ES2660475T3

ES2660475T3 - Biomarcadores de futuros eventos cardíacos

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Publication number: ES2660475T3
Application number: ES15176660.7T
Authority: ES
Inventors: Ericus Anna Leonardus Biessen; Theodorus Josephus Cornelis Van Berkel; Adriaan Otto KRAAIJEVELD
Original assignee: Academisch Ziekenhuis Leiden Acting Under Name Leiden Univ Medical Center; Universiteit Leiden; Leids Universitair Medisch Centrum LUMC
Current assignee: Academisch Ziekenhuis Leiden Acting Under Name Leiden Univ Medical Center; Universiteit Leiden; Leids Universitair Medisch Centrum LUMC
Priority date: 2007-09-10
Filing date: 2008-09-10
Publication date: 2018-03-22
Anticipated expiration: 2028-09-10
Also published as: US20110059103A1; US20160054334A1; PT2995957T; EP2995957A2; US20180172703A1; EP2995957B1; EP2201384B1; WO2009034470A3; WO2009034470A2; ES2770154T3; HK1217535A1; EP2201384A2; EP2995957A3; GB0717637D0; EP3336550B1; PT2201384E; HK1256407A1; US10746745B2; PT3336550T; EP3336550A1

Abstract

Uso de quimiocina CCL18 y opcionalmente CCL5 como biomarcador para la identificación de si un sujeto de prueba está o no en riesgo elevado de un futuro síndrome o evento cardiovascular agudo.

Description

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Se determinaron todas las quimiocinas y parámetros inflamatorios en muestras de plasma de una cohorte de pacientes, derivada del estudio bien definido APRAIS (Reacción de fase aguda y síndromes isquémicos)13. En resumen, se incluyeron 54 pacientes que fueron ingresados en el servicio de urgencias del Centro médico de la Universidad de Leiden entre marzo y septiembre de 1995 con angina de pecho inestable Braunwald clase IIIB y fueron seguidos durante hasta 18 meses. Se obtuvieron muestras de sangre venosa al ingreso (t=0), después de 2 (t=2) y 180 días después del ingreso (t=180), se centrifugaron y se almacenaron alícuotas de plasma a -80 ºC hasta el posterior análisis. Todos los pacientes habían recibido terapia médica convencional, es decir, aspirina 300 mg por vía oral, nitroglicerina por vía intravenosa e infusión de heparina basada ajustada al tiempo de tromboplastina parcial activado. Un punto final clínico del estudio APRAIS fue la aparición de angina de pecho inestable resistente durante la hospitalización. La angina de pecho inestable se consideró resistente si la angina en reposo, a pesar del tratamiento médico, siguió o volvió a aparecer, provocando evaluación coronaria invasiva y posterior terapia de revascularización. Aunque la cohorte de estudio fue relativamente pequeña, constituyó una población bien documentada claramente definida con un punto de partida similar. Todos los sujetos dieron el consentimiento informado por escrito y el protocolo del estudio fue autorizado por el Comité ético del Centro médico de la Universidad de Leiden.

Aislamiento de células

Se aislaron CMSP de pacientes (t=0 y t=180), además de 6 voluntarios sanos de la misma edad de muestras de sangre venosa con EDTA mediante centrifugación de densidad en Histopaque (Sigma, St. Louis, MO). Las CMSP se recogieron de la interfase y se lavaron dos veces con medio de cultivo, que consistía en medio Dulbecco modificado con Iscove que contenía Glutamax (Gibco, Paisly, RU) y complementado con 10 % de FCS. Las CMSP se crioconservaron en medio de cultivo que contenía 20 % de FCS y 10 % de sulfóxido de dimetilo hasta uso adicional.

Ensayo múltiplex de quimiocinas

Se determinaron los niveles circulantes de las quimiocinas CCL2, CCL3, CCL5, CCL11, CCL17, CCL18, CCL22, CXCL8, CXCL9, CXCL10 y el factor de tipo quimiocina MIF, las citocinas OSM, IFN-γ y OPG y moléculas de adhesión sRankl, sVCAM y sICAM en muestras a t=0 con un bioensayo múltiplex hecho a medida usando el sistema Bio-Plex Suspension Array (Bio-Rad laboratories, Hercules, CA). Se filtraron muestras de plasma y posteriormente se diluyeron con 10 % de suero de rata y ratón normal (Rockland, Gilvertsville, PA) para bloquear la unión de anticuerpo no específico residual. Se añadieron 1000 microesferas por quimiocina (10 µl/pocillo) en un volumen total de 60 µl, junto con muestras estándar y de blanco, y la suspensión se incubó durante 1 hora en una placa filtrante de 96 pocillos a temperatura ambiente (TA). Entonces, se añadieron 10 µl de mezcla de anticuerpo biotinilado (16,5 µg/ml) y se incubó durante 1 hora a TA. Después de lavar con PBS-1 % de BSA-0,5 % de Tween 20, se incubaron perlas con 50 ng/pocillo de estreptavidina R-ficoeritrina (BD Biosciences, San Diego, CA) durante 10 minutos. Finalmente, las perlas se lavaron otra vez con PBS-1 % de BSA-0,5 % de Tween 20, y la intensidad de fluorescencia se midió en un volumen final de 100 µl de tampón de ELISA de alto rendimiento (Sanquin, Ámsterdam, Los Países Bajos). Las mediciones y análisis de datos se realizaron con el sistema Bio-Plex Suspension Array en combinación con el software Bio-Plex Manager versión 3.0 (Bio-Rad laboratories, Hercules, CA) (véase también la ref. N.º: 14)

ELISA y otros ensayos

Para el análisis temporal de niveles de CCL5 y CCL18 humana en plasma durante el seguimiento, se ensayaron las muestras a t=0, t=2 y t=180 por un kit de ELISA instantáneo de CCL5 (Bender MedSystems, Viena, Austria) y un ELISA de CCL18 (RayBiotech, Norcross, GA), respectivamente, según el protocolo del fabricante. Se determinaron parámetros inflamatorios del nivel inicial tales como proteína C reactiva, fibrinógeno, tasa de sedimentación eritrocítica (ESR) e inhibidor 1 del activador de plasminógeno (PAI-1) como se ha descrito en detalle previamente 13. Se determinaron ligando CD40 soluble (sCD40L) e interleucina 6 (IL-6) mediante un inmunoensayo altamente sensible (Quantakine HS, R&D Systems, Minneapolis, MN), muestras de CRP a t=180 mediante un ensayo turbidimétrico en una unidad Modular P800 completamente automática (Roche, Almere, Los Países Bajos).

Evaluación de la interacción heterófila de CCL5 y CCL18

Se usó electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) para evaluar si CCL5 recombinante (7,8 kDa) y CCL18 sintético (7,8 kDa) interaccionaban en interacciones heterófilas. Se incubaron proteínas (rCCL5, sCC118, rCCL5/sCCL18 a una relación de peso 1:1 y a 1:5 (p:p); 2 µg de proteína total por carril) durante una hora a TA en tampón HEPES 50 mM / EDTA 0,1 mM (pH=7,4), después de que se añadieran 25 mM de paraformaldehído para reticular cualquier homo-o heterodímero formado. Después de 30 minutos, se desnaturalizaron mezclas de proteína en tampón de carga y se sometieron a SDS-PAGE (18 %; 2 µg de proteína por carril, una hora a 70 mV y 30 minutos a 150 mV), las proteínas se visualizaron por tinción con plata. También se analizaron mezclas de proteína en un espectrómetro de masas MALDI-TOF Voyager-DE Pro (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA).

Análisis de RT-PCR

Para evaluar la expresión de CCL5, CCL18, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CX3CR1 y péptido-3 de neutrófilo

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prueba exacta de Fisher y la prueba de la t de Student para datos independientes. Se probaron los niveles en plasma de quimiocinas y marcadores inflamatorios para distribución gaussiana normal y los valores se transformaron logarítmicamente en el caso de una distribución sesgada cuando conviniera. Con respecto a lo último, se dan medias geométricas en lugar de aritméticas. Las medias se compararon por la prueba de la t de Student bilateral 5 para datos independientes o la prueba de la U de Mann-Whitney cuando conviniera. Con el fin de evaluar el valor predictivo de CCL5 y CCL18 para la aparición de síntomas resistentes, independientes de factores posiblemente confusos, se realizó un análisis multivariante, que corregía para la edad, niveles de HDL y ESR, además de para otros factores de riesgo cardiovascular establecidos (por ejemplo, hipertensión, hipercolesterolemia, uso de lípido y medicación hipotensora, diabetes mellitus, comportamiento de fumar, IMC e historia de enfermedad cardiovascular) 10 y biomarcadores sCD40L y CRP. Se evaluó la distribución de cuartiles y se usó para el coeficiente de correlación de Spearman y la prueba de la chi-cuadrado de Pearson para determinar la asociación de niveles en plasma de quimiocinas, además de niveles de sCD40L y CRP para la aparición de API resistente. Se generaron curvas de rendimiento diagnóstico para evaluar valores de quimiocinas predictivos para síntomas isquémicos resistentes. Se realizaron análisis de correlación entre valores de múltiplex y ELISA y entre quimiocinas y parámetros inflamatorios

15 por la prueba de correlación ordinal de Spearman. Los resultados se analizaron por FACS mediante la prueba de la t para datos emparejados, el ensayo de estimulación se analizó mediante ANOVA. Se consideró significativo un valor de P bilateral < 0,05. Todos los análisis se realizaron usando el software SPSS versión 14.0 (SPSS, Chicago, IL).

Resultados

Población del estudio

20 Se realizaron análisis de plasma en quimiocinas en una subcohorte de muestras de plasma previamente no congeladas de 54 pacientes consecutivos, excluyendo el sesgo de selección. Esta subcohorte, que consiste en 31 pacientes con síntomas isquémicos establecidos y 23 con resistentes, se correspondió con la cohorte original en factores de riesgo cardiovascular, historia de infarto de miocardio o PTCA/CABG y parámetros de laboratorio (Tablas 2A y B).

25 Tabla 2A. Características de pacientes iniciales y parámetros de laboratorio.

Cohorte de quimiocinas (N=54) APRAIS (N=211) Valor de P

Edad, años: 65,4 ± 11,0 62,7 ± 10,2 0,08

Resistentes (%): 43 36 0,43

Sexo masculino (%): 73,8 71,1 0,75

Fumador actual (%): 24,6 30,5 0,45

IMC (kg/m2): 25,2 ± 6,0 25,9 ± 3,36 0,23

Diabetes (%): 16,4 14,6 0,98

Hipertensión (%): 23 23,5 0,99

Uso de estatinas (%): 8,2 12,2 0,48

Historia de:

Infarto de miocardio (%): 45 43,2 0,88

PTCA (%): 26 29,1 0,75

CABG (%): 23 21,6 0,86

Parámetros de laboratorio:

Colesterol total, mmol/l: 6,00 ± 1,5 6,18 ± 1,2 0,38

HDL, mmol/l: 1,14 ± 0,4 1,14 ± 0,3 0,97

CRP, mg/l *: 2,36 2,66 0,50

ESR, mm/h *: 16,44 14,88 0,30

Fibrinógeno, g/l *: 3,56 3,42 0,34

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Tabla 3. Concentraciones plasmáticas de quimiocinas analizadas mediante la técnica múltiplex.

Variable Estabilizados Resistentes Valor de P

CCL5, pg/ml: 23158 32704 0,018

CCL18, pg/ml: 53678 104399 0,011

CCL2, pg/ml: 154 146 0,77

CCL3, pg/ml: 53,6 73,7 0,09

CCL11, pg/ml: 63,7 65,8 0,88

CCL17, pg/ml: 40,3 51,2 0,34

CCL22, pg/ml: 527 546 0,79

CXCL8, pg/ml: 12,4 13,4 0,84

CXCL9, pg/ml: 158 156 0,96

CXCL10, pg/ml: 221 157 0,12

MIF, pg/ml: 330 439 0,45

OPG, pg/ml *: 937 1096 0,25

OSM, pg/ml: 456 690 0,25

sRankL, pg/ml: 5,0 5,7 0,83

sVCAM, pg/ml: 681082 735190 0,45

sICAM, pg/ml: 106340 117625 0,28

Los valores son medias geométricas

* indica media aritmética

Además, las diferencias observadas en los niveles de CCL5 siguieron siendo significativas después del análisis multivariante ajustando para los factores de riesgo de cardiovascular y niveles de sCD40L y CRP (P=0,023), mientras que los niveles de CCL18 fueron limítrofes significativos (P=0,06). Sin embargo, diferencias en los niveles de CCL18 alcanzaron significancia después del análisis multivariante para todos los factores confusos, excepto HDL (P=0,021). Por tanto, CCL5, además de CCL18, parecen ser factores pronósticos independientes de la aparición de síntomas isquémicos resistentes, incluso cuando se ajusta para niveles de sCD40L y CRP. Además, los niveles de CCL5 y CCL18 no mostraron correlación mutua (R=0,05; P=0,7), reflejando que estas quimiocinas están reguladas u operan de una manera independiente. Todavía, aunque no se observaron interacciones heterófilas significativas entre CCL5 y CCL18, es concebible que ambas quimiocinas, que comparten CCR3 como receptor de diana común, interaccionarán funcionalmente (Figuras 6 y 7). CXCL10 tuvo una tendencia a aumentar en pacientes estabilizados, aunque no fue bastante significativa (221,6 frente a 157,5 pg/ml; P=0,12), que podría indicar hacia un efecto protector de esta quimiocina específica. Los niveles de IFN-γ fueron simplemente indetectables y, por tanto, no se muestran.

A continuación, los presentes inventores buscaron evaluar si los niveles de CCL5 y CCL18 tenían potencial de diagnóstico. Dado el tamaño de la cohorte, los niveles de CCL5 y CCL18 se clasificaron en cuartiles y se analizaron para la correlación con la aparición de futuros síntomas isquémicos resistentes (Tabla 4A).

Tabla 4A. Niveles de cuartiles de CCL5 y CCL18 en el nivel inicial como se ha determinado por análisis múltiplex

Cuartiles CCL5 CCL18

1: < 15,1 < 39,3

2: > 15,1 y < 25,5 > 39,3 y < 66,0

3: > 25,5 y < 40,3 > 66,0 y < 130,0

4: > 40,3 > 130,0

Todos los valores son en ng/ml

Se observó que aumentó el riesgo de síntomas isquémicos resistentes en los cuartiles superiores de CCL5 (R=0,32; P=0,017; chi-cuadrado de asociación lineal por lineal 5,53; P=0,019), mientras que esta tendencia fue incluso más pronunciada para CCL18 (R=0,392; P=0,003; chi-cuadrado de asociación lineal por lineal 8,105; P=0,004) (Figura 2A). Niveles de CCL18 elevados fueron ligeramente más predictivos que aquellos de CCL5 como se indica por la

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curva de rendimiento diagnóstico (área bajo la curva 0,71 frente a 0,69). Los valores de corte de > 40 ng/ml para CCL5 y > 130 ng/ml para CCL18 dieron una sensibilidad del 73,9 % y 65,2 %, respectivamente, además de una especificidad del 67,7 % y 61,3 %. El análisis combinado de los dos cuartiles superiores de CCL5 y CCL18 para la aparición de síntomas isquémicos resistentes revelaron una relación muy significativa (χ2 con corrección de continuidad 8,12; P<0,01). Aunque la sensibilidad alcanzó el 47,8 %, la especificidad del análisis combinado fue un 90,3 % sorprendentemente alto. El valor predictivo positivo de análisis combinado para los niveles de CCL5 y CCL18 fue del 78,5 % con un valor predictivo negativo concomitante del 70,0 %. Añadir sCD40L o niveles de CRP al análisis no dio ningún aumento adicional en la sensibilidad, especificidad o valor predictivo (datos no mostrados).

Análisis de verificación y seguimiento de ELISA de CCL5 y CCL18

Se correspondieron excelentemente el ELISA medio e individual y los niveles de CCL5 múltiplex (P<0,001). Además, también se observaron que aumentaron los niveles en plasma de CCL5 en pacientes resistentes en comparación con estabilizados en el día 0 cuando se evaluaron por ELISA (36,4 frente a 26,5 ng/ml). De forma interesante, ya después de dos días, se observó una marcada disminución en los niveles de CCL5 en plasma en la cohorte completa (12,1 frente a 30,3 ng/ml; P<0,001) y también se observaron niveles de CCL5 reducidos a t=180, que muestra que CCL5 aumenta transitoriamente durante un evento de angina de pecho inestable (Figura 1B). Los presentes inventores no observaron ninguna diferencia entre los grupos estabilizados y resistentes 2 y 180 días después de la inclusión. Los niveles en plasma de CCL18 mostraron un patrón temporal diferente después de los síntomas isquémicos. El análisis de ELISA confirma la expresión diferencial de CCL18 en el día 0 entre pacientes resistentes y estabilizados (56,2 frente a 41,1 ng/ml; P=0,02). Aunque valores absolutos fueron ligeramente más bajos en el ELISA en comparación con el ensayo múltiplex, los análisis estadísticos revelaron una excelente correlación entre los dos ensayos (prueba de Spearman; P<0,001). De forma interesante, los niveles de CCL18 de la cohorte total en el día 2 no se diferenciaron de los niveles iniciales (día 0), sugiriendo que los niveles de CCL18 y CCL5 podrían ser regulados mediante mecanismos separados. A los 180 días, los niveles de CCL18 estuvieron significativamente desregulados por disminución en comparación con los valores del día 2 (48,4 frente a 34,5 ng/ml; P<0,001), que sugiere una función de CCL18 en los procedimientos relacionados con la isquemia-reperfusión cardíaca (Figura 1C).

Ligando CD40 soluble y CRP

Los niveles de tanto sCD40L, además de CRP, fueron significativamente elevados a t=0 en comparación con t=180 (sCD40L 2,04 frente a 0,69 ng/ml; P<0,001, CRP 2,36 frente a 0,96 mg/l; P<0,001) (Figura 1D,E). Sin embargo, los niveles de sCD40L empezaron a disminuir ya a t=2 (1,35 ng/ml; P<0,05), que indica que los niveles elevados en el nivel inicial reflejan una respuesta de fase aguda relacionada con la activación de plaquetas. Como los niveles de CD40L soluble a t=0 y t=2 se correlacionaron significativamente con los niveles de CCL5 a t=0 y t=2 (t=0 R=0,40; P<0,01, t=2 R=0,35; P=0,01), niveles de CCL5 elevados también pueden ser principalmente causados por activación de plaquetas. Sin embargo, sCD40L mostró una correlación negativa significativa con niveles de CCL18 a t=0 (R=0,36; P=0,01), sugiriendo que lo último representa una respuesta de retroalimentación a la activación de plaquetas. Los niveles de CRP fueron incluso adicionalmente elevados a t=2 (6,43 mg/l; P<0,001), que está de acuerdo con informes previos 15,16, y es supuestamente indicativo de un estado inflamatorio sistémico post-isquémico potenciado en estos pacientes dos días después de la isquemia y/o intervención coronaria. Niveles de CRP no mostraron correlaciones con niveles de CCL5 o CCL18. Los niveles de cuartiles de sCD40L, además de CRP, no tuvieron ningún potencial para predecir síntomas isquémicos resistentes (R=0,043 y R=-0,034; N.S) (Figura 2A: para la distribución de cuartiles, véase la Tabla 4B).

Tabla 2B. Niveles de cuartiles de CRP y sCD40L en el nivel inicial.

Cuartiles CRP mg/l sCD40L ng/ml

1: < 1,2 < 14,2

2: > 1,2 y < 2,6 > 14,2 y < 26,4

3: > 2,6 y < 6,5 > 26,4 y < 33,7

4: > 6,5 > 33,7

Todos los valores son en ng/ml

Inflamación y seguimiento clínico

El análisis de correlación para las quimiocinas con los parámetros inflamatorios sistémicos fibrinógeno, IL-6, PAI-1 y ESR no reveló asociación, excepto por una débil correlación entre los niveles de CXCL10 e IL-6 (R=0,29; P=0,02, otros datos no mostrados). Y, lo que es más importante, se observó que los niveles de cuartiles superiores iniciales de CCL5 como se han determinado por múltiplex se correlacionaron con la necesidad de procedimientos de revascularización en el plazo de los siguientes 18 meses (R=0,35; P=0,01). Además, niveles de cuartiles superiores iniciales de CCL18 se correlacionaron con la re-manifestación de angina de pecho inestable (API) durante la hospitalización (R=0,36; P=0,007), además de con la aparición de un síndrome coronario agudo (SCA) durante el

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periodo de seguimiento de 18 meses (R=0,31; P=0,02) (Figuras 2B-D). Niveles iniciales de sCD40L y CRP no se correlacionaron con ninguno de los parámetros de seguimiento (datos no mostrados).

Análisis de expresión de quimiocinas de CMSP y receptores de quimiocinas

Aunque la interacción de CCL5 con CCR1, CCR3, CCR4 y CCR5 está bien descrita, el actual receptor para CCL18 es hasta ahora desconocido, que hace de CCL18 actualmente un ligando huérfano 17. Sin embargo, se ha informado que CCL18 es un inhibidor competitivo de unión de CCL11 (eotaxina) a CCR3 18. Por tanto, los presentes inventores examinaron la expresión de ARNm de receptores de quimiocinas CCR1, CCR3, CCR4 y CCR5, además de la de CCL5 y CCL18 en CMSP. Los presentes inventores observaron una sorprendente regulación por disminución altamente significativa de los cuatro receptores de quimiocinas implicados en el nivel inicial (t=0) en comparación con CMSP a t=180 (Figura 3B). Se observó un patrón temporal similar para CCL5 y CCL18, siendo CCL5 abundantemente expresado en CMSP y CCL18 a solo niveles menores (Figura 3A). El posterior análisis de FACS para detectar la expresión de CCR3 y CCR5 en linfocitos T CD3+ y monocitos CD14+ reveló, para sorpresa de los presentes inventores, una elevada expresión significativa de proteínas de CCR3 y CCR5 en tanto células CD3+ como CD14+ a t=0 en comparación con t=180 (Figura 4A-D) (véase el comentario p. 28). La tinción triple para CD3 o CD14 con CCR3 y CCR5 mostró una elevada expresión de receptores de quimiocinas en la población CD3+ (3,1 % triple de células positivas a t=0 frente a 2,3 % a t=180; P=0,007) e incluso más prominentemente en las células CD14+ (32,1 % frente al 5,1 % a t=0 y t=180, respectivamente; P<0,001). Se observó un patrón idéntico para el porcentaje de células CCR3+ y CCR5+, además de las células CCR3+/CCR5+ combinadas en la población de CMSP total (Figura 4G-I).

Para evaluar si el patrón de expresión génica reducido en el nivel inicial fue producido por desplazamientos transitorios en el perfil de distribución de leucocitos, los presentes inventores han monitorizado el porcentaje total de células CD14+ (monocitos) y CD3+ (linfocitos T) en CMSP. Los números de monocitos no fueron diferentes entre los dos momentos de tiempo, mientras que las células CD3+ disminuyeron ligeramente a t=0 (54,2 frente a 66,6%; P=0,01) (Figura 8A) véase p. 28. Un estudio adicional no reveló diferencias en la relación de expresión de CCR2:CX3CR1, una medida de la distribución del subconjunto de monocitos 19, en CMSP también. Los presentes inventores observaron, sin embargo, niveles de expresión significativamente elevados de HNP-3, un marcador de neutrófilos selectivo, a t=0, que indica una liberación potenciada de neutrófilos durante API (Figura 8B) véase p. 28. Posiblemente, los cambios observados en la expresión de receptores de quimiocinas a t=0 pueden atribuirse al menos parcialmente a los elevados números de neutrófilos. A diferencia de los niveles en plasma de quimiocinas, no se observaron diferencias en el nivel de expresión para los receptores de quimiocinas entre pacientes estabilizados y resistentes a t=0 (datos no mostrados).

Ensayo de estimulación de CMSP

En parte, sin embargo, la regulación por disminución de receptores de quimiocinas puede reflejar una respuesta de retroalimentación al estallido inmunomodulador después de API. Para verificar si la regulación de expresión observada de CCR1, CCR3, CCR4 y CCR5 en CMSP está relacionada con los elevados niveles de CCL5 y CCL18 durante los eventos isquémicos, los presentes inventores estimularon CMSP con rCCL5 y/o sCCL18. Después de 6 horas de estimulación, los presentes inventores no observaron efecto diferencial sobre la expresión de ARNm de CCR1, CCR4 y CCR5. A diferencia, sin embargo, sCCL18 causó una espectacular regulación por disminución en la expresión de CCR3, y este efecto se amplificó adicionalmente por la co-incubación con rCCL5 (P<0,01, Figura 5A-D). Por tanto, la regulación por disminución de ARNm de CCR3 en CMSP observadas in vivo podría producirse por los elevados niveles de CCL18. La regulación por disminución de CCR1, CCR4 y CCR5 in vivo podría ser bien regulada por ligandos distintos de CCL5 y CCL18.

Discusión

A conocimiento de los presentes inventores, este es el primer estudio para describir el perfilado de un amplio panel de quimiocinas por ensayo múltiplex en plasma de pacientes con API de una manera prospectiva. De todas las quimiocinas probadas, se observó que solo los niveles de CCL5 y CCL18, independientes de otros marcadores inflamatorios y sCD40L, fueron transitoriamente elevados en pacientes resistentes frente a estabilizados en el nivel inicial y que disminuyeron en el plazo de 6 meses después de la aparición de los síntomas de API. Estos fenómenos fueron acompañados de una disminución brusca, probablemente inducida por CCL18, en la expresión de ARNm de los receptores de quimiocinas relacionados CCR3 y CCR5 en CMSP en el día 0 frente al día 180. Concomitantemente, se encontró que la expresión superficial de CCR3 y CCR5 aumentaba en el nivel inicial, reflejando posiblemente una rápida exposición del receptor por CMSP durante síntomas isquémicos. Tanto CCL5 como CCL18 también muestran características predictivas referentes al desenlace clínico.

El panel múltiplex contuvo diversas quimiocinas, que han sido previamente asociadas a la aterosclerosis o enfermedad cardiovascular, tales como CCL2, CCL5, CCL11, CXCL8 y CXCL10 5. CCL5 y CCL18 fueron las dos únicas quimiocinas que fueron diferencialmente reguladas al nivel inicial entre pacientes resistentes y estabilizados. Pacientes resistentes tuvieron graves quejas isquémicas sostenidas a pesar de la medicación antianginosa que garantizaba angiografía coronaria con o sin intervención coronaria percutánea. Por tanto, mientras que los niveles de otras quimiocinas que participan en CVD fueron relativamente inalterados y mientras que pacientes resistentes

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Referencias

1.: Bertrand ME, Simoons ML, Fox KA, Wallentin LC, Hamm CW, McFadden E, De Feyter PJ, Specchia G, Ruzyllo W. Management of acute coronary syndromes in patients presenting without persistent ST-segment elevation. Eur Heart J. 2002;23:1809-40.

2.: Hansson GK. Inflammation, Atherosclerosis, and Coronary Artery Disease. N Engl J Med. 2005;352:16851695.

3.: Charo IF, Taubman MB. Chemokines in the pathogenesis of vascular disease. Circ Res. 2004;95:858-66.

4.: Weber C. Platelets and chemokines in atherosclerosis: partners in crime. Circ Res. 2005;96:612-6.

5.: Kraaijeveld AO, de Jager SC, van Berkel TJ, Biessen EA, Jukema JW. Chemokines and Atherosclerotic Plaque Progression: Towards Therapeutic Targeting? Curr Pharm Des. 2007;13:1039-1052.

6.: Dewald O, Frangogiannis NG, Zoerlein M, Duerr GD, Klemm C, Knuefermann P, Taffet G, Michael LH, Crapo JD, Welz A, Entman ML. Development of murine ischemic cardiomyopathy is associated with a transient inflammatory reaction and depends on reactive oxygen species. Proc Natl Acad Sci USA. 2003;100:2700-5.

7.: Charo IF, Ransohoff RM. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. N Engl J Med. 2006;354:610-21.

8.: Damas JK, Boullier A, Waehre T, Smith C, Sandberg WJ, Green S, Aukrust P, Quehenberger O. Expression of fractalkine (CX3CL1) and its receptor, CX3CR1, is elevated in coronary artery disease and is reduced during statin therapy. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005;25:2567-72.

9.: Nomura S, Uehata S, Saito S, Osmni K, Ozeki Y, Kimura Y. Enzyme immunoassay detection of plateletderived microparticles and RANTES in acute coronary syndrome. Thromb Haemost. 2003;89:506-12.

10.: McDermott DH, Yang Q, Kathiresan S, Cupples LA, Massaro JM, Keaney JF, Jr., Larson MG, Vasan RS, Hirschhorn JN, O'Donnell CJ, Murphy PM, Benjamin EJ. CCL2 polymorphisms are associated with serum monocyte chemoattractant protein-1 levels and myocardial infarction in the Framingham Heart Study. Circulation. 2005;112:1113-20.

11.: de Lemos JA, Morrow DA, Sabatine MS, Murphy SA, Gibson CM, Antman EM, McCabe CH, Cannon CP, Braunwald E. Association between plasma levels of monocyte chemoattractant protein-1 and long-term clinical outcomes in patients with acute coronary syndromes. Circulation. 2003;107:690-5.

12.: de Jager W, te Velthuis H, Prakken BJ, Kuis W, Rijkers GT. Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin Diagn Lab Immunol. 2003;10:133-9.

13.: Verheggen PW, de Maat MP, Cats VM, Haverkate F, Zwinderman AH, Kluft C, Bruschke AV. Inflammatory status as a main determinant of outcome in patients with unstable angina, independent of coagulation activation and endothelial cell function. Eur Heart J. 1999;20:567-74.

14.: de Jager W, Prakken BJ, Bijlsma JW, Kuis W, Rijkers GT. Improved multiplex immunoassay performance in human plasma and synovial fluid following removal of interfering heterophilic antibodies. J Immunol Methods. 2005.

15.: Cusack MR, Marber MS, Lambiase PD, Bucknall CA, Redwood SR. Systemic inflammation in unstable angina is the result of myocardial necrosis. J Am Coll Cardiol. 2002;39:1917-23.

16.: Kennon S, Price CP, Mills PG, Ranjadayalan K, Cooper J, Clarke H, Timmis AD. The effect of aspirin on Creactive protein as a marker of risk in unstable angina. J Am Coll Cardiol. 2001;37:1266-70.

17.: Schutyser E, Richmond A, Van Damme J. Involvement of CC chemokine ligand 18 (CCL18) in normal and pathological processes. J Leukoc Biol. 2005;78:14-26.

18.: Nibbs RJ, Salcedo TW, Campbell JD, Yao XT, Li Y, Nardelli B, Olsen HS, Morris TS, Proudfoot AE, Patel VP, Graham GJ. C-C chemokine receptor 3 antagonism by the beta-chemokine macrophage inflammatory protein 4, a property strongly enhanced by an amino-terminal alanine-methionine swap. J Immunol. 2000;164:1488-97.

19.: Tacke F, Alvarez D, Kaplan TJ, Jakubzick C, Spanbroek R, Llodra J, Garin A, Liu J, Mack M, van Rooijen N, Lira SA, Habenicht AJ, Randolph GJ. Monocyte subsets differentially employ CCR2, CCR5, and CX3CR1 to accumulate within atherosclerotic plaques. J Clin Invest. 2007;117:185-94.

20.: Steppich BA, Moog P, Matissek C, Wisniowski N, Kuhle J, Joghetaei N, Neumann FJ, Schomig A, Ott I. Cytokine profiles and T cell function in acute coronary syndromes. Atherosclerosis. 2007;190:443-51.

21.: Parissis JT, Adamopoulos S, Venetsanou KF, Mentzikof DG, Karas SM, Kremastinos DT. Serum profiles of C-C chemokines in acute myocardial infarction: possible implication in postinfarction left ventricular remodeling. J Interferon Cytokine Res. 2002;22:223-9.

22.: Andre P, Nannizzi-Alaimo L, Prasad SK, Phillips DR. Platelet-derived CD40L: the switch-hitting player of cardiovascular disease. Circulation. 2002;106:896-9.

23.: Aukrust P, Muller F, Ueland T, Berget T, Aaser E, Brunsvig A, Solum NO, Forfang K, Froland SS, Gullestad L. Enhanced levels of soluble and membrane-bound CD40 ligand in patients with unstable angina. Possible reflection of T lymphocyte and platelet involvement in the pathogenesis of acute coronary syndromes. Circulation. 1999;100:614-20.

24.: Garlichs CD, Eskafi S, Raaz D, Schmidt A, Ludwig J, Herrmann M, Klinghammer L, Daniel WG, Schmeisser

A. Patients with acute coronary syndromes express enhanced CD40 ligand/CD154 on platelets. Heart. 2001;86:649-55.

25.: Nelson PJ, Kim HT, Manning WC, Goralski TJ, Krensky AM. Genomic organization and transcriptional regulation of the RANTES chemokine gene. J Immunol. 1993;151:2601-12.

26.: Weber C, Schober A, Zernecke A. Chemokines: key regulators of mononuclear cell recruitment in atherosclerotic vascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004;24:1997-2008.

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(Figura 14B). Como control para el modelo de IAM, se midieron niveles de la citocina IL-6 relacionada con isquemia16,17. Los niveles de IL-6 estuvieron significativamente regulados por incremento después de la ligadura (0,67 ± 0,26 en animales simulados frente a 1,34 ± 0,46 ng/ml en ligados; P=0,007, Figura 14A). Sorprendentemente, los niveles de CXCL10 estuvieron, a diferencia de los hallazgos MISSION!, significativamente potenciados después de IAM (157,3 ± 64,8 en animales con operación simulada en comparación con 310,6 ± 86,6 pg/ml en ligados; P=0,03) (Figura 14C). Además, se recogieron CMSP y se analizaron para la expresión de receptores de quimiocinas en diferentes subconjuntos de células. Como era de esperar, se potenció la población de linfocitos T total en la circulación después de la ligadura (14,1 ± 3,8 % en controles frente a 32,8 ± 14,4 % en ratones ligados; P=0,038), aunque no se observaron efectos en linfocitos T esplénicos (P=0,9, Figura 15A y D, respectivamente). Además, el número de tanto macrófagos circulantes, además de esplénicos, no estuvo regulado por lesión isquémica (datos no mostrados). Análisis más amplios de la población de linfocitos T reveló un enriquecimiento específico de linfocitos T CCR5+ (8,0 ± 2,0 % en controles en comparación con 11,4 ± 1,4 % en animales ligados; P=0,02) (Figura 15B). El enriquecimiento en linfocitos T CCR5+ circulatorios estuvo acompañado por una reducción en los linfocitos T CCR5+ esplénicos (19,95 ± 0,5 % frente a 14,1 ± 3,1 %; P=0,004) (Figura 15E). CCR3 es el receptor conocido para la quimiocina relacionada con CCL3 CCL4. Como CCL3 y CCL4 están normalmente co-regulados, los presentes inventores también analizaron CMSP y esplenocitos para la expresión de CCR3. Los números de linfocitos T CCR3+ circulantes fueron muy bajos. Los análisis mostraron un aumento ligero, aunque no significativo (P=0,24), en los linfocitos T CCR3+ circulantes (datos no mostrados). No fueron evidentes diferencias en los linfocitos T CCR3+ esplénicos (datos no mostrados). Tomados conjuntamente, estos datos sugieren una migración específica de CCL3 de linfocitos T de los órganos linfoides secundarios hacia el sitio de lesión isquémica. Además, también se determinó la expresión del receptor de quimiocinas CXC CXCR3 en los linfocitos T circulantes. En coincidencia con los potenciados niveles de CXCL10, el número de linfocitos T CXCR3+ circulantes fue significativamente elevado después de la ligadura de LAD (29,1 ± 1,9 % frente a 43,5 ± 5,7 %; P=0,04) (Figura 15C). Sin embargo, no fueron evidentes efectos sobre los linfocitos T esplénicos CXCR3+ (P=0,78) (Figura 15F).

Datos preliminares sugieren que los niveles de CCL3 no son predictivos del riesgo de futuros eventos cardiovasculares, pero también pueden estar causalmente implicados en el desarrollo de la enfermedad ya que el crecimiento de placas ateroscleróticas en el seno aórtico de ratones inactivados en el receptor de LDL hiperlipidémicos con una deficiencia de leucocitos en CCL3 es significativamente más bajo (-60 %) que aquél en ratones con producción de leucocitos normal de CCL3 (Figura 10).

Referencias

1.: Hansson GK. Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease. N Engl J Med. 2005;352:1685-95.

2.: Laing KJ, Secombes CJ. Chemokines. Dev Comp Immunol. 2004;28:443-60.

3.: Weber C. Novel mechanistic concepts for the control of leukocyte transmigration: specialization of integrins, chemokines, and junctional molecules. J Mol Med. 2003;81:4-19.

4.: Weber C, Schober A, Zernecke A. Chemokines: key regulators of mononuclear cell recruitment in atherosclerotic vascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004;24:1997-2008.

5.: Olson TS, Ley K. Chemokines and chemokine receptors in leukocyte trafficking. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2002;283:R7-28.

6.: Kraaijeveld AO, de Jager SC, van Berkel TJ, Biessen EA, Jukema JW. Chemokines and atherosclerotic plaque progression: towards therapeutic targeting? Curr Pharm Des. 2007;13:1039-52.

7.: Mause SF, von Hundelshausen P, Zernecke A, Koenen RR, Weber C. Platelet Microparticles. A Transcellular Delivery System for RANTES-Promoting Monocyte Recruitment on Endothelium. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005.

8.: Simeoni E, Winkelmann BR, Hoffmann MM, Fleury S, Ruiz J, Kappenberger L, Marz W, Vassalli G. Association of RANTES G-403A gene polymorphism with increased risk of coronary arteriosclerosis. Eur Heart J. 2004;25:1438-46.

9.: Boger CA, Fischereder M, Deinzer M, Aslanidis C, Schmitz G, Stubanus M, Banas B, Kruger B, Riegger GA, Kramer BK. RANTES gene polymorphisms predict all-cause and cardiac mortality in type 2 diabetes mellitus hemodialysis patients. Atherosclerosis. 2005.

10.: Frangogiannis NG. The role of the chemokines in myocardial ischemia and reperfusion. Curr Vasc Pharmacol. 2004;2:163-74.

11.: Tarzami ST, Miao W, Mani K, Lopez L, Factor SM, Berman JW, Kitsis RN. Opposing effects mediated by the chemokine receptor CXCR2 on myocardial ischemia-reperfusion injury: recruitment of potentially damaging neutrophils and direct myocardial protection. Circulation. 2003;108:2387-92.

12.: Liem SS, van der Hoeven BL, Oemrawsingh PV, Bax JJ, van der Bom JG, Bosch J, Viergever EP, van Rees C, Padmos I, Sedney MI, van Exel HJ, Verwey HF, Atsma DE, van der Velde ET, Jukema JW, van der Wall EE, Schalij MJ. MISSION!: optimization of acute and chronic care for patients with acute myocardial infarction. Am Heart J. 2007;153:14 e1-11.

14.: de Jager W, te Velthuis H, Prakken BJ, Kuis W, Rijkers GT. Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin Diagn Lab Immunol. 2003;10:133-9.

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