PT2723850E - Método para cultura de células em meio contendo um lisado de plaquetas - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"MÉTODO PARA CULTURA DE CÉLULAS EM MEIO CONTENDO UM LISADO DE PLAQUETAS"

Antecedentes da invenção A invenção refere-se a um método para cultura de células aderentes utilizando um meio liquido compreendendo lisado de plaquetas sanguíneas e uma substância inibidora da gelatinização. A invenção refere-se ainda a um sistema bifásico e um gel para cultura de células. Técnica anterior

As células são normalmente cultivadas em meios que são suplementados com soro fetal de vitelo (FCS) ou outros soros sanguíneos de modo a proporcionar às células factores de crescimento essenciais.

Embora qualquer tipo de célula não precise realmente de soro para o crescimento, a maior parte dos tipos de células sensíveis, e.g., células estaminais, são por agora ainda dependentes de meios contendo soro. No entanto, à luz das aplicações terapêuticas, há um interesse crescente em evitar a utilização de FCS devido a potenciais reacções imunitárias xenogénicas (e.g., anticorpos anti- FCS), agentes patogénicos de bovinos (vírus e priões) e uma elevada variabilidade de lote para lote que dificulta a reprodutibilidade dos resultados (Heiskanen et al.,2007; Sundin et ai., 2007) . Meios de cultura sintéticos definidos quimicamente estão agora disponíveis comercialmente, mas a sua composição exacta muitas vezes não é revelado e frequentemente incluem outros componentes xenogénicos como factores de crescimento recombinantes. O lisado de plaquetas humano (HPL) representa outra alternativa atraente ao FCS. O HPL pode ser gerado a partir de unidades de plaquetas comuns através de um procedimento simples de congelação-descongelação. É até possível usar HPL do mesmo doador para minimizar mais ainda o risco de efeitos secundários imunológicos ou infecções virais. Estes estudos foram realizados com células estro-mais mesenquimatosas (MSC) de medula óssea e recentemente foi demonstrado que o HPL também pode ser utilizado para o isolamento de MSC de tecido adiposo humano (Blande et al., 2009) .

Um método para a preparação de lisado de plaquetas sanguíneas e um meio de HPL é conhecido da EP 0413727 BI. De acordo com este método conhecido é adicionado citrato a sangue total de modo a evitar a coagulação. O plasma derivado deste sangue é centrifugado de modo a se obter uma pasta rica em plaquetas e é então adicionado Ca2+ para lisar as plaquetas e coagular os restantes componentes. O lisado transparente filtrado é misturado com uma composição nutriente convencional de modo a se obter um meio contendo HPL.

Além disso, o WO 2008/034803 AI descreve um suplemento de meio de cultura de células compreendendo ligado de plaquetas isento de plasma. O suplemento compreende ainda substâncias adicionais como albumina e dextrano. A fim de preparar o suplemento, as plaquetas são lisadas congelando-as e descongelando-as e adiciona-se ácido citrato e dextrose (ACD) ou citrato fosfato e dextrose (CPD) como anticoagulante.

No entanto, muitas células, e.g., células estro-mais mesenquimatosas (MSC), crescem numa monocamada aderente plástica até que serem inibidas por contacto. Mais cedo ou mais tarde, a velocidade de proliferação das células decai até que por fim alcançam um estado de senescência. Isto é acompanhado pela morfologia ampliada, expressão reduzida de marcadores à superfície e potencial de diferenciação diminuído. Este processo não ocorre em paralelo através das células em cultura devido a diferentes subpopulações, apoptose, e por último mas não menos importante, inibição do contacto no seio das colónias. Uma densidade de sementeira mais baixa facilita maiores intervalos para repicagem das células e assim a proliferação só pode ocorrer na borda das colónias maiores. Consequentemente, quando se utiliza culturas em monocamada aderente plástica, dificilmente é possível realizar uma expansão fiável e minimizar inibição por contacto. Além disso, a repicagem de células não é possível sem utilização também de um tratamento com peptidase que danifica as células. Com culturas de células estaminais, uma outra desvantagem das culturas em monocamada aderente plástica é que a superfície plástica pode causar diferenciação indesejada das células.

Sumário da invenção 0 objecto da invenção é proporcionar um método para a cultura de células aderentes e um substrato para cultura de células que permita uma expansão fiável das células, em que a inibição por contacto é minimizada e a repicagem das células é possível sem necessidade de um tratamento enzimático. 0 objecto é conseguido proporcionando um método compreendendo a cultura de células na superfície e/ou no seio de um substrato tridimensional semelhante a gel compreendendo 1-40% (concentração em volume) de lisado de plaquetas sanguíneas (BPL) mas estando substancialmente isento de uma substância inibidora da gelatinização, em que um meio liquido compreendendo lisado de plaquetas sanguíneas e uma substancia inibidora da gelatinização é colocado em camada sobre o substrato semelhante a gel. A gelatinização de lisado de plaquetas sanguíneas puro ou de uma composição compreendendo lisado de plaquetas sanguíneas, que está isento de qualquer substância inibidora da gelatinização como a heparina, ocorre espontaneamente a cerca de 37 °C dentro de uma hora. Surpreendentemente, a adição de agentes de indução da coagulação, como trombina e/ou gluconato de cálcio, não é necessária para a gelatinização. Além disso, constatou-se que o substrato do tipo gel resultante é um substrato perfeito para a expansão de células aderentes, em especial células estromais mesenquimatosas (MSC) ou fibroblastos. A utilização de um substrato do tipo gel compreendendo lisado de plaquetas sanguíneas evita o risco de reacções imunológicas xeno-génicas ou transmissão de agentes patogénicos de bovinos e também é mais eficiente do que o FCS para expansão de células em larga escala, especialmente MSC de tecido adiposo. Por exemplo, o lisado de plaquetas humano (HPL) aumenta significativamente a velocidade de proliferação e número máximo de duplicações da população cumulativa de MSC derivadas de tecido adiposo. Assim, o método de acordo com a invenção permite a expansão fiável de células aderentes e a minimização eficiente da inibição por contacto uma vez que as células podem crescer tridimensionalmente no seio do substrato, i.e., em multicamadas, enquanto os factores de crescimento estão uniformemente disponíveis em todas as direcções. Além disso, é possivel a repicagem das células sem necessidade de um tratamento enzimático, por exemplo, uma digestão com tripsina/EDTA, e um passo de centrifugação. Uma vez que o substrato semelhante a gel é biocom-pativel e portanto proporciona um ambiente fisiológico para as células, o risco de qualquer influência indesejada sobre as células é minimizado. Por exemplo, a diferenciação indesejada de células estaminais pode ser eficazmente evitada. Além disso, cobrindo a superfície do substrato semelhante a gel com um meio liquido compreendendo lisado de plaquetas sanguíneas e uma substância inibidora da gelatinização proporciona com vantagem um ambiente homogéneo para as células e assegura assim condições de cultura óptimas.

Numa forma de realização preferida da invenção, o meio liquido e o substrato semelhante a gel, fora a substância inibidora da gelatinização, têm uma composição substancialmente idêntica, de modo que os factores de crescimento e nutrientes estão uniformemente distribuídos em todo o sistema de cultura e até as células na superfície do substrato semelhante a gel podem ser cultivadas em condições homogéneas.

Numa forma de realização da invenção, a repicagem colheita de células é realizada por degradação enzimática do substrato semelhante a gel, preferencialmente utilizando uma peptidase, em particular plasmina. Alternativamente, a repicagem ou colheita de células pode ser realizada por fragmentação mecânica da estrutura semelhante a gel, preferencialmente por pipetagem, opcionalmente seguida por tratamento com tripsina/EDTA ou tratamento com EDTA para singularização das células. Contudo, como mesmo uma simples pipetagem sem qualquer tratamento enzimático é suficiente com o método de acordo com a invenção, a utilização de quaisquer enzimas durante a repicagem das células pode ser evitada.

Preferencialmente, a substância inibidora da gelatinização compreende heparina ou uma heparina de baixo peso molecular (LMWH) como Clexane® (Sanofi-Aventis, Paris, França). Numa forma de realização preferida da invenção, o meio liquido compreende 0,1-100 U/mL de heparina como substância inibidora da gelatinização, preferencialmente 0,1-10 U/mL, em particular 0,2-5 U/mL. Se se utilizar Clexane®, esta LMWH pode preferencialmente ser proporcionada numa concentração de 0,001-1 mg/mL, preferencialmente 0,005-1 mg/mL, em especial 0,005-0,5 mg/mL.

Noutra forma de realização preferida, tanto o meio liquido como o substrato semelhante a gel estão substancialmente isentos de soro de modo a evitar quaisquer reacções imunitárias xenogénicas ou infecções patogénicas. Assim, o método de acordo com a invenção é adequado para proporcionar células para aplicações terapêuticas.

Preferencialmente, as células são estaminais ou progenitoras, particularmente preferidas células estaminais mesenquimatosas, em particular células estromais mesen-quimatosas. Noutra forma de realização preferida da invenção, as células são células mesodérmicas, preferencialmente fibroblastos ou células estromais mesenquimatosas. Mas, obviamente, o método de acordo com a invenção também pode ser adequado para a cultura de outros tipos de células, por exemplo células derivadas de linhagens ectodérmicas ou endodérmicas. Além disso, o método de acordo com a invenção é bem adequado para a cultura de células primárias. 0 objecto é ainda realizado por um método para a produção de um substrato tridimensional semelhante a um gel, compreendendo o referido método: a) Proporcionar um concentrado de trombócitos; b) Colher plaquetas sanguíneas do referido concentrado; c) Lisar as plaquetas sanguíneas; d) Adicionar pelo menos um componente do meio ao lisado de modo a obter um meio compreendendo 1-40% de lisado de plaquetas sanguíneas; e e) Deixar o meio de lisado de plaquetas sanguíneas gela-tinizar a aproximadamente 37 °C de modo a se obter um substrato semelhante a gel compreendendo lisado de plaquetas sanguíneas.

Surpreendentemente, constatou-se que o lisado de plaquetas sanguíneas, quer puro quer diluído, gelatiniza espontaneamente a cerca de 37 °C sem necessidade de adicionar qualquer agente indutor de coagulação como, por exemplo, trombina e/ou gluconato de cálcio.

Numa forma de realização preferida deste método, o componente meio compreende uma composição de meio para cultura de células padronizada, preferencialmente meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), em particular DMEM com baixo teor de glucose (DMEM-LG). Assim, é proporcionado um meio contendo factores de crescimento essenciais e todos os nutrientes necessários para a cultura de células sem componentes de soro indesejados.

De acordo com uma forma de realização preferida da invenção, o substrato pode compreender 5-40% de lisado de plaquetas sanguíneas, mais preferido 5-20% de lisado de plaquetas sanguíneas, em particular aproximadamente 10-20% de lisado de plaquetas sanguíneas. Por exemplo, o substrato semelhante a gel de acordo com a invenção pode consistir essencialmente em 10% de HPL, 8 9% de DMEM e 2 mM de L-glutamina. O objecto é ainda realizado por um sistema bi-fásico compreendendo (a) um meio liquido compreendendo lisado de plaquetas sanguíneas e uma substância inibidora da gelatinização e (b) um substrato tridimensional semelhante a gel compreendendo 1-40% de lisado de plaquetas sanguíneas, mas estando substancialmente isento de uma substancia inibidora da gelatinização.

Numa forma de realização preferida do presente sistema bifásico, o meio liquido e o substrato semelhante a gel, para além da substância inibidora da gelatinização, têm uma composição substancialmente idêntica. Preferencialmente, a substância inibidora da gelatinização na fase liquida do sistema bifásico compreende heparina. A invenção é adicionalmente descrita em pormenor com referência às figuras.

Breve descrição das figuras A Figura 1 mostra uma representação esquemática de arranjos experimentais para demonstrar a invenção. As células são cultivadas quer convencionalmente directamente em plástico de cultura de células quer num gel de acordo com a invenção compreendendo lisado de plaquetas humanas (HPL) , mas que está isento de heparina. 0 meio de cultura liquido contém componentes essencialmente idênticos mas adicionalmente inclui heparina para inibição da coagulação. As células podem ser colhidas por degradação do gel de HPL usando plasmina ou por pipetagem. A Figura 2 mostra um diagrama de barras que demonstra a proliferação de células estromais mesenquimatosas (MSCs) em diferentes superficies (barras brancas: superfície de plástico; barras cinzentas: gel de colagénio; barras pretas: gel de HPL). As MSCs foram cultivadas em meio de cultura compreendendo diferentes concentrações de lisado de plaquetas humanas (HPL) e o número de células foi determinado após sete dias utilizando um ensaio de MTT. A concentração HPL no seio do gel era respectivamente consistente com a concentração de HPL no meio liquido. A proliferação celular em gel de HPL em comparação com a proliferação em plásticos e gel de colagénio mostra diferenças significativas (n = 5) . A Figura 3 mostra um diagrama de barras que demonstra a proliferação de células estromais mesen-quimatosas (MSC) para diferentes métodos de repicagem em células com gel compreendendo lisado de plaquetas humanas (HPL) . As MSC foram cultivadas durante sete dias em geles de HPL e, para efeitos de comparação, em plásticos de cultura de células. As células foram colhidas utilizando tratamento com plasmina ou pipetagem, com ou sem tratamento subsequente com tripsina/EDTA ou tratamento com EDTA, respectivamente, e depois transferidas para uma nova placa de cultura de células contendo meio sem HPL. Após mars um dia de cultura, o número de células foi determinado por um ensaio de MTT. Por razões de controlo, os valores resultantes (barras pretas) foram normalizados a valores de plástico de cultura de células (barra branca, OD590 = 1) . N = 3, é indicado o desvio padrão.

A: Cultura em plásticos, repicagem por tripsina/EDTA B: Gel de HPL, repicagem por pipetagem C: Gel de HPL, repicagem por pipetagem e tratamento com

EDTA D: Gel de HPL, repicagem por pipetagem e tratamento com

tripsina/EDTA E: Gel de HPL, repicagem por degradação com plasmina do gel F: Gel de HPL, repicagem por degradação com plasmina e

tratamento com EDTA L. Gel de HPL, repicagem por degradação com plasmina e tratamento com tripsina/EDTA. A Figura 4 mostra um diagrama que ilustra a proliferação de células estromais mesenquimatosas (MSC) derivadas de medula óssea (BM) ou de tecido adiposo (TA) em função da concentração de heparina ([U/mL]) no seio do meio liquido. As MSC foram cultivadas durante sete dias em geles de HPL cobertos com meio de HPL liquido com diferentes quantidades de heparina. 0 número de células foi determinado após sete dias utilizando um ensaio de MTT (OD 590 nm). A Figura 5 mostra um diagrama que ilustra a proliferação de células estromais mesenquimatosas (MSC) derivadas de medula óssea (BM) ou de tecido adiposo (AT) em função da concentração de Clexane® (heparina de baixo peso molecular (LMWH) da Sanofi-Aventis, Paris, França) ([mg/mL]) no seio do meio liquido. As MSCs foram cultivadas durante sete dias em geles de HPL cobertos com meio de HPL liquido contendo diferentes concentrações de LMWH. O número de células foi determinado após sete dias utilizando um ensaio de MTT (OD 590 nm). A Figura 6 mostra um diagrama que representa a elasticidade de geles de HPL em função da concentração de HPL (A) e micrografias que demonstram que MSC crescem na interface do gel de HPL e meio de HPL (B-E) . O meio de cultura de células contendo lisado de plaquetas humanas sem substância inibidora da gelatinização (anticoagulante) foi gelatinizado em poços de fundo fino de cultura de células nas concentrações indicadas. Cada concentração de HPL foi analisada quanto à elasticidade em duas amostras independentes com uma a três determinações por amostra. A elasticidade do substrato de gel de HPL era muito baixa e correlacionada com as concentrações de HPL (A) . Os valores médios da elasticidade estão indicados como uma linha fina. Em seguida, foram semeadas MSC no topo com o mesmo meio de cultura suplementado com heparina. Secções histológicas após 4 dias de cultura de células mostraram o crescimento celular em multicamadas na interface do gel de HPL e do meio de HPL (B) . A microscopia electrónica de varrimento (SEM) demonstrou a arquitectura de fibrina reticular do gel de HPL (C) . As MSC em TCP (D) e em gel de HPL (E) apresentaram a morfologia das MSC em forma de fuso típica. A Figura 7 mostra diagramas que demonstram o aumento da velocidade de proliferação e frequência de UFC-f em gel HPL. MSCs foram semeadas em placas com 96 poços ou em TCP, gel de colagénio ou em gel de HPL em meio de cultura suplementado com 1%, 5%, 10% ou 20% de HPL. Após 7 dias a proliferação foi avaliada com o ensaio de MTT (por favor note que este ensaio proporciona uma medida relativa que pode variar entre experiências) . Globalmente, o crescimento celular foi estimulado com concentrações mais elevadas de HPL e foi significativamente aumentado em gel de HPL em comparação com TCP e gel de colagénio (A; n = 7). Além disso, a proliferação de MSC foi maior em gel de HPL do que em gel de fibrina (B; n = 3) . Também foi observado um efeito semelhante de suporte do crescimento do gel de HPL para fibroblastos dérmicos (C; n = 4). A velocidade de proliferação de MSC foi também analisada no decurso da expansão da cultura após 2, 5, 7, e 9 dias em 10% de HPL (D; n = 3). Para quantificar a formação inicial de colónias em TCP ou em gel de HPL as células foram semeadas em diluição limitante em placas com 96 poços. Após 14 dias, os poços foram classificados quanto à formação de colónias utilizando um ensaio de MTT e a frequência UFC-f foi determinada pela estatística de Poisson (E; n = 3) *P<0,05; **P <0,005; ***P <0,0005. A Figura 8 mostra uma representação esquemática de arranjos experimentais (A) e diagramas que demonstram expansão da cultura e repicagem de MSCs em geles de HPL (B e C). Esquema de expansão da cultura em TCP ou gel de HPL: MSC em TCP foram continuamente repicadas depois de atingirem um nível de confluência de 80% com tripsina-EDTA. Em paralelo, células em gel de HPL foram colhidas em conjunto com o gel por pipetagem e novamente semeadas sem separação de MSC da sua matriz (A) . A cultura de longo prazo de MSC foi realizada em paralelo com ambos os métodos durante quatro repicagens consecutivas. As duplicações da população cumulativas (cPD) foram calculadas a partir da primeira repicagem em diante. Estão apresentados os dados representativos de três experiências independentes (B) . Para comparação dos diferentes métodos de repicagem 1000 MSC foram cultivadas de um dia para o outro em TCP ou gel de HPL. As MSC em TCP foram então repicadas com tripsina enquanto as células em gel de HPL foram propagadas em TCP ou por pipetagem, tratamento adicional com tripsina/EDTA ou incubação com plasmina. Após mais um dia as células aderentes e não aderentes foram determinadas utilizando o ensaio de MTT (C). A Figura 9 mostra uma comparação de MSCs cultivadas em plástico de cultura de tecidos e gel de HPL. As células foram isoladas e expandidas durante três repicagens quer em TCP, em gel de HPL, ou em gel de HPL com transferência para TCP durante uma repicagem adicional (A). São apresentados histogramas representativos para cada preparação de células. Todas as MSC revelaram o mesmo imunofenótipo CD14 + , CD31", CD34~, CD45“, CD29+, CD73+, CD90 + e CD105+ sem diferenças significativas na intensidade média do sinal (n = 4; normalizada para a autofluorescência correspondente). As MSC isoladas em TCP ou em gel de HPL em seguida foram então induzidas para linhagem adipogénica (B) ou osteogénica (C) em TCP convencional durante três semanas, enquanto a diferenciação condrogénica foi induzida em cultura em sedimento durante três semanas (D). A diferenciação foi analisada pelo corante verde fluorescente BODIPY, por coloração com Vermelho de Alizarina ou coloração com Azul Alciano, respectivamente. Estão apresentados os dados representativos de três experiências independentes. Barra da escala: 200 ym.

Descrição de formas de realização exemplifi-cativas e preferidas da invenção

As células estromais mesenquimatosas (MSC) são uma população de células biologicamente importante que é capaz de sustentar a hematopoiese, pode diferenciar entre linhagens mesenquimatosas e não mesenquimatosas in vitro, é capaz de suprimir repostas alogénicas e parece ser não imunogénica. Essas propriedades sugerem papéis emergentes para células estromais mesenquimatosas em terapêutica celular.

As MSC foram isoladas da cabeça do fémur na sequência de fractura da anca, após consentimento escrito utilizando as directrizes aprovadas pelo Comité de Ética da Universidade de Aachen. Os fragmentos ósseos foram lavados com PBS e as células mononucleares (MNC) subsequentemente isoladas por gradiente de densidade em Biocoll (Biochrom AG, Berlim, Alemanha). As células foram cultivadas em placas de cultura de células revestidas com fibronectina (Greiner, Kremsmunster, Áustria) em meio de Eagle modificado por Dulbecco com baixo teor de glucose (DMEM-LG; PAA, Pasching, Áustria) com 2 mM de L-glutamina (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e 100 U/mL de penicilina/estreptomicina (pen/strep; Lonza, Basileia, Suiça). O meio de cultura foi suplementado com FCS (Hyclone, Bonn, Alemanha) ou HPL consoante indicado. O meio de cultura foi sempre mudado duas vezes por semana. Quando atingiram 80% de confluência as células foram tripsinizadas, contadas numa câmara de contagem Neubauer (Brand, Wertheim, Alemanha) e novamente plaqueadas a 104 células/cm2. As duplicações de população cumulativas foram calculadas a partir da primeira repicagem em diante. Alternativamente, as MSC também podem ser isoladas de lipoaspirados. 0 lisado de plaquetas humanas (HPL) foi gerado a partir de unidades de plaquetas de dadores saudáveis como descrito por Horn et al. (2010) . Em particular, o HPL foi gerado por aférese utilizando o sistema de colheita Trima Accel (CaridianBCT, Garching, Alemanha). Esses concentrados de trombócitos tinha um teor de plaquetas de 2,0 a 4,2 x 1011 plaquetas em 200 mL de plasma suplementado com Ácido-Citrato-Dextrose (ACD) (01:11 v/v) . As unidades de plaquetas foram aliquotadas, congeladas duas vezes a -80°C, redescongeladas a 37°C e centrifugadas a 2600 g durante 30 min a 4°C para remover fragmentos celulares e combinadas em quantidades iguais. O sobrenadante foi filtrado através de dispositivo de filtro GD / X de PVDF de 0,22 pm (Whatman, Dassel, Alemanha), opcionalmente suplementado com 2 U/mL de heparina para evitar a gelatinização, e armazenado a -80°C.

As células foram cultivadas em placas de cultura de células (Greiner, Kremsmunster, Áustria) em meio de Eagle modificado por Dulbecco com baixo teor de glucose (DMEM-LG; PAA) com 2 mM de L-glutamina (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e 100 U/mL de penicilina/estreptomicina (pen/strep; Lonza, Basileia, Suíça). O meio de cultu-ra/substrato foi suplementado com FCS (Hyclone, Bonn, Alemanha) ou HPL como indicado na especificação. As células foram cultivadas a 37 °C numa atmosfera humidificada contendo 5% de dióxido de carbono com as mudanças de meio duas vezes por semana. A proliferação celular foi avaliada através do ensaio com brometo de tiazolil azul de tetrazólio (MTT). MSC foram semeadas numa placa com 96 poços (3000 célu-las/poço) em meio de cultura/substrato suplementado com 0, 1, 5, 10 ou 20% de FCS ou HPL como indicado na especificação. Após 7 dias de cultura, as células foram lavadas com PBS (PAA) e incubadas com 1 mM de MTT (Sigma-Aldrich) em PBS durante 3,5 h. A solução em excesso foi eliminada e os cristais foram resolvidos em HC1 4 mM em isopropanol (ambos de Roth, Karlsruhe, Alemanha). A densidade óptica (OD) foi medida ao comprimento de onda de 590 nm com um leitor de placas Infinite 2000 da Tecan (Tecan Trading, Mànnedorf, Suiça). A Figura 1 mostra arranjos experimentais para cultivar células quer directamente em plásticos de cultura de células (a) ou num gel de acordo com a invenção compreendendo lisado de plaquetas humanas (HPL) mas estando isento de heparina (b, c) . No método do estado da técnica de acordo com (a) , as células 1 estão directamente ligadas ao plástico de cultura de tecidos 2 e cultivadas num meio de HPL líquido 3 contendo heparina 3. De acordo com este método conhecido, as células 1 são colhidas por tratamento enzimático utilizando tripsina (I). No método de acordo com a Invenção (b, c), as células são cultivadas em e dentro de um substrato semelhante a gel 4 que compreende HPL mas está isento de heparina. O meio de cultura líquido 3, que cobre o substrato 4, contém componentes essencialmente idênticos mas adicionalmente inclui heparina para inibir a coa gulação. As células podem ser colhidas ou por degradação do substrato semelhante a gel 4 utilizando plasmina (II) ou por fragmentação do substrato semelhante a gel 4 utilizando uma pipeta 5 e subsequente ressemeadura (III). Como resultado, a repicagem em células é possível sem necessidade de um tratamento enzimático. Como o substrato semelhante a gel 4 é biocompatível e portanto proporciona um ambiente fisiológico para as células, o risco de qualquer influência indesejável nas células pelo plástico de cultura de tecidos 2 é minimizada. Além disso, cobrindo a superfície do substrato semelhante a gel 4 com um meio líquido 3 compreendendo lisado de plaquetas sanguíneas e uma substância inibidora da gelatinização vantajosamente proporciona um ambiente homogéneo para as células e assegura assim condições de cultura óptimas. A Figura 2 mostra a proliferação de células estromais mesenquimatosas (MSCs) em diferentes superfícies. As MSC foram cultivadas em meio de cultura compreendendo diferentes concentrações de lisado de plaquetas humanas (HPL) e o número de células foi determinado após sete dias utilizando um ensaio com MTT. A concentração HPL no seio do gel era respectivamente consistente com a concentração de HPL no meio líquido. A proliferação celular no gel de HPL de acordo com a invenção (barras pretas) foi significativamente aumentada em comparação com a proliferação em plásticos (barras brancas) ou gel de colagénio (barras cinzentas). 0 aumento da proliferação é directamente dependente da concentração do meio. Em conformidade, o lisado de plaquetas humanas (HPL) aumenta significativamente a velocidade de proliferação de MSC derivadas de tecido adiposo. Assim, o método de acordo com a invenção permite a expansão fiável das células e minimização eficiente da inibição de contacto uma vez que as células podem crescer tridimensionalmente no seio do substrato, i.e., em multi-camadas, enquanto os factores de crescimento estão uniformemente disponíveis em todas as direcções. A Figura 3 mostra um diagrama de barras que mostra a proliferação de células estromais mesenquimatosas (MSC) para diferentes métodos de repicagens de células com gel compreendendo lisado de plaquetas humanas (HPL). As MSC foram cultivadas durante sete dias em geles de HPL e, para efeitos de comparação, em plásticos de cultura de células. As células foram colhidas utilizando tratamento com plasmina ou pipetagem, com ou sem tratamento subsequente com tripsina/EDTA ou tratamento com EDTA, respectivamente, e depois transferidos para uma nova placa de cultura de células contendo meio sem HPL. Após mars um dia de cultura, o número de células foi determinado por um ensaio com MTT. Os valores da proliferação relativos mostram que a repicagem de células por simples pipetagem sem qualquer tratamento enzimático é uma forma vantajosa de destacar e ressemear as células uma vez que é evitada a danificação das células por digestão enzimática.

As Figuras 4 e 5 mostram diagramas que ilustram a proliferação das células estromais mesenquimatosas (MSC) derivadas de medula óssea (BM) ou de tecido adiposo (AT) em função da concentração de heparina ([U/mL]) e LMWH (Clexane®, [mg/mL]), respectivamente. Como se torna evidente a partir destes diagramas, o número de células aumenta com o aumento da concentração da substância inibidora da gelatinização, i.e. heparina ou Clexane®, até ser atingido um valor máximo. Se a concentração da substância inibidora da gelatinização dentro do meio liquido for aumentado ainda mais, o número de células diminui até não poder ser observada nenhuma proliferação a concentrações elevadas de heparina ou LMWH. As melhores velocidades de proliferação com heparina podem ser conseguidas na gama de 0,1-100 U/mL, preferencialmente 0,2-50 U/mL, particularmente preferido 0,2-10 U/mL, mais preferido ainda 0,5-10 U/mL. Com Clexane® as melhores velocidades de proliferação podem ser alcançadas na gama de 0,001-1 mg/mL, preferencialmente 0,005-1 mg/mL, em especial 0,005-0,5 mg/mL. Com baixas concentrações de substâncias inibidoras da gelatinização ocorre gelatinização. Por exemplo o meio liquido suplementado com 10% de HPL gelatiniza se só forem adicionados menos do que 0,1 U/mL de heparina ou menos do que 0,001 mg/mL de Clexane®.

Exemplo

Geração de lisado de plaquetas humanas:

As unidades de plaquetas foram gentilmente cedidas pelo Institute for Transfusion Medicine, RWTH

Aachen University Medical School após a sua data de validade (5 dias após a colheita). As unidades de plaquetas foram geradas por aférese utilizando o sistema de colheita Trima Accel (CaridianBCT, Garching, Alemanha) e compreendem 2,0-4,2 x 1011 plaquetas em 200 mL de plasma suplementado com Ácido-Citrato-Dextrose (ACD) (01:11 v/v) . Aliquotas de 45 mL foram congeladas duas vezes a -80°C e re-descongeladas a 37°C e depois centrifugadas a 2600 x g durante 30 minutos. O sobrenadante foi filtrado através de filtros GD/X PVDF de 0,2 ym (Whatman, Dassel, Alemanha) e armazenado a -80°C até à utilização. As experiências deste estudo foram realizados com três pools de HPL cada um consistindo em Usados de quatro dadores, mas resultados semelhantes também foram observados usando HPLs derivados de dadores individuais. Os HPLs consistiam predominantemente em sangue de tipo A, mas uma análise sistemática não revelou qualquer impacto do grupo sanguíneo. A fim de evitar a formação de gel de HPL, adicionou-se 2 U/mL de heparina (Ratiopharm, Ulm, Alemanha) foram adicionados como um anticoagulante antes da adição ao meio de cultura.

Meio de cultura e gel de HPL: O meio de cultura consistiu em meio de Eagle modificado por Dulbecco com baixo teor de glucose (DMEM-LG; PAA, Pasching, Áustria) com 2 mM de L-glutamina (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e 100 U/mL de penici-lina/estreptomicina (pen/strep; Lonza, Basileia, Suiça) e HPL (10% salvo indicação em contrário) . As células foram cultivadas em plástico de cultura de tecidos (TCP; Greiner, Kremsmunster, Áustria). Para a preparação do gel, placas de cultura de células foram cheias com HPL contendo meio de cultura de células sem heparina. Devido ao cálcio contido no meio foi iniciada a cascata de coagulação e o meio de HPL gelatinizou dentro de uma hora a 37°C. 0 gel de HPL resultante foi utilizado como substrato de cultura de células que foi semeado com a mesma quantidade de MNC, e coberto com o mesmo meio de HPL suplementado com heparina. Para efeitos de comparação, foram utilizados geles consistindo em 80% de colagénio g (3 mg/mL de colagénio de tipo I/III em HC1 12 mM; Biochrome, Berlim, Alemanha) tal como descrito anteriormente. Além disso, utilizou-se a geles de fibrina que foram produzidos a partir de pó de fibrinogénio humano liofilizado (F3789 Sigma Aldrich, Deisenhofen, Alemanha) dissolvido em soro fisiológico tamponado com Tris (TBS) com uma adição de 3,75 mM de CaCl2 e 3 UI/mL de trombina em pó (T1063 Sigma Aldrich) dissolvidos em água estéril para reticulação. As células foram cultivadas a 37°C em placas com 6 poços ou balões de cultura de tecidos T75 (Nunc Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Alemanha).

Determinações da elasticidade de geles de HPL:

Para as determinações de elasticidade, foram formados geles de HPL nas concentrações de 5%, 10% e 20%, utilizando cilindros de plástico (14 mm de diâmetro e 2 mm de altura) como moldes sobre lamelas finas. Após a gelatinização como descrito acima, os cilindros dos moldes foram removidos e os geles foram cobertos com uma lamela de massa conhecida. A espessura do gel foi determinada usando um microscópio de varrimento a laser confocal (LSM 510 Meta, Zeiss, Alemanha) equipado com uma objectiva de longa distância 40x Achroplan (NA 0,6, PH 2) . A colocação de lamelas adicionais de peso conhecido e subsequente medição da espessura foram repetidas pelo menos duas vezes para cada cilindro de gel de HPL. A partir das quantidades determinadas de espessura do gel (h) , a massa total da(s) lamela(s) (m) , a redução da espessura devido à carga (Dh), e a secção transversal do gel (A) , foram calculados os módulos elásticos do gel de acordo com E = (m*g) /A* (h/Dl) , em que g denota a aceleração devida à gravitação.

Isolamento de células estromais mesenquimatosas humanas a partir de medula óssea: MSC foram isoladas a partir de células mononucleares (MNC) por aderência a plástico. Em resumo, os fragmentos ósseos da cabeça do fémur de doentes submetidos a prótese da cabeça do fémur foram lavados com soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS). Subsequentemente, as MNC foram isoladas por centrifugação em gradiente de densidade de Ficoll (solução de separação Biocoll, densidade 1,077 g/L, Biochrom AG, Berlim, Alemanha) e lavadas duas vezes com PBS. Pelo menos 5 x 105 MNC foram então ressuspensas em meio de cultura em TCP, gel de HPL ou geles de colagénio em placas com 6 poços. As células foram cultivadas a 37 °C numa atmosfera humidificada com 5% de CO2 · A primeira troca de meio foi efectuada após 48 horas para remover as células não aderentes. Posteriormente, as mudanças médias de meio foram realizadas duas vezes por semana e as MSC foram ainda repicadas como descrito adiante.

Isolamento de fibroblastos dérmicos humanos:

Os fibroblastos foram isolados de amostras de pele de doentes submetidos a cirurgia cosmética. Inicialmente as células foram expandidas em meio DMEM-LG, suplementado com glutamina (PAA), penicilina/estreptomicina (PAA) e 10% de FCS (Biochrom, Berlim, Alemanha). As células na repicagem 3 a 5 foram então transferidas para condições de cultura de HPL como descrito acima.

Microscopia electrónica de varrimento: MSC humanas/matriz de gel de HPL foram fixadas em glutaraldeído a 3% durante pelo menos 1 hora à temperatura ambiente, lavadas com PBS e desidratadas por incubação consecutivamente em 30%, 50%, 70%, 90% e 100% de etanol durante 10 minutos à temperatura ambiente. Geles de HPL foram então secos ao ponto crítico em CO2 líquido e revestidos por pulverização catódica com uma camada de ouro de 30 nm utilizando um pulverizador catódico (LEICA EM SCD 500). As amostras foram analisadas utilizando um microscópio electrónico de varrimento ambiental na unidade do microscópio electrónico, RWTH Aachen University (ESEM XL 30 FEG, FEI, Philips, Eindhoven, Holanda).

Cortes histológicos - coloração com HE:

Para a análise histológica, geles de HPL com células de cultura na superfície foram fixados em formal-deido a 3,7% durante 24 horas. As construções foram embebidas em parafina, orientadas segundo o plano perpendicular, cortadas com um micrótomo rotativo a 2 ym de espessura (Leica, Wetzlar, Alemanha) e coradas com hematoxilina e eosina de acordo com protocolos histológicos de rotina.

Ensaio de proliferação e análise da vitalidade: A proliferação celular foi avaliada através do ensaio de brometo de tiazolil azul de tetrazólio (MTT). Resumidamente, MSC de repicagem 3-6 foram semeadas em placas com 96 poços (3000 células/cm2) em TCP, gel de colagénio, gel de fibrina ou geles de HPL em meio de cultura suplementado com 1%, 5%, 10% ou 20% de HPL. Após 7 dias, as células foram lavadas com PBS e incubadas com MTT 1 mM (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA) durante 3,5 horas a 37°C. A solução em excesso foi eliminada e os cristais de formazan foram resolvidos em HC1 4 mM em isopropanol (ambos de Roth, Karlsruhe, Alemanha). A absorvência foi medida a 590 nm utilizando um leitor de placas Tecan Infinite 200 (Tecan Trading, Suiça). Cada determinação incluiu guatro réplicas técnicas. Alternativamente, a proliferação foi estimada por coloração com éster N-succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE) como descrito anteriormente. Além disso, a coloração nuclear ou coloração de células vivas e mortas foi realizada com DAPI (4',6 — diamidino-2-fenilindole; Molecular Probes) ou com 5 yg/mL de diacetato de fluoresceina (Sigma) e 0,5 g de iodeto de propidio/mL (BD Pharmingen), respectivamente, depois de 7 dias de cultura em TCP ou geles de HPL e analisadas com um microscópio de fluorescência Leica DM IL HC.

Ensaio de unidades formadoras de colónias de fibroblastóides (UFC-f): O ensaio de UFC-f foi realizado por plaqueamento de MNC numa série de diluições limitantes em placas com 96 poços (330000; 100000; 33000; 10000; 3000; e 1000 células por poço; a pelo menos 24 poços por passo de diluição em cada experiência) em paralelo em TCP e gel de HPL. O meio foi substituído após 48 horas pela primeira vez e depois duas vezes por semana. Após 14 dias em cultura, as células foram lavadas duas vezes com PBS e marcadas com MTT. Todos os poços com crescimento de células tiveram pontuação positiva e a frequência UFC-f foi determinada por estatística de Poisson (L-calc; Stem Cell Technologies; Vancouver, Canadá).

Passagem e cultura de MSC de longo prazo: MSC em TCP foram repicadas continuamente depois de terem atingido um nivel de confluência de 80% utilizando uma solução de tripsina-EDTA a 0,25% (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA). As células em gel de HPL foram colhidas em conjunto com o gel por pipetagem. Deste modo, a mistura de gel-MSC foi diluida com meio de cultura e depois plagueada emplacas com poços revestidos com gel de HPL fresco. Para determinar o número de células MSC, uma fracção da mistura de MSC/gel de HPL foi semeada em TCP durante 24 horas para facilitar a ligação à superfície do plástico. As células aderentes ao plástico foram então tripsinizadas e o número de células foi finalmente determinado utilizando câmara de contagem Neubauer (Brand, Wertheim, Alemanha). As duplicações da população celular por repicagem (PDP) e duplicações da população cumulativas (cPD) foram calculadas como conhecido é na arte. Alternativamente, o MSC/gel de HPL foi incubado com 20 yg de plasmina (solução mãe a 2,76 mg/mL; Enzyme Research Laboratories, Indiana, EUA) durante 18 horas a 37°C.

Para comparar diferentes métodos de propagação de células MSC foram semeadas em paralelo em TCP e gel de HPL (1000 células/poço) e aderiram de um dia para o outro. As células em TCP foram então repicadas com tripsina, enguanto as MSC em gel de HPL foram colhidas por pipetagem com ou sem incubação adicional com tripsina/EDTA durante 5 minutos, ou com plasmina como descrito acima. Todas as células foram de novo semeadas em TCP e após 1 dia o número de células aderentes e não aderentes foi estimado utilizando o ensaio de MTT.

Análise imunofenotípica:

Para caracterização da MSC utilizou-se um painel de marcadores de superfície. As MSC foram isoladas e cultivadas durante três repicagens em TCP ou em gel de HPL. Para remover o gel de HPL antes da análise por citometria de fluxo semeou-se as células para uma repicagem adicional em TCP ou colheu-se o gel de HPL por pipetagem e lavou-se as células uma vez em meio de cultura. Cada preparação de células foi corada em paralelo com os seguintes anticorpos monoclonais: anti-CD14-APC humano de murganho (clone M5E2), CD29-PE (clone MAR4), CD31-PE (clone WM59), CD34-APC (clone 8G12), CD45-APC (clone HI30), CD73-PE (clone AD2), CD90-APC (clone 5E10) (todos de BD Bioscience, Heidelberg, Alemanha) e CD105-FITC (clone MAR-226; ImmunoTools, Friesoythe, Alemanha). A análise foi realizada utilizando um citómetro FACS Canto II (BD Bioscience, Heidelberg, Alemanha) e os dados recolhidos foram analisados com o software WinMDI 2.9 (Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry). Para comparação estatística de diferentes determinações normalizou-se as intensidades de fluorescência para as correspondentes determinações de autofluorescência.

Diferenciação in vitro: MSC isoladas de fresco foram directamente semeadas em geles de HPL ou TCP e expandidas durante três repicagens antes da diferenciação in vitro. A diferenciação em relação à linhagem osteogénica, adipogénica e condrogénica foi então induzida como é conhecido na arte. Esta diferenciação de MSC em gel de HPL foi realizada em gel de HPL ou por transferência para TCP. A diferenciação condrogénica foi realizada em cultura em sedimento 3D por centrifugação a 400 x g durante 7 minutos. Após três semanas, a diferenciação foi analisado por coloração com vermelho de alizarina (diferenciação osteogénica), com o corante verde fluorescente BODIPY (4,4-difluoro-1,2,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno; Molecular Probes, Eugene, EUA; diferenciação adipogénica) ou com azul Alcian ou vermelho rápido nuclear (para cortes de amostras diferenciadas condrogénicas) de acordo com protocolos histológicos de rotina e analisadas com um microscópio de fluorescência Leica DM IL HC (Leica, Wetzlar, Alemanha). Além disso, a diferenciação adipogénica foi quantificada em TCP e gel de HPL por contra-coloração de todas as células com DAPI e contagem directa de não diferenciadas em relação a células diferenciadas (pelo menos 300 células por experiência).

Estatística:

Os resultados são expressos como média ± desvio padrão de experiências independentes. Para estimar a probabilidade de diferenças foi adoptado o teste T de Student bilateral para amostras emparelhadas.

Resultados :

Formaram-se geles translúcidos dentro de 30 a 60 minutos após a adição de HPL ao meio de cultura na ausência de anticoagulantes. Os geles de HPL resultantes tinham uma consistência muito macia e viscosa. A elasticidade do substrato foi extremamente baixa e aumentou com maiores percentagens de HPL (5% de HPL: 20 Pa; 10% de HPL: 28 Pa; 20% de HPL: 32 Pa; Figura 6A) . Estes geles foram cobertos com uma camada do mesmo meio de HPL suplementado com heparina para evitar a gelatinização da fase liquida. Quando as MSC foram semeadas no gel de HPL, cresceram na interface entre o gel de HPL e o meio de HPL sem qualquer contacto com a superfície de plástico. A coloração de células vivas/mortas praticamente não revelou quaisquer células não vitais após sete dias de cultura. A análise histológica demonstrou o crescimento em camadas múltiplas nesta interface entre o gel e o meio. As densidades celulares foram muito maiores em gel de HPL em comparação com o crescimento bidimensional em plástico de cultura de tecidos (TCP; Figura 6B) . A microscopia electrónica de varrimento demonstrou a estrutura de fibrina do gel de HPL e apoiou a noção de que as MSC cobriram esta matriz densamente de um modo em múltiplas camadas (Figura 6C-E). As MSC podem segregar enzimas que degradam fibrina portanto avaliou-se a manutenção de um gel de HPL fino sobre a expansão da cultura: nos primeiros 4 dias praticamente não foi observada nenhuma degradação, enquanto após 8 dias alguns geles de HPL foram parcialmente degradados e as células entraram em contacto com a superfície de plástico. Isto foi particularmente observado em poços de cultura maiores enquanto praticamente não ocorreu degradação em placas de multititulação. A proliferação foi analisada por sementeira de MSC aderentes a plástico em paralelo em TCP, estruturas de colagénio, gel de fibrina e gel HPL. 0 meio de cultura foi suplementado com diferentes concentrações de HPL (1%, 5%, 10% e 20%) e as concentrações de HPL em gel e meio foram ajustadas correspondentemente (n = 7) . Após sete dias, o ensaio com MTT mostrou que a proliferação de MSC aumentou a concentrações mais elevadas de HPL e isto está de acordo com observações anteriores. De assinalar, a expansão das células foi significativamente maior em gel de HPL do que em TCP, gel de colagénio (Figura 7A) ou gel de fibrina (Figura 7B) . Foram observados resultados semelhantes com fibroblastos dérmicos (Figura 7C) . Adicionalmente, testou-se a proliferação no decurso da expansão da cultura após 2, 5, 7 e 9 dias. A vantagem prolif erativa em gel de HPL tornou-se cada vez mais evidente - especialmente após 9 dias quando as MSC já estavam confluentes em TCP (Figura 7D) . É preciso ter em conta que o ensaio com MTT é apenas um indicador indirecto do número de células por determinação da actividade metabólica. No entanto, a mesma tendência também foi observada quando se mediu a fluorescência residual por coloração com CFSE ou contagem de núcleos corados com DAPI. Assim, a proliferação foi muito aumentada em gel de HPL. Subsequentemente, comparou-se o aumento do crescimento inicial de MSC semeando células mono-nucleares de medula óssea humana em paralelo em TCP e gel de HPL para determinar o número de unidades formadoras de colónias fibroblastóides (UFC-f). Esta análise foi realizada com ensaios de limitação da diluição em formato multi-poços para excluir efeitos por proliferação ou actividade migratória. A frequência média de UFC-f em TCP foi de 88,35 por 106 MNC. 0 que é interessante, a frequência UFC-f foi 2,24 vezes mais alta em gel de HPL em comparação com TCP (P = 0,02; N = 3; Figura 7E). Estes resultados indicam que o gel de HPL aumenta o desenvolvimento de MSC. A cultura de longo prazo e a expansão em grande escala de células requer passos de repicagens em série. Isto é geralmente realizado por colheita das células com tripsina/EDTA pela altura em que as células atingem um certo nivel de confluência. O gel de HPL é demasiado frágil para esses procedimentos de colheita da superfície do gel. Em vez disso, a matriz de fibrina do gel de HPL foi degradada por adição de plasmina à fase liquida de um dia para o outro - desse modo, a estrutura de fibrina do gel de HPL foi dissolvida e as células relocalizadas em TCP, que então facilitou os procedimentos de repicagem convencionais. No entanto, a consistência semifluida do gel de HPL permitiu uma forma mais conveniente para repicagem sem contacto intermédio das células com a superfície de plástico: o gel de HPL viscoso foi pipetado conjuntamente com as células e ressemeado sem separação das MSC da sua matriz (Figura 8A). Este método foi utilizado ao longo das quatro repicagens subsequentes e as velocidades de expansão foram semelhantes em comparação com o método convencional em TCP com tripsina (Figura 8B). Para avaliar a velocidade de recuperação celular após repicagem determinou-se quantas células permaneceram associadas a tampões de gel de HPL não dissolvido, utilizando o ensaio com MTT: cerca de 1/3 das células permaneceu separado com o procedimento de pipetagem, ao passo que a maioria das células foram capazes de crescimento com aderência ao plástico. A percentagem de aumento do crescimento das células foi ligeiramente aumentada por tratamento adicional com tripsina que pode afectar a adesão célula-célula no gel de HPL. De assinalar que a actividade das células era menor por tratamento com plasmina, que pode ser devida ao facto de o tratamento a longo prazo com esta peptidase ser prejudicial para a sobrevivência das MSC (Figura 8C).

As condições de cultura podem afectar a composição de subpopulações e têm impacto directo nas características celulares. Para comparação morfológica de preparações de MSC isoladas de culturas em TCP ou em gel de HPL, transferiu-se portanto durante uma repicagem para as mesmas condições de TCP convencionais - não foram observadas diferenças no crescimento aderente em plástico ou morfologia celular. A análise imunofenotípica de MSC em gel de HPL foi realizada ou com células que foram directamente colhidas de gel de HPL ou por transferência de células para TCP durante uma repicagem adicional. Todas as preparações de MSC (em TCP, gel de HPL, ou gel de HPL com transferência para TCP) revelaram o mesmo imunofenotipo CD14 + , CD31-, CD34-, CD45“, CD29+, CD73+, CD90 + , e CD105+ sem quaisquer diferenças significativas (n = 4; Figura 9A) . A diferenciação in vitro no sentido das linhagens adipogénica e osteogénica foi inicialmente comparada em TCP para excluir potenciais efeitos dos diferentes substratos - não foram observadas diferenças entre MSC que foram isoladas em TCP ou em gel de HPL com transferência para TCP durante uma repicagem (n> 3; Figura 9B-C). Além disso, a diferenciação adipogénica foi directamente induzida em gel de HPL e não houve diferença significativa na percentagem de células com goticulas lipidicas em TCP e gel de HPL (42% contra 37%; n = 3) . A diferenciação osteogénica também foi induzida directamente em gel de HPL, sem diferenças aparentes entre TCP e gel de HPL (n = 3) . A diferenciação condrogénica foi induzida na cultura do sedimento por colheita de células directamente do TCP ou do gel de HPL - a análise da deposição de proteoglicanos com azul Alcian não revelou diferenças significativas (Figura 9D) . Estes resultados demonstram que os procedimentos de cultura modificados em gel de HPL facilitam o isolamento de células com caracteristicas de MSC tipicas. 0 gel de lisado de plaquetas humanas proporciona uma nova matriz para a expansão da cultura de MSC. 0 principal constituinte do gel é uma estrutura de fibrina que polimeriza normalmente um coágulo semelhante a uma rede durante os estádios finais da cascata de coagulação hemostática. 0 fibrinogénio deriva da fracção de plasma de unidades de plaquetas e a cascata de coagulação é inibida por quelação de iões cálcio com citrato. Por adição ao meio de cultura DMEM, o excesso de iões cálcio estimula a poli-merização a uma matriz de fibrina. Esta matriz tem muitas vantagens: (i) é de ocorrência natural - especialmente em áreas de formação de feridas e regeneração; (ii) que é biocompativel e biodegradável; (Iii) é translúcida facilitando as observações microscópicas; e (iv) há um crescente interesse em estruturas de fibrina para aplicações de engenharia de tecidos. Além disso, o gel de HPL pode ser injectado em combinação com células integradas nos ambientes de transplantação que pode facilitar uma maior recuperação e sobrevivência de células do que a injecção de sedimentos celulares em soluções aquosas.

Uma expansão eficiente e elevadas velocidades de proliferação são importantes para muitas aplicações de células. Demonstrou-se que a proliferação foi maior em gel de HPL em comparação com a cultura em TCP, gel de fibrina ou gel de colagénio. Demonstrou-se que o HPL é um suplemento de soro muito eficaz, que aumenta ainda mars a proliferação de MSC em comparação com FCS. A fracção de plaquetas compreende factores de crescimento relevantes como factores de crescimento derivados de plaquetas (PDGFs) que suportam esta tremenda estimulação do crescimento em comparação com o plasma ou soro humano. A proliferação aumentada em gel de HPL pode ser devida às seguintes razões: 1) em gel de HPL os nutrientes e factores de crescimento estão acessíveis às células a partir de todas as direcções e o seu fornecimento é tamponada pela matriz subjacente; 2) o crescimento celular não está estritamente limitado a duas dimensões com inibição por contacto por crescimento confluente. Em vez disso as células proliferam mais homogeneamente e atingem densidades celulares mais elevadas em gel de HPL; e 3) o gel de HPL pode facilitar uma melhor interacção adesiva com proteínas de adesão especificas como as integrinas. Isto pode também contribuir para o crescimento significativamente aumentado de UFC-f em gel de HPL. Tomados em conjunto, o gel de HPL aumenta fortemente expansão da MSC - por uma melhor recuperação de colónias iniciais, velocidades de proliferação mais rápidas e densidades celulares mais elevadas em camadas múltiplas. A propagação de células durante repicagens subsequentes normalmente envolve tratamento enzimático, e.g. com tripsina ou Accutase™, a fim de colher as células da superfície da cultura de células - após passos de lavagem a suspensão de células é então semeada em novas placas de cultura. Este procedimento tem pouco impacto na sobrevivência das células, mas atrasa-as no seu ciclo proliferativo. Outra alternativa para a colheita de células sem enzimas é a utilização de polímeros que respondem à temperatura que podem libertar células após uma mudança de temperatura. Se necessário, o gel de HPL pode ser dissolvido pela plasmina que é uma peptidase fisiológica embora tenha sido demonstrado que a plasmina exógena prejudica a sobrevivência de MSC ao longo do tempo. Mais importante ainda, a natureza muito macia e viscosa do gel de HPL facilita um procedimento alternativo por pipetagem das células conjuntamente com a sua matriz em novas placas de cultura. Isto só foi possível devido à natureza extremamente macia do gel de HPL - o colagénio convencional e os geles de fibrina são mais rígidos. Inicialmente, esperava-se que a recuperação das células pudesse ser dificultada uma vez que as células pode ficar presas nos fragmentos de gel de HPL ou que podem ser rompidas durante o procedimento de pipetagem. Apesar de alguma perda de células nos fragmentos de gel de HPL as velocidades de expansão situaram-se numa gama semelhante às dos métodos convencionais utilizando tripsina em TCP - provavelmente devido à velocidade de proliferação muito aumentada. 0 processo de repicagem sem separação de células da sua matriz tem várias vantagens como não serem necessários passos de lavagem e centrifugação. Isto tem interesse especifico para protocolos melhorados para a automação de cultura de células. As abordagens de automação podem ajudar a atender às necessidades crescentes e dispendiosas em terapêutica celular no futuro e um procedimento de pipetagem simples é muito mais fácil de implementar nessas plataformas. Não é uma tarefa trivial determinar o número exacto de células em gel de HPL. Para a maioria das experiências utilizou-se o ensaio com MTT que não requer a separação das células da matriz de gel. No entanto, este ensaio proporciona apenas uma estimativa indirecta dos números de células por determinação da conversão de MTT em formazan. Como alternativa, procedeu-se à contagem de núcleos corados com DAPI, mas a quantificação fiável foi prejudicada pela localização das células em diferentes níveis no gel de HPL. A plasmina pode ser utilizada para degradar os geles de HPL mas isto pode comprometer a viabilidade celular ao longo do tempo e correspondentemente o sinal de MTT foi mais baixo depois do tratamento com plasmina. Alternativamente, diluiu-se o gel de HPL com meio de cultura para transferir estas células para superfícies de TCP convencionais. Como descrito acima este procedimento de repicagem funcionou eficientemente e a maioria das MSC pode ser transferida para a superfície do TCP potencialmente por migração ou adelgaçamento do gel de HPL com o procedimento de pipetagem. No entanto cerca de 1/3 de células permaneceu não aderente em fragmentos de HPL flutuantes. Esta perda de células poderia ser um pouco, mas não significativamente, reduzida por tratamento adicional com tripsina/EDTA, potencialmente devido ao rompimento da adesão célula-célula entre as MSC no gel de HPL. Outro aspecto importante é a estabilidade do gel de HPL que pode ser parcialmente degradado por enzimas fibrinolíticas segregadas pelas MSC. Por outro lado, o nosso estudo demonstrou que é possível utilizar gel de HPL mesmo para a cultura de longo prazo ao longo de 3 semanas sem adição de agentes antifibrinolíticos, embora a estabilidade possa ser melhorada por aprotinina ou ácido tranexâmico. A padronização de protocolos é uma questão importante na geração de produtos de células terapêuticas.

Os suplementos de soro como FCS e HPL notoriamente revelam variação de lote para lote. Em trabalhos anteriores demonstrou-se diferenças em HPL gerado a partir de unidades de plaquetas individuais e o efeito estimulador diminuiu significativamente com a idade do dador de HPL. É de notar que foi observada também alguma variação no processo de gelatinização que pode resultar da fracção de plasma do HPL. Mais investigação vai permitir um melhor controlo da formação do gel e padronização de geles de HPL e vai proporcionar uma melhor visão da variação associada aos dadores de HPL. Esta variação pode ser nivelada através da combinação de vários HPLS, ao passo que pode ser favorável utilizar só um gel de HPL derivado de um único dador -potencialmente mesmo de quem recebe o transplante - para reduzir o risco de infecções com agentes patogénicos humanos. 0 crescimento e diferenciação celular in vitro podem ser influenciados pela elasticidade da superfície. 0 gel de HPL mostrou uma elasticidade do substrato de cerca de 30 Pa - isto é extremamente baixo e até mesmo abaixo da rigidez estimado de tecido adiposo. Pode prever-se que a diferenciação adipogénica é mais pronunciada em gel de HPL do que em TCP mas este efeito não se tornou evidente na nossa análise. Globalmente, não detectámos efeitos claros sobre a morfologia, imunofenótipo ou potencial de diferenciação indicando que a composição de MSC pode ser semelhante em gel de HPL e TCP. De qualquer maneira, o gel de HPL facilita o isolamento de células com características de MSC típicas.

Em conclusão, o gel de HPL é uma matriz extremamente macia que proporciona várias novas perspectivas para a cultura de células. Facilita o crescimento de células incorporadas em componentes do meio de cultura sem qualquer contacto com biomateriais artificiais como o poliestireno. Além disso, este meio não inclui componentes xenogénicos como FCS. É ainda concebível utilizar gel de HPL num ambiente autólogo para minimizar ainda mais o risco de efeitos imunológicos ou infecções. 0 crescimento inicial e a velocidade de proliferação das MSC eram muito mais elevados em gel de HPL do que em TCP. A consistência mecânica permite um procedimento de repicagem simples, sem a necessidade da separação das células da sua matriz ou passos de lavagem adicionais - este procedimento de propagação conveniente é de relevância específica para a automatização de cultura de células. 0 gel de HPL pode facilitar a geração mais rápida de números elevados de células em terapêutica celular. A cultura de células em medicina regenerativa precisa de facilitar a expansão eficiente de acordo com requisitos de BPF (Boas Práticas de Fabrico) . 0 lisado de

plaquetas humanas (HPL) pode ser utilizado como substituto de soro fetal de vitelo (FCS) sem o risco de reacções imunitárias xenogénicas ou a transmissão de agentes patogénicos de bovinos. A heparina precisa de ser adicionada como anticoagulante antes da adição de HPL ao meio de cultura - de contrário o meio de HPL forma um gel dentro de uma hora. Demonstrou-se aqui que esses geles de HPL proporcionam uma matriz tridimensional adequada para a cultura de células que - exceptuando a heparina - consiste nos mesmos componentes que o meio de cultura aplicado em sobrecamada. As células estromais mesenquimatosas (MSC) cresceram em várias camadas na interface entre o gel de HPL e o meio de HPL sem contacto com quaisquer biomateriais artificiais. De assinalar, a proliferação de MSC foi muito maior em gel de HPL em comparação com plástico de cultura de tecidos (TCP) . Além disso, a frequência das unidades formadoras de colónias de fibroblastóides inicial (CFU-f) foi aumentada em gel de HPL. A consistência viscosa de gel de HPL permitiu a repicagem com uma colheita conveniente e procedimento de re-semeadura por pipetagem das células conjuntamente conjunto com a sua matriz de HPL - este método não requer passos de lavagem e pode ser facilmente automatizado. 0 imunofenótipo e potencial de diferenciação in vitro em linhagem adipogénica, osteogénica e condro-génica não foram afectados pelo isolamento da cultura em gel de HPL. Tomadas em conjunto, o gel de HPL tem várias vantagens em relação a superficies de plástico convencionais: facilita o crescimento aumentado de CFU-f, aumentou as velocidades de proliferação, densidades celulares mais elevadas e procedimentos de repicagem não enzimáticos para expansão da cultura de MSC.

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Lisboa, 16 de junho de 2016

Claims (14)

REIVINDICAÇÕES

1. Método de cultura de células aderentes utilizando um meio líquido compreendendo lisado de plaquetas sanguíneas e uma substância inibidora da gelatinização, compreendendo o referido método a cultura das células na superfície e/ou no seio de um substrato semelhante a gel tridimensional compreendendo 1-40% de lisado de plaquetas sanguíneas mas estando substancialmente isento de uma substância inibidora da gelatinização, em que o meio líquido é aplicado em camada sobre o substrato semelhante a gel.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o meio líquido e o substrato semelhante a gel, para além da substância inibidora da gelatinização, têm uma composição substancialmente idêntica.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a repicagem ou a colheita das células é realizada por degradação enzimática do substrato semelhante a gel, preferencialmente utilizando uma peptidase, em particular plasmina.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, em que a repicagem ou a colheita das células é realizada por fragmentação mecânica da estrutura semelhante a gel, preferencialmente por pipetagem.

5. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, em que a substância inibidora da gelat-inização compreende heparina ou uma heparina de baixo peso molecular (LMWH).

6. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, em que o meio líquido compreende 0,1-100 U/mL de heparina ou 0,001-1 mg/mL de LMWH como substância inibidora da gelatinização.

7. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, em que ambos o meio líquido e o substrato semelhante a gel estão substancialmente isentos de soro.

8. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, em que as referidas células são células tronco ou células progenitoras, preferencialmente células tronco mesenquimatosas, em particular células estromais mesenquimatosas.

9. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, em que as referidas células são células mesodérmicas, preferencialmente fibroblastos ou células estromais mesenquimatosas.

10. Método para a produção de um substrato tridimensional semelhante a gel, compreeendendo o referido método: - Proporcionar um concentrado de trombócitos; - Colher plaquetas sanguíneas do referido concentrado; - Lisar as plaquetas sanguíneas; - Adicionar pelo menos um componente do meio ao lisado de modo a obter um meio compreendendo 1-40% de lisado de plaquetas sanguíneas; e - Deixar o meio de lisado de plaquetas sanguíneas gelati-nizar a aproximadamente 37°C de modo a se obter um substrato semelhante a gel compreendendo lisado de plaquetas sanguíneas.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o referido componente do meio compreende uma composição de meio de cultura de células padronizado, preferencialmente meio DMEM.

12. Método de acordo com a reivindicação 10 ou 11, em que o referido substrato compreende 5-40% de lisado de plaquetas sanguíneas, preferencialmente 5-20% de lisado de plaquetas sanguíneas, em particular aproximadamente 10-20% de lisado de plaquetas sanguíneas.

13. Um sistema bifásico compreendendo (a) um meio líquido compreendendo lisado de plaquetas sanguíneas e uma substância inibidora da gelatinização e (b) um substrato tridimensional semelhante a gel compreendendo 1-40% de lisado de plaquetas sanguíneas mas estando substancialmente isento de uma substância inibidora da gelatinização.

14. 0 sistema bifásico de acordo com a reivin dicação 13, em que o meio liquido e o substrato semelhante a gel, para além da substância inibidora da gelatinização, têm uma composição substancialmente idêntica. Lisboa, 16 de junho de 2016