PT649325E - Utilizacao de substancias para a producao de medicamentos para as aves domesticas - Google Patents

Description

1 Μ'6413Ζ5

Descrição “Utilização de substâncias para a produção de medicamentos para as aves domésticas”

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As aves domésticas criadas em explorações avícolas, tais como galinhas, perus, patos, gansos, galinholas, faisões e codornízes, estão sujeitas a diversas doenças e infecções após a eclosão dos ovos chocados. Há uma certa resistência às doenças, que é proporcionada pelos anticorpos que ocorrem naturalmente e pelas globulinas γ neutralizantes de vírus, existentes na gema do ovo, transportada pela avezinha ainda implume, imediatamente por baixo da pele do abdómen. O conteúdo da gema é absorvido pelo tracto digestivo da avezinha ainda implume ao longo de um período de sete a nove dias após a eclosão do ovo chocado. Ver, v.g., C. R. Parkhurst e G. J. Mountney (1989), capítulo 5, “Incubation and Hatchery Management"’, em ‘Poultry Meat and Egg Production’, Van Nostrand (Nova Iorque). E possível administrar medicações suplementares às aves domésticas por meio de vários métodos, incluindo a injecção subcutânea e as gotas oculares. As injecções subcutâneas são vulgarmente aplicadas nos pescoços das avezinhas implumes recém-nascidas, por um processo sequencial semiautomático, havendo equipamento para isso comercialmente disponível. Segundo este processo, as avezinhas implumes são apanhadas manualmente uma por uma e os seus pescoços são colocados contra um dispositivo de injecção automática; então, uma agulha de injecção avança rapidamente, penetrando no pescoço da avezinha implume, injecta-lhe uma dose calibrada de medicamento e seguidamente é retirada. O medicamento injectado desta forma difúnde-se rapidamente no sistema vascular da avezinha implume.

Num esforço para conferir às aves domésticas imunidade ou resistência contra as doenças a seguir à eclosão dos ovos chocados, também é possível administrar-lhes medicamentos antes da eclosão dos ovos. De um modo geral, os ovos que se pretende tratar são colocados em pé, com a câmara de ar para cima; abre-se então um pequeno orifício através da casca do ovo, na parte de cima, e faz-se passar por esse orifício a agulha de injecção, desejavelmente até ao interior do âmnio, aí se descarregando o medicamento. Por vezes o próprio embrião é injectado inadvertidamente, daí podendo resultar a sua morte.

Se o medicamento for uma vacina solúvel, a injecção inadvertida da vacina dentro da câmara de ar pode ser eficaz; no entanto, as vacinas associadas a células são normalmente ineficazes quando injectadas na câmara de ar. Os métodos e os dispositivos para injectar ovos foram descritos por Sharma et ai, na patente de invenção norte-americana n° 4 458 630, por Christensen, na patente de invenção norte-americana n° 4 604 968, e por Hebrank, nas patentes de invenção norte-americanas n- 4 681 063 e 4 903 635. Conforme se disse antes, a injecção do medicamento no interior do âmnio faz com que a quantidade total desse medicamento fique imediatamente disponível para o embrião.

Na indústria avícola é particulaimente preocupante a doença conhecida pela designação de coccidiose, provocada por organismos protozoários parasitas do género Eimeria. Ver, como leitura genérica, “Coccidiosis”, pp. 153-157 em Avian Disease Manual C.E., Whiteman e A. A. Bickford, eds., Kendall/Hunt Publishing Co., 1989. Há muitos anos que vêm sendo efectuadas com sucesso, à escala comercial, imunizações activas e passivas das aves domésticas adultas, contra esta doença. No entanto, apenas foi possível obter um sucesso limitado no caso dos frangos. A razão para tal reside no facto de os frangos serem normalmente enviados para o mercado com cerca de 6 semanas de idade. Ora, ao utilizar os métodos convencionais de imunização à escala comercial, acontece simplesmente que este período de vida não é suficiente para que o sistema imunitário das aves desenvolva uma imunidade protectora. Há um procedimento designado por “vacinação por gotas” que tem sido utilizado como via possível para conferir uma imunidade eficaz às aves juvenis. Este procedimento, aplicável ao produto “Cocei-Vac”, fornecido por ‘Sterwin, Inc. \ exige que seja administrados 200 oocistos (trata-se de uma fase de desenvolvimento no ciclo de vida do parasita Eimeria) per os a cada avezinha implume nos primeiros dois dias a seguir à eclosão dos ovos chocados. Quando tal quantidade de oocistos é ingerida durante o primeiro período neonatal, a avezinha implume desenvolve imediatamente, de um modo geral, imunidade protectora. Embora do ponto de vista teórico este método de vacinação das aves domésticas juvenis contra a coccidiose possa ter o seu mérito, em termos práticos não há até ao momento presente nenhum método exequível à escala comercial que garanta que cada avezinha implume venha a ingerir os necessários 200 oocistos. Ver, v.g. P.L. Long et al, Exp. Parasitol. 16:1-7 (1965), N.N. Sharma, J. Parasitol, 50:509-517 (1964) e Μ. E. Rose et al, Parasitol., 102:317-324 (1990). DESCRIÇÃO ABREVIADA DA INVENÇÃO A presente invenção visa a utilização de uma vacina probiótica, estimuladora do crescimento ou modificadora da função sexual, de acordo com a reivindicação 1. O presente texto descreve também um dispositivo e um método para a administração de medicamentos às aves domésticas acabadas de sair dos ovos chocados, não sendo tais medicamentos parte da presente invenção. O método descrito compreende os passos seguintes: (a) orientar sequencial e individualmente as aves domésticas por forma a facilitar o acesso à pele que cobre o saco vitelino residual de cada uma das avezinhas implumes e

(b) injectar uma quantidade eficaz de medicamento através da pele e dentro do saco vitelino de cada avezinha implume assim orientada.

Descobriu-se que o saco vitelino residual das aves domésticas recém-nascidas constitui um local desejável e eficaz para injectar medicamentos nas aves. E particularmente surpreendente o facto de a via proporcionada pelo saco vitelino permitir a administração de medicamentos que não são eficazes, conforme demonstrado já, quando injectados por outras vias tradicionais. Por exemplo, comprovou-se que a administração de oocistos do parasita Eimeria tenella, que é agente causador da coccidiose vulgar, protege perfeitamente os frangos contra um estímulo subsequente com oocistos. Uma tal protecção nunca antes havia sido conseguida por vacinação de frangos à escala comercial.

Além disso, verificou-se que a via proporcionada pelo saco vitelino é geralmente tanto ou mais eficaz do que as vias tradicionais de administração para os medicamentos administrados normalmente por tais vias. Seja como for, comparativamente com as vias tradicionais, a via proporcionada pelo saco vitelino tem a vantagem complementar de permitir a formulação de medicamentos segundo uma forma que tira partido da absorção gradual do próprio saco vitelino, por exemplo, com a finalidade de permitir a libertação retardada ou contínua do medicamento. O saco vitelino residual de uma avezinha recém-nascida é tipicamente uma estrutura achatada, inserida imediatamente por baixo da pele do abdómen, e no caso das galinhas pode ter um diâmetro de dois ou mais centímetros (isto é, aproximadamente % de polegada), pelo que constitui um alvo grande para administração por injecção numa unidade semiautomática, conforme aqui descrito. O medicamento pode ser administrado por meio de qualquer dispositivo adequado, v.g., pode ser injectado por meio de uma agulha de injecção através da pele abdominal e dentro do saco vitelino.

O dispositivo aqui descrito serve para administrar o medicamento e permite a orientação rápida de cada uma das aves de uma forma sequencial, para que a pele que cobre o saco vitelino residual possa ser penetrada, de um modo consistente e predeterminado, por uma agulha de injecção. O dispositivo preferido possui uma parede contra a qual é empurrado o abdómen da avezinha implume, estando prevista nessa parede uma agulha para injectar o medicamento dentro do abdómen. Com a avezinha implume orientada e manietada numa posição de patas para cima, estando o seu abdómen ao nível da agulha, a injecção do medicamento dentro do saco vitelino é pois facilitada. O alvo preferido no abdómen é a zona ventral imediatamente adjacente à cicatriz umbilical, isto é, logo abaixo da cicatriz umbilical e logo acima do orifício da cloaca.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

Explicação das figuras dos desenhos. A figura 1 é uma vista em perspectiva do dispositivo preferido aqui referido. A figura 2 é uma vista em perspectiva do dispositivo da figura 1, representando o dispositivo aberto para que se possa observar os seus componentes interiores. A figura 3 é uma vista em perspectiva do dispositivo da figura 1, mostrando a extremidade onde a avezinha implume é vacinada. A figura 4 é uma vista em perspectiva que mostra uma avezinha implume a ser vacinada, em conformidade com o método aqui descrito e utilizando o dispositivo da figura 1. A figura 5 é uma representação gráfica que traduz a variação das massas corporais (MC) e das massas do saco vitelino (MSV) ao longo do tempo (após a eclosão dos ovos chocados) para pintos recém-nascidos, conforme descrito no exemplo 1, sendo possível calcular entre tais parâmetros um coeficiente de correlação (r) igual a -0,71. A figura 6 é uma representação gráfica da variação percentual da absorção do saco vitelino em função do tempo para pintos recém-nascidos (após a eclosão dos ovos chocados), conforme descrito no exemplo 1. A invenção revela ou descreve um método para administrar medicamentos a diversas espécies de aves domésticas (incluindo as aves de capoeira) criadas para fins comerciais, em particular galinhas, perus, patos, gansos, galinholas, faisões e codornízes. As aves domésticas recém-nascidas serão aqui designadas simplesmente por “pintos ou pintainhos” independentemente da sua espécie, embora se saiba que as aves recém-nascidas de espécies diferentes podem ter nomes específicos diferentes, v.g., os perus acabados de nascer podem ser designados por “peruzinhos”. O termo “medicamento” aqui utilizado designa uma grande variedade de substâncias que ao serem administradas a um pintainho recém-nascido, de acordo com o método descrito, têm sobre ele um efeito biológico benéfico. Entre os medicamentos aqui referidos estão as vacinas, os nutrientes, os antibióticos, os probióticos, os agentes estimuladores do crescimento e os agentes modificadores da fimção sexual, explicitados na lista não exaustiva de substâncias adiante identificadas. O método descrito proporciona uma vantagem particular no tratamento da coccidiose das aves de criação. Os agentes comuns causadores desta doença vulgar e devastadora nos perus são os microrganismos E. meleagrimitis, E. adenoeidese E. gallopavonis. No caso das galinhas, os agentes causadores vulgares são os microrganismos E. tenella, E. acervulina. E. necatrix, E. bnmetti, E. maxima, E. mivarti, E. hagani, E. praecox e E. miíis. O método agora descrito permite administrar uma vacina eficaz para o tratamento da coccidiose. O termo “vacina”, quando utilizado neste sentido, refere-se à administração de qualquer substância útil 7

para imunizar os pintainhos contra a coccidiose. A substância da vacina pode ser obtida directamente ou por meio de técnicas da engenharia genética, a partir do género Eimeria. As vacinas particularmente preferidas para tal fim compreendem os oocistos e os esporozóitos do género Eimeria.

Antes do método aqui descrito não havia nenhuma vacina eficaz contra esta doença, uma vez que presumivelmente não era possível conseguir os desenvolvimento da imunidade contra os organismos coccidianos por simples injecção convencional ou através da administração dietética de componentes antigénicos.

Sem se pretender estabelecer qualquer relação de dependência com nenhuma teoria particular, presume-se que a eficácia do método aqui descrito para vacinação contra a coccidiose possa ser explicada pela hipótese de se considerar o saco vitelino como uma extensão do intestino do pintainho parafetal e recém-nascido. Sabe-se que os tecidos imunobiológicos, isto é, os macrófagos, as células B e as células T interactuam com os tecidos linfóides associados ao intestino, estimulando a imunidade mediada pelas células. Num estudo sobre a absorção de carbono coloidal existente no saco vitelino dos pintainhos recém-nascidos, Jeurissen et al., ‘Develop. and Comp. Immunol.’, 15:437-442 (1991) concluíram que as partículas de carbono eram absorvidas pelo epitélio do divertículo de Meckel e eram transportadas para os leucócitos e para os fagócitos mononucleares dos tecidos linfóides subjacentes. Os anticorpos matemos existentes no saco vitelino podem desempenhar, de alguma forma, uma função “condicionante” dos antigénios coccidianos, aumentando consequentemente a sua imunogenicidade. O método e o dispositivo agora descritos também podem ser utilizados para administrar vacinas que estejam ou possam vir a estar disponíveis para inúmeras doenças das aves de criação, incluindo as doenças seguintes:

f? a cólera que ataca todas as espécies de aves e cujo agente causador é Pasteurella multocida; a colibacilose nas aves domésticas de criação e cujo agente causador é Escherichia coli\ a varicela que afecta galinhas e perus e cujo agente causador é o vírus da varicela; a bronquite infecciosa das galinhas e cujo agente causador é o vírus da bronquite infecciosa; a doença bolsai infecciosa (Gumboro) das galinhas cujo agente causador é o vírus da doença bolsai infecciosa; a laringotraqueite das galinhas cujo agente causador é o vírus da laringotraqueite; o complexo da leucose, que afecta galinhas e perus, compreendendo as seguintes doenças principais: (1) a doença de Marek nas galinhas, cujo agente causador é o vírus da doença de Marek, (2) a leucose linfóide nas galinhas, cujo agente causador é o vírus da leucose, (3) a reticuloendoteliose nas galinhas, cujo agente causador é o vírus da leucose, (4) a doença linfoproliferativa nos perus, cujo agente causador é o vírus da leucose; a doença de Newcastle nas galinhas e nos perus, cujo agente causador é o vírus de Newcastle; a artrite virai das galinhas, cujo agente causador é o reovírus. É possível utilizar antibióticos para evitar ou retardar as infecções bacterianas nas primeiras fases de vida, para facilitar o crescimento nos primeiros dias de vida e para atenuar a resposta extenuante (stress) ao meio ambiente após a eclosão dos ovos chocados. Como exemplos de antibióticos adequados refere-se os seleccionados entre oxitetraciclina, cloro-tetraciclina, espectinomicina, cefalosporina, gentamicina, lincomicina e as quinolonas. É possível utilizar probióticos para a exclusão competitiva de organismos indesejados, tais como Salmonella, de organismos patogénicos E. coli e de organismos dos géneros Listeria e Campylobacter e para povoar o intestino com os organismos desejáveis. Como exemplos de nutrientes refere-se as vitaminas, os minerais, os aminoácidos, os açúcares e os ácidos gordos, podendo estas substâncias ser utilizadas para estimular o crescimento e para atenuar as respostas extenuantes (stress).

Os agentes estimuladores do crescimento são normalmente secreções endócrinas utilizáveis para estimular o crescimento e a eficiência alimentar. Como exemplos refere-se a hormona do crescimento, a hormona libertadora da hormona do crescimento, os factores de crescimento I e II de tipo insulínico, as interleucinas das aves (v.g. a IL2), os factores de crescimento dos nervos, a hormona de libertação da tiroxina, a hormona estimuladora da tiroxina e as substâncias monoiodotirosina, diiodotirosina, triiodotironina, tiroxina e corticosterona.

Os agentes modificadores da função sexual são normalmente secreções endócrinas utilizáveis para inverter a função sexual fisiológica, alterar o período de maturidade sexual e/ou para aumentar as funções sexuais nos adultos. Como exemplos refere-se a substância inibidora da medularina, Π-β-estradiol, estrona, estrogénio, progesterona, testosterona, epiandrostenodiona, a hormona de libertação da gonadotropina, a hormona estimuladora dos folículos, a hormona de luteinização e a prolactina.

Os medicamentos do tipo exemplificado antes são combinados de forma desejável com soluções salinas fisiologicamente equilibradas para se obter líquidos injectáveis que possam ser misturados com a gema para efeitos de absorção pelo corpo conjuntamente com a parte restante do saco vitelino. Descobriu-se que os constituintes normais dos fosfolípidos e das lipoproteinas existentes na gema possuem uma excelente capacidade de transporte; aderem facilmente aos medicamentos ou toleram medicamentos tais como os exemplificados antes.

Os medicamentos podem ser administrados ao saco vitelino de um pintainho utilizando para tal uma seringa hipodérmica, sendo adequadas para tal fim as agulhas biseladas de calibre 20. Não é necessário utilizar agulhas de maiores dimensões ou não biseladas pois têm tendência para induzir um efeito prejudicial sobre a integridade do saco vitelino. Foram já utilizados com sucesso volumes de injecção que podem ir até cerca de 0,5 mL, sendo este volume suficientemente pequeno para evitar perdas significativas do fluido injectado que eventualmente possa sair pelo local de injecção. São preferíveis os volumes de injecção compreendidos entre cerca de 0,1 mL e cerca de 0,5 mL. O saco vitelino de um pintainho recém-nascido é praticamente plano e está centrado na cicatriz umbilical. De um modo geral cobre toda a superfície ventral da cavidade abdominal. Geralmente tem uma forma oval com um comprimento compreendido entre cerca de 2,5 cm e 3 cm (no sentido dorsoventral) e com uma largura entre cerca de 1,5 cm e cerca de 2 cm (sentido ventral). No interior desta região é particularmente preferido um alvo circular de menores dimensões, de modo a constituir uma região do saco vitelino com uma profundidade suficiente e com melhor facilidade de acesso para uma agulha e que simultaneamente diminua a probabilidade de a agulha atingir órgãos ou tecidos que não devam ser facetados. O alvo preferido é uma zona circular pequena (com um diâmetro de cerca de 1 cm e de preferência com cerca de 5 mm) em que a cicatriz umbilical fica localizada aproximadamente a meio, entre o centro da zona que constitui o alvo e a sua posição correspondente às 12 horas de um relógio.

De forma desejável utiliza-se um aparelho automático de vacinação, tal como um aparelho pneumático de vacinação (do tipo comercializado por ‘Vineland Laboratories’ com a marca comercial “ViMark”) adaptado à prática do método aqui descrito. O aparelho de vacinação de tipo comercial é constituído por cinco partes principais (ver v.g. “The ViMark Pneumatic Vaccinator Instruction Manual”, Vineland Laboratories, Inc.: 11 (1) um corpo de paredes protectoras feitas de alumínio, ligado por dobradiças a uma tampa de aço, no qual se coloca o pintainho, (2) um cilindro pneumático que permite desencadear uma poderosa força de comando, conjuntamente com um componente para absorver os choques e que se destina a eliminar a pressão excessiva exercida sobre o medicamento na seringa, (3) uma unidade pneumática de regulação, incluindo um regulador de filtração do ar, um sistema de circulação de ar, um dispositivo externo de contagem e os comandos para ajustar a agulha e a activação do fluxo de ar, um manómetro e uma virola de acoplamento, (4) uma placa pneumática de retenção para colocar correctamente cada pintainho, e (5) uma unidade equipada com uma seringa, sendo esta tipicamente uma seringa de 0,2 mL com capacidade para administrar doses exactas. O dispositivo de tipo ‘ViMark’ utiliza uma corrediça por botão de contacto na parte superior do dispositivo, possuindo um orifício central através do qual pode passar a agulha hipodérmica. Quando o botão é impelido, tal como sucede quando o pescoço de um pintainho é empurrado conta a sua superfície, a agulha avança rapidamente uma determinada distância para além da superfície do botão e simultaneamente o êmbolo da seringa avança para injectar uma certa quantidade, v.g. 0,2 mL de vacina no pescoço ou na pata do pintainho.

Tendo por base os preceitos aqui descritos, qualquer especialista na matéria pode modificar facilmente tal dispositivo ou conceber um dispositivo alternativo. De acordo com uma variante particularmente preferida, a seringa do dispositivo comercial anteriormente descrito é recolocada de tal modo que a agulha saia por uma das extremidades do dispositivo, em vez de sair pela parte de cima deste.

Descreve-se adiante um dispositivo deste tipo, tomando como referência os desenhos. A figura 1 é uma vista em perspectiva de um dispositivo 10 preferido em que se observa a caixa de alumínio 12 e a tampa de aço 14, sendo essa tampa imobilizada por um trinco 15 e pelas dobradiças (não representadas). O dispositivo é constituído por um suporte de garrafa, feito de arame rígido 16, um activador manual 18, um manómetro 20 de pressão de ar e um contador 21. Como nota particular refere-se o facto de o dispositivo dispor de uma placa de retenção 22, feita de ‘plexiglass’, montada de forma estável sobre a extremidade do injector e que serve simultaneamente para orientar e imobilizar um pintainho na posição desejada. A figura 2 é uma vista em perspectiva do dispositivo da figura 1 em que se observa a tampa e a face lateral do dispositivo abertas para se ver os componentes interiores. Vê-se nitidamente a unidade pneumática de controlo 24, a unidade pneumática de comando 26 e a unidade 28 que constitui a seringa, estando todas estas unidades montadas de modo a que se forme um ângulo adequado para permitir realizar a injecção através da extremidade do dispositivo em vez de se efectuar a injecção pela sua parte de cima, tal como concebido originalmente. A figura 3 é uma vista em perspectiva do dispositivo da figura 1 em que se observa a extremidade onde o pintainho é vacinado, incluindo a placa de retenção 22 e o interruptor de disparo manual 30. Também se pode observar o orifício 32 do injector que foi aberto na extremidade da tampa de aço 14 e pelo qual irá passar a agulha. A circundar o orifício do injector existe uma abertura de imobilização 34 de maiores dimensões que foi aberta na placa de retenção 22 e que é almofadada preferencialmente com um material macio para estofos, tal como uma borracha esponjosa. A abertura 34 serve simultaneamente para aconchegar o pintainho e impedir os seus movimentos quando colocado contra o orifício do injector. A figura 4 é uma vista em perspectiva onde se observa um pintainho a ser vacinado, em conformidade como método aqui descrito, utilizando o dispositivo ilustrado na figura 1. O pintainho é mantido numa posição em que fica de patas para cima, ficando a sua cabeça colocada entre o polegar e os dedos do operador. A zona desejada do pintainho é colocada sobre o orifício do injector (não observável), ficando essa zona alinhada axialmente com a seringa e a agulha, sendo então a seringa activada ao ser impelido o interruptor de disparo 30. De forma facultativa e desejável, é possível prever um dispositivo pneumático que permita que a seringa dispare automaticamente no momento em que o pintainho é colocado na posição devida. A agulha penetra na zona abdominal no local desejado e até à profundidade pretendida.

Deste modo, o pintainho pode ser agarrado firmemente e colocado com a sua cicatriz umbilical voltada para a agulha e com a cabeça para baixo. De preferência, a superfície contra a qual o pintainho é empurrado no momento da injecção (no caso vertente, a placa de retenção de ‘plexiglass’) pode ser modificada de tal modo que o abdómen do pintainho seja impelido contra o material macio, por exemplo, uma borracha esponjosa, com a finalidade de retardar o movimento do pintainho durante a injecção e para facilitar a exactidão da injecção no saco vitelino.

Para não traumatizar um pintainho, a agulha de injecção deve ser inserida no saco vitelino e dele removida perfeita e suavemente. Pode ocorrer uma lesão indesejada do saco vitelino e dos tecidos envolventes, com a subsequente infecção da zona lesionada, se houver movimentos laterais entre a agulha e o local de injecção.

Utilizando o dispositivo injector pneumático, tal como adiante descrito mais minuciosamente, regula-se a agulha de modo a avançar uma distância de aproximadamente 5 mm medida a partir da extremidade da tampa de aço. Devido a certas particularidades, tais como

14 o chanfro da agulha, a espessura das penas do pintainho e quaisquer pequenas bolsas de ar que eventualmente possa haver, tendo ainda em conta a ligeira retracção que tem lugar quando o pintainho é vacinado, considera-se que o avanço da agulha de 5 mm para além da extremidade do dispositivo permite que esta penetre realmente a uma profundidade compreendida entre 1 e 2 mm no abdómen do pintainho.

Conforme adiante se descreve mais minuciosamente nos exemplos, o tamanho do saco vitelino mantém-se aproximadamente constante durante o período de 24 horas a seguir à eclosão dos ovos chocados e depois vai perdendo peso a uma razão praticamente uniforme. De forma correspondente, a massa corporal do pintainho varia muito pouco durante este período de 24 horas, mas a seguir aumenta a um ritmo praticamente uniforme. De forma desejável, a injecção dentro do saco vitelino tem lugar aproximadamente nas primeiras 24 horas, uma vez que depois de decorridas essas primeiras 24 horas o saco vitelino fica mais estreito e mais pequeno e consequentemente é mais difícil localizá-lo com exactidão.

Seguidamente procede-se à descrição de alguns exemplos ilustrativos que não fazem parte da presente invenção. EXEMPLOS Exemplo 1

Anatomia e Fisiologia do Saco Vitelino

Efectuou-se uma avaliação para determinar o tamanho, a localização e os parâmetros de absorção do saco vitelino em pintainhos recém-nascidos e a partir de tal avaliação foram determinados os parâmetros preferenciais que permitem utilizar o saco vitelino como local para a administração de medicamentos. 15 15 ✓ /<

Antes de mais, foram adquiridos 360 ovos galados (Arbor Acres X Peterson) numa empresa avícola do Mississipi. Os ovos foram chocados numa chocadeira de ar forçado, de tipo comercial. Foram mantidos os valores normais de temperatura e de humidade de choco durante todo o período de choco. O resultado do processo foi excelente, tendo havido mais de 95% de ovos férteis em que ocorreu a eclosão. Os pintainhos recém-nascidos revelaram um excelente estado de saúde, sem nenhuns sinais de doenças.

Efectuou-se uma selecção aleatória de vinte e cinco (25) pintainhos em função das suas massas corporais (“MC”) e das correspondentes massas dos sacos vitelinos (“MSV”) ao fim de 0, 12 e 24 horas após a eclosão dos ovos. Estes pintainhos foram mantidos numa incubadora até ao momento definido de amostragem. Além disso, houve outros 215 pintainhos que foram retirados da incubadora 12 horas após a eclosão dos ovos e que foram colocados em gaiolas de aviário. Efectuou-se a pesagem de vinte e cinco (25) destes pintainhos que foram sacrificados para determinação das MSV decorridas 24, 48, 72, 96 e 120 horas após a eclosão dos ovos.

Durante o período de crescimento de 5 dias os pintainhos foram alimentados com uma dieta convencional de milho e soja para o período inicial de vida, a qual continha energia me-tabolizável à razão de 1425 kcal/libra (3139 kcal/kg) e 20% (em peso) de proteínas, estando satisfeitas todas as necessidades nutricionais conhecidas, na dose certa ou em excesso. Foram utilizadas criadeiras artificiais alimentadas a gás propano e também criadeiras aquecidas por infravermelhos. A área disponível para cada pintainho nas gaiolas era aproximadamente de 0,75 ft2 (0,23 m2). Como cama para as aves foram utilizadas aparas e cavacos de pinheiro. A iluminação foi obtida a partir de lâmpadas incandescentes e o fotoperíodo foi de 23 HLD (23 horas de luz por dia). Tais condições ambientais tiveram como resultado uma produção consistentemente superior nesta instalação.

Os valores das MC e das MSV estão expressos adiante em gramas, tendo sido calculados os valores relativos entre as MSV (“MRSV”) e as MC, estando os valores expressos em gramas de MSV/100 g de MC. As correlações estatísticas entre os valores das MC e das MSV durante o período da experiência foram calculadas em conformidade com os Procedimentos dos Modelos Lineares Gerais do Sistema de Análise Estatística (Statistical User’s Guide, 1985, SAS Institute, Inc., Cary, NC). QUADRO 1

Horas após a eclosão dos ovos Chocadeira Aviário X±D.P. 0 12 24 24 48 72 96 120 MC 47,04 45,80 46,67 47,87 53,24 59,60 71,28 81,96 ±0,69 ±0,55 ±0,75 ±0,72 ±0,75 ±1,01 ±1,01 ±1,35 MSV 7,90 7,30 6,41 6,77 3,56 1,94 1,28 0,95 ±0,25 ±0,24 ±0,25 ±0,32 ±0,24 ±0,23 ±0,22 ±0,09 MRSV 16,76 15,88 13,64 14,04 6,61 3,23 1,80 1,18 ±0,43 ±0,42 ±0,38 ±0,52 ±0,40 ±0,37 ±0,24 ±0,13

Os resultados tabelados dos valores de MC, MSV e MRSV estão agrupados no quadro 1. A apresentação gráfica dos resultados simplificados está contida nas figuras 5 e 6. O crescimento, tal como indicado pelos valores das MC ao fim de 24 horas após a eclosão dos ovos, medidos nas aves que foram mantidas nas chocadeiras permanentemente e também para as aves que foram mantidas nas chocadeiras durante 12 horas e depois colocadas no aviário durante mais 21 horas foram quase idênticos. No entanto, depois de ter começado

I

17 o crescimento, foi evidente um aumento quase linear dos valores das MC durante todo o período de crescimento de 5 dias a seguir à eclosão dos ovos.

Durante as primeiras 24 horas, a absorção do saco vitelino após a eclosão dos ovos, conforme indicado pelos valores das MSV e das MRSV, agrupados no quadro 1, e a percentagem de absorção do saco vitelino, indicada na figura 2, foi aproximadamente de 20% (em peso). Houve uma maior absorção do saco vitelino no período decorrido entre as 24 e as 72 horas após a eclosão dos ovos. No entanto, no final do período de observação de 120 horas ainda havia cerca de 10% (em peso) do saco vitelino. Estes resultados indicam que o saco vitelino só é completamente absorvido ao fim de cerca de 5 dias após a eclosão dos ovos.

Conforme se observa na figura 1, verificou-se a existência de uma relação negativa evidente entre os valores das MC e das MSV. Dito de outra forma, à medida que aumentou a MC, diminuiu a MSV. A comparação estatística destes parâmetros indicou a existência de uma correlação negativa significativa (r) com o valor de -0,71. E evidente que a absorção do saco vitelino começa antes de ter início o crescimento; no entanto, depois de começar o crescimento, há uma absorção rápida e contínua do saco vitelino.

Efectuou-se uma avaliação do aspecto geral dos sacos vitelinos nas necrotomias. Decorridas 0, 12 e 24 horas após a eclosão dos ovos, o saco vitelino enche uma grande parte da cavidade abdominal. O saco vitelino era achatado e cobria geralmente toda a superfície ventral da cavidade. No entanto, decorridas 48 horas após a eclosão dos ovos, o saco vitelino tinha um aspecto mais alongado. Simultaneamente, a estrutura abdominal mais proeminente era a moela. O saco vitelino não cobria a moela; em vez disso, o saco vitelino ocupava uma posição posterior à moela. Ao mesmo tempo, o saco vitelino tinha adquirido a forma de uma estrutura mais comprida e mais espessa. Nas necrotomias realizadas em momentos posteriores, o saco vitelino apresentou-se com menores dimensões e arredondado, de forma esférica. Uma observação final, em todos os momentos das necrotomias, permitiu confirmar que o saco vitelino se apresentava tipicamente raiado com uma substância esverdeada. Estes resultados comprovam nitidamente que o saco vitelino atinge o seu tamanho máximo imediatamente após a eclosão dos ovos e que esse tamanho é mantido pelo menos durante 24 horas após a eclosão dos ovos.

Além disso, o saco vitelino assume um aspecto achatado e cobre a maior parte da superfície abdominal ventral durante as primeiras 24 horas após a eclosão. A injecção numa zona com o tamanho de um quarto (2 cm de diâmetro), ficando a cicatriz umbilical a meia distância entre o ponto central e a posição das 12 horas do círculo, vai garantir a penetração no saco vitelino. Decorridas 24 horas após a eclosão dos ovos, passa a ser mais difícil acertar no saco vitelino por injecção intraumbilical devido ao facto de o tamanho e a forma do saco vitelino estarem a mudar continuamente. O saco vitelino pode acomodar facilmente um volume de injecção de cerca de 1 mL durante o período de 0 a 24 horas após a eclosão dos ovos. Tomando por base a cinética da absorção, se o medicamento for formulado de modo a ser retido pelo saco vitelino, então o composto pode ser doseado na corrente sanguínea pelo menos durante 5 dias e possivelmente pelo menos durante cerca de 10 dias. Estas estimativa baseia-se na descoberta do facto de apenas estar completada uma absorção de 90% do saco vitelino ao fim de 120 horas (5 dias) após a eclosão dos ovos. Efectuando a extrapolação desta curva verifica-se que são necessários aproximadamente 10 dias para a absorção completa do saco vitelino. A descoberta de uma substância esverdeada no saco vitelino sugeriu a existência de um fenómeno até agora não identificado. De forma concreta, admite-se que a bílis penetre no saco vitelino a partir do intestino, onde pode emulsionar as gorduras, daí resultando uma parte vital do processo digestivo que ocorre dentro do saco vitelino. Isto vem reforçar a teoria já anteriormente descrita que considera o saco vitelino como um possível prolongamento do tracto gastrointestinal nas aves recém-nascidas.

Estes resultados fundamentam o princípio de que a via de injecção intraumbilical, isto é, o saco vitelino, é uma alternativa viável para injecções nas aves recém-nascidas. Os especialistas na matéria têm competência para realizar estudos análogos, tomando em consideração os preceitos aqui explicados, com a finalidade de determinarem parâmetros semelhantes respeitantes à anatomia e à fisiologia do saco vitelino de outras espécies de aves.

Exemplo 2

Administração de Substâncias Experimentais no Saco Vitelino De acordo com uma variante preferida, o método agora descrito de administração intra-saco vitelino (“ISV”), para inocular substâncias no saco vitelino de pintainhos recém--nascidos, pode ser praticado mediante uma ligeira adaptação dos métodos e dos dispositivos presentemente utilizados para a prática dos métodos de injecção convencionais por via subcutânea, isto é, a injecção na parte posterior do pescoço (SQ). Deste modo, é possível administrar injecções por via ISV nas explorações avícolas de tipo comercial, com modificações mínimas ao nível do pessoal existente, do equipamento ou da produtividade. O exemplo presente permite comparar os dois métodos, utilizando pintainhos obtidos em aviários de tipo comercial e preparações directas de vacinas e antibióticos para a doença de Marek. Comparou-se a produtividade conseguida com os pintainhos tratados por ambos os métodos. Os resultados obtidos indicam que o método de administração por via ISV é realmente exequível sob o ponto de vista comercial. 20

Antes de mais, foram adquiridos 3 000 pintainhos (Arbor Acres X Arbor Acres) numa exploração avícola de tipo comercial em Caitago, Mississipi. Os pintainhos foram transportados para o local da experiência num veículo aquecido e foram tratados aproximadamente 24 horas após a eclosão dos ovos.

Foram praticados três tratamentos: 1. pintainhos de contraprova não injectados (“Não-Inj.”), 2. pintainhos injectados subcutaneamente (“SQ”), 3. pintainhos injectados por via intra-saco vitelino (“ISV”).

Os pintainhos Não-Inj não foram tratados e por isso serviram de contraprova para a experiência. Os pintainhos SQ receberam 6 000 unidades formadoras de placas (u.f.p.) da estirpe CEVA de HVT-INOVAC® (vacina de Marek preparada para administração aos frangos, Sanofi Animal Health, Inc., Overland Park, KS) mais 0,2 mg de Garasol® (gentamicina, ASL Laboratories, Schering-Plough Animal Health, Inc., Kenilworth, NJ) em 0,20 mL de diluente CEVA utilizável com vacinas injectáveis em frangos (Sanofi Animal Health, Inc., Overland Park, KS). As injecções foram realizadas na parte posterior dos pescoços em conformidade com as técnicas vulgares de vacinação, utilizando para tal um aparelho de vacinação pneumático automatizado, produzido por Vineland “ViMark” (modelo ViMark). Aplicou-se uma agulha de calibre 20 de modo a poder avançar um comprimento de 5 mm e activou-se a seringa de injecção com uma pressão de ar de 60 psi (libras por polegada quadrada), ou seja 52,8 kg por cm2.

Nas aves injectadas por via ISV foram administradas as mesmas soluções e as mesmas doses que foram administradas às aves injectadas por via SQ. No entanto, a diferença entre tratamentos foi o local de injecção. Instalou-se a agulha de calibre 20 de modo a poder avançar um comprimento de 5 mm para injecção na região umbilical. Isto foi realizado removendo o &

21, interruptor de disparo automático e os blocos de posicionamento dos pintainhos. Assim, o abdómen de cada pintainho ficou colocado sobre o orifício de entrada da agulha na plataforma de injecção. Ao ser activado o interruptor de disparo automático da injecção, a agulha penetrou no abdómen e assim foi efectuada a deposição directa da vacina mais o antibiótico no saco vitelino. A exactidão da injecção, isto é, a percentagem de todas as injecções que realmente penetraram no saco vitelino foi de aproximadamente 97%.

Depois de completadas as vacinações, os pintainhos foram colocados em gaiolas aquecidas num aviário industrial com capoeiras para o crescimento dos frangos. Estas gaiolas foram guarnecidas com aparas recentes de pinheiros para servirem de cama às aves. Cada gaiola estava equipada com uma lâmpada de aquecimento por infravermelhos para aquecer cada ninhada. Além disso, o sistema de regulação ambiental dos habitáculos garantiu uma temperatura ambiente de 85°F ± 3°F (29,4°C ± 1°C) durante as primeiras duas semanas da experiência. Durante o período que medeia entre a 3a e a 5a semanas, manteve-se a temperatura de cada habitáculo no valor médio de 82°F (27,8°C) e durante a 6a semana manteve-se a temperatura do habitáculo no valor médio de 88°F (31,3°C).

Os pintainhos foram alimentados com rações convencionais para a fase inicial de vida e para a fase de crescimento, colocadas à sua disposição ad libitum. A qualquer das rações acrescentou-se o produto ‘Coban®’, que é um aditivo ionóforo alimentar anticoccidiano para os frangos, identificado pela designação “Monensin sodium” (Elanco Production Division, Eli Lily, Co., Indianapolis, IN), à razão de 90 g/ton (99 mg/kg); foram excluídos das rações os antibióticos e outros medicamentos.

Foram colocados 50 pintainhos em cada gaiola, ocupando o seu espaço com uma densidade aproximada de 0,9 ft2 (0,28 m2) por pintainho. Cada gaiola estava equipada com um alimentador de tipo tubular e com um reservatório de fornecimento automático de água potável para os pintainhos. O regime de iluminação foi de luz constante durante as primeiras 2 semanas e depois foi de 23 HLD. A hora de escuridão foi desde a meia noite até à 1 da manhã. A fonte de luz era uma lâmpada incandescente de 40 W para cada gaiola.

Efectuou-se a pesagem dos pintainhos ao 43° dia para determinar o valor final das suas massas corporais. Procedeu-se à determinação das razões de conversão dos alimentos para o período de crescimento de 43 dias. Estas conversões foram ajustadas em função dos animais que morreram. Uma vez que a maior parte das mortes ocorreu durante a 6a semana (devido ao stress térmico), os ajustamentos foram feitos apenas para as mortes verificadas durante este período. Todos os corpos dos animais mortos foram necropsiados para confirmar as causas da morte. O quadro 2 agrupa as massas corporais e as razões de conversão dos alimentos aos 43 dias de idade. Os dados obtidos indicam que os pintainhos Não-ínj tinham massas corporais finais significativamente maiores do que os dois grupos tratados (foram realizadas comparações estatísticas por meio de uma análise unidireccional da variância, que faz parte dos Procedimentos com Modelos Lineares Gerais do Sistema de Análise Estatística ‘Statistical User’s Guide’, 1985; SAS Institute, Inc., Cary, NC). Além disso, os pintainhos injectados por via ISV tinham massas corporais que eram em média 2,38% superiores às dos pintainhos injectados por via SQ. No entanto, não se considerou isto como sendo uma diferença significativa (P < 5%).

As razões de conversão dos alimentos não foram estatisticamente diferentes (P < 5%) entre os três grupos de tratamento. Além do mais, a variância das conversões dos alimentos entre os grupos replicados que constituíam cada grupo de tratamento foi exígua, sugerindo tal facto que a conversão de alimentos foi uniforme.

As A" 23

No quadro 3 estão indicadas as taxas de mortalidade. Efectuou-se o cálculo das taxas de mortalidade em termos da percentagem de mortalidade que ocorreu entre o dia 0 e o 36° dias e entre o 37° e o 43° dias e em todo o período de 43 dias de crescimento. Não foram verificadas diferenças significativas (P < 5%) nas taxas de mortalidade para qualquer um destes períodos. As necrotomias dos corpos das aves mortas revelaram padrões consistentes. No período que medeia entre o dia 0 e o 36° dia as mortes observadas nos pintainhos Não-Inj e nos pintainhos injectados por via SQ foram provocadas por diversos motivos, incluindo as mortes acidentais, as mortes pela fome e as mortes por estrangulamentos intestinais. No entanto, as mortes observadas no grupo injectado por via ISV foram quase exclusivamente provocadas por uma infecção do saco vitelino, induzida por um traumatismo. Durante o período que medeia entre o 37° dia e o 43° dia as mortes observadas nos três grupos foram provocadas geralmente por prostração térmica.

Os resultados obtidos comprovam nitidamente que o método de vacinação dos pintainhos por via ISV pode ser utilizado nas explorações avícolas de tipo comercial. Esta conclusão fundamenta-se no facto de os pintainhos vacinados por via ISV apresentarem massas corporais superiores às dos pintainhos tratados por via SQ, tendo estes sido vacinados pelo método actualmente utilizado nas explorações avícolas de tipo comercial, vulgarizadas em todo o mundo. Além do mais, a conclusão de que os pintainhos Não-Inj tinham massas corporais significativamente superiores às de qualquer ave dos outros grupos vacinados não é surpreendente. O processo de vacinação é traumático para os pintainhos recém-nascidos e não é inesperado um atraso no início do crescimento. No entanto, faz-se observar que nenhum dos pintainhos utilizados neste estudo esteve exposto à doença de Marek. Se tivessem sido expostos a tal doença, os resultados seriam indubitavelmente diferentes. Dito de forma concreta, os pintainhos de contraprova Não-Inj iriam ser sensíveis à doença de Marek, ocorreriam as inevitáveis mortes a ela associadas e seria de prever uma produtividade mínima. QUADRO 2

Massas corporais e razões de conversão dos alimentos nos pintainhos com 43 dias de idade,

vacinados pelos métodos SQ e IS V

Parâmetro Con. Não-Inj.1 Inj. SQ2 Inj. ISV3 MC (lbs) 4,62* 4,37 4,47 (2,1 kg) (1,98 kg) (2,03 kg) C.A.4 -1-^-X 1,85 1,88 1,86

Con. Não-Inj. = não vacinado.

Inj. SQ = pintainhos com 1 dia de idade vacinados no pescoço com 6000 u.f.p. de HVT e 0,2 mg de ‘GarasoF num volume de diluente de 0,2 mL.

Inj. ISV = pintainhos com 1 dia de idade vacinados no saco vitelino com 6 000 u.f.p. de HVT e 0,2 mg de ‘GarasoT num volume de diluente de 0,25 mL. C.A. = conversões de alimentos corrigidas em função do número de pintainhos mortos entre os dias 37° e 43°.

Uma média numa linha do quadro com este símbolo difere significativamente das outras duas médias com uma probabilidade de 5%. QUADRO 3

Taxas de mortalidade (%) dos frangos com 43 dias de idade, vacinados pelos métodos SQ e IS V

Período (dias) Con. Não-Inj.1 Inj. SQ2 Inj. ISV3 0-36 2,8 3,8 3,8 37-43 9,4 4,8 9,0 0-43 -1-xt' 12,2 8,6 12,8

Inj. SQ = pintainhos com 1 dia de idade vacinados no pescoço com 6000 u.f.p. de HVT e 0,2 mg de ‘GarasoT num volume de diluente de 0,2 mL. 3 Inj. ISV = pintainhos com 1 dia de idade vacinados no saco vitelino com 6 000 u.f.p. de HVT e 0,2 mg de ‘GarasoT num volume de diluente de 0,25 mL.

Uma vez que as conversões de alimentos variaram pouco entre os grupos, é possível concluir que os tratamentos não alteram o metabolismo básico. O crescimento e o desenvolvimento, conforme indicado pelas conversões de alimentos, também foram normais em todos os grupos.

As taxas de mortalidade durante as primeiras 5 semanas sugerem que o método de administração por via ISV não induziu um maior nível de mortalidade, comparativamente com o método de administração por via SQ. No entanto, a descoberta, revelada pela necrotomia, de que o traumatismo associado à injecção ocorreu ocasionalmente na região do saco vitelino, vem demonstrar que o método de administração por via ISV tem de ser executado com cuidado particular.

Para fazer diminuir a hipótese de ocorrência de qualquer traumatismo é possível aperfeiçoar o método anteriormente descrito de injecção dos pintainhos por via ISV, utilizando um dispositivo convencional de vacinação de pintainhos, por exemplo, recorrendo à utilização de 26 uma almofada preparada com uma substância macia e flexível, tal como uma borracha esponjosa. A almofada pode ser aplicada de tal modo que impeça, no momento em que os pintainhos são colocados sobre o orifício de entrada da agulha, os movimentos dos pintainhos ao ser realizada a injecção. Verificou-se que este traumatismo era minimizado quando o pintainho não se movia durante a penetração da agulha. O interruptor de disparo pode ser montado na barra de posicionamento, por forma a que a injecção seja desencadeada ao colocar os pintainhos contra essa barra de posicionamento.

Durante a sexta semana deste estudo verificou-se, na instalação industrial experimental no Mississipi, a ocorrência da semana mais quente do Verão. Os relatórios referentes a este sector industrial assinalarem taxas de mortalidade entre 10% e 15% nos frangos prontos para seguirem para o mercado. Foram instaladas 11 ventoinhas na instalação de crescimento com o intuito de maximizar a ventilação do habitáculo. Apesar disso, temperaturas compreendidas entre 100°F e 105°F (entre 37,8°C e 40,6°C) e uma humidade relativa entre 50 e 75% originaram uma taxa média de mortalidade de 11,2% durante este período de grande canícula. Todavia, não houve diferenças significativas (P < 5%) nas taxas de mortalidade entre os diversos grupos de tratamento.

Conforme se pode concluir por estes resultados, o método de administração por via ISV para injecção de medicamentos nos pintainhos recém-nascidos parece ser adaptável às práticas comerciais. O pessoal existente nas explorações avícolas tem capacidade para dominar esta técnica sem que seja necessária nova formação ou nova orientação de natureza exaustiva. A produtividade, isto é, o número de pintainhos injectados por hora (2500 a 4000/hora) não deve ser afectado por este método, uma vez que no método de administração por via SQ é necessário executar as mesmas operações ou operações semelhantes.

Exemplo 3

Comparação Entre Vias de Administração

Efectuou-se uma experiência para determinar a profundidade e o volume óptimos de injecção e bem assim a intensidade de qualquer lesão provocada no saco vitelino.

Pintainhos: foram adquiridos cento e sessenta (160) pintainhos macho recém-nascidos em Choctaw Maid Hatcheiy em Cartago, MS. A cada um dos três grupos de tratamento foram atribuídos cinquenta (50) pintainhos. Procedeu-se à aplicação de agulhas (calibres 20, 22 ou 25) numa rolha para regular a profundidade da injecção para 1, 3 ou 5 mm. As injecções foram realizadas utilizando as agulhas aplicadas em seringas de plástico descartáveis, tendo sido inseridas na região umbilical (envolvente da cicatriz umbilical) para determinar a profundidade desejada de injecção que poderia penetrar no saco vitelino. A seguir a esta determinação efectuou-se uma injecção de uma solução de azul-de-metileno em soluto salino. Escolheu-se o volume determinando qual a quantidade que poderia ser aceite dentro do saco vitelino com perdas mínimas. Os pintainhos foram então sacrificados a seguir à injecção e foram realizadas as correspondentes necrotomias para se determinar se tinha havido lesões e/ou perdas de fluido.

Tratamento 1: contraprovas virtuais

Tratamento la: contraprovas virtuais com agulha suja. Vinte e cinco (25) pintainhos receberam uma injecção virtual (inserção da agulha seguida imediatamente pela sua remoção). A agulha não foi substituída de pintainho para pintainho; assim, presume-se que tenha havido um potencial de contaminação induzida pela agulha. Tratamento lb: contraprovas virtuais com agulha limpa: vinte e cinco (25) pintainhos receberam injecções virtuais e cada injecção foi realizada com uma agulha estéril. 77Í

Tratamento 2: injecções salinas

Tratamento 2a: injecções salinas com agulha suja. Vinte e cinco (25) pintainhos receberam uma dose de soluto salino a 0,85% (profundidade e volume idênticos aos do tratamento 1). As agulhas não foram substituídas entre injecções. Tratamento 2b: injecções salinas com agulha limpa. Vinte e cinco (25) pintainhos receberam uma dose de soluto salino, tendo sido utilizada uma agulha estéril para cada injecção.

Tratamento 3: injecções de glicose

Tratamento 3a: injecções de glicose com agulha suja. Vinte e cinco (25) pintainhos foram injectados com uma solução de glicose a 5% (profundidade e volume idênticos aos do tratamento 1). A agulha não foi substituída entre injecções.

Tratamento 3b: injecções de glicose com agulha limpa. Vinte e cinco (25) pintainhos receberam uma dose de uma solução de glicose a 57%, utilizando uma agulha estéril para cada injecção.

Parâmetros de Medição: apenas foram utilizados pintainhos macho. Procedeu-se à determinação das massas corporais de cada pintainho (identificados individualmente com uma etiqueta no momento da eclosão dos ovos) na altura em que foram agrupados para os tratamentos e aos 13 e aos 35 dias de idade. Foram sacrificados dez (10) pintainhos e foram determinadas as correspondentes MSV para se definir uma linha de referência para os pintainhos recém-nascidos. Depois, três (3) pintainhos de cada grupo de tratamento la,, lb, 2a, 2b, 3a e 3b foram sacrificados para determinação das correspondentes MSV nos três dias a seguir ao tratamento; isto é, foram pesados os sacos vitelinos não absorvidos. Efectuou-se o registo da 29 mortalidade diariamente e efectuou-se a necrotomia de cada pintainho morto, com o intuito de se determinar a causa da morte.

Os pintainhos foram alimentados com uma ração convencional experimental para a fase inicial de vida (ver o exemplo 1) durante os primeiros 10 dias e depois com uma ração convencional experimental de crescimento até terminar a experiência. Estas rações satisfaziam ou excediam todas as necessidades nutricionais conhecidas para alimentar pintainhos, conforme estipulado pelo ‘National Research Council, U.S. Academy of Science’, 1985, Washington, DC. A densidade em aves foi de 0,9 ft2 (0,28 m2) por pintainho nesta experiência, tendo sido colocados cinquenta (50) pintainhos em cada uma das três gaiolas.

Os pintainhos receberam as dietas descritas antes e também água, sendo tudo colocado à sua disposição ad libiíum. A ração da fase inicial de vida foi colocada em folhas de cartão directamente sobre a cama das aves, durante os primeiros três dias. Este procedimento permitiu que os pintainhos recém-nascidos estabelecessem um contacto íntimo com o alimento para assim se maximizar os resultados do processo de estabelecimento de um comportamento alimentar uniforme por parte de todos os pintainhos. A seguir, as rações foram colocadas à disposição dos pintainhos em dispositivos de alimentação tubulares pendurados. A água foi fornecida por reservatórios de distribuição automática de água potável (reservatórios Plasson®, Diversified Imports, D.I. V. Co., Lakewood, NJ). Em cada gaiola havia um dispositivo de alimentação e um reservatório de água. O regime de iluminação consistiu de luz permanente durante os primeiros 14 dias. A seguir, o regime de iluminação passou a ser o de 23 HLD, sendo a hora de escuridão entre a meia noite e a 1 da manha. A fonte de luz foi uma lâmpada incandescente de 40 W em cada gaiola.

Cada gaiola estava equipada com uma lâmpada de infravermelhos que serviu de fonte térmica para cada ninhada. As lâmpadas de aquecimento foram utilizadas conforme necessário durante os primeiros 14 dias para garantir um máximo de conforto aos pintainhos. O habitáculo era uma estrutura de aço prefabricada e instalada sobre uma laje de cimento. As paredes laterais eram resguardos accionados de forma convencional por roldanas e as paredes dos topos e o tecto estavam completamente isolados (valor R = +25). Em cada gaiola foram colocadas aparas recentes de pinheiro que serviram de cama aos pintainhos. Havia ventoinhas de extracção de ar e ventoinhas de insuflação de ar, para renovar a atmosfera, nas extremidades opostas da estrutura referida. A admissão de ar foi forçada através de um espaço repleto de matéria para condicionar o ar (aquecedor ou desumidificador auxiliares) antes deste entrar na circulação geral.

Os sistemas de regulação das condições ambientais do habitáculo garantiram uma temperatura de 85°F ± 3°F (29°C ±1°C) durante os primeiros 14 dias, independentemente da estação do ano, e uma temperatura de 75°F ± 3°F (24°C ± 1°C) durante a parte restante do período de crescimento de seis semanas, independentemente da estação do ano. A regulação da temperatura do habitáculo teve sempre em vista o máximo conforto dos pintainhos.

Os pares de ventoinhas de admissão e de expulsão de ar (montadas em extremidades opostas do habitáculo) foram regulados para trabalharem 15 segundos em cada 10 minutos durante os primeiros 7 dias e durante 45 segundos em cada 10 minutos durante o período que medeia entre o 8o e o 14° dias; a seguir, considerou-se a ventilação como parte do factor de conforto total das aves.

Seguiu-se o programa adiante indicado:

Evento

Dia 0 um total de 160 pintainhos recém-nascidos transportados para a instalação experimental 0 sacrifício de 10 pintainhos e determinação das respectivas MSV, 0 etiquetagem dos pintainhos restantes, determinação das respectivas massas corporais, realização das injecções, distribuição dos pintainhos pelas gaiolas correspondentes, 3 sacrifício dos pintainhos - foram sacrificados 3 pintainhos de cada um dos tratamentos la, lb, 2a, 2b, 3a e 3b, efectuou-se as correspondentes necro-tomias e determinou-se as MC e MSV, 12 determinação das MC de todos os pintainhos e substituição da ração alimentar que passou a ser a ração de crescimento, 45 determinação final das MC, 0-45 verificação diária das aves para garantir uma gestão adequada.

Os resultados estão agrupados nos quadros 4 a 6. No quadro 4 estão indicadas as massas corporais correspondentes aos tratamentos das aves na 2a e na 5a semanas de idade. Um asterisco indica que o valor médio da massa corporal foi estatisticamente diferente dos valores obtidos com outros grupos de tratamento com a mesma idade. O valor médio indicado em cada linha superior do quadro está expresso em gramas, ao passo que o correspondente valor médio entre parênteses está expresso em libras. Não são apresentados os valores das MSV porque não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre os diversos grupos. No quadro 6 apresenta-se uma comparação para todas as aves tratadas com agulhas não estéreis e com agulhas estéreis, independentemente de cada categoria de tratamento. No quadro 7 indica-se a probabilidade de sobrevivência (o número de aves ainda vivas na 2a e na 5a semanas, expresso em percentagem do número de aves vivas no dia 0).

Foram efectuadas comparações estatísticas por análise unidireccional da variância, conforme descrito supra. QUADRO 4

Idade (semanas)

Tratamentos 2 5 gramas (libras) Contraprova 203,1* 1426 (0,45) (3,14) Soluto salino, 0,5 mL 212,1* 1430 (0,47) (3,15) Glicose, 0,5 mL 196,5* 1395 (0,43) (3,07) QUADRO 5 Agulha Idade (semanas) Estado 2 5 gramas (libras) Estéril 203,0 1375 (0,45) (3,08) Não estéril 206,0 1434 (0,45) (3,16) <r

33 QUADRO 6

Idade (semanas)

Tratamentos 2 gramas (libras) 5 Contraprova 93,2 93,2 Soluto salino, 0,5 mL 90,1 90,1 Glicose, 0,5 mL de uma solução a 5% 93,3 92,3 É possível concluir que com a idade de duas semanas os pintainhos que foram injectados com soluto salino eram significativamente mais pesados (P < 5%) do que os que foram injectados com glicose. As massas corporais das aves de contraprova tinham valores intermédios entre os das aves injectadas com o soluto salino e com a glicose. No entanto, às cinco semanas, já não foram observadas diferenças significativas (P < 5%) entre os valores das MC para os três grupos de tratamento.

No quadro 5 estão indicadas as massas corporais das aves em função do facto de se ter utilizado uma agulha estéril ou uma agulha suja. A utilização de uma agulha estéril parece não ter afectado o crescimento das aves.

No quadro 6 estão indicados os resultados correspondentes às probabilidades de sobrevivência. Registou-se para todos os grupos a probabilidade de sobrevivência normal.

Estabeleceu-se um procedimento preferencial para a injecção manual pela via ISV conforme a seguir se descreve: apanhar um pintainho à mão, segurá-lo de tal modo que a região umbilical (umbigo) seja visível; com a outra mão inserir uma agulha com um comprimento de uma polegada (2,5 cm), de calibre 20 ou 22, na zona abdominal, sendo o alvo para a picadela um círculo em tomo do umbigo com um diâmetro não superior a 1 cm. A cicatriz umbilical deve estar entre o centro e a posição das 12 horas do círculo. A profundidade preferida é de 3 mm. Isto pode ser efectuado colocando uma rolha de cortiça sobre a agulha, de tal modo que apenas um aponta de 3 mm da agulha fique exposta. Aplica-se então um golpe seco para perfurar a pele e os tecidos subjacentes que cobrem o saco vitelino. O volume desejável é de 0,5 mL de solução. Este volume, quando injectado, irá originar perdas mínimas a partir do saco vitelino. A agulha é então removida e o pintainho seguinte é injectado. O tempo total necessário para uma injecção manual é de 2 e 3 segundos.

Os resultados desta experiência indicam nitidamente que a administração por via ISV de compostos que obedeçam à classificação “Generally Regarded as Safe “ (GRAS), isto é, solutos salinos e glicose, não foram prejudiciais para os pintainhos com um dia de idade. A maior MC dos pintainhos injectados com soluto salino, com duas semanas de idade, ficou a dever-se provavelmente a um efeito positivo de hidratação. Além do mais, o efeito negativo sobre o crescimento, provocado pela injecção de glicose, ficou a dever-se provavelmente a uma dose de glicose quadre tóxica.

Os resultados obtidos na 5a semana, isto é, o crescimento normal e a probabilidade de sobrevivência, independentemente do tratamento e da esterilidade da agulha, indicam que o método de administração por via ISV é seguro para os frangos criados em recintos de pequenas dimensões.

Exemplo 4

Vacinação contra a Coccidiose em Condições Laboratoriais Adquiriu-se um total de 675 pintainhos recém-nascidos numa exploração avícola em

Filadélfia, MS. Cada pintainho foi etiquetado na asa para facilitar a sua identificação. 35 <r

Os pintainhos foram então distribuídos por grupos de 15 indivíduos, num total de 45 gaiolas. As gaiolas ficaram localizadas em recintos gradeados aquecidos, dispostos sequencialmente.

Os recintos gradeados foram mantidos num compartimento de condições ambientais controladas por forma a garantir temperaturas constantes compreendidas entre 80°F e 85°F (entre 27°C e 29°C). Os recintos gradeados montados sequencialmente estavam equipados com aquecedores regulados termostaticamente e manteve-se a temperatura das ninhadas a 90°F (32°C) durante os dias 0 ao 7o, a 85°F (29°C) desde o 8o dia até ao 14° e a 75°F (24°C) no período subsequente. O compartimento foi iluminado com luminárias fluorescentes penduradas no tecto que proporcionaram uma iluminação contínua.

Os pintainhos dos tratamentos 1 a 8 adiante enumerados foram alimentados ad libitum com uma dieta convencional de milho e soja à qual não se adicionou nenhuma gordura. Esta ração satisfez ou excedeu todas as necessidades nutricionais conhecidas típicas dos pintainhos, conforme estipulado pelo ‘National Research Council, U.S. Academy of Science, Washington, D.C.’ (1985). A dieta alimentar do tratamento 9 era idêntica à dos outros tratamentos com a única excepção de se lhe ter acrescentado ‘BioCox®’ (um produto químico ionóforo anti-coccidiano cujo ingrediente activo é a salinomicina sódica; “Agri-Bio Corp.”, subsidiária de “A.H. Robbis Co.”, Gainesville, GA) à razão de 60 g/ton. (66 mg/kg).

Cada um dos nove tratamentos foi efectuado em 5 gaiolas de pintainhos.

Tratamento Designação Estímulo de vacinação 1 Con. Neg. 0 oocistos Nenhum 2 Con. Pos. 0 oocistos Sim IS V-125 125 oocistos ISV Sim 4 ISV-250 250 oocistos ISV Sim 5 ISV-500 500 oocistos ISV Sim 6 ISV-1000 1000 oocistos ISV Sim 7 Gotas 200 oocistos oralmente Sim 8 ‘CocciVac’ ‘CocciVac’ oralmente Sim 9 ‘BioCox’ ‘BioCox’ oralmente Sim

Os oocistos para os tratamentos 3 a 7, e bem assim os oocistos para todos os estímulos, foram preparados em conformidade com procedimentos experimentais consagrados. Os animais que não foram utilizados neste estudo foram criados em recintos gradeados de quarentena, foram infectados por via oral com oocistos de Eimeria tenella e sacrificados 5 dias após a infecção. Removeu-se-lhes os intestinos que foram lavados para se lhe retirar o conteúdo correspondente que continha os oocistos, tendo estes sido colhidos. Estes oocistos puderam então servir como vacinas ou como estímulos infecciosos.

As vacinações para os tratamentos 3 a 6 foram administradas dentro do saco vitelino utilizando para tal o aparelho de injecção automática ‘Vineland ViMark’, modificado conforme aqui descrito. Estas injecções foram aplicadas no dia 0. O tratamento 7, isto é, a vacinação por gotas, foi efectuada obrigando os pintainhos a ingerir no dia 0 um total de 200 oocistos em 1 mL de água destilada. Para a ingestão forçada utilizou-se uma agulha montada numa seringa de 6 cm3 que foi inserida no esófago de cada ave, junto ao papo, tendo a solução para ingestão forçada sido depositada directamente no papo. O tratamento 8, isto é, a vacinação de ‘CocciVac®’ (uma vacina que contém oocistos contra 4 espécies de Eimeria, a qual é recomendada para ser pulverizada sobre a ração alimentar da fase inicial de vida dos pintainhos, produzida por “Sterwin Laboratories, Inc.”, subsidiários de “Pitman Moore, Co., Millsboro, DE”), consistiu em administrar oralmente, de um modo forçado, a cada pintainho 37 no dia 0 uma quantidade de 0,1 mL de ‘CocciVac’ em 0,9 mL de água destilada. O tratamento 9 não envolveu vacinações, mas em vez disso juntou-se ‘BioCox’ a todas a rações alimentares fornecidas aos pintainhos, na quantidade previamente descrita.

Todos os pintainhos foram estimulados por administração forçada por via oral de 50000 oocistos esporulados (passaram por uma galinha e foram recuperados para se garantir a infectabilidade) em 1,0 mL de água destilada ao 21° dia. Uma vez que houve 5 gaiolas de pintainhos para cada um dos tratamentos, há pois 5 réplicas para cada um desses tratamentos.

Foi praticado o programa a seguir descrito.

Dia Evento 0 adquirir 675 pintainhos e transportá-los para a instalação experimental 0 etiquetar os pintainhos, determinar as correspondentes massa corporais, administrar as injecções e as ingestões forçadas e distribuir os pintainhos pelas gaiolas adequadas, 21 pesar todos os pintainhos e estimulá-los com 50 000 oocistos 28 pesar todos os pintainhos, sacrificá-los e efectuar as correspondentes necrotomias para classificar as lesões, 0-28 verificar as aves diariamente para garantir uma gestão adequada

Foram realizadas as medições a seguir indicadas. (a) Realização de pesagens no momento da eclosão dos ovos, no momento de aplicação do estímulo e novamente ao fim de 8 dias após a aplicação do estímulo inoculante. Mais uma vez se calculou a massa corporal para cada período. (b) Foram atribuídas separadamente as classificações de lesões às bolsa secais esquerda e direita 8 dias após a aplicação do estímulo inoculante. Depois efectuou-se os cálculos para definir a classificação média das lesões para cada pintainho. Determinou-se a classificação das lesões inspeccionando cada bolsa secai e atribuindo-lhe uma /. 38 classificação de uma escala de 0 a 4, em que 0 significa normal, 1 significa vermelhidão ligeira e inchaço; 2 significa sangue evidente no conteúdo secai, 3 significa que o conteúdo secai estava coagulado, inchado e preenchido com resíduos celulares e sangue e 4 significa formação de camicões no lúmen secai com lesões teciduais intensas e formação de escaras. (c) Registou-se diariamente o número de aves mortas e calculou-se as mortalidades antes e após a administração do estímulo inoculante.

Foram realizadas comparações estatísticas recorrendo à análise unidireccional da variância, conforme descrito supra.

Os resultados desta experiência estão indicados no quadro 7. No período anterior à administração do estímulo inoculante, isto é, entre a semana 0 e a 3a semana, as massas corporais e as taxas de mortalidade não foram significativamente diferentes (P < 5%) entre todos os tipos de tratamentos. Tais resultados sugerem que nenhum dos tratamentos afectou prejudicialmente os pintainhos. O ganho de massa corporal, associado aos tratamentos durante as semanas imediatamente subsequentes à administração dos estímulos inoculantes, isto é, 3a e 4a semanas, indica que todos os tratamentos, incluindo o caso das contraprovas negativas, reduziram significativamente esse ganho (P < 5%). No entanto, o ganho nas aves de contraprova positiva não foi significativamente diferente (P < 5%) de um para outro dos tratamentos. Além disso, as taxas de mortalidade durante o período de estimulação, isto é, nas semanas 3a e 4a, não foram significativamente diferentes (P < 5%) entre todos os grupos de tratamento. Estes resultados indicam que todos os tratamentos protegeram os pintainhos por forma a garantir um crescimento normal e uma probabilidade de vida normal.

As classificações sobre as lesões das bolsas secais indicaram que apenas o tratamento 9, isto é, o tratamento com ‘BioCox’, protegeu o intestino de uma forma equivalente à das contraprovas negativas não estimuladas. No entanto, todos os tratamentos por via ISV foram numericamente superiores, mas não de forma significativa (P < 5%), no que diz respeito à protecção do intestino, comparativamente com resultados obtidos com a vacina contra a coccidiose ‘CocciVac’ comercialmente disponível.

Estipulou-se que o forro do intestino deve ser invadido para que se desenvolva o processo de imunidade quando se administra uma vacina coccidiana. No entanto, os agentes ionóforos anticoccidianos impedem os microrganismos Eimeria de penetrarem no revestimento do intestino, pelo que era de prever a ausência de lesões secais. Os ionóforos anticoccidianos podem passar a ser ineficazes se a sua utilização for generalizada, uma vez que as populações de parasitas se tomam resistentes ao fármaco. Esta resistência ao fármaco pode ocorrer aparentemente devido à adaptabilidade genética do parasita em resposta a uma exposição prolongada ao fármaco. QUADRO 7

Resposta dos pintainhos vacinados por via ISV com oocistos espomlados

Tratamento Ganho (g)1 Mort (%)2 Ganho (g)3 Mort (%)4 Classificação (semanas 0-3) (semanas 0-3) (semanas 3-4) (semanas 3-4) das lesões 1 (Con. Neg.) 569a 2,7a 416a 0,0a 0,lb 2 (Con. Pos.) 553 a 0,0 a 379 b 2,0a 3,4 a 3 (ISV-125) 555a 2,7 a 408a 0,0a 3,1a 4 (ISV-250) 555 a 4,0 a 420 a 4,0a 2,7a 5 (ISV-500) 576 a 4,0 a 401a 6,0 a 3,1a 6 (ISV-1000) 596 a 4,0 a 409 a 2,0 a 2,8 a 7 (Gotas) 541a 0,0 a 410a 2,0 a 2,8 a 8 (CocciVac) 541a 0,0 a 391a 2,0 a 3,5 a 9 (Bio-Cox) 578 a 0,0 a 430 a 2,0 a 0,3 b 40

As médias de uma coluna do quadro que possuam sobrescritos diferem significativamente com uma probabilidade de 5%. 1 O ganho de massa corporal entre as semanas 0 e 3a é o aumento de massa corporal que vai desde a eclosão dos ovos até ao momento imediatamente anterior ao estímulo com os oocistos esporulados. 2 A mortalidade entre as semanas 0 e a 3a é a mortalidade cumulativa que vai desde o momento da eclosão dos ovos até ao momento imediatamente anterior à estimulação com os oocistos esporulados. 3 O ganho das semanas 3a - 4a é o aumento da massa corporal durante a semana imediatamente a seguir ao estímulo com os oocistos esporulados. 4 A mortalidade das semanas 3a - 4a é a mortalidade cumulativa durante a semana imediatamente a seguir ao estímulo com os oocistos esporulados.

Exemplo 5

Vacinação Contra A Coccidiose Em Condições Naturais Com Uma Vacina De Tipo Oocistos

Adquiriu-se um total de 400 pintainhos numa exploração avícola em Filadélfia, Mississipi. Os pintainhos foram transportados para o local da experiência num veículo automóvel aquecido e os tratamentos foram efectuados nas 24 horas a seguir à eclosão dos ovos.

Manteve-se os pintainhos numa instalação de crescimento de tipo descrito no exemplo 3. Esta instalação oferece condições que são semelhantes às da maior parte das instalações de criação de frangos existentes nos Estados Unidos da América do Norte. Os procedimentos de trabalho utilizados nesta experiência foram iguais aos descritos anteriormente. 41

Os pintainhos foram etiquetados numa asa e depois distribuídos por 8 grupos de 50 pintainhos cada um. Manteve-se cada gaiola dentro da instalação de crescimento. Foram utilizados 2 grupos para cada um dos 4 tratamentos. Os tratamentos realizados sào os que a seguir se indica:

Tratamento Designação Vacinação Estímulo 1 Con. Neg. 0 oocistos Nenhuns 2 Con. Pos. 0 oocistos Sim 3 ISV 200 oocistos Sim 4 per os (oral) 200 oocistos Sim

Realizou-se a administração dos tratamentos 3 e 4 utilizando um dispositivo automático e pneumático de vacinação de pintainhos, correspondente a um modelo modificado ‘Vineland ViMark’.

No tratamento 3 injectou-se cada pintainho no dia 0 por via ISV com 200 oocistos espomlados (preparados conforme descrito no exemplo 4). No tratamento 4 cada pintainho foi forçado a ingerir por via oral (tal como descrito no exemplo 4) 200 oocistos esporulados.

Manteve-se o programa a seguir indicado.

Dia Evento 0 adquirir 400 pintainhos recém-nascidos e transportá-los para a instalação industrial, 0 etiquetar os pintainhos e determinar as massas corporais e massas dos alimentos, aplicar as injecções e realizar as ingestões forçadas e distribuir os pintainhos pelas gaiolas adequadas, 7 sacrificar 5 pintainhos de cada tratamento para avaliar a absorção do saco vitelino, 21 pesar todos os pintainhos e os alimentos e depois efectuar a estimulação com 50000 oocistos/pintainho, 42 28 pesar todos os pintainhos e os alimentos e depois sacrificar 10 pintainhos de cada gaiola, efectuar as correspondentes necrotomias para determinar as classificações das lesões 36 pesar todos os pintainhos e os alimentos, 0-36 os pintainhos foram observados diariamente para garantir uma gestão adequada

Foram efectuadas as medições a seguir indicadas. (a) Determinou-se a massa corporal no momento da eclosão dos ovos, no momento de aplicação do estímulo inoculante, 8 dias após a aplicação do estímulo e aos 36 dias de idade. Calculou-se o ganho de massa corporal durante o período anterior à estimulação (semanas 0-3a), durante o período da estimulação (semanas 3a-4a) e durante o período final de crescimento (semanas 4a-6a). (b) Procedeu-se à classificação das lesões nas bolsas secais separadas (conforme ante-riormente descrito no exemplo 4) 8 dias após o estímulo (semanas 3a-4a) (c) Efectuou-se o cálculo dos coeficientes de conversão dos alimentos durante cada período do modo seguinte: alimentos consumidos durante o período a dividir pelo ganho de massa corporal durante o período. (d) Procedeu-se ao registo das aves mortas diariamente e efectuou-se o cálculo da mortalidade para cada período.

Foram efectuadas comparações estatísticas recorrendo à análise unidireccional da variância. Os resultados desta experiência estão agrupados no quadro 8. Durante o período anterior ao estímulo inoculante (semanas 0 a 3a) não houve diferenças significativas (P < 5%) nos ganhos das massas corporais, nas taxas de mortalidade e nas conversões dos alimentos.

/í

J 43

Estes resultados indicam que os tratamentos não afectaram o crescimento normal nem a probabilidade de sobrevivência dos pintainhos mais jovens.

No entanto, durante o período de estimulação foram observadas diferenças significativas (P < 5%) entre os ganhos de massa corporal e as classificações das lesões. O ganho de massa corporal nas aves de contraprova positiva foi significativamente menor do que nas aves dos outros tratamentos, tendo os pintainhos tratados por via ISV manifestado um ganho de massa corporal significativamente menor do que o das aves de contraprova negativa e o das aves tratadas por meio de gotas. As classificações das lesões dos pintainhos de contraprova negativa foram significativamente menores (P < 5%) do que nos outros grupos e os pintainhos tratados por meio de gotas manifestaram uma classificação de lesões cujo valor médio é significativamente menor (P < 5%) do que o observado nos pintainhos de contraprova positiva e nos pintainhos tratados por via ISV.

Notou-se um efeito significativo singular (P < 5%) durante o período final de crescimento (semanas 4a - 6a). As aves de contraprova negativa revelaram um ganho de massa corporal menor do que o das aves de contraprova positiva.

Estes resultados indicam que tanto os tratamentos por via ISV como os tratamentos por gotas, comparativamente com os resultados observados nas aves de contraprova, proporcionam uma protecção útil aos pintainhos. O tratamento por meio de gotas conferiu-lhes, de algum modo, uma melhor protecção do que o tratamento por via ISV, o que já era de esperar, uma vez que se sabe que a administração de 200 oocistos no momento preferido, isto é, nos primeiros momentos durante o período pós-natal, confere um grau elevado de imunidade. QUADRO 8

Resultado da vacinação de pintainhos com oocistos por via ISV em condições naturais

Parâmetro Con. Neg. Tratamento Con. Pos. ISV Gotas Ganho (g) (semanas 0-33)1 556a 535 a 532 a 539 a Ganho (g) (semanas 3a-4a)2 395 a 343c 365 b 393 a Ganho (g) (semanas 4a-6a)3 856 b 922 a 872ab 880ab Mort. (%) (semanas 0-3a)4 2,0 a 2,0 a 2,0 a 2,0 a Mort. (%) (semanas 3^43)3 0,0 a 2,0 a 0,0 a 0,0 a Mort. (%) (semanas 4a-6a)6 0,0 a 0,0 a 0,0 a 0,0 a CA (semana 0-3a)7 1,66 a 1,66 a 1,64 a 1,66 a CA (semanas 3a-4a)8 1,86 a 2,06 a 1,96 a 1,87a CA (semanas 4a-6a)9 2,40 a 2,25 a 2,37 a 2,36 a Classificação de lesões (semanas 3a-4a) 0,49c 3,04 a 3,30a 1,47 b

As médias de uma linha do quadro, isto é, para cada parâmetro, que possuam sobrescritos diferentes diferem significativamente com uma probabilidade de 5% 1-3 O ganho das semanas 0-3a é o aumento da massa corporal antes do estímulo inoculante; o ganho das semanas 3a-4a é o aumento de massa corporal durante a semana imediatamente a seguir ao estímulo; e o ganho nas semanas 4a-6a é o aumento da massa corporal durante as últimas duas semanas da experiência. 4-6 A mortalidade nas semanas 0-3a é a mortalidade cumulativa antes do estímulo; a mortalidade nas semanas 3a-4a é a mortalidade cumulativa durante a semana imediatamente a seguir ao estímulo; e a mortalidade nas semanas 4a-6a é a mortalidade cumulativa durante as duas últimas semanas da experiência. CA Designa a taxa de conversão dos alimentos, isto é, a quantidade em gramas de alimentos consumidos por cada grama de aumento da massa corporal. CA nas semanas 0-3a é 45 a conversão de alimentos antes do estímulo, CA nas semanas 3a-4a e a conversão dos alimentos durante a semana imediatamente a seguir ao estímulo e CA nas semanas 4a-6a é a conversão de alimentos durante as duas últimas semanas da experiência.

Exemplo 6

Vacinação Contra A Coccidiose Em Condições Naturais Com Uma Vacina De Esporozóitos Os esporozóitos foram considerados como elegíveis num método preferencial enquanto componentes activos de uma vacina contra a coccidiose. Os esporozóitos constituem a fase infecciosa do parasita. Significa isto que ao serem injectados os oocistos, as condições acídicas conjuntamente com as enzimas digestivas do intestino excisam os oocistos e os esporozóitos são libertados. Esta forma de vida do género Eimeria é capaz de infectar as células epiteliais destinatárias no intestino. Os esporozóitos são capazes de atacar e penetrar nos linfócitos T que se encontram em ligação perfeita com o forro epitelial do intestino. As células T podem então iniciar o processo de imunidade celular.

Nesta experiência utilizou-se um total de 1000 pintainhos. Estes pintainhos foram adquiridos numa exploração avícola em Filadélfia, MS. Os procedimentos de trabalho utilizados nesta experiência são os descritos antes (exemplo 3).

Colocou-se 50 pintainhos em cada uma de 20 gaiolas numa instalação de criação. Foram destinadas 5 gaiolas aleatoriamente para cada um dos 4 tratamentos. Assim, houve 5 réplicas para cada tratamento.

Os 4 tratamentos realizados são os que a seguir se descreve.

Tratamento Designação Vacinação Estímulo 1 Con. Neg. Oocistos ou esporozóitos Nenhum 2 Con. Os. Oocistos ou esporozóitos Sim 3 ISV Gotas esporozóitos de 200 oocistos 200 oocistos oralmente

Sim Sim

No tratamento 3, isto é, os pintainhos tratados por via ISV, cada ave recebeu 200 esporozóitos recolhidos mediante a excisão de 200 esporozóitos. O procedimento de excisão foi realizado conforme descrito por Hofmann e Raether (Parasitol. 76:479-486 (1990)). Colocou-se um determinado número de oocistos num tubo de centrifiigadora e efectuou-se a centrifugação até se obter uma massa agregada. Decantou-se o sobrenadante e substituiu-se por uma solução salina de Hanks equilibrada (SSHE, o mesmo que HBSS). Introduziu-se na suspensão de oocistos esférulas de vidro com 1 mm de diâmetro e efectuou-se a centrifugação numa centrifugadora até romper todos os oocistos. Lavou-se então os esporozóitos libertados, sem as esférulas de vidro, e depois efectuou-se a centrifugação num tubo de centrifugadora para se obter uma massa agregada. Colocou-se então os esporozóitos em 100 mL de SSHE contendo 0,25% de tripsina e 4% e ácido taurodessoxicólico. Realizou-se a incubação da suspensão num banho de água agitada durante 20 minutos à temperatura de 41°C. A seguir efectuou-se a centrifugação dos esporozóitos até se obter uma massa agregada, colocou-se novamente em suspensão em SSHE e utilizou-se o produto obtido como vacina. No tratamento 4, isto é, os pintainhos tratados com gotas, cada ave recebeu 200 oocistos esporulados, por administração oral forçada, conforme anteriormente descrito (exemplo 4).

Os tratamentos 2, 3 e 4 foram praticados ao 21° dia por administração oral forçada à razão de 50 000 oocistos/pintainho.

Foram efectuadas as medições a seguir indicadas: (a) determinação das massas corporais no momento da eclosão dos ovos, no momento do estímulo inoculante e 8 dias após o estímulo, (b) classificação das lesões conforme indicado no exemplo 4) 8 dias após o estímulo numa gaiola de pintainhos para cada tratamento, (c) registou-se o número de aves moitas diariamente e procedeu-se ao cálculo das taxas de mortalidade antes e após o estímulo, (d) efectuou-se o cálculo das taxas de conversão dos alimentos (ver o exemplo 5) antes e após o estímulo.

Praticou-se o programa a seguir descrito

Dia Evento 0 obter 1000 pintainhos recém-nascidos e transportá-los para a instalação experimental, 0 etiquetar os pintainhos, determinar as massas corporais e dos alimentos, administrar as injecções e a alimentação forçada e distribuir os pintainhos pelas gaiolas adequadas, 21 determinar a massa corporal de todos os pintainhos e dos alimentos e depois efectuar a estimulação à razão de 50 000 oocistos/pintainho, 28 determinar as massas corporais de todos os pintainhos e dos alimentos e depois sacrificar os pintainhos de uma gaiola de cada tratamento e a seguir efectuar as correspondentes necrotomias para estabelecer a classificação das lesões, 0-28 os pintainhos foram observados diariamente para garantir uma gestão adequada.

Foram realizadas comparações estatísticas por análise unidireccional da variância, conforme descrito antes. Os resultados desta experiência estão agrupados no quadro 9. Antes do estímulo, todos os pintainhos cresceram com uma taxa estatisticamente semelhante e não houve diferenças significativas (P < 5%) nas taxas de mortalidade e também nas taxas de 48 conversão dos alimentos. Estes resultados sugerem que a vacina de tipo esporozóito não afectou o crescimento, o desenvolvimento ou a probabilidade de sobrevivência dos pintainhos durante o primeiro período de desenvolvimento.

Durante o período do estímulo foram observadas diferenças significativas (P < 5%) entre os pintainhos dos diversos tratamentos. As aves de contraprova positiva ganharam significativamente menos massa corporal do que as aves dos outros grupos. E interessante notar que os outros três grupos não foram estatisticamente diferentes. As classificações das lesões no grupo de contraprova negativa foram significativamente inferiores (P < 5) às dos outros grupos, e nos grupos dos tratamentos por via ISV e por gotas, embora não fossem significativamente diferentes umas das outras, foram significativamente inferiores às do grupo de contraprova positiva.

Estes resultados indicam que os pintainhos protegidos com a vacina de esporozóitos é tão boa quanto o tratamento com gotas contendo os oocistos e é ainda melhor do que a vacina de oocistos. Estes resultados sugerem que ao serem utilizados esporozóitos para vacinar pintainhos com 1 dia de idade pela via intra-saco vitelino, a imunidade se desenvolve logo às 3 semanas para proteger as aves contra qualquer estímulo com oocistos vivos. Esta protecção foi comparável àquela que é conseguida pela vacinação por gotas contendo 200 oocistos na fase inicial de vida. Estes resultados sugerem que a vacinação por via ISV com esporozóitos constitui um procedimento exequível e comercialmente vantajoso. QUADRO 9

Resultado Da Vacinação De Pintainhos Com Esporozóitos Por Via IS V Em Condições Naturais

Parâmetro Con. Neg. Tratamento Con. Pos. ISV Gotas Ganho (g) (semanas 0-3a)‘ 37 7a 432 a 402 a 401a Ganho (g) (semanas 3a-4a)2 303 a 231b 291a 313a Mort. (%) (semanas 0-3a)3 3,0 a 5,0 a 10,0 a 9,0 a Mort. (%) (semanas 3a-4a)4 0,0 a 6,0 a 1,0 a 0,0 a CA (semanas 0-3a)5 1,95 a 1,85 a 2,01a 1,93 a CA (semanas 3a-4a)6 1,88 a 3,09 a 2,17a 1,98 a Classificação de lesões (semanas 3a-4a)7 0,lc 3,7a 2,4 b 1,9 b a_c As médias indicadas numa linha do quadro, isto é, para cada parâmetro, que possuam sobrescritos diferentes diferem significativamente com uma probabilidade de 5% 12 0 ganho (semanas 0-3a) é o aumento da massa corporal antes do estímulo inoculante; o ganho (semanas 3a-4a) é o aumento de massa corporal durante a semana imediatamente a seguir ao estímulo. M A mortalidade (semanas 0-3a) é a percentagem de mortalidade cumulativa durante o período antes do estímulo; e a mortalidade (semanas 3a-4a) é a percentagem de mortalidade cumulativa durante a semana imediatamente a seguir ao estímulo. 3-6 CA (semanas 0-3a) é a taxa de conversão dos alimentos durante o período anterior ao estímulo e CA (semanas 3a-4a) é a taxa de conversão de alimentos durante a semana imediatamente a seguir ao estímulo. 7 A classificação das lesões nas semanas 3a-4a é a classificação das lesões médias durante a semana imediatamente a seguir ao estímulo. 50

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Os exemplos descritos antes têm por finalidade ilustrar aspectos relacionados com a invenção mas não fazem parte, de forma alguma, da presente invenção.

Lisboa, 21 de Março de 2000

\genio ΟΠ c'c; Pfo^isdscb Industriai

Claims (8)

1. Reivindicações 1. Utilização de uma vacina, de um probiótico, de um agente estimulador do crescimento ou de um agente modificador da função sexual para a preparação de um medicamento para injecção no saco vitelino de aves domésticas recém-nascidas.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o medicamento é uma vacina.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 2, em que o medicamento é uma vacina para a coccidiose.
4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 3, em que a vacina é seleccionada entre o grupo constituído por oocistos e esporozóitos do género Eimeria.
5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o medicamento é um agente que estimula o crescimento, seleccionado entre o grupo constituído por hormona do crescimento, hormona libertadora da hormona do crescimento, factores de crescimento de tipo I e Π de tipo insulínico, interleucinas das aves (v.g., a IL2), factores de crescimento dos nervos, hormona de libertação da tiroxina, hormona estimuladora da tiroxina, monoiodotirosina, diiodotirosina, triiodotironina, tiroxina e corticosterona.
6. 6. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que 0 medicamento é um agente modificador da função sexual, seleccionado entre 0 grupo constituído por: substância inibidora 2 da medularina, 17-P-estradiol, estrona, estrogénio, progesterona, testosterona, epian-drostenodiona, hormona libertadora da gonadotropina, hormona estimuladora dos folículos, hormona de luteinização e prolactina.
7. 7. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o medicamento é útil para o tratamento de uma doença das aves, sendo tal doença seleccionada entre o grupo constituído por cólera, colibadlose, varicela, bronquite infecciosa, doença bolsai infecciosa, laringotraqueite, complexo da leucose, doença de Marek, leucose linfóide, reticuloendeteliose, doença linfoproliferativa, doença de Newcastle e artrite virai.
8. 8. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7, em que a injecção é realizada ao fim de cerca de 24 horas depois de o pintainho ter saído da casca do ovo. Lisboa, 21 de Março de 2000

   1250 LISBOA