durante os dias 9 a 12, após o que a percentagem de linfócitos T4+ retomou ao seu valor inicial. Concomitantemente com o aumento em células T4+, a percentagem de linfócitos positivos para T8 aumentou desde o dia 9 ao dia 11. Após esse dia, esta percentagem voltou aos valores iniciais. d) Os níveis de mAc L0-CD2a circulantes decresceram para valores de ruído de fundo 3 dias após a primeira injecção (veja-se figura 17b). Quando o L0-CD2a é aplicado em quatro doses espaçadas de pouco tempo (dias 7 a 10) , os níveis de 39 / L0-CD2a no soro (cerca de 3,7 mg/ml, valor máximo neste período) decresceu lentamente após a última dose (dias 10 a 16) , indicando uma semi-vida relativamente longa do Ac, neste modelo animal. Não se detectaram nenhuns anticorpos anti-CO-CD2a de babuíno nas amostras de sangue recolhidas nos dias 11, 12, 13, 16 e 24.

CONCLUSÃO

[0109] O LO-CD2a parece ser bem tolerado por primatas não humanos, como demonstrado pela ausência de reacções aparentes no macaco babuíno cinomólogo. O LO-CD2a parece ter uma semi-vida relativamente longa no babuíno. Vinte e quatro horas após a primeira dose de L0-CD2a (dia 1 na Figura 24b), 50% do nível máximo de mAc detectável estava ainda presente no soro. Três dias após a última dose de L0-CD2a (dia 13 na Figura 24b) , 50% do nível máximo de mAc detectável ainda estavam presentes no soro.

[0110] Por outro lado, o decréscimo na percentagem de linfócitos positivos para CD2, seguido de um ligeiro aumento desta percentagem de células, apresenta a mesma cinética que a observada nas células mononucleares PBMC, na presença de L0-CD2a.

Exemplo 5

Pacientes tratados com LO-CD2a 40

Pacientes tratados com L0-CD2a numa base compassiva PACIENTE # 1 (Mb. E.) [0111] Este paciente era uma fêmea com pielonefrite crónica, que foi tratada com um aloenxerto renal para falha renal em fase final. Ocorreu uma crise de rejeição e tratou-se durante 10 dias com 0KT3. 0 nível de creatinina diminuiu de 2 para 1,4 mg/dl. Aproximadamente quatro (4) meses mais tarde diagnosticou-se uma crise de rejeição, através de um nível de creatinina de 2 mg/dl e uma biopsia que indicava rejeição moderada. A paciente foi tratada com 1,5 g de Solumedrol e um ciclo de ATG durante os oito (8) dias seguintes, altura em que o nível de creatinina era de 1,65 mg/dl. Sete dias após o tratamento, realizou-se uma biopsia, que indicou uma rejeição celular e rejeição vascular moderada. Dois dias após a biopsia (dia 0) , a paciente estava anúrica, com um nível de creatinina de 2,4 mg/dl. No mesmo dia, a paciente recebeu 10 mg de Lo-CD2a, 1,5 g de Solumedrol mais 1 g de Polarimina (um anti-histamínico) e 1 g de Dafalgan (acetaminofeno) . Não se observaram efeitos secundários. No final das 23 horas, a paciente produziu 700 ml de urina e a creatinina era de 2,72 mg/dl. Durante os 9 dias seguintes, a paciente recebeu 10 mg/dia de L0-CD2a. A paciente deixou o hospital sem realizar uma biopsia de monitorização nesse dia, dia 11.

[0112] A medição do nível de creatinina no sangue, durante o tratamento com ATG e durante o tratamento seguinte com LO-CD2a indicaram que o nível de creatinina subiu, apesar do tratamento com ATG e diminuiu e estabilizou com LO-CD2a (Figura 27). 41 [0113] A contagem de leucócitos decresceu desde 10.000 para 2.000 durante o tratamento com LO-CD2a e continuou a decrescer até à última medição no dia 21 (Figura 20) . A contagem de linfócitos era baixa e variável durante o período de observação.

[0114] Os níveis de L0-CD2a no soro aumentaram para picos de 2,0-3,0 μg/ml, imediatamente após cada tratamento e decresceram para níveis baixos de aproximadamente 1,0 μg/ml entre cada tratamento (Figura 21) . Com o último tratamento no dia 9, o nível decresceu em 50% em 24 horas e para 0 no dia 14. Esta paciente voltou à clínica no dia 40.

[0115] O nível de creatinina da paciente era de 2,27 no dia 40, 2,48 no dia 50 e aumentou para 3,11 no dia 66, altura em que se obteve uma biopsia, com um relatório inicial consistente com uma rejeição celular e hemorragia intersticial graves (veja-se a seguir). A paciente foi tratada com 150R de radiação no rim, 3 x 125 mg de Solumedrol, continuando ao mesmo tempo a manter a terapia de ciclosporina mais 1,25 mg/dia de esteróides. O nível de creatinina continuou a aumentar durante o período subsequente. No dia 70, o nível de creatinina era de 3,3; dia 80, 5, 63; dia 84, 8,35. No dia 86, o nível de creatinina era de 10,8 e realizou-se uma nefrectomia do transplante no dia 88. A anuência desta paciente em relação à manutenção da imunosupressão, durante o período entre a sua alta no dia 10 e a biopsia no dia 66 é posta em causa e a perda do rim, apesar da recuperação com ciuceaoo evidente, deverá ter em conta esta anuência duvidosa. 42 (ii) PACIENTE #2 [0116] O paciente era um macho de 38 anos de idade que tinha hepatite C+. Este tinha recebido um aloenxerto renal para o tratamento de falha renal em fase final, devido a uma nefropatia intersticial crónica. Um ano e três meses mais tarde, foi submetido a uma nefrectomia do transplante devido a rejeição celular e vascular agudas, resistentes a um ciclo de 0KT3.

[0117] Um ano e dez meses após a nefrectomia do transplante, recebeu um segundo aloenxero renal. Três dias mais tarde, o nível de creatinina era de 1,4 mg/dl. Três dias mais tarde recebeu 500 mg de Solumedrol; a creatinina do paciente mais tarde nesse dia, era de 1,8 mg/dl. No dia seguinte recebeu 500 mg de Solumedrol; a creatinina era de 3,25 mg/dl. No dia seguinte recebeu 500 mg de Solumedrol, a sua creatinina era de 2,95 mg/dl. Três dias mais tarde o seu nível de creatinina era de 2,3 mg/dl e foi submetido a uma biopsia, que demonstrou uma rejeição celular 3 mais. Três dias mais tarde recebeu 10 mg de L0-CD2a, mais 200 mg de Solumedrol, Polaramina e Dalfagan. Os efeitos secundários observados limitavam-se a sonolência; não foi observada hipertermia, nem hipertensão. Durante os 9 dias seguintes, o paciente recebeu tratamentos diários de 10 mg de L0-CD2a. No dia após o final deste tratamento, fez-se uma biopsia, que não mostrou sinais de rejeição.

[0118] O paciente tolerou bem o ciclo de Lo-CD2a, sem evidência de efeitos secundários clínicos, incluindo ausência de febre ou hipertensão, em qualquer dose. Os testes laboratoriais hematológicos e de química clínica de rotina (incluindo LFTs), obtidos no decorrer do tratamento não 43 demonstraram nenhumas alterações atribuíveis à administração do anticorpo, excepto um decréscimo na contagem de linfócitos de 290/mm3 para 100/mm3 e a redução no nível de creatinina associado com a resolução da crise de rejeição (de 2,7 mg/dl no início do tratamento com Lo-CD2a para 1,10 no final do ciclo).

[0119] A figura 22 mostra o nível de creatinina no soro deste paciente, o qual decresce de 2,5 para aproximadamente 1,0 nos dias a seguir ao tratamento com LO-CD2a. O paciente era linfopénico antes e durante o tratamento e a contagem de leucócitos não revelou nenhuma alteração drástica com o tratamento (Figura 23) . Neste paciente, os níveis séricos de L0-CD2a não aumentaram acima dos 2,0 μg/ml após cada tratamento e caíram para níveis baixos de 1,0 a menos de 0,25 μg/ml (Figura 24). Oito meses após o primeiro tratamento com LO-CD2a, o paciente estava bem, com uma função renal normal e sem evidência de rejeição recorrente.

Paciente 2 - Biopsia #1 - Diagnóstico: Indeterminado [0120] A biopsia continha cerca de 20 glomérulos o que não é singular. Havia um infiltrado mononuclear escasso, com um grau mínimo de edema intersticial. Apenas se observaram níveis menores de invasão tubular e nenhumas lesões vasculares. Estas observações são insuficientes para o diagnóstico de rejeição celular aguda. Havia células mononucleares raras em pequenas artérias, o que é suspeito, mas não preenchia os critérios de um diagnóstico de rejeição.

[0121] Paciente #2 - Biopsia 2. Aproximadamente 2 semanas após a primeira biopsia - não se reconheceu nenhuma anomalia do diagnóstico. Λ biopsia parecia semelhante à biopsia anterior e 44 continha cerca de 10 glomérulos. O infiltrado era muito escasso e não se identificaram lesões vasculares. (iii) PACIENTE #3 [0122] O paciente tinha 19 anos de idade e a doença de von Willebrand e recebeu um aloenxerto renal, para tratamento de falha renal em fase final, devido a pielonefrite crónica. O transplante foi removido 17 dias mais tarde, devido a rejeição vascular aguda, com hipertensão secundária após o fracasso de um ciclo de 6 dias com OKT3.

[0123] Cinco meses e meio mais tarde, o paciente recebeu um segundo aloenxerto renal. Dez dias mais tarde, o seu nivel de creatinina era de 6 mg/dl. No dia seguinte, o nivel de creatinina era de 7 mg/dl e uma biópsia indicou uma rejeição celular 3 mais e rejeição vascular (endartrite proliferativa, sem necrose ou trombose) . No mesmo dia, o paciente recebeu 10 mg de LO-CD2a, 40 mg de Solumedrol e Polaramina e Dafalgan. Não se observaram efeitos secundários. Nos 9 dias seguintes, o paciente recebeu tratamentos diários de 10 mg de LO-CD2a, sem nenhuns outros medicamentos e sem efeitos secundários. Dois dias após o tratamento, o seu nivel de creatinina era de 1,75 mg/dl e uma biopsia não indicou sinais de rejeição aguda, com necrose intersticial e um local focal de rejeição crónica.

[0124] Não se observaram efeitos secundários clínicos (alteração na Pressão Sanguínea ou temperatura). Os testes hematológicos e de química clínica de rotina (incluindo LFTs), não mostraram alterações atribuíveis à administração do anticorpo, excepto o decréscimo no nível de creatinina associado com a resolução da crise de rejeição (de 7,10 mg/dl 45 no início do tratamento com L0-CD2a , para 1,75 mg/dl no final do ciclo de 10 dias) . A contagem de linfócitos foi de 340/mm3 antes do tratamento e decresceu para um nível baixo de 220/mm3 durante o tratamento, aumentou para 690/mm3 9 dias após o final do tratamento com LO-CD2a e tinha aumentado para 1000/mm3, 23 dias após o final do tratamento.

[0125] A contagem de leucócitos neste paciente não foi significativamente alterada pelo tratamento (Figura 25) . 0 nível de creatinina no soro decresceu drasticamente com o tratamento (Figura 25). Sete meses após o primeiro tratamento com LO-CD2a, o paciente estava bem, com uma função renal normal e sem evidência de rejeição recorrente.

Paciente #3 - Biopsia #1 - Diagnóstico: rejeição celular grave, afectando pequenas artérias e, numa menor extensão, o interstício e glomérulos.

[0126] Uma artéria arqueada mostrou uma infiltração mononuclear marcada da intima, com rompimento da elástica. Havia um infiltrado escasso no interstício, com túbulos ocasionalmente invadidos. 0 interstício mostrava um edema intersticial difuso, suave. Estavam presentes cerca de 7 glomérulos. Estes apresentam hipercelularidade, com células mononucleares e inchaço endotelial. No global, este padrão era o diagnóstico de uma rejeição celular aguda, grave.

Paciente #3 - Biopsia #2. Aproximadamente 2 semanas após a primeira biopsia - diagnóstico: consistente com uma rejeição tratada. 46 [0127] A biopsia apresentava algumas pequenas artérias que apresentam fibrose da intima, por vezes com um material mucóide, mas um infiltrado celular mínimo. 0 interstício apresentava uma fibrose difusa fina e um infiltrado mononuclear mínimo. Os túbulos eram localmente atrópicos mas de qualquer modo não notáveis. Não havia evidências de rejeição celular activa. (iv) PACIENTE #4 [0128] 0 paciente que sofria de doença de enxerto versus hospedeiro grave (toxicidade da pele, intestino, renal e do CNS, graves, resistente a doses elevadas de prednisona) após um transplante de medula óssea alogénico recebeu 12 dias de L0-CD2a a 10 mg/dia. Os seus sintomas melhoraram; a função renal voltou ao normal, a diarreia cessou, a pele melhorou e a confusão foi resolvida. Quatro dias após o anticorpo ter cessado, os sintomas recorreram e o paciente morreu, apesar do início de um segundo ciclo de anticorpo.

[0129] 0 L0-CD2a pode assim ser utilizado para reverter respostas imunitárias em curso, a tecidos estranhos (alogénicos e xenogénicos, uma vez que inibe o MLR xeno, bem como o MLR alio). O anticorpo seria dado por infusão i.v., uma vez ou duas vezes por dia, durante 10 dias a 14 dias. Também pode ser utilizado profilaticamente para prevenir a activação de células T, como parte do protocolo de indução, imediatamente após o transplante do órgão.

[0130] Embora a presente invenção, numa forma de concretização preferida, seja direccionada para a inibição da rejeição do enxerto, deve entender-se que o âmbito da invenção 47 não se limita a esta e é qeralmente útil para a inibição da activação de células-T, para qualquer e todos os fins.

Exemplo 6

Construção e expressão de anticorpo quimérico Ά. clonagem e sequenciação de VH e VL de L0-CD2a [0131] Isolou-se ARN total a partir da linha celular LO-CD2a (ATCC HB 11423) de acordo com o método de Chergwin (Biochemistry, 18:5294, 1979). Preparou-se então ARNm utilizando o kit de ARNm oligotex-dT (Qiagen, Chatsworth, CA) . Aproximadamente 200-300 ng de ARNm foram transcritos em sentido inverso, utilizando o kit RNA-PCR da Perkin-Elmer Cetus (Norwalk, CT) . A reacção foi realizada a 42°C, durante 1 hora. Os iniciadores de síntese de oligonucleótidos, necessários para amplificação dos genes VH e VL foram seleccionados utilizando as seguintes referências: 1) Sequences of Proteins of

Immunological Interest, Kabat et al., 5a ed, 1991, 2) Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sei., (USA) 86:3833-3837 (1989). VL sentido directo

Sma 1 #1 2345678 5' 3'

AA CCC GGG GAC ATT CAG CTG ACC CAG TCT CAA

Ci sentido inverso

Sal 1 #115 114 113 112 111 110 109 5' 3'

CA GTC GAC TAC AGT TGG TGC AGC ATC AGC 48

Vh sentido directo

Sma 1 #1 2345678 5' 3' AA CCC GGG GAG GTC CAG CTG CAG CAG TCT GG CHj. sentido inverso

Sal 1 #124 123 122 121 120 119 5' 3'

AAG TCG ACC CAG TGG ATA GAC CGA TGG

[0132] Os números referem-se a resíduos de aminoácidos, como descrito em Kabat et al., 1991 [0133] As reacções em cadeia com polimerase (PCR) foram realizadas num Cilizador térmico de ADN, Perkin-Elmer 480, utilizando as seguintes condições: 5 minutos a 94°C, 30 ciclos que consistem de 1 minuto a 94°C, 2 minutos a 60°C e 2 minutos a 72°C. Isto foi seguido de 5 minutos a 72°C. Purificaram-se em gel fragmentos de ADN a partir de agarose a 1%, utilizando o kit de extracção em gel Qiaex (Qiagen, Chatsworth, CA) . As extremidades dos fragmentos foram tornadas rombas, de acordo com o método de Kanungo e Pandey, BioTechniques, 14:912-913 (1993) e ligados no local Sma I de Bluescript KSII+ (Stratagene, La Jolla, CA). Sequenciaram-se vários clones pelo método da terminação didesoxi, utilizando o kit de Sequenase ™ T7 Polymerase (U.S. Biochemical, Cleveland, OH).

[0134] Devido à taxa de erro potencial inerente à PCR, realizaram-se pelo menos três reacções separadas. As sequências mais vulgarmente observadas para os genes VH e VL de L0-CD2a são apresentados nas figuras 29a e b e 30a e b, em que a figura 29a mostra as sequências de nucleótidos e aminoácidos da cadeia Vl de L0-CD2a, incluindo a sequência "leader" do vector MRC hcmv-vllys-kr-neo e a Figura 29b mostra as sequências de nucleótidos e aminoácidos da cadeia VL de LO-CD2a, incluindo a sequência 49 "leader" do gene L0-CD2a; A figura 30a mostra as sequências de nucleótidos e aminoácidos da cadeia VH de L0-CD2a, incluindo as sequências "leader" do vector MRC hcmv-Vh-Lys-gammal-neo; e a figura 30b mostra as sequências de nucleótidos e aminoácidos da cadeia VH de LO-CD2a, incluindo as sequências "leader" do gene LO-CD2a. B. Inserção em vectores para expressão transiente [0135] Dois dos vectores foram licenciados pela The Medicai Research Council (MRC) em Londres para a expressão das cadeias leve e pesada, quiméricas, de LO-CD2a, respectivamente. O vector da cadeia leve de 9,2 kb (hcmv-vllys-kr-neo) contém o clone genómico da região constante kappa humana e o domínio VL humanizado da anti-lisozima, como um fragmento Hind III-Bam Hl, 0 vector de cadeia pesada de 8,6 kb (hcmv-VhLys-gammal-neo) contém o clone genómico da região constante yle o domínio VH reformulado da anti-lisozima, como um fragmento Hind III-Bam Hl. Estes vectores estão descrito em maior pormenor em Maeda, et ai., Hum. Antibod. Hybridomas 2:124-134 (1991).

[0136] Uma vez que os fragmentos de ADN que contêm os péptidos sinal nativos estavam indisponíveis, as regiões V de LO-CD2a foram clonadas a seguir aos sinais já presentes nos vectores MRC. A região V de cadeia leve com o fragmento sinal foi construída a partir de dois fragmentos, sendo cada um derivado a partir de uma reacção de PCR separada, como se segue: Reacção 1: o modelo de ADN era o vector de cadeia leve de MRC. O fragmento amplificado continha o péptido sinal, mais uma porção de sequência (FR) 1. Os dois oligonucleótidos utilizados foram: 50

5'Vllyssig (sentido directo) : Hind III 5' CCGCAAGCTTCATGGATGGAG 3'

3'Vllyssig (sentido inverso): TthlII 5' GCTGCTTGGGGACTGGGTCAGCTGGAT 3' [0137] O iniciador de síntese de sentido inverso continha a sequência FRl de L0-CD2a, não a encontrada no vector MRC para a anti-lisozima. 0 produto de reacção de PCR produziu um fragmento Hind III-Tth III de 0,15 Kb.

[0138] Reacção 2: O modelo de ADN era o clone de VL de L0-CD2a em Bluescript. O fragmento amplificado incluía LO-CD2a FRl (do local de Tth III) até ao final de FR 4. A região 3' não traduzida encontrada no vector de cadeia leve MRC, foi adicionada à extremidade 3' de LO-CD2a utilizando o oligonucleótido de sentido inverso. Os 2 oligonucleótidos utilizados foram : 5' VL LO-CD2a (sentido directo):

Tth III 5'ATTCAGCTGACCCAGTCTCCA 3' 3'VL L0-CD2a (sentido inverso):

BamHI 5'GATCGGATCCACCTGAGGAAGCAAAGTTAAATTCTACTCAC GTTTCAGTTCCAGCTT 3' [0139] Esta reacção originou um fragmento TthlII-Bam Hl de 0,35 Kb. Ambos os produtos de PCR foram purificados em gel utilizando Qiaex e cortados com as enzimas de restrição adequadas. O fragmento Hind III-Tth III mais o fragmento Tth III - Bam Hl foram então ligados entre os locais de Hind III e Bam Hl de Bluescript, numa ligação de 3 vias. Esta construção, contendo a região VL completa de Lo-CD2a, mais o péptido sinal de MRC, foi em seguida sequenciada. 51 [0140] A construção da região V da cadeia pesada de LO-CD2a contém a sequência sinal de MRC na sua extremidade 5' e a região 3' não traduzida, longa, também derivada do vector da cadeia H de MRC, na sua extremidade 3'. A construção final foi feita a partir de 3 reacções separadas de PCR, como se segue: Reacção 1: 0 modelo de ADN era o vector da cadeia H de MCR. Uma vez que os genes VL e VH da anti-lisozima utilizam o mesmo sinal, o iniciador de sintese de sentido directo era o mesmo que o utilizado na construção de VL de Lo-CD2a, i.e. 5' Vilyssiq. 0 iniciador de sintese de sentido inverso era 3'VHlyssig:

Pst 1 5'TCTCGTGCAGTGGGACCTCGGAGTGGACACC3'

Esta reacção produziu um fragmento Hind III - Pst I de 0,16 Kb, contendo o sinal MRC mais uma porção de FR1 de Lo- CD2a. O fragmento foi purificado em gel, cortado com enzimas de restrição e ligado no corte Hind III - Pst I de Bluescript, para sequenciação.

Reacção 2: O modelo de ADN era a região VH de L0-CD2a em Bluescript. Esta reacção originou um fragmento Pst I - Sty I de 0,3 Kb contendo a maior parte da região VH. Uma vez que havia um local interno de Pst I na FR3 de LO-CD2a, o fragmento Pst ! - Sty I teve que ser construído a partir de duas reacções de PCR, como se segue:

Pst 1 2 4 0.2 Kb

Pst 1 <----- Sty 1 0.1 Kb FR 1 FR3 FR4 ------> -----> 1 3 52 0 ADN modelo apresentado acima é o clone 82-8, VH de L0-CD2a em Bluescript.

Reacção A: Origina um fragmento de 90,2 Kb, utilizando oligonucleótidos, também referidos como oligos 1 e 2, como iniciadores de síntese:

Oligo 1 é: 5'Pst I 82-8 (sentido directo):

Pst I 5'GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCT3' Oligo 2 é: 3'int. Pst I (sentido inverso): 5'CGATGTATCAGCTGTCAGTGTGGC3'

Reacção B: Origina um fragemnto de 0,1 Kb, utilizando oligos 3 e 4 como iniciadores de síntese. Oligo 3 é 51int.Pst I (sentido directo) :

Oligo 4 é: 3'Sty I 82-8 (sentido inverso):

5'GCCACACTGACAGCTGATACATCG3' Sty I 5'CAGAGTGCCTTGGCCCCAGTA3'

Os oligos 2 e 3 acima contêm alterações na sequência de nucleótidos, que removem o local de Pst I interno, sem alterar a sequência de aminoácidos de Lo-CD2a. Combinaram-se alíquotas (2-5 μΐ) de produtos sobrepostos, das reacções A & B acima e estes foram utilizados como modelos, para uma terceira reacção de PCR. Os iniciadores de síntese de oligobucleótidos para esta reacção eram os número 1 e 4 do diagrama anterior. O produto de 0,3 Kb foi purificado em gel por Qiaex e cortado com as enzimas de restrição Pst I e Sty I. Uma vez que o fragmento permaneceu intacto, o local interno de Pst 1 foi mutado com sucesso. 53

Reacção 3. o fragmento V« final foi produzido utilizando ao vector de cadeia pesada de MRC como modelo. Este fragmento Sty I - Bam Hl de 0,23 Kb continha uma porção de FR4 de Lo-CD2a e toda a região 3' não traduzida do vector MRC. Os iniciadores de síntese utilizados foram: 5'VHlys Sty I (sentido directo):

Sty I 5' TACTGGGGCCAAGGCACCCTCGTCACA3' 3'VHlys Bam Hl (sentido inverso): Bam Hl 5'GATCGGATCCCTTATAAATCTCTGGC3' O fragmento resultante foi purificado em gel e cortado com as enzimas de restrição Sty I e Bam Hl. Os fragmentos PstI - Sty I e Sty I-Bam Hl foram então ligados no corte Pst I- Bam Hl de Bluescript, para sequenciação.

[0141] Todos os oligonucleótidos foram sintetizados num sintetizador da Applied Biosystems. Todas as reacções de sequenciação foram realizadas utilizando o kit de Sequenase™T7 Polymerase (U.S. Biochemical, Cleveland, OH). Todas as PCR foram realizadas utilizando o seguinte protocolo: 5 min a 95°C, 35 ciclos que consistem de 1 min a 94°C, 1 min a 50°C, 2 min a 72°C, uma extensão final de 5 min a 72°c.

[0142] Os fragmentos VL a vH de LO-CD2a que continham as sequências correctas foram removidos de Bluescript e clonados entre os locais de Hind III e Bam Hl dos vectores da cadeia leve e pesada MRC, respectivamente. Para a cadeia Η, o fragmento 5' Hind III - Pst I foi primeiro ligado ao restante 54 da construção (PstI-Bam Hl) em Bluescript; todo o fragmento Hind III - Bam Hl foi então clonado no vector MRC.

C. Sequenciação de aminoácidos de VH e VL de terminal-N

[0143] A análise de sequência de aminoácidos de terminal-N foi realizada pelo Harvard Microchemistry Laboratory em Cambridge, MA, em amostras de cadeia leve e pesada de L0-CD2a, de modo a confirmar as sequências obtidas utilizando PCR de ARN. As amostras foram preparadas como se segue:

Aplicaram-se 200 μg de Lo-CD2a num gel de poliacrilamida-SDS a 12%, corrido na presença de B-mercaptoetanol. Após a electroforese, a proteína foi transferida para uma membrana de PVDF, utilizando um dispositivo de transferência Western. A membrana foi corada levemente com Ponceau S, descorada em ácido acético a 1% e as bandas da cadeia leve e pesada foram secas sob vácuo e enviadas para análise de aminoácidos e sequenciação de terminal-N.

[0144] A sequência de aminoácidos dos primeiros 20 resíduos de Vh de Lo-CD2a, concordava completamente com a sequência clonada; no entanto, a sequência de VL indicava que os resíduos 2, 3 e 7 em FR1 eram diferentes dos codificados pelos genes clonados. Estas diferenças residem todas no iniciador de síntese de PCR utilizado para fins de clonagem, com base numa melhor estimativa de sequência, obtida a partir da literatura anteriormente citada. D. Confirmação da sequência de ADN da sequência de aminoácidos de terminal-N e sua correcção 55 [0145] De modo a corrigir esta sequência e simultaneamente clonar os péptidos sinal nativos, tanto de VL como de Vh de LO-CD2a, utilizou-se RACE-PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends): o ARNm de células LO-CD2a foi transcrito no sentido inverso e adicionou-se uma cauda-G ao ADnc resultante, na sua extremidade 3', utilizando transferase terminal na presença de dGTP. O ADNc foi então amplificado utilizando um oligonucleótido 3' especifico e um oligonucleótido 5' complementar à cauda-G. Para simplificar a sub-clonagem, adicionou-se um local de restrição adequado na extremidade 5' de cada oligonucleótido.

[0146] Os oligonucleótidos utilizados para a preparação de ANDc foram os seguintes:

3' oligo Vk(VKA) Bam Hl Not I Sal I

TTGGATCCGCGGCCGCGTCGACTACAGTTGGTGCAGCATCAGC 3' oligo Vh(CHA) Bam Hl Not 1 Sal 1

ATGGATCCGCGGCCGCGTCGACCCAGTGGATAGACCGATGG

Os oligonucleótidos para a RACE-PCR eram como se segue:

5' Iniciador de síntese (TV1): Xho I 5' CCA TGG CCT CGA GGG CCC CCC CCC CCC CCC C 3'

Stu I 3' oligo Vh (BHA) 5' CCT GTT TAG GCC TCT GCT TCA CCC AGT AC 3'

Sph I 3' oligo Vk (BKA) 5' GGA TAA TGG GTA AAT TGC ATG CAG TAA TA 3' [0147] As reacções de RACE_PCR foram realizadas utilizando o seguinte protocolo: 5 min a 94°C, 40 ciclos, incluindo 30 seg. a 94°C, 30 seg. a 50°C e 50 seg. a 72°C, seguido de 5 min de extensão a 72°C. 56 [0148] Os produtos de PCR obtidos para VL e VH de LO-CD2a foram extraidos em gel, utilizando Qiaex. O fragmento VH foi cortado com as enzimas de restrição Xho I e Stu I e ligado no corte Xho I - sma I de Bluescript. As extremidades do fragmento VT. foram tornadas rombas e ligadas no corte Sma I de Bluescript. Sequenciaram-se vários clones para ambas as regiões V leve e pesada e identificaram-se as sequências sinal.

[0149] Uma vez que as sequências sinal encontradas nos genes de imunoglobulina têm geralmente intrões, estes podem ser importantes para a expressão. Os clones genómicos que contêm as sequências "leader" de VL e VH também foram identificadas. O ADN genómico foi preparado como se segue: 4 x 107 células LO-CD2a foram centrifugadas, lavadas em PBS frio, centrifugadas e lavadas com PBS mais uma vez. As células foram ressuspendidas em 0,4 ml de tampão de digestão (com proteinase K adicionada de fresco). esta mistura foi incubada com agitação a 50°C durante 12-15 horas, extraída com um volume igual de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico e centrifugadas a 1700 x g. A fase aquosa foi transferida para um tubo limpo e adicionou-se 1/2 volume de acetato de amónio 7,5 M e 2 volumes de etanol a 95%. 0 ADN foi sedimentado por centrifugação durante 2 minutos, 1700 x g. O pelete foi lavado com etanol a 70% e seco ao ar. O pelete foi ressuspendido em 80 ml de TE , pH 8,0.

[0150] Utilizando ADN genómico, obtido da linha celular LO-CD2a, como modelo, desígnaram-se os seguintes oligonucleótidos, de modo a amplificar as sequências "leader" genómicas de ambos, o VL e Vh, bem como porções das regiões de sequência em locais de restrição únicos (Sph I para VL, Pst I para VH) .

TiVH #430 TGCAAGCTTCATGATGAGTCCTGTCCAGTC 57

T.eader VL sentido directo/Hind III LVL #429 AGTAAGCTTCATGAAATGCAGGTGGATC Leader VH sentido directo/Hind III

PVHA #428 GGGAGATTGCTGCAGCTGGACTTC VH sentido inverso/Pst I

[0151] As reacções de PCR foram realizadas como se segue: 100 ng de ADN genómico de células LO-CD2a, 200 pmol de cada um dos oligos LVL e BKA (para o fragemnto VL) ou 200 pmol cada de LVH e PVHA (para o fragmento VH), 100 μΐ de dNTPs 1 mm, 10 μΐ de tampão 10 x Pfu, 1 ml (2,5 unidades) de pólimerase de ADN pfu (Stratagene, La Jolla, CA), água desionizada para 100 μΐ. O Pfu foi utilizado devido a ter maior precisão que a pólimerase Taq.

[0152] As condições reaccionais eram como se segue: 5 min. 94°C, 5 min. 50°C, 35 ciclos de 1 min, 94°C, 1 min. 50°C, 1 min. 72°C, seguido de 5 min a 72°C. Os produtos de PCR foram purificados em gel, cortados com enzimas de restrição e ligados em Bluescript, para sequenciação. Uma vez identificados os clones contendo a sequência correcta, os vectores Bluescript contendo estes clones foram cortados com Hind III e Sph I (VL) ou Hind III e Pst I (VH) e os fragmentos foram isolados em gel. O fragmento Hind III- Sph I de 0,75 Kb foi então ligado em Bluescript contendo a construção de VL de L0-CD2a original, a partir da qual o fragmento Hind III - Sph I foi removido. A nova construção continha o sinal L0-CD2a nativo mais intrão e uma sequência FR1 corrigida (de acordo com a sequência de terminal-N) . O fragmenlo Hind III - Pst I de 0,16Kb foi ligado em Bluescript contendo a construção VH de L0-CD2a original, da qual se removeu o fragmento Hind III - Pst I. A nova construção continha o sinal nativo + intrão. Os fragmentos VL e VH construídos de novo foram então removidos de Bluescript, por 58 digestão com Hind III e Bam Hl e clonados nos vectores de cadeia leve e pesada MRC, respectivamente, para expressão em células COS.

E. Expressão transiente em células COS

[0153] As células COS 7 foram obtidas da ATCC e foram crescidas em meio mínimo essencial da Dulbecco (DMEM) com soro fetal de vitela a 10% (FBS). Obteve-se uma transfecção óptima de aproximadamente 50% de confluência de células aderentes. Na preparação para transfecção, adicionou-se ADN de plasmídeo a DMEM contendo NuSerum e difosfato de DEAE-Dextran/cloroquina. Removeu-se o meio das células COS, adicionou-se a mistura de ADN e as células forma incubadas durante 3 horas a 37°C. O meio foi em seguida removido e adicionou-se DMSO a 10% em PBS às células durante 2 minutos e em seguida removeu-se. Adicionou-se DMEM com FBS a 10% às células. Após uma incubação durante a noite, o meio foi substituído e as células foram incubadas durante 2 dias a 37°C. Recolheram-se os sobrenadantes para teste por ELISA, para a secreção de anticorpos quiméricos.

F. Detecção de quiméricos segregados, por ELISA

[0154] A secreção de anticorpos quiméricos foi confirmada por teste dos sobrenadantes de células COS transfectadas num teste ELISA, concebido para detectar a presença de anticorpos humanos (ou uma porção sua derivada). Diluiu-se IgG anti-humano de cabra (H+L) em solução salina tamponada com fosfato (PBS), a uma concentração de 5 μg/ml e ligou-se a poços de placas de microtítulo de ELISA, por incubação durante a noite a 4°C. As placas foram lavadas 3 vezes, utilizando um lavador de placas ELISA. 59 [0155] Os locais livres remanescentes foram bloqueados pela adição de 200 μΐ de PBS contendo albumina de soro bovino a 1% (PBS-BSA), durante 1/2 h à temperatura ambiente. Prepararam-se diluições de duas vezes em PBS-BSA dos sobrenadantes e de um padrão de referência, de controlo positivo (IgGIK humano purificado). Os meios sozinhos e/ou PBS-BSA sozinho constituíam os controlos negativos. As diluições de anticorpos e os controlos foram adicionados aos poços e incubados à temperatura ambiente durante 1 1/2 horas. As placas foram então lavadas 3 vezes com um lavador de placas em PBS contendo Tween-20 a 0,05%. A diluição adequada de um anticorpo IgG anti-humano de cabra (específica para a cadeia gama)- conjugado com peroxidase de rábano (HRP) ou anticorpo da cadeia leve kappa, anti-humano, de cabra- conjugado com HRP foi adicionado a cada poço e incubou-se à temperatura ambiente durante 1 hora. As placas foram lavadas com PBs-Tween20 como descrito acima, após o que se adicionou o substracto de desenvolvimento (ABTS), contendo peróxido de hidrogénio. O anticorpo ligado foi detectado por leitura de absorvância a um comprimento de onda de 405 nm. G. Especificidade de ligação do anticorpo quimérico segregado.

[0156] A especificidade de ligação do quimérico foi avaliada por análise de citometria de fluxo do anticorpo que se liga à linha celular Jurkat mutante que expressa CD2, JRT3-T3-5. O perfil de ligação do anticorpo quimérico (IgGl humano) foi comparado com os de anticorpo de rato nativo (IgG2b) e com os mAcs controlo do mesmo isotipo (IgGl humano e IgG2b de rato), que exibiam especificidades de ligação irrelevantes (não-CD2).

[0157] Preparação da linha celular JRT3-T3-5 (Jurkat). A linha celular Jurkat foi obtida da ATCC () e foi propagada em 60 DMEM contendo soro fetal de bovino a 10% (FBS), suplemento de aminoácidos a 10% (NCTC) e L-glutamina 6 mM (meio completo). As células foram mantidas a 37°C com CO2 a 10% e foram passadas três vezes por semana, a uma razão de 1:4 (sendo a concentração de células por passagem de aproximadamente 3 x 106/ml) . As células Jurkat foram recolhidas, centrifugadas para remover o meio gasto e lavadas em DMEM. As células foram então ressuspendidas em solução salina tamponada com fosfato (PBS)com azida de sódio (NaZ) a 0,1% e removeu-se uma alíquota para quantificação celular. O número de células viáveis foi determinada por exclusão de azul de tripano.

[0158] Coloração indirecta de células Jurkat. A coloração da superfície celular foi realizada numa placa de microtítulo de 96 poços, de fundo em U. Aproximadamente 6 x 105 células num volume de 90 μΐ foram distribuídas em cada poço da placa de microtítulo. As diluições dos anticorpos a ser testados foram preparadas em PBS com NaZ a 0,1% e distribuídas nos poços adequados, num volume de 10 μΐ. As células foram incubadas com anticorpo durante 15 minutos à temperatura ambiente, após o que as células forma lavadas 3 vezes por adição de PBS com NaZ a 0,1%, a cada poço, e por centrifugação durante 2 minutos a 1900 rpm (Sorvall RT6000D). A ressuspensão das células foi realizada batendo levemente nas placas. Adicionaram-se alíquotas de 10 μΐ do anticorpo secundário conjugado com fluoresceína-isotiocianato (FITC), adequado (Ig anti-humano ou Ig anti-rato) aos poços adequados e incubou-se à temperatura ambiente, durante 15 minutos, no escuro. As placas foram lavadas 3 vezes em PBS com NaZ a 0,1 %, como descrito acima, as células coradas foram fixadas por adição de 200 μΐ de paraformaldeído a 0,5% em PBS e foram armazenadas a 4°C (até 1 semana). 61 [0159] Análise de citometria de fluxo de células Jurkat coradas. As células coradas foram transferidas para tubos de poliestireno 12 x 17 mm para aquisição de dados, utilizando um FACscan Becton-Dickinson. A aquisição e análise de dados foram realizados utilizando o software LYSIS-II. As células Jurkat que expressam CD2 foram incubadas com o L0-CD2a (IgG2b de rato)MAB, a versão quimérica de L0-CD2a (IgGl humano) e os controlos correspondentes do mesmo isotipo. O anticorpo ligado foi detectado utilizando o anticorpo secundário conjugado a FITC, adequado, de acordo com o protocolo acima descrito. A análise mostra padrões de ligação semelhantes do L0-CD2a de rato nativo e do L0-CD2a humano-rato quimérico.

Lisboa, 11 de Dezembro de 2001. q/agente oficial da propriedade industrial 62

Claims (22)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo que se liga especificamente ao mesmo epitopo em linfócitos humanos que o anticorpo monoclonal produzido pela linha celular depositada como ATCC HB 11423.
2. 2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal, ou um seu fragmento.
3. 3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal idêntico ao anticorpo monoclonal produzido pela referida linha celular depositada.
4. 4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido anticorpo é um anticorpo com os mesmos CDR que o anticorpo produzido pela referida linha celular depositada.
5. 5. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 4, em que o referido anticorpo inclui uma cadeia VL com uma sequência de aminoácidos como indicado na figura 29A ou figura 29B. 1
6. 6. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 4, em que o referido anticorpo inclui uma cadeia VH com uma sequência de aminoácidos, como indicado na figura 30A ou figura 30B.
7. 7. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido anticorpo se liga a um epitopo conformacional.
8. 8. Anticorpo de acordo com uma das reivindicações anteriores, em que o referido anticorpo se liga ao epitopo CD2 das células-T humanas, positivas para CD2.
9. 9. Anticorpo de acordo com uma das reivindicações anteriores, em que o referido anticorpo se liga a pelo menos uma porção das células CD2+NK humanas.
10. 10. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o referido anticorpo é uma forma humanizada do anticorpo.
11. 11. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o referido anticorpo é uma forma quimérica do anticorpo.
12. 12. Anticorpo de acordo com a reivindicação 10 ou 11, em que o referido anticorpo desencadeia uma hiporesposta especifica, aloantigénica. 2
13. 13. Anticorpo de acordo com a reivindicação 12, que desencadeia uma hiporesposta especifica de antigénios.
14. 14. Anticorpo de acordo com a reivindicação 13, que desencadeia uma hiporespota específica de aloantigénios.
15. 15. Anticorpo de acordo com a reivindicação 13 ou 14, que compete para a ligação a um antigénio com o anticorpo monoclonal produzido pela linha celular depositada como ATCC HB 11423.
16. 16. Utilização do anticorpo de acordo com uma das reivindicações anteriores, para a preparação de um medicamento ou uma composição farmaceuticamente activa, para inibir, tratar, ou prevenir uma resposta imunitária.
17. 17. Utilização do anticorpo de acordo com uma das reivindicações 1 a 15, para a preparação de um medicamento ou uma composição farmaceuticamente activa, para o tratamento de uma doença auto-imune.
18. 18. Utilização de acordo com a reivindicação 16 ou 17, em que o referido medicamento ou composição também compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável. 3
19. 19. Utilização de acordo com a reivindicação 18, em que a referida resposta imunitária é a rejeição de um enxerto, ou a doença de enxerto versus hospedeiro.
20. 20. Utilização de acordo com a reivindicação 18 ou 19, em que a referida resposta imunitária é desencadeada por um transplante de aloenxerto ou xenoenxerto.
21. 21. Utilização de acordo com uma das reivindicações 18 a 20, em que o referido medicamento ou composição é administrado antes do transplante.
22. 22. Composição que compreende um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 e um transportador farmaceuticamente aceitável. Lisboa, 11 de Dezembro de 2001.

    4