PT2420833E

PT2420833E - Vacina de células t

Info

Publication number: PT2420833E
Application number: PT111886768T
Authority: PT
Inventors: Jim C Williams; Mitzi M Montgomery; Brian S Newsom
Original assignee: Opexa Therapeutics
Priority date: 2006-05-05
Filing date: 2007-05-04
Publication date: 2015-11-24
Also published as: DK2016414T3; IL195115A; EP2016414B1; AU2007247869A1; EP2420833B1; CA2651328A1; EP2712623A1; PL2016414T3; ES2552667T3; JP6000205B2; AU2007247869B2; EP2420833A1; NZ572644A; JP2013252142A; WO2007131210A3; JP2009536036A; EP2016414A4; ES2553192T3; IL195115A0; WO2007131210A2

Description

DESCRIÇÃO

VACINA DE CÉLULAS T

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a vacinas de células T e métodos de preparação destas vacinas. As vacinas de células T podem ser utilizadas para tratar doenças autoimunes, tais como a esclerose múltipla.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória, caraterizada pela destruição da mielina no sistema nervoso central (SNS). Indícios crescentes implicam as respostas

autoimunes das células T aos antigénios de mielina, tais como a proteína básica de mielina (MBP), a glicoproteína oligodendrocitária da mielina (MOG) e a proteína proteolipídica da mielina (PLP), na patogénese da doença (Stinissen et ai., Crit. Rev. Immunol. 1997; 17: 33-75). A ativação e a expansão clonal de células T reativas à mielina, seguida pela sua entrada no SNS através da barreira sanguínea do cérebro, resulta em danos para a membrana de mielina. As células T reativas à MBP são encontradas submetidas à ativação in vivo e ocorrem com elevada frequência precursora no sangue e no fluido cerebrospinal de pacientes com EM (Zhang et ai., J. Exp. Med., 1994; 179: 973-984; Chou et ai., J. Neuroimmunol. , 1992; 38: 105-114; Allegretta et ai., Science, 1990; 247:

718-721). As estratégias recentes para combater a doença têm-se centrado na diminuição do número de células T reativas à mielina ativadas, por um processo denominado vacinação com células T. As inoculações repetidas com células T reativas à MBP que foram inativadas por tratamento químico ou irradiação demonstraram prevenir ou curar a encefalomielite autoimune experimental (EAE), um modelo animal para a EM (Ben-Nun et ai., Eur. J. Immunol., 1981; 11: 195-204). A vacinação com células T tem avançado para ensaios clínicos em pacientes com EM. Num ensaio clínico piloto, três inoculações subcutâneas com células T reativas à MBP irradiadas induziram respostas de células T, que reduziram o número de células T reativas à MBP que circulavam a níveis indetetáveis num número de indivíduos (Zhang et al. , Science, 1993; 261: 1451-1454, Medear et al. , Lancet 1995; 346: 807-808). Consequentemente, os pacientes aos quais foi administrada a vacina demonstraram uma melhoria clínica evidenciada como uma redução na taxa de recaída e na atividade de lesão de MRI. O perfil de segurança e a viabilidade tecnológica do ensaio clínico piloto foram excelentes. Os pacientes tiveram melhorias nos parâmetros subjetivos físicos e psicológicos, e na escala expandida do estado de incapacidade de Kurtzke (EDSS), que é uma medida objetiva da incapacidade física de um paciente. A estratégia inicial de vacinação com células T utilizou MBP de comprimento total para identificar epitopos autorreativos. A vacinação com células T autorreativas inativadas produzidas utilizando este método, foi inicialmente pensada ser suficiente para tratar a EM. No entanto, estudos subsequentes revelaram que, algum tempo depois da vacinação, as células T de antigénio de mielina reativas reapareceram. (Zhang et al.) . Estas células T de antígeno de mielina reativas exibiam frequentemente um perfil de reatividade diferente do que as identificadas inicialmente, um processo denominado mudança de epítopo. Os epitopos reconhecidos pelas células T que reapareciam eram frequentemente epitopos crípticos, não acessíveis ao sistema imunitário no polipéptido de comprimento total e representavam uma mudança na imunodominância.

As estratégias subsequentes de vacinação com células T têm contado com o uso de epitopos de antigénio de mielina imunodominantes para identificar as células T autorreativas de um determinado paciente com EM. As caraterísticas estruturais das interações do péptido do TCR-MHC da classe II e/ou I conduzem a resposta de células T para os epítopos importantes. Embora a base molecular para a imunodominância esteja relacionada com a afinidade do péptido para o MHC, as células T reconhecem um complexo de fragmentos antigénicos associados ao MHC em células apresentadoras de antigénio (APC). A imunodominância é considerada ser um número relativo maior (ou frequência) de células T específicas do antigénio que atingem um limiar de resposta de ativação (por exemplo, índice de estimulação) para um antigénio particular. A imunodominância é usada de modo variável para descrever quer a resposta mais frequentemente detetada entre os indivíduos testados quer a resposta mais forte dentro de um único indivíduo, no entanto, os fatores que determinam quer a imunodominância inter quer intraindividual ainda são pouco conhecidos. A imunodominância é uma caraterística central das respostas de células T a antigénios. Dos muitos péptidos presentes em antigénios complexos, as respostas aos péptidos podem ser ordenadas com base nos números e/ou na atividade de células T que respondem numa hierarquia relativamente estável. Apesar da sua importância para a compreensão de respostas imunes e conceção de vacinas, a imunodominância é mal compreendida ao nível mecanicista. A imunodominância não é simplesmente explicada pelos números de complexos de péptidos gerados por células apresentadoras de antigénios (APC), afinidades dos péptidos para moléculas da classe I ou classe II, ou afinidades dos recetores de células T para complexos de péptidos da classe I ou classe II, embora cada um destes parâmetros contribua para o fenómeno. A utilização de epítopos imunodominantes na produção de uma vacina de células T foi baseada no reconhecimento de que, embora as respostas das células T aos antigénios de mielina sejam heterogéneas no reconhecimento do epítopo entre diferentes indivíduos, certas regiões de antigénios de mielina, tais como os resíduos 83 - 99 e 151 - 170 da MBP, são preferencialmente reconhecidas em alguns pacientes com EM. (Ota et al. , Nature, 1990; 346 : 183-187) . As células T autólogas reativas aos péptidos imunodominantes foram expandidas e inativadas, em seguida, foram injetadas no paciente a partir do qual foram isoladas. Embora esta estratégia tenha conduzido a uma diminuição nas taxas de progressão da doença, o curso da doença dos pacientes continua a progredir. Assim, existe uma necessidade de melhores vacinas de células T.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção é tal como estabelecida nas reivindicações. É divulgado um método para a identificação de um epítopo dentro de um antigénio polipeptídico para células T autorreativas. Pode ser fornecida uma amostra que compreende células T isoladas a partir de um hospedeiro. Podem ser adicionados um ou mais péptidos diferentes a uma pluralidade de porções da amostra. As sequências dos péptidos podem compreender coletivamente uma porção da sequência do antigénio polipeptídico. Pode ser identificada uma porção da amostra que compreende células T autorreativas ativadas. Um péptido que ativa as células T autorreativas pode compreender o epítopo.

As sequências dos péptidos compreendem coletivamente a sequência completa do antigénio polipeptídico. O antigénio polipeptídico é a MBP, a PLF e a MOG.

Os diferentes péptidos compreendem uma sequência de sobreposição de 4 - 19 aminoácidos. Os diferentes péptidos têm de 8 - 20 aminoácidos. O número de células T autorreativas estimuladas pode ser aumentado em pelo menos um fator de cerca de 2 a 4, em comparação com um controlo. É fornecido um método para a preparação de uma vacina de células T, tal como definido nas reivindicações. É fornecida uma amostra que compreende células T isoladas de um paciente. As células T são postas em contacto com uma ou mais misturas de péptidos diferentes que ativam as células T autorreativas. As células T autorreativas ativadas são expandidas. As células T autorreativas são em seguida atenuadas. Os diferentes péptidos estimulam células T autorreativas com um índice de estimulação acima de um valor predeterminado. 0 antigénio polipeptídico é a MBP, a PLP e a MOG. É também divulgado um método para a deteção da mudança de epítopo numa doença mediada por células T. Podem ser identificados, tal como descrito anteriormente, os epítopos de um antigénio autorreativo. Os epítopos podem ser comparados com um controlo. A mudança de epítopo pode ter ocorrido se os epítopos são diferentes. A deteção da mudança de epítopo pode ser usada para diagnosticar a mudança de epítopo num indivíduo. A deteção da mudança de epítopo também pode ser utilizada para monitorizar a mudança de epítopo num indivíduo, através da comparação de epítopos com epítopos num momento anterior.

Achiron et al. , Clin. Immunology, 2004, divulgam a imunização de pacientes com esclerose múltipla com linhas de células T autólogas atenuadas que foram ativadas com péptidos sintéticos da MBP (aminoácidos 83 - 99, 87 - 110 e 151 - 170) e da MOG (aminoácidos 6 - 26 e 34 - 56) . A vacinação com células T mostrou efeitos clínicos benéficos nos pacientes vacinados. O comunicado de imprensa da PharmaFrontiers apresenta o Tovaxin, que é uma formulação trivalente de células T reativas atenuadas com péptidos contra a MBP, a PLP e a MOG. Foram usados para a produção da vacina dois péptidos de cada MBP, PLP e MOG. O tratamento com Tovaxin esgotou as células T reativas ao péptido de mielina em pacientes com esclerose múltipla, (http://www. businesswire.com/portai/site/google/index.j sp? ndmViewld=news_view&n ewsld=20051003005233&news- Lang=en) É também divulgada uma vacina de células T. A vacina compreende células T que são específicas para um antigénio polipeptídico. A vacina compreende células T que reconhecem cada epítopo dos antigénios polipeptídicos capazes de produzir um índice de estimulação acima de um valor predeterminado. Os antigénios polipeptídicos são a MBP, a PLP, e a MOG. A vacina pode compreender menos do que 50 % de células T que reconhecem os epítopos do antigénio polipeptídico capazes de produzir um índice de estimulação de menos do que um valor predeterminado. As células T podem compreender marcadores celulares incluindo, mas não se limitando a, CD3, CD4, CD8, CD25, TCR αβ, TCR γδ, HSP60 (proteína de choque térmico 60) ou uma combinação dos mesmos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 mostra a análise EAA da reatividade das células T de um paciente a misturas de péptidos da MOG. A figura 2 mostra as frequências da reatividade a misturas de péptidos da MBP entre as células T de 48 indivíduos. A figura 3 mostra as frequências da reatividade a misturas de péptidos da PLP entre as células T de 48 indivíduos. A figura 4 mostra as frequências da reatividade a misturas de péptidos da MOG entre as células T de 48 indivíduos. A figura 5 mostra as previsões da ligação ProPred dentro da proteína MOG para os 3 alelos HLA do paciente. Os resíduos de aminoácidos a vermelho representam resíduos de ancoragem previstos para a ligação no interior do sulco do HLA, enquanto que os resíduos a amarelo representam os outros resíduos que se encaixariam no interior do sulco. A figura 6 mostra a análise EAA da reatividade das células T de um paciente a misturas de péptidos da MBP. A figura 7 mostra a percentagem de expressão das cadeias beta do TCR V na linha de base e após 18 dias de estimulação com péptidos MBPmlO utilizando células T de um paciente. A figura 8 mostra a análise EAA da reatividade das células T de um paciente a misturas de péptidos de mielina. A figura 9 mostra o crescimento de células T que exibiram forte reatividade a dois péptidos de mielina por análise EAA, tal como se mostra na figura 8. A figura 10 mostra a focagem do TCR V beta que ocorreu na linha de células T de um paciente à medida que a cultura progrediu desde o dia 9 até ao dia 16, enquanto está a ser estimulada pela mistura de péptidos PLPm27. A figura 11 mostra alguns dos dados de frequência de células T reativas à mielina de um paciente que tinha sido submetido a uma primeira série de tratamentos com três vacinas de células T reativas à mielina. A figura 12 mostra a reatividade de células T de um paciente na semana 24 a péptidos que abrangem a MBP de comprimento total. As caixas à volta das barras indicam os péptidos que contêm as duas sequências imunodominantes da MBP utilizadas anteriormente na análise de frequência das células T (TCFA). A figura 13 mostra a reatividade de células T de um paciente na semana 24 a péptidos que abrangem a PLP de comprimento total. As caixas à volta das barras indicam os péptidos que contêm as duas sequências imunodominantes da PLP utilizadas anteriormente na TCFA. A figura 14 mostra a reatividade de células T de um paciente na semana 24 a péptidos que abrangem a MOG de comprimento total. As caixas à volta das barras indicam os péptidos que contêm as duas sequências imunodominantes da MOG utilizadas anteriormente na TCFA. A figura 15 mostra o padrão de reatividade a péptidos da MBP em oito pacientes. A linha vermelha horizontal mostra o corte do SI 3. As caixas à volta das barras indicam os péptidos imunodominantes que foram usados anteriormente. A figura 16 mostra o padrão de reatividade a péptidos da PLP em oito pacientes. A linha vermelha horizontal mostra o corte do SI 3. As caixas à volta das barras indicam os péptidos imunodominantes que foram usados anteriormente. A figura 17 mostra o padrão de reatividade a péptidos da MOG em oito pacientes. A linha vermelha horizontal mostra o corte do SI 3. As caixas à volta das barras indicam os péptidos imunodominantes que foram usados anteriormente. A figura 18 mostra os SI médios contra a MBP para amostras de um total de 15 pacientes com EM, testadas usando o EAA. As caixas à volta das barras indicam os péptidos imunodominantes. A figura 19 mostra os SI médios contra a PLP para amostras de um total de 15 pacientes com EM, testadas usando o EAA. As caixas à volta das barras indicam os péptidos imunodominantes. A figura 20 mostra os SI médios contra a MOG para amostras de um total de 15 pacientes com EM, testadas usando o EAA. As caixas à volta das barras indicam os péptidos imunodominantes. A figura 21 mostra a frequência da reatividade aos péptidos da MBP entre 54 indivíduos. Os indivíduos eram saudáveis ("Norm"), tinha apenas sido recolhido sangue ("MD"), foram incluídos num estudo de vacinação de repetição ("Ext"), ou foram incluídos num estudo de escalonamento da dose ("DES") . As caixas à volta das barras indicam os locais dos péptidos imunodominantes utilizados na produção da vacina do exemplo 1. A figura 22 mostra a frequência da reatividade aos péptidos da PLP entre 54 indivíduos. Os indivíduos eram saudáveis ("Norm"), tinha apenas sido recolhido sangue ("MD"), foram incluídos num estudo de vacinação de repetição ("Ext"), ou foram incluídos num estudo de escalonamento da dose ("DES") . As caixas à volta das barras indicam os locais dos péptidos imunodominantes utilizados na produção da vacina do exemplo 1. A figura 23 mostra a frequência da reatividade aos péptidos da MBP entre 54 indivíduos. Os indivíduos eram saudáveis ("Norm"), tinha apenas sido recolhido sangue ("MD"), foram incluídos num estudo de vacinação de repetição ("Ext"), ou foram incluídos num estudo de escalonamento da dose ("DES") . As caixas à volta das barras indicam os locais dos péptidos imunodominantes utilizados na produção da vacina do exemplo 1. A figura 24 mostra as curvas de crescimento de cinco células T reativas à mielina que tinham exibido um índice de estimulação de menos de 2,0. As células T foram isoladas a partir de dois pacientes.

As figuras 25 A - H mostram um mapa do ensaio 429 (ensaios únicos nas linhas e os péptidos nas colunas). Os ensaios para cada paciente são listados na ordem da data em que foram realizados. As misturas de péptidos positivas são mostradas em cinzento. A figura 26 mostra um mapa do ensaio 65 (ensaios únicos nas linhas e os péptidos nas colunas) . Os ensaios para cada paciente são listados na ordem da data em que foram realizados. As misturas de péptidos positivas são mostradas em cinzento. A figura 27 mostra a mudança do epitopo ao longo do tempo em quatro indivíduos.

DESCRIÇÃO DETALHADA É divulgada uma vacina de células T que compreende células T específicas para epítopos de um antigénio polipeptídico. Também são divulgados métodos para a identificação de tais epítopos e métodos para a preparação de uma tal vacina. A vacina pode ser uma vacina personalizada. Outros aspetos irão tornar-se evidentes para um especialista na matéria através da descrição que se segue. 1. Definições. A terminologia que é aqui utilizada é para o propósito de descrever apenas formas de realização particulares e, não se destina a ser limitativa. Tal como são utilizadas na especificação e nas reivindicações em anexo, as formas singulares "um", "uma" e "o", "a" incluem os respectivos plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário. "Péptido" ou "polipéptido" pode significar uma sequência de aminoácidos ligada e pode ser natural, sintética, ou uma modificação ou combinação de aminoácidos naturais e sintéticos. "Tratamento" ou "tratar", quando se refere à proteção de um animal contra uma doença, pode significar a prevenção, supressão, repressão, ou a eliminação completa da doença. A prevenção da doença envolve a administração de uma composição da presente invenção a um animal antes do aparecimento da doença. A supressão da doença envolve a administração de uma composição da presente invenção a um animal após a indução da doença, mas antes do seu aparecimento clinico. A repressão da doença envolve a administração de uma composição da presente invenção a um animal após o aparecimento clinico da doença, a. substancialmente idêntica "Substancialmente idêntica" tal como é aqui utilizado pode significar que uma primeira e uma segunda sequência são pelo menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % idênticas ao longo de uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 ou mais aminoácidos.

2. Resposta imunitária de células T A fim de iniciar uma resposta imunitária específica a uma célula T reativa à mielina (MRTC) , o sistema imunológico deve ser capaz de identificar as células T autorreativas envolvidas na patogénese e isolar determinados produtos proteicos que irão aprimorar os esforços de defesa do hospedeiro. Implícito neste modelo de neutralização está a transformação de um epítopo peptídico imunogénico e a sua apresentação na superfície de células apresentadoras de antigénio. O resultado destas ações é a indução de uma resposta de células T que recruta e envolve os outros participantes moleculares da resposta imunitária. No centro deste elemento do sistema imunológico está o complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Localizado no cromossoma humano 6, o MHC é um conjunto altamente polimórfico de genes que codificam para moléculas essenciais para a discriminação do próprio e estranho e para o processamento e apresentação de antigénios. O poder deste complexo multigénico reside no seu polimorfismo, que permite que diferentes classes de produtos alélicos da classe I e da classe II se liguem a uma matriz quase infinita de péptidos. A natureza do MHC sugere o agora conceito fundamental da restrição do MHC próprio. As células T CD4+ são ativadas apenas por células apresentadoras de antigénio que partilham alelos do MHC da classe II com elas; isto é, o reconhecimento do antigénio pelas células auxiliares T (Th) CD4+ é restrito ao MHC da classe II. Por outro lado, o reconhecimento do antigénio por células citotóxicas T (Tc) CD8+ é restrito ao MHC da classe I.

Um dogma central da resposta imunitária das células T é a apresentação do péptido pelo antigénio de leucócitos humanos (HLA, também conhecido como MHC) . As moléculas do HLA estão presentes na superfície de células apresentadoras de antigénio (APC). Estas moléculas do HLA (das quais existem centenas de alelos diferentes) constituem o fenótipo do HLA de um paciente. Um péptido que seja apresentado a uma célula T deve ligar-se especificamente dentro do sulco do MHC I ou II criado pela molécula do HLA.

Tal como discutido anteriormente, as vacinas de células T produzidas utilizando proteínas antigénicas de comprimento total foram infrutíferas. Os antigénios de comprimento total são dependentes de processamento pela APC, a fim de que o péptido adequado seja apresentado pelo HLA. 0 processamento incompleto diminui a capacidade de o HLA apresentar epítopos relevantes de doenças. A primeira tentativa de ultrapassar o problema do processamento do antigénio de comprimento total foi, em vez disso para produzir a vacina utilizando péptidos. A fim de determinar quais os péptidos que eram o antigénio estimulador apropriado, foram realizados rastreios de pacientes com EM para identificar os epítopos imunodominantes. Estes epítopos imunodominantes abrangem, na realidade, uma parcela ainda menor de toda a reatividade entre os indivíduos com EM. É aqui fornecido um método para detetar os péptidos imunorreativos verdadeiramente específicos individualmente (relevantes de doença) dentro de cada indivíduo. 0 método também pode ser usado para rastrear estas células idiotípicas. 0 método também pode ser utilizado para detetar novos idiotipos patogénicos à medida que surgem e controlar a persistência da supressão de outros.

Apesar de que possam existir péptidos relevantes de doença adicionais para um determinado paciente, o uso de epítopos imunodominantes foi considerado suficiente, porque a vacinação de um paciente com uma tal vacina iria conduzir a uma resposta imunitária anti-idiotípica e antiergotípica. Acreditou-se que a resposta anti- idiotípica era dirigida para uma população especifica de células T na vacina, enquanto que a resposta antiergotípica se acreditou ser dirigida a todas as populações de células T ativadas.

Utilizando o mesmo conjunto de péptidos para cada paciente não dá qualquer reflexão do fenótipo do HLA do indivíduo e, por conseguinte, a ligação de péptidos às suas APC não está otimizada. 0 uso de apenas péptidos imunodominantes resulta frequentemente em culturas que crescem fracamente, uma vez que as células T não são otimamente estimuladas por estes péptidos. Para alelos do HLA que são conhecidos, a produção de uma vacina de células T utilizando péptidos que são capazes de se ligar ao HLA do paciente, leva geralmente à produção de uma vacina robusta. No entanto, para aqueles alelos do HLA desconhecidos, os péptidos que se ligam não podem ser previstos e, por conseguinte, devem ser utilizados num ensaio de rastreio para produzir uma resposta robusta. Para além disso, mesmo para os alelos conhecidos, o modelo de previsão não é 100 % exato. Portanto, a abordagem do EAA aqui descrita também pode limitar o efeito da difusão do epítopo para péptidos adicionais sobre as proteínas da mielina. A vacina de células T aqui proporcionada pode ser individualizada para um determinado paciente com base na variabilidade e na promiscuidade dos recetores de células T autorreativas entre os pacientes. 3. Análise de rastreamento de epitopo (EAA) É proporcionado um método para a identificação de um epítopo de um polipéptido autorreativo. É fornecida uma amostra que compreende células T isoladas a partir de um hospedeiro. Por exemplo, podem ser recolhidas a partir de um hospedeiro células mononucleares de sangue periférico (PBMC) ou células mononucleares do fluido cerebrospinal (CSFMC) . A amostra pode então ser dividida em uma pluralidade de porções, cada uma das quais pode ser incubada na presença de um ou mais péptidos diferentes ou de um controlo. As sequências dos péptidos podem compreendem coletivamente uma porção da sequência do antigénio polipeptídico, que pode ser o polipéptido completo. Finalmente, uma porção da amostra pode ser identificada compreendendo células T autorreativas estimuladas. A porção da amostra que compreende células T autorreativas estimuladas pode ser identificada por referência a um índice de estimulação (SI). 0 EAA pode resultar no crescimento de CD4 (MHC II) e CD8 (MHC I) . Originalmente, as células Thl CD4 da classe II foram pensadas para serem as únicas células patogénicas na EM; no entanto, tornou-se evidente que as células CTL CD8 da classe I estão também fortemente associadas com a EM. Alguns descreveram que os loci do MHC II são o elo genético predominante e outros mostraram que, no plano de fundo dos loci do MHC II existe uma forte associação com certos loci do MHC I para a EM e formas mais graves da EM. As metodologias preditivas anteriores não identificam os péptidos ao longo de ambos o MHC II e I. 0 EAA identifica estes péptidos sem a necessidade de conhecer as relações do MHC II e I. Para além disso, o EAA pode utilizar um péptido de comprimento suficiente para adaptar a vacina ao paciente. As APC podem processar um péptido para se obter um péptido de 10 a 11 aminoácidos que é apresentado pelo MHC da classe II. Os péptidos podem ser sujeitos a proteólise parcial para se obter uma sequência que pode ser ligada ao MHC da classe I, que pode ser de cerca de 9 aminoácidos de comprimento. Como resultado, as células T CD4 e CD8 podem crescer por meio de um péptido apropriado, se de facto o MHC I e MHC II estão associados com a EM num paciente em particular, a. Péptidos

Os péptidos que compreendem uma porção de qualquer polipéptido autorreativo podem ser utilizados no método de rastreio. Os péptidos podem compreender uma porção de polipéptidos autorreativos associados com a EM, tais como a MBP (número de acesso NCBI P02686, ou um polipéptido substancialmente idêntico da mesma), a MOG (número de acesso NCBI CAA52617, ou um polipéptido substancialmente idêntico da mesma), a PLP (número de acesso NCBI AAA60350, ou um polipéptido substancialmente idêntica da mesma), ou uma combinação das mesmas. As sequências dos péptidos podem compreender coletivamente a sequência completa do antigénio polipeptidico. Os diferentes péptidos compreendem uma sequência de sobreposição de 4 a 19 aminoácidos. Os péptidos são de 8 a 20 aminoácidos. b. índice de estimulação (SI) O SI pode ser calculado através da comparação da incorporação da [3H] timidina da amostra na presença de um péptido que compreende uma porção de um polipéptido alvo da MRTC à da na presença de um controlo somente de meio. Resumidamente, são plaqueadas alíquotas separadas da amostra e são incubadas na presença quer de um péptido que compreende uma porção do polipéptido quer de um controlo somente de meio, a fim de estimular as células T reativas. As culturas são pulsadas com [3H] timidina durante as últimas 6-18 horas de incubação. O SI é calculado como o quociente entre as contagens médias por minuto (cpm) das alíquotas do antigénio e as cpm médias das alíquotas de controlo. O SI das células T autorreativas pode ser aumentado por pelo menos um fator de 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1.7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2.8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3.9, ou 4,0 em comparação com um controlo. (1) Valor predeterminado O valor predeterminado do SI é 1,3. O valor predeterminado pode também ser calculado utilizando um método de avaliação da variância, tal como se segue: 1. 0 EAA pode ser executado numa determinada população de pacientes (mínimo de 120 ensaios de 120 indivíduos únicos) 2. Pode ser gerada uma "população negativa" fazendo uma média de todos os valores do SI < 2,5 3. O desvio-padrão (SD) pode ser calculado para cada péptido 4. Pode ser calculado o que se segue para cada péptido:

a. média + 1 SD

b. média + 2 SD

c. média + 3 SD 5. Os SI que se seguem podem ser considerados acima do valor predeterminado:

a. SI superior ou igual à média + 3 SD b. Qualquer SI superior ou igual a 2,5 O SI também pode ser calculado testando cada poço, em vez de se fazer a média de poços realizados em triplicado. Neste caso, qualquer célula única que reúna os critérios anteriores pode tornar o ensaio anterior o valor predeterminado. O valor predeterminado pode também ser avaliado utilizando um método de variância de contagens por minuto (CPM). Este algoritmo pode definir um corte abrangente para todos os péptidos dentro de um determinado ensaio. Pode ser calculado tal como se segue: 1. O EAA pode ser executado e pode ser feita a média das CPM para todos os poços do controlo (apenas meio, sem antigénio) 2. O SD para as CPM dos poços do controlo pode então ser calculado. 3. Pode ser calculado o que se segue para os poços do controlo:

a. média + 1 SD

b. média + 2 SD

c. média + 3 SD 4. Qualquer péptido com uma CPM média superior ou igual à média + 3 SD dos poços do controlo pode ser considerado acima do valor predeterminado.

Cada poço pode também ser avaliado em vez de ser feita uma média dos poços realizados em triplicado. Neste caso, qualquer célula única que reúna os critérios anteriores pode tornar o ensaio anterior o valor predeterminado.

Qualquer péptido, quer seja analisado num poço individual quer tenha sido feita a média ao longo dos poços realizados em triplicado, com um SI > 2,5, um SI > média + 3 SD pelo método de avaliação da variância, ou um SI > média + 3 SD pelo método de variância de CPM, pode ser considerado acima do valor predeterminado, o que pode indicar uma(s) célula(s) T positiva(s) para a reatividade a um péptido.

4. Método de produção de uma vacina de células T É divulgado um método para a preparação de uma vacina de células T. Pode ser fornecida uma amostra que compreende células T isoladas a partir de um paciente. Pode então ser adicionado um péptido que compreende um epitopo identificado pelo método de rastreio. As células T autorreativas podem depois ser isoladas. As células T podem então ser atenuadas, a. Estimulação

As células T autólogas identificadas como tendo um SI acima de um valor predeterminado para um péptido que compreende um epitopo identificado pelo método de rastreio podem ser submetidas a ciclos de estimulação recorrentes com o péptido correspondente, opcionalmente e IL-2, na presença de APC, tal como as PBMC autólogas irradiadas. A irradiação pode ser a 3500 ou de 2500 - 6000 rads. Os ciclos de estimulação podem ser levados a cabo durante 7 -14 dias. Os ciclos de estimulação podem também ser levados a cabo durante 7-10 dias. As células T podem ser propagadas em ciclos de estimulação até que o número total de células atinja um nível terapêutico. As linhas de células T podem ser criopreservadas nesta altura.

As células T podem ser ativadas por estimulação não específica para induzir a sobrerregulação de ergotopos. As células T ativadas resultantes podem então ser atenuadas. As células T podem ser atenuadas por qualquer método que torne a replicação de células T incompetente, mas ainda viável. Por exemplo, as células T podem ser atenuadas por irradiação tal como a irradiação gama ou por inativação química. b. Ativação

As células T autorreativas podem ser ativadas durante os ciclos de crescimento de estimulação antes da atenuação. A ativação das células T durante os ciclos de crescimento antes da atenuação pode induzir uma

sobrerregulação geral de ergotopos expressos na superfície de células T ativadas mas não em repouso (Irun R. Cohen, Francisco J. Quintana, e Avishai Mimran. Tregs in T cell vaccination: exploring the regulation of regulation. JCI volume 114 (9) 1227-1232, 2004) . Assim, quando as células T autorreativas são crescidas como células T ativadas antes da atenuação, podem ser esperadas respostas de células T tanto antiergotípicas como anti-idiotípicas após a vacinação. (Cohen et al., JCI volume 114 (9) : 1227-1232, 2004) . As células T autorreativas podem ser ativadas por exposição a mitogénios (tais como a fitohemaglutinina (PHA)) ou a interleucina-2 na presença da PHA, ou através da ligação do complexo TCR / CD3 (Kobayashi et al., J. Exp. Med. 170: 827). Um dos principais mecanismos através do qual a ativação de células T pode conferir capacidade de resposta à IL-2 é através da sobrerregulação das subunidades do recetor (ergotopos) para estas citocinas (Chua et al., J. Immunol. 153: 128, 1994; Desai et al. , J.

Immunol. 148: 3125, 1992; Presky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14002, 1997; e Wu et al., Eur. J. Immunol. 27 : 147, 1997) .

C. APC

As APC podem ser células brancas do sangue. Os exemplos representativos de APC incluem os monócitos, as células dendríticas e as células B.

d. Células T A vacina de células T pode compreender células T positivas para os marcadores celulares CD3, CD4, CD8, CD25, TCR αβ, TCR γδ, HSP60 (proteína de choque térmico 60) ou uma combinação dos mesmos. A vacina de células T pode também compreender as membranas das células T ou fragmentos das mesmas. e. Atenuação A vacina de células T pode ser atenuada. A atenuação pode ser efetuada por qualquer método que torna a replicação de células T incompetente, mas ainda viável. Por exemplo, as células T podem ser atenuadas por irradiação tal como a irradiação gama ou por inativação química. A irradiação gama pode ser a 10.000 ou de 7.000 -12.000 rads.

5. Vacinas de células T É também divulgada uma vacina de células T. A vacina pode ser produzida tal como descrito anteriormente. A vacina pode compreender células T que são específicas para um polipéptido antigénico caraterizado pelo facto dos epitopos (opcionalmente, todos os epítopos) do polipéptido antigénico capazes de produzir um índice de estimulação acima de um valor predeterminado serem reconhecidos por células T autorreativas presentes na vacina. A vacina pode compreender de 60 - 90 milhões, de 30 - 45 milhões, ou de 6-9 milhões de células T. A vacina também pode compreender menos de 50 % de células T que reconhecem os epítopos do polipéptido antigénico capazes de produzir um índice de estimulação de menos do que o valor predeterminado. A vacina também pode compreender menos do que 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % ou 1 % de células T que reconhecem os epítopos do polipéptido antigénico capazes de produzir um índice de estimulação de menos do que o valor predeterminado. A vacina de células T pode compreender células T que são específicas para vários polipéptidos antigénicos. Por exemplo, uma vacina de células T para ser administrada a um paciente com EM pode conter células T específicas para a MBP, a PLP e a MOG. 6. Método de deteção da mudança de epítopo É divulgado um método para a deteção de uma mudança de epítopo numa doença mediada por células T. O método compreende identificar os epítopos de um antigénio autorreativo utilizando o método de rastreio e, comparando esses epítopos a um controlo. Se os epítopos são diferentes, foi detetada uma mudança do epítopo. A deteção de uma mudança de epítopo pode ser utilizada para diagnosticar uma mudança de epítopo ou para monitorizar uma mudança de epítopo.

Ao fornecer péptidos que compreendem uma porção da sequência de um antigénio polipeptídico, a invenção proporciona um método para a identificação de epítopos crípticos que estão mascarados na proteína de comprimento total. A presente invenção tem vários aspetos, ilustrados pelos exemplos não limitativos que se seguem.

Exemplo 1

Vacinas baseadas em imunodominantes

Em ensaios clínicos anteriores, foram produzidas linhas de células de vacina por estimulação de culturas de células T com dois péptidos imunodominantes da MBP. Em ensaios clínicos recentes, foram produzidas linhas de células de vacina por estimulação de células T com um total de seis péptidos imunodominantes (2 da MBP, 2 da PLP e 2 da MOG) . Para alguns pacientes, a utilização deste conjunto limitado de péptidos resultou em culturas que crescem mal e durante várias semanas, para produzir a vacina. As células T não estavam a ser otimamente estimuladas porque os péptidos não foram otimamente adaptados ao fenótipo do HLA para cada paciente. Para além disso, a maioria dos epítopos envolvidos não estão abrangidos pela utilização de apenas epítopos imunodominantes suspeitos e, portanto, não é conseguida uma vacina verdadeiramente individualizada. Os epítopos que não estão abrangidos podem estar a estimular a expansão clonal e a patogénese in vivo e podem não estar a ser comprovados.

Exemplo 2

Epítopos de mielina A fim de determinar se a escolha dos péptidos estimuladores adequados poderia ser melhorada, foram preparados epítopos de péptidos adicionais dentro da MBP, da PLP e da MOG, e foram testados em pacientes com esclerose múltipla. Para realizar a análise, foram sintetizados um total de 163 péptidos sobrepostos diferentes (a síntese de cada péptido de 16 aminoácidos (16-mer) é compensada por 4 aminoácidos, com uma sobreposição de 12 aminoácidos da sequência anterior) que abrangiam o comprimento total da MBP, da PLP e da MOG.

Foram sintetizadas um total de 44 sequências de péptidos da MBP, 67 da PLP e 52 da MOG. A lista de sequências, os seus identificadores e o número de aminoácidos e como foram combinados para utilização no EAA (identificação da mistura) são mostrados nas tabelas 1 - 3. As seis sequências imunodominantes utilizadas no exemplo 1 estão a negrito.

Exemplo 3

Geração de um repertório de antigénios de mielina

Foram gerados péptidos sobrepostos que abrangem a proteína MBP, que têm cada um 16 aa de comprimento e sobrepõem-se em 12 aa. Todos os péptidos da MBP puderam ser fabricados, no entanto, o repertório de péptidos da MBP excluiu oito péptidos. Os 36 péptidos resultantes abrangem 95,7 % da proteína. Só não foram abrangidos os aminoácidos 1 - 8. A lista dos péptidos da MBP está na tabela 4, com os péptidos não utilizados destacados a cinzento claro.

Foram também gerados péptidos sobrepostos que abrangem a proteína PLP, que têm cada um 16 aa de comprimento e sobrepõem-se em 12 aa. Nem todos os péptidos da PLP puderam ser fabricados, incluindo as sequências de aminoácidos 61 - 72 e 245 - 248. Para além disso, o repertório de péptidos da PLP excluiu 20 péptidos. Os 35 péptidos resultantes abrangem 83,0 % da proteína. As únicas regiões não abrangidas foram os aminoácidos 21 -24, 61 - 80, 117 - 128, 165 - 168 e 237 - 248. A lista de péptidos da PLP é mostrada na tabela 5, com os péptidos que não são utilizados destacados a cinzento claro e aqueles que não puderam ser fabricados a cinzento escuro.

Foram também gerados péptidos sobrepostos que abrangem a proteína MOG, que têm cada um 16 aa de comprimento e sobrepõem-se em 12 aa. Nem todos os péptidos da MOG puderam ser fabricados, incluindo a sequência de aminoácidos 141 - 144. Para além disso, o repertório de péptidos da MOG excluiu oito péptidos. Os 40 péptidos resultantes abrangem 93,6 % da proteína. As únicas regiões não abrangidas foram os aminoácidos 69 - 80 e 141 - 144. A lista de péptidos da MOG é mostrada na tabela 6, com os péptidos que não são utilizados destacados a cinzento claro e aqueles que não puderam ser fabricados a cinzento escuro.

Os péptidos foram sintetizados para todo o comprimento da MBP, da PLP e da MOG com graus de pureza > 95 % na maioria dos casos. Todos os péptidos que puderam ser sintetizados foram avaliados em experiências subsequentes. Um total de 16 péptidos não puderam ser sintetizados por síntese de péptidos em fase sólida (SPPS). Estes 16 péptidos abrangem um único conjunto de 18 aminoácidos ao longo das 3 proteínas (2,6 % do conteúdo de proteína total) . Todos os péptidos que não puderam ser fabricados eram de natureza hidrofóbica.

Exemplo 4

Ensaio de análise de epitopo

Os péptidos no exemplo 2 foram testados num ensaio de estimulação das PBMC in vitro para identificar as células T reativas à mielina no sangue de um paciente. As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram separadas do sangue total, foram lavadas, foram contadas e foram plaqueadas a 250.000 células por poço num total de quatro placas de 96 poços. As misturas de péptidos de mielina de dois péptidos 16-mer sobrepostos foram adicionadas a poços em triplicado de PBMC com poços de controlo apenas com meio em triplicado incluídos em cada placa e, em seguida, foram incubadas. Após dois dias de incubação, foram adicionadas 20 U/ml de interleucina-2 (IL-2). No quinto dia, as placas foram marcadas com um radioisótopo (timidina tritiada) e foram recolhidas 6 horas depois. Neste ensaio, as células que incorporam timidina tritiada são representativas de células T ativadas e induzidas a proliferar pelos complexos recetor de células T - péptido - MHC. As células T que incorporam comparativamente mais timidina tritiada do que as células controlo e experimentais são células T mais altamente ativadas e estão a proliferar mais rapidamente.

Os índices de estimulação (SI) foram determinados para cada mistura de péptidos através da divisão das contagens médias radiomarcadas por minuto (CPM) dos poços de péptido estimulado pela CPM média dos poços de controlo apenas com meio ponderada por todas as quatro placas. Um SI de pelo menos 3 foi considerado positivo. A figura 1 é um exemplo do EAA de um paciente com EM. Sete das misturas de péptidos foram ligeiramente reativas, com os poços com a M0Gml5 estimulada sendo muito reativos. As figuras 2-4 mostram a frequência de reatividade para as misturas de péptidos em 48 pacientes.

Exemplo 5 Análise do HLA

Os péptidos ativos identificados pelo EAA, tal como descrito no exemplo 2, foram comparados com o fenótipo HLA do paciente. Foi utilizado um algoritmo para a previsão de regiões de ligação da classe II disponível no endereço http://www.imtech.res.in/raghava/propred/ (Singh, H. e G.P.S. Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites) para prever as regiões de ligação da MOG com base no haplótipo HLA-DR do paciente de DRB1_0801, DRB1_1501 e DRE>5_0101. A figura 5 mostra as previsões de ligação do ProPred dentro da proteína MOG para os 3 alelos HLA do paciente. Os resíduos de aminoácidos a vermelho representam resíduos de ancoragem previstos para a ligação no interior do sulco do HLA, enquanto que os resíduos a amarelo representam os outros resíduos que se encaixam no interior do sulco. Como resultado, estes resíduos seriam previstos serem epítopos estimuladores candidatos para células T deste paciente. A caixa amarela clara rodeia as sequências incluídas na mistura de péptidos MOGmlõ que deu o SI de 10. Há sequências dentro destes péptidos que estão previstas ligarem-se a todos os três alelos do HLA. Para dois dos alelos existem dois epítopos de ligação previstos e ainda uma parte de um terceiro dentro destas sequências. Embora a ligação prevista destas sequências se tenha correlacionado, em certa medida, com os resultados obtidos no ensaio de EA, existem péptidos estimuladores que não são preditos.

Estes resultados mostram que o EAA fornece resultados de previsão superiores para a identificação de péptidos estimuladores específicos de pacientes. A superioridade do EAA é melhorada tendo em vista as variantes de expressão do HLA. Os estudos comparativos entre a sorologia e a tipagem molecular para os loci HLA-A e B descobriram alelos detetados por reagentes de tipagem de ADN, mas não detetados por reagentes serológicos. Estas variantes de expressão do HLA não são expressas ou são expressas em quantidades muito pequenas na superfície da célula. 0 EAA é superior a ecrãs de software, porque não existe a necessidade de identificar as variantes do HLA.

Exemplo 6

Produção da vacina

Os péptidos específicos do paciente identificados pelo EAA foram testados para determinar se podiam ser utilizados para produzir e expandir células T reativas à mielina para utilização numa vacina. Foi obtido um saco de 500 ml de sangue a partir do paciente para estabelecer culturas de produção de vacina. As culturas em massa foram criadas em meio AIM V, juntamente com os péptidos otimizados. Após 48 horas de incubação, foi adicionada rIL-2 a 20 U/ml. Sete dias mais tarde, as culturas foram reestimuladas com as PBMC e o péptido. O meio foi mudado para 2 % de soro AB com 100 U/ml de rIL2 em meio X Vivo 15. As culturas foram alimentadas e, se necessário divididas a cada 1-4 dias. Depois de um período adicional de sete dias, as culturas foram novamente estimuladas com as APC e os péptidos. As culturas continuaram a ser alimentadas e, se necessário divididas a cada 1-4 dias. Depois de um período adicional de 7 - 14 dias, as culturas tinham-se expandido para pelo menos 100 X 106 células. As células foram divididas em alíquotas de 10 x 106 células e foram congeladas.

Exemplo 7 Análise da TCR VB A vacina produzida no exemplo 6 foi testada para determinar se as células T expandidas de forma seletiva tinham um subconjunto específico de células T. O enriquecimento de subconjuntos de células T foi avaliado através da análise do uso da cadeia variável beta (νβ) do recetor de células T. As 24 diferentes famílias da região da cadeia beta variável (νβ) conhecidas foram avaliadas usando anticorpos monoclonais específicos marcados com fluorescência e citometria de fluxo. Se um subconjunto particular de células T é expandido de forma seletiva por estimulação com um péptido, seria detetado um aumento na percentagem de células que expressam uma das famílias Vbeta à medida que esse subconjunto se expande.

Foi realizada uma análise ao recetor de célula T (TCR) Vbeta após aproximadamente 18 dias da produção de uma vacina, produzida tal como descrito no exemplo 6. Foi produzida uma linha de células T através da estimulação das PBMC do paciente com a mistura de péptidos MBPmlO, que tinha produzido um SI de 4,6 no EAA inicial, para este paciente. A figura 6 mostra que a mistura de péptidos MBPmlO produziu um SI de 4,6. Esta mistura foi usada para estimular as PBMC deste paciente em cultura. A figura 7 mostra a análise da Vbeta realizada nas células na linha de base, em PBMC, e no dia 18 da cultura de células T com os péptidos MBPmlO para este mesmo paciente. Na linha de base existe uma distribuição relativamente uniforme típica da cadeia Vbeta do TCR em PBMC. No entanto, após 18 dias de estimulação em cultura com MBPmlO, as células T positivas V beta 5-6 compõem agora 45 % das células em cultura, indicando que a estimulação com a mistura de péptidos MBPmlO foi capaz de concentrar, ou expandir de forma seletiva, um subconjunto de células T no interior das PBMC deste paciente.

Exemplo 8

Análise do crescimento

Foi testada a capacidade de estimulação com os péptidos selecionados pelo EAA de expandirem mais rapidamente as células T estimuladas. As curvas de crescimento das células foram analisadas para duas misturas de péptidos estimuladores diferentes. Os dados das CPM EAA mostrados na figura 8 mostram uma mistura fortemente reativa a MBPml9 para um paciente com um SI de 4,7. Uma segunda placa do mesmo ensaio mostra uma outra mistura reativa a PLPm33 com um SI elevado de 17,9. Estas duas misturas de péptidos foram então utilizadas para estimular as PBMC deste paciente para produzir linhas de células T. A análise do crescimento dos péptidos identificados pelo EAA é mostrada na figura 9. As células estimuladas com PLPm33 expandiram de 15 milhões de PBMC para 200 milhões de células T em 20 dias, com 3 estimulações com a mistura de péptidos. As células estimuladas com MBPml9 foram mais lentas a serem expandidas rapidamente, mas também se expandiram de 15 milhões de PBMC para 217 milhões de células T após uma nova estimulação adicional com o péptido no dia 21. Foram recolhidas no dia 27 a partir do dia do inicio da cultura. Este processo representa um processo 6 vezes mais curto do que os métodos de produção anteriores usando apenas péptidos imunodominantes da MBP, da PLP e da MOG.

Para outro paciente com EM, foi originalmente plaqueado um total de 8,25 x 106 PBMC para cada condição de estimulação. Aos 21 dias em cultura, após um total de 3 estimulações com o péptido (sem utilização da PHA), uma linha de células tinha-se expandido para 142 x 106 células, enquanto a outra linha de células tinha-se expandido para 95 x 106 células T. A figura 10 mostra a focagem do TCR V beta que ocorreu à medida que a cultura progrediu desde o dia 9 até ao dia 16 na cultura, enquanto está a ser estimulada pela mistura de péptidos PLPm27. O subconjunto de células T que utiliza a cadeia V beta 5-5 está a expandir-se à custa da maioria dos outros subconjuntos de células T V beta.

Exemplo 9

Monitorização das MRTC O EAA foi usado para avaliar a especificidade de células T reativas à mielina (MRTC) após a vacinação com células T. Foi também testada a deteção da disseminação do epitopo, que ocorre quando o ataque imune inicial focado sobre as proteínas da mielina se dissemina para incluir novos epítopos. A figura 11 mostra alguns dos dados de frequência das MRTC de um paciente que tinha sido submetido à primeira série de tratamento de 3 vacinas. Na semana 52 após a primeira série de vacinas, as MRTC do paciente tinham-se voltado a ligar a um total de 29 MRTC por 10 milhões de PBMC. A TCFA anterior, na semana 28, tinha mostrado apenas 4 MRTC / 10 milhões de PBMC.

Foi preparada uma nova vacina utilizando os mesmos procedimentos que para a primeira série de vacinas e o tratamento foi reiniciado. O paciente recebeu uma dose de reforço na semana 4 e na semana 8, e os números das MRTC caíram para 6/10 milhões de PBMC. Quinze semanas depois, na semana 24, as MRTC do paciente começaram a reaparecer, em particular, as células T reativas à MBP. A figura 12 mostra a reatividade das células T do paciente na semana 24 aos péptidos da MBP de comprimento total. As caixas rodeiam os péptidos que contêm as duas sequências imunodominantes da MBP utilizadas anteriormente na TCFA. Tal como pode ser observado, há ainda reatividade ao péptido 2 da MBP, o que pode contribuir para o aumento da reatividade contra a MBP, também observado na TCFA.

As figuras 13 e 14 mostram a reatividade das células T do paciente na semana 24 aos péptidos que abrangem as proteínas PLP e MOG de comprimento total, respetivamente. As caixas rodeiam os péptidos que contêm as duas sequências imunodominantes da PLP e da MOG utilizadas anteriormente e na TCFA. Tal como indicado, existem três áreas na PLP e duas áreas na MOG que mostram forte reatividade no EAA. Esta análise foi usada para produzir uma nova vacina para o paciente utilizando as seis misturas de péptidos reativas recentemente identificadas. Exemplo 10

Resumo da análise 1 do EAA

As figuras 15 - 17 mostram o padrão de reatividade aos péptidos da MBP, da PLP e da MOG, respetivamente, em 8 pacientes com EM. A linha a vermelho mostra o corte positivo do SI 3. Os dois péptidos imunodominantes da MBP, da PLP e da MOG que foram utilizados anteriormente são identificados pelas caixas. Tal como indicado na figura 15, existe um epítopo dentro de MBPml9 que não está presente nos dois péptidos imunodominantes da MBP. Para a PLP, a figura 16 indica que existem outras três áreas de imunorreatividade que não estão incluídas dentro dos péptidos imunodominantes da PLP. A imunorreatividade mais elevada foi no interior de todas as 3 regiões no final da sequência da proteína PLP. Para a MOG, a figura 17 indica que a porção transmembranar e imediatamente intracelular da proteína é muito mais imunorreativa do que os péptidos imunodominantes da MOG utilizados anteriormente.

As figuras 18 - 20 mostram os SI médios para as amostras de um total de 15 pacientes com EM testados utilizando o ensaio EA. Tal como pode ser notado, foi observada alguma reatividade ligeiramente maior para o terminal-C da MBP. Quando os mesmos dados são analisados para a proteína PLP é muito evidente a zona imunodominante, mais uma vez no terminal-C desta proteína. A análise da reatividade contra a proteína MOG mostra a área imunodominante na região transmembranar, bem como na região do terminal-C da proteína. Tomados em conjunto, os dados indicam que é importante a inclusão de outros epítopos de péptidos de proteínas da mielina para identificar as células T reativas à mielina de pacientes com EM, para uso em vacinas de células T, a fim de produzir uma vacina mais eficaz de uma forma mais eficiente. 0 conhecimento do padrão da disseminação de epítopo, ou deslocamento, em EM pode ser utilizado para conceber terapias de vacinação com células T específicas do péptido, que bloqueiam a destruição em curso do tecido. Pode ser usado o EAA sequencial para determinar se e quando um paciente desenvolve reatividade contra epítopos "novos" dentro das 3 proteínas da mielina analisadas. Podem ser utilizados péptidos reativos recentemente identificados para produzir linhas de células T para uma vacina de seguimento.

Exemplo 11

Resumo da análise 2 do EAA 0 EAA foi realizado em 54 indivíduos. Os indivíduos incluíram indivíduos saudáveis (N = 12), pacientes com EM envolvidos num ensaio clínico de escalonamento da dose para Tovaxin (N = 16), pacientes com EM envolvidos num ensaio clínico de vacinação repetida (estudo de extensão) para Tovaxin (N = 13) e pacientes com EM envolvidos num ensaio clinico de apenas uma única recolha de sangue (método de desenvolvimento) (N = 13) . A tabela 4 mostra a reatividade dos sujeitos às misturas de péptidos da mielina. As tabelas 5-7 mostram a reatividade dos sujeitos às misturas de péptidos da MBP, da PLP e da MOG, respetivamente. As figuras 21 - 23 mostram a reatividade dos sujeitos às misturas de péptidos da mielina, com as caixas a indicar a localização dos péptidos imunodominantes utilizados na produção da vacina do exemplo 1.

Foi observada reatividade para pelo menos uma das misturas de péptidos de mielina em 42 dos 54 indivíduos testados (78 %) , incluindo 7 dos 12 indivíduos saudáveis. 0 número de misturas de péptidos a que os indivíduos reagiram variou de 0 a 11. A reatividade positiva variou do SI mínimo de 3,0 a um SI máximo de 21,1.

Tal como mostrado pelos padrões de reatividade, a maioria dos indivíduos testados tinha células T reativas a sequências de péptidos em regiões das três proteínas da mielina fora dos seis péptidos imunodominantes que foram utilizados para preparar as vacinas no exemplo 1. Quarenta e um por cento dos indivíduos testados foram reativos para os péptidos imunodominantes da MBP (MBP 83-99 e MBP 151-170) . Apenas 31 % dos indivíduos testados foram reativos para os péptidos imunodominantes da PLP (PLP 30-49 e PLP 180-199). Apenas 11 % dos indivíduos testados foram reativos para as sequências de péptidos imunodominantes da MOG (MOG 1-17 e MOG 19-39). O padrão de reatividade inicialmente parece consistente com estudos anteriores que identificam a sequência do péptido da MBP 83-99 como mais reativa do que os péptidos da PLP e da MOG. No entanto, em geral, a reatividade contra péptidos da MBP foi menor do que a reatividade observada contra péptidos da PLP e da MOG; 30 % de todos os indivíduos testados foram reativos contra um ou mais péptidos da MBP em oposição a 65 % para péptidos da PLP e 61 % para péptidos da MOG. A tabela 11 abaixo mostra o número médio de péptidos para cada proteína a que os sujeitos foram reativos contra.

No caso da proteína MOG, os estudos anteriores focaram-se na porção extracelular da proteína. A MOG tem uma parte extracelular que inclui os aa 1 - 122 com um domínio semelhante a Ig, uma parte transmembranar, e uma parte intracelular que compreende os aa 123 - 218. Os resultados anteriores indicam um elevado nível de reatividade para a porção da proteína que está dentro ou imediatamente após a sequência transmembranar no espaço intracelular, aminoácidos 113 - 132 (MOGml5).

Curiosamente, todos (100 %) os pacientes do estudo de extensão, que tinham sido previamente vacinados com a vacina do exemplo 1, mostraram imunorreatividade com a porção intracelular da MOG. Isto está em contraste com todos os outros indivíduos testados, dos quais apenas 49 % mostraram qualquer reatividade com péptidos da MOG. Crescimento de linhas de células T de mielina reativas com baixos índices de estimulação 0 que se segue demonstra a capacidade das células T de mielina reativas de crescerem com um SI de menos de 3,0 e, especialmente inferior a 2,0. Utilizando os algoritmos descritos acima, foram observados SI estatisticamente significativos tão baixos quanto 1,3 e, portanto, devem ser capazes de crescer em resposta ao antigénio. Para verificar esta capacidade, 5 linhas celulares em dois pacientes são mostradas com um SI < 2,0. Os resultados são mostrados na tabela 12 e na figura 24, que indicam o crescimento destas linhas de células com apenas a estimulação de antigénio peptídico e fatores de crescimento de células T comuns.

As PBMC do sujeito 1042 foram corridas no EAA, e 2 misturas de péptidos foram positivas, incluindo a PLPml8 com um SI de 1,8, a PLPm26 com um SI de 2,5 e a PLPm28 com um SI de 2,5. As células foram submetidas a estimulação antigénica, conforme o protocolo normal, tal como mostrado em seguida e foram recolhidas 14, 19, 26, 33 e 35 dias mais tarde. As PBMC do sujeito 1014 foram corridas no EAA, e 4 misturas foram positivas, incluindo a MBPml4 com um SI de 1,7, a PLPml7 com um SI de 1,7, a PLPm28 com um SI de 2,2 e a MOGm6 com um SI de 1,9. As células do sujeito 1014 foram submetidas a estimulação antigénica tal como mostrado em seguida e foram recolhidas 14, 19, 26, 33 e 35 dias mais tarde.

As PBMC foram isoladas através da centrifugação em gradiente de densidade a partir de sangue periférico obtido através de punção venosa para anticoagulante ACD-1. As PBMC foram plaqueadas a 2,5 E + 06 células / poço em placas de 24 poços. Os antigénios sob a forma de péptidos de 16mer identificados no EAA foram adicionados a uma concentração final de 20 ug/ml. A interleucina-2 (IL-2) foi adicionada a uma concentração final de 100 U/ml a partir de 48 horas e a IL-2 foi adicionada à mesma

concentração com a alimentação ou a cada divisão de poços. A reestimulação do péptido na presença de células apresentadoras de antigénio (PBMC APC autólogas irradiadas a 3500 rad) foi realizada nos dias 7, 14 e 21. A interleucina-15 (IL-15) foi adicionada a uma concentração final de 5 ng/ml - 20 ng/ml (específico do lote), começando no dia 14 e continuando ao longo do resto do período de cultura. As linhas de células foram todas recolhidas pelo dia 35 e tinham alcançado expansões de 3,0 - 8,2 vezes.

A figura 24 mostra que as 5 linhas de células T dos indivíduos 1042 e 1014 reativas a misturas de péptidos de mielina com SI < 2,0 foram capazes de crescer em resposta ao antigénio. Por conseguinte, as linhas de células T que exibem o SI baixo podem ser cultivadas em resposta a um antigénio de mielina.

Exemplo 12

Análise EAA de péptidos de mielina reativos

Os péptidos do exemplo 3 foram testados em 429 EAA nos ensaios clínicos tal como se segue. Um total de 162 dos 429 ensaios (37,8 %) mostraram SI positivos usando o método de avaliação de variância ou o método de variância de CPM. Os EAA pré-vacina têm 158 positivos em 387 ensaios (40,8 %), com pacientes com EM com recaída remitente (RRMS) mostrando 150 positivos em 368 ensaios (40,8 %) , e pacientes com síndroma clinicamente isolada (CIS) mostrando 8 positivos em 19 ensaios (42,1 %) .

Dos indivíduos rastreados, 144 ensaios de um total de 312 têm sido positivos de 249 indivíduos (46,2 % e 57,8 %, respetivamente). Destes, os pacientes com RRMS apresentaram 136 positivos em 301 ensaios em 238 indivíduos (45,2 % e 57,1 %, respetivamente), e os pacientes com CIS apresentaram 8 positivos em 11 ensaios (72,7 %) .

Durante a aquisição, 14 de 89 ensaios (15,7 %) foram positivos, dos quais os pacientes com RRMS mostraram 14 positivos em 84 ensaios (16,7 %) , e os pacientes com CIS mostraram 0 positivos entre 5 ensaios (0 %) . Durante os EAA de linha de base, 6 de 31 ensaios (19,4 %) foram positivos, com os pacientes com RRMS a mostrarem 6 positivos em 28 ensaios (21,4 %) , os pacientes com CIS a mostrarem 0 positivos em 3 ensaios (0 %).

Os EAA pós-vacina mostraram 4 de 42 ensaios (9,5 %) positivos, dos quais os pacientes com RRMS apresentaram 3 positivos em 37 ensaios (8,1 %) , e os pacientes com CIS apresentaram 1 positivo em 5 ensaios (20,0 %) .

Na semana 4 os EEA mostraram 2 positivos em 21 ensaios (9,5 %) , dos quais os pacientes com RRMS apresentaram 1 positivo em 19 ensaios (5,3 %) , e os

pacientes com CIS apresentaram 1 positivo em 2 ensaios (50,0 %) . Na semana 8 os EAA apresentaram 2 positivos em 16 ensaios (12,5 %), dos quais os pacientes com RRMS apresentaram 2 positivos em 14 ensaios (14,3 %) e os pacientes com CIS apresentaram 0 positivos em 2 ensaios (0 %). Na semana 12 os EAA mostraram 0 positivos em 5 ensaios (0 %) , dos quais os pacientes com RRMS mostraram 0 positivos em 4 ensaios (0 %) e os CIS mostraram 0 positivos em 1 ensaio (0 %).

Exemplo 13 Ensaio clinico EAA

Ao longo de 6 meses foi realizado um estudo com 120 indivíduos que satisfazem os critérios para o ensaio clínico. Os indivíduos tinham esclerose múltipla com recaída remitente (RR-EM; n = 114) ou síndroma clinicamente isolada de alto risco (CIS; n = 6) com uma escala expandida do estado de incapacidade (EDSS) de 0 -5,5, um diagnóstico de doença de 0 - 10 anos, 18 - 55 anos de idade, critérios de MRI indicativos de EM e um EAA positivo. A população de indivíduos mencionada anteriormente foi avaliada por EAA usando o método de avaliação de variância e o método da variância de CPM, tal como descrito anteriormente, e foi considerada elegível para a produção da vacina. Das 120 tentativas para produzir a vacina, ocorreram 2 falhas de envio (o sangue não foi recebido dentro dos nossos critérios declarados), 1 cultura foi perdida devido a contaminação e 5 amostras chegaram com baixo volume de células / rendimento. Dos restantes 112 indivíduos, a vacina foi produzida com sucesso em 89 indivíduos, com 22 ainda em produção (98,9 % das amostras elegíveis, 92,5 % de todas as amostras concluída) . Com base nisto, um EAA positivo foi considerado preditivo da capacidade de produzir uma vacina para dose terapêutica através dos métodos aqui divulgados.

Os métodos atuais para crescer linhas de células T incluem:

1. 0 isolamento das PBMC 2. 0 plaqueamento das PBMC em placas de 24 poços a 2,5 E+06 células / poço 3. A adição do antigénio a 20 ug/ml / péptidos, 2 péptidos / poço 4. A adição da IL-2 (10 - 200 IU/ml) às 48 horas (e incluída até à colheita) 5. Reest imulações com APC irradiadas a 3500 rads (1,0 E+06, tal como descrito antes) e antígeno (o mesmo antígeno / mesma concentração) nos dias 7, 14 e 21 6. A adição da IL-15 (1 - 50 ng/ml) no dia 14 (e incluída até à colheita) 7. Potencial de adição de mitogénio, superantigénio ou anticorpo para estimular o crescimento em d35, se as células não cresceram a quantidade suficiente

Ao longo deste estudo foram descobertos nesta população de indivíduos com EM vários epítopos com imunodominância. Vários destes epítopos são novos. Estes péptidos apresentaram reatividade num grande número de indivíduos rastreados no nosso ensaio. Várias destas regiões imunodominantes não foram previamente descritas na literatura. Os epítopos de interesse estão listados nas tabelas 13 - 15.

As figuras 25 - 27 mostram os resultados deste ensaio clinico. As figuras 25 A - H mostram um mapa do ensaio 429 (ensaios únicos a descer e péptidos em transversal) . Os ensaios estão alinhados por data. As misturas de péptidos positivas são mostradas em cinzento. Isto mostra que as misturas de péptidos que se verificou serem positivas foram únicas e imprevisíveis. A figura 26 mostra um mapa do ensaio 65 (ensaios únicos a descer e péptidos em transversal). Os ensaios estão alinhados por data. As misturas de péptidos positivas são mostradas em cinzento. Isto mostra que as misturas de péptidos que se verificou serem positivas foram únicas e imprevisíveis. 0 número de misturas positivas variou num único indivíduo de 0 até 19. A figura 27 mostra os resultados da análise EAA que indica a mudança de epítopo ao longo do tempo em 4 indivíduos. 0 indivíduo 1 mostrou uma pequena mudança com a reatividade primeiramente em torno de M0Gm4, M0Gm5 e M0Gm6 e mudando para M0Gm21, MOGm22 e MOGm23. Note-se que estas duas se sobrepõem. 0 indivíduo 2 mostrou os mesmos péptidos reativos ao longo do tempo, mas com o aumento da reatividade a novos péptidos quanto mais longe do tempo zero. 0 indivíduo 3 mostrou uma mudança significativa na reatividade da PLP para MOG e o indivíduo 4 mostrou vários epicentros para a reatividade, com uma mudança gradual de uma área (PLP terminal-C) para outra (MOG terminal-N). Também neste mesmo indivíduo foi observada uma reatividade a longo prazo, mas transitória, à porção central da MOG e, finalmente, uma reatividade a MBP nos dois últimos pontos temporais.

Declarações adicionais da divulgação: 1. Um método de identificar um epítopo dentro de um antigénio polipeptídico para uma célula T autorreativa, que compreende: (a) proporcionar uma amostra que compreende células T isoladas a partir de um hospedeiro; (b) adicionar um ou mais péptidos diferentes a uma pluralidade de porções da amostra, em que as sequências dos péptidos compreendem coletivamente uma porção da sequência do antigénio polipeptídico; e (c) identificar uma porção da amostra que compreende células T autorreativas ativadas, em que um péptido que ativa as células T autorreativas identificado por (c) compreende o epítopo. 2. 0 método de 1 em que as sequências dos péptidos compreendem coletivamente a sequência completa do antigénio polipeptídico. 3. 0 método de 1 em que o antigénio polipeptídico é MBP, PLP, MOG ou uma combinação dos mesmos. 4. 0 método de 1 em que os diferentes péptidos compreendem sequência de sobreposição de 8 - 12 ou 4 - 19 aminoácidos. 5. 0 método de 1 em que os diferentes péptidos compreendem cerca de 12 - 16 ou 8 -20 aminoácidos. 6. O método de 1 em que o índice de Estimulação da amostra que compreende as células T autorreativas ativadas está acima de um valor predeterminado. 7. Um método de preparar uma vacina de células T, que compreende (a) proporcionar uma amostra que compreende células T isoladas a partir de um paciente; (b) contactar as células T com um ou mais péptidos diferentes, através do que as células T autorreativas são ativadas; (c) expandir as células T autorreativas ativadas; e (d) atenuar as células T autorreativas; em que os um ou mais péptidos diferentes compreendem todos os epitopos de um polipéptido antigénico capaz de estimular células T autorreativas com um índice de estimulação acima de um valor predeterminado. 8. 0 método de 7 em que o polipéptido antigénico é 1V1BP, PLP, MOG ou uma combinação dos mesmos. 9. Um método de preparar uma vacina de células T, que compreende (a) proporcionar uma amostra que compreende células T isoladas a partir de um paciente; (b) contactar as células T com um ou mais péptidos diferentes que compreendem um epitopo identificado pelo método de 1, através do que as células T autorreativas são ativadas; (c) expandir células T autorreativas ativadas; e (d) atenuar as células T autorreativas; em que o um ou mais péptidos diferentes compreendem todos os epitopos de um polipéptido antigénico capaz de estimular as células T autorreativas com um índice de estimulação acima de um valor predeterminado. 10. Um método de detetar a mudança de epitopo numa doença mediada por células T, que compreende: (a) identificar os epitopos de um antigénio autorreativo de acordo com o método de 1; e (b) comparar os epitopos de (a) com os epitopos num controlo, em que a mudança de epítopo ocorreu se os epítopos são diferentes. 11. Um método de diagnosticar uma mudança de epítopo, que compreende: (a) detetar uma mudança de epítopo de acordo com o método de 10, em que a deteção da mudança de epítopo indica que a mudança de epítopo ocorreu. 12. Um método de monitorizar uma mudança de epítopo, que compreende: (a) detetar uma mudança de epítopo de acordo com o método de 10; e (b) comparar os epítopos com um momento anterior, em que a mudança de epítopo ocorreu se os epítopos são diferentes. 13. Uma vacina de células T que compreende células T que são específicas para um polipéptido antigénico em que cada epítopo do polipéptido antigénico capaz de produzir um índice de estimulação acima de um valor predeterminado é reconhecido por células T autorreativas presentes na vacina. 14. A vacina de células T de 13 em que o polipéptido antigénico é MBP, PLP, MOG ou uma combinação dos mesmos.

15. A vacina de células T de 13 em que as células T autorreativas presentes na vacina compreendem menos do que 50% de células T que reconhecem os epítopos do polipéptido antigénico capazes de produzir um índice de estimulação menor do que um valor predeterminado.

16. A vacina de células T de 13 em que as células T autorreativas presentes na vacina são positivas para marcadores celulares selecionados a partir de um dos seguintes: CD3, CD4, CD8, CD25, TCR αβ, TCR γδ, HSP60 ou uma combinação dos mesmos.

LISTA DE SEQUÊNCIAS

<110> OPEXA THERAPEUTICS

<120> VACINA DE CÉLULAS T <130> SMW/FP 67 94 54 9 <140> EP <141> 04-05-2007 <150> EP07797347.7 <151> 04-05-2007 <150> PCT/US2007/068304 <151> 04-05-2007 <150> US 60/746.611 <151> 05-05-2006 <150> US 60/747.903 <151> 22-05-2006 <160> 163 <170> Patentln versão 3.3

<210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 1

Met Ala Ser Gin Lys Arg Pro Ser Gin Arg His Gly Ser Lys Tyr Leu 15 10 15 <210> 2 <211> 16

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Lys Arg Pro Ser Gin Arg His Gly Ser Lys Tyr Leu Ala Thr Ala Ser 15 10 15

<210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Gin Arg His Gly Ser Lys Tyr Leu Ala Thr Ala Ser Thr Met Asp His 15 10 15

<210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Ser Lys Tyr Leu Ala Thr Ala Ser Thr Met Asp His Ala Arg His Gly 15 10 15

<210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5

Ala Thr Ala Ser Thr Met Asp His Ala Arg His Gly Phe Leu Pro Arg 15 10 15

<210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6

Thr Met Asp His Ala Arg His Gly Phe Leu Pro Arg His Arg Asp Thr 15 10 15

<210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7

Ala Arg His Gly Phe Leu Pro Arg His Arg Asp Thr Gly lie Leu Asp 15 10 15

<210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8

Phe Leu Pro Arg His Arg Asp Thr Gly lie Leu Asp Ser lie Gly Arg 15 10 15

<210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 9

His Arg Asp Thr Gly lie Leu Asp Ser lie Gly Arg Phe Phe Gly Gly 15 10 15

<210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 10

Gly lie Leu Asp Ser lie Gly Arg Phe Phe Gly Gly Asp Arg Gly Ala IS 10 15

<210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 11

Ser lie Gly Arg Phe Phe Gly Gly Asp Arg Gly Ala Pro Lys Arg Gly 15 10 15

<210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 12

Phe Phe Gly Gly Asp Arg Gly Ala Pro Lys Arg Gly Ser Gly Lys Val 15 10 15 <210> 13 <211> 16

<212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 13

Asp Arg Gly Ala Pro Lys Arg Gly Ser Gly Lys Val Pro Trp Leu Lys 15 10 15

<210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 14

Pro Lys Arg Gly Ser Gly Lys Val Pro Trp Leu Lys Pro Gly Arg Ser 15 10 15

<210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 15

Ser Gly Lys Val Pro Trp Leu Lys Pro Gly Arg Ser Pro Leu Pro Ser 15 10 15

<210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 16

Pro Trp Leu Lye Pro Gly Arg Ser Pro Leu Pro Ser Bis Ala Arg Ser 15 10 15

<210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 17

Pro Gly Arg Ser Pro Leu Pro Ser His Ala Arg Ser Gin Pro Gly Leu 15 10 15

<210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 18

Pro Leu Pro Ser His Ala Arg Ser Gin Pro Gly Leu Cys Asn Met Tyr 15 10 15

<210> 19 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 19

His Ala Arg Ser Gin Pro Gly Leu Cys Asn Met Tyr Lys Asp Ser His 15 10 15 <210> 20 <211> 16

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20

Gin Pro Gly Leu Cys Asn Met Tyr Lys Asp Ser His His Pro Ala Arg 15 10 15

<210> 21 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21

Cys Asn Met Tyr Lys Asp Ser His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr 15 10 15

<210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22

Lys Asp Ser His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro 15 10 15

<210> 23 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23

His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys Ser His 15 10 15

<210> 24 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24

Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys Ser His Gly Arg Thr Gin 15 10 15

<210> 25 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25

Gly Ser Leu Pro Gin Lys Ser His Gly Arg Thr Gin Asp Glu Asn Pro 15 10 15

<210> 26 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26

Gin Lys Ser His Gly Arg Thr Gin Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe 15 10 15

<210> 27 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27

Gly Arg Thr Gin Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lye Asn lie 15 10 15

<210> 28 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28

Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn lie Val Thr Pro Arg 15 10 15

<210> 29 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29

Val Val His Phe Phe Lys Asn lie Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro 15 10 15

<210> 30 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30

Phe Lys Asn lie Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gin Gly Lys 15 10 15 <210> 31 <211> 15

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31

Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gin Gly Gly Ala Glu Gly 15 10 15

<210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32

Thr Pro Pro Pro Ser Gin Gly Gly Ala Glu Gly Gin Arg Pro Gly 15 10 15

<210> 33 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33

Ser Gin Gly Gly Ala Glu Gly Gin Arg Pro Gly Phe Gly Tyr Gly 15 10 15

<210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34

Ala Glu Gly Gin Arg Pro Gly Phe Gly Tyr Gly Gly Arg Ala Ser 15 10 15

<210> 35 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35

Arg Pro Gly Phe Gly Tyr Gly Gly Arg Ala Ser Asp Tyr Lys Ser 15 10 15

<210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36

Gly Tyr Gly Gly Arg Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly 15 10 15

<210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37

Arg Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val 15 10 15

<210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38

Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gin Gly 15 10 15

<210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39

His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gin Gly Thr Leu Ser Lys 15 10 15

<210> 40 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40

Lys Gly Val Asp Ala Gin Gly Thr Leu Ser Lys lie Phe Lys Leu 15 10 15

<210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41

Ala Gin Gly Thr Leu Ser Lys lie Phe Lys Leu Gly Gly Arg Asp 15 10 15

<210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 42

Leu Ser Lys lie Phe Lys Leu Gly Gly Arg Asp Ser Arg Ser Gly 15 10 15

<210> 43 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43

Phe Lys Leu Gly Gly Arg Asp Ser Arg Ser Gly Ser Pro Met Ala 15 10 15

<210> 44 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44

Gly Arg Asp Ser Arg Ser Gly Ser Pro Met Ala Arg Arg 15 10

<210> 45 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45

Met Gly Leu Leu Glu Cys Cys Ala Arg Cys Leu Val Gly Ala Pro Phe 15 10 15 <210> 46

<211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46

Glu Cys Cys Ala Axg Cys Leu Val Gly Ala Peo Phe Ala Sec Leu Val 15 10 15

<210> 47 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47

Arg Cys Leu Val Gly Ala Pro Phe Ala Ser Leu Val Ala Thr Gly Leu 15 10 15

<210> 48 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48

Gly Ala Pro Phe Ala Ser Leu Val Ala Thr Gly Leu Cys Phe Phe Gly 15 10 15

<210> 49 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49

Ala Ser Leu Val Ala Thr Gly Leu Cys Phe Phe Gly Val Ala Leu Phe 15 10 15

<210> 50 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50

Ala Thr Gly Leu Cys Phe Phe Gly Val Ala Leu Phe Cys Gly Cys Gly 15 10 15

<210> 51 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51

Cys Phe Phe Gly Val Ala Leu Phe Cys Gly Cys Gly His Glu Ala Leu 15 10 15

<210> 52 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52

Val Ala Leu Phe Cys Gly Cys Gly His Glu Ala Leu Thr Gly Thr Glu 15 10 15

<210> 53 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53

Cys Gly Cys Gly Bis Glu Ala Leu Thr Gly Thr Glu Lys Leu lie Glu 15 10 15

<210> 54 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54

His Glu Ala Leu Thr Gly Thr Glu Lys Leu lie Glu Thr Tyr Phe Ser 15 10 15

<210> 55 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55

Thr Gly Thr Glu Lys Leu lie Glu Thr Tyr Phe Ser Lys Asn Tyr Gin 15 10 15

<210> 56 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56

Lys Leu lie Glu Thr Tyr Phe Ser Lys Asn Tyr Gin Asp Tyr Glu Tyr 15 10 15

<210> 57 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57

Thr Tyr Phe Ser Lys Asn Tyr Gin Asp Tyr Glu Tyr Leu lie Asn Val 15 10 15

<210> 58 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58

Lys Asn Tyr Gin Asp Tyr Glu Tyr Leu lie Asn Val lie His Ala Phe 15 10 15

<210> 59 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59

Asp Tyr Glu Tyr Leu lie Asn Val He His Ala Phe Gin Tyr Val lie 15 10 15

<210> 60 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 0

Leu lie Asn Val He His Ala Phe Gin Tyr Val lie Tyr Gly Thr Ala 15 10 15

<210> 61 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 lie His Ala Phe Gin Tyr Val He Tyr Gly Thr Ala Ser Phe Phe Phe 15 10 15

<210> 62 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62

Gin Tyr Val He Tyr Gly Thr Ala Ser Phe Phe Phe Leu Tyr Gly Ala 15 10 15

<210> 63 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63

Tyr Gly Thr Ala Ser Phe Phe Phe Leu Tyr Gly Ala Leu Leu Leu Ala 15 10 15 <210> 64 <211> 16

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64

Ser Phe Phe Phe Leu Tyr Gly Ala Leu Leu Leu Ala Glu Gly Phe Tyr 15 10 15

<210> 65 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65

Leu Tyr Gly Ala Leu Leu Leu Ala Glu Gly Phe Tyr Thr Thr Gly Ala 15 10 15

<210> 66 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 6

Leu Leu Leu Ala Glu Gly Phe Tyr Thr Thr Gly Ala Val Arg Gin lie 15 10 15

<210> 67 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67

Glu Gly Phe Tyr Thr Thr Gly Ala Val Arg Gin lie Phe Gly Asp Tyr 15 10 15

<210> 68 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68

Thr Thr Gly Ala Val Arg Gin lie Phe Gly Asp Tyr Lys Thr Thr lie 15 10 15

<210> 69 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 9

Val Arg Gin lie Phe Gly Asp Tyr Lys Thr Thr lie Cys Gly Lys Gly 15 10 15

<210> 70 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70

Phe Gly Asp Tyr Lys Thr Thr lie Cys Gly Lys Gly Leu Ser Ala Thr 15 10 15

<210> 71 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71

Lys Thr Thr lie Cys Gly Lys Gly Leu Ser Ala Thr Val Thr Gly Gly 15 10 15

<210> 72 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72

Cys Gly Lys Gly Leu Ser Ala Thr Val Thr Gly Gly Gin Lys Gly Arg 15 10 15

<210> 73 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73

Leu Ser Ala Thr Val Thr Gly Gly Gin Lys Gly Arg Gly Ser Arg Gly 15 10 15

<210> 74 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74

Val Thr Gly Gly Gin Lys Gly Arg Gly Ser Arg Gly Gin His Gin Ala 15 10 15

<210> 75 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 75 61η Lys Gly Arg Gly Ser Arg Gly Gin His Gin Ala His Ser Leu Glu 15 10 15

<210> 76 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76

Gly Ser Arg Gly Gin His Gin Ala His Ser Leu Glu Arg Val Cys His 15 10 15

<210> 77 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77

Gin His Gin Ala His Ser Leu Glu Arg Val Cys His Cys Leu Gly Lys 15 10 15

<210> 78 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78

His Ser Leu Glu Arg Val Cys His Cys Leu Gly Lys Trp Leu Gly His 15 10 15 <210> 79

<211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79

Arg Val Cys His Cys Leu Gly Lys Trp Leu Gly His Pro Asp Lys Phe 15 10 15

<210> 80 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80

Cys Leu Gly Lys Trp Leu Gly His Pro Asp Lys Phe Val Gly lie Thr 15 10 15

<210> 81 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81

Trp Leu Gly His Pro Asp Lys Phe Val Gly lie Thr Tyr Ala Leu Thr 15 10 15

<210> 82 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82

Pro Asp Lys Phe Val Gly lie Thr Tyr Ala Leu Thr Val Val Trp Leu 15 10 15

<210> 83 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83

Val Gly lie Thr Tyr Ala Leu Thr Val Val Trp Leu Leu Val Phe Ala 15 10 15

<210> 84 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84

Tyr Ala Leu Thr Val Val Trp Leu Leu Val Phe Ala Cys Ser Ala Val 15 10 15

<210> 85 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85

Val Val Trp Leu Leu Val Phe Ala Cys Ser Ala Val Pro Val Tyr lie 15 10 15

<210> 86 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 8 6

Leu Val Phe Ala Cys Ser Ala Val Pro Val Tyr lie Tyr Phe Asn Thr 15 10 15

<210> 87 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87

Cys Ser Ala Val Pro Val Tyr lie Tyr Phe Asn Thr Trp Thr Thr Cys 15 10 15

<210> 88 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88

Pro Val Tyr lie Tyr Phe Asn Thr Trp Thr Thr Cys Gin Ser lie Ala 15 10 15

<210> 89 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89

Tyr Phe Asn Thr Trp Thr Thr Cys Gin Ser lie Ala Phe Pro Ser Lys 15 10 15 <210> 90

<211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90

Trp Thr The Cys Gin Ser lie Ale Phe Pro Ser Lys Thr Sec Ala Sec 15 10 15

<210> 91 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91

Gin Ser lie Ala Phe Pro Ser Lys Thr Ser Ala Ser lie Gly Ser Leu 15 10 15

<210> 92 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92

Phe Pro Ser Lys Thr Ser Ala Ser lie Gly Ser Leu Cys Ala Asp Ala 15 10 15

<210> 93 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93

Thr Ser Ala Ser lie Gly Ser Leu Cys Ala Asp Ala Arg Met Tyr Gly IS 10 15

<210> 94 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 lie Gly Ser Leu Cys Ala Asp Ala Arg Met Tyr Gly Val Leu Pro Trp 15 10 15

<210> 95 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95

Cys Ala Asp Ala Arg Met Tyr Gly Val Leu Pro Trp Asn Ala Phe Pro 15 10 15

<210> 96 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 6

Arg Met Tyr Gly Val Leu Pro Trp Asn Ala Phe Pro Gly Lys Val Cys 15 10 15

<210> 97 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 97

Vai Leu Pro Trp Asn Ala Phe Pro Gly Lys Vai Cys Gly Ser A$n Leu 15 10 15

<210> 98 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98

Asn Ala Phe Pro Gly Lys Vai Cys Gly Ser Asn Leu Leu Ser Ile Cys 15 10 15

<210> 99 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99

Gly Lys Vai Cys Gly Ser Asn Leu Leu Ser Ile Cys Lys Thr Ala Glu 15 10 15

<210> 100 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 100

Gly Ser Asn Leu Leu Ser lie Cys Lys Thr Ala Glu Phe Gin Met Thr 15 10 15 <210> 101

<211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 101

Leu Sec lie Cys Lye Thr Ale Glu Phe Gin Met Thr Phe His Leu Phe 15 10 15

<210> 102 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 102

Lys Thr Ala Glu Phe Gin Met Thr Phe His Leu Phe lie Ala Ala Phe 15 10 15

<210> 103 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 103

Phe Gin Met Thr Phe His Leu Phe lie Ala Ala Phe Val Gly Ala Ala 15 10 15

<210> 104 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 104

Phe His Leu Phe He Ala Ala Phe Val Gly Ala Ala Ala Thr Leu Val 15 10 15

<210> 105 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 105 lie Ala Ala Phe Val Gly Ala Ala Ala Thr Leu Val Ser Leu Leu Thr 15 10 15

<210> 106 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 106

Val Gly Ala Ala Ala Thr Leu Val Ser Leu Leu Thr Phe Met He Ala 15 10 15

<210> 107 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 107

Ala Thr Leu Val Ser Leu Leu Thr Phe Met He Ala Ala Thr Tyr Asn 15 10 15 <210> 108 <211> 16

<212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 108

Ser Leu Leu Thr Phe Met lie Ala Ala Thr Tyr Asn Phe Ala Val Leu 15 10 15

<210> 109 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 109

Phe Met lie Ala Ala Thr Tyr Asn Phe Ala Val Leu Lys Leu Met Gly 15 10 15

<210> 110 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 110

Ala Thr Tyr Asn Phe Ala Val Leu Lys Leu Met Gly Arg Gly Thr Lys 15 10 15

<210> 111 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111

Phe Ala Val Leu Lys Leu Met Gly Arg Gly Thr Lys Phe 15 10

<210> 112 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 112

Gly Gin Phe Arg Val lie Gly Pro Arg His Pro 11« Arg Ala Leu Val 15 10 15

<210> 113 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 113

Val lie Gly Pro Arg His Pro lie Arg Ala Leu Val Gly Asp Glu Val 15 10 15

<210> 114 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 114

Arg His Pro lie Arg Ala Leu Val Gly Asp Glu Val Glu Leu Pro Cys 15 10 15

<210> 115 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 115

Arg Ala Leu Val Gly Asp Glu Val Glu Leu Pro Cys Arg lie Ser Pro 15 10 15

<210> 116 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 116

Gly Asp Glu Val Glu Leu Pro Cys Arg lie Ser Pro Gly Lys Asn Ala 15 10 15

<210> 117 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 117

Glu Leu Pro Cys Arg lie Ser Pro Gly Lys Asn Ala Thr Gly Met Glu 15 10 15

<210> 118 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 118

Arg lie Ser Pro Gly Lys Asn Ala Thr Gly Met Glu Val Gly Trp Tyr 1 5 10 15 <210> 119

<211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 119

Gly Lys Asn Ala Thr Asx Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Pro Pro Phe 15 10 15

<210> 120 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 120

Thr Gly Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Pro Pro Phe Ser Arg Val Val 15 10 15

<210> 121 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 121

Val Gly Trp Tyr Arg Pro Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu Tyr Arg 15 10 15

<210> 122 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 122

Arg Pro Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu Tyr Arg Asn Gly Lys Asp 15 10 15

<210> 123 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 123

Ser Arg Val Val His Leu Tyr Arg Asn Gly Lys Asp Gin Asp Gly Asp 15 10 15

<210> 124 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 124

His Leu Tyr Arg Asn Gly Lys Asp Gin Asp Gly Asp Gin Ala Pro Glu 15 10 15

<210> 125 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 125

Asn Gly Lys Asp Gin Asp Gly Asp Gin Ala Pro Glu Tyr Arg Gly Arg 15 10 15

<210> 126 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 126

Gin Asp Gly Asp Gin Ala Pro Glu Tyr Arg Gly Arg Thr Glu Leu Leu 15 10 15

<210> 127 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 127

Gin Ala Pro Glu Tyr Arg Gly Arg Thr Glu Leu Leu Lys Asp Ala lie 15 10 15

<210> 128 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 128

Tyr Arg Gly Arg Thr Glu Leu Leu Lys Asp Ala lie Gly Glu Gly Lys 15 10 15

<210> 129 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 129

Thr Glu Leu Leu Lys Asp Ala lie Gly Glu Gly Lys Val Thr Leu Arg 15 10 15 <210> 130 <211> 16

<212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 130

Lye Asp Ala lie Gly Glu Gly Lys Val Thr Leu Arg lie Arg Asn Val 15 10 15

<210> 131 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 131

Gly Glu Gly Lys Val Thr Leu Arg lie Arg Asn Val Arg Phe Ser Asp 15 10 15

<210> 132 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 132

Val Thr Leu Arg lie Arg Asn Val Arg Phe Ser Asp Glu Gly Gly Phe 15 10 15

<210> 133 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 133 lie Arg Asn Val Arg Phe Ser Asp Glu Gly Gly Phe Thr Cys Phe Phe 15 10 15

<210> 134 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 134

Arg Phe Ser Asp Glu Gly Gly Phe Thr Cys Fhe Pbe Arg Asp His Ser 15 10 15

<210> 135 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 135

Glu Gly Gly Phe Thr Cys Phe Phe Arg Asp His Ser Tyr Gin Glu Glu 15 10 15

<210> 136 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 136

Thr Cys Phe Phe Arg Asp His Ser Tyr Gin Glu Glu Ala Ala Met Glu 15 10 15

<210> 137 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 137

Arg Asp His Ser Tyr Gin Glu Glu Ala Ala Mat Glu Leu Lys Val Glu 15 10 15

<210> 138 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 138

Tyr Gin Glu Glu Ala Ala Met Glu Leu Lys Val Glu Asp Pro Phe Tyr 15 10 15

<210> 139 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 139

Ala Ala Met Glu Leu Lys Val Glu Asp Pro Phe Tyr Trp Val Ser Pro 15 10 15

<210> 140 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 140

Leu Lys Val Glu Asp Pro Phe Tyr Trp Val Ser Pro Gly Val Leu Val 15 10 15 <210> 141 <211> 16

<212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 141

Asp Pro Phe Tyr Trp Val Ser Pro GXy Val Leu Val Leu Leu Ala Val 15 10 15

<210> 142 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 142

Trp Val Ser Pro Gly Val Leu Val Leu Leu Ala Val Leu Pro Val Leu 15 10 15

<210> 143 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 143

Gly Val Leu Val Leu Leu Ala Val Leu Pro Val Leu Leu Leu Gin lie 15 10 15

<210> 144 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 144

Leu Leu Ala Val Leu Pro Val Leu Leu Leu Gin lie Thr Val Gly Leu 15 10 15

<210> 145 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 145

Leu Pro Val Leu Leu Leu Gin lie Thr Val Gly Leu Val Phe Leu Cys 15 10 15

<210> 146 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 146

Leu Leu Gin lie Thr Val Gly Leu Val Phe Leu Cys Leu Gin Tyr Arg 15 10 15

<210> 147 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 147

Thr Val Gly Leu Val Phe Leu Cys Leu Gin Tyr Arg Leu Arg Gly Lys 15 10 15

<210> 148 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 148

Vai Phe Leu Cys Leu Gin Tyr Arg Leu Arg Gly Lys Leu Arg Ala Glu 15 10 15

<210> 149 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 149

Leu Gin Tyr Arg Leu Arg Gly Lys Leu Arg Ala Glu lie Glu Asn Leu 15 10 15

<210> 150 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 150

Leu Arg Gly Lys Leu Arg Ala Glu lie Glu Asn Leu His Arg Thr Phe 15 10 IS

<210> 151 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 151

Leu Arg Ala Glu lie Glu Asn Leu His Arg Thr Phe Asp Pro His Phe 15 10 15 <210> 152 <211> 16

<212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 152 lie Glu Asn Leu His A_rg Thr Phe Asp Pro His Phe Leu Arg Val Pro 15 10 15

<210> 153 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 153

His Arg Thr Phe Asp Pro His Phe Leu Arg Val Pro Cys Trp Lys lie 15 10 15

<210> 154 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 154

Asp Pro His Phe Leu Arg Val Pro Cys Trp Lys lie Thr Leu Phe Val 15 10 15

<210> 155 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 155

Leu Arg Val Pro Cys Trp Lys lie Thr Leu Phe Val lie Val Pro Val 15 10 15

<210> 156 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 156

Cys Trp Lys lie Thr Leu Phe Val lie Val Pro Val Leu Gly Pro Leu 15 10 15

<210> 157 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 157

Thr Leu Phe Val lie Val Pro Val Leu Gly Pro Leu Val Ala Leu lie 15 10 15

<210> 158 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 158 lie Val Pro Val Leu Gly Pro Leu Val Ala Leu lie lie Cys Tyr Asn 15 10 15

<210> 159 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 159

Leu Gly Pro Leu Val Ala Leu lie lie Cys Tyr Asn Trp Leu His Arg 15 10 15

<210> 160 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 160

Val Ala Leu lie lie Cys Tyr Asn Trp Leu His Arg Arg Leu Ala Gly 15 10 15

<210> 161 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 161 lie Cys Tyr Asn Trp Leu His Arg Arg Leu Ala Gly Gin Phe Leu Glu 15 10 15

<210> 162 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 162

Trp Leu His Arg Arg Leu Ala Gly Gin Phe Leu Glu Glu Leu Arg Asn 15 10 15

<210> 163 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 Ο 0> 163

Arg Leu Ala Gly Gin Phe Leu Glu Glu Leu Arg Asn Pro Phe 15 10

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • EP 07797347 A [0099] • US 2007068304 W [0099] • US 60746611 B [0099] • US 60747903 B [0099]

Documentos de não patente citados na descrição • STINISSEN et al. Crit. Rev. Immunol., 1997, vol. 17, 33- 75 [0002] • ZHANG et al. J. Exp. Med., 1994, vol. 179, 973-984 [0002] • CHOU et al. J. Neuroimmunol. , 1994, vol. 38, 105-114 [0002] • ALLEGRETTA et al. Science, 1990, vol. 247, 718-721 [0002] • BEN-NUN et al. Eur. J. Immunol., 1981, vol. 11, 195-204 [0002] • ZHANG et al. Science, 1993, vol. 261, 1451-1454 [0003] • MEDEAR et al. Lancet, 1995, vol. 346, 807-808 [0003] • OTA et al. Nature, 1990, vol. 346, 183-187 [0007] • IRUN R. COHEN ; FRANCISCO J. QUINTANA ; AVISHAI MIMRAN.

Tregs in T cell vaccination: exploring the regulation of regulation. JCI, 2004, vol. 114 (9), 1227-1232 [0042] • COHEN et al. JCI, 2004, vol. 114 (9), 1227-1232 [0042] • KOBAYASHI et al. J. Exp. Med., vol. 170, 827 [0042] • CHUA et al. J. Immunol., 1994, vol. 153, 128 [0042] • DESAI et al. J. Immunol., 1992, vol. 148, 3125 [0042] • PRESKY et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, vol. 93, 14002 [0042] • WU et al. Eur. J. Immunol., 1997, vol. 27, 147 [0042] Lisboa, 10 de Novembro de 2015

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Um método de preparação de uma vacina de células T, que compreende: (a) proporcionar uma amostra que compreende células T a partir de um paciente; (b) contactar as células T com misturas de péptidos especificas de paciente, pelo que células T autorreativas são ativadas; (c) expandir as células T autorreativas; e (d) atenuar as células T autorreativas, de modo a que as células T sejam de replicação incompetente mas ainda viável; em que as misturas de péptidos especificas de paciente compreendem misturas de péptidos de MBP, PLP e MOG capazes de estimular as células T autorreativas com um índice de estimulação acima de 1,3, o índice de estimulação para cada mistura de péptidos sendo calculado comparando a incorporação de [3H] timidina numa amostra de células T do paciente cultivadas na presença de uma mistura de péptidos que compreende uma porção do polipéptido com a incorporação de [3H] timidina numa amostra de células T cultivadas apenas com meio de controlo, expresso como o quociente entre as contagens médias por minuto de alíquotas de antigénio / contagens médias por minuto de alíquotas de controlo, em que cada péptido numa mistura de péptidos tem desde 8-20 aminoácidos e compreende uma sequência de sobreposição de 4 - 19 aminoácidos com outro péptido na mistura de péptidos.
2. Um método de preparar uma vacina de células T, que compreende: (a) proporcionar uma amostra que compreende células T a partir de um paciente; (b) adicionar misturas de péptidos cada compreendendo diferentes péptidos a uma pluralidade de porções da amostra, em que as sequências dos diferentes péptidos nas misturas de péptidos compreendem coletivamente uma porção da sequência de MBP, PLP e MOG; e (c) identificar uma porção da amostra que compreende células T autorreativas ativadas, em que uma mistura de péptidos que ativa as células T autorreativas identificada por (c) com um índice de estimulação acima de um valor predeterminado é uma mistura de péptidos específica de paciente para as células T autorreativas; (d) proporcionar uma amostra adicional que compreende células T a partir do paciente; (e) contactar as células T com as misturas de péptidos específicas de paciente identificadas na etapas (a) a (c) , pelo que as células T autorreativas são ativadas; (f) expandir as células T autorreativas ativadas; e (g) atenuar as células T autorreat ivas, de modo que as células T sejam de replicação incompetente mas ainda viável; em que o valor predeterminado é 1,3, o índice de estimulação acima de 1,3, o índice de estimulação para cada mistura de péptidos sendo calculado comparando a incorporação de [3H] timidina numa amostra de células T do paciente cultivadas na presença de uma mistura de péptidos que compreende uma porção do polipéptido com a incorporação de [3H] timidina numa amostra de células T cultivadas apenas com meio de controlo, expresso como o quociente entre as contagens médias por minuto de alíquotas de antigénio / contagens médias por minuto de aliquotas de controlo, em que cada péptido numa mistura de péptidos tem desde 8-20 aminoácidos e compreende uma sequência de sobreposição de 4 - 19 aminoácidos com outro péptido na mistura de péptidos.
3. 0 método da reivindicação 1 ou 2, em que as células T são atenuadas através de irradiação ou por inativação química.
4. 0 método de qualquer uma das reivindicações 1 a 3 em que as sequências dos péptidos compreendem coletivamente a sequência completa de MBP, PLP e MOG.
5. 0 método de qualquer uma das reivindicações 1 a 4 em que os péptidos diferentes têm cada 12 - 16 aminoácidos e compreendem sequências de sobreposição de 8 - 12 aminoácidos.
6. 0 método de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que os péptidos consistem em péptidos com as sequências estabelecidas nas SEQ ID Nos: 3-8, 11-20, 23-34, 37-46, 51-52, 55-56, 65-70, 77-82, 87-88, 91-100, 107-125, 132-135, 138-143, 148-159 e 162-163. Lisboa, 10 de Novembro de 2015