JPH07502754A - フラボペレイリンに基づく組成物及びそのｈｉｖウイルスの処置におけるその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 フラボペレイリンに基づく組成物及びそのＨＩＶウィルスの処置におけるその使 用 本発明はフラボベレイリン（ｆ　１ａｖｏｐｅｒｅｉｒｉｎｅ）の抗菌的使用（ ａｎｔｉｖｉｒａｌ　ｕｓａｇｅ）に関する。特に、本発明は唯一の活性成分が フラボペレイリンである医薬製剤及びヒトのウィルス感染、−特に、ヒト免疫不 全ウィルス（ＨＩＶ）によって誘発されるウィルス感染のごときウィルス感染の 処置における上記の製剤の使用に関する。

フラボペレイリンはベーター−カルボリン類（ｂｅｔａ−ｃａｒｂｏｌｉｎｅｃ ｌａｓｓ）のアルカロイドである。フラボペレイリンは慣用的に”ＩＩ又はＰＢ 　１００化合物”　（”　Ｈｏｒ　ＰＢ　１００　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）と も呼ばれており、２５０−２５４及び３０６　ｒ＋ｍにおいてＵＶ放射蛍光（Ｕ Ｖ　ｅｍｉｓｓｉｏｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を示す。

フラボペレイリンはパオ　ベレイラ　ゲイソスペルマム　ベロシイ−パイロン　 アボシナセアエ（Ｐａｏ　Ｐｅｒｅｉｒａ　Ｇｅｉｓｓｏｓｐｅｒｍｕｍｖｅｌ ｌｏｓｉｉ−Ｂａｊｌｌｏｎ　Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ）の皮から取得し得る［ ０．　Ｒａｐｏｐｏｒｔ等（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　８０．１６ ０１−１６０８（１９５８））　；及びＭ、　Ｂｅｌ　ｊａｎｓｋｉ及び１、Ｂ ｕｇｉｅｌ：フランス特許請求（ｐａｔｅｎｔ　ｒｅｑｕｅｓｔ）７８０７１５ ５に対する追加＃　７９０５８３の第一認証（ｆｉｒｓｔ　ｃｉｒｔｉｆｉｃａ ｔｅ）についての請求及び文献ＥＰ−Ａ−０５９８１７参照］。

フラボベレイリンは２００−６００μｇの投与量又は２．５−５００　ｍｇ／日 の投与量、好ましくは、３０ｍｇ７日の投与量で内皮投与した場合、ショープフ ィブローム（Ｓｈｏｐｅ　ｆｉｂｒｏｍｅ）型のウィルス又はワクチンウィルス の場合、ウィルスの丘疹（ｐａｐｕｌｅ）の出現と進展が抑制されることも知ら れている。

フラボペレイリンは生体内でインフルエンザ（ＲＮＡ）ウィルスに対して作用す ること及び更に、フラボペレイリンはタバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）と短時 間接触した後にはこのウィルスの増殖を抑制し得ることも知られている。

更に、文献ＥＰ−＾−００５９８１７からフラボペレイリンはインフルエンザウ ィルスに対して活性を示すことが明らかにされている；しかしながら、この種の 第４級ベーター−カルボリンの半減期は余りにも短く、その効果を遅延させた微 小顆粒以外のガレン製剤の形ではヒトに効果的に投与し得ない。

文献ＦＲ８８１５８４５にはヒトにおける（ＲＮ＾ウィルス−特にＡＩＤＳ及び ＤＮＡウィルスに対する）免疫不全を改善するための系が記載されている。この 文献によれば、問題のウィルスの増殖の抑制は、フラボペレイリンが唯一の物質 ではない４種の物質の組合せによって可能である。この文献に記載の医薬組成物 はこれらの４つのカテゴリーの活性成分の各々の代表的のものの少なくとも一つ を含有していなければならない。この組合せに含まれるフラボペレイリンは０、 ２５ｇ／日の投与量で、好ましくは、経口的に投与される。

今般、驚くべきことに、フラボペレイリンは、それ自体で、ヒトを包含する哺乳 動物におけるＩＩＩＶウィルスの撲滅において効果的な活性物質を構成すること が発見された。特に、フラボペレイリンはそれ自体で、生体内及び生体外で、Ｈ ＩＶウィルスの感染に対して、特に、ＨＩＶ−１に感染した患者についての選択 的な活性成分であることが認められた。

従って、本発明は唯一の活性成分としてのフラボペレイリンを、好ましくは、単 位投与当り、約５００ｍｇのフラボベレイリン又はフラボベレイリン塩又は他の 薬理学的に許容される適当な誘導体の一つを含有する固体の形で含有することを 特徴とする特にＨＩＶウィルスの感染の処置おいて医薬として使用するための医 薬組成物をその第一の目的とする。

本発明は、更に、旧Ｖの抗菌的処置のための医薬を調製するための、フラボベレ イリンに基つくかかる医薬製剤の使用を目的とする。

この目的及び他の目的は本明細書において明らかになるであろう。

本明細書に記載される試験及び実験は例示的なものに過ぎず、本発明の範囲を限 定するものではない。

フラボペレイリンはヒトを包含する哺乳動物において毒性及び副作用を示さない 。スプラグ−ドウレイ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）　ＥＯＰＳラットにお けるＬＤ　５ｏは経口投与の場合、１０．４５　ｇ／ｋｇ　（安全限界：９．６ ３−１１、３５）であり、腹腔内投与の場合、２．４５ｇ／ｋｇ　（安全限界： ２．３５−２、５５）である。動物は経口投与又は腹腔内投与から３０〜６０分 以内に呼吸停止により死亡する。その後の１４日の間には死亡率に変化は認めら れなかった。

雄及び雌スプラグードウレイラット（ＯＰ＾）における亜慢性経口役において毒 性がないことを示した。これらの投与量においては体重又は食物の摂取に変化は 認められなかった。血球数に変化は認められず、肝機能及び腎機能は正常なまま であった。肝臓、腎臓、十二指腸、心筋、牌、甲状腺及び上皮小体線（ｐａｒａ ｔｈｙｒｏｉｄ　ｇｌａｎｄ）、コラガン又は卵巣の病変（ｌｅｓｉｏｎ）は顕 微鏡によっては認められなかった。

１０　ｍｇのフラボペレイリン製剤を経口的に投与した雄ＣＤＩマウスにおいて は、髄液（ｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ）フラボペレイリン含有量が約７μｇ（即ち、 ０．５ｇの脳を有する２０ｇのマウスについて、１４ｇｇ／ｇの濃度）であると いう事実によって示されるごとく、フラボペレイリンは血液髄液関門（ｈｅｍａ ｔｏ−ｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ　ｂａｒｒｉｅｒ）に浸透する。

本発明において使用するために、フラボペレイリンの調製は、実験においては、 ゲインスペルマム　ベロシイ粉末をＩＮＨＣＪ中、１００℃で加水分解しＫＯＨ により中和し、エタノールにより抽出しついで蒸留により濃縮することにより行 われる。ついで、蒸留残渣をクロロホルムに再溶解し、過剰の塩をエタノールの 存在下、冷却して沈殿させることにより除去しついで主としてフラボペレイリン を含有する残渣を濃縮する。

本発明の目的のためには、フラボペレイリンは製造されたものをそのままで使用 するか、又は、その塩又は薬理学的に許容される誘導体の形で使用し得る。

前記した治療的な目的に関連する下記の薬理学的試験を行った。

試験は添付図面によって補足されている：図面において、第１図は感染後の時間 数と、１当りの細胞数との関係の比較を示すグラフである：フラボベレイリンの 添加（”Ｈ”の標識が付されている）は感染から１２時間後に行った。

第２図は化合物Ｈを添加しない場合と３０及び６０μｇ７ｍ１．の割合で添加を 行った場合の、感染後の時間数と感染単位（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｕｎｉｔ） （１０／■）との関係を示すグラフである。

第３図は健康なドナーからのヒト単核（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）によるインターロイ キン−６の生成に対する、化合物Ｈ（フラボペレイリン）の影響を示すグラフで ある。

第４図は１（ＩＶ−陽性（ＨＩＶ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）患者からのヒト単球によ るインターロイキン−６の自然的生成に対する、化合物Ｈの影響を示すグラフで ある。

旧■に対するフラボペレイリンの抗菌効果正常な又は健康な細胞に対する影響を 伴わない、生体外培養細胞（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｅｌｌ）内 でのＨＩＶの破壊を、Ｐａｕｌ　ＥｈｒｌｉｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（ドイツ、 フランクフルト）のＤｒ、Ｒ，Ｇａ１ｌｏから入手したかツＩｎ５ｔｉｔｕｔｅ 　ｆｕｒ　Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ　Ｍｊｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃ　ｕｎｄ　 Ｈｙｇｉｎｅ（スイス、ベルン大学）によって増殖されたＴ４リンパ球のＨ−９ コロニーを使用することにより示した。

１（ＩＶは叶、Ｇａ１１ｏからＨＴＬＶ−ＩＩＩとして入手し、前記したＥｌ− ９細胞内で増殖させた。感染Ｆｌ−９細胞培養によって生成された表面物質を− ８０℃で貯蔵した。この物質は使用の時点で１０６ＩＵ／ｍ／の濃度を有してい た。ｆｌ−９細胞をフアシヨン（Ｆａｌｃｏｎ）ビン（２５ｃｍ３）内の、１ｖ ｎｌ当り、１５％のウシ胎児血清、０．００２μｍのグルタミン及び１００ＩＵ のペニシリンを含有するＲＰＭＩ　１６４０培地中で培養した。ビン１個当り、 ８〜２０ｍｊ！培地を使用した。ビンを垂直にして３７℃でインキュベートした 。培養はＨ−９細胞濃度が１ｍｌ当り２ｘｌＯ”個の濃度で開始し、細胞数が１ ｍ１当り１ｘｌＯ６個に到達したときに分割した。感染及び非感染［１−９細胞 の培養におけるフラボペレイリンを試験するために、マイクロタイトレージョン プレートを使用した。これらの場合には、培養は細胞数が１ｍｌ当り６ｘｌＯ” 個の濃度で開始した。２３時間、インキュベーションを行った後、１０２工Ｕの 旧Ｖを含有する０、　１ｍｌのＲＰＭ１１６４０培地を、０．１ｍＡの細胞懸濁 物を含有する各々のウェル（ｗｅｌｌ）に添加した。これは１．６ｘｌＯ’の感 染増殖（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、即ち、細胞５ ００当り、１感染単位（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｕｎｉｔ）に相当する。感染から １６時間後、フラボペレイリンを含有しているか又は含有していない０．１ａ＋ １のＲＰＭＩ　１６４０培地を感染及び非感染ウェルに添加した。

フラボペレイリンは３０μｇ７ｍｌ及び６０μｇ／ｒｎｌの濃度で使用した。マ イクロタイトレージョンプレートをアメルシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）プレート カバーで覆い、３７℃でインキュベートした。細胞数はノイバウエル室（Ｎｅｕ ｂａｕｅｒ　ｃｈａｍｂｅｒ）内で測定した。ｔｌＩＶ抗原の全量は＾ｂｂｏｔ ｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから提供されるＨＩＶ抗原キットを使用して測定し た。

分析のために、１０μｌの容量（マイクロタイトレージョンプレートのウェルの 各々から採取）を１　ｒｎｌのＲＰＭＩ　１６４０培地中で稀釈した。

この原液（ｓｔａｃｋ）に基づいて、１〜３及び１〜５のそれぞれの系列で８個 の稀釈物を調製した。０．１ｍｌの容量の各稀釈物を取出し、１ｍ７当り、５　 Ｘ　１０”個の細胞を含有するＩ（−９細胞の予備インキ−ベート培地の０．２ ｍ７Ｉに添加した。３７℃でインキュベーションを行った後、＾ｂｂｏｔｔ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから提供されるＨＩＶ抗原キットを使用してＨＩＶ抗原 の存在を測定した。

第１図にグラフの形で示されている結果は、フラボペレイリンは非感染細胞の増 殖には影響を与えないことを示している。これに対して、フラボペレイリンが存 在する場合、感染細胞の量は約４０％低い。

より顕著なことは（第３図に示す結果により示されるごとく）、非処理感染細胞 のウィルス粒子は時間と共に増大するが、この特定の試験の制限内において、フ ラボペレイリン（３０μｇ又は６０μｇ）で処理した感染細胞の系列においては ３０００以上の感染単位の存在を検出することができなかったことである。この ことは感染の抑制率は非常に小さい場合でも９９％を越えることを示している。

ＭＴ４細胞に対するＨＩＶウィルスの細胞変性効果を検討することによりフラボ ペレイリンの抗菌効果の評価も行い、ＨＩＶ−１の感染から４−６日後にシンジ チア（融合細胞）　（ｓｙｎｃｙｔｉａ）の形成が観察され、ついて細胞が死亡 するという結果が得られた。

フラボベレイリンはアルコール溶液（アルコール１００μｌ中に４０ｍｇ）の形 で使用した。ＲＰＭＩ媒体を使用して稀釈して、Ｆｅ２１０％、ＰＳＮ　１％及 びグルタミン１％とした。１０μｌのフラボペレイリン溶液について３ｘｌＯ５ 個の細胞を含有するフラボペレイ１ルの連続稀釈物を使用して、ＭＴ４細胞を３ ７℃で２時間予備インキュベートした。

溶液は４−６日以内にンンシチア形成を生ずる、旧Ｖウィルスの１０−４稀釈物 の１．００μｌを添加することにより得た。３７℃で１時間インキュベートした 後、感染ＭＴ４細胞をＲＰＭＩ溶液で３回洗浄しついでフラボペレイリンの種々 の稀釈物の存在下、培地に接種した（２４個のウェルを有するマイクロプレート 中、１ｍＡ’当り細胞３　ｘ　１０　”個）。シンジチアの数を毎日、重複して 数えた。その結果は下記の表工、エエ及びＩＩＩに要約されている。

表■ Ｈｄ３　ｄ４　ｄ６　ｄ７ ４００　Ｐｇ／ｍｌ　Ｔｏｘ　Ｔｏｘ ｌｏｏ　ＴＯＸ　ＴＯＸ ｓｏ　（＋）　（＋１　（＋）（＋）　−−−−１０＋　＋　＋　（＋）　＋　 ＋＋　＋＋＋＋１　＋　（＋）　＋　＋　＋＋　＋＋　＋＋バ＋＋／Ｔ１００ｎ ｇ／ｍｌ　＋＋　＋　＋　４４４４　＋＋／Ｔ＋＋／ＴＶＩＨ−１単独　＋　＋ 　＋　＋　＋＋　＋＋　＋＋　＋＋／Ｔ表ＩＩ Ｈｄ３　ｄ４　ｄ５　ｄ６　ｄ７　ｄ１０１００Ｑ／ｍｌ　Ｔｏｘ　Ｔａｘ ｌ　−−＋　＋　＋　＋＋＋＋＋＋　＋＋＋＋／丁１１００ｎ／ｍｌ　−（＋） 　＋　＋　＋　＋　＋＋　４４　＋＋　＋＋ＶＩＨ−１ｊｌ独−−（＋）　＋　 ＋　＋＋　＋＋　＋＋　＋＋／Ｔ　＋＋／Ｔ表ＩＩＩ Ｈｄ３　ｄ４　ｄ５　ｄ６　ｄ７ １０（＋）−（＋）（＋）十（＋）＋＋＋＋＋＋＋＋１　（÷）　（リ　（＋） 　（＋）　（＋）　（＋）　＋＋　＋　＋＋　十＋１１００ｎ／ｍｌ　−（＋） 　（＋）　（＋）　＋　（＋）　＋　＋＋　＋＋　＋＋ＶＩＨ−１単独　（÷） 　（＋）　（＋）　（＋）　＋　＋　＋＋　＋＋　＋＋　＋＋表■に１００及び ４００μｇ／ｍＩのフラボペレイリンの細胞毒性が示されている。５０μｇ／ｍ ｌにおいては、培養７日後にはシンジチアは形成されなかった。１０．ｃｚｇ／ ｍＡ　〜１００　ｒ＋ｇ／ｍｌにおいては、対照ＨＩＶ−１におけるごとく、シ ンジチアが観察された。

表ＩＩから、５０μｇｉｒｄのフラボペレイリンにより保護が行われることが確 認され、表ＩＩＩからもこのような結果が確認される＝６０μｇ７ｍｌにおいて は、培養７日後にもシンジチアは形成されず、一方、３０μｇ７ｍｌの投与にお いては、２日後にシンジチアが少量観察された。

ウィルス感染試験（Ｐ２４抗原の測定）ＨＩＶ−１の一次単離物（ｐｒｉｍａｒ ｙ　１ｓｏｌａｔｅ）、ＢＲＥＩ　（無症候患者から）及びＴｌＧ２　（ＡＩＤ Ｓ患者から）の１ナノグラムを、５人の無作為的に選択したＨＩＶ−陰性（ＨＩ Ｖ−ｎｅｇａｔｉｖｅ）ドナーから採取した、ＰＨＡで刺激した１０６個の末梢 血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　 ｃｅｌｌ）（ＰＢＭＣ）と共にインキュベートした。２時間インキュベートした 後、細胞を２回洗浄しついで１ｍｌ当り、２０　ＩＵのＩＬ−２（ドイツ、マン ハイム、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、１　ｍｌ当り、２μｇのポリブレン（ｐｏｌ ｙｂｒｅｎｅ）（ヘキサジメトリンブロマイド）（米国、ミズリー州、セントル イス、Ｓｉｇｍａ）及び１　ｒｎｌ当り、１Ｏ−７ＩＵの、ヒト　アルファーイ ンターフェロンに作用するヤギ抗血清（ベルギー、ビールス、Ｊａｎｓｓｅｎ） を含有する、１　ｍｌのＲＰＭＩ　１６４０中で培養した。７２時間後に培養液 の半分を交換し、その後、３０日口重で、４８時間毎に交換した。培養液の表面 物質を抗原Ｐ２４（米国、イリノイ州、シカゴ、Ａｂｂｏｔｔ）の生成について の酵素抗体法（ＥＬＩＳ＾）により試験しかつ得られる色の光学密度を１．　Ｌ ｕ及びＪ、−帽ＡｎｄｒｉｅｕによりＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ 、６６（１）：３３４−３４０（１９９２）に記載されたごとき標準計算図表か らＰ２４濃度に変換した。

ｆｌＩＶ−１の感染能力に対するフラボベレイリンの効率の試験１）第１実験： ＰＨＡによって刺激されたＰＢＭＣ［幼若細胞（ｂｌａｓｔｃｅｌｌ）］中のウ ィルスのインキュベーションの前に、細胞外ウィルスストック（ｖｉｒａｌ　５ ｔｏｃｋ）を１　ｍＡ’当り３０又は６０μｇのフラボペレイリンにより２時間 ３回重複して予備処理した。

２）第２実験：幼若細胞をｌ　ｍｌ当り３０又は６０μｇのフラボベレイリンに より２時間３回重複して予備処理し、２回洗浄しついでウィルス接種物に暴露し た。

静止（ａｔ　ｒｅｓｔ）ＰＢＭＣ中及び幼若細胞中のフラボペレイリンの細胞毒 性 ５人の無作為的に選択された、健全なＨＩＶ−陰性ドナーから採取した、予備洗 浄した、新しいかつ幼若な（ｂｌａｓｔｉｃ）ＰＢＭＣを、アルコール溶液１　 ｒｎｌ当り３０又は６０μｇのフラボペレイリンにより２時間、３回処理した。

２回洗浄後、細胞培地（ｃｅｌｌｕａｒ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ）中で １５日口重で培養した。各々の群の細胞の生存率をトリパンブルーを使用する色 素排除（ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　ｃｏｌｏｒｉｎｇ）試験と定量分析（ｑｕａｎｔ ｉコｅｔｒｉｃ　ａｎｌｙｓｉｓ）により測定した。フラボベレイリンを使用し ない）ＩＩＶ−陰性ＰＢＭＣの培地を対照として使用した。

化合物Ｈによる増殖性（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）ｔｌＩＶ−１感染の抑制御）化 合物ｌ（によるＨＩＶ−１の予備処理（３０又は６０　μｇｆｉｎｌの割合）に より、症候（ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ）及び非症候（ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ）患者から採取した一次旧ｖ−１単離物による標的ＰＢＭＣの感染は完全に予防 （ｐｒｅｖｅｎｔ）された（後記表Ｖ参照）。

２）シかしながら、６０μｇ／ｍｌ！を使用して標的ＰＢｉｌＣを予備処理した 場合だけ、増殖性ウィルスの感染が完全に抑制（ｉｎｈｉｂｉｔ）された。

静止ヒトＰＢＭＣ及びＰＨ１八により刺激された幼若細胞に対する化合物Ｈの細 胞毒性 １）静止ＰＢＭＣの生存率は６０μｇ／Ｉｌ］ｌを使用して処理した細胞の群に おいては著しく減少したが（ｐ＜０．０５）、３０μｇ／ｍｌの化合物Ｈを使用 して処理した細胞の群においてはこのことは認められなかった（表ＶＩ参照）。

２）幼若細胞の生存率は化合物日への暴露に依存するように思われる（表■Ｖ、 　Ｖ及びＶＩ参照）。

化合物Ｈの使用による、ＨＩＶ−１による増殖性感染の抑制旧ｖ−１を化合物Ｈ （１０，３０，６０，１００，２００μｇ７ｍｌの投与）を予備処理することに より、投与量の応じて、ウィルスによる標的ＰＢＭＣの感染が抑制された（後記 表ＶＩＩ参照）。１ｍｌ当り６０μｇに等しいか又はそれ以上の化合物＋１の投 与量が、増殖性ウィルス感染を完全に抑制するのに必要な濃度であると考えられ る。

−次ヒトＰＭＢＣ培養系においては、抑制試験の前に５０％のヒト血清を含有す る培地中にインキュベーションのために医薬を存在させた場合、野生復旧ｖ−１ の抑制に対する化合物Ｈの効率は変化しなかった（表ＶＩＩＩ参照）。

ＰＨＡによって刺激されたヒトＰＭＢＣ中での化合物Ｈの細胞毒性幼若ＰＭＢＣ の生存率は２００μｇ７ｍｌを使用して処理した細胞の群においては著しく減少 したが（ｐ＜　０．００１）、１００．６０．３０及び１０μｇ／ｍｌの化合物 Ｈを使用して処理した細胞の群においてはこのことは認められなかった（表ＩＸ 参照）。

ＨＩＶ−１の複製は１　ｍｌ当り６０−１００μｇの化合物Ｈにより完全に抑制 された。これらの濃度は細胞毒性濃度より２〜４倍低い。この効果はヒト血清の 成分によって影響されないと思われる。

１ｉＩＶ−１−陽性患者から採取した正常単球による一次（ＩＬ（β及びＴＮＦ −α）及び二次（ＩＬ−６）サイトカイニンの生成に対する化合物Ｈの影響 使用した接着性単球（ａｄｈｅｓｉｖｅ　ｍｏｎｏｃｙｔｅ）は２つの型のドナ ーの血液から採取したニ ー正常ドナー−フランス、バリー、Ｐｉｔｉｅ−３ａｌｐｅｔｒｉｅｒｅ病院の 血液バンクに提供している自発的血液提供者；−医薬審議団体（ｍｅｄｉｃａｌ 　ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ）からのＨＩＶ−１−陽性ドナー。これらの個体は ＩＩＩＶ感染の初期段階にあり、血液を採取した時点では何等の処置も受けてい なかった。危険要因（ｒｉｓｋ　ｆａｃｔｏｒ）として存在したものは、ドナー の６人については静脈内医薬の乱用であり、３人については性的伝搬（ｓｅｘｕ ａｌ　ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）であり、１人の患者については輸注（ｂｌｏ ｏｄ　ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ）　（Ｚａｉｒｅにおける）であった。危険要因 と実験結果の間には関連は認められなかった。旧Ｖ−陽性ドナーの場合、多数の 異常性（ａｎｏｍａｌｙ）が認められた；これらは主として、多核白血球（ｐｏ ｌｙｎｕｃｌｅａｒ）及びリンパ球（Ｉｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ）系列に関係する ；−１０人中４人において、ハイポセグメント（ｈｙｐｅｒｓｅｇｍｅｎｔｅｄ ）又はハイポセグメント（ｈｙｐｏｓｅｇｍｅｎｔｅｄ）　（Ｐｅ　Ｉｇｅｒ型 ）多核白血球（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅａｒ）。

一１０人中４人において（上記と同一のケースではない）、過好塩基性（ｈｙｐ ｅｒｂａｓｏｐｈｉ　１ｉｃ）リンパ球も発見された。

これらの異常性と実験において得られた結果の間には関連は認められなかった。

免疫表現型的（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ２１）分析においては、検討 した分化抗原（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ａｎｔｉｇｅｎ）（ＣＤ３４ ．　ＣＤ３３．ＣＤ１３及びＣＤ１１ｂ）の発現は不完全であることは認められ なかった。

■、　正常なドナー これらの実験における１０人のドナーは結果についてのかなりの一貫性（ｃｏｈ ｅｒｅｎｃｅ）を示した。

−一次サイトカイニン（ＩＬ−Ｉβ及びＴＮＦ−α）又は二次サイトカイニン（ インターロイキン−６）自然的生成（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ　ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｏｎ）はないニ ーインターフェロン（１，００００／＋ｎ／　）による４８時間に亘る単球の刺 激により、ドナー＃１０におけるＩＬ−Ｉβを除いて、−次サイトカイニン、は 生成せず、また、ドナー＃１及び５の場合を除いて、二次サイトカイニンは生成 しなかった。

一子測されたごと＜、ＬＰＳ（リボポリサツカリド）又はインターフェロン−γ ↓ＬＰＳの組合せにより得られる刺激はドナー毎にその大きさが相違した；この 刺激は常に大きく、二重刺激（ｄｏｕｂｌｅｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）の場合に は相乗効果を示す。

化合物Ｈの効果 これらの実験では、化合物Ｈを、水１１１１１当り、２０μｇ以上の割合では使 用しなかったが、これは、これ以上の割合では正味の（ｎｅｔ）の毒性を示さな かったからである。４人のドナーは実質的に全細胞毒性を示す３０．５０．１０ ０μｇ／ｒｎ１で予め検査した＝３０μｇ／ｍｉでは４０％であり、この割合以 上では１００％であった（培地表面物質の分析は行わなかった）。

最初の２人のドナーについての結果から５μｇ／ｍ１以下の投与量では不活性で あることが示されたので、第２のシリーズの実験から、５．１０及び２０μｇ／ ｌｒ＋１の投与量を選択した。

化合物Ｈの直接的活性 一一次サイトカイニンの生成について：＊−投与においてだけ、ＴＮＦ−αの生 成が増大（ドナー＃７）；この効果はＩＦＮ−γに対する応答においても検出さ れた。

＊　ＩＬ−Ｉβの生成が増大し、投与効果を示すが（ドナー＃３．５及び６）、 この効果は二次的であった（ｍａｒｇｉｎａｌ）。しかしながら、ドナー＃１０ は１０及び２０μｇ／ｒｎｌの投与に対して良好に応答した。

−二次サイトカイニン（インターロイキン−６）の生成について：＊応答におけ る変化は認められなかった。

化合物Ｈの間接的活性 一一次サイトカイニンの生成について：＊　ＴＮＦ−αの生成：生成が明確に減 少したが、これは化合物Ｈを多量に投与した場合でけである（２０　ｕｇ／ｒｎ ｌｌ　）（Ｐ＜０．０５）。

＊　ＩＬ−Ｉβの生成二ＬＰＳ又はＩＦＮ−γ＋ＬＰＳに対する応答に重大な変 化はなかった。

一二次サイトカイニン（インターロイキン−６）の生成について：＊　ＩＬ−６ の生成は明らかに減少した；この抑制は全体的なものではなく、ＴＮＦ−αの場 合と異なり、投与量−依存性であった（ｐ＜０．０５）。

これらの種々の結果は第３図及び第４図に示されている。これらの図において測 定投与量はサイトカイニンのμｇ／ｌｌ１ｌで示されており、標準変差は、これ らは常に平均値より１０％低いので正確ではない。

ＩＩ、　ＩＩＩＶ−陽性ドナ一 種々のＩＩＩＶ−陽性ドナーから採取した単球の応答を自然応答（ｓｐｏｎｔａ ｎｅｏｕｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ）について試験した。受容された細胞（ｒｅｃｅ ｉｖｅｄ　ｃｅｌｌ）の量は少なく　（ドナーはシタフエレシー（ｃｙｔａｐｈ ｅｒｅｓｙ）によって影響されなかった）、従って、実験は利用し得る細胞の数 によって制限された。

化合物Ｈの直接的活性 一一次サイトカイニンの生成について。

ＴＮＦ−α又はＩＬ−Ｉβについて、塩基（ｂａｓｅ）の生成に変化はなかつｔ こ。

−二次サイトカイニンの生成について：１０人のドナー中の８人がインターロイ キン−６における大きな自然的応答を示した。

化合物Ｈの間接的活性 一一次サイトカイニンの生成に対する影響。

健康なドナーについて得られた結果と同一の結果が得られた。即ち、ＴＮＦ−α の生成が殆ど全体的に減少しく２０μｇ７ｍｌの投与量（こおいてのみ）また使 用した３種の投与量におけるインターロイキン−１の生成に対する影響はなかっ た（Ｐ　＜　０．０５）。

−インターロイキン−６の生成に対する影響。

化合物Ｈと同時にインターロイキン−４を使用した；その理由はこれらの実験以 前にこのサイトカイニンはある種のＨＩｖ−陽性患者においてはインターロイキ ン−６の自然的生成が封鎖されることが示されていたことにある。

５つのケースの場合には比較のためインターロイキン−９を使用した；その理由 はこのインターロイキン−９もＬＰＳによって刺激された正常な単球における比 −６の生成を封鎖するからである。

得られた結果は下記の通りであった： ＊インターロイキンー４はＩＬ−６の生成を抑制したが、こび抑制は全体的では なかった（Ｐ＜０．０５）。

＊インターロイキンー９は自然的生成を部分的に（最大で５０％まで）抑制した ；インターロイキン−９はインターロイキン−４の効果に追加的な効果を示さな かった（実際に、５つのケースの内、２つにおいては、これらの効果の中和を生 じた；これらの結果は表には示されていない）。

＊化合物Ｈは抑制効果を示し、投与量の影響（ｄｏｓｅ　ｅｆｆｅｃｔ）は非常 に明確であった（約＜　０．０５）。しかしながら、この化合物はＩＬ−６の自 然的生成に対する全体的な抑制はもたらさなかった。これに対して、インターロ イキン−４が存在する場合には、増幅効果が常に得られ（＃４の場合を除（）、 化合物Ｈの投与量が３μｇ／ｌｌＩｎの場合に（しばしば、１μｇ７ｍｌ）から の場合でも）生成が全体的に消滅した。

結論ニ ー化合物Ｈはこれらの実験の構成内で使用された細胞、例えば、健康なドナー及 び非症候性ＨＩＶ−陽性ドナーから採取されたヒト単球に対して、生体外で２０ μｇ７ｍｌより高い投与量において毒性であることが認められた； −化合物Ｈはサイトカイニンの生成を調整（ｍｏｄｕｌａｔｅ）　Ｌ得ることが 認められた：このことは一次サイトカイニンについては直接的にあてはまるが、 この効果は小さかった；間接的にはこの変性はＴＮＦ−α及びＩＬ−６の場合に は認められたが、ＩＬ−１の場合には認められなかった。化合物Ｈは若干のＨＩ Ｖ−陽性患者において示されるＩＬ−６の自然的生成も抑制した。これらの実験 においては全体的でないこれらの抑制効果は比−４の存在により増幅された。

−ＩＬ−１の生成の抑制の場合を除いて、ＨＩＶ−陽性患者におけるＩＬ−６及 びＴＮＦ−α応答の正常化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）は極めて大であった ；その理由は化合物Ｈは単球とリンパ球の間の潜在的免疫関係又は骨髄のストッ ク細胞の刺激及び一般的水準についての防御反応の形成ごとき生存に必要な大部 分の炎症反応を変性しないからである。

フラボペレイリンの臨床耐性（ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｔｏｌｅｒａａｎｃｅ）及び 効率。

０、２−０．４ｘ１０９／ｌの絶対値の全７４１ルパ球数を有する２４人のＨＩ Ｖ陽性患者について臨床試験を行った。使用されている活性成分と試験の時に使 用されている他の抗レトロウイルス医薬を全ての患者に知らせた。患者の選択は Ｔ４リンパ球の絶対数に基づいて行った：９０％に等しいか又はそれ以上のカル ノフスキー指数（Ｋａｒｎｏｆｓｋｙ　１ｎｄｅｘ）を有する、２回の連続的試 験（ＥＬＩＳＡ法）においテＣＤＣ８７分ｉ中ノ群ＣＤＣＩＩ、　ＣＤＣＩＩＩ 、　ＣＤＣＩＶ　Ｃ２、ＣＤＣＩＶ　Ｅがラノ抗−ＦＩＩＶ　Ｉ抗体の存在を示 す、１００−１２０　ｇｅ１以上のヘモグロビン、１．５　ｘ　１０９／１以上 の好中球多核白血球（ｎｅｕｔｏｒｏｐｈｉｌｅｐｏｌｙｎｕｃｌｅａｒ）、８ ０ｘ１０９／Ｉ以上の血小板数、０．２　ｘ　１０”　／Ｉ以下及び０．４　ｘ 　１０９／１以上の７４１ルパ球数を有する、そして、特に、＾ＺＴによる抗レ トロウイルス療法を行っていない１８才以上の男子及び女子。

２０人の患者は上記の基準に基づいて受容された。検査を行う前に、各々の患者 に予備臨床検査を行った：臨床後（ｐｏｓｔｃｌｉｎｉｃａｌ）及び治療履歴（ ｈｉｓｔｏｒｙ）、熱、食欲欠乏及び吐気、頭痛、かゆさくｐｒｕｉｔｕｓ）　 、咳及び咳、下痢、線区（ａｄｅｎｏｐａｔｈｙ）、頬真菌症（ｂｕｃｃａｌ　 ｍｙｃｏｓｅ）、脂漏性皮膚炎及びカボジ病（Ｋａｐｏｓｉｏｓ　１ｅｓｉｏｎ ）。

生物学的試験も行った；この試験は赤血球（ｒｅｄ　ｃｏｒｐｕｓｃｌｅｓ）、 血小板、リンハサフークルーフ（ＣＤ２、ＣＤ４、ＶＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ４／ ８）、抗原Ｐ２４及びマイクログロブリン　ベーター−２の測定、ＤＥＩＬ　［ 脱水素ラクテート（ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ　１ａｃｔａｔｅ）］　、プ ラズマフェリチン（ｐｌａｓｍａｔｉｃ　ｆｅｒｒｉｔｉｎ）、＾ＬＡＴ（アラ ニン−アミノトランスフェラーゼ）　、ＡＳＡＴ　（アスパレートーアミノトラ ンスフェラーゼ）及びプラズマクレアチニンの測定を包含していた。

フラボペレイリン（化合物Ｈ）は６００　ｍｇカプセルの形で、１日当り１〜３ 　ｇ、好ましくは、少なくとも、約１ｇの投与量（この投与量は通常１日間有効 である）を投与した。平均的処置期間は４３±１１週であった。副作用は僅かで あり、最初の３か月間だけ生じた。血液毒性も腎臓毒性も観察されなかった；＾ ＬＡＴ及びＡＳＡＴにおける重大な変化はなかった。ＣＤＣ分類（ＣＤＣｃｌａ ｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）における劣化及び感染は認められなかった。全ての場 合においてカルノフスキー指数は約１００の水準のままであり、患者の部分につ いての物理的な及び特定の活性（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ ）は完全に正常なままであった。

処理に対する免疫応答は、主として、ＣＤＪ＋細胞の顕著な増大（Ｐ　＜　０． ０５）並びにＣＤ１９＋細胞の顕著な増大（Ｐ＜　０．０５）として表現された 。ＣＤ４の負の勾配（ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｄｅｃｌｉｎｅ）は１９人の患者中、 １８人において逆転した（Ｐ　＜　０．０５）。

生体外及び生体内での全ての結果はフラボペレイリン化合物はヒト細胞において は生体外で、ＨＩＶ−１感染患者においては生体内で、ＢＩＶのウィルス感染能 力に対して大きい抑制効果を発揮することを明らかに示している。

１年に亘って処置を受けた患者の１０人においては、以下のごとき顕著な変化が 更に認められたニ ー９か月での赤色細胞（ｒｅｄ　ｃｅｌｌ）の増加；−９か月でのヘモグロビン の増加； −９か月及び１２か月での全リンパ球塊（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ｍａｓｓ）の 増加ニー９か月でのＣＤ２の増加。

−１２か月でのＣＤ４の増加。

−９か月てのＣＤ８の増加； −６−９月及び１２か月てのＣＤ１９の増加；−３−６月及び１２か月でのマイ クログロブリンの増加。

実際には、例えば、錠剤又はカプセルのごとき固体の形で、理想的には経口投与 することが推奨される。約２５０〜５ｏｏ　ｍｇの活性成分の単一投与が特に好 ましい。

上記の結果及び毒性の指標から、推奨される投与量は約１〜３ｇであり、これは 通常１日間活性を示す量（ｇ／ｄ）であり、そして、好ましくは少なくとも約１ 　ｇ／ｄであり、−日のコースに亘って連続的な間隔を置いて摂取することが最 も適当である。

しかしながら、投与量及び／又は保持されるガレン製剤は患者の状態及び処置さ れるウィルスによる発病の段階に従って変動し得る。

特定の処置に関連する特定の場合への適合は専門家により、その経験にもとづい て、必要ならば、日常的な予備検査を行って、達成し得る。これに関して、半減 期を決定するために、及び、必要に応じて、投与のための医薬製剤の形を適合さ せるために、投与される活性成分について行われた薬力学的研究によって提供さ れるデーターに十分な注意を払うことが特に推奨される。医薬製剤は例えば徐放 性（ｔｉｍｅ−ｒｅｌｅａｓｅ）ガレン製剤の形を取り得る。

活性成分又はその塩又は他の誘導体の他に、投与するための単位投与医薬は少な くとも１種の支持体（ｓｕｐｐｏｒｔ）又はベクター並びに賦形剤、担体及び標 準的な香料及び／又は着色剤を含有している。

表Ｉｖ 化合物Ｉ＋によるウィルスイノキュラムの予備処理（３回の重複試験）ウィルス 　Ｈで２時間　ＢＩＶ　Ｐ２４の感染後の生成ストック　予備処理した　（ｐｇ ／ｍ＊）（］、ｎｇ／ｍＩ）　ＩＩＩＶ　ｄ３　ｄ５　ｄ１４　ｄ２１　ｄ３０ １１１Ｖ−Ｌ　Ａ、。　対照　２５０＋２５　＞１５００ＨＩｖ−ｔ　Ａｉｄｓ 　対照　５７５±１２９５人の無作為的に選択された、健康なＩＩＩＶ−陰性ド ナーから採取した、再単一化した末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）表■ 化合物１１による標的細胞の予備処理（３回の重複試験）ウィルス　■で２時間 　１１１Ｖ　Ｐ２４の感染後の生成ストック　予備処理した　（ｐｇ／ｍ／）（ Ｉｎｇ／ｍ／）　ＰＢＭＣ＊ｄ３　、ｄ５　ｄｌ４　ｄ２１　ｄ３０１（ＩＶ− Ｉ　Ａｓ、、　対照　２５０±２５　＞１５００（ストックＢｒ、、ｔ　）　＋ ３０　ｕ　ｇ／　ｒｘ１１１３±７　＞１５００＋６０μｇ／ｒｎｌ　−−−ｍ − １１１Ｖ−Ｉ　Ａｉｄｓ　対照　５７５±１２９　＞１５００（ストｙ　りＴｉ 、ｒ）　＋３０　μｇ／　ｍｌ　５１５　＋１０３　＞１５００＊　５人の無作 為的に選択された、健康なＩＩＩＶ−陰性ドナーから採取した、再単一化したＰ ＢＭＣ 表ｖ■ 静止中のヒトＰＢＭＣ及びＰＦＩ＾により刺激されたＰＢＭＣ（幼若）における 化合物Ｈの細胞毒性（試験は５回反復） 標的細胞　＋１で処理した　化合物１１に暴露後のＰＢＭＣの生存率（％）細胞 （２時間）　ｄ３　ｄ７　ｄｌ、１　ｄｌ３　ｄ１５＋３０　μｇ／　ｍｌ　９ ５±４　９３±２　８８±７　８２±１０　８１±１１＋６０　ｔｔｇ７　ｍｌ 　５６±６２３±４１７±４１２±５２５±８幼若細胞°°　対照　８６±５８ ４±６７６±４７５±５６８±７＋３０　μｇ７　ｍ１８８±３８５±７７１± ３７６±９６９±８＋６０　μｇ／　ｍｌ　７９±４７４±５７０±４７１±８ ６３±７・　５人の無作為的に選択された、健康なＩＩＩＶ−陰性ドナーから採 取した、再単一化したＰＢＭＣ。

・・　５人の無作為的に選択された、健康なｎＩＶ−陰性ドナーから採取した、 ＰＩＴ＾により刺激された幼若細胞。

表ＶＴＩ ヒトへＢＯ血清の不存在下での化合物Ｈによるウィルスイノキュラムの予備処理 （試験は５回反復） ＩＩ　テ２時間１１１Ｖ中Ｔｆ７）　Ｐ２４ノ生成（ｐｇ／ａｌ）予備処理した 旧Ｖ　ｄ４　ｄｌｏ　ｄｌ４　ｄ２１ ＋２００μｇ／　ｍｌ　−−−− ＋３０　ｕｇ／　ｍｌ　１７３±１０２　＞　１５００＋ＩＯｔ１ｇ／　ｍｌ　 ３８８±１２４　＞　１５００５人の無作為的に選択された、健康なＩＩＩＶ− 陰性ドナーから採取した、再単一化した末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）表ＶＩＩ Ｉ ヒトＡＢ群血清の存在下での化合物＋１によるウィルスイノキュラムの予備処理 （試験は３回反復） ■で２時間　５０％の　ｎＩＶ中でのＰ２４の生成（ｐｇ／　ｖａｔ　）予備処 理した　ＡＢ血清 Ｈ■ｖノ存在／　ｄ４　ｄｌｏ　ｄｌ４　ｄ２１対照　５１０±２３５　＞　１ ５００ ＋３０μｇ／ｍｌ　＋　２７５±９８　＞　１５００ｎｏ　μｇ／　ｒａｌ＋　 ３８４±８３　＞　１５００５人の無作為的に選択された、健康なＩＩＩＶ−陰 性ドナーから採取した、再単一化した末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）表ＩＸ ヒト八Ｂ群血清の存在下又は不存在下での、ＰＨ＾で刺激されたヒトＰＢＭＣ（ 幼若）　に対する化合物Ｈの細胞毒性（試験は５回反復）Ｈで処理　５０％の　 ＰＢＭＣ＊に！露した後の化合物１１の細胞毒性した細胞　＾Ｂ血清の　ｄ４　 ｄｌｏ　ｄ１４　ｄ２１（２時間）　存在／不存在 （＋／−） ＋２００μｇ７ｍｌ　−４５±６．３　３３±７．８　２４±７．６　１５±５ ．４＋１００μｇ／ｌｌ１ｌ−８４±１．６　７９±３．１　７３±５．３　７ ４±４．７＋６０μｇ／ｌｌｌ　−８６±１．５　８２±２．４　８２±２．６ 　８０±３．３＋３０　ｕｇ／　ｒｏｌ　−８１±２．８　８３±２．６　８０ ±３．９　７８±４．５＋ＩＯｔｔｇ７　ｍｌ　−８７±１．２　８６±１．４ 　８４±１．５　８１±２．３＋２００μｇ／　ｍｌ　＋　３７±６．８　２４ ±６．６　１７±７．９　１１±５．６＋１．ＯＯμｇ／　ｒｎｌ　＋　８３± ２．３　８０±４．５　７７±５．６　７３±４．４＋６０　μｇ／　ｍｌ　＋ 　８５±１．２　８４±１．７　８２±２．１　７９±３．５＋３０　μｇＺＩ Ｉｌｌ＋８８±１．３　８４±２．５　８２±３．７　８１±４．６＋１０μｇ ／のｌ　＋　８７±１．１　８８±１．４　８４±３．２　８２±３．１＊　５ 人の無作為的に選択された、健康なＨＩＶ−陰性ドナーから採取した、ＰＦＩ＾ により刺激された幼若細胞。

＊＊　生存細胞のパーセンテージ（平均上標準変差）。

国際膿杏輔牛 、　、陶ＰＣＴ／Ｉ’１１９３１００７６１

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．唯一の活性成分としてのフラポペレイリンを、単位投与当り、約２５０〜５ ００ｍｇのフラポペレイリン又はフラポペレイリン塩又は他の薬理学的に許容さ れる適当な誘導体を含有する固体の形で含有することを特徴とする、ＨＩＶウイ ルスに対する医薬として使用するための医薬組成物。
2. ２．錠剤又はカプセルの形である、請求の範囲１に記載の組成物。
3. ３．徐放性ガレン製剤の形である、請求の範囲１又は２に記載の組成物。
4. ４．フラポペレイリンはパオペレイラゲイソスペルムペロシイーパイロンの根か ら抽出する、請求の範囲１に記載の組成物。
5. ５．ＨＩＶウイルスの抗菌的処置に使用する医薬を提供するための、単一の活性 成分としてのフラポペレイリンを含有する医薬製剤の利用。
6. ６．フラポペレイリンは請求の範囲１〜４に記載の特定の製剤の形で提供される 請求の範囲５に記載の利用。