PT2201384E - Biomarcadores de evento cardíaco futuro - Google Patents

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PT2201384E
PT2201384E PT88308978T PT08830897T PT2201384E PT 2201384 E PT2201384 E PT 2201384E PT 88308978 T PT88308978 T PT 88308978T PT 08830897 T PT08830897 T PT 08830897T PT 2201384 E PT2201384 E PT 2201384E
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PT
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ccl18
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ccl5
chemokine
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PT88308978T
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Theodorus Josephus Cornelis Van Berkel
Ericus Anna Leonardus Biessen
Adriaan Otto Kraaijeveld
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Univ Leiden
Academisch Ziekenhuis Leiden Acting Under The Name Leiden University Medical Ct
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Description

DESCRIÇÃO "Biomarcadores de evento cardíaco futuro"
Campo do invento 0 presente invento refere-se à identificação de biomarcadores de quimoquina preditivos de sindromes coronárias agudas futuras incluindo angina de peito instável (UAP, angina instável pectoris).
Antecedentes do invento
As sindromes coronárias agudas, incluindo angina de peito instável (UAP), estão associadas a elevadas morbilidade e mortalidade. Em geral, a UAP resulta da erosão ou rutura de uma placa aterosclerótica vulnerável sobreposta por formação de trombo oclusivo e isquemia distal1. A aterosclerose é cada vez mais encarada como uma perturbação dislipidémica com um forte carácter inflamatório2. Estes processos inflamatórios são em parte orquestrados por quimoquinas, que participam no processo inflamatório por mediação do recrutamento de monócitos para os locais de lesão, proliferação de células do músculo liso vascular, neovascularização e ativação de plaquetas3-5. Adicionalmente, as quimoquinas parecem desempenhar um papel também na isquemia cardíaca. De facto, foi noticiado que a isquemia conduz a expressão induzida de quimoquinas no miocárdio ou na circulação, traduzindo-se no recrutamento de subconjuntos de leucócitos e células progenitoras para a zona da lesão para contribuir para a reparação da lesão6. Devido ao seu impacto diverso e profundo em doenças cardiovasculares, as quimoquinas não apenas poderão servir como biomarcadores de aterosclerose, disrupção de placa ou isquemia, mas também representam alvos terapêuticos atrativos7.
Até agora foram caraterizadas aproximadamente 50 quimoquinas e constatou-se que várias estão implicadas em aterosclerose e aterotrombose5. De facto, tem também sido mostrado em vários estudos que os níveis no plasma de proteína Regulada na Ativação Normalmente Expressa e Segregada em Células T (RANTES, Regulated on Activation Normally T-cell
Expressed and Secreted, ou CCL5), Fractalquina (CX3CL1) e Proteína Quimiotática de Monócitos 1 (MCP-1 ou CCL2) estão alteradas em UAP ou enfarte do miocárdio8-11. No entanto, faltam dados prospetivos sobre os níveis plasmáticos de quimoquina e/ou sobre a expressão do recetor de quimoquina por subconjuntos de leucócitos na circulação em síndromes coronárias agudas. Além disso, a utilização destas quimoquinas como marcadores de eventos coronários futuros não tem até agora sido explorada.
Ardigo et al. (2007; Physiol. Genomics vol. 31 p 402-409), Parissis et al. (2002; Int. J. Cardiol, vol. 83 p 13-21) e de Jager et al. (2005; Circulation vol. 112, 17 Suppl. S) revelam CCL3 como um biomarcador para doença cardíaca aterosclerótica, hipertensão arterial e enfarte do miocárdio iminente, respetivamente. Aukrust et al. (1998; Circulation vol. 97 p 1136-1143) revela CCL3 como um biomarcador para insuficiência cardíaca congestiva. Vanderfelde et al. (2007; Cardiovasc. Res. vol. 73 p 783-793) e WOOl/66124 revelam CCL3 como um biomarcador para enfarte do miocárdio e insuficiência cardíaca, respetivamente. Ridker et al. (2004; Circulation 109 pIV-6-IV-19) revela hsCRP como biomarcador de prognóstico para eventos cardiovasculares.
Sumário do invento A presente revelação refere-se a um estudo para avaliar os níveis de 11 quimoquinas em angina de peito instável refratária. Os inventores examinaram os padrões plasmáticos de quimoquina na linha de base de um grupo prospetivo de pacientes com angina de peito instável por um ensaio multiplex de elevado rendimento, que permite a quantificação simultânea de múltiplas quimoquinas numa única amostra de plasma12. Para análise prospetiva, analisaram-se quimoquinas expressas diferencialmente na linha de base em amostras de seguimento por ELISA. Adicionalmente, examinaram-se células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) em relação à expressão de recetor de quimoquina.
Num primeiro aspeto o presente invento proporciona a utilização de quimoquina CCL3 como um biomarcador para a identificar se um sujeito de teste está ou não em risco acrescido de uma síndrome ou evento cardiovascular agudo futuro. A utilização pode ainda compreender a utilização de CCL18 e opcionalmente de CCL5 como um tal biomarcador. A CCL3 é também conhecida como MIP-1 (proteína inflamatória de macrófago alfa) e LD78a/b; a CCL18 é também conhecida como PARC, DC-CK-1, AMAC-1 ou MIP-4; e a CCL-5 é também conhecida como RANTES regulada na ativação, expressa e excretada por células T normais e SISd. A síndrome ou evento cardiovascular pode compreender doença da artéria coronária, aterosclerose, enfarte agudo do miocárdio, arteriosclerose, angina de peito instável (UAP), embolismo, trombose venosa profunda, acidente vascular cerebral, insuficiência cardíaca congestiva ou arritmia.
Como utilizado no presente invento, biomarcador significa que o nível de CCL3 (e opcionalmente CCL18 e opcionalmente CCL5) conforme determinado (e.g. detetado e/ou quantificado) numa amostra de tecido ou numa amostra de um fluido corporal de um indivíduo é um indicador preditivo para uma perturbação cardiovascular aguda futura como tal e/ou para monitorização do estado e/ou da evolução de uma perturbação. A deteção destes biomarcadores pode também ser utilizada para monitorizar regimes terapêuticos e/ou ensaios clínicos de modo a detetar se um tratamento particular pode ou não ser eficaz.
As citoquinas acima mencionadas podem ser identificadas numa amostra de fluido corporal de um sujeito, ou em células obtidas a partir de um sujeito, tais como as obtidas a partir de uma placa aterosclerótica, por exemplo. A amostra de um fluido corporal de um indivíduo pode ser obtida a partir de sangue, e.g. células mononucleares isoladas, ou a partir de uma fração de sangue, e.g. plasma ou soro, especialmente plasma. Para os propósitos dos aspetos e concretizações anteriores, o sujeito pode ser um humano ou qualquer outro animal. Em concretizações particulares o sujeito é selecionado entre o grupo consistindo de humanos, primatas não humanos, equinos, bovinos, ovino, caprinos, leporinos, aves, felinos ou caninos. CCL3, CCL18 e CCL5 como aqui utilizadas incluem proteina a todo o comprimento, um fragmento de proteina, uma proteina mutada, derivados e células secretoras (produtoras), e.g. leucócitos e seus recetores. Fragmentos, mutantes e derivados das referidas quimoquinas são tais que a caraterística de biomarcador das quimoquinas é mantida. A utilização das quimoquinas acima mencionadas como biomarcadores de acordo com o presente invento significa que uma ou mais das referidas quimoquinas são determinadas na referida amostra de um indivíduo e.g. com meios de deteção incluindo os convencionais no campo dos ensaios, e.g. imunoensaios, as quimoquinas são detetadas por um imunoensaio tal como imunoensaios ligados a enzima (ELISAs); ensaios baseados em fluorescência, tais como fluoroimunoensaio de lantanídeo de dissociação melhorada (DELFIA, dissociation enhanced lanthanide fluoroimmunoassay), ensaios radiométricos, imunoensaios multiplex ou ensaios de pérolas citométricos (CBA, cytometric bead assays); sensores. Meios de deteção do presente invento incluem e.g. uma molécula que especificamente reconhece a quimoquina particular, e.g. uma molécula que é detetável diretamente ou indiretamente. Meios de deteção do presente invento compreendem preferivelmente um anticorpo, incluindo derivados de anticorpo ou seus fragmentos, e.g. um anticorpo que reconhece a(s) referida(s) quimoquina(s) e.g. um anticorpo que reconhece a quimoquina transportando um marcador. 0 marcador pode ser um marcador convencional, e.g. biotina ou uma enzima tal como fosfatase alcalina (AP), peroxidase de rábano (HRP) ou peroxidase (POD), ou uma molécula fluorescente, e.g. um pigmento fluorescente, tal como e.g. isotiocianato de fluoresceína. A molécula transportando um marcador, e.g. o anticorpo transportando um marcador, pode ser detetada de acordo com métodos como é convencional, e.g. através de métodos de medição de fluorescência ou de deteção de enzima. Células segregando CCL3, e opcionalmente CCL18 e/ou CCL5, numa amostra de um fluido corporal de um indivíduo, e.g. sangue, podem ser determinadas utilizando métodos convencionais tais como e.g. como descrito acima. As células podem ser purificadas, e.g. separadas por um gradiente de densidade, a partir de uma amostra, e.g. sangue, e as células purificadas obtidas são coradas. Anticorpos anti-CCL3 e opcionalmente anti-CCLl8/5, e.g. anticorpos marcados por fluorescência, podem ser adicionados à preparação de células coradas, opcionalmente após estimulação das células, e.g. com interleucina-4, e determina-se o nivel de secreção de CCL3 e opcionalmente de secreção de CCL18/5 pelas células ou de células segregando CCL3 e opcionalmente de células segregando CCL18/5, ou determina-se a expressão do(s) recetor(es) de CCL3 e opcionalmente de CCL18 e opcionalmente de CCL5.
Opcionalmente, a CCL3 e opcionalmente CCL18 e/ou CCL5 compreendidas na amostra ou a molécula detetável compreendida nos meios de deteção, podem estar imobilizadas sobre uma fase sólida. Uma fase sólida apropriada inclui e.g. uma fase sólida convencional, e.g. uma placa de plástico tal como uma placa de poliestireno ou de polivinilo, especialmente uma placa de microtitulação. Como fase sólida, podem-se também utilizar micropérolas, e.g. micropérolas revestidas. A fase sólida pode estar revestida com um material de revestimento cuja natureza depende e.g. do marcador compreendido nos meios de deteção. 0 material de revestimento deverá ser capaz de se ligar ao marcador, e.g. o marcador pode ser biotina e o material de revestimento inclui estreptavidina, e.g. ligada covalentemente à fase sólida.
Noutro aspeto o presente invento proporciona um método in vitro para prever se um indivíduo está ou não em risco acrescido de uma perturbação ou síndrome cardiovascular aguda, método que compreende a) proporcionar uma amostra de um fluido corporal previamente obtida a partir do indivíduo; b) determinar um nível de CCL3 na amostra; c) comparar o nível de CCL3 conforme determinado no passo b) com um nível de referência a partir de uma amostra de um fluido corporal previamente obtida a partir de um indivíduo de controlo saudável; e d) rastrear e/ou diagnosticar in vitro se o nível da referida CCL3 conforme determinado no passo b) é significativamente diferente do referido nível de referência.
Pode-se também determinar um nível de CCL18 e opcionalmente de CCL5 no passo (b) e comparar com um nível de referência de CCL18 e opcionalmente CCL5 a partir de uma amostra de um fluido corporal previamente obtida a partir de um indivíduo de controlo saudável.
Como acima mencionado pode-se também determinar o recetor de quimoquina apropriado, por exemplo por análise FACS utilizando um anticorpo, preferivelmente marcado, que reconhece especificamente o recetor. A determinação de CCL3 e opcionalmente de CCL18 e opcionalmente de CCL5 é realizada como descrito acima, e.g. utilizando uma molécula que reconhece especificamente o biomarcador, e.g. um anticorpo, um derivado de anticorpo, um fragmento de anticorpo, tal como e.g. um anticorpo anti-CCL3, e.g. um anticorpo específico de CCL3 disponível comercialmente, e.g. por um método de ensaio de imunodiagnóstico.
De modo a melhorar adicionalmente a sensibilidade e/ou seletividade do potencial de diagnóstico das quimoquinas acima mencionadas como biomarcadores, os métodos aqui descritos podem ser utilizados em conjunto com a avaliação de sintomas clínicos e/ou com a determinação do nível de pelo menos um outro biomarcador no sujeito, onde a quantidade do pelo menos um outro biomarcador pode também ser indicativa de uma doença cardiovascular ou de uma predisposição para a mesma. 0(s) biomarcador(es) adicional(ais) pode(m) ser selecionado(s) entre outras quimoquinas ou citoquinas e fatores de risco que têm sido indicados como biomarcadores de doenças, tais como CXCL 10 (IP-10), Proteína C Reativa, troponina 1, creatina-quinase, creatina-quinase MB, CD40L, HDL, ESR, contagens de plaquetas, sexo, um índice cardíaco, mioglobina e/ou interleucina-6 (concretização preferida) ou qualquer outro biomarcador mais ou menos preditivo de perturbações cardiovasculares. É também revelado um método para monitorizar a eficácia terapêutica do tratamento de um indivíduo com uma substância que se espera ter um efeito na redução ou cura de uma perturbação ou doença ACS método que compreende determinar o nível de CCL3 e/ou CCL18 e opcionalmente CCL5 ou seu (s) recetor(es) numa amostra de um fluido corporal do referido indivíduo e comparar este com o nível de CCL3 e/ou CCL18 e opcionalmente CCL5 antes da administração da referida substância. É também revelado um método para modular uma resposta de quimoquina num vertebrado a sofrer ou predisposto a sofrer de uma síndrome cardiovascular aguda (ACS) compreendendo o passo de aumentar ou diminuir, ou de outro modo alterar, a atividade funcional de CCL3 e/ou CCL18. 0 termo "modular uma quimoquina" inclui também no seu âmbito prevenir substancialmente ou induzir propositadamente num vertebrado atividade funcional de quimoquina. 0 termo "prevenir ou induzir propositadamente atividade funcional de quimoquina" inclui no seu âmbito aumentar ou diminuir a expressão e/ou a distribuição intracelular ou extracelular e/ou a atividade de pelo menos uma quimoquina como aqui descrito. 0 aumento da expressão pode ocorrer como resultado do aumento da expressão de ARNm, ou por aumento da transcrição génica utilizando métodos conhecidos dos peritos na especialidade. A expressão ou função de uma ou mais quimoquinas pode ser aumentada ou diminuída por aumento ou diminuição dos níveis de ARNm de quimoquina, respetivamente, por modulação pós-transcrição. Por exemplo, pode-se utilizar ARN interferente as método para diminuir os níveis de ARN de quimoquina. 0 aumento ou diminuição da distribuição intracelular pode ocorrer como resultado da adição de proteínas de ligação de quimoquina ao ambiente intracelular. Alternativamente, a distribuição intracelular pode ser aumentada, diminuída ou alterada pela adição ou remoção de sequências de sinal e/ou sequências líder para a quimoquina. Técnicas para utilização destes procedimentos serão familiares para os peritos na especialidade. 0 aumento ou diminuição da atividade das quimoquinas pode ser conseguido pondo as quimoquinas em contacto com inibidores de quimoquinas, ou ativadores de quimoquinas e/ou moléculas de ligação de quimoquina. Exemplos incluem anticorpo, fragmento de anticorpo ou nanocorpo; quimoquina modificada geneticamente/quimicamente ou porção de quimoquina com atividade agonista ou antagonista; uma entidade molecular pequena sintética; ou qualquer outra proteína (mamífera, virai ou bacteriana) com capacidade de modificação da atividade de CCL3, CCL5 ou CCL18. 0 termo "contato" significa que não requer um contato físico. Um contato funcional, isto é onde a presença do inibidor ou ativador ou proteína de ligação de quimoquina afeta a atividade da quimoquina, é suficiente. Isto pode ocorrer, por exemplo, quando uma terceira proteína medeia a interação/contato entre a molécula de ligação de quimoquina e a quimoquina. Isto é, a interação é indireta.
Inibidores e ativadores adequados incluem mas não estão limitados a inibidores de recetores de quimoquina. Adicionalmente, cofatores ou moléculas de ligação de quimoquina podem afetar a sua atividade. Exemplos incluem anticorpos e seus fragmentos (por exemplo Fab, F(Ab')2, Fv, Fv ligados por dissulfureto, scFv, diacorpo). É também revelado um ensaio de rastreio para identificar um modulador de CCL3 e/ou CCL18 para utilização potencial no tratamento de ACS, tal como UAP, o ensaio de rastreio compreendendo os passos de: proporcionar in vitro uma célula capaz de expressar CCL3 e/ou CCL18; pôr em contato uma molécula moduladora de teste com a referida célula; submeter a referida célula a condições nas quais a célula expressaria normalmente CCL3 e/ou CCL18 na ausência da molécula de teste e; detetar se a molécula de teste tem ou não um efeito modulador na atividade de CCL3 e/ou CCL18. 0 efeito modulador é preferivelmente um efeito inibidor na atividade de CCL3 e/ou CCL18 e, por exemplo, pode-se referir a níveis de expressão do ARNm codificando as referidas quimoquinas, ou a níveis de proteína observados. Estes níveis podem ser facilmente determinados pelo destinatário especializado, utilizando técnicas bem conhecidas do perito na especialidade e como aqui descrito. Tipicamente, pode-se ensaiar um controlo em paralelo, o controlo compreendendo uma célula à qual a molécula de teste não foi adicionada, de modo a obter um nivel de referência de CCL3 e/ou CCL18. Células convenientes para utilização num tal método incluem leucócitos ou neutrófilos. A atividade funcional de CCL3 e/ou CCL18 é modulada utilizando qualquer um de mais dos métodos selecionados entre o grupo consistindo de: administrar uma quantidade farmaceuticamente eficaz da(s) referida(s) quimoquina(s) ao vertebrado; administrar uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um ou mais inibidores da(s) referida(s) quimoquina(s) ao vertebrado; modular a transcrição da(s) referida(s) quimoquina(s) no vertebrado; modular a tradução de quimoquina(s) no vertebrado; modular a modificação pós-tradução de quimoquina (s) no vertebrado e modular a distribuição intracelular ou extracelular da(s) referida(s) quimoquina(s) no vertebrado. A atividade funcional da(s) referida(s) quimoquina (s) pode ser modulada por administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um ou mais inibidores da(s) referida(s) quimoquina(s) ao vertebrado. Vantajosamente, os um ou mais inibidores de quimoquina são selecionados entre o grupo consistindo de: inibidores quimoquina químicos, anticorpos anti-quimoquina e mutantes negativos dominantes das uma ou mais quimoquinas aqui descritas.
Pode-se modular a atividade funcional de uma ou de ambas as quimoquinas.
Descrição detalhada do invento 0 presente invento será agora adicionalmente descrito a título de exemplo e com referência às figuras que mostram:
Figura 1: Níveis plasmáticos de CCL5 e CCL18 conforme determinado por multiplex em pacientes estabilizados e refratários com angina de peito instável a t=0 (A). Utilizou-se ELISA para modelação temporal a t=0, t=2 e t=180 dias. Os niveis de CCL5 cairam significativamente a t=2 e estavam ao mesmo nivel a t=180 (B), enquanto os niveis de CCL18 permaneceram elevados a t=2 e cairam para t=180 (C). Os niveis de CD40L solúvel tinham um pico a t=0 e estavam diminuídos a t=2 e t=180 (D). Os níveis de CRP mostraram um pico a t=2, e diminuíram até valores abaixo da linha de base (t=0) a t=180 (E) . Os valores representam a média ± SEM, * P<0,05, ** P<0,001 e N.S. = não significativo.
Figura 2: Os níveis plasmáticos do quartil superior de CCL5 e CCL18 estavam significativamente associados com a ocorrência de sintomas isquémicos refratários em angina de peito instável, enquanto os níveis de quartil de sCD40L e CRP não mostraram qualquer correlação significativa (A) . Os níveis do quartil superior de CCL5 ao dia 0 são preditivos da necessidade de procedimentos de revascularização futuros (B), enquanto os níveis de quartil superior de CCL18 eram preditivos de síndromes coronárias agudas ou sintomas recorrentes de angina de peito instável nos 18 meses seguintes (C,D). * P=0,02, ** P=0,01, * P<0,01 e N.S. = não significativo.
Figura 3: A análise de PCR quantitativa mostrou uma expressão acentuadamente regulada de modo descendente de CCL5 e CCL18 em PBMCs não estimulados de pacientes com sintomas isquémicos a t=0 em comparação com PBMCs a t=180 (A) . Em contraste com a expressão de proteína de superfície de recetor de quimoquina em PBMCs, a expressão de ARNm dos recetores de CCL5 e CCL18, CCR1, CCR3, CCR4 e CCR5, estava também regulada de modo descendente aproximadamente pelo menos 2 vezes na linha de base (B). Os valores representam a média ± SEM, * P<0,05 e ** P<0,001.
Figura 4: A expressão em PBMCs de proteína de CCR3 e CCR5 mostrou uma clara regulação ascendente de ambos os recetores em células CD14+ (A,B) e células CD3+ (C,D) na linha de base. A gating tripla para CD14, CD3 e CCR3/5 revelou a mesma tendência, ainda que as células CD14+ exibissem regulação ascendente mais proeminente da expressão de CCR3 e CCR5 do que células CD3+ (E,F). Análise da expressão de superfície total de CCR3 e CCR5 em todos os PBMCs mostraram também uma regulação ascendente drástica da expressão de CCR3 e CCR5, indicando que o aumento na expressão de CCR3 e CCR5 é apenas parcialmente causada por células positivas CD3+ e CD14+ (G,H,I). * P<0,05, ** P<0,01 e * P<0,001.
Figura 5: A estimulação de PBMCs durante 6 horas com rCCL5 e SCCL18 não mostrou quaisquer diferenças significativas na expressão de ARNm de CCR1 (A), CCR4 (C) e CCR5 (D) . A expressão de CCR3 foi acentuadamente regulada de modo descendente após estimulação com sCCL18, mas não com rCCL5 (B) . Os valores representam a média ± SEM, * P<0,01, N.S. = não significativo, rCCL5 = CCL5 recombinante, SCCL18 = CCL18 sintético.
Figura 6: Avaliação da interação heterófila entre CCL5 e CCL18 em PAGE (18%) . As pistas 1 e 2 mostram a mobilidade de referência de rCCL5 (7,851 kDa) e SCCL18 (7,855 kDa), ambas as quimoquinas mostraram uma fraca tendência para formar homodímeros de 15,6 kDa. As pistas 3 e 4 foram carregadas com misturas de rCCL5 e SCCL18 numa proporção 1:1 e 1:5 (peso:peso), nas quais os dimeros tinham sido reticulados por incubação durante 30 min à TA com paraformaldeido 25 mM. Note-se a mobilidade eletroforética ligeiramente superior e uma coloração ligeiramente mais amarelada de monómero CCL18 e dimero. A extensão da formação de dimero não foi alterada após co-incubação e reticulação subsequente de CCL5 e CCL18, indicando que CCL5 e CCL18 não estão provavelmente envolvidas em qualquer interação cruzada heterófila significativa mesmo a concentrações suprafisiológicas. A carga de proteína total por pista era constante (2 pg) (A).
Figura 7: A análise PAGE foi corroborada por análise MS MALDI-TOF: CCL5 e CCL18 (10 pmol/μΐ) deram picos de massa a aproximadamente 7860 Da (M+; massas teóricas de CCL5 e CCL18 7851 e 7855 Da, respetivamente), com apenas pequenos picos a aproximadamente 15730 Da, ilustrando a baixa tendência para formar homodímeros (M2+) (A,B). A espetrometria de massa MALDI-TOF de CCL18 que tinha sido pré-incubada com CCL5 numa proporção 1:1 e 1:5 p:p (concentração total 10 pmol/μΐ) em HEPES 50 mM/EDTA 0,1 mM com paraf ormaldeido deu um padrão essencialmente similar e a formação de dimero foi igualmente marginal para ambas as proporções (C,D).
Figura 8: Os níveis totais de CD14+ (monócitos e neutrófilos) não diferiram entre t=0 e t=180, enquanto as células CD3+ mostraram uma pequena diminuição (11,8%), ainda que significativa, na linha de base (A) . Ao nível do ARNm, observou-se um aumento de neutrófilos HNP-3+, sugestivo de libertação pós-isquémica melhorada de neutrófilos. No entanto, a razão de expressão de CCR2:CX3CR1, uma medida do perfil do subconjunto de monócitos, não estava regulada diferencialmente (B). Os valores representam a média ± SEM, * P=0,01, ** P<0,001 e N.S.= não significativo.
Figura 9: Demonstra que uma exposição transiente de ratinhos a níveis elevados de CCL18 na circulação (conforme efetuada por administração repetida de proteína CCL18 recombinante) agravará o desenvolvimento de aterosclerose e por isso aumentará o risco de doença cardiovascular.
Figura 10: Demonstra que o desenvolvimento de placa aterosclerótica no sino aórtico de ratinhos hiperlipidémicos (LDLr_/_) com uma deficiência de CCL3 é drasticamente reduzido.
Figura 11: Os níveis de CCL3 na circulação em APRAIS eram comparáveis com os observados em pacientes do grupo MISSION! (A). A monitorização temporal de CCL3 mostra claramente o aumento transiente de CCL3 durante a isquemia, uma vez que os níveis estavam significativamente diminuídos a t=180 em comparação com t=0 (B). * P=0,03 e ** P<0,001.
Figura 12: Os níveis do quartil superior de CCL3 na linha de base são preditivos da ocorrência de síndromes coronárias agudas durante o seguimento (A). Adicionalmente, os níveis do quartil superior eram também indicativos de sintomas isquémicos recorrentes durante ou diretamente após hospitalização (B). * P=0,01 e ** P<0,01.
Figura 13: Os níveis plasmáticos de CCL3 (A), CCL5 (B) e CXCL8 (C) estavam significativamente elevados em pacientes AMI ( fersus controlos ( ), enquanto CXCL10 (D) mostrou o padrão oposto. * P=0,025, ** P=0,006, *** P=0,02 e # P=0,004.
Figura 14: Avaliação dos níveis de IL-6, CCL3 e CXCL10 em ratinhos LAD laqueados ou operados em falso. A isquemia cardíaca induziu níveis significativamente elevados de IL-6 e CCL3, (A,B). Por outro lado, a CXCL10 apresentou um padrão inverso (C). * P=0,007, ** P=0,02 e *** P=0,03.
Figura 15: Ratinhos laqueados apresentaram um aumento significativo na percentagem de células T na circulação com um enriquecimento concomitante nos subconjuntos CCR5+ e CXCR3+ (A-C). 0 aumento em células T na circulação foi acompanhado por uma diminuição em células T esplénicas CCR5+, enquanto não foram visíveis quaisquer efeitos em células T totais ou esplénicas CXCR3+ (D-F). * P=0,04, ** P=0,02, *** P=0,04 e P=0,004. A Figura 16 mostra o perfil temporal da expressão de CCL3 em placas de artéria carótida induzidas por colar que mostraram produção de CCL3 aumentada 2 semanas após colocação de colar (A) . Observou-se uma indução rápida e estacionária do marcador de macrófago CD68 (B), enquanto a indução de CD36 estava algo retardada (C) . **P<0,01 em comparação com a linha de base (t = 0) . A Figura 17 mostra que a expressão de CCL3 em macrófagos está fortemente regulada de modo ascendente após estimulação com LPS (50 ng/ml) (A) mas não com ox-LDL (10 g/ml) (B). A resposta de CCL3 induzida por LPS in vivo está suprimida em quimeras CCL3_/_ (C, barras a preto) ***P<0,001. A Figura 18 mostra que lesões ateroscleróticas eram significa menores em quimeras CCL3_/_ em comparação com controlos WT (A com imagens representativas) . O teor de macrófagos (B) , colagénio (C) e células T (D) era similar entre WT e quimeras CCL3_/_. O influxo (E) e a adesão (F) de neutrófilos estavam significativamente atenuados em quimeras CCL3_/_. As barras a preto representam controlos WT e as barras a branco quimeras CCL3_/_. *P<0,05, **P<0,01. A Figura 19 mostra que o número total de glóbulos brancos (A) e monócitos (B) não era diferente em ratinhos CCL3_/_, enquanto os números de neutrófilos (C) estavam significativamente diminuídos. As barras a preto representam WT e as barras a branco quimeras CCL3_/_. **P<0,01, ***P<0,001. A Figura 20 mostra a cinética de leucopenia (A) e neutropenia (B) transiente induzida por ciclofosfamida em ratinhos de controlo (barras a branco) e CCL3_/_ (barras a preto) . A eliminação de neutrófilos está acelerada nas quimeras CCL3_/_ (C) , enquanto a repopulação é similar (D) . As barras a preto representam ratinhos WT e as barras a branco representam ratinhos CCL3-/-. *P<0,05, **P<0,01. A Figura 21 mostra que a injeção intraperitoneal de KC não afetou os números de neutrófilos CDllb+ CD71~ Grlhl<3h na circulação em ratinhos WT e CCL3~7~ (A). A indução induzida por KC do influxo de neutrófilos para a cavidade peritoneal era 2,5 vezes mais baixa em ratinhos CCi/3 em comparação com ratinhos WT (B). As barras a preto representam ratinhos WT e as barras a branco representam ratinhos CCL3_/_. **p=0,003.
Exemplo 1: CCL5 (RANTES) e CCL18 (PARC) são marcadores específicos de angina de peito instável refratária e estão elevados transientemente durante sintomas isquémicos severos. Métodos
População de estudo
Todas as quimoquinas e parâmetros inflamatórios foram determinados em amostras de plasma de um grupo de pacientes, derivados do estudo bem definido APRAIS (Acute Phase Reaction and Ischemic Syndromes) 13. Resumidamente, incluíram-se 54 pacientes que foram admitidos no serviço de emergência do Centro Médico da Universidade de Leiden entre março e setembro de 1995 com angina de peito instável da classe IIIB Braunwald e seguiram-se durante até 18 meses. Obtiveram-se amostras de sangue venoso na admissão (t=0), 2 dias (t=2) e 180 dias após admissão (t=180), centrifugaram-se e armazenaram-se alíquotas de plasma a -80°C até análise posterior. Todos os pacientes tinham recebido terapia médica padrão, i.e. aspirina 300 mg oralmente, nitroglicerina intravenosamente e perfusão de heparina com base em titulação para o tempo de tromboplastina parcial ativada. Um ponto final clínico do estudo APRAIS foi a ocorrência de angina de peito instável refratária durante a hospitalização. A angina de peito instável era considerada refratária se a angina subsistisse ou ocorresse de novo no repouso, apesar do tratamento médico, conduzindo a avaliação coronária invasiva e a terapia de revascularização subsequente. Ainda que o grupo de estudo fosse relativamente pequeno, este constituiu uma população claramente definida, bem documentada, com um ponto de partida similar. Todos os sujeitos deram consentimento informado por escrito e o protocolo de estudo foi aprovado pela Comissão de Ética do Centro Médico da Universidade de Leiden.
Isolamento de células PBMCs de pacientes (t = 0 e t=180) bem como de 6 voluntários saudáveis da mesma idade foram isolados a partir de amostras de sangue venoso EDTA através de centrifugação de densidade em Histopaque (Sigma, St. Louis, MO, E.U.A.). Colheram-se os PBMCs a partir da interface e lavaram-se duas vezes com meio de cultura, consistindo de Meio de Dulbecco com modificação de Iscove contendo Glutamax (Gibco, Paisly, Reino Unido) e suplementado com 10% de FCS. Os PBMCs foram criopreservados em meio de cultura contendo 20% de FCS e 10% de dimetilsulfóxido até utilização posterior.
Ensaio multiplex de quimoquina
Os níveis na circulação das quimoquinas CCL2, CCL3, CCL5, CCL11, CCL17, CCL18, CCL22, CXCL8, CXCL9, CXCL10 e do fator semelhante a quimoquina MIF, das citoquinas OSM, IFN- e OPG e das moléculas de adesão sRankl, sVCAM e sICAM foram determinados em amostras t=0 com um bioensaio multiplex feito à medida utilizando o sistema Bio-Plex Suspension Array (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, E.U.A.). Filtraram-se amostras de plasma e diluíram-se subsequentemente como soro normal de rato e de ratinho a 10% (Rockland, Gilvertsville, PA, E.U.A.) para bloquear a ligação de anticorpo não específica residual. Adicionaram-se 1000 microsferas por quimoquina (10 μΐ/poço) num volume total de 60 μΐ, em conjunto com amostras padrão e de branco, e incubou-se a suspensão durante 1 hora numa placa de filtro de 96 poços à temperatura ambiente (TA) . Depois, adicionaram-se 10 μΐ de mistura de anticorpos biotinilados (16,5 pg/ml) e incubou-se durante 1 hora à TA. Após lavagem com PBS-1% BSA-0,5% Tween 20, incubaram-se as pérolas com 50 ng/poço de estreptavidina-R-ficoeritrina (BD Biosciences, San
Diego, CA, E.U.A.) durante 10 minutos. Finalmente, lavaram-se de novo as pérolas com PBS-1% BSA-0,5% Tween 20, e mediu-se a intensidade de fluorescência num volume final de 100 μΐ de tampão ELISA de elevado desempenho (Sanquin, Amsterdão, Países-Baixos). As medições e análise de dados foram realizadas com o sistema Bio-Plex Suspension Array em combinação com o software Bio-Plex Manager versão 3.0 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, E.U.A.) (ver também referência n.2 14). ELISA e outros ensaios
Para análise temporal dos níveis plasmáticos de CCL5 e CCL18 de humano durante o seguimento, ensaiaram-se as amostras t=0, t=2 e t=180 por um kit ELISA instantâneo de CCL5 (Bender MedSystems, Viena, Áustria) e um ELISA de CCL18 (RayBiotech, Norcross, GA, E.U.A.), respetivamente, de acordo com o protocolo dos fabricantes. Os parâmetros inflamatórios da linha de base, tais como proteína C reativa, fibrinogénio, velocidade de sedimentação de eritrócitos (ESR) e inibidor 1 de ativador de plasminogénio (PAI-1), foram determinados como descrito anteriormente em detalhe 13. O ligando de CD40 solúvel (sCD40L) e a Interleucina 6 (IL-6) foram determinados através de um imunoensaio altamente sensível (Quantakine HS, R&D Systems, Minneapolis, MN, E.U.A.), e as amostras de CRP t=180 através de um ensaio turbidimétrico numa unidade Modular P800 totalmente automática (Roche, Almere, Países-Baixos).
Avaliação da interação heterófila de CCL5 e CCL18
Utilizou-se eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) para avaliar se CCL5 recombinante (7,8 kDa) e CCL18 sintético (7,8 kDa) se envolviam em interações heterófilas. Proteínas (rCCL5, sCC118, rCCL5/sCCL18 numa proporção em peso de 1:1 e 1:5 (p:p); 2 pg de proteína total por pista) foram incubadas durante uma hora à TA em tampão HEPES 50 mM/EDTA 0,1 mM (pH=7.4), após o que se adicionou paraformaldeído 25 mM para ligar de modo cruzado quaisquer homo ou heterodímeros formados. Após 30 minutos, as misturas de proteína foram desnaturadas em tampão de carga e submetidas a SDS-PAGE (18%; 2 pg de proteína por pista, uma hora a 70 mV e 30 minutos a 150 mV), e as proteínas foram visualizadas por coloração com prata. As misturas de proteína foram também analisadas num espetrómetro de massa MALDI-TOF Voyager-DE Pro (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA, E.U.A.).
Análises de RT-PCR
Para avaliar a expressão de CCL5, CCL18, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CX3CR1 e de péptido 3 de neutrófilo humano (HNP-3) em PBMCs, isolou-se a analisou-se o ARNm. Utilizou-se tiocianato de guanidina-fenol para extrair o ARN total dos PBMCs, e submeteram-se as amostras a tratamento com DNAse I (Promega, Madison, WS, E.U.A.) após o que foi gerado ADNc utilizando transcriptase reverse M-MuLV RevertAid (Fermentas, Burlington, Canadá) de acordo com o protocolo do fabricante2. A expressão génica semiquantitativa foi realizada utilizando o método SYBR-Green (Eurogentec, Liege, Bélgica) num equipamento ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, E.U.A.) com iniciadores para CCL5, CCL18, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CX3CR1, CDllb e péptido 3 de neutrófilo humano (HNP-3). Utilizaram-se ciclofilina e hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferase (HPRT) como genes housekeeping (ver Tabela 1 para as sequências de iniciador).
A expressão génica relativa foi calculada subtraindo o número de ciclos limite (Ct) do gene alvo do Ct médio de ciclofilina e HPRT e elevando dois à potência desta diferença.
Citometria de fluxo
Avaliou-se a expressão superficial de CCR3 e CCR5 em PBMCs CD3+ e CD14+ por citometria de fluxo. Descongelaram-se PBMCs criopreservados, lavaram-se três vezes em RPMI 1640 contendo 20% de FCS e subsequentemente coraram-se utilizando anticorpos anti-CD3 e anti-CD14 conjugados com APC (BD Biosciences, San Jose, CA, E.U.A.) bem como anticorpos anti-CCR3 e anti-CCR5 conjugados com FITC (R&D Systems). Como controlos negativos utilizaram-se isótipos não específicos de anticorpos IgG2a de rato conjugado com FITC e IgG2b de ratinho conjugado com FITC (eBiosciences, San Diego, CA, E.U.A.). Analisaram-se as amostras com um citómetro de fluxo ativado por fluorescência (FACSCalibur) e subsequentemente analisou-se utilizando o software CELLQuest (BD Biosciences) . Contaram-se 50000 células para cada amostra.
Ensaio de estimulação de PBMC
Descongelaram-se espécimes de PBMC criopreservados, obtidos a partir de seis voluntários saudáveis como descrito acima, plaquearam-se numa placa de 96 poços de fundo redondo em forma de U (Greiner Bio-one) e estimularam-se durante 6 horas a 37°C com meio simples (controlo) ou com meio suplementado com 50 ng/ml de CCL5 recombinante (Peprotech, Rocky Hill, NJ, E.U.A.), 50 ng/ml de péptido de CCL18 sintético SM-1 (sCCL18) ou uma combinação de rCCL5 e SCCL18 (25 ng/ml por péptido) 3. Após incubação, isolou-se o ARN total a partir das células, preparou-se ADNc e determinou-se a expressão de recetor de quimoquina.
Análise estatística
Examinaram-se as diferenças entre as nossas populações de estudo e o grupo original pelo teste exato de Fisher e pelo teste t de Student desemparelhado. Testaram-se os níveis plasmáticos de quimoquinas e de marcadores inflamatórios em relação a uma distribuição de Gauss normal e submeteram-se os valores a transformação logarítmica no caso de uma distribuição distorcida quando apropriado. No último caso, utilizaram-se médias geométricas em vez de médias aritméticas. Compararam-se as médias pelo teste t de Student bicaudal desemparelhado e pelo teste U de Mann-Whitney quando apropriado. De modo a aferir o valor preditivo de CCL5 e CCL18 quanto à ocorrência de sintomas refratários, independentemente de fatores potencialmente confundidos, realizou-se uma análise multivariada, com correção para idade, níveis de HDL e ESR, bem como para outros fatores estabelecidos de risco cardiovascular (e.g. hipertensão, hipercolesterolemia, utilização de medicação para diminuição de lípido e pressão sanguínea, diabetes mellitus, comportamento tabágico, IMC e história de doença cardiovascular) e biomarcadores sCD40L e CRP. A distribuição de quartis foi avaliada e utilizada para o coeficiente de correlação de Spearman e para o ensaio de qui-quadrado de Pearson para determinar a associação dos níveis plasmáticos de quimoquina bem como dos níveis de sCD40L e CRP quanto à ocorrência de UAP refratária. Foram geradas curvas operativas características do recetor para avaliar o valor preditivo de quimoquinas quanto a sintomas isquémicos refratários. As análises de correlação entre os valores dos ensaios multiplex e ELISA e entre quimoquinas e parâmetros inflamatórios foram realizadas por um teste de correlação ordinal de Spearman. Os resultados de FACS foram analisados através de um teste t emparelhado, e o ensaio de estimulação foi analisado por ANOVA. Um valor de P bilateral < 0,05 foi considerado significativo. Todas as análises foram realizadas utilizando o software SPSS versão 14.0 (SPSS, Chicago, IL, E.U.A.).
Resultados População de estudo
Realizaram-se análises de quimoquinas no plasma num subgrupo de amostras de plasma previamente descongeladas de 54 pacientes consecutivos, excluindo vieses de seleção. Este subgrupo, consistindo de 31 pacientes com sintomas estabilizados e 23 com sintomas isquémicos refratários, correspondia ao grupo original em fatores de risco cardiovascular, história de enfarte do miocárdio ou PTCA/CABG e parâmetros de laboratório (Tabelas 2A e B).
Como nem todos os 54 pacientes responderam para doar sangue após 180 dias, a análise ELISA neste ponto foi realizada para 47 pacientes (29 estabilizados vs. 18 refratários), mas as caraterísticas de linha de base deste subgrupo correspondiam às do grupo original (dados não mostrados). A comparação quanto à demografia da linha de base no grupo de quimoquina não mostrou quaisquer diferenças marcantes entre pacientes refratários versus pacientes estabilizados, exceto para uma diferença pequena, mas significativa, em composição de género (87% vs. 67% de indivíduos do sexo masculino; P=0,05); a idade média de todos os pacientes era 65 anos (41 a 85 anos). No que se refere aos parâmetros clínicos e de lípidos no plasma na linha de base, os níveis de colesterol total em pacientes estabilizados e refratários não diferiam (5,92 vs. 6,16 mmol/1; P = 0,56), enquanto os níveis de HDL eram inferiores (1,23 vs. 0,99 mmol/1; P=0,02) na última população. Este grupo exibiu uma tendência acrescida no sentido de um estado inflamatório mais elevado, como ilustrado por níveis elevados do ESR (14,15 vs. 20,7 mm/h; P=0,03) ainda que os níveis de fibrinogénio e CRP fossem essencialmente similares. Não se observaram quaisquer diferenças nos níveis de sCD40L na linha de base entre grupos.
Análise multiplex: regulação ascendente de CCL5 e CCL18
Todos os dados de quimoquina e citoquina conforme determinados por análise multiplex (amostras t=0) foram submetidos a transformação logarítmica antes de análise estatística adicional por causa dos seus perfis de distribuição distorcidos, exceto para OPG. Os níveis plasmáticos da maioria das quimoquinas e citoquinas não diferiam entre pacientes estabilizados e refratários. Os níveis de CCL5 (23,1 vs. 32,7 ng/ml; P=0,018) e CCL18 (53,7 vs. 104,4 ng/ml; P=0,011) pareceram no entanto estar significativamente aumentados em pacientes refratários, enquanto existiu um aumento significativo próximo do limite nos niveis de CCL3 (53,6 vs. 73,7 pg/ml; P=0,09) (Tabela 3 e Figura IA).
Os valores são médias geométricas * designa média aritmética
Para além disso, as diferenças observadas nos niveis de CCL5 permaneceram significativas após análise multivariada com ajustamento quanto aos fatores de risco cardiovascular e niveis de sCD40L e CRP (P=0,023), enquanto os niveis CCL18 eram significativos próximos do limite (P = 0,06) . No entanto, as diferenças nos niveis de CCL18 atingiram significância após análise multivariada para todos os fatores confundidos menos para HDL (P=0,021). Deste modo, CCL5 e também CCL18 parecem ser preditores independentes da ocorrência de sintomas isquémicos refratários, mesmo quando se faz o ajustamento para os niveis de sCD40L e CRP. Adicionalmente, os niveis de CCL5 e CCL18 não mostraram qualquer correlação mútua (R=0,05; P=0,7), refletindo que estas quimoquinas são reguladas ou operam de um modo independente. Ainda, embora não tivessem sido observadas quaisquer interações heterófilas significativas entre CCL5 e CCL18, é concebível que ambas as quimoquinas, partilhando CCR3 como recetor alvo comum interagirão funcionalmente (Figuras 6 e 7). 0 CXCL10 tinha tendência para subir em pacientes estabilizados, ainda que não muito significativamente (221,6 vs. 157,5 pg/ml; P=0,12), o que poderá apontar para um efeito protetor desta quimoquina específica. Os níveis de IFN- eram simplesmente indetetáveis e por isso não são mostrados.
Em seguida, procurámos avaliar se os níveis de CCL5 e CCL18 tinham potencial de diagnóstico. Dado o tamanho do grupo, os níveis de CCL5 e CCL18 foram categorizados em quartis e analisados quanto à correlação com a ocorrência de sintomas isquémicos refratários futuros (Tabela 4A).
Todos os valores estão em ng/ml
Observou-se que o risco de sintomas isquémicos refratários estava aumentado nos quartis superiores de CCL5 (R=0,32; P=0,017; associação qui-quadrado linear por linear 5,53; P=0,019), enquanto esta tendência era ainda mais pronunciada para CCL18 (R=0,392; P=0,003; associação qui- quadrado linear por linear 8,105; P = 0, 004) (Figura 2A) . Os níveis de CCL18 elevados eram ligeiramente mais preditivos do que os de CCL5 como indicado pela curva operativa característica do recetor (área sob a curva 0,71 vs. 0,69). Os valores de corte de >40 ng/ml para CCL5 e >130 ng/ml para CCL18 produziram uma sensibilidade de 73,9% e 65,2%, respetivamente bem como uma especificidade de 67,7% e 61,3%. A análise combinada dos dois quartis superiores de CCL5 e CCL18 para a ocorrência de sintomas isquémicos refratários revelou uma relação muito significativa ( 2 com correção de continuidade 8,12; P<0,01). Enquanto a sensibilidade atingiu 47,8%, a especificidade da análise combinada era notavelmente elevada 90,3%. O valor preditivo positivo da análise combinada para os niveis de CCL5 e CCL18 era 78,5% com um valor preditivo negativo concomitante de 70,0%. Adicionar os niveis de sCD40L ou CRP à análise não produziu qualquer aumento adicional em sensibilidade, especificidade ou valor preditivo (dados não mostrados).
Verificação por ELISA de CCL5 e CCL18 e análise de seguimento
Os niveis de CCL5 médios e individuais ELISA e multiplex correspondiam excelentemente (P<0,001). Além disso, observou-se também que os niveis plasmáticos de CCL5 estavam aumentados em pacientes refratários em comparação com pacientes estabilizados ao dia 0 quando avaliados por ELISA (36,4 vs. 26,5 ng/ml). Curiosamente, já após dois dias, observou-se uma diminuição acentuada nos niveis de CCL5 no plasma em todo o grupo (12,1 versus 30,3 ng/ml; P<0,001) e observaram-se também niveis de CCL5 reduzidos a t=180, mostrando que CCL5 está transientemente elevado durante um episódio de angina de peito instável (Figura 1B) . Não observámos quaisquer diferenças entre os grupos estabilizado e refratário aos 2 e 180 dias pós-inclusão. Os niveis plasmáticos de CCL18 mostraram um padrão temporal diferente após sintomas isquémicos. A análise ELISA confirmou a expressão diferencial de CCL18 ao dia 0 entre pacientes estabilizados e refratários (56,2 vs. 41,1 ng/ml; P=0,02). Embora os valores absolutos fossem ligeiramente mais baixos no ELISA em comparação com o ensaio multiplex, a análise estatística revelou uma correlação excelente entre os dois ensaios (teste de Spearman; P<0,001). Curiosamente, os níveis de CCL18 do grupo total ao dia 2 não diferiram dos níveis na linha de base (dia 0), sugerindo que os níveis de CCL18 e CCL5 poderão ser regulados através de mecanismos separados. Aos 180 dias, os níveis de CCL18 estavam significativamente regulados de modo descendente em comparação com os valores ao dia 2 (48,4 vs. 34,5 ng/ml; P<0,001), sugestivo de um papel de CCL18 nos processos relacionados com reperfusão-isquemia cardíaca (Figura 1C).
Ligando CD40 solúvel e CRP
Os níveis de sCD40L e também de CRP estavam significativamente elevados a t=0 em comparação com t=180 (sCD40L 2,04 vs. 0,69 ng/ml; P<0,001, CRP 2,36 vs. 0,96 mg/1; P<0,001) (Figura 1D,E). No entanto, os níveis de sCD40L começaram a diminuir já a t=2 (1,35 ng/ml; P<0,05) indicando que níveis elevados na linha de base refletem uma resposta de fase aguda relacionada com a ativação de plaquetas. Uma vez que os níveis de CD40L solúvel a t = 0 e t=2 se correlacionam significativamente com os níveis de CCL5 t = 0 e t=2 (t = 0 R=0,40; P<0,01, t-2 R=0,35; P=0,01), níveis de CCL5 elevados podem ser causados principalmente também por ativação de plaquetas. Contudo, o sCD40L mostrou uma correlação negativa significativa com os níveis de CCL18 a t=0 (R=-0,36; P=0,01), sugerindo que estes últimos representam uma resposta de retorno à ativação de plaquetas. Os níveis de CRP estavam ainda adicionalmente aumentados a t=2 (6,43 mg/1; P<0,001) o que está de acordo com relatórios anteriores15'15, e é presumivelmente indicativo de um estado inflamatório sistémico pós-isquémico aumentado nestes pacientes dois dias após isquemia e/ou intervenção coronária. Os níveis de CRP não mostraram quaisquer correlações com os níveis de CCL5 ou CCL18. Os níveis de quartil de sCD40L e também de CRP não tinham qualquer potencial para prever sintomas isquémicos refratários (R=0,043 e R=-0,034; N.S.) (Figura 2A: para distribuição de quartis, ver Tabela 4B).
Todos os valores estão em ng/ml
Inflamação e seguimento clinico A análise de correlação para todas as quimoquinas com os parâmetros inflamatórios sistémicos fibrinogénio, IL-6, PAI-1 e ESR não revelou qualquer associação, exceto uma correlação fraca entre os níveis de CXCL10 e IL-6 (R=0,29; P=0,02, outros dados não mostrados). De modo importante, observou-se que os níveis de linha de base do quartil superior de CCL5, conforme determinados por ensaio multiplex, estão correlacionados com a necessidade de procedimentos de revascularização nos 18 meses seguintes (R=0,35; P=0,01). Adicionalmente, os níveis de linha de base do quartil superior de CCL18 estavam correlacionados com a recorrência de angina de peito instável (UAP) durante a hospitalização (R=0,36; P=0,007) bem como com a ocorrência de uma síndroma coronária aguda (ACS) durante o período de seguimento de 18 meses (R=0,31; P = 0,02) (Figuras 2B-D) . Os níveis de linha de base de sCD40L e CRP não estavam correlacionados com quaisquer dos parâmetros de seguimento (dados não mostrados).
Análise de expressão de quimoquina e de recetor de quimoquina em PBMC
Enquanto a interação de CCL5 com CCR1, CCR3, CCR4 e CCR5 está bem descrita, o recetor real para CCL18 é ainda desconhecido, o que torna atualmente o CCL18 um ligando órfão17. Contudo, tem sido noticiado que a CCL18 é um inibidor competitivo de CCL11 (eotaxina) que se liga a CCR3 18. Por conseguinte, examinámos a expressão de ARNm dos recetores de quimoquina CCR1, CCR3, CCR4 e CCR5 bem como a de CCL5 e CCL18 em PBMCs. Observámos uma regulação descendente assinalável altamente significativa de todos os quatro recetores de quimoquina envolvidos na linha de base (t=0) em comparação com PBMCs a t=180 (Figura 3B) . Observou-se um padrão temporal similar para CCL5 e CCL18, com a CCL5 sendo abundantemente expressa em PBMCs e a CCL18 apenas com níveis menores (Figura 3A) . A análise FACS subsequente para detetar a expressão de CCR3 e CCR5 em células T CD3+ e em monócitos CD14+ revelou, para nossa surpresa uma expressão de produto elevada significativa de CCR3 e CCR5 em ambas as células CD3+ e CD14+ a t=0 em comparação com t=180 (Figura 4A-D) (ver comentário na p.28) . A coloração tripla para CD3 ou CD14 com CCR3 e CCR5 mostrou uma expressão aumentada de recetor de quimoquina na população CD3+ (3,1% células triplamente positivas a t = 0 vs. 2,3% a t=180; P=0,007) e ainda mais proeminentemente nas células CD14+ (32,1% vs. 5,1% a t = 0 e t=180, respetivamente; P<0,001). Observou-se um padrão idêntico para a percentagem de células CCR3+ e CCR5+ bem como para as células CCR3+/CCR5+ combinadas na população de PBMC total (Figura 4G-I) .
Para avaliar se os padrões de expressão génica reduzida na linha de base eram causados por desvios transientes no perfil de distribuição de leucócitos, monitorizámos a percentagem total de células CD14+ (monócitos) e CD3+ (linfócitos T) nos PBMCs. As contagens de monócitos não eram diferentes entre os dois pontos temporais, enquanto as células CD3+ estavam ligeiramente diminuídas a t = 0 (54,2 vs. 66,6%; P=0,01) (Figura 8A) ver p.28. Um estudo posterior não revelou também quaisquer diferenças na razão de expressão de CCR2:CX3CR1, uma medida da distribuição do subconjunto de monócitos19, em PBMCs. Contudo, observámos mesmo níveis de expressão significativamente elevados de HNP-3, um marcador seletivo de neutrófilos, a t=0, apontando para uma libertação de neutrófilos aumentada durante a UAP (Figura 8B) ver p.28. Concebivelmente, as alterações observadas na expressão de recetor de quimoquina a t=0 podem ser atribuídas, pelo menos parcialmente, às contagens aumentadas de neutrófilos. Em contraste com os níveis plasmáticos de quimoquina, não se observaram quaisquer diferenças no nível de expressão para recetores de quimoquina entre pacientes estabilizados e refratários a t=0 (dados não mostrados).
Ensaio de estimulação de PBMC
Em parte porém, a regulação descendente do recetor de quimoquina pode refletir uma resposta de retorno sobre a explosão imunomoduladora após UAP. Para verificar se a regulação de expressão observada de CCR1, CCR3, CCR4 e CCR5 em PBMCs está relacionada com os níveis elevados de CCL5 e CCL18 durante eventos isquémicos, estimulámos PBMCs com rCCL5 e/ou sCCL18. Após 6 horas de estimulação, não observámos qualquer efeito diferencial na expressão de ARNm de CCR1, CCR4 e CCR5. Em contraste acentuado porém, a sCCL18 causou uma regulação descendente acentuada na expressão de CCR3, e este efeito foi adicionalmente amplificado por co-incubação com rCCL5 (P<0,01, Figura 5A-D). Deste modo, a regulação descendente de ARNm de CCR3 em PBMCs observada in vivo poderia ser causada pelos niveis aumentados de CCL18. A regulação descendente de CCR1, CCR4 e CCR5 in vivo poderá ser bem regulada por outros ligandos que não CCL5 e CCL18.
Discussão
Tanto quanto é do nosso conhecimento, este é o primeiro estudo para descrever o perfil de um painel abrangente de quimoquinas por um ensaio multiplex em plasma de pacientes de UAP de um modo prospetivo. De todas as quimoquinas testadas, observou-se que apenas os niveis de CCL5 e CCL18, independentemente de outros marcadores inflamatórios e SCD40L, estavam transientemente elevados em pacientes refratários versus pacientes estabilizados na linha de base e declinavam 6 meses após o aparecimento dos sintomas de UAP. Estes fenómenos foram acompanhados por uma diminuição acentuada, provavelmente induzida por CCL18, na expressão de ARNm dos recetores de quimoquina cognatos de CCR3 e CCR5 em PBMCs ao dia 0 versus dia 180. Concomitantemente, constatou-se que a expressão de superfície de CCR3 e CCR5 estava aumentada na linha de base, possivelmente refletindo uma exposição de recetor rápida por PBMCs durante sintomas isquémicos. CCL5 e CCL18 mostram também ambas caraterísticas preditivas quanto ao desfecho clínico. O painel multiplex continha várias quimoquinas, que tinham anteriormente sido relacionadas com aterosclerose ou doença cardiovascular, tal como CCL2, CCL5, CCL11, CXCL8 e CXCL10 5. CCL5 e CCL18 eram as únicas duas quimoquinas que estavam reguladas diferencialmente na linha de base entre pacientes refratários e pacientes estabilizados. Os pacientes refratários tinham queixas isquémicas continuadas severas apesar de medicação anti-anginosa justificando uma angiografia coronária com ou sem intervenção coronária percutânea. Por conseguinte, enquanto os níveis de outras quimoquinas que tinham sido implicadas em CVD estivessem relativamente inalteradas e enquanto os pacientes refratários não diferem em geral dos pacientes estabilizados na extensão de inflamação sistémica em geral, a CCL5 e a CCL18 poderão ser marcadores de quimoquinas exclusivos da severidade de isquemia em pacientes com UAP. CCL5 e CCL18 foram selecionadas para análise temporal adicional durante um seguimento de 180 dias. Como anteriormente mencionado, o papel de CCL5 como mediador inflamatório em doença cardiovascular é amplamente reconhecido, e observou-se que os níveis de CCL5 estavam de facto elevados em pacientes com síndromes coronárias agudas9'20. Contudo, estes estudos examinaram os níveis de CCL5 na hospitalização e, com uma única exceção, não incluíram um desenho de estudo prospetivo. Apenas Nomura et al. mostraram uma queda nos níveis de CCL5 em pacientes de UAP 30 dias após PCI, para níveis comparáveis com os níveis aos 180 dias no nosso estudo9. Os nossos dados alargam esta observação, uma vez que demonstram que o declínio nos níveis de CCL5 não é uma consequência de PCI, mas uma caraterística intrínseca de pacientes de UAP estabilizados. Ainda que faltem dados sobre os níveis de referência de CCL5, a CCL5 aos 2 e 180 dias pós-inclusão era muito comparável com valores em controlos saudáveis reportados por Parissis et al., sugerindo que os níveis de CCL5 tinham retornado à linha de base em 2 dias após aparecimento dos sintomas isquémicos21.
Para conhecer melhor a contribuição das plaquetas ativadas para os níveis de pico de CCL5, realizámos uma avaliação temporal de sCD40L 22. Observámos níveis significativamente elevados de sCD40L na linha de base, o que está de acordo com estudos anteriores e reflete o estado de ativação de plaquetas aumentado em UAP 23'24. n0 entanto, o declínio progressivo observado nos níveis de sCD40L a t=2 e t=180 após UAP nunca tinha sido documentado em pacientes com UAP e pode ilustrar o rápido restauro da homeostasia de sCD40L após UAP. Para além disso, os níveis a t = 0 e t=2 estão correlacionados com os níveis de CCL5, sugerindo que as plaquetas ativadas podem ser, diretamente ou indiretamente, uma fonte principal de CCL5. À parte da sua secreção massiva por plaquetas ativadas, os níveis elevados de CCL5 durante a UAP poderão também resultar de linfócitos T ativados e como um resultado de homeostasia alterada no tecido isquémico distai da oclusão 25'26. uma vez que Rothenbacher et al. observaram níveis de CCL5 reduzidos em pacientes com doença cardíaca coronária estável em comparação com os controlos, a inflamação aguda per se dificilmente pode ser responsabilizada pelo aumento transiente em CCL5 durante a UAP 27. Isto é sublinhado pelas nossas constatações, uma vez que observámos uma regulação descendente da expressão de ARNm de CCL5 em PBMCs na linha de base em comparação com a expressão aos 180 dias após inicio da isquemia. Continua por determinar se a resposta aumentada em pacientes refratários reflete uma ativação de plaquetas (ou de células T) mais extensa ou uma capacidade mais elevada de plaquetas e células T para elaborar CCL5.
Curiosamente, a CCL18 não foi ainda associada a perturbações cardiovasculares em grupos de pacientes. A CCL18 está presente no sangue com níveis elevados e é produzida por células de apresentação de antigénio e por eosinófilos. Pensa-se que atua na resposta imunitária primária funcionando como um atrativo para células T, linfócitos B e monócitos17. Contudo, como mencionado anteriormente, o seu recetor não foi identificado, ainda que tenha sido noticiado que a CCL18 funciona como um antagonista de CCR3 neutro18. A evidência sobre um papel direto de CCL18 na doença cardiovascular não é conclusiva e está limitada a dois estudos descritivos documentando a expressão de CCL18 em placas ateroscleróticas e em particular em locais de estabilidade reduzida28'29. Mostrámos agora que os níveis plasmáticos de CCL18 estão aumentados em pacientes de UAP e ainda mais em pacientes com sintomas refratários. A elevação de CCL18 é mantida transiente mas os níveis estão diminuídos após 180 dias. A origem real do aumento persistente de CCL18 após UAP é menos clara. A expressão de CCL18 estava regulada de modo descendente em PBMCs na linha de base, desqualificando a produção abundante por estas células como uma fonte principal de CCL18 no plasma. Concebivelmente, os níveis no plasma podem refletir uma libertação a partir de placas vulneráveis contendo CCL1 8 28 . Os níveis de CCL18 estavam correlacionados negativamente com os níveis de SCD40L, possivelmente apontando para uma resposta de retorno negativa após ativação de plaquetas. Investigação adicional terá que clarificar o seu papel em síndromes coronárias agudas.
Tem sido sugerido que várias quimoquinas podem atuar na patogénese de cardiomiopatia isquémica sem enfarte, uma vez que a geração de oxigénio reativo prevalente e hipoxia no tecido isquémico induzirão uma resposta de quimoquina30. Como ilustração, observou-se que a MCP-1 estava regulada de modo ascendente no miocárdio pelo menos 7 dias após isquemia em ratinhos e associada a fibrose intersticial e disfunção ventricular esquerda na ausência de enfarte do miocárdio6. Os níveis de CCL18 também persistiram com um nível elevado durante pelo menos dois dias, e dada a sua capacidade para ativar fibroblastos e aumentar a produção de colagénio, é tentador propor um papel similar de CCL18 na cicatrização de feridas31. Não apenas pode modular a atração de subconjuntos de leucócitos mas também, como mostrado por Wimmer et al., a CCL18 pode também desempenhar um papel facilitador na função de células estaminais hematopoiéticas de medula óssea32. Por conseguinte, níveis de CCL18 elevados poderão contribuir para a resposta inflamatória mas também para a mobilização de células progenitoras para áreas de isquemia miocárdica em antecipação do processo de reparação miocárdica.
Para adicionalmente enfatizar o papel de CCL5 e CCL18 na patofisiologia de isquemia miocárdica, observámos um aumento significativo na exposição superficial de CCR3 e CCR5 por células T CD3+ e monócitos CD14+ e uma regulação descendente paradoxal de ARNm de CCR1, CCR3, CCR4 e CCR5 na linha de base. Esta é uma observação intrigante e contra à intuição, ainda que não sejamos os primeiros a observar uma tal discrepância entre proteína e expressão de ARNm de recetor de quimoquina em PBMCs de pacientes de UAP. De facto Damas et al. reportaram um efeito similar mas oposto para CXCR4, i.e. regulação descendente ao nível da proteína mas regulação ascendente ao nível de ARNm em sujeitos com UAP em comparação com sujeitos de controlo saudáveis, enquanto os níveis do seu ligando CXCL12 estavam diminuídos em pacientes com UAP em comparação com os controlos33. 0 aumento rápido na exposição de proteína de superfície pode resultar da mobilização aguda de recetores intracelulares, em resposta a níveis plasmáticos aumentados dos ligandos cognatos de outros atores que são libertados em angina instável. A regulação descendente relativa de ARNm de recetores de quimoquina em PBMCs pode refletir parcialmente um perfil de leucócitos deslocado em UAP com uma mobilização rápida de neutrófilos HNP-3+ como avaliado a partir da expressão de HNP-3 aumentada em ARNm de PBMC a t=0 34, e uma diminuição menor em células CD3+, enquanto os níveis de CD14+ totais permaneceram não afetados. Parcialmente porém isto pode também ser atribuível a uma resposta de retorno negativa para normalizar os níveis de recetor exposto como se depreende dos nossos estudos de regulação de CCL18 in vitro (Figura 5) . 0 retorno de transcrição pode ser efetuado em resposta direta à exposição dos recetores de superfície a CCL18, uma vez que os níveis de ARNm de CCR3 foram diminuídos dramaticamente após exposição a sCCL18, identificando-se assim um novo papel modulador de CCL18 em isquemia cardíaca. 0 exame da distribuição de quartis de CCL5 e CCL18 mostra uma relação de corte clara com a ocorrência de sintomas refratários. Adicionalmente, os níveis do quartil superior estão também correlacionados com futuros eventos cardiovasculares e procedimentos de revascularização, enquanto sCD40L e CRP, que tinham mostrado ter um forte poder de prognóstico noutros estudos35-37, não o estavam para este tamanho de grupo. Dadas a principais origens celulares de CCL5 e CCL18, plaquetas ativadas e tecido isquémico, os níveis aumentados em UAP refratária podem refletir uma trombose mais pronunciada e indução relacionada com isquemia nestes pacientes. Se isto é ou não causal na progressão da doença refratária continua ainda por clarificar. No que se refere às capacidades de prognóstico de CCL5 e CCL18, a sensibilidade e especificidade dos níveis de quartil superior das quimoquinas separadamente não excederam 80%. A combinação dos dois quartis superiores de ambas as quimoquinas produziu uma especificidade viável de 90,3%, que assim regula de modo bastante eficaz sintomas refratários para níveis baixos de CCL5 e CCL18. Contudo, ainda que CCL5 e CCL18 possam ter potencial como biomarcadores prospetivos independentes para a doença, as correlações que observámos entre estas quimoquinas e a severidade clínica dos sintomas bem como vários parâmetros de seguimento, ainda que muito significativas, presentemente não são por si só fortes o suficiente. Por conseguinte, a determinação dos níveis de CCL5 e CCL18 no plasma, em combinação com outros parâmetros de diagnóstico clínico, poderá acrescentar caraterísticas de prognóstico à avaliação de pacientes com UAP. Este assunto necessita de ser abordado em futuros estudos em maior escala.
Alguns problemas e limitações deste estudo deverão ser salientados. Em primeiro lugar, a nossa configuração exclui principalmente o estudo dos níveis de controlo destas quimoquinas antes da UAP. Apesar disso, como as análises prospetivas foram realizadas nos mesmos pacientes, acreditamos que as conclusões sobre o perfil temporal de CCL5 e CCL18 são justificadas. Como todos os pacientes estão em grande parte isentos de sintomas aos 180 dias após UAP, podemos assumir com segurança que estes últimos valores se aproximarão dos níveis pré-UAP de pacientes de CAD. Em segundo lugar, foi recentemente mostrado que as estatinas podem influenciar os níveis séricos de quimoquina bem como a expressão de recetor de quimoquina em PBMCs8'38. Como estávamos na feliz circunstância de a amostragem do grupo ter ocorrido quando a terapia de estatina tinha apenas começado a surgir, apenas 8,2% dos pacientes do nosso grupo estavam com terapia de estatina. Uma vez que os nossos dados foram corrigidos em relação a este uso menor de estatinas, acreditamos que os nossos resultados não estão influenciados pela terapia de estatina. Finalmente, o painel multiplex compreendia também quimoquinas que tinham sido anteriormente associadas a aterosclerose ou isquemia miocárdica, incluindo CCL2, CCL3, CXCL8 e CXCL1021'39'40. No nosso estudo, pacientes de angina instável refratária não mostraram diferenças significativas para estas quimoquinas nem para os outros imunomoduladores que tinham sido ensaiados. Assim, estas citoquinas não foram selecionadas para análise temporal posterior mas a priori não podemos excluir que estas citoquinas possam afetar a angina de peito instável e a isquemia miocárdica.
Adicionalmente, dados preliminares em ratinhos ApoE~3~ propensos a aterosclerose que já tinham desenvolvido placas na artéria carótida induzidas por colar mostraram que um regime de administração intraperitoneal de 3 semanas com CCL18 recombinante agravou a progressão da lesão por uns significativos 50% (Figura 9), sugerindo que a CCL18 pode não só ser um marcador promissor de doença cardiovascular mas também um candidato válido para intervenção terapêutica em doença cardiovascular.
Para concluir, identificámos CCL5 e particularmente CCL18 como quimoquinas relevantes em UAP. Se desempenham um papel causador na patogénese ou estão mais indiretamente envolvidos através de outros mecanismos, ou se estes marcadores encerram qualquer potencial de diagnóstico adicional e se são alvos terapêuticos adequados, necessita de ser abordado em estudos futuros.
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Exemplo 2: Os níveis de CCL3 (MIP-1 ) estão elevados durante sindromes coronárias agudas e mostram urn forte poder de prognóstico para eventos isquémicos futuros. Métodos
Grupos de pacientes MISSÃO
As populações de estudo foram compiladas a partir do estudo de intervenção MISSION! 12. O grupo de pacientes de AMI consistia de 44 pacientes (54,5% do sexo masculino; idade média 61,8 ± 11,6 anos) diagnosticados com AMI com base no ECG e em parâmetros químicos clínicos (níveis elevados de troponina e creatina-quinase). O grupo de controlo representava 22 sujeitos não sintomáticos da mesma idade e sexo (54,5% do sexo masculino; idade média 61,7 ± 12,8), não padecendo de doença da artéria coronária manifestada (Tabela 5) . As amostras de sangue na linha de base dos pacientes de AMI foram colhidas 2 horas após hospitalização e em 6 horas após surgimento de AMI.
Pacientes padecendo de doença autoimune, doenças malignas, doenças inflamatórias crónicas tais como artrite reumatoide ou a receber imunossupressores ou quimioterapia foram excluídos do estudo. Este estudo foi aprovado pela comissão de ética local e todos os pacientes e voluntários saudáveis deram consentimento informado antes de serem recrutados. A investigação estava em conformidade com os princípios delineados na Declaração de Helsínquia.
APRAIS
As amostras de plasma de pacientes com angina instável, obtidas a partir do bem definido estudo APRAIS (Acute Phase Reaction and Ischemic Syndromes), foram utilizadas para determinar os níveis de CCL3 na circulação 13. Resumidamente, incluíram-se 54 pacientes que foram admitidos no serviço de emergência do Centro Médico da Universidade de Leiden entre março e setembro de 1995 com angina de peito instável da classe IIIB Braunwald e seguiram-se durante até 18 meses. Obtiveram-se amostras de sangue venoso na admissão (t=0) , 2 dias (t=2) e 180 dias após admissão (t=180), centrifugaram-se e armazenaram-se alíquotas de plasma a -80°C até análise posterior. Todos os pacientes tinham recebido terapia médica padrão, i.e. aspirina 300 mg oralmente, nitroglicerina intravenosamente e perfusão de heparina com base em titulação para o tempo de tromboplastina parcial ativada. Todos os sujeitos deram consentimento informado por escrito e o protocolo de estudo foi aprovado pela Comissão de Ética do Centro Médico da Universidade de Leiden.
Ensaio multiplex de quimoquina
Os níveis na circulação das quimoquinas CCL2, CCL3, CCL5, CCL11, CCL17, CCL18, CCL22, CXCL8, CXCL9 e CXCL10 bem como de quatro citoquinas de referência foram determinados no grupo MISSION!, bem como os níveis de CCL3 no grupo APRAIS, utilizando uma leitura baseada em microsferas fluorescentes altamente sensível como anteriormente descrito 14Ί5. Resumidamente, filtraram-se amostras de plasma e diluíram-se subsequentemente com soro normal de rato e de ratinho a 10% (Rockland, Gilvertsville, PA, E.U.A.) para bloquear a ligação de anticorpo não específico residual. Adicionaram-se 1000 microsferas por quimoquina (10 μΐ/poço) num volume total de 60 μΐ, em conjunto com amostras padrão e de branco, e incubou-se a suspensão durante 1 hora numa placa de filtro de 96 poços à temperatura ambiente (TA) . Depois, adicionaram-se 10 μΐ de mistura de anticorpos biotinilados (16,5 pg/ml) e incubou-se durante 1 hora à TA. Após lavagem com PBS-1% BSA-0,5% Tween 20, incubaram-se as pérolas com 50 ng/poço de estreptavidina-R-ficoeritrina (BD Biosciences, San Diego, CA, E.U.A.) durante 10 minutos. Finalmente, lavaram-se de novo as pérolas com PBS-1% BSA-0,5% Tween 20, e mediu-se a intensidade de fluorescência num volume final de 100 μΐ de tampão ELISA de elevado desempenho (Sanquin, Amsterdão, Países-Baixos). As medições e análise de dados foram realizadas com o sistema Bio-Plex Suspension Array em combinação com o software Bio-Plex Manager versão 3.0 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, E.U.A.)
Enfarte do miocárdio murino
Os ratinhos foram anestesiados e ventilados artificialmente com uma mistura de oxigénio e N2O [1:2 (vol/vol)] utilizando um ventilador de roedor (Harvard Apparatus, Holliston, MA, E.U.A.) ao qual se adicionaram 2-2,5% de isoflurano (Abbott Laboratories, Hoofddorp, Países-Baixos) para anestesia. O enfarte do miocárdio foi induzido por laqueação permanente da artéria coronária descendente anterior esquerda proximal com uma sutura de seda 7/0 estéril (Ethicon, Johnson & Johnson, Amersfoort, Países-Baixos). Três horas após laqueação sacrificaram-se os ratinhos, isolaram-se PBMCs e baços para análise de citometria de fluxo e colheu-se o plasma para deteção de quimoquina. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pela Comissão de Ética Animal da Universidade de Leiden. ELISA e outros ensaios
Os níveis de CCL3 humana e também murina (Biosource, Carlsbad, CA, E.U.A.), CXCL10 murina (R&D Systems, Minneapolis, MN, E.U.A.) e IL-6 murina (eBioscience, San Diego, CA, E.U.A.) foram determinados por ensaios ELISA de sanduíche como descrito pelos protocolos dos fabricantes. Os parâmetros inflamatórios de linha de base no grupo APRAIS, tais como proteína C reativa, fibrinogénio e velocidade de sedimentação de eritrócitos (ESR) , foram determinados como anteriormente descrito 13. 0 ligando de CD40 solúvel (sCD40L) foi determinado através de um imunoensaio altamente sensível (Quantakine HS, R&D Systems, Minneapolis, MN, E.U.A.).
Citometria de fluxo
Os PBMCs foram isolados a partir de sangue inteiro por supressão dos eritrócitos. Os esplenócitos foram isolados espremendo os baços através de um coador de células de 70 pm (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA, E.U.A.) . Após colheita incubaram-se as células sanguíneas totais e esplenócitos com tampão de lise de eritrócitos durante 5 minutos em gelo. Centrifugaram-se as células durante 5 minutos e ressuspenderam-se em tampão de lise. Lisaram-se os eritrócitos residuais por incubação durante 5 minutos. Lavaram-se as células duas vezes com PBS e contaram-se. Consequentemente coraram-se as células em relação aos marcadores de superfície CD4, CCR3, CCR5 (BD Biosciences), CD8, F4/80 (eBioscience) e CXCR3 (US Biological, Swampscott, MA, E.U.A.) adicionando 0,25 pg de anticorpo por amostra. Após 45 minutos de incubação em gelo, lavaram-se as células com PBS e subsequentemente analisaram-se por citometria de fluxo (FACScalibur, BD Biosciences). Métodos estatísticos A análise estatística foi realizada com o SPSS versão 13.0 (SPSS, Chicago, IL, E.U.A.). Todos os valores são expressos como a média ± erro padrão da média. Analisaram-se as diferenças em distribuição de fatores de risco entre o grupo de controlo e o grupo de AMI com um teste de probabilidades exato de Fisher. Os dados de quimoquina foram testados em relação a uma distribuição normal pela utilização de uma análise de Kolmogorov-Smirnov. Os dados distribuídos de modo não gaussiano foram analisados por um teste U de Mann-Whitney, enquanto as variáveis normalmente distribuídas foram analisadas pelo teste t de Student. A análise de correlação com parâmetros inflamatórios foi realizada pelo teste de correlação ordinal de Spearman. O ajustamento covariado para os fatores de risco foi realizado por um teste de regressão linear univariado. Avaliou-se a distribuição de quartis de CCL3 e utilizou-se no teste de qui-quadrado para associar niveis elevados de CCL3 com eventos cardiovasculares futuros. Um valor de P < 0,05 era considerado significativo.
Resultados
Estatística de pacientes MISSION
Foram compilados dois subgrupos numa proporção 2:1 como um estudo piloto que revelou que o desvio padrão nos niveis de citoquina na população AMI era em média 1,5 vezes mais elevado do que o dos sujeitos de controlo. Os subgrupos de AMI e de controlo estavam equiparados para género, idade e fatores de risco conhecidos por estarem associados a estados inflamatórios (diabetes mellitus tipo 2, hipertensão e hiperlipidemia). O grupo de AMI incluía uma fração mais elevada de fumadores e ex-fumadores do que o grupo de controlo (56,8% em AMI em comparação com 22,7% nos controlos; P=0,01; Tabela 5) . Deste modo, todos os valores de quimoquina foram ajustados em relação ao tabagismo por análise univariada. Todas as proteínas estavam bem dentro da gama detetável do ensaio utilizado.
Painel de referência
Como controlo para a validade do ensaio multiplex incluiu-se na análise um painel de citoquinas de referência e marcadores de adesão celular. Em conformidade com constatações anteriores, os níveis plasmáticos de IL-2 (0,07 ± 0,06 pg/ml em controlos vs. 0,65 ± 0,28 em AMI; P=0,003), TNF- (1,05 ± 0,32 pg/ml em controlos vs. 2,4 ± 0,72 em AMI; P = 0,03), sICAM-1 (476,1 ± 80,7 ng/ml em controlos vs. 713,0 ± 49,9 em AMI; P=0,04) e IL-6 (9,8 ± 4,1 em controlos em comparação com 23,7 ±8,0 pg/ml em AMI; P=0,04) estavam significativamente elevados em pacientes de AMI (Tabela 6) . Outros marcadores de inflamação gerais como IL-1 , IFN- e sVCAM-1 permaneceram inalterados (dados não mostrados), mostrando por isso que o grupo de pacientes de AMI não estava enriquecido em sujeitos com um estado hiper-inflamatório geral.
Quimoquinas
Os níveis plasmáticos das quimoquinas CC CCL3 (39,8 pg/ml, IQR 21,3-50,3 em controlos em comparação com 47,8 pg/ml, IQR 39,6-67,2 em AMI; P=0,01: Figura 13A) e CCL5 (13,4 ng/ml, IQR 6,4-29,2 em controlos em comparação com 33,3 ng/ml, IQR 19,1-45,3 em AMI; P=0,001: Figura 14B) estavam significativamente regulados de modo ascendente em pacientes de AMI em comparação com pacientes de controlo (Tabela 7). Após correção em relação aos fatores de risco cardiovascular CCL3 e CCL5 permaneceram significativamente elevados durante a AMI (P=0,025 e P=0,006 respetivamente). Das quimoquinas CXC apenas a CXCL8 (4,2 ± 0,50 pg/ml em controlos em comparação com 6,8 ± 0,56 em AMI; P=0,01; Figura 13C) estava significativamente regulada de modo ascendente, enquanto a CXCL10 (255,1 ± 47,2 pg/ml em controlos vs. 162,6 ± 20,3 em AMI; P = 0,002: Figura 13D) estava regulada de modo descendente em AMI em comparação com os controlos.
Após ajustamento covariado CXCL8 e CXCL10 permaneceram ambas significativamente alteradas (P=0,02 e P=0,04 respetivamente).
Todas as outras quimoquinas não foram reguladas diferencialmente durante AMI (Tabela 7).
Referência (IL-2, IL-6, TNF- e sICAM-1) e painel de quimoquina de parâmetros medidos contendo o valor de P e o valor de P corrigido (P*) após ajustamento quanto ao tabagismo.
Os valores estão expressos como a média ± SEM ou mediana com IQR quando apropriado.
APRAIS
Para verificar esta observação comparámos os níveis de CCL3 do grupo MISSION! com os do grupo APRAIS como descrito anteriormente por referência ao Exemplo 1. A análise inter- estudos mostrou que pacientes com UAP exibiram também niveis plasmáticos de CCL3 aumentados similares em comparação com os pacientes AMI MISSION! (Figura 11A). A seguir, realizámos uma análise temporal dos niveis de CCL3 na circulação no grupo de pacientes APRAIS com angina de peito instável. Amostras de plasma a partir da linha de base (t=0), t=2 e t=180, conforme analisadas por ELISA, revelaram uma diminuição significativa dos niveis de CCL3 para t=180 em comparação com t=0 bem como para t=2 (t=0 7,57 pg/ml; t=2 6,49 pg/ml; t=180 4,31 pg/ml, P<0,001) (Figura 11B) . Ainda que os niveis plasmáticos absolutos de CCL3 detetados por ELISA fossem mais baixos, a comparação de ambas as técnicas revelou uma correlação altamente significativa (R=0,92, P<0,001). A seguir, procurámos avaliar se os niveis plasmáticos de CCL3 tinham qualquer potencial para prever o desfecho clinico. Considerando o tamanho do grupo, os niveis plasmáticos de CCL3 multiplex t=0 foram deste modo categorizados em quartis e analisados quanto à correlação com a ocorrência de sintomas isquémicos durante ou imediatamente após hospitalização e/ou sindromes coronárias agudas (para distribuição de quartis, ver Tabela 6). Os niveis do quartil superior de CCL3 eram altamente preditivos quanto à ocorrência de sindromes coronárias agudas durante o seguimento (Razão de verossimilhança 11,52; P<0,01) e angina de peito instável recorrente durante a hospitalização (Razão de verossimilhança 14,63; P<0,01) (Figura 12A,B). A morte cardíaca durante o seguimento mostrou também uma associação significa, ainda que menos forte (Razão de verossimilhança 7,92; P<0,05) (dados não mostrados). Finalmente, a CCL3 não se correlacionava com qualquer dos parâmetros inflamatórios (dados não mostrados). No entanto, os níveis de sCD40L revelaram uma correlação negativa significativa com os níveis de CCL3 (R=-0,44; P=0,001), sugestivo de uma resposta de retorno após ativação de plaquetas.
Ao contrário de CCL5 e CCL18, os níveis de CCL3 não eram preditivos de uma natureza refratária de UAP (estado precoce) mas de um modo grandemente significativo de eventos mais a médio prazo que ocorrem em 180 dias após UAP.
Enfarte do miocárdio murino
Os resultados obtidos em humanos sugerem um papel importante para CCL3 em lesão miocárdica isquémica. Para avaliar se as quimoquinas aumentadas estavam relacionadas com isquemia realizámos experiências de enfarte do miocárdio em ratinhos. Uma vez que as quimoquinas CCL5 e CXCL8 tinham sido estudadas extensivamente no que se refere à aterotrombose e AMI virámos o nosso interesse para CCL3 e CXCL10. Para induzir enfarte agudo do miocárdio a artéria coronária descendente anterior esquerda foi laqueada em ratinhos C57B16. Em concordância com as constatações anteriores de MISSION!, os níveis de CCL3 estavam significativamente elevados após AMI (33,2 ± 1,5 vs. 76,4 ± 37,4 pg/ml em animais laqueados; P = 0,02) (Figura 14B) . Como controlo para o modelo de AMI, mediram-se os níveis da citoquina IL-6 relacionados com isquemia16'1?. os níveis de IL-6 estavam significativamente regulados de modo ascendente após laqueação (0,67 ± 0,26 em animais operados em falso vs. 1,34 ± 0,46 ng/ml em animais laqueados; P = 0, 007,
Figura 14A). Surpreendentemente os níveis de CXCL10, em oposição às constatações MISSION!, estavam significativamente aumentados após AMI (157,3 ± 64,8 em animais operados em falso em comparação com 310,6 ± 86,6 pg/ml em animais laqueados; P = 0,03) (Figura 14C) . Adicionalmente, colheram-se os PBMCs e analisaram-se quanto à expressão de recetor de quimoquina em subconjuntos de células diferentes. Como esperado, a população de células T totais estava aumentada na circulação após laqueação (14,1 ± 3,8% em controlos vs. 32,8 ± 14,4% em ratinhos laqueados; P=0,038) enquanto não se observaram quaisquer efeitos em células T esplénicas (P=0,9, Figura 15A e D respetivamente) . Para além disso o número de macrófagos tanto na circulação como também esplénicos não era regulado por lesão isquémica (dados não mostrados). Uma análise mais abrangente da população de células T revelou um enriquecimento específico de células T CCR5+ (8,0 ± 2,0% em controlos em comparação com 11,4 ± 1,4% em animais laqueados; P=0,02) (Figura 15B). O enriquecimento em células T CCR5+ na circulação foi acompanhado por uma redução em células T CCR5+ esplénicas (19,95 ± 0,5% vs. 14,1 ± 3,1%; P=0,004) (Figura 15E). O CCR3 é o recetor conhecido para a quimoquina CCL4 relacionada com CCL3. Como CCL3 e CCL4 são usualmente co-reguladas analisámos também PBMCs e esplenócitos quanto à expressão de CCR3. Os números de células T CCR3+ na circulação eram muito baixos. A análise mostrou um ligeiro aumento, ainda que não significativo (P=0,24), em células T CCR3+ na circulação (dados não mostrados). Não foram evidentes quaisquer diferenças em células T CCR3+ esplénicas (dados não mostrados). Considerados em conjunto, estes dados sugerem uma migração de células T específica de CCL3 a partir dos órgãos linfoides secundários para o local da lesão isquémica. Adicionalmente, a expressão do recetor de quimoquina CXC CXCR3 foi também determinada nas células T em circulação. Em concordância com os níveis de CXCL10 aumentados, o número de células T CXCR3+ na circulação foi significativamente aumentado após laqueação de LAD (29,1 ± 1,9% vs. 43,5 ± 5,7%; P=0,04) (Figura 15C). No entanto, não foram evidentes quaisquer efeitos em células T esplénicas CXCR3+ (P=0,78) (Figura 15F).
Dados preliminares sugerem que os níveis de CCL3 não só são preditivos do risco de eventos cardiovasculares futuros, mas também podem estar causalmente implicados no desenvolvimento de doenças, uma vez que o crescimento de placas ateroscleróticas no sino aórtico de ratinhos knockout em recetor de LDL hiperlipidémicos com uma deficiência leucocitária de CCL3 é significativamente mais baixo (-60%) do que em ratinhos com produção leucocitária normal de CCL3 (Figura 10).
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Materiais e métodos
Animais
Os ratinhos LDLr_/~ foram obtidos a partir de uma instalação local de criação de animais. Os ratinhos foram mantidos com ração regular esterilizada (RM3; Special Diet Services, Essex, Reino Unido). A água de beber foi fornecida com antibióticos (83 mg/L de ciprof loxacina e 67 mg/L de sulfato de polimixina B) e 6,5 g/L de sacarose e foi proporcionada ad libitum. As experiências com animais foram realizadas nas instalações para animais dos laboratórios Gorlaeus da Universidade de Leiden. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pela comissão de ética para experiências com animais da Universidade de Leiden.
Perfil de expressão temporal
Os ratinhos LDLr_/~ machos foram alimentados com uma dieta do tipo Ocidental contendo 0,25% de colesterol e 15% de manteiga de cacau (Special Diet Services, Sussex, Reino Unido) duas semanas antes da cirurgia e ao longo da experiência. Para determinar os níveis de expressão génica em placas de ratinho (n=20) foram induzidas lesões ateroscleróticas na artéria carótida por colocação de colar perivascular como anteriormente descrito1. Os ratinhos foram anestesiados por injeção subcutânea de cetamina (60 mg/kg, Eurovet Animal Health, Bladel, Países-Baixos), citrato de fentanilo e fluanisona (1,26 mg/kg e 2 mg/kg respetivamente, Janssen Animal Health, Sauderton, Reino Unido). Desde as 0 a 8 semanas após colocação do colar um subconjunto de 4 ratinhos foi sacrificado a cada duas semanas. Os animais foram anestesiados como acima descrito e perfundidos através do ventrículo cardíaco esquerdo com PBS e exsanguinados por seccionamento transversal da artéria femoral. Subsequentemente removeram-se ambas as artérias carótidas comuns e congelaram-se instantaneamente em azoto líquido para preservação ótima do ARN. Os espécimes foram armazenados a -80°C até utilização posterior.
Isolamento de ARN
Reuniram-se duas ou três carótidas por amostra e homogeneizaram-se por trituração em azoto líquido com um pilão. Extraiu-se o ARN total a partir do tecido utilizando reagente Trizol de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen, Breda, Países-Baixos). O ARN foi transcrito de modo reverso utilizando transcriptase reversa M-MuLV (RevertAid, MBI Fermentas, Leon-Roth) e utilizado para análise quantitativa da expressão génica com um equipamento ABI PRISM 7700 Taqman (Applied Biosystems, Foster City, CA, E.U.A.) como anteriormente descrito2, utilizando hipoxantina- fosforribosiltransferase (HPRT) murina e ciclofilina A (CypA) como genes housekeeping padrão (Tabela 8).
Transplante de medula óssea
Para induzir aplasia de medula óssea, ratinhos recipientes LDLr_/~ machos foram expostos a uma dose única de irradiação corporal total de 9 Gy (0,19 Gy/min, 200 kV, 4 mA) utilizando uma fonte Andrex Smart 225 Rõntgen (YXLON International) com um filtro de alumínio de 6 mm 1 dia antes do transplante. A medula óssea foi isolada a partir de ratinhos macho CCL3_/_ ou da mesma ninhada purgando os fémures e tíbias. Os recipientes irradiados receberam 0,5xl07 células de medula óssea por injeção na veia caudal e deixaram-se recuperar durante 6 semanas. Colocaram-se os animais com uma dieta do tipo ocidental contendo 0,25% de colesterol e 15% de manteiga de cacau (SDS) durante 12 semanas e subsequentemente sacrificaram-se. Vinte e quatro horas antes do sacrifício, um subconjunto de animais foi injetado intraperitonealmente com lipopolissacárido (LPS) (Salmonella minnesota R595 (Re) (List Biological Laboratories Inc., Campbell, CA, E.U.A.)). Os níveis plasmáticos de CCL3 foram determinados por ELISA de sanduíche (Biosource, Carlsbad, CA, E.U.A., de acordo com o protocolo do fabricante) para confirmar a produção enfraquecida de CCL3 a partir de leucócitos.
Análise histológica
Colheram-se secções de crióstato da raiz aórtica (10 pm) e coraram-se com Oil-red-O. Determinou-se o tamanho da lesão em 5 secções da área da cúspide da válvula aórtica. Secções correspondentes em lâminas separadas foram coradas imuno-histoquimicamente com um anticorpo dirigido contra um antigénio específico de macrófago (MOMA-2, IgG2b de rato monoclonal, diluição 1:50; Serotec, Oxford, Reino Unido). Como anticorpo secundário utilizou-se anticorpo de cabra anti-IgG de rato-AP (diluição 1:100; Sigma, St. Louis, MO, E.U.A.) e NBT-BCIP (Dako, Glostrup, Dinamarca) como substrato de enzima. Utilizou-se coloração com tricromo de Masson (Sigma, St. Louis, MO, E.U.A.) para visualizar o colagénio (coloração azul). Os neutrófilos foram visualizados por coloração com naftol AS-D cloroacetato-esterase de acordo com o protocolo do fabricante (Sigma).
Estimulação de macrófagos
Macrófagos RAW 264.7 privados de soro foram estimulados com 10 pg/ml de ox-LDL ou 1 ng/ml de LPS durante 24 horas. Isolou-se o ARN total para PCR em tempo real para avaliar a expressão de CCL3. Macrófagos RAW 264.7 privados de soro foram estimulados com CCL3 recombinante (10 ou 100 ng/ml) durante 24 horas. Subsequentemente, adicionou-se [3H]-timidina (1 pCi/poço, atividade específica 24 Ci/mmol; Amersham
Biosciences, Países-Baixos) a cada poço e deixaram-se as células proliferar durante outras 24 horas. Enxaguaram-se as células duas vezes com PBS frio e subsequentemente lisaram-se com NaOH 0,1 Μ. A quantidade de incorporação de [3H]-timidina foi medida utilizando um analisador de cintilação de líquido (Tri-Carb 2900R).
Neutropenia induzida por ciclofosfamida
Ratinhos fêmeas CCL3_/_ ou WT de controlo receberam uma injeção intraperitoneal (i.p.) de ciclofosfamida (6 mg/ratinho) para exaurir os neutrófilos do sangue como anteriormente descrito 3'4. Colheram-se amostras de sangue através da veia caudal regularmente e determinou-se a diferenciação de células sanguíneas num equipamento de diferenciação celular Sysmex (Goffin Meyvis, Etten-Leur, Países-Baixos).
Quimiotaxia in vivo
Ratinhos fêmeas CCL3_/_ ou WT de controlo receberam uma injeção i.p. de 500 ng de KC recombinante (Peprotech, Rocky Hill, NJ, E.U.A.) ou PBS. Duas horas mais tarde isolaram-se células sanguíneas e peritoneais e analisaram-se quanto à composição de neutrófilos por citometria de fluxo.
Citometria de fluxo
Os leucócitos peritoneais foram colhidos por lavagem da cavidade peritoneal com PBS. Incubaram-se células mononucleares de sangue periférico (PBMC) em bruto e leucócitos peritoneais a 4°C com tampão de lise de eritrócitos (NH4CI 155 mM em Tris/HCl 10 mM, pH 7,2) durante 5 minutos. Centrifugaram-se as células durante 5 minutos a 1500 rpm, ressuspenderam-se em tampão de lise para remover eritrócitos residuais. Lavaram-se as células duas vezes com PBS. Incubaram-se as suspensões de células com soro de ratinho normal a 1% em PBS e coraram-se quanto aos marcadores de superfície CDllb, GR1 e CD71 (eBioscience, San Diego, CA, E.U.A.) numa concentração de 0,25 pg de Ab/200000 células. Subsequentemente submeteram-se as células a análise de citometria de fluxo (FACSCalibur, BD Biosciences, San Diego, CA, E.U.A.) . Os dados de FACS foram analisados com software CELLQuest (BD Biosciences).
Análise estatística
Os dados estão expressos como a média ± SEM. Utilizou-se um teste t de Student bicaudal para comparar grupos de indivíduos, enquanto os múltiplos grupos foram comparados com uma ANOVA de um só fator e um teste subsequente de comparações múltiplas de Student-Newman-Keuls. Os dados não paramétricos foram analisados utilizando um teste U de Mann-Whitney. Um nível de P<0,05 foi considerado significativo.
Resultados A análise da expressão temporal de lesões ateroscleróticas em ratinhos LDLr~/_ mostrou uma regulação ascendente transiente clara de CCL3 em placas iniciais (2 semanas após colocação do colar) . Em estados mais avançados de evolução da lesão, a CCL3 vai retornando ao seu nível original. Esta expressão é inicialmente acompanhada por expressão aumentada do marcador de macrófago CD68 cujos níveis permanecem elevados em pontos temporais mais tardios. A expressão de CD36 é algo retardada em comparação com CD68 e CCL3 (Figura 16). Os perfis de expressão sugerem que a CCL3 pode estar envolvida no recrutamento crítico de células inflamatórias para locais de lesão aterosclerótica. A exposição in vitro de macrófagos RAW 264.7 a ox-LDL conduz a uma indução moderada da expressão de CCL3, enquanto o ligando de TLR4 LPS induz fortemente MIP1 ao nível de ARNm (Figura 17).
Para avaliar os efeitos da deficiência de CCL3 hematopoiética na migração e ativação de leucócitos bem como na aterogénese reconstituímos ratinhos LDLr_/_ com medula óssea CCL3_/_. A deficiência em CCL3 não influenciou o peso corporal ou os níveis de colesterol total durante o decorrer da experiência (dados não mostrados). Os níveis de MIP1 no plasma não eram significativamente diferentes entre quimeras CCL3_/_ e controlos da mesma ninhada (2,4 ±0,8 pg/ml em WT vs. 0,9 ± 0,6 pg/ml em quimeras CCL3_/_; p = 0,1, Figura 17C) . O fenótipo deficiente em CCL3 foi muito mais pronunciado após tratamento in vivo com LPS. Os níveis de MIP1 na circulação 24 h após tratamento com LPS aumentaram de modo robusto em WT mas não em quimeras CCL3_/_ (14,7 ± 0,4 pg/ml em ratinhos de controlo em comparação com 2,1 ± 1,0 pg/ml em quimeras CCL3_/_; p=0, 00005, Figura 18A). O desenvolvimento de lesão na raiz aórtica de quimeras CCL3~7~ foi reduzido por uns significativos 31% (135,1 ± 76,5xl03 pm2 em CCL3_/_ em comparação com 198,4 ± 51,4xl03 pm2 nos controlos; P = 0,04, Figura 19A). A percentagem de macrófagos MoMa-2+ da íntima não era diferente entre grupos (19,3 ± 2,6% nos controlos vs. 22,9 ± 3,0% em CCL3~7~, Figura 18B), sugerindo que a CCL3 sozinha pode não ser muito crítica na acumulação e proliferação de macrófagos na placa aterosclerótica. Os números de células T CD3 não foram influenciados pela deficiência de CCL3 (2,9 ±1,2 células T/mm2 de placa nos controlos e 2,6 ± 1,5 células T/mm2 de placa em CCL3_/_, Figura 18D) . Em contraste, a quantidade de neutrófilos de placa (7,0 ± 0,7 em WT em comparação com 2,9 ± 0,8/mm2 de tecido da íntima em placas CCL3_/_; P = 0,001, Figura 18E) , bem como a adesão de neutrófilos, foram significativamente reduzidas em placas CCL3~7~ (Figura 18F) . Como medida do estado de evolução da lesão determinou-se a deposição de colagénio na íntima. A percentagem de colagénio em placas CCL3_/_ não foi influenciada por deficiência de CCL3 (7,5 ± 1,4 em WT em comparação com 5,7 ± 1,0% em quimeras CCL3_/_, Figura 18C) . A deficiência de CCL3 não influenciou o número total de glóbulos brancos na circulação em animais WT e transplantados CCL3_/_ (4,4 ±0,7 em WT vs. 3, 9 ± 0,6xl06 células/ml em CCL3_/_, Figura 19A) e o número de monócitos na circulação também não foi afetado por deficiência de CCL3 (7,7 ±1,1 em WT vs. 8,9 ± 1,0% em quimeras CCL3_/_, Figura 19B) . Curiosamente a percentagem de neutrófilos na circulação estava significativamente diminuída em quimeras CCL3_/_ (35,3 ±3,9 em WT vs. 23,6 ± 2,5% em quimeras CCL3_/_; p=0,02, Figura 19C) .
Os números de neutrófilos diminuídos podem resultar de uma meia-vida reduzida ou numa diferenciação debilitada e egresso estromal de neutrófilos. Para investigar isto, os animais foram tratados com uma única injeção de ciclofosfamida e a cinética da eliminação/repopulação de neutrófilos foi monitorizada durante 10 dias. O número basal de glóbulos brancos e a composição celular não foi diferente entre controlos WT e ratinhos CCL3_/_. Células deficientes em CCL3 eram ligeiramente mais sensíveis ao tratamento de ciclofosfamida (Figura 20A,B) uma vez que a meia-vida de glóbulos brancos foi significativamente melhorada em ratinhos CCL3_/_ em comparação com WT (1,09 ± 0,07 dias em WT em comparação com 0,89 ± 0,06 dias em CCL3~7~; p=0,04, Figura 20C) e pareceu igualmente distribuída através do subconjunto de neutrófilos e linfócitos (Figura 20C) . Assim, os ratinhos deficientes em CCL3 mostram uma meia-vida de neutrófilos diminuída o que está de acordo com os números reduzidos de neutrófilos na circulação e na placa nesta estirpe. A repopulação de células iniciou-se 5 dias pós-injeção e era similar entre CCL3_/_ e controlos WT (Figura 20D) . A seguir avaliámos a resposta quimiotática de neutrófilos WT e CCL3_/_ em relação a um gradiente da quimoquina principal no recrutamento de neutrófilos, KC. Duas horas após injeção i.p. de KC, isolaram-se glóbulos brancos e leucócitos peritoneais e analisaram-se quanto ao teor de neutrófilos. Os números de neutrófilos eram similares entre animais WT e CCL3_/_ (6,1 ±1,0 em WT em comparação com 5,3 ± 1,0 em CCL3_/_, Figura 21A). Surpreendentemente, considerando os números de neutrófilos reduzidos na circulação, os animais CCL3_/_ tinham números de neutrófilos ligeiramente aumentados no peritoneu sob condições normais (0,6 ± 0,5% em WT em comparação com 1,4 ± 0,07, p=0,2, dados não mostrados). As injeções de KC induziram de modo robusto a migração de neutrófilos para o peritoneu de animais de controlo. As contagens de neutrófilos peritoneais após injeções de KC em animais CCL3~7~ eram apenas marginalmente mais baixas em comparação com animais WT (12,3 ± 0,4 em controlos em comparação com 10,2 ± 1,9 em animais CCL3_/_, dados não mostrados) . No entanto, a indução do influxo de neutrófilos estava diminuída em animais CCL3_/_ (indução de 20x em WT em comparação com indução de 7,5x em CCL3_/_, p=0,003; Figura 21C), sugestivo de quimiotaxia debilitada de neutrófilos CCL3_/_ sob condições de inflamação.
Curiosamente a formação de placa foi atenuada como resultado da ausência de CCL3 específica de leucócitos, o que pode ser devido a uma acumulação diminuída de neutrófilos na placa. Coletivamente os nossos dados indicam que a deficiência de CCL3 traduzir-se-á numa meia-vida de neutrófilos reduzida e numa acumulação de neutrófilos na placa dependente de CXCR2 comprometida, o que subsequentemente se traduzirá numa evolução atenuada da placa.
Discussão A migração de leucócitos mediada por quimoquina para o interior da parede do vaso é um passo essencial na formação e evolução da lesão aterosclerótica5. A quimoquina CC CCL3 pode interagir com recetores de quimoquina CCR4, CCR1 e CCR5, dos quais os últimos dois têm sido implicados na aterogénese. Combinado com a expressão aórtica regulada de modo ascendente durante a aterogénese6, e o seu efeito quimiotático potente sobre TNF- de células T, macrófagos e neutrófiló,s é concebível um papel desta quimoquina na aterogénese. Mostramos aqui que os leucócitos são a principal fonte de CCL3 sob condições de inflamação e que a deficiência de CCL3 de leucócitos atenua o desenvolvimento de placa por alteração da meia-vida de neutrófilos e redução da acumulação de neutrófilos.
Experiências in vitro estabeleceram claramente que macrófagos ativados são uma fonte rica de CCL3, o que está em concordância com dados anteriores8. Além disso, observou-se que os níveis de linha de base de CCL3 na circulação eram apenas parcialmente de origem leucocitária mas quase exclusivamente produzidos por leucócitos durante respostas inflamatórias induzidas por LPS 2'9. Os perfis de expressão do desenvolvimento de lesão aterosclerótica revelaram que a CCL3 está principalmente regulada de modo ascendente durante a evolução precoce da doença, sugerindo que a CCL3 está envolvida na inflamação da placa6. A aterogénese em ratinhos CCL3_/_ foi significativamente atenuada, mas não foram evidentes quaisquer efeitos no teor de macrófagos ou células T. Curiosamente, a deficiência hematopoiética e sistémica de um dos recetores de CCL3, CCR1, conduziu a aterosclerose acelerada 1[l'n. As placas deficientes em CCR1 continham mais macrófagos e células T e células T CCRl_/_ produziram mais IFN 10. Por outro lado, a deficiência funcional de CCR5 quer na linhagem hematopoiética quer sistemicamente mostrou reduzir o desenvolvimento de lesão aterosclerótica e as placas continham menos macrófagos e células T u'12. 0 antagonismo de CCR5 pela utilização de Met-RANTES atenuou similarmente o desenvolvimento de aterosclerose, o teor de macrófagos e de células T. Adicionalmente, o tratamento com Met-RANTES resultou em níveis de expressão de CCR5, mas não do seu ligando CCL313. A CCL3 mostrou ter uma afinidade de ligação mais elevada por CCR514'1s(, sugestivo de que os efeitos mediados por CCR5 são principalmente durante uma inflamação crónica de baixa velocidade, enquanto a inflamação aguda substancial poderia corrigir estes efeitos através da sinalização de CCR1. A alteração fenotípica observada na deficiência de CCL3 hematopoiética parece ser mais consistente com a de uma função de CCR5 comprometida, ainda que não tenhamos observado quaisquer efeitos assinaláveis no teor de macrófagos da placa. Isto indica que, embora o CCL3 possa influenciar a migração celular inflamatória, não é crucial na migração de monócitos ou células T para a placa.
Até recentemente, os neutrófilos não estavam implicados na patogénese de aterosclerose. Contudo, estão-se a acumular cada vez mais dados que suportam um papel ativo deste subconjunto de glóbulos brancos nesta doença. Naruka et al. mostraram que infiltrados de neutrófilos da placa estão associados a eventos coronários agudos16. 0 suporte experimental veio de van Leeuwen e colaboradores mostrando a presença abundante de neutrófilos em placas de ratinho avançadas17, e de uma expansão colaborativa após bloqueio de CXCR418. Os neutrófilos de placa são células inflamatórias potentes que atuam num intervalo de tempo curto. Os neutrófilos estão associados a apoptose da íntima aumentada e a um fenótipo pro-inflamatório18. Concebivelmente, a acumulação de neutrófilos em lesões ateroscleróticas pode induzir destabilização da placa como resultado de inflamação aumentada, formação de núcleos necróticos como uma consequência de lesão oxidativa e degradação da matriz por libertação de elastases de neutrófilo. Tem sido reportado que o CCL3 é capaz de aumentar a quimiotaxia de neutrófilos induzida pela citoquina pró-inflamatória TNF de um modo dependente de CCR5 7. Em concordância com estas constatações mostramos migração de neutrófilos atenuada e diapedese para o interior da placa na deficiência de CCL3 hematopoiética. Para além disso, migração de neutrófilos in vivo em relação a KC (análogo de IL8 murino) estava reduzida em ratinhos CCL3_/_. Isto indica que a IL-8, similar a TNF , pode induzir a migração de neutrófilos mediada por CCL3.
Outra opção intrigante é que a CCL3 afeta a homeostasia de neutrófilos. Durante a inflamação, os números de neutrófilos na circulação eram significativamente inferiores em ratinhos CCL3_/_, o que se encaixa bem na noção de que a apoptose de neutrófilos é encarada como uma medida protetora para diminuir respostas inflamatórias agudas e prevenir danos indesejados no tecido19. Os neutrófilos maturados terminalmente mostram por conseguinte uma meia-vida nitidamente reduzida. Além disso, têm a migração e a desgranulação comprometidas 20'21. Observámos um efeito claro de CCL3_/_ na cinética de eliminação de neutrófilos, uma vez que a meia vida de neutrófilos deficientes em CCL3 estava diminuída. Contudo, a repopulação de neutrófilos não foi influenciada pela deficiência de CCL3, mostrando que a maturação de neutrófilos e a libertação estromal per se não são influenciadas. Estes dados sugerem que os neutrófilos CCL3_/_ são mais sensíveis a ciclofosfamida, e talvez a outros sinais pró-apoptóticos conduzindo a uma meia-vida reduzida.
Considerados em conjunto, os nossos dados estabelecem claramente um papel causal para os neutrófilos no desenvolvimento da aterosclerose. Adicionalmente, colocamos a hipótese de que, sob condições de inflamação, o CCL3 derivado de leucócitos, possivelmente em concertação com TNF , pode alterar a homeostasia de neutrófilos e melhorar a quimiotaxia de neutrófilos para a placa aterosclerótica para acelerar a formação de lesão.
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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> universiteit Leiden Biessen Ericus Anna Leonardus Kraaijeveld Adriaan Otto Jukema Johan wouter van Berkel Theodorus Josephus Cornells <120> BIOMARCADORES DE EVENTO CARDÍACO FUTURO <130> PC/P15382PC <160> 22 <170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 23
<212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <4 0 0> 1 gaaatgtcag ttgctgcatt cct 23 <210> 2 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 2 accaatccgcc caaagggaac 20 <210> 3 <211> 21
<212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 3 agtcttggca gtgcagatga a 21 <210> 4 <211> 28
<212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 4 gaagatgaga acttcatcct aaagcata 28 <210> 5 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 5 tcctgctgac gattgacagg ta 22 <210> 6 <211> 17 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 6 gtgcccgcaa ggcaaac 17 <210> 7 <211> 22
<212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 7 ttcggcctga gtaactgtga aa 22 <210> 8 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 8 tgagtcatcc caagagtctc tgtc 24 <210> 9 <211> 18
<212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 9
ctgctgcatg aacccggt 18 <210> 10 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <4 0 0> 10 ggaagaagtg gcgaggtact 20 <210> 11 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <4 0 0> 11 actgtgggct cctccaaatt t 21 <210> 12 <211> 18
<212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <4 0 0> 12 tccatggtgg actgcgtg 18 <210> 13 <211> 23
<212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <4 0 0> 13 agacatccgt tcccctacaa gaa 23 <210> 14 <211> 25
<212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <4 0 0> 14 cagggctccg atgtataata attga 25 <210> 15 <211> 23
<212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <4 0 0> 15 gtccacgttg atttctcctc ate 23 <210> 16 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <4 0 0> 16 cgtgtggtaa gtaaaattgc tget 24 <210> 17 <211> 21
<212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <4 0 0> 17 cccagaagtg gttgtttccc t 21 <210> 18 <211> 20
<212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <4 0 0> 18 tttccttgag cctggatgct 20 <210> 19 <211> 18
<212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <4 0 0> 19 tctgcgctcc tgcatctg 18 <210> 20 <211> 16 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <4Ο0> 20 cagtgggcgg gcaatg 16 <210» 21 <211> 21
<212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 21 cctggaggcc acctcttcta a 21 <210> 22 <211> 25
<212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 22 tgcagctcaa caatagaaat caatt 25 Lisboa, 2015-11-09

Claims (11)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de quimoquina CCL3 como um biomarcador para identificar se um sujeito de teste está ou não em risco acrescido de uma sindrome ou evento cardiovascular agudo futuro.
  2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1 compreendendo adicionalmente a utilização de CCL18 e opcionalmente CCL5 como um biomarcador para identificar se um sujeito de teste está ou não em risco acrescido de uma sindrome ou evento cardiovascular agudo futuro.
  3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 onde a sindrome ou evento cardiovascular pode compreender doença da artéria coronária, aterosclerose, enfarte agudo do miocárdio, arteriosclerose, angina de peito instável, embolismo, trombose venosa profunda, acidente vascular cerebral, insuficiência cardíaca congestiva ou arritmia.
  4. 4. Utilização de acordo com as reivindicações 1 ou 2 para monitorizar o estado e/ou a evolução da referida sindrome ou evento.
  5. 5. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2 para monitorizar regimes terapêuticos e/ou ensaios clínicos de modo a detetar se um tratamento particular pode ou não ser eficaz na redução de um risco acrescido de uma sindrome ou evento cardiovascular agudo.
  6. 6. Utilização de acordo com qualquer reivindicação precedente onde o(s) biomarcador (es) é/são detetado (s) numa célula retirada de um sujeito ou de uma amostra de um fluido corporal de um indivíduo que pode ser derivada de sangue, e.g., células mononucleares isoladas, ou de uma fração sanguínea, e.g. plasma ou soro, especialmente plasma.
  7. 7. Utilização de acordo com qualquer reivindicação precedente onde o sujeito é selecionado entre o grupo consistindo de humanos, primatas não humanos, equinos, bovinos, ovino, caprinos, leporinos, aves, felinos ou caninos.
  8. 8. Utilização de acordo com qualquer reivindicação precedente onde a referida uma ou mais quimoquinas é detetada por um imunoensaio tal como imunoensaios ligados a enzima (ELISAs); ensaios baseados em fluorescência, tais como fluoroimunoensaio de lantanideo de dissociação melhorada (DELFIA), ensaios radiométricos, imunoensaios multiplex ou ensaios de pérolas citométricos (CBA); sensores.
  9. 9. Método in vitro para prever se um indivíduo está ou não em risco acrescido de uma perturbação ou síndrome cardiovascular aguda futura, método que compreende: a) proporcionar uma amostra de um fluido corporal previamente obtida a partir do indivíduo; b) determinar um nível de CCL3 na amostra; c) comparar o nível de CCL3 conforme determinado no passo b) com um nível de referência a partir de uma amostra de um fluido corporal previamente obtida a partir de um indivíduo de controlo saudável; e d) detetar se o nível da referida CCL3 conforme determinado no passo b) é significativamente diferente do referido nível de referência e assim se um indivíduo está ou não em risco acrescido de uma perturbação ou síndrome cardiovascular aguda.
  10. 10. Método in vitro de acordo com a reivindicação 9 compreendendo adicionalmente: a) determinar um nível de CCL18 e opcionalmente CCL5 na amostra; b) comparar o nível de CCL18 e opcionalmente CCL5 conforme determinado no passo a) com um nível de referência a partir de uma amostra de um fluido corporal previamente obtida a partir de um indivíduo de controlo saudável; e c) detetar se o nível da referida CCL18 e opcionalmente CCL5 conforme determinado no passo a) é ou não significativamente diferente do referido nível de referência e assim se um indivíduo está ou não em risco acrescido de uma perturbação ou síndrome cardiovascular aguda.
  11. 11. Utilização ou método de acordo com qualquer reivindicação precedente compreendendo adicionalmente a avaliação de sintomas clínicos e/ou a determinação do nível de pelo menos um outro biomarcador no sujeito selecionado entre CXCL 1 (IP-10), Proteína C Reativa, troponina 1, creatina- quinase, creatina-quinase MB, CD40L, HDL, ESR, contaqens de plaquetas, sexo, um índice cardíaco, mioglobina, interleucina-6, onde a quantidade do pelo menos um outro biomarcador é indicativa de doença cardiovascular ou uma predisposição para a mesma. Lisboa, 2015-11-09
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