PT2274433E

PT2274433E - Celulose altamente desordenada

Info

Publication number: PT2274433E
Application number: PT09728575T
Authority: PT
Inventors: Rajai H Atalla
Original assignee: Cellulose Sciences International Inc
Priority date: 2008-04-03
Filing date: 2009-04-03
Publication date: 2012-08-16
Also published as: RU2525140C2; BRPI0910959B1; RU2010144861A; EP2274433B1; CA2720177A1; BRPI0910959A2; US20110091940A1; US8617851B2; HK1153239A1; WO2009124240A1; ZA201007851B; WO2009124240A4; CA2720177C; EP2274433A1

Description

DESCRIÇÃO "CELULOSE ALTAMENTE DESORDENADA"

INTRODUÇÃO A celulose é o mais abundante de todos os polímeros de ocorrência natural. Quimicamente, é um polissacárido composto por unidades de anidroglucose (anéis de β-D glucopiranose) unidas por uma ponte de oxigénio (ligação β-l,4-glicosidica) e tem a fórmula empírica (C6H10O5)n· A celulose é o componente mais característico das paredes das células das plantas uma vez que forma a maior parte da estrutura de suporte da parede celular. Tem uma estrutura de cadeia linear que forma nanofibrilas cristalinas em que muitos filamentos de β-l,4-glucano paralelos se associam lado a lado para formar microfibrilas em escala nanométrica (2-20 nm de diâmetro e 100-40000 nm de comprimento) que têm grande resistência à tracção e estabilidade química, e são muito resistentes à degradação, e. g. , degradação enzimática, química e mecânica. A celulose é insolúvel em água e solventes orgânicos simples. Vai inchar em soluções de hidróxido de sódio e é solúvel em reagente de Schweitzer.

Comercialmente, a celulose é utilizada para fazer papel, plásticos e têxteis. Os derivados da celulose incluem rayon, celofane, espessantes utilizados em alimentos e tintas, e revestimentos. Mais recentemente, a indústria de biocombustiveis tem mostrado grande interesse em 1 matérias-primas celulósicas para a produção de biocombustiveis, tal como álcoois, e. g. etanol ou butanol, através de processos microbiológicos, bem como de hidrocarbonetos através de conversão catalítica química. A atractividade da produção de biocombustiveis a partir de matérias-primas celulósicas, tais como resíduos agrícolas, ervas e resíduos florestais, decorre da disponibilidade de grandes quantidades destas matérias-primas baratas e do desejo de evitar a queima ou deposição em aterro de resíduos de materiais celulósicos. Algumas fontes celulósicas que podem ser utilizadas para a produção de biocombustiveis, especificamente incluem (1) resíduos agrícolas, como palha de milho, palha de trigo, palha de cevada, palha de arroz, palha de aveia, cascas de aveia, palha de canola e palha de soja, (2) ervas, como painço amarelo, miscanto, murraça e caniço malhado; (3) resíduos florestais, como madeira e serrim de álamo e (4) resíduos de processamento do açúcar, como bagaço e polpa de beterraba. 0 processo de conversão de fibras celulósicas num biocombustível requer: 1) libertação da celulose e hemicelulose da lenhina ou aumento da acessibilidade à celulose e hemicelulose dentro da matéria-prima celulósica por enzimas celulases e 2) despolimerização ou hidrólise dos polímeros de hidratos de carbono hemicelulose e celulose a açúcares livres. Para produzir álcoois, os açúcares são então fermentados a um álcool, e. g. etanol, e o álcool é recuperado, tipicamente por destilação. Alternativamente, os açúcares podem ser convertidos em hidrocarbonetos através de reformação catalítica. 2

No entanto, como observado acima, a celulose contida na maioria da matéria vegetal não é facilmente convertível em açúcares, e este passo representa um importante obstáculo na comercialização de processos para a produção de biocombustíveis. Por causa da estrutura cristalina da celulose, a conversão enzimática de açúcares , por exemplo, leva uma quantidade de tempo considerável e requer grandes quantidades de enzimas hidroliticas, tal como celulases. Analogamente para a produção de derivados de celulose quimicamente modificada, a celulose tem de estar acessível aos agentes químicos reactivos; isto requer geralmente temperatura elevada, pressões, condições químicas severas e períodos de tempo prolongados.

Pensou-se originalmente que a conversão eficiente de celulose em açúcares a partir de material celulósico envolvesse simplesmente a libertação de celulose e hemicelulose do seu complexo com lenhina. No entanto, os processos mais recentes focam-se em aumentar a acessibilidade à celulose no interior da biomassa lenhocelulósica, seguida por despolimerização ou hidrólise de polímeros de hidratos de carbono da celulose a açúcares. 0 aumento da acessibilidade à celulose é mais frequentemente realizado por pré-tratamento do substrato celulósico. 0 objectivo da maioria dos métodos de pré-tratamento é proporcionar uma combinação suficiente de acção mecânica e química, de modo a romper a estrutura de fibras e melhorar a acessibilidade da matéria-prima às enzimas hidroliticas, tal como celulases, que podem hidrolisar celulose. A acção mecânica inclui tipicamente a utilização de pressão, trituração, moagem, agitação, desfibramento, 3 compressão/expansão ou outros tipos de acção mecânica. A acção química inclui tipicamente a utilização de calor (muitas vezes vapor), ácido e solventes orgânicos.

Mesmo com o mais eficiente dos processos de pré-tratamento actualmente conhecidos, a quantidade de enzimas hidrolíticas necessárias para converter a celulose em açúcares continua a ser elevada e representa um custo significativo na produção de biocombustível celulósico. Assim, a conversão eficiente de celulose em açúcares a partir de material celulósico e, por exemplo, a fermentação subsequente de açúcares a álcool, como o etanol, enfrenta um grande desafio para a viabilidade comercial. Aumentando os tempos de hidrólise para evitar custos mais elevados da dosagem crescente de enzimas requer reactores maiores, o que, por sua vez, aumenta os custos de equipamento. A mistura e a mistura intermitente da matéria-prima durante a hidrólise pode aumentar a eficiência da enzima, mas os custos de equipamento aumentam de novo e as forças de cisalhamento aumentadas podem provocar a desnaturação da enzima. Ainda outros sistemas comprometem a actividade enzimática óptima e reduzem a eficiência das enzimas.

Além disso, a dificuldade com a conversão de celulose em produtos de alto valor acrescentado vai muito para além da produção de biocombustíveis. Como observado, os derivados de celulose incluem fibras e plásticos, e. g. celuloses regeneradas, tais como rayon e celofane, ésteres de celulose, tais como acetato, butirato, triacetato e ésteres mistos, nitrato de celulose, viscose e liocel (Tencel). Alguns dos domínios cristalinos da celulose estão tão fortemente agregados que os reagentes químicos não podem neles penetrar 4 totalmente, analogamente à falta de acesso das enzimas para os hidrolisar completamente. 0 resultado é que o grau de substituição ao longo das cadeias de celulose nos derivados de celulose pode ser bastante irregular, resultando em problemas de controlo de qualidade. Em Biofuels, Bioproducts & Biorefining, vol. 2, 2007, páginas 58-73, estão descritas tecnologias de pré-tratamento correntes.

BREVE DESCRIÇÃO

De acordo com os princípios manifestados em formas de realização da invenção, são proporcionados métodos que desagregam ou descristalizam a celulose de tal modo que fica mais acessível para modificação enzimática ou química, e. g. reacções de despolimerização ou hidrólise. Os métodos, com efeito, aumentam a conversão de matérias-primas à base de celulose para utilização na produção de biocombustíveis e derivados de celulose.

Os métodos aqui descritos incluem o tratamento de matérias-primas celulósicas com uma solução de um álcali num sistema de co-solvente, incluindo água e um segundo solvente que é polar e totalmente miscível em água, para formar uma celulose descristalizada e estabilizar a celulose descristalizada por lavagem para remoção do álcali para dar uma celulose descristalizada num meio aquoso. A lavagem pode ser realizada com um sistema de co-solvente que é o mesmo que no passo de tratamento com proporções variáveis de água e do segundo solvente. Entre os co-solventes mais eficazes identificados até agora estão os álcoois. Em formas de 5 realização da invenção, este processo é realizado em condições suaves de temperatura e pressão.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A invenção pode ser melhor compreendida e apreciada por referência à descrição pormenorizada de formas de realização especificas aqui apresentadas em conjunto com os desenhos anexos de que: A FIG. 1 é um difractograma de raios X de uma pasta antes e depois do processo de pré-tratamento de acordo com formas de realização da invenção. A FIG. 2 é um fluxograma que ilustra um sistema de acordo com formas de realização da invenção, incluindo o pré-tratamento de matéria-prima celulósica para aumentar a sua acessibilidade à despolimerização. A FIG. 3 mostra difractogramas de raios X comparativos de uma celulose isolada a 70 °C antes e depois de ser recozida a 150 °C. A FIG. 4 é um gráfico da largura a meia-altura de amostras de celulose recozida a diferentes temperaturas; A FIG. 5 é um fluxograma descrevendo uma forma de realização em que as enzimas são aplicadas sem pré-tratamento prévio seguido por separação da celulose residual, pré-tratamento de acordo com princípios da invenção e, depois, 6 recombinaçao com o sobrenadante da separação depois da primeira fase; A FIG. 6 é um fluxograma que ilustra uma forma de realização alternativa para reduzir os tempos de reacção enzimática de acordo com os princípios da invenção, incluindo o tratamento de celulose residual de um pré-tratamento da primeira fase com segundas fases de descristalização e hidrólise enzimática a glucose antes da fermentação a etanol. A FIG. 7 é um fluxograma que ilustra ainda uma outra forma de realização para reduzir os tempos de reacção enzimática de acordo com os princípios da invenção utilizando um sistema em contracorrente, em que a celulose residual das segundas fases de tratamento é recirculada para a primeira fase de pré-tratamento .

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA São proporcionados métodos que incorporam os princípios da invenção em que os materiais celulósicos são descristalizados ou desagregados por tratamentos que incluem fazer contactar um material celulósico com um álcali num sistema de co-solvente que inclui água e um solvente miscível com água, e. g. um álcool ou poliol. A celulose descristalizada fica mais acessível para a reacção enzimática e química. Os métodos de acordo com formas de realização da invenção aumentam assim a eficiência da modificação enzimática ou química da celulose para utilização como biocombustíveis ou derivados de celulose. 7

Os Exemplos nao pretendem limitar o âmbito da invenção como definida nas reivindicações anexas.

Ao longo desta descrição, os vários aspectos da presente invenção podem ser apresentados num formato de intervalos. Deve entender-se que a descrição no formato de intervalos é meramente por conveniência e brevidade, e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível do âmbito da invenção. Consequentemente, como será entendido por um especialista na matéria, para qualquer e todos os fins, particularmente em termos de proporcionar uma descrição escrita, todos os intervalos aqui descritos também englobam qualquer e todos os possíveis subintervalos e combinações dos seus subintervalos, bem como todos valores numéricos inteiros e fraccionados dentro desse intervalo. Apenas como um exemplo, um intervalo de 20% a 40% pode ser dividido em intervalos de 20% a 32,5% e 32,5% a 40%, 20% a 27,5% e 27,5% a 40%, etc.

Qualquer intervalo listado também é facilmente reconhecido como suficientemente descrito e permitindo que o mesmo intervalo seja dividido em pelo menos metades, terços, quartos, quintos, décimos iguais, etc. Como um exemplo não limitativo, cada intervalo aqui discutido pode ser prontamente dividido num terço inferior, terço médio e terço superior, etc. Além disso, como também será entendido por um especialista na matéria, todos os termos como "até", "pelo menos", "maior do que", "inferior", "mais do que" e semelhantes, incluem o número indicado e referem-se a intervalos que podem ser subsequentemente decompostos em subintervalos como discutido acima. Do mesmo modo, todas as proporções aqui divulgadas também incluem todas as subproporções abrangidas pela proporção mais lata. Além disso, as frases "variando/varia entre" um primeiro número indicador e um segundo número indicador e "variando/varia de" um primeiro número indicador "até" um segundo número indicador são aqui utilizadas indistintamente. 0 que precede são apenas exemplos do que é especificamente pretendido.

Além disso, entender-se-á que a fraseologia e a terminologia aqui utilizada é para fins de descrição e não devem ser considerada como limitativa. A utilização de "compreendendo", "incluindo", "tendo" e suas variações destinam-se aqui a abranger os itens listados a seguir e os seus equivalentes, bem como itens adicionais. "Compreendendo" abrange os termos "consistindo em" e "consistindo essencialmente em". A utilização de "consistindo essencialmente em" significa que a composição ou método pode incluir ingredientes e/ou passos adicionais, mas só se os ingredientes e/ou passos adicionais não alterarem materialmente as caracteristicas básicas e inovadoras da composição ou método reivindicado. Salvo especificação ou limitação em contrário, os termos como "montado", "ligado", "suportado" e "acoplado" e as suas variações são utilizados de forma ampla e abrangem as montagens, ligações, suportes e acoplamentos directos e indirectos. Além disso, "ligado" e "acoplado" não estão restringidos às ligações ou acoplamentos físicos ou mecânicos.

Salvo indicação em contrário, os termos técnicos são utilizados de acordo com a utilização convencional. No entanto, como aqui utilizadas, as definições seguintes podem ser úteis no auxílio ao profissional especializado na compreensão da invenção: 9

Como aqui utilizados, os termos "matéria-prima celulósica", "substrato celulósico" ou "material celulósico" pretendem referir-se a qualquer tipo de biomassa que contém celulose. Por exemplo, matérias-primas celulósicas pode incluir ervas como painço amarelo, murraça, azevém, miscanto ou uma sua combinação; resíduos de processamento do açúcar, tal como bagaço de cana e polpa de beterraba açucareira; resíduos agrícolas, tal como palha de soja, palha de milho, palha de aveia, palha de arroz, casca de arroz, palha de cevada, carolos de milho, palha de trigo, palha de canola, casca de aveia e fibra de milho e resíduos florestais, tais como a fibra de pasta de madeira reciclada, serrim, madeira de resinosas, madeira de folhosas ou qualquer combinação sua. Além disso, a matéria-prima celulósica pode incluir resíduos celulósicos ou resíduos de materiais florestais, tais como papel de jornal, papelão e semelhantes. Matéria-prima celulósica também pode incluir uma ou mais espécies de fibras que têm origem em diferentes matérias-primas celulósicas. Palha de trigo, palha de cevada, palha de milho, palha de soja, palha de canola, painço amarelo, caniço malhado, bagaço de cana de açúcar, murraça, casca de aveia, polpa de beterraba açucareira e miscanto são particularmente vantajosos como matérias-primas celulósicas devido à sua ampla disponibilidade e baixo custo. 0 termo "enzima(s) hidrolítica(s)" pretende referir-se às enzimas que catalisam a hidrólise de materiais biológicos, tal como celulose. As enzimas hidrolíticas incluem "enzimas celulases" ou "celulases" (utilizados indistintamente) que são enzimas que catalisam a hidrólise de celulose a produtos, tais como glucose, celobiose, celo-oligodextrinas e outros celo-oligossacáridos. "Celulase" pretende ser um termo 10 genérico que denota um complexo ou família multienzimas, incluindo exo-celobio-hidrolases (CBH), endoglucanases (EG) e β-glucosidases (βΟ que podem ser produzidos por uma série de plantas e microrganismos. É de notar que muitos extractos de celulase em bruto também incluem algumas hemicelulases. 0 processo de acordo com formas de realização da invenção pode ser realizado com qualquer tipo de complexo de enzimas celulases, independentemente da sua origem, no entanto, as celulases microbianas estão geralmente disponíveis a um custo menor do que as de plantas. Entre as celulases mais amplamente estudadas, caracterizadas e produzidas comercialmente estão, e. g., as obtidas de fungos dos géneros Aspergillus, Humicola, e Trichoderma e das bactérias dos géneros Bacillus e Thermobifida. Além disso, por exemplo, a celulase produzida pelo fungo filamentoso Trichoderma longibrachiatum inclui, pelo menos, duas enzimas celobio-hidrolases denominadas CBHI e CBHII e pelo menos 4 enzimas EG. "Enzimas de fermentação" referem-se às enzimas que podem catalisar a conversão dos açúcares celulósicos a álcoois, incluindo o etanol, bem como álcoois de cadeia superior, tal como butanol. Tipicamente é utilizada levedura, como Saccharomyces cerevisiae, para produzir as enzimas que catalisam a conversão. Enzimas também podem incluir enzimas bacterianas de Clostridium acetobuytlicum, assim como, enzimas produzidas por microrganismos geneticamente modificados para produzir álcoois de cadeia superior a partir dos açúcares da celulose. 0 termo "grau de polimerização" (abreviado como D.P.) refere-se ao número de monómeros de D-glucose numa molécula de celulose. Assim, o termo "grau médio de polimerização" ou 11 "D.P. médio", refere-se ao número médio de moléculas de D-glucose por polímero de celulose numa população de polímeros de celulose.

Como aqui utilizados, os termos "tratamento", "tratar", "pré-tratamento" ou "pré-tratar" em relação a celulose pretendem referir-se a um processo ou tratamento de acordo com formas de realização da invenção em que a celulose é tornada mais acessível para reacção enzimática ou química, e. g. reacção química catalítica. "Modificação ou degradação" em referência à celulose é utilizado para referir a alteração induzida biologicamente, e. g. enzimática ou quimicamente, na estrutura nativa de celulose. Essas modificações e alterações são conhecidas pelos especialistas na matéria e incluem as envolvidas na degradação enzimática e/ou hidrólise enzimática ou química da celulose, bem como modificações químicas envolvidas numa variedade de produtos comerciais à base de celulose, produção de álcoois por fermentação de biomassa e geração de biocombustíveis ricos em hidrogénio. 0 termo "estável" ou "estabilização" em relação à celulose descristalizada refere-se a celulose descristalizada que não muda substancialmente ao longo de um período de tempo seleccionado e em condições seleccionadas.

Tendo em conta as desvantagens inerentes anteriores na conversão convencional de celulose, formas de realização da invenção proporcionam novos métodos para descristalização ou desagregação da celulose. Os métodos incluem fazer reagir a celulose com uma solução de tratamento, que inclui um álcali 12 dissolvido num sistema de co-solvente, em condições suaves de temperatura e de pressão que podem ser optimizadas para viabilidade económica. Submeter a celulose a esse tratamento de acordo com formas de realização da invenção torna a celulose mais acessível para reacção enzimática ou química, por abertura dos domínios firmemente agregados, que são também a fonte de recalcitrância durante a hidrólise. A celulose descristalizada resultante de acordo com formas de realização da invenção também permite uma substituição muito mais uniforme ao longo das cadeias de celulose, minimizando assim os problemas de controlo de qualidade actualmente inerentes na produção de produtos derivados de celulose. Faz-se referência à FIG. 1, que mostra um difractograma de raio X de pasta antes e depois do tratamento de acordo com formas de realização da invenção, demonstrando a descristalização da pasta. Há muitos sistemas de solventes que podem inchar celuloses nativas sem as solubilizar. Com o processo de acordo com formas de realização da invenção que abre os domínios da celulose semicristalina, é provável que diversos sistemas que incham celulose possam ser utilizados para a solubilizar e, assim, tornar possível a regeneração da celulose num processo economicamente competitivo.

Como descrito acima, a solução de tratamento para utilização de acordo com formas de realização da invenção inclui um álcali dissolvido num sistema de co-solvente. Com vantagem, o álcali é dissolvido num sistema de co-solvente de água mais um segundo solvente miscível em água. Num aspecto, o segundo solvente é com vantagem um álcool que pode incluir, e. g. metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, isobutanol ou um poliol. Noutro aspecto, o segundo solvente 13 pode incluir outros solventes próticos bem como solventes apróticos que são misciveis em água. De um modo preferido, o sistema de co-solvente é etanol e água. 0 álcali é, com vantagem, hidróxido de sódio (NaOH), embora possam ser utilizados outros álcalis, tais como hidróxido de lítio (LiOH) ou hidróxido de potássio (KOH). A concentração de NaOH necessário na solução de tratamento depende da natureza da celulose a ser tratada, uma vez que celuloses diferentes podem ter as suas formas reticuladas interrompidas a diferentes concentrações de álcali. Por exemplo, o limiar para a mercerização da maioria das pastas é de aproximadamente 8% de NaOH em água; para o algodão, é cerca de 11 a 12%, dependendo do pré-tratamento anterior, e para a celulose bacteriana é cerca de 14%. 0 estabelecimento da molaridade de NaOH da solução de tratamento é um processo iterativo. Como ponto de partida, a proporção de co-solvente é fixada a um nível que foi considerado óptimo no acabamento de algodão (4), que está descrito como sendo o 75% de etanol e 25% de água. A molaridade é, então, variada e a eficácia do tratamento é avaliada até ser identificada uma molaridade óptima do NaOH nos co-solventes.

Nos Exemplos adiante, o efeito das soluções em Avicel, uma celulose microcristalina preparada a partir de madeira de pinheiro-americano (American Viscose Company, Marcus Hook, PA) e transformada em pasta a 180 °C, foi comparado com as

observações anteriores sobre outras celuloses. Verificou-se que uma molaridade de soluções de NaOH entre 1 M e 2 M funcionava bem. O Avicel foi seleccionado para o ensaio porque 14 se tornou no substrato padrão utilizado na maioria dos estudos publicados de bioconversão de celulose. 0 Avicel é uma celulose altamente recalcitrante e representativa dos efeitos da temperatura elevada na cristalinidade da celulose. Em Exemplos adicionais, utilizou-se pastas kraft derivadas de um papel higiénico. 0 papel higiénico foi do tipo concebido para utilização em sistemas sépticos de modo que não contêm aditivos de resistência em húmido. 0 papel foi feito de aproximadamente 65% de eucalipto e 35% de madeira de pinheiro-americano. A utilização de uma pasta organosolv (e. g. , ver, patente U.S. N° 4100016 de Diebold et al.) também está incluída nos Exemplos adiante.

Uma vez estabelecida a molaridade aproximadamente óptima do NaOH, é estabelecida a proporção optimizada de co-solventes. Enquanto 75% foi escolhido por investigadores anteriores, não exploraram o potencial de 70% ou de 80%. Ao variar a proporção, é importante evitar níveis de etanol que possam resultar na precipitação do NaOH.

Faz-se agora referência à FIG. 2 que ilustra o processo de tratamento geral para formas de realização de acordo com a invenção, bem como passos adicionais no processamento de matéria-prima celulósica a um álcool, e. g. etanol. O processo começa no passo 100 com uma fonte celulósica. Numa forma de realização ilustrada, utilizou-se o Avicel como uma fonte de celulose no passo 100.

No passo 102, o material celulósico é submetido a um passo de pré-tratamento de acordo com formas de realização da invenção, i. e., uma solução de tratamento de álcali num sistema 101 de co-solvente de água e um segundo solvente, tal 15 como um álcool, e. g. etanol, ou outro solvente miscível em água, para descristalizar a celulose No passo 104, a mistura reaccional é separada para dar a celulose 108 descristalizada e remover a solução de tratamento 101. No passo 106, a celulose tratada é lavada com uma solução de lavagem de co-solvente ou mistura 107 para remover o álcali. O co-solvente ou mistura de lavagem é, com vantagem, uma mistura de álcool/água. No passo 112, a celulose tratada de acordo com formas de realização da invenção é hidrolisada, por exemplo, por tratamento com celulases 110, para formar açúcares. No passo 114, os açúcares, que incluem a glucose e celo-oligodextrinas, são adequadamente fermentadas e um álcool celulósico 118 é recuperado da mistura de fermentação por destilação ou outro método de separação, e. g. a separação por membrana. A eficácia da solução de tratamento é, com vantagem, medida pelo aparecimento de perturbações do espectro Raman da celulose, particularmente, na região de baixa frequência entre 250 cirT1 e 600 cm-1 em que a banda a 3 78 cirT1 é um índice muito sensível do grau de perturbação da rede nativa.

Quanto à mistura 107 de lavagem, se foi utilizado metanol como o co-solvente com água, verificou-se que a mesma proporção de metanol para água como sistema de co-solvente do tratamento é adequado para remover o NaOH da celulose por lavagem. Para o sistema de etanol/água, uma proporção adequada também foi a mesma que no co-solvente de tratamento.

Notou-se anteriormente que o trabalho com metanol foi baseado na utilização da mesma proporção de co-solventes que no pré-tratamento e foi utilizado como o ponto de partida para 16 o co-solvente de etanol/água. Foi determinado o efeito da variação do co-solvente inicial da primeira lavagem. De uma perspectiva de processo, é especialmente adequado se a proporção de co-solvente na mistura de lavagem for maior em etanol do que a utilizada para o pré-tratamento uma vez que reduziria o custo do pós-tratamento da solução de lavagem. No entanto, é de notar novamente que é necessário garantir que o teor de etanol da lavagem inicial não é suficientemente elevado para causar a precipitação do NaOH.

Depois de completada a primeira lavagem, é necessário continuar a lavagem do substrato de celulose até ser obtido um pH neutro. Verificou-se em alguns casos que era mais eficaz passar da primeira lavagem para lavagens com co-solventes incluindo níveis mais elevados de água, antes da lavagem eventual só com água.

Também se verificou que o grau em que a celulose está fortemente agregada e, consequentemente, a sua recalcitrância, está relacionado com a temperatura mais alta à qual a celulose é exposta durante o isolamento (5) . Ver FIG. 3 e 4 retiradas de Atalla et ai. referência (5) . A FIG. 3 mostra a redução dramática da largura a meia-altura do pico de difracção primária de celuloses nativas como resultado do recozimento a 150 °C. A largura a meia altura para a reflexão mais importante em padrões de difracção de pós de celuloses de madeira sempre foi considerada como um dos índices mais sensíveis do grau de coerência da ordem no seio da celulose nas paredes das células da madeira. A FIG. 4 mostra como a largura a meia altura diminui à medida que aumenta a temperatura de tratamento. Assim, em essência, a 17 recalcitrância de uma amostra celulósica está directamente correlacionada com a temperatura de isolamento.

Uma vez tratada e lavada, o grau em que a celulose tratada se tornou mais acessível, i. e. descristalizada, pode ser avaliado. Métodos analíticos simples, tal como a perda de peso por hidrólise enzimática, podem e foram utilizados como a medida do sucesso na descristalização da celulose. Também podem ser utilizados métodos que utilizam a acessibilidade ao óxido de deutério (D20) da celulose. Embora estes métodos possam classificar os tratamentos, a facilidade com que o deutério permuta com hidrogénio sugere que a utilização de D20 pode resultar em exagerar o grau de acessibilidade. Verificou-se que o etileno glicol deuterado (OHCD2CD2OH) avalia apropriadamente o grau de acessibilidade à acção enzimática.

Na utilização de métodos deuterados, as medições mais comuns de acessibilidade basearam-se na observação do acesso a grupos hidroxilo celulósicos com base da perfusão de amostras com D20 (4). Embora esta seja uma medição útil, uma medida mais fiável baseia-se na acessibilidade a moléculas maiores do que o ião D+. Essas moléculas incluem com vantagem perdeutero metanol (CD3OH), perdeutero etileno glicol (CD2OHCD2OH) e perdeutero glicerol (CD2OHCDOHCD2OH) , que podem ser adicionadas a amostras celulósicas pré-tratadas em solução em H20 e deixadas atingir o equilíbrio. A quantidade de moléculas deuteradas no seio das amostras celulósicas é monitorizada através da medição dos espectros de Raman das amostras na região entre 2300 e 2700 crrf1 onde não vai haver nenhuma interferência de quaisquer outros grupos funcionais. A preparação das amostras perdeuteradas dos álcoois ou polióis pode ser realizada por refluxo em D20 sobre níquel de Raney. 18 0 metanol perdeuterado está disponível comercialmente e a perdeuteração de glicol e glicerol pode ser realizada como descrito acima. 0 metanol perdeuterado é utilizado em medições baseadas na utilização de outras celuloses que são padrões correntes como Avicel, que é derivado de pastas de dissolução, e pó CF-1 da Whatman, que é derivado de línteres de algodão. Estes padrões são pré-inchados utilizando protocolos conhecidos.

Como a maioria das enzimas é muito maior em tamanho do que as moléculas utilizadas para avaliar a acessibilidade da celulose, foi desenvolvido um ensaio para as transformações das celuloses mais estreitamente relacionado com a actividade de enzimas. Nesse ensaio, a celulose pré-tratada e lavada é incubada com celulases representativas de Aspergillus niger e Trichoderma reesi para avaliar o efeito das transformações na susceptibilidade à acção enzimática. Como notado anteriormente, a disponibilidade acrescida de celuloses às enzimas hidrolíticas deve aumentar a taxa de conversão em açúcares em, pelo menos, uma ordem de grandeza ou mais.

Faz-se de novo referência à FIG. 2 em que é de notar que uma porção do álcool, e. g. etanol, produzido, i. e. a referência 118 numérica, pode ser utilizada no passo 102 de descristalização como o co-solvente. Assim, de acordo com formas de realização da invenção, todo o processo de conversão da celulose pode com vantagem ter um circuito de retroalimentação para fornecer co-solvente ao processo de pré-tratamento. 19

Note-se que uma barreira à implementação económica da hidrólise enzimática de celuloses é a natureza bifásica do processo quando as celuloses são submetidas a enzimas hidrolíticas numa base continua num processo descontinuo. Os tempos de residência muito longos necessários para a segunda fase resultam na necessidade de grandes tanques de retenção para acomodar o tempo necessário para a segunda fase ficar completa. Noutra forma de realização, prevê-se que os tempos de residência longos de reacções de hidrólise enzimática devido à sua natureza bifásica possam ser reduzidos por utilização do processo de tratamento de acordo com formas de realização da invenção. Para superar esta barreira, a aplicação das enzimas pode, com vantagem, ser realizada em fases múltiplas, com os substratos celulósicos submetidos ao tratamento de acordo com formas de realização da invenção entre as fases.

Estão contemplados, pelo menos, três desses processos de fases múltiplas. Como ilustrado na FIG. 5, uma primeira aplicação de hidrólise enzimática é realizada numa fase inicial, antes de um pré-tratamento como aqui descrito, de modo a tirar partido da fase inicial relativamente rápida de hidrólise enzimática. Quando a velocidade de hidrólise abrandou no início da segunda fase, o resíduo celulósico sólido é separado e pré-tratado como aqui descrito e, em seguida, recombinado com a corrente de sobrenadante líquido separado dos sólidos no final da primeira fase. Especificamente, um material 100 celulósico é submetido a hidrólise 112 enzimática com celulase até a primeira fase de hidrólise enzimática começar a ficar mais lenta. No passo 120, a mistura reaccional é separada em celulose 122 residual e o restante 128 de celulases e glucose. A celulose 122 residual é 20 submetida a descristalização 124 como ilustrado na FIG. 2, para se obter uma celulose 126 residual descristalizada que é novamente submetida a hidrólise 130 enzimática, utilizando a restante solução 128 enzimática. Os produtos açúcares são então fermentados no passo 114 para produzir etanol 118 celulósico.

Uma forma de realização de um segundo processo de fases múltiplas está ilustrada na FIG. 6 e baseia-se na repetição do processo de descristalização como aqui descrito entre fases hidrolíticas. No passo 132, uma celulose 108 descristalizada como aqui descrito é exposta a enzimas durante um período correspondente à fase inicial de hidrólise rápida. Em seguida, no passo 134, a celulose 136 residual é separada do meio 142 líquido contendo enzima por filtração ou centrifugação. A celulose 136 residual é, então, submetida a um segundo ciclo de descristalização no passo 138, como ilustrado na FIG. 6, para dar uma celulose 140 residual descristalizada, a qual, por sua vez, é novamente exposta à solução 142 de água tamponada contendo enzima para a hidrólise enzimática a glucose no passo 144 antes da fermentação a etanol 118 celulósico no passo 114. Prevê-se que a hidrólise decorra de novo a uma velocidade rápida de modo que a hidrólise da celulose pode ser completada num período muito mais curto do que no caso de uma hidrólise numa única fase. Assim, um dos principais factores de custos em processos baseados em modelos actuais, que necessitam de tempos de espera ou tempos de residência muito longos na solução enzimática, é superado e significativamente reduzido.

Uma forma de realização de um terceiro processo de fases múltiplas está ilustrada na FIG. 7, e inclui uma mistura em 21 contracorrente da celulose e das soluções enzimáticas. No passo 146, uma celulose 108 descristalizada como aqui descrito é exposta às enzimas. No passo 148, a celulose 150 residual é separada do meio 149 liquido contendo a enzima por filtração ou centrifugação. A celulose residual 150 é submetida a um segundo ciclo de descristalização no passo 152 para dar uma celulose 154 residual descristalizada, que por sua vez é exposta novamente à solução de água tamponada contendo a enzima no passo 156. Como ilustrado na FIG. 7, pode utilizar-se enzima fresca no passo 156 na segunda fase do tratamento, e após a segunda fase de tratamento, a celulose 160 residual é separada no passo 158 e, depois, introduzida num segundo ciclo de descristalização 152 para dar celulose 154 residual descristalizada e, depois, reintroduzida na solução 156 enzimática. Além disso, após filtração ou dissolução completa da celulose no passo 158, a solução 102 enzimática é reaplicada à celulose descristalizada no passo 146. Os produtos açúcares são então fermentados no passo 114 para produzir etanol 118 celulósico. Este tipo de abordagem reduz a quantidade de enzima necessária para a conversão da celulose em glucose. O custo das enzimas é outra grande barreira económica para processos baseados nos modelos actuais. A forma de realização especifica neste terceiro processo de fases múltiplas vai depender da natureza da matéria-prima celulósica. Se a celulose for relativamente pura, prevê-se que a conversão possa estar completa antes que a solução contendo a enzima seja adicionada à celulose descristalizada de fresco. No entanto, se a matéria-prima contiver outros componentes da matéria lenhocelulósica, vai ser necessário um passo de filtração ou centrifugação antes da utilização da solução 22 enzimática da segunda fase para tratar a matéria-prima na primeira fase.

Uma forma de realização da invenção está também contemplada como um kit, incluindo o kit um álcali num co-solvente de álcool/água, enzimas celulases, um ou mais floculantes e instruções para descristalizar a celulose para produzir uma celulose descristalizada e instruções para hidrolisar a celulose descristalizada para produzir um produto de hidrólise.

Está ainda previsto que um tratamento semelhante pode tornar a celulose mais acessível a soluções de catalisadores homogéneos que podem ser utilizados para transformar a matéria-prima celulósica noutras formas. Por exemplo, a celulose descristalizada como aqui descrito poderia ser mais facilmente penetrada pelos sistemas catalíticos para a reformar a hidrocarbonetos. Esse processo poderia utilizar a vasta quantidade de recursos celulósicos como matérias-primas para reformação catalítica para gerar biocombustíveis, tais como diesel, gases combustíveis, tais como o hidrogénio e outros tipos de produtos químicos de alto valor. Assim, em algumas formas de realização, é proporcionado um método de produção de biocombustíveis celulósicos. 0 método inclui o tratamento de um material celulósico com um álcali num sistema de co-solventes de álcool/água para dar uma celulose descristalizada; lavagem da celulose descristalizada para remover o álcali; hidrólise da celulose a glucose e celo-oligodextrinas; e reformação catalítica da glucose e celo-oligodextrinas a hidrocarbonetos. 23

Como notado acima, uma barreira à utilização muito mais ampla da celulose como matéria-prima no fabrico de fibras ou películas é a dificuldade de solubilização da celulose num sistema ambientalmente aceitável. Os sistemas mais frequentemente utilizados fora dos Estados Unidos são baseados no processo centenário do xantato de celulose, que é ambientalmente indesejável porque a regeneração da celulose a partir da solução resulta na formação de sulfureto de hidrogénio e de outros produtos secundários tóxicos. 0 sistema do N-óxido de metil morfolina desenvolvido mais recentemente baseia-se num solvente complexo e dispendioso que é propenso a explosão se as condições não forem cuidadosamente controladas. Por outro lado, o sistema de co-solvente utilizado aqui é ambientalmente benigno. Prevê-se que este sistema possa alterar drasticamente a economia do fabrico de rayon e celofane, bem como de biocombustiveis como aqui descrito.

Os Exemplos seguintes, que não devem ser interpretados como limitando o âmbito da invenção, explicam adicionalmente formas de realização da invenção.

EXEMPLOS

Experiências para demonstrar a redução da recalcitrância de celulose foram realizados em duas fases. A primeira incluiu o processo de tratamento da celulose nativa. A segunda avaliou a consequência deste tratamento por exposição das amostras de celulose tratadas a enzimas hidrolíticas e medição da sua perda de peso em comparação com um controlo consistindo em celulose nativa não tratada da mesma fonte. A celulose escolhida como o substrato para o primeiro Exemplo foi de uma amostra de Avicel PH1, que tem sido utilizado como um padrão no laboratório da requerente desde a década de 1970 e foi fornecido pela American Viscose Company (Marcus Hook, PA) . É uma celulose microcristalina geralmente fabricada por hidrólise ácida de uma pasta de madeira de pinheiro-americano dissolvida com elevado grau de pureza seguida por desintegração mecânica das fibras da pasta e secagem por atomização da dispersão de fragmentos de fibras resultante. Este tipo de celulose foi escolhido porque o Avicel tornou-se num substrato padrão em estudos de hidrólise enzimática de celulose e é representativo das celuloses derivadas das pastas mais recalcitrantes. Num segundo conjunto de Exemplos, utilizou-se uma pasta kraft derivada de papel higiénico. Ainda noutro exemplo, utilizou-se uma pasta organosolv.

As enzimas utilizadas nas avaliações foram uma celulase do fungo Trichoderma reesi adquirida a Worthington e uma glucosidase derivada de amêndoas disponível de Sigma Aldrich.

Exemplo 1: Descristalização

Uma solução preparada para tratamento do Avicel era uma solução de hidróxido de sódio (NaOH) 1,5 N numa mistura de etanol (CH3CH2OH) e água que era etanol a 75% em volume. Para preparar a solução de tratamento, misturou-se etanol e água e depois dissolveu-se 6 g de NaOH por 100 mL da mistura de solventes. 25 0 procedimento de tratamento foi o seguinte: 1 g de Avicel foi colocado num copo de 300 mL. A este adicionou-se 50 mL da solução de tratamento. Deixou-se gue o Avicel permanecesse na solução de tratamento durante 15 minutos. Em seguida, a solução foi decantada e substituída por 100 mL da mistura de solventes (75% de etanol, 25% de água). Esta solução foi deixada em repouso durante alguns minutos para permitir a difusão do NaOH da celulose. O solvente foi então decantado e o processo repetido duas vezes após o gue o pH era de aproximadamente 8. Após a decantação do solvente pela última vez, adicionou-se uma solução tampão de acetato de amónio 0,05 M a um pH de 5; o pH era de 5,4 após a lavagem em tampão. A solução tampão foi decantada e adicionou-se novamente 30 mL de tampão; o pH foi então determinado como sendo 5,0. A dispersão de celulose em 30 mL de tampão foi transferida para um tubo de centrífuga de polipropileno de 50 mL e adicionou-se tampão até ao nível de 40 mL. Adicionou-se enzimas hidrolíticas ao tubo. Estas enzimas eram 0,2 g de celulase (108 μ/mg) e 0,1 g de β-glucosidase (6 μ/mg).

Uma amostra de controlo de 1 g de Avicel não tratado foi também colocada num tubo de centrífuga de polipropileno de 50 mL e adicionou-se 40 mL de tampão, seguido pela adição das mesmas guantidades de enzimas que na amostra de teste.

Os dois tubos de centrífuga foram então hermeticamente fechados com as suas tampas e inseridos numa incubadora com agitação Vortemp 1550. Os conteúdos dos tubos foram incubados 26 a 45 °C e agitados a uma velocidade de 900 rpm. Verificou-se ser necessário agitar a 900 rpm para manter as partículas de celulose microcristalina adequadamente dispersas.

Para uma primeira experiência, a incubação foi durante 41 h e para uma segunda a incubação foi durante 13 h.

Após a incubação, as duas dispersões foram, cada uma delas, divididas em 8 porções em tubos de centrífuga de 15 mL. Os tubos foram inseridos numa centrífuga e centrifugados durante 2 minutos a 3800 rpm. O líquido tampão-enzima foi decantado de cada tubo e substituído por etanol a 95%, re-disperso e centrifugado de novo; isto foi feito duas vezes para cada uma das amostras. O último etanol decantado foi substituído por acetona seguido por dispersão na acetona.

As dispersões em acetona foram então, por sua vez, vertidas em cadinhos tarados com filtros de fundo de vidro sinterizado; os cadinhos de filtração foram montados num frasco de vácuo com vácuo total aplicado durante a filtração. Os cadinhos foram então transferidos para uma estufa de vácuo com vácuo total aplicado, aquecida a 105 °C, e mantidos a essa temperatura em vácuo de um dia para o outro.

As amostras foram depois pesadas numa balança analítica, e a perda de peso foi tomada como uma medida da conversão da celulose em glucose e oligómeros solúveis.

Deve notar-se que a solução de NaOH 1,5 M (ou 1,5 N) , na mistura de solventes foi seleccionada porque a celulose microcristalina Avicel foi derivada de uma pasta dissolvida. Se a celulose microcristalina tivesse sido feita a partir de 27 lintéres de algodão, teria sido necessário utilizar uma solução de NaOH 2 M (ou 2 N) no solvente. Inversamente, se a celulose tivesse sido isolada a partir de uma planta herbácea a uma temperatura muito mais próxima da temperatura ambiente, podia ter sido adequada uma solução 1 M (ou 1 N) . Esta variabilidade na normalidade necessária para o pré-tratamento da celulose reflecte a grande diversidade do nível de agregação de celuloses de diferentes fontes e com diferentes histórias em domínios semicristalinos.

Resultados:

Como indicado acima, os pesos iniciais das amostras de teste e de controlo eram de 1 g cada. Os pesos após a exposição à mistura da enzima a 45 ° C estão apresentados adiante na Tabela 1.

Tabela 1

Tempo de incubação Controlo Pré-tratada Δ 13 h 0,535 g 0,408 g 0,127 g 41 h 0,251 g 0,189 g 0,062 g em que Δ representa a diferença de perda de peso entre o controlo e amostras pré-tratadas. Assim, em ambos os casos, a perda de peso da amostra tratada como aqui descrito foi significativamente maior do que a da amostra de controlo.

Os resultados demonstraram que a perda de peso para ambas as amostras durante a primeira exposição de 13 h foi 28 significativamente maior do que a perda durante a exposição adicional durante mais 28 h. Isto é típico da natureza bifásica da acção enzimática sobre celuloses em que a taxa de conversão em glucose ou oligómeros solúveis prossegue primeiro rapidamente mas depois nivela para uma taxa muito mais lenta. Os resultados destas experiências demonstram que o tratamento de descristalização aqui descrito aumenta a desorganização em substratos de celulose e torna-os mais susceptíveis à hidrólise enzimática por celulases.

Exemplo 2: Processo de duas fases

Uma solução preparada para tratamento de Avicel era uma solução de hidróxido de sódio (NaOH) 1,5 N numa mistura de etanol (CH3CH2OH) e água que era etanol a 75% em volume. Para preparar a solução de tratamento, mistura-se o etanol e água e depois dissolve-se 6 g de NaOH por 100 mL da mistura de solventes. O procedimento de tratamento foi como se segue: 2 amostras de 1 g cada de Avicel foram colocadas em tubos de centrífuga de 50 mL, uma amostra experimental e um controlo. A cada uma adicionou-se 45 mL de tampão de acetato de amónio 0,05 N de com um pH de 5,01. Ambos os tubos receberam 0,15 g de celulase, que foi doseada a 136 μ/mg DW, sem suplementação com β-glucosidase.

Ambas as amostras foram colocadas numa incubadora com agitação Vortemp 1550. Foram incubadas a 50 °C e agitadas a uma velocidade de 900 rpm. A incubação inicial foi de 5,5 horas. 29

Após o período de incubação inicial, a amostra experimental foi retirada da incubadora e arrefecida num banho de gelo para parar a acção enzimática. A amostra experimental foi então colocada numa centrífuga e centrifugada a 4500 rpm para extrair o sobrenadante. O sobrenadante foi decantado e posto de lado para mais tarde retornar ao tubo da amostra.

Ao tubo da amostra adicionou-se, em seguida, 50 mL da solução de tratamento de NaOH e agitou-se durante 5 minutos, após o que o tubo foi recolocado na centrífuga para extrair a solução de tratamento.

Em seguida, a solução foi decantada e substituída por 50 mL da mistura de solventes (75% de etanol, 25% de água). Foi agitada durante 5 minutos para permitir a difusão de NaOH da celulose. Foi então centrifugada a 4500 rpm. O solvente foi então decantado e o processo repetido duas vezes. Depois da última decantação do solvente, adicionou-se uma solução tampão de acetato de amónio 0,05 M a um pH de 5,01; o pH era de 8,4 após dispersão da amostra em tampão. A solução tampão foi centrifugada e decantada e adicionou-se outra vez 40 mL de tampão; determinou-se que o pH era de 5,15. Este ciclo foi repetido mais uma vez, após o que o pH da amostra em tampão era de 5,04. Foi então removido o tampão. A solução enzimática sobrenadante extraída anteriormente foi devolvida ao tubo da amostra e a incubação foi retomada a 50 °C e 900 rpm. A segunda fase de incubação durou 2,5 horas. 30

Após a incubação, ambos os tubos de amostra experimental e de controlo foram inseridos numa centrífuga e centrifugados durante 2 minutos a 4500 rpm. O líquido de tampão-enzima foi decantado de cada tubo e os sólidos remanescentes vertidos em papel de fibra de vidro tarado para secagem num forno de microondas com uma balança analítica embutida, com a perda de peso tomada como uma medida da conversão da celulose em glucose e oligómeros solúveis.

Resultados:

Como referido acima, os pesos iniciais da amostra de teste e do controlo eram de 1 g cada. O peso após a exposição à mistura de enzima a 50 °C está apresentado adiante na

Tabela 2.

Tabela 2

Tempo de incubação Controlo Pré-tratada Δ 8 h 0,529 g 0,269 g 0,26 g em que Δ representa a diferença de perda de peso entre as amostra de controlo e pré-tratada. Assim, a perda de peso da amostra tratada como aqui descrito foi significativamente maior do que a da amostra de controlo. 31

Exemplo 3: Tratamento de Duas Fases Utilizando Uma Pasta de Papel Kraft

Uma solução preparada para o tratamento de papel higiénico (marca Cottonelle™) foi uma solução de hidróxido de sódio (NaOH) 1,5 N numa mistura de etanol (CH3CH2OH) e água que era etanol a 75% em volume. A preparação da solução de tratamento foi a mesma que a descrita nos exemplos anteriores. 0 procedimento de tratamento foi como se segue: 2 amostras (um controlo e uma amostra experimental) de papel higiénico foram pesadas e, depois, cortadas em pedaços pequenos e colocados em tubos de centrífuga de 50 mL. Os tubos foram cheios com água e colocados numa incubadora com agitação Vortemp 1550 à temperatura ambiente a 900 rpm e deixou-se dispersar de um dia para o outro.

Cada tubo foi cheio até à marca dos 50 mL com tampão de acetato de amónio 0,05 N com um pH de 5,01. Ambos os tubos receberam 0,125 g de celulase, que foi ensaiada a 136 μ/mg DW, sem suplementação com β-glucosidase. Ambas as amostras foram colocadas na incubadora Vortemp. Foram incubadas a 50 °C e agitadas a uma velocidade de 900 rpm. A incubação inicial foi durante 4,25 horas.

Após o período de incubação inicial, ambas as amostras foram retiradas da incubadora e arrefecidas num banho de gelo para parar a acção enzimática. A amostra experimental foi, depois, colocada numa centrífuga e centrifugada a 4500 rpm para extrair o sobrenadante. O sobrenadante foi decantado e posto de lado para mais tarde voltar para o tubo da amostra. 32

Ao tubo da amostra adicionou-se em seguida 50 mL da solução de tratamento de NaOH e foi agitado durante 2 minutos, após o que foi colocado de volta na centrífuga para extrair a solução de tratamento.

Em seguida, a solução foi decantada e substituída com 50 mL da mistura de solventes (75% de etanol, 25% de água) . Foi agitada durante 2 minutos para permitir a difusão da NaOH para fora da celulose. O solvente foi então decantado e o processo repetido duas vezes. Depois de decantar o solvente pela última vez, adicionou-se uma solução tampão de acetato de amónio 0,05 M a um pH de 5,01; o pH era de 6,4 após dispersão da amostra em tampão. A solução tampão foi centrifugada e decantada e adicionou-se outra vez 40 mL de tampão; determinou-se, então, que o pH era de 5,23. A solução enzimática sobrenadante extraída anteriormente foi devolvida ao tubo da amostra e a incubação foi retomada a 50 °C e 900 rpm. A segunda fase de incubação durou aproximadamente 9,5 horas.

Após a incubação, ambos os tubos de amostra experimental e de controlo foram inseridos numa centrífuga e centrifugados durante 2 minutos a 4500 rpm. O líquido de tampão-enzima foi decantado de cada tubo e os sólidos remanescentes vertidos em papel de fibra de vidro tarado para secagem num forno de microondas com uma balança analítica embutida, com a perda de peso tomada como uma medida da conversão da celulose em glucose e oligómeros solúveis. 33

Resultados:

Os pesos iniciais da amostra de teste e do controlo, juntamente com os pesos após a exposição à mistura de enzima a 50 °C estão apresentados adiante na Tabela 3.

Tabela 3

Peso inicial Peso final % de conversão Controlo 1,021 g 0,314 g 69,25%

Pré-tratada 1,026 g 0,226 g 77,97% A diferença na percentagem de peso da amostra remanescente demonstra que a conversão da amostra tratada como aqui descrito foi maior do que a da amostra de controlo.

Exemplo 4: Tratamento Numa Fase Única Utilizando um Papel de Pasta Kraft

Uma solução preparada para o tratamento de papel higiénico (marca Cottonelle™) era uma solução de hidróxido de sódio (NaOH) 1,5 N numa mistura de etanol (CH3CH2OH) e água que era etanol a 75% em volume. A preparação da solução de tratamento foi o mesmo que a descrita nos exemplos anteriores. O procedimento de tratamento foi como se segue: 2 amostras (um controlo e uma amostra experimental) de papel higiénico foram pesadas e, depois, cortadas em pedaços pequenos e colocadas em tubos de centrífuga de 50 mL. Os tubos foram cheios com água e colocados numa incubadora com agitação 34

Vortemp 1550 à temperatura ambiente a 900 rpm e deixados dispersar de um dia para o outro. A amostra experimental foi colocada numa centrífuga durante 2 minutos a 4500 rpm e a água extraída foi decantada. O tubo foi novamente cheio com etanol absoluto e agitada durante 5 minutos a 900 rpm, após o que o tubo foi centrifugado de novo, o etanol decantado e depois o tubo foi novamente cheio com uma mistura de 75% de etanol e 25% de água, agitado durante 5 minutos, centrifugado e decantado novamente.

Ao tubo da amostra adicionou-se em seguida 50 mL da solução de tratamento de NaOH e foi agitado durante 5 minutos, após o que foi recolocado na centrífuga para extrair a solução de tratamento.

Em seguida, a solução foi decantada e substituída por 50 mL da mistura de solventes (75% de etanol, 25% de água) . Foi agitada durante 5 minutos para permitir a difusão do NaOH para fora da celulose. O solvente foi então decantado e o processo repetido duas vezes. Depois de decantar o solvente pela última vez, adicionou-se uma solução tampão de acetato de amónio 0,05 M a um pH de 5,01; o pH era de 12,63 após dispersão da amostra em tampão. A solução tampão foi centrifugada e decantada e adicionou-se outra vez 40 mL de tampão; determinou-se que o pH era de 9,37. Este ciclo foi repetido mais 4 vezes, com o pH determinado a 6,02, 5,29, 5,14 e, depois, 5,05 no último ciclo. 35 0 tubo de controlo foi cheio até à marca dos 50 mL com a mesma solução tampão de acetato de amónio. Ambos os tubos receberam 0,125 g de celulase, que foi ensaiada a 136 μ/mg DW, sem suplementação com β-glucosidase. Ambas as amostras foram colocadas numa incubadora com agitação Vortemp 1550. Foram incubadas a 50 °C e agitadas a uma velocidade de 900 rpm durante uma incubação total de 16 horas e 25 minutos.

Resultados:

Os pesos iniciais das amostras de teste e de controlo, juntamente com os pesos após a exposição à mistura enzimática durante 16 horas e 25 minutos a 50 °C estão apresentados adiante na Tabela 4.

Tabela 4

Peso inicial Peso final % de conversão

Controlo 1,020 g Pré-tratada 1,017 g 0,367 g 0,225 g 64,02% 77,88% 36 A diferença na percentagem de peso da amostra remanescente demonstra que a conversão da amostra tratada como aqui descrito foi maior do que a da amostra de controlo.

Exemplo 5: Tratamento em Duas Fases Utilizando uma Pasta Organosolv

Uma pasta organosolv (e. g., Patente U.S. N° 4100016) foi inicialmente tratada com clorito de sódio para a

deslenhif icar, após o que foi deixada secar ao ar. O tratamento com clorito de sódio é uma técnica bem estabelecida de branqueamento suave. Duas amostras (um controlo e uma amostra experimental) foram pesadas a partir da pasta deslenhifiçada seca resultante.

Uma solução preparada para o tratamento da pasta organosolv deslenhifiçada era uma solução de hidróxido de sódio (NaOH) 1,5 N numa mistura de etanol (CH3CH2OH) e água que era etanol a 75% em volume. A preparação da solução de tratamento foi a mesma que a descrita nos exemplos anteriores. O procedimento de tratamento foi como se segue: 2 amostras (um controlo e uma amostra experimental) de pasta foram pesadas e depois colocadas em tubos de centrífuga de 50 mL. Os tubos foram cheios com água e colocados numa incubadora com agitação Vortemp 1550 à temperatura ambiente a 900 rpm e deixados dispersar durante dois dias. Após a dispersão, ambos os tubos foram colocados numa centrífuga e centrifugados a 4500 rpm durante cerca de 3 minutos, após o que a água foi decantada. 37

Cada tubo foi então cheio até à marca dos 50 mL com tampão de acetato de amónio 0,05 N com um pH de 5,01. Ambos os tubos receberam 0,2 g de celulase, que foi ensaiada a 136 μ/mg DW, sem suplementação com β-glucosidase. Ambas as amostras foram colocadas numa incubadora Vortemp. Foram incubadas a 50 °C e agitadas a uma velocidade de 900 rpm. A incubação inicial foi durante 5,5 horas.

Depois do período de incubação inicial, ambas as amostras foram retiradas da incubadora. A amostra experimental foi, depois, colocada numa centrífuga e centrifugada durante 7 minutos a 4700 rpm para extrair o sobrenadante. O sobrenadante foi decantado e posto de lado para posterior devolução ao tubo da amostra.

Ao tubo da amostra adicionou-se em seguida 50 mL da solução de tratamento de NaOH e foi agitado durante 2 minutos, após o que foi recolocado na centrífuga para extrair a solução de tratamento.

Em seguida, a solução foi decantada e substituída por 50 mL da mistura de solventes (75% de etanol, 25% de água). Foi agitada durante 2 minutos para permitir a difusão do NaOH da celulose. 0 solvente foi então decantado e o processo repetido duas vezes. Depois de decantado o solvente pela última vez, adicionou-se uma solução tampão de acetato de amónio 0, 05 M a um pH de 5,01; o pH era de 7,32 após dispersão da amostra em tampão. A solução tampão foi centrifugada e decantada e adicionou-se outra vez 40 mL de tampão; determinou-se então que o pH era de 5,18. A solução enzimática sobrenadante 38 extraída previamente foi devolvida ao tubo da amostra e a incubação foi retomada a 50 °C e 900 rpm. A segunda fase de incubação durou aproximadamente 3,5 horas.

Resultados:

Os pesos iniciais das amostras de teste e de controlo, juntamente com os pesos após a exposição à mistura enzimática a 50 °C estão apresentados adiante na Tabela 5.

Tabela 5

Peso inicial Peso final % de conversão

Controlo 1,003 g 0,539 g 46,26% Pré-tratada 1, 005 g 0,409 g 59,3% A diferença da percentagem de peso da amostra remanescente demonstra que a conversão da amostra tratada como aqui descrito foi maior do que a da amostra de controlo. 39

REFERÊNCIAS 1. "Breaking the Biological Barriers to Cellulosic Ethanol: A Joint Research Agenda" A Research Roadmap Resulting from the Biomass to Biofuels Workshop, 7-9 de Dezembro de 2005, Rockville, Maryland: June 2006; DOE/SC-0095. 2. Curtis S. Walseth, "Enzymatic Hydrolysis of Cellulose", Dissertação, Institute of Paper Chemistry, Appleton, WI 1948 . 3. Bruce E. Dimick, "The Importance of the Structure of Alkali Metal Hydroxide Solutions in Decrystallizing Cellulose I", Dissertação, Institute of Paper Chemistry, Appleton, WI 1976. 4. R. Jeffries e J. O. Warwicker, Textile Res. J., 39, 548 (1969) . 5. R. H. Atalla e R. Whitmore, "The influence of elevated temperatures of structure in the isolation of native cellulose", J. Polymer Sei. Polymer Lett. 16:601 (1978). 6. R. H. Atalla e S. C. Nagel, "Cellulose: Its regeneration in the native lattice", Science, 185:522 (1974). 7. R. H. Atalla e D. L. VanderHart, "Native cellulose: a composite of two distinct crystalline forms", Science, 223:283 (1984) . 40 R. H. Atalla e U. P. Agarwal, "Raman microprobe evidence for lignin orientation in cell walls of native woody tissue", Science, 227:636 (1985).

Lisboa, 8 de Agosto de 2012 41

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Método de desagregaçao ou descristalização de celulose, compreendendo: tratamento de um material celulósico com um álcali num sistema de co-solvente para formar uma celulose desagregada ou descristalizada, compreendendo o sistema de co-solvente água e um segundo solvente miscível com água, e lavagem da celulose desagregada ou descristalizada com o co-solvente para remover o álcali e estabilizar a celulose desagregada ou descristalizada em meio aquoso.
2 . Método de acordo com a reivindicação 1 (i) em que o solvente miscível com água é um álcool primário, secundário ou terciário ou um poliol; ou (ii) em que o solvente miscível com água é um solvente orgânico polar.
3. Método de produção de glucose como uma matéria-prima para a produção de biocombustíveis compreendendo a hidrólise da celulose desagregada ou descristalizada estável a glucose em meios aquosos da reivindicação 1.
4. Método de produção de etanol celulósico, compreendendo o tratamento de um material celulósico com um álcali num sistema de co-solvente de álcool/água para dar um material celulósico desagregado ou descristalizado; 1 lavagem do material celulósico com o co-solvente para remover o álcali; hidrólise do material celulósico para dar açúcares; fermentação dos açúcares para produzir etanol numa mistura de fermentação; e separação do etanol da mistura de fermentação.
5. Método de acordo com a reivindicação 4 (i) compreendendo ainda a reciclagem de uma porção do etanol produzido para o passo de tratamento; ou (ii) em que uma porção do etanol é utilizada para produzir o sistema de co-solvente de álcool/água.
6. Celulose desagregada ou descristalizada, produzida pelo método da reivindicação 1.
7. Método de pré-tratamento de celulose para desagregar ou descristalizar a celulose, compreendendo fazer contactar a celulose com uma solução de tratamento de um álcali num sistema de co-solvente de álcool/água.
8 . Método de produção de açúcares, compreendendo o tratamento de um material celulósico com um álcali num sistema de co-solvente de álcool/água para dar um material celulósico desagregado ou descristalizado; lavagem do material celulósico com o co-solvente para remover o álcali e hidrólise do material celulósico para dar açúcares.
9. Método da reivindicação 8, compreendendo ainda a fermentação dos açúcares para dar etanol e a reciclagem 2 de uma porção do etanol para o sistema de co-solvente para desagregar ou descristalizar o material celulósico.
10. Kit compreendendo um álcali num co-solvente de álcool/água, enzimas celulases, um ou mais floculantes e instruções para desagregar ou descristalizar a celulose para produzir uma celulose desagregada ou descristalizada e para hidrolisar a celulose desagregada ou descristalizada para produzir um produto de hidrólise.
11. Método de produção de biocombustíveis celulósicos, compreendendo o método: tratamento de um material celulósico com um álcali num sistema de co-solvente de álcool/água para dar uma celulose desagregada ou descristalizada; lavagem da celulose desagregada ou descristalizada com o co-solvente para remover o álcali; e reformação catalítica da celulose desagregada ou descristalizada a hidrocarbonetos ou biocombustíveis.
12. Método de produção de biocombustíveis celulósicos, compreendendo o método: tratamento de um material celulósico com um álcali num sistema de co-solvente de álcool/água para dar uma celulose desagregada ou descristalizada; lavagem da celulose desagregada ou descristalizada com o co-solvente para remover o álcali; hidrólise da celulose a glucose e celo-oligodextrinas; e 3 reformação catalítica da glucose e celo-oligodextrinas a hidrocarbonetos.
13. Método de produção de biocombustíveis, compreendendo: a) hidrólise de um material celulósico para formar glucose e uma celulose residual até ao início de um segundo passo de hidrólise cinética; b) tratamento da celulose residual com um álcali num sistema de co-solvente de álcool/água para dar uma celulose desagregada ou descristalizada; c) lavagem da celulose desagregada ou descristalizada com o co-solvente para remover o álcali; e d) hidrólise da celulose a glucose e celo-oligodextrinas.
14. Método da reivindicação 13, em que a hidrólise do passo (d) é realizada com as enzimas do passo (a).
15. Método da reivindicação 13 (i) compreendendo ainda a fermentação da glucose e celo-oligodextrinas a álcoois; ou (ii) compreendendo ainda a reformação catalítica da glucose e celo-oligodextrinas a hidrocarbonetos. Lisboa, 8 de Agosto de 2012 4