PT605700E - Composicao farmacutica a base de flavopereirina e sua utilizacao no tratamento contra o virus hiv - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

“COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA À BASE DE FLAVOPEREIRINA E SUA UTILIZAÇÃO NO TRATAMENTO CONTRA O VÍRUS HIV” A presente invenção refere-se à utilização antiviral da flavopereirina. Refere-se mais particularmente a uma composição farmacêutica que contém como único princípio activo a flavopereirina e a sua utilização para o tratamento no homem das infecçoes virais, em particular, tais como as provocadas pelo vírus da imunodeficiência humana HIV. A flavopereirina é um alcaloide da classe das beta-carbolinas. É igualmente denominada classicamente “composto H ou PR 100” e apresenta uma fluorescência UV de emissão a 250-254 e 306 nm.

Pode-se obter a partir da casca de Pao Pereira, Geissospermum vellosii-Baillon Apocynaceae [ver H. Rapoport e col. (J. Am. Chem. Soc. 80, 1601-1608 (1958) e M. Beljanski e J. Bugiei: pedido do Io certificado de aditamento n° FR 2450607 ao pedido de patente francesa n° FR 2419726 e Patente Europeia n° EP A 0 069 817].

Conhece-se que a flavopereirina administrada em doses de 200-600 μg por via intra-dérmica ou de 2,5-500 mg/dia, de preferência 30 mg/dia impede o aparecimento e o desenvolvimento de pápulas virais no caso de vírus do tipo do de fibroma de Shope e da vacina.

Conhece-se igualmente que a flavopereirina é suposta agir in vivo contra o vírus da gripe (vírus de ARN) e que não pode por outro lado inibir a multiplicação do vírus do mosaico do tabaco (VMT) aquando de um breve contacto com este vírus. A patente europeia n° EP-A-0 059 817 divulga por outro lado que a flavopereirina é activa contra o vírus da gripe, mas que a meia-vida de uma tal beta-carbolina quaternária é demasiadamente curta para que ela possa ser administrada eficazmente no homem sob uma forma galénica sem que os micro-grãos tenham efeito retardado. A patente francesa n° FR 2639830 descreve quanto a isso um sistema de melhoramento da defesa imunitária nos seres humanos (contra os vírus ARN-SIDA em particular - e os vírus de ADN). De acordo com esta patente a inibição da multiplicação dos vírus em causa não é possível senão por um sistema de quatro substâncias diferentes, em que a flavopereirina não é mais que uma delas. A composição farmacêutica assim divulgada compreende obrigatoriamente pelo menos um representante de cada uma destas quatro categorias de substâncias activas. A flavopereirina compreendida num tal sistema composto é administrada numa dose de 0,25 a 1 g/dia, de preferência por via oral.

Foi agora verificado de forma inesperada que a flavopereirina pode constituir ela própria um princípio activo eficaz na luta contra o vírus HIV nos mamíferos, incluindo o homem. Foi mais particularmente verificado que a flavopereirina é um princípio activo que sozinho exerce, quer in vitro quer in vivo, uma acção de inibição selectiva sobre a infecção virai pelo HIV, especialmente nos pacientes infectados por HIV-1. A presente invenção tem assim por objecto a utilização de uma composição farmacêutica para a obtenção de um medicamento destinado ao tratamento das infecções virais por HIV, compreendendo a flavopereirina como único princípio activo, vantajosamente sob uma forma sólida contendo por dose unitária cerca de 500 mg de flavopereirina ou de um dos seus sais ou outros derivados farmacologicamente aceitáveis.

Esta invenção será melhor compreendida após a seguinte descrição, na qual os ensaios e experiências relatados são dados apenas a título indicativo e não limitam de forma alguma a invenção. 2 A flavopereirina não tem efeito tóxico nem efeitos secundários nos mamíferos, incluindo o homem. A DL50 na ratazana Spague-Dawley EOPS é de 10,45 g/kg (intervalo confiança: 9,63 a 11,35) por via oral e de 2,46 g/kg (intervalo confiança: 2,35 a 2,55) para uma administração intraperitioneal. O animal morre nos 30 a 60 minutos seguintes à administração oral ou intraperitioneal, por paragem respiratória. Não foi observada morte diferida durante os 14 dias seguintes.

Uma administração sub-crónica por via oral nas ratazanas Spague-Dawley machos e fêmeas (OFA) demonstrou ausência de toxicidade a doses iguais a 1/20 de DL50 (ou seja 530 mg.kg^.d"1) ou a 1/5 de DL50 (seja 2120 mg.kg^.d'1). Com estas doses não foram detectadas modificações nem no peso corporal nem na perda de apetite. Também não se manifestaram alterações no número de glóbulos sanguíneos e as funções hepáticas e renais mantiveram-se normais. Não foi observado ao microscópio qualquer lesão no fígado, nos rins, no duodeno, no miocárdio da ratazana, nas glândulas tiróides e paratiróides, nos testículos e nos ovários. A flavopereirina transpõe a barreira hematoencefálica, uma vez que foi demonstrado o facto de que nos ratos machos CDI que receberam 10 mg deste composto por via oral, o teor encefálico em flavopereirina era de cerca de 7 μg (ou seja uma concentração de 14 μg/g, para ratos de 20g com uma massa encefálica que pesava 0,5 g).

Na prática prepara-se a flavopereirina, em vista da sua utilização de acordo com a presente invenção, por exemplo por hidrólise em HC1 IN de pó de Geissospermum vellosi a 100a C, seguido de uma neutralização por KOH, de uma extracção de etanol e de uma redução por destilação. Retoma-se de seguida o resíduo da destilação com o clorofórmio, elimina-se o excesso de sais por precipitação a frio na presença do etanol e concentra-se o resíduo, que contém essencialmente a flavopereirina.

Para os objectivos da presente invenção, a flavopereirina pode ser utilizada quer como se encontra, quer sob a forma de um sal ou outro derivado farmacologicamente aceitável. 3

Foram realizados os seguintes ensaios farmacológicos, correspondentes à indicação terapêutica acima referida.

Eles são completados pelas figuras anexas, em que: A Fig. 1 representa um gráfico que mostra as contagens comparadas de células/ml em função do tempo em horas a seguir à infecção, sendo a adição de flavopereirina (denominada por “H”) efectuada 12 horas após a infecção; A Fig. 2 representa as quantidades comparadas das unidades infecciosas (em Ul/ml) em função do tempo em horas a seguir à infecção, sem adição do composto H e com adição deste respectivamente à razão de 30 e 60 μg/ml. A Fig. 3 representa sob a forma de diagramas o efeito do produto H (flavopereirina) na produção de interleucina-6 por monócitos humanos provenientes de doadores sãos. A Fig. 4 representa sob a forma de diagramas o efeito do produto H sobre a produção espontânea de interleucina-6 por monócitos humanos provenientes de pacientes seropositivos.

Efeito antiviral contra HIV da flavopereirina A destruição do HIV nas células em cultura in vitro sem efeito sobre as células normais ou sãs foi demonstrada pela utilização da estirpe H-9 dos linfócitos T4 obtidos junto do Dr. R. Gallo pelo Paul Ehrlich Institute (Francoforte, Alemanha) e passada ao Instituto fur Medizinische Mikrobiologie und Hygiene (Universidade de Berna, Suíça). O HIV foi obtido ao mesmo tempo que o HTLV III junto do Dr. Gallo e propagado nas células H-9 acima mencionadas. O sobrenadante proveniente da cultura das células H-9 infectadas foi armazenado a -80°C. Este sobrenadante tem uma concentração de 106 Ul/ml quando se utilizava. As células H-9 foram cultivadas num meio RPMI 1640 contendo 15% de soro de bezerro fetal, 0,002 pg de glutamina e 100 UI de penicilina/ml em frascos de Falcon (25 cm ). Foram utilizados 8 a 20 ml de meio por frasco. Os frascos foram colocados a incubar a 37°C, em posição direita. A cultura iniciou-se a uma concentração de 4 2x10° células H-9 por ml e dividida quando o número de células atingia lxlO6 células/ml. Para testar a flavopereirina nas culturas de células H-9 infectadas e não infectadas, utilizaram-se placas de microtritulação. Neste caso, as culturas iniciaram-se a uma concentração de 6x105 células/ml. Após 23 horas de incubação juntaram-se, a cada alvéolo contendo 0,1 ml desta suspensão celular, 0,1 ml de meio RPMI 1640 contendo 102 UI de VIII. Tal corresponde a uma multiplicidade de infecção de 1,6 x 101, ou seja uma unidade infecciosa para 500 células. 16 horas após a infecção, juntaram-se nos alvéolos infectados e nos alvéolos não infectados 0,1 ml de meio RPMI 1640 com ou sem flavopereirina. A flavopereirina foi utilizada na concentração de 30 pg e de 60 pg/ml. As placas de microtritulação foram recobertas com uma cobertura de placas de Amersham e foram incubadas a 37°C. As contagens celulares foram determinadas numa câmara de Neubauer. Determinou-se a quantidade total de antigénio de HIV utilizando-se uma camada ou um feixe de antigénio de HIV fornecido pela sociedade Abbott Laboratories. Para a titulação, foi pré diluído um volume de 10 pg (proveniente de cada um dos alvéolos da placa de microtritage) em 1 ml de meio RPMI 1640. Fez-se a partir deste conjunto 8 diluições em série respectivamente de 1 a 3 e de 1 a 5. Foi previamente retirado um volume de 0,1 ml de cada diluição e junto a 0,2 ml de uma cultura pré incubada de células H-9 contendo 5 x 105 células/ml. Após incubação a 37°C, a presença de antigénio de HIV foi testada por meio de um conjunto de antigénio de HIV fornecido pela sociedade Abbott Laboratoires.

Os resultados reproduzidos sob forma gráfica na figura 1 aqui anexa mostram que a flavopereirina não afecta a multiplicação de células não infectadas.

Ao contrário, a quantidade de células infectadas é de cerca de 40% inferior na presença da flavopereirina. 5 0 que é ainda mais impressionante é que (ver a apresentação dos resultados na figura 2), embora houvesse um aumento de partículas virais de células infectadas não tratadas com o tempo, não foi possível, nos limites do teste aplicado, detectar a presença de unidades infecciosas além de 3000 nas séries de células infectadas tratadas com a flavopereirina (30 μg ou 60 pg). Tal facto mostra que a inibição da infecção ultrapassa pelo menos 99%.

Foi igualmente efectuada uma avaliação do efeito antiviral da flavopereirina por estudo do efeito citopatogénico do vírus de HIV nas células MT4, sendo certo que foi observada uma formação de sincitia 4 a 6 dias após a infecção por HIV 1, seguida da morte das células. A flavopereirina foi utilizada sob a forma de uma solução alcoólica (40 mg em 100 pg de álcool). Foram feitas diluições no meio RPMI a 10% de TCS, 1% de PSN, 1% de glutina. As células MT4 foram colocadas a pré-incubar durante duas horas a 37°C com uma diluição sucessiva de flavopereirina contendo 3 x 105 células para 10 pg de solução de flavopereirina. Foi obtida a solução juntando 100 pg de uma diluição por 10' do vírus HIV-1, produzindo uma formação de cincitia em 4 a 6 dias. Após 1 hora de incubação a 37°C, as células MT4 infectadas foram lavadas 3 vezes com um meio RPMI antes de serem colocadas em cultura (3x105 células/ul em micro-placas a 24 alvéolos) em presença de diferentes diluições de flavopereirina. A contagem das cincitia foi efectuada cada dia duas vezes. Os resultados são resumidos nos Quadros I, II e III abaixo. 6

Quadro I H d3 d4 dó d7 400 μg/ml Tox Tox 100 Tox Tox 50 (+) (+) (+) - - - - - 10 + + + (+) + ++ ++ ++ 1 + (+) + + ++ ++ ++/T ++/T 100 ng/ml + + + + ++ ++ ++/T ++/T HIV-1 só + + + + ++ ++ ++ ++/T MT4 - - - - - - - -

Quadro II

Quadro III H d3 d4 d5 dó d7 60 μg/ml - - - - - - - - - - 30 - - - - - - (+) - ++ (+) 10 (+) - (+) (+) + (+) ++ ++ ++ ++ 1 (+) (+) (+) (+) (+) (+) ++ + ++ ++ 100 ng/ml - (+) (+) (+) + (+) + ++ ++ ++ VIH-1 só (+) (+) (+) (+) + + ++ ++ ++ ++ MT4 - - - - - - - - - - 7 O quadro I mostra uma toxicidade celular para 100 e 400 pg/ml de flavopereirina. A 50 μg/ml não se transformava sincitia após 7 dias de cultura. De 10 pg/ml a 100 pg/ml foram observadas sincitias como no HIV-1 testemunho. O quadro II confirma a protecção procurada pela flavopereirina a 50 pg/ml e o quadro C confirma de novo estes resultados: não se formavam sincitias a 60 μg/ml após 7 dias de cultura e observou-se um pouco após 2 dias com a dose de 30 pg/ml. Ensaio de infecção virai (determinação do antigénio P24).

Inoculou-se 1 nanograma de isolados primários de HIV -1, BRE1 (de um paciente assintomático) e TIG2 (de um paciente infectado com SIDA) com 106 células mononucleares de sangue periférico (PBMC) estimuladas com PHA recolhidas a partir de cinco doadores negativos para HIV escolhidos ao acaso. Após 2 horas de incubação, as células foram lavadas duas vezes e foram cultivadas em 1 ml de RPMI 1640 contendo 20 UI de IL-2 por ml (Boehringer Mannheim, Alemanha), 2 pg de Polybrene (brometo de hexadimetrina) por ml (Sigma, 3t Louis, MO, EUA) e 107 UI de antisoro de cabra por ml, agindo contra o interferão humano alfa (Janssen, Reerse, Bélgica). Mudou-se metade do meio de cultura após 72 horas e de seguida todas as 48 horas até ao 30° dia. Testavam-se os sobrenadantes da cultura por uma dosagem imuno-enzimática (EI.ISA) quanto à produção de antigénio P24 (Abbott, Chicago, IL, EUA) e a densidade óptica (DO) da cor resultante foi convertida em concentração em proteína P24 por meio de um nomograma tipo, como descrito por W. Lu e J.-M. Andrieu, Journal of Virology, 66(1); 334-340 (1992).

Teste de eficácia da flavopereirina sobre o poder infectante do HIV-1 1) Primeira experiência: antes da incubação do vírus na presença de PBMC estimulada por PHA (células blásticas), foram pré-tratados conjuntos virais extra-celulares em triplo com 30 ou 60 pg de flavopereirina por ml durante 2 horas. 8 2) Segunda experiência: foram pré-tratadas células blásticas em triplo com 30 ou 60 pg de flavopereirina por ml durante 2 horas, e foram em seguida lavadas duas vezes antes de se exporem à inoculação virai.

Citoxicidade da flavopereirina nas PCMB em repouso e em células blásticas São reunidas as PBMC frescas e as PBMC blásticas tiradas de cinco doadores sãos, seronegativos para HIV, escolhidos ao acaso, e tratadas por três vezes com 30 ou 60 pg da flavopereirina por ml de solução alcoólica durante 2 horas. Após lavagem por duas vezes, as células foram colocadas em cultura num meio de cultura celular até ao décimo quinto dia. A viabilidade das células de cada grupo foi examinada por coloração de exclusão ao azul tripano e por análise quantimétrica. Foram utilizadas como testemunho as culturas de PBMC seronegativas a HIV sem flavopereirina (composto H).

Inibição da infecção produtiva por HIV-1 pelo composto H 1) Um pré-tratamento de HIV-1 pelo composto H (à razão de 30 ou 60 pg/ml) inibe completamente a infecção dos PBMC alvo pelos isolados de VIII-1 primários derivados de pacientes quer assintomáticos quer sintomáticos (ver quadro V mais à frente). 2) Apenas durante o pré-tratamento dos PBMC alvo com 60 μg/ml conduziu a uma inibição completa das infecções virais produtivas (ver quadro VI).

Citoxicidade do composto H nos PBMC humanos em repouso e as células blásticas estimuladas por PHA 9 1) A viabilidade dos PBMC em repouso diminuía significativamente (p<0,05) no grupo das células tratadas com 60 μg/ml, mas não no grupo tratado com 30 μg de composto H por ml (ver quadro VI). 2) A viabilidade das células blásticas revelou-se dependente da exposição ao composto H (ver quadros IV, V e VI).

Inibição da infecção produtiva por HIV-1 por meio do composto II

Um pré-tratamento de HIV-1 com o composto H (à razão de 10, 30, 60, 100, 200 μg/ml) inibe a infecção dos PBMC alvo pelo vírus de uma forma dependente da dose (ver quadro VII mais adiante). A dose igual ou superior a 60 pg de composto H por ml parece ser a concentração requerida para a inibição completa das infecções virais produtivas.

No sistema de cultura de PMBC humanos primários, a eficácia do composto H na inibição do HIV-1 de tipo selvagem permanece inalterada quando se colocava o medicamento a incubar num meio de cultura contendo 60% de soro humano antes do ensaio de inibição (ver quadro VIII).

Citoxicidade do composto H nos PBMC humanos estimulados por PHA A viabilidade dos PBMC blásticos diminui significativamente (p<0,001) no grupo das células tratadas com 200 μg/ml, mas não nos grupos tratados com, respectivamente, 100, 60, 30 e 10 μg/ml de composto H (ver quadro IX). A duplicação do HIV-1 era totalmente inibida por 60-100 μg/ml de composto H por ml. Estas concentrações são 2 a 4 vezes mais baixas que as concentrações citotóxicas. Tal efeito revelou não ser influenciado pelos constituintes do soro humano.

Efeitos do produto H sobre a produção de citoquinas primárias (IL-Ιβ e TNF-(x) e secundária (IL-6) pelos monócitos normais provenientes de pacientes seropositivos. 10

Foram utilizados monócitos aderentes provenientes do sangue de dois tipos de doadores: - doadores normais, voluntários sãos, doadores espontâneos que se apresentavam no banco de sangue do hospital da Pitié-Salpetrière, Paris (França); - doadores seropositivos provenientes de consultas médicas: tratam-se de pessoas em início de seroconversão e não tendo na altura da recolha qualquer tratamento. Os factores de risco são a toxicomania, por via intravenosa para seis de entre eles, a transmissão sexual por três pacientes e a transmissão sanguínea (Zaire) para um caso. Não foi possível ser efectuada qualquer correlação entre factores de risco e resultados experimentais.

No caso de doadores seropositivos foram anotadas quaisquer anomalias, anomalias qualitativas referentes essencialmente às linhas polinuclear e linfocitária: - polinucelares hipersegmentados ou hiposegmentados (do tipo Pegler) em quatro casos em 10; - limfocitos hiperbasófilos igualmente em quatro caos em aO (diferentes dos precedentes).

As anomalias observadas não puderam ser correlacionadas com os resultados obtidos durante as experiências.

Em análise imunofenotípica, nenhuma expressão dos antigénios de diferenciação estudados (cd84, Cd33, CD 13 e Cdl lb) se mostrou deficiente. I. Doadores normais

Os dez doadores que entram nestas experiências mostraram uma grande coerência de resultados: 11 - nenhuma produção espontânea nem de citoquinas primárias (nem IL-Ιβ e TNF-α), nem de interleucina-6, citoquina secundária; - a estimulação dos monócitos durante 48 horas com interferrão-y (1000 U/ml) não levou a nenhuma produção de citoquinas primárias, excepto para o doador #10 em IL-6, e de citoquina secundária, excepto para os doadores #1 e 5. - as estimulações obtidas com o LPS (lipopolissacárido) e a mistura interferão-y LPS foram como esperados, isto é de amplitude diferente de um doador a outro, mas sempre significativas com um efeito sinérgico no caso da dupla estimulação.

Efeito do produto H O produto H não foi utilizado nestas experiências a mais de 20 pg/ml de água, valor para além do qual pôde ser posta em evidência uma clara toxicidade. Quatro doadores foram testados previamente a 30, 50, 100 μg/ml com uma citotoxicidade praticamente total: mais de 40% a 30 μg/ml e 100% para valores superiores (as análises dos sobrenadantes da cultura não foram realizadas).

As doses de 5, 10 e 20 pg/ml foram escolhidas a partir da segunda série de experiências, indicando os resultados obtidos com os dois primeiros doadores que as doses abaixo de 5 μg/ml se revelavam inactivas.

Actividade directa do produto H: - sobre a produção de citoquinas primárias. - aumento da produção de TNF-α (doador #7) mas a uma única dose, sendo o efeito igualmente visível à resposta ao IFN-y; - aumento da produção de IL-Ιβ (doadores #3, 5 e 6) com um efeito-dose, mas esta resposta era marginal. Pelo contrário, o doador #10 respondeu muito bem às doses de 10 e 20 μg/ml; 12 - sobre a produção de citoquina secundária (interleucina-6): - não é observada qualquer modificação da resposta.

Actividade indirecta do produto H: - sobre a produção de citoquinas primárias: produção de TNF-α: atrás houve uma grande diminuição de produção unicamente para grandes doses de produto (20 μ8/ηι1) (p<0,05); produção de IL-Ιβ: não houve qualquer modificação significativa das respostas ao LPS ou à IFN-y - LPS (p<0,05). - sobre a produção de citoquina secundária (interleucina-6): - houve uma grande diminuição da produção de IL-6; esta inibição nunca foi total e contrariamente ao caso de TNF-α, é dependente da dose (p<0,05).

Estes resultados diferentes são reagrupados nas figuras 3 e 4, onde as doses medidas, em ordenadas, são em μg/ml de citoquinas, e os desvios padrão não são precisados, uma vez que são sempre inferiores a 10% da média. II. Doadores seropositivos A resposta dos monócitos proveniente dos diferentes doadores seropositivos foi testada em termos de resposta espontânea. As quantidades de células obtidas são baixas (estes não são doadores escolhidos por citaferese). As experiências foram limitadas em função deste número de células.

Actividade directa do produto H - sobre a produção de citoquinas primárias. Não foi observada qualquer modificação na produção de base, quer para o TNF-oc, ou para o IL-Ιβ. 13

- sobre a produção de citoquinas secundárias. 8 pacientes em 10 apresentaram uma resposta espontânea significativa de interleucina-6.

Actividade indirecta do produto H: - Efeito sobre a produção de citoquinas primárias.

Os efeitos obtidos são os mesmos dos doadores sãos, isto é uma diminuição quase total da produção de TNF-α, (unicamente a 20 pg/ml) e uma ausência de efeito sobre a produção de interleucina-1 nas três doses ensaiadas (P<0,05).

Efeito sobre a produção de interleucina-6

Ao mesmo tempo que o produto H, a interleucina-4 foi utilizada, uma vez que foi mostrada previamente a estas experiências, que esta citoquina bloqueava a produção espontânea de interleucina-6 em certos pacientes seropositivos.

Em cinco casos, a interleucina-9 foi utilizada em comparação, uma vez que ela bloqueia igualmente a produção de IL-6 pelos monócitos normais estimulados pelo LPS.

Os resultados obtidos são os seguintes: - A interleucina-4 inibia a produção de IL-6, mas esta inibição não era nunca completa (p<0,05). - A interleucina-9 inibia parcialmente a produção espontânea (50% no máximo) e não teve nunca efeito aditivo com o efeito interleucina-4 (pelo contrário, em dois casos sobre cinco, houve anulação dos efeitos; estes resultados não foram reproduzidos nas figuras). 14

- O produto Η apresentou um efeito inibidor com um muito claro efeito-dose (p<0,05). Não houve contudo nunca inibição total da produção espontânea de 11-6. Pelo contrário, na presença de interleucina-4, foi praticamente sempre obtido um efeito de ampliação (excepto no caso #4), com desaparecimento total da produção a 3 μ^ιηΐ de produto H (e mesmo frequentemente a partir de 1 pg/ml) (p<0,05).

Em conclusão: - o produto H revelou-se tóxico para além da dose de 20 pg/ml in vitro sobre as células utilizadas no âmbito das experiências do título, isto é os monócitos humanos provenientes quer de doadores sãos, quer de pacientes seropositivos assintomáticos; - o produto H revelou-se apto a modular a produção de citoquinas quer directamente para as citoquinas primárias, efeito que permanecia fraco, quer de forma muito clara indirectamente para as produções de TNF-α, e de IL-6, mas não de II-1. Da mesma forma, o produto H inibia as produções espontâneas de IL-6 observadas em certos pacientes seropositivos. Este efeito inibidor, que nunca foi total no âmbito das experiências relatadas, era ampliado na presença de IL-4; - a normalização das respostas 11-6 e TNF-α no paciente seropositivo, sem para isso inibir as produções de IL-1, era muito importante, pois o produto H não modificava o potencial de relações imunes entre monócitos e linfócitos, bem como uma grande parte das reacções inflamatórias necessárias à sobrevivência, como a estimulação das células de estirpe da medula óssea e o estabelecimento de uma reacção de defesa ao nível geral. 15

Tolerância clínica e eficácia da flavopereirina O estudo clínico foi efectuado em 24 pacientes seropositivos apresentando uma numeração de linfócitos 14 compreendida em valor absoluto entre 0,200 e 0,400 x 103/1. Todos os pacientes foram informados sobre o composto activo em causa e sobre os outros medicamentos antivirais correntemente utilizados ao tempo do estudo. A selecção dos pacientes foi efectuada com base no número absoluto de linfócitos Tl: homens e mulheres com mais de 18 anos, com um índice de Kamofeky igual ou superior a 90%, apresentando anticorpos anti-HIV-1, em dois ensaios testemunhos sucessivos (método ELISA), grupos CDC II, CDC III, CDC IV E da classificação CDC 87; sendo a hemoglobina superior a 100-120 g/1, sendo os polinucleares neutrófilos superiores a 1,5 x 109/1, sendo as plaquetas mais de 80 x 109/1, sendo os linfócitos T4 iguais ou superiores a 0,2 x 109/1 e inferiores ou iguais a 0,4 x 109/1, na ausência de terapia antiretroviral, em particular pelo AZT.

Foram admitidos 20 pacientes com base nestes critérios de inclusão. Antes de a incluir no estudo, foi feito para cada um deles um balanço pré-terapêutico: estado histórico pós-clínico e terapêutico, exame clínico com determinação da febre, a anorexia e as náuseas, as dores de cabeça, o prurido, a tosse e a expectoração, a diarreia, as adeénopatias, a micose bucal, a dermatite seborreica e as lesões de Kaposi. Efectuou-se igualmente um estudo biológico incluindo as hematias e as plaquetas, as sub-populações linfocitárias (CD2, CD4, VD8, CD 19, CD 1/8), a determinação do antigénio P24 e da beta-2 microglobubina, da LDH (lactato desidrogenase), a ferritina plasmática, a AL AT (alanino-amino-transferase), a ASAT (aspartato-aminotransferase) e a creatinina plasmática.

Administrou-se a flavopereirina (composto H) sob a forma de géis de 600 mg a uma dose diária de 1-3 g, de preferência de pelo menos 1 g de princípio activo por dia. A duração média do tratamento era de 43 ± 11 semanas. Houve poucos efeitos secundários apenas durante os três primeiros meses. Não se observou nem toxicidade sanguínea ou renal, nem modificações significativas na ALAT ou na ASAT. Não se notou qualquer degradação na classificação 16 CDC nem qualquer infecção; o índice de Kamofsky mantinha-se sempre à volta dos 100%. A actividade física ou profissional dos pacientes mantinha-se estritamente normal. A resposta imunitária ao tratamento era essencialmente um aumento significativo das células Cd4+ (p<0,05), bem como as células CD 10+ (p<0,05). A perda negativa dos CD4+ inverteu-se em 18 pacientes em 19 (P<0,05).

Todos os resultados obtidos in vitro e in vivo indicam claramente que o composto flavopereirina exerce um efeito inibidor significativo sobre o poder infectante virai do HIV quer in vitro nas células humanas quer in vivo nos pacientes infectados por HIV-1.

Em 10 das doenças tratadas durante 1 ano, notaram-se ainda as variações significativas seguintes: - aumento das hematias em 9 meses; - aumento da hemoglobina em 9 meses; - aumento da massa total dos linfócitos em 9 e 12 meses; - aumento dos CD2 em 9 meses; - aumento dos CD4 em 12 meses; - aumento dos CD5 em 9 meses; - aumento dos CD 19 em 6-9 e 12 meses; - aumento dos beta-2 microglobulinas em 3-6 e 12 meses.

Na prática, preconiza-se de preferência uma administração por via oral sob a forma sólida, tal como os comprimidos ou os géis, por exemplo. Uma dose unitária de cerca de 250-500 mg de princípio activo é muito particularmente apropriada. A posologia recomendada é, tendo em conta os resultados acima mencionados e as indicações de toxicidade relatadas, de cerca de 1 a 3 g de princípio activo por dia (g/d), e de preferência de pelo menos cerca de 1 g/d, vantajosamente por doses sucessivas repartidas durante o dia. 17

As dosagens e/ou formas galénicas retidas podem todavia variar de acordo com o estado da doença e o estado da doença virai a tratar. A sua adaptação ao caso específico respeitante a cada tratamento particular pode ser realizado facilmente pelo especialista, com base nos seus conhecimentos na matéria e se necessário, com a ajuda de ensaios de rotina preliminares. Desta forma, é muito particularmente recomendado ter em conta os dados fornecidos por um estudo de farmacocinética feito sobre o ser humano para avaliar a duração de meia vida do princípio activo administrado e eventualmente adaptar em função dos resultados obtidos a forma de preparação farmacêutica para a administração. Isto pode também compreender formas galénicas com efeito retardado, por exemplo.

As doses a administrar compreendem, na prática, por um lado o princípio activo ou um sal outro derivado deste, pelo menos um suporte ou veículo farmacêutico e excipientes, cargas, agentes perfumantes e/ou colorantes habituais.

Quadro IV

Pré-tratamento de inócolo virai com o composto H (experiências em triplicado)

Produto Virai (1 ng/ml) HIV pré-tratado com H durante 2 horas Produção pós infecção de P24 de HIV (pg/ml) d3 d5 dl4 d21 d30 HIV-1 Assin. Testemunho 250±25 >1500 (Produtosrat) +30 pg/ml - - - - - +60 pg/ml - - - - - HIV-1 SIDA Testemunho 5751129 >1500 (Produtoxigr) +30 pg/ml - - - - - +60 pg/ml - - - - - Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) reunidas colhidas de cinco doadores de boa saúde seronegativos para HIV escolhidos ao acaso. _ 18

Quadro V

Pré-tratamento de células alvo com o composto H (experiências em triplicado) Produto Virai (1 PBMC pré-tratadas Produção pós infecção de P24 de HIV (pg/ml) ng/ml) com H durante 2 horas d3 d5 dl4 d21 d30 Hl V-1 Assin. Testemunho 250+25 >1500 (ProdutOBrat) +30 μg/ml 113±7 >1500 +60 μ§/τη1 - - - - - HIV-Isida Testemunha 575±129 >1500 (Produtofigr) +30 μ§/πι1 515±103 >1500 +60 μg/ml - - - - - PBMC reunidas colhidas de cinco doadores de boa saúde seronegativos para HIV escolhidos ao acaso. 19

Quadro VI

Citotoxidade do composto H em PBMC humanas em repouso e em PBMC estimuladas com PHA (blásticas) (experiências repetidas 5 vezes) Células Alvo Células tratadas Viabilidade (%) das PBMC após exposição ao com H (2 horas) composto H d3 d7 dll dl 3 dl5 PBMC* Testemunho 97±2 95±3 98+2 91+8 85±9 +30 pg/ml 95±4 93±2 88±7 82±10 81±11 +60 μg/ml 56±6 23±4 17±4 12±5 25±8 Blast.** Testemunho 86±5 84±6 76±4 75±5 68±7 +30 pg/ml 88±3 85±7 71±3 76±9 69±8 +60 μg/ml 79±4 74±5 70±4 71±8 63±7 * PBMC reunidas colhidas de cinco doadores de boa saúde seronegativos para HIV escolhidos ao acaso. ** Células blásticas estimuladas com PHA colhidas de cinco doadores de boa saúde seronegativos para HIV escolhidos ao acaso 20

Quadro VII

Pré-tratamento de inócolo virai com o composto H na ausência de soro humano do grupo AB (experiências repetidas 5 vezes) HIV pré-tratado com H Produção de P24 de HIV (pg/ml) durante 2 horas d4 dlO dl4 d21 Testemunho 510+235 >1500 +200 μg/ml - - - - +1Ó0 ug/ml - - - - +60 μg/ml - - - - +30 μg/ml 173±102 >1500 +10 μg/ml 388+124 >1500 Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) reunidas colhidas de cinco doadores de boa saúde seronegativos para HIV escolhidos ao acaso 21 ι

Quadro VIII

Pré-tratamento de inócolo virai com o composto H na presença de soro humano do grupo AB (experiências em triplicado) HIV pré-tratado com Sem/com (-/+) Produção de P24 de HIV (pg/ml) H durante 2 horas 50% de soro AB d4 dlO dl4 d21 Testemunho - 510±235 >1500 +200 μ§/πι1 + - - - - +100 μ§/ιη1 + - - - - +60 μg/ml + - - ' - - +30 μ§/ηι1 + 275±98 >1500 +10 μ§/ιη1 + 384±83 >1500 Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) reunidas colhidas de cinco doadores de boa saúde seronegativos para HIV escolhidos ao acaso. 22

Quadro IX

Citotoxidade do composto H sobre as PBMC humanas estimuladas com PHA (blásticas) na presença ou na ausência de soro humano do grupo AB (experiências repetidas cinco vezes) Células tratadas com H (2 horas) Sem/com (-/+) 50% de soro AB Citotoxidade do composto H após exposição às PBMC* d4 dlO dl4 d21 Testemunho - 85±1,4** 86±1,3 80+2,7 77±3,1 +200 gg/ml - 45±6,3 33±7,8 24±7,6 15±5,3 +100 gg/ml - 84±1,6 79±3,1 73±5,3 74±4,7 +60 gg/ml - 86+1,5 82+2,4 82±2,6 80±3,3 +30 μg/ml - 81±2,8 83±2,6 80±3,9 78±4,5 +10 gg/ml - 87+1,2 86±1,4 84±1,5 81±2,3 +200 gg/ml + 37+6,8 24±6,6 17±7,9 11±5,6 +100 gg/ml + 83+2,3 80+4,5 77±5,6 73±4,4 +60 gg/ml + 85±1,2 84±1,7 82±2,1 79±3,5 +30 gg/ml + 88±1,3 84±2,5 83±3,7 81 ±4,6 +10 gg/ml + 87+1,1 88±1,4 84±3,2 82±3,1 * Células blásticas estimuladas com PHA colhidas de cinco doadores de boa saúde seronegativos de HIV escolhidos ao acaso. ** Percentagem (média ± desvio padrão) de células viáveis.

Lisboa, 17 de Agosto de 2000.

Pela Requerente ^ O Agente Oficial

Gonçalo da Ci Adiunto

i Ferreire jiciel da ustrial 23

Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização da flavopereirina como único princípio activo para a obtenção de um medicamento destinado a um tratamento antiviral contra o vírus HIV.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o referido princípio activo estar presente na razão de cerca de 250-500 mg por dose unitária.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por a flavopereirina estar presente na razão de cerca de 500 mg por dose unitária e com indicação de uma posologia de 1-3 g/d.
4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender a flavopereirina como único princípio activo para a obtenção de um medicamento sob a forma de comprimidos ou de géis contendo por dose unitária cerca de 250-500 mg de flavopereirina ou de um dos seus sais ou outros derivados farmacologicamente aceitáveis.
5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o referido medicamento estar sob uma forma galénica com efeito retardado. Lisboa, 17 de Agosto de 2000. Pela Requerente f' O Agente Oficial