PT2197903E - Delecções no domínio ii da exotoxina a de pseudomonas que reduzem toxicidade não específica - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "DELEÇÕES NO DOMÍNIO II DA EXOTOXINA A DE PSEUDOMONAS QUE REDUZEM TOXICIDADE NÃO ESPECÍFICA"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Nos últimos anos foram desenvolvidos imunoconjugados como uma abordagem terapêutica alternativa para tratar doenças malignas. Os imunoconjugados eram originalmente compostos por um anticorpo conjugado quimicamente com uma toxina vegetal ou bacteriana, uma forma que é conhecida como imunotoxina. 0 anticorpo liga-se ao antigénio expresso na célula alvo e a toxina é internalizada causando morte celular por paragem da síntese de proteínas e indução de apoptose (Brinkmann, U., Mol. Med. Today, 2: 439-446 (1996)). Mais recentemente, genes codificando o anticorpo e a toxina foram fundidos e a imunotoxina expressa como uma proteína de fusão.

Uma variedade de toxinas vegetais, fúngicas e bacterianas tem sido adaptada para utilização com imunotoxinas, incluindo ricina, toxina da difteria, exotoxina A de Pseudomonas (PE) (Pastan, I. et ai., Annu. Rev. Med., 58: 221-237 (2007)). Imunotoxinas baseadas em PE estão actualmente em ensaios clínicos para o tratamento de linfomas e leucemias expressando CD22, bem como tumores sólidos expressando mesotelina (Kreitman, R., et al., J. Clin. Oncol. 23: 6719-6729 (2005); Hassan, R., Clin. Câncer Res. , 13: 5144-5149 (2007)). Tipicamente, a PE tem sido truncada ou mutada para reduzir a sua toxicidade não específica mantendo ao mesmo tempo a sua toxicidade para as células às quais é dirigida pela porção de direccionamento da imunotoxina. Ao longo dos anos, numerosas formas mutadas e truncadas de PE foram desenvolvidas. A usada na maioria dos ensaios clínicos até à data é a forma truncada de 38 kDa referida como "PE38". WO 2008/052322 descreve uma forma truncada da exotoxina A de Pseudomonas que consiste nos aminoácidos 252 a 608 ou uma variante desta.

Apesar destas décadas de esforços, as actuais imunotoxinas baseadas em PE não são ainda totalmente satisfatórias. Embora as imunotoxinas PE38 que alcançaram ensaios clínicos sejam comparativamente bem toleradas a doses baixas, as toxicidades limitativas da dose têm restringido o seu efeito terapêutico. Num ensaio clínico de fase I de uma imunotoxina baseada em PE conhecida como LMB-2, toxicidades limitativas da dose acima de 40 pg/kg dadas em dias alternados (QOD) *3 consistiram em elevação das transaminases, diarreia, cardiomiopatia e uma reacção alérgica (Kreitman, R.J. et al. J. Clin. Oncol. , 18: 1622- 1636 (2000)). Num ensaio clínico de fase I de uma imunotoxina anti-mesotelina, referida como SS1P, eventos adversos de pleurite, urticária e síndroma de vazamento vascular foram verificados como limitantes da dose (Hassan, R. et al. , Clin. Res. Cancelar, 13: 144-5149 (2007)). Num ensaio de fase I de uma terceira imunotoxina baseada em PE, BL22, toxicidades limitantes da dose incluíram vários casos de síndroma hemolítica urémica e uma síndroma de libertação de citocinas com síndroma de vazamento vascular sistémico (Kreitman, RJ et al., J. Clin. Oncol., 23: 6719-6729 (2005)).

Além disso, as imunotoxinas baseadas em PE actualmente em ensaios clínicos são altamente imunogénicas. Isto provou não ser um problema no tratamento de malignidades hematológicas, em que a capacidade do sistema imunitário para montar uma resposta está frequentemente comprometida. As imunotoxinas podem ser tipicamente administradas várias vezes a pacientes com doenças malignas hematológicas. Os pacientes com tumores sólidos, no entanto, desenvolvem geralmente anticorpos neutralizantes para imunotoxinas baseadas em PE em poucas semanas após a primeira administração. Uma vez que muitos protocolos exigem um período de três semanas entre a administração de imunotoxinas, o desenvolvimento dos anticorpos durante este período significa efectivamente que, para tumores sólidos, normalmente apenas pode ser feita uma única administração de uma imunotoxina baseada em PE antes dos anticorpos do paciente a tornarem ineficaz. Mesmo uma única administração de uma imunotoxina baseada em PE pode ser altamente útil na redução da carga tumoral do paciente, na eliminação de metástases mais pequenas, e no alívio dos sintomas, mas a capacidade para administrar doses múltiplas seria claramente útil.

Um número limitado de abordagens foi desenvolvido como uma tentativa de resolver estes problemas. Uma abordagem à redução da toxicidade não específica, redução do ponto isoeléctrico das regiões estruturais de Fv utilizadas como a porção de direccionamento de imunotoxinas, foi relatada no Pedido PCT No. PCT/US01/43602 em co-propriedade, publicado como Publicação Internacional No. WO 02/40545. Uma abordagem para reduzir a imunogenicidade é descrita no pedido PCT No. PCT/US06/028986 em co-propriedade, publicado como WO 2007/016150, que relata o mapeamento de vários epitopos de PE e mutações de resíduos de aminoácidos individuais que podem ser combinados para reduzir a imunogenicidade total da molécula de PE resultante em comparação com a de PE38. No entanto, seria desejável ter abordagens adicionais de redução da toxicidade limitante da dose da imunotoxina. Além disso, seria desejável ter métodos adicionais para reduzir a imunogenicidade de PE e de imunotoxinas em que PE actue como a porção tóxica. A presente invenção satisfaz estas e outras necessidades.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Num primeiro aspecto, a invenção proporciona uma exotoxina A de Pseudomonas (PE), mutada e isolada, compreendendo uma sequência de fórmula: R1n-FCS-R2n-R3n-domínio funcional III de PE, em que: n = 0 ou 1 independentemente para cada um de R1, R2 e R3; R1 = 1 a 10 resíduos de aminoácidos; FCS = uma sequência de clivagem de furina de resíduos de aminoácidos, cuja sequência é clivável por furina e tem uma extremidade ácida amino e uma extremidade carboxilo, em que a FCS: a) é representada pela fórmula P4-P3-P2-P1, em que P4 é um resíduo de aminoácido na extremidade amino, Pi é um resíduo de aminoácido na extremidade carboxilo, Pi é um resíduo de arginina ou lisina, e a referida sequência é clivável na extremidade carboxilo de Pi por furina; b) (i) compreende ainda os resíduos de aminoácidos representados por P6-P5 na referida extremidade amino, (ii) compreende ainda resíduos de aminoácidos representados por Pl'-P2' na referida extremidade carboxilo, (iii) e ainda em que Pi é um resíduo de arginina ou de lisina, P2' é triptofano, e P4 pode ser arginina, valina ou lisina, desde que se P4 não for arginina, então P6 e P2 são resíduos básicos, e (iv) a referida sequência é clivável na extremidade carboxilo de PI por furina; c) é seleccionada a partir de SEQ ID NO:12-20; d) é SEQ ID NO: 10, ou uma versão truncada desta compreendendo RQPR (SEQ ID NO:21); ou e) é SEQ ID NO: 11, ou uma versão truncada desta compreendendo RSKR (SEQ ID NO:26); R2 = 1 a 10 aminoácidos; e R3 = 1 ou mais resíduos contíguos dos resíduos 365-394 de SEQ ID NO:1; o domínio funcional III de PE sendo os resíduos 395-613 de SEQ ID NO:1, compreendendo opcionalmente (i) substituições em um ou mais resíduos correspondendo a 609-613 de SEQ ID NO:1, (ii) uma substituição de arginina por glicina, alanina, valina, leucina, ou isoleucina numa posição correspondendo à posição 490 de SEQ ID NO:1, (iii) uma substituição de um ou mais resíduos correspondendo a resíduos seleccionados a partir de D403, R412, R427, E431, R432, R458, D461, R467, R505, R513, E522, R538, E548, R551, R576, K590, e L597 de SEQ ID NO:1 por alanina, glicina, serina ou glutamina, cujo resíduos de SEQ ID NO:1 mantêm a imunogenicidade de um epitopo ou subepitopo do domínio III de PE, ou (iv) uma combinação de qualquer um de (i) (iii), em que a PE mutada não inclui os resíduos 1 a 273 e 285 a 364 de SEQ ID NO:1.

Num segundo aspecto, a invenção proporciona uma molécula quimérica compreendendo: (a), uma citocina, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, citocina, anticorpo ou fragmento de anticorpo esse que se liga especificamente a um antigénio ou receptor na superfície de uma célula, conjugado ou fundido com (b) uma PE mutada de acordo com qualquer forma de realização do primeiro aspecto da invenção 5.

Nalgumas formas de realização, a FCS pode ser representada pela fórmula P4-P3-P2-P1 (SEQ ID NO:36), em que P4 designa a extremidade amino, Pi designa a extremidade carboxilo, Pi é um resíduo de arginina, e a sequência é clivável na extremidade carboxilo de Pi por furina. Nalgumas formas de realização, a FCS (i) compreende ainda resíduos de aminoácidos representados por P6-P5 na referida extremidade amino, (ii) compreende ainda resíduos de aminoácidos representados por Pl'-P2' na referida extremidade carboxilo, (iii) além de que PI é um resíduo de arginina, P2' é triptofano, e P4 pode ser arginina, valina ou lisina, desde que se P4 não for arginina, então P6 e P2 são resíduos básicos, e (iv) a referida sequência é clivável na extremidade carboxilo de Pl por furina. Nalgumas formas de realização, a FCS é SEQ ID NO:10. Nalgumas formas de realização, o domínio funcional III de PE consiste na sequência de resíduos 395 a 613 de SEQ ID NO:1. Nalgumas formas de realização, a PE mutada compreende um ou mais resíduos contíguos dos resíduos 365-394 de SEQ ID NO:1 entre a referida FCS e o referido domínio III de PE. Nalgumas formas de realização, "n" é 0 para Rl, R2, e R3. Nalgumas formas de realização, o ligando é um anticorpo ou fragmento deste que mantém a capacidade de reconhecimento do antigénio.

Num terceiro aspecto a invenção proporciona uma molécula quimérica para utilização em inibição do crescimento de uma célula alvo possuindo um exterior, a referida molécula quimérica compreendendo: (a) uma citocina, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, cuja citocina, anticorpo ou fragmento de anticorpo se liga especificamente a um antigénio ou receptor no exterior da referida célula, e é conjugado ou fundido com (b) uma PE mutada de acordo com qualquer forma de realização do primeiro aspecto da invenção.

Nalgumas formas de realização, a FCS pode ser representada pela fórmula P4-P3-P2-P1 (SEQ ID NO:36), em que P4 designa a extremidade amino, PI designa a extremidade carboxilo, PI é um resíduo de arginina, e a referida sequência é clivável na extremidade carboxilo de PI por furina. Nalgumas formas de realização, a FCS (i) compreende ainda resíduos de aminoácidos representados por P6-P5 na referida extremidade amino, (ii) compreende ainda resíduos de aminoácidos representados por Pl'-P2' na referida extremidade carboxilo, (iii) além de que PI é um resíduo de arginina, P2 ' é triptofano, e P4 pode ser arginina, valina ou lisina, desde que se P4 não for arginina, então P6 e P2 são resíduos básicos, e (iv) a referida sequência é clivável na extremidade carboxilo de PI por furina. Nalgumas formas de realização, a FCS é SEQ ID NO:10. Nalgumas formas de realização, o domínio funcional III de PE consiste na sequência de resíduos 395 a 613 de SEQ ID NO:1. Nalgumas formas de realização, a PE mutada compreende um ou mais resíduos contíguos dos resíduos 365-394 de SEQ ID NO:1 entre a referida FCS e o referido domínio III de PE. Nalgumas formas de realização, o ligando é um anticorpo ou fragmento deste que mantém a capacidade de reconhecimento do antigénio.

Num quarto aspecto, a invenção proporciona um ácido nucleico isolado, o referido ácido nucleico codificando uma PE mutada de acordo com qualquer forma de realização do primeiro aspecto da invenção.

Nalgumas formas de realização, a FCS pode ser representada pela fórmula P4-P3-P2-P1 (SEQ ID NO.:36), em que P4 designa a extremidade amino, PI designa a extremidade carboxilo, PI é um resíduo de arginina, e a referida sequência é clivável na extremidade carboxilo de PI por furina. Nalgumas formas de realização, a FCS (i) compreende ainda resíduos de aminoácidos representados por P6 P5 na referida extremidade amino, (ii) compreende ainda resíduos de aminoácidos representados por Pl' P2' na referida extremidade carboxilo, (iii) além de que Pl é um resíduo de arginina, P2 ' é triptofano, e P4 pode ser arginina, valina ou lisina, desde que se P4 não for arginina, então P6 e P2 são resíduos básicos, e (iv) a referida sequência é clivável na extremidade carboxilo de Pl por furina. Nalgumas formas de realização, a FCS é SEQ ID NO:10. Nalgumas formas de realização, o domínio III de PE consiste na sequência de resíduos 395 a 613 de SEQ ID NO:1. Nalgumas formas de realização, o ácido nucleico codifica ainda um ligando que se liga especificamente a um antigénio ou receptor à superfície de uma célula, cujo ligando é fundido directamente ou através de um ligador peptídico à referida PE. Nalgumas formas de realização, o ligando é um anticorpo ou uma porção deste que mantém a capacidade de ligação ao antigénio.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figuras IA e 1B. A Figura IA é uma representação esquemática da estrutura da imunotoxina anti-CD22 conhecida como "HA22". HA22 compreende um fragmento de anticorpo Fv anti-CD22 ligado por dissulfureto (VH/VL) unido de forma recombinante a uma truncagem citotóxica de 38 kDa de exotoxina A de Pseudomonas ("PE", a truncagem de 38 kDa é conhecida na técnica como "PE38"). PE38 é criada através de deleção da sequência de 613 resíduos de aminoácidos dos resíduos 1-252 da PE nativa, que correspondem ao domínio I, juntamente com os resíduos 365-380 do domínio Ib. A Figura 1B mostra a sequência dos domínios II (resíduos 251-364) e Ib (resíduos 365-394) de PE38 (SEQ ID NO:4) . A numeração dos resíduos é baseada na sequência de aminoácidos da PE nativa. Os resíduos 365 a 380 da PE nativa (em caixa) foram suprimidos na geração de PE38. Os locais de clivagem de proteases lisossómicas são indicados pelas setas adjacentes para a designação da sua banda correspondente a partir da análise de SDS-PAGE. Os locais de clivagem de proteases lisossómicas ocorrem entre os resíduos 260-261, 265-266, 297-298, 341-342, 342-343, 351-352, 352-353, 353-354, 364-381, 390-391, e 391-392. O local de clivagem da furina (279-280) também é indicado. A sequência sensível a furina de 11 resíduos no domínio II de HA22-LR está sombreada.

Figura 2. A Figura 2 é um diagrama esquemático da estrutura do mutante de HA22 "JW008". JW008 é uma forma de HA22 que tem as mesmas truncagens de PE38 como HA22 LR, mas em que a sequência nativa da sequência clivável por furina dos resíduos 274-284 foi alterada através de substituições de dois resíduos (SEQ ID NO: 11).

Figura 3. A Figura 3 mostra desenhos esquemáticos de HA22 e de uma série de variantes nas quais foram introduzidas deleções nos domínios II e Ib do componente PE38 de HA22 para eliminar locais de clivagem de proteases lisossómicas. Estas cinco proteínas mutantes (Ml, M2, M3, M4, e M5) são ilustradas usando uma visão ampliada dos domínios II e Ib de PB38 para mostrar a extensão das deleções (linhas pontilhadas) e a presença em M3 e M4 de uma mutação pontual C287S. A numeração dos resíduos baseia-se na localização de aminoácidos na PE nativa. As proteínas foram subsequentemente purificadas e comparadas com HA22 utilizando um ensaio de citotoxicidade in vitro em células Raji. A proteína M5 é também aqui referida como "HA22-LR" (SEQ ID NO: 10) . A IC50 (ng/ml) de cada mutante em relação à IC50 de HA22 é apresentada como uma média de pelo menos três experiências separadas.

Figura 4. HA22-LR é resistente à digestão com extractos lisossómicos. HA22 e HA22-LR foram incubadas com extractos lisossómicos de células Raji sob condições idênticas. Após a adição de extracto lisossómico, foram retiradas imediatamente amostras (0), após 30 minutos, e após 1, 2, 4, 8, e 24 h, em seguida analisadas através de SDS-PAGE redutor. As setas indicam as bandas de Vl, Vh-PE38 (HA22) e Vh~PE25 (HA22-LR) que compõem as imunotoxinas maduras.

Figura 5. Farmacocinética de HA22-LR. Ratinhos Balb/c foram injectados intravenosamente com 10 pg de qualquer uma de HA22 (□) ou HA22-LR (o) e sangrados a vários intervalos entre 2 e 60 minutos a partir do momento da injecção. A concentração de imunotoxina no soro nos vários intervalos foi determinada por ELISA e ajustada a uma única função exponencial de decaimento. A semivida correspondente (ti/2) é indicada. Cada ponto é a concentração de imunotoxina no soro de um ratinho, e a concentração a cada intervalo de tempo foi determinada a partir de pelo menos dois ratinhos diferentes.

Figura 6. HA22-LR tem potente actividade antitumoral.

Ratinhos SCID xenoenxertados com tumores CA46 foram tratados QOD x3 (nos dias 6, 8, e 10) por via intravenosa com PBS (x; linha continua), HA22 a 0,3 mg/kg (o; linha continua), ou HA22-LR a 1,0 (A; linha tracejada), 1,75 (□; linha continua), ou 2,5 (*; linha tracejada) mg/kg. As setas indicam os dias em que o tratamento foi administrado. O tamanho do tumor foi medido ao longo de 40 dias. Os pontos representam o tamanho médio do tumor de todos os ratinhos no grupo de tratamento. As barras de erro mostram um intervalo de confiança de 95% de cada valor médio.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

INTRODUÇÃO

Nos últimos vinte anos, a exotoxina A de Pseudomonas ("PE") tem sido intensamente estudada para utilização como a porção tóxica de toxinas direccionadas, tais como imunotoxinas. A forma mais comum de PE utilizada em toxinas direccionadas tem sido uma forma de 38 kDa conhecida como PE38, em que a totalidade do domínio I da toxina foi suprimida, juntamente com os resíduos 365-379 do domínio Ib. PE38 contém a totalidade dos domínios II e III da toxina. O domínio II de PE tem uma sequência reconhecida e clivada por uma enzima conhecida como furina, que está presente em células animais. As PE contendo a sequência de clivagem de furina sofrem processamento proteolitico no interior das células alvo, activando a actividade citotóxica da toxina. Algumas formas de PE desenvolvidas no passado tentavam aumentar a actividade, através da eliminação da porção do domínio II a montante do local de clivagem de furina, na esperança de que isto eliminasse a necessidade de processamento proteolítico no interior das células alvo.

Surpreendentemente, descobrimos agora que podem ser produzidas formas de PE através da inversão de algumas das estratégias anteriormente utilizadas para desenvolver PE para uso em toxinas direccionadas, e que estas novas formas de PE têm vantagens que não são proporcionadas pelas PE anteriores. Mais surpreendentemente, estas novas formas de PE retêm uma excelente actividade citotóxica e têm muito menos toxicidade não específica em utilização in vivo. Esta diminuição da toxicidade permite que sejam administradas doses muito mais elevadas, com um aumento concomitante da actividade antitumoral.

Nas novas formas de PE, suprimimos os resíduos restantes do domínio Ib (para além dos que são necessários para uma boa actividade de ribosilação de ADP), o que se pensou ser útil para facilitar a translocação eficaz da toxina na célula alvo após activação proteolítica. Em segundo lugar, eliminámos todo o domínio II excepto a sequência de clivagem de furina. A eliminação da maior parte do domínio II e de todo o domínio Ib proporciona moléculas de PE com numerosas vantagens sobre as formas de PE anteriormente disponíveis. Em primeiro lugar, tanto o domínio Ib como o domínio II contêm epitopos que aumentam a imunogenicidade global da PE. Ao eliminar todo o domínio II excepto o local de clivagem de furina e a porção do domínio Ib anteriormente incluída mesmo em PE truncadas, tanto os epitopos lineares como conformacionais presentes nos domínios são eliminados, reduzindo a imunogenicidade da PE resultante em comparação com as formas da toxina que estavam anteriormente disponíveis.

Em segundo lugar, o tamanho global da toxina é reduzido. As formas exemplares estudadas no decurso do presente trabalho tinham um peso molecular de 25 kDa, e, por conseguinte, representam uma diminuição de cerca de 13 kDa do tamanho da forma mais comum de PE actualmente em uso, PE38. Moléculas menores podem ser capazes de penetrar mais profundamente nos tumores sólidos, e, portanto, tem geralmente sido considerado desejável desenvolver formas menores da toxina para utilização contra tumores sólidos. 0 menor tamanho das PE da invenção em comparação com as anteriormente disponíveis sugere que estas se mostrarão úteis no tratamento, tanto de tumores sólidos, em que o menor tamanho da toxina pode facilitar a penetração no tumor, como no tratamento de malignidades hematológicas, em que o tamanho da toxina é de menor importância. Além disso, as PE são utilizadas como as porções tóxicas de toxinas dirigidas a células alvo diferentes das células tumorais. As toxinas mais pequenas da invenção devem ser úteis também no contexto destas células alvo.

Em terceiro lugar, e surpreendentemente, ensaios in vivo mostraram que imunotoxinas produzidas com as toxinas resultantes retiveram boa citotoxicidade para a maioria das células alvo, ao mesmo tempo que possuem marcadamente menos toxicidade não específica num modelo animal que a imunotoxina comparável produzida com PE38. De facto, ao mesmo tempo que ratinhos portadores de tumores de xenoenxertos de uma malignidade hematológica humana mostraram uma resposta completa quando injectados com a imunotoxina várias vezes a 2,5 mg/kg, não morreu nenhum ratinho quando injectados com a imunotoxina várias vezes a 5,0 mg/kg (o equivalente a 100 mg por dose). Em comparação, a LD50 de HA22 em ratinhos é de aproximadamente 1,3 mg/kg. Estes resultados mostram que os ratinhos podem tolerar doses das novas imunotoxinas mais de 3 vezes maiores que a de uma imunotoxina produzida com PE38, mas podem tolerar doses de pelo menos o dobro do necessário para induzir uma resposta completa.

Em quarto lugar, algumas formas anteriores de PE em que uma porção do domínio II foi suprimida eliminaram o local de clivagem da furina. Isto eliminou a necessidade de clivagem intracelular por furina, mas também tornou mais difícil conceber uma molécula funcional. Tipicamente, o anticorpo foi ligado ao domínio III de PE, e tendeu a permanecer associado à porção PE dentro da célula. Em moléculas quiméricas utilizando PE da presente invenção, o anticorpo ou outra porção de direccionamento pode ser ligado a montante do local de clivagem da furina e pode ser clivado do domínio III de PE uma vez dentro da célula.

Foram conduzidos estudos tanto in vitro como in vivo numa PE exemplar da invenção para comparar os seus efeitos quando tornada numa imunotoxina semelhante a uma imunotoxina produzida com PE38. A imunotoxina exemplar escolhida para comparação é uma imunotoxina conhecida como HA22, que emprega um anticorpo anti-CD22 fundido com PE38. Comparações foram feitas entre uma imunotoxina em que o anticorpo utilizado em HA22 foi fundido com uma das novas PE como a toxina (por conveniência, esta construção será referida como "HA22-LR", com "LR" referindo-se à resistência do componente PE modificado a degradação lisossómica) para HA22 (em que o mesmo anticorpo é fundido com PE38). Em estudos in vitro, a imunotoxina produzida com a nova PE tinha aproximadamente a mesma citotoxicidade que HA22 contra células de várias linhas celulares que expressam CD22. Em estudos in vivo num modelo animal, estimou-se que a imunotoxina HA22-LR era menos citotóxica que HA22, a imunotoxina produzida com PE38. A nova imunotoxina, no entanto, teve também uma toxicidade não especifica significativamente reduzida, e pode ser tolerada pelos ratinhos a doses muito mais elevadas do que HA22, aumentando assim o efeito anti-tumoral do tratamento e permitindo uma maior janela terapêutica entre a dose máxima tolerada e a necessária para induzir uma resposta completa.

Foram produzidas várias imunotoxinas utilizando diferentes anticorpos ou outros ligandos como porção de direccionamento, mas utilizando uma PE como porção toxina. Sabe-se que, em alguns casos, a porção de direccionamento pode ter alguma contribuição para a toxicidade não especifica de uma imunotoxina. Ver, p. ex., Pedido PCT No. PCT/US01/43602 em co-propriedade, publicado como Publicação Internacional No. WO 02/40545, que relata que a toxicidade não especifica de algumas imunotoxinas pode ser reduzida através da redução do ponto isoeléctrico das regiões estruturais dos Fv utilizados como a porção de direccionamento. Tornou-se também claro, no entanto, que, em imunotoxinas e outras moléculas quiméricas utilizando PE como porção toxina, o principal contribuinte para a toxicidade não especifica é o componente PE. Assim, espera-se que resulte também uma toxicidade não especifica reduzida semelhante à observada em relação à imunotoxina HA22-LR nos estudos aqui relatados quando as PE da invenção forem utilizadas como porção toxina de moléculas quiméricas utilizando como porção de direccionamento anticorpos diferentes do anticorpo utilizado em HA22 como porção de direccionamento ou outros ligandos como porção de direccionamento.

Foram realizados estudos da citotoxicidade de uma imunotoxina produzida utilizando um anticorpo diferente, SS1, que reconhece e se liga a mesotelina, um antigénio presente nas células de vários cancros. 0 anticorpo SS1, é descrito em, p. ex. , Patente U.S. No. 7,081,518, e uma imunotoxina compreendendo SS1 fundido com PE38 (a imunotoxina é referida como "SS1P") foi testada num ensaio clinico de Fase I. Uma imunotoxina foi produzida utilizando o anticorpo SS1 como porção de direccionamento e a forma de PE utilizada em HA22-LR ("PE-LR") como a porção toxina e as duas imunotoxinas, SN1P e SS 1-PE-LR foram testadas quanto à sua citotoxicidade contra várias linhas celulares expressando mesotelina. As duas imunotoxinas tinham uma actividade comparável contra várias linhas celulares. A imunotoxina SS1-PE-LR não tinha actividade notavelmente mais baixa contra algumas linhas celulares em comparação com SS1P. Isto indica que, tal como a maioria dos agentes terapêuticos, nem todos os cancros dos pacientes ou outras células de interesse serão susceptiveis a tratamento com uma imunotoxina utilizando uma PE-LR como porção toxina. Se o crescimento de células de qualquer tipo de cancro em particular ou outras células alvo de interesse pode ser inibido, pode ser facilmente determinado através de meios padrão, tais como através da tomada de uma biopsia de células, contacto das células com a imunotoxina contendo PE-LR, e determinação de se a imunotoxina inibe o crescimento do cancro ou outras células alvo na extensão desejada.

Além disso, são conhecidos vários meios para aumento da citotoxicidade da PE através da alteração de resíduos no domínio III da sequência nativa. Estudos do laboratório dos presentes inventores ao longo de uma década determinaram que podem ser usadas certas sequências de aminoácidos e repetições destas sequências em vez da sequência nativa dos resíduos 609-613 de PE para aumentar a citotoxicidade da PE resultante em comparação com a PE produzida com a sequência nativa (a sequência nativa dos resíduos 609-613 e mutações específicas que aumentam a citotoxicidade são discutidas em mais detalhe abaixo na secção intitulada "exotoxina A de Pseudomonas"). Mais recentemente, trabalho do laboratório dos presentes inventores indicou que uma substituição de arginina presente na posição 490 da sequência de PE nativa por glicina, alanina, valina ou outros resíduos aumentaria a citotoxicidade, sendo a substituição da arginina por alanina particularmente vantajosa. Ver, p. ex. Pedido de Patente Publicado U.S. 2007/0189962; Bang et al., Clin. Câncer Res., 11: 1545-1550 (2005) . Embora se espere que as PE da invenção utilizando a sequência do domínio III nativo sejam úteis em si mesmas, se desejado a citotoxicidade da PE pode ser aumentada através da utilização de uma ou mais destas substituições ou mutações. Qualquer substituição ou mutação particular pode ser testada para determinar se mantém citotoxicidade adequada para utilização in vitro e se tem uma toxicidade não específica suficientemente baixa para utilização in vivo, utilizando ensaios conhecidos na técnica, incluindo os expostos nos Exemplos.

Além disso, trabalho anterior do laboratório dos presentes inventores mapeou a presença de epitopos ou subepitopos no domínio III. A ligação de anticorpos que reconhecem estes epitopos pode ser reduzida ou eliminada através de substituições dos resíduos normalmente presentes em certas posições. Tal como apresentado no Pedido de Patente Publicado U.S., a ligação destes anticorpos pode ser reduzida através da substituição por uma alanina, glicina, serina ou glutamina de um resíduo de aminoácido correspondendo a um resíduo de aminoácido de SEQ ID NO:1 seleccionado a partir do grupo que consiste em D403, R412, R427, E431, R432, R458, D461, R467, R505, R513, E522, R538, E548, R551, R576, K590 e L597. Uma vez que a presença destes resíduos antes da sua substituição mantém um epitopo ou subepitopo no domínio III, para facilidade de referência, os resíduos nestas posições podem ser referidos como "mantendo" a imunogenicidade dos seus respectivos epitopos ou subepitopos, embora a sua substituição com alanina ou afins reduza a imunogenicidade do domínio III da PE resultante do epitopo ou subepitopo nativo. Espera-se que as PE da invenção utilizando a sequência nativa do domínio III sejam úteis por si próprias, portanto, se desejado, podem ser feitas substituições de um ou mais dos resíduos identificados acima para reduzir ainda mais a imunogenicidade das PE da invenção. Qualquer substituição ou mutação particular pode ser testada para determinar se ela mantém a citotoxicidade adequada para uso in vitro ou in vivo utilizando ensaios conhecidos na técnica, incluindo os expostos nos Exemplos.

Em formas preferidas, o agente de direccionamento das moléculas quiméricas, tais como imunotoxinas, em que as PE da invenção sao utilizadas não são o factor de crescimento transformante α ("TGFa").

FURINA E SEQUÊNCIAS CLIVÁVEIS POR FURINA

Tal como relatado por Duckert et al. . "Protein Engineering", Design & Selection 17(1): 107-112 (2004) (adiante, "Duckert et al."), a furina é uma enzima numa "família de serina-proteases dependentes de Ca2+ dibásicas e monobásicas especificas evolutivamente conservadas chamadas convertases da proproteína semelhante a substilisina/quexina". Id. , na pág. 107. A furina, também conhecida como "enzima de clivagem de aminoácidos básicos emparelhados" ou "PACE", é um dos sete membros da família de mamífero e está envolvida no processamento de várias proteínas humanas endógenas. Ver, na generalidade, p. ex., Thomas G. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., (10): 753-66 (2002). É uma proteína associada à membrana verificada principalmente na rede trans-Golgi. A sequência de furina humana é conhecida desde o início dos anos 1990. Ver, p. ex., Hatsuzawa, K. et al., J. Biol. Chem., 267: 16094-16099 (1992): Molloy, S. et al. J. Biol. Chem., 267: 16396-16402 (1992) . O local de clivagem mínimo da furina é, no código de uma letra para os resíduos de aminoácidos, R-X-X-R (SEQ ID NO:6), com a clivagem a ocorrer após o segundo "R". Duckert et al. resume a informação disponível sobre as sequências de 38 proteínas relatadas na literatura como tendo locais de clivagem de furina, incluindo proteínas de mamífero, proteínas de bactérias patogénicas e proteínas virais. Relata que 31, ou 81%, dos motivos de clivagem revistos tinham a sequência de consenso R-X-[R/K]-R (SEQ ID NO:7), dos quais 11, ou 29%, tinham R-X-R-R (SEQ ID NO:8), e 20, ou 52%, eram R-X-K-R (SEQ ID NO: 9) . Três dos motivos de clivagem continham apenas a sequência de clivagem mínima. Duckert et ai. alinhou ainda os motivos e identificou os resíduos verificados em cada posição em cada furina tanto para o próprio motivo de clivagem como para os resíduos circundantes. A Fig. IA de Duckert et al. mostra através do tamanho relativo os resíduos mais frequentemente verificados em cada posição. Por convenção, os resíduos rodeando o local de clivagem de furina são numerados a partir da ligação físsil (que é tipicamente indicada pelo símbolo " j.") . Contando para o terminal N, os resíduos substrato são designados Pl, P2 e assim por diante, enquanto contando para terminal C, os resíduos são designados, Pl', P2 ' , e assim por diante. Ver, p. ex., Rockwell, N.C., e J.W. Thorner, Trends Biochem. Sei., 29: 80-87 (2004), Thomas G., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 3: 753- 766 (2002). Assim, seguindo a convenção, a seguinte sequência pode ser usada para alinhar e numerar os resíduos da sequência de clivagem mínima e os resíduos circundantes: P6-P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5', em que a sequência de clivagem de furina mínima é numerada como P4-P1. O alinhamento de Duckert et ai. de 38 sequências clivadas por furina identifica as variações permitidas dependendo dos resíduos presentes em várias posições. Por exemplo, se o resíduo em P4 não for um R, isso pode ser compensado por possuir resíduos de arginina ou lisina e P2 e P6. Id., na pág. 109.

Na PE nativa, a clivagem por furina ocorre entre arginina 279 e glicina 280 numa volta rica em arginina localizada no domínio II da toxina. A sequência de clivagem de furina nativa no domínio II de PE é exposta abaixo (com os números indicando as posições dos resíduos na sequência de 613 aminoácidos da PE nativa), e alinhada para mostrar a sua numeração sob a convenção acima referida: 274- RHRQPRGWEQL -284 (SEQ ID NO:10) P6-P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2-P3'-P4'-P5'

Em estudos subjacentes à presente invenção, foram efectuadas substituições nas posições P3 e P2 para formar a seguinte sequência, com as substituições sublinhadas: 274- RHRSKRGWEQL -284 (SEQ ID NO:11).

Esta sequência mostrou uma velocidade de clivagem mais rápida do que a da sequência nativa, e quando utilizada numa imunotoxina exemplar (referida como "JW008" por conveniência de referência) resultou numa citotoxicidade para células alvo aproximadamente igual à da sequência nativa.

Com base neste e nos nossos estudos prévios, a sequência de clivagem de furina usada para ligar a molécula de direccionamento ao domínio III de PE pode ser a sequência de clivagem de furina mínima, R-X-X-R (SEQ ID NO:6), ou qualquer uma das outras sequências de clivagem de furina conhecidas na técnica ou permitidas pela Fig. IA de Duckert et al. com a condição de que, se existir um resíduo presente na posição identificada como P2' , este deve ser triptofano ou, se não triptofano, não deve ser valina ou alanina. Por exemplo, nalgumas formas de realização, a sequência pode ser RKKR (SEQ ID NO:12), RRRR (SEQ ID NO:13), RKAR (SEQ ID NO:14), SRVARS (SEQ ID NO:15), TSSRKRRFW (SEQ ID NO:16), ou ASRRKARSW (SEQ ID N0:17).

Tal como observado em Duckert et al. , um resíduo menos favorável que R (principalmente valina) pode ser utilizado na posição P4 se compensado por resíduos de arginina ou lisina nas posições P2 e P6, de modo a que pelo menos dois dos três resíduos em P2, P4 e P6 sejam básicos. Assim, nalgumas formas de realização, a sequência clivável de furina é RRVKKRFW (SEQ ID NO:18), RNVVRRDW (SEQ ID NO:19), ou TRAVRRRSW (SEQ ID NO:20) . 0 resíduo na posição PI pode ser a arginina presente na sequência nativa, ou lisina. Assim, uma lisina pode substituir a arginina na posição PI em, por exemplo, qualquer uma das sequências expostas acima.

Nalgumas formas de realização, a sequência da sequência clivável de furina segue a sequência da sequência de clivagem de furina de PE: R-H-R-Q-P-R-G-W-E-Q-L (SEQ ID NO:10) ou uma versão truncada da sequência nativa, desde que contenha a sequência de clivagem de furina mínima e seja clivável por furina. Assim, nalgumas formas de realização, a sequência clivável por furina pode ser R-Q-P-R (SEQ ID NO:21), R-H-R-Q-P-R-G-W (SEQ ID NO:22), R-H-R-Q-P-R-G-W-E (SEQ ID NO:23), H-R-Q-P-R-G-W-E-Q (SEQ ID NO:24), ou R-Q-P-R-G-WE (SEQ ID NO:25). Nalgumas formas de realização, a sequência é R-H-R-S-K-R-G-W-E-Q-L (SEQ ID NO:11), ou uma versão truncada desta sequência, desde que contenha a sequência de clivagem de furina mínima e seja clivável por furina. Assim, nalgumas formas de realização, a sequência clivável por furina pode ser R-S-K-R (SEQ ID NO:26), R-H-R-S-K-R-G-W (SEQ ID NO:27), H-R-S-K-R-G-W-E (SEQ ID NO:28), R-S-K-R-G-W-E-Q-L (SEQ ID NO:29), H-R-S-K-R-G-W-E-Q-L (SEQ ID NO:30), ou R-H-R-S-K-R (SEQ ID NO:31). Qualquer sequência clivável por furina particular pode ser facilmente testada produzindo-a numa imunotoxina com o anticorpo utilizado em HA22 e testando a imunotoxina resultante in vitro numa linha celular CD22+. Em formas de realização preferidas, as sequências cliváveis por furina não reduzem a citotoxicidade da imunotoxina resultante abaixo de 10% da citotoxicidade de HA22 quando HA22 é testada na mesma linha celular, e de preferência não reduzem a citotoxicidade da imunotoxina resultante abaixo de 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% ou mais da citotoxicidade de HA22 quando HA22 é testada na mesma linha celular, sendo mais preferido cada aumento percentual da citotoxicidade que aquela que o precede.

Se qualquer sequência particular é clivável por furina ou não, pode ser determinado através de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, se uma sequência é clivável por furina ou não, pode ser testado através da incubação da sequência com furina em tampão de furina (NaOAc 0,2 M (pH 5,5), CaCÍ2 5 mM) a uma razão molar de enzima:substrato de 1:10 a 25°C durante 16 horas. Estas condições foram previamente estabelecidas como óptimas para a clivagem por furina da PE. De preferência, a furina utilizada é furina humana. Furina humana truncada recombinante encontra-se comercialmente disponível, por exemplo, em New England Biolabs (Beverly, MA). Ver também, Bravo et ai., J. Biol. Chem., 269 (14): 25.830-25.837 (1994).

Por razões de clareza, note-se que a PE actualmente em utilização, tal como PE38 e PE40, compreende a sequência nativa de clivagem de furina, e essa sequência de clivagem da furina está ligada ao domínio III de PE. Ao contrário das PE da invenção, no entanto, a sequência de clivagem de furina de PE38 e PE40 não está ligada directamente ao domínio III destas PE; em vez disso, está ligada ao domínio III através de (a) 79 resíduos de domínio II no lado carboxilo do local de clivagem de furina (resíduos 285 a 364 do domínio II; por conveniência, estes resíduos serão referidos como os "resíduos carboxilo do domínio II"), mais (b) os resíduos 365-394 de SEQ ID NO:1, no caso de PE40, ou os resíduos 381-394 de SEQ ID NO:1, no caso de PE38. Tal como discutido mais adiante, embora o limite estrutural do domínio III de PE seja considerado começar no resíduo 405, a análise funcional mostrou que o domínio III requer que um segmento do domínio Ib mantenha actividade de ribosilação de ADP. Por conseguinte, o domínio funcional III é definido como resíduos 395-613 de PE, e é portanto preferido que as toxinas da invenção compreendam os resíduos 395-613 de PE, com certas variações permitidas descritas mais abaixo. Para facilidade de referência, as referências aqui a deleções do domínio Ib ou à inclusão opcional de alguns resíduos contíguos do domínio Ib referem-se à porção do domínio Ib que consiste nos resíduos 365-394, embora seja entendido que estruturalmente o domínio Ib compreende os resíduos 365 -399. A deleção dos resíduos 365-394 e dos resíduos constituindo o domínio II, excepto aqueles na sequência de clivagem de furina, é desejável, uma vez que as deleções eliminam quaisquer epitopos imunogénicos presentes nestas porções da molécula de PE. Nalgumas formas de realização, no entanto, o praticante pode desejar manter alguns ou todos os resíduos 381-394, normalmente verificados em PE38, ou manter 1-10 resíduos nas extremidades amino ou carboxilo, ou ambas, da sequência de clivagem de furina, com 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 e 1 resíduos de intervalo sucessivamente mais preferidos. Tipicamente, os resíduos em ambos os lados da sequência de clivagem de furina são os resíduos normalmente presentes na posição correspondente da PE (SEQ ID NO:1). Por exemplo, tal como observado acima, a sequência de clivagem de furina de PE é considerada terminar no resíduo 284. Se o médico desejar prolongar a sequência para o lado carboxilo em três resíduos, normalmente os resíduos escolhidos serão aqueles presentes nas posições 285-287 de SEQ ID NO:1. Assim, embora em formas de realização preferidas o termo "sequência de clivagem de furina" se refira a uma sequência de 4 a 11 resíduos de aminoácidos clivável por furina (tal como na sequência de clivagem de furina nativa de PE, exposta acima como SEQ ID NO:10), nalgumas formas de realização, faz referência a uma sequência compreendendo ainda 1-10 resíduos de aminoácidos posicionados nas extremidades amino ou carboxilo, ou ambas.

Como referido acima, em PE actualmente em utilização como porções tóxicas, tais como PE38 e PE40, a sequência de clivagem de furina é ligada ao domínio III através da sequência carboxilo (resíduos 285-364) do domínio II e através dos resíduos 365-394 (em PE40) ou através dos resíduos 381-394 (em PE38). Em contraste, nas PE da invenção, uma sequência de clivagem de furina (tal como SEQ ID NO:10, ou variantes truncadas ou modificadas desta) é ligada na sua extremidade carboxilo ao domínio III, sem possuir interpostos entre os dois alguns ou todos os resíduos carboxilo do domínio II, e de preferência sem possuir entre os dois alguns ou todos os resíduos 365-394.

As PE da invenção podem ser representadas pela fórmula definida no primeiro aspecto da invenção.

Nalgumas formas de realização, pelo menos num de R1, R2 e R3, n não é igual a 0. Tal como observado, nalgumas formas de realização preferidas, todos os resíduos 365-394 são suprimidos; assim, nestas formas de realização, no termo R3n, n=0. Do mesmo modo, nalgumas formas de realização, não existem resíduos no lado amino da FCS; nestas formas de realização, no termo R2n, n=0. Do mesmo modo, nalgumas formas de realização, não existem resíduos no lado carboxilo da FCS entre a FCS e os domínios de PE Ib ou III; nestas formas de realização, no termo R2n, n=0. Em formas de realização particularmente preferidas, o n em R2n, e R3n é igual a zero.

DEFINIÇÕES

As unidades, os prefixos, e os símbolos são indicados na sua forma aceite pelo Système International de Unites (SI) . Os intervalos numéricos são inclusivos dos números que definem o intervalo. A menos que indicado de outro modo, os ácidos nucleicos são escritos da esquerda para a direita no sentido de 5' para 3'; as sequências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita no sentido de amino para carboxilo. A exotoxina A de Pseudomonas ("PE") é uma proteína monomérica extremamente activa (peso molecular 66 kDa), segregada por Pseudomonas aeruginosa, que inibe a síntese de proteínas em células eucarióticas. A sequência de PE nativa (SEQ ID NO:1) é bem conhecida na técnica e é exposta, por exemplo, em SEQ ID NO:1 da Patente U.S. No. 5,602,095. O método de acção e a estrutura da PE, bem como as modificações resultantes em várias variantes de PE, são discutidas com algum detalhe numa secção destinada a este fim.

As mutações da PE são tipicamente descritas na técnica por referência ao resíduo de aminoácido presente numa determinada posição na sequência de 613 aminoácidos da PE nativa (SEQ ID NO:1). Esta convenção é seguida na presente divulgação. Se o resíduo de aminoácido presente numa determinada posição tiver sido substituído por outro resíduo, por oposição, por exemplo, a simplesmente ser suprimido como parte de uma truncagem da sequência nativa, é indicado expondo o resíduo presente na sequência nativa da PE, e o número da posição, seguido pelo resíduo de aminoácido com o qual o resíduo nativo foi substituído na mutação particular sob discussão. Assim, por exemplo, o termo "R490A" indicaria que "R" (arginina, no código padrão de uma letra) na posição 490 da sequência de PE nativa (SEQ ID NO:1) foi substituído por um "A" (alanina, no código padrão de uma letra) na PE mutada em discussão. Do mesmo modo, "K590Q" indicaria que a lisina normalmente presente na posição 590 da PE foi substituída com uma glutamina. O código padrão de uma letra para aminoácidos comuns é exposto abaixo.

O termo "domínio funcional III de PE" refere-se aos resíduos 395-613 da PE nativa (a sequência nativa é SEQ ID NO:1). Apesar dos limites estruturais do domínio III terem sido fixados nos resíduos 405-613, a análise funcional mostrou que o domínio III requer que um segmento do domínio Ib mantenha a actividade de ribosilação de ADP (Hwang, J. et al., Cell, 48: 129-136 (1987), Siegall, C.B. et al., J. Biol. Chem., 264: 14256-14261 (1989)). O domínio funcional III de PE é assim definido pelos resíduos 395-613 de PE (Kihara, A. e Pastan, I., Bioconjug. Chem., 5: 532-538 (1994)).

Uma variedade de agentes, tais como citocinas, são conhecidos são conhecidos por se ligarem a receptores específicos na superfície das células e podem ser utilizados para toxinas direccionadas para células possuindo tais receptores. Por exemplo, IL-13 tem sido usada como um agente para direccionar toxinas, incluindo formas de PE para células sobre-expressando o receptor de IL-13. Os anticorpos ligam-se a antigénios específicos e são um outro tipo de agente utilizado para direccionar toxinas para células alvo desejadas. 0 termo "ligando" é aqui utilizado para referir genericamente moléculas que se ligam especificamente a um receptor ou antigénio numa superfície de uma célula. Em formas preferidas, o termo engloba tanto citocinas como anticorpos ou fragmentos destes que retêm a capacidade de reconhecimento e ligação ao antigénio. Na forma mais preferida, o termo refere-se a anticorpos ou fragmentos destes que retêm a capacidade de reconhecimento e de ligação ao antigénio. 0 termo "toxina direccionada" refere-se a uma toxina que é direccionada a células desejadas por um ligando que se liga a receptores ou antigénios específicos presentes na superfície de tais células. 0 termo imunotoxinas refere-se a um subconjunto de toxinas direccionadas em que a toxina é direccionada para as células desejadas por um anticorpo ou fragmento deste. 0 factor de crescimento transformante a, ou "TGFa" é um factor de crescimento bem conhecido que na sua forma madura é uma proteína de 50 aminoácidos de 5,5 kDa. Ver, p. ex., Brown, "The epidermal growth factor/transforming growth factor-α family and their receptors". Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 7: 914-922 (1995); Soler C., e Carpenter G., Thomson A.W., ed. "The epidermal growth factor (EGF) family". "The Citocina Handbook", 3a ed., San Diego, CA, (páginas 194-197) (1998) . TGF α recombinante humano está comercialmente disponível em, por exemplo, Sigma-Aldrich (catalog no. T7924, Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO).

Por conveniência de referência, tal como aqui utilizado, o termo "anticorpo" inclui anticorpos inteiros (que podem também ser referidos como "intactos"), fragmentos de anticorpo que retêm a capacidade de reconhecimento e ligação ao antigénio, quer sejam produzidos pela modificação de anticorpos inteiros quer sejam sintetizados de novo utilizando metodologias de ADN recombinante, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, e anticorpos miméticos, a menos que estabelecido de outra forma pelo contexto. O anticorpo pode ser um IgM, IgG (p. ex. IgGi, IgG2, IgG3 ou IgGé) , IgD, IgA ou IgE. O termo "fragmentos de anticorpo" significa moléculas que compreendem uma porção de um anticorpo intacto, geralmente a região de ligação ao antigénio ou variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e Fv; anticorpos estabilizados em hélice (ver, p. ex., Arndt et ai., J. Mol. Biol., 312: 221-228 (2001); diacorpos (ver abaixo); moléculas de anticorpo de cadeia simples ("scFvs," ver, p. ex., Patente U.S. No. 5,888,773); anticorpos estabilizados por dissulfureto ("dsFvs", ver, p. ex., Patente U.S. No. 5,747,654 e 6,558,672), e anticorpos do domínio ("dAbs," ver, p. ex., Holt et al. , Trends Biotech, 21(11): 484-490 (2003), Ghahroudi et al.. FEBS Lett., 414: 521-526 (1997), Lauwereys et al. , EMBO J., 17: 3512-3520 (1998), Reiter et al., J. Mol. Biol., 290: 685-698 (1999), e Davies e Riechmann, Biotechnology, 13: 475-479 (2001)). O termo "diacorpos" refere-se a pequenos fragmentos de anticorpos com dois locais de ligação ao antigénio, cujos fragmentos compreendem um domínio de cadeia variável ("Vh" ou "VH") ligado a um domínio de cadeia leve ("Vl" ou "VL") na mesma cadeia polipeptídica (Vh-Vl) . Através da utilização de um ligador que seja demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois locais de ligação ao antigénio. Os diacorpos e a sua produção são descritos mais completamente, por exemplo, em EP 404,097: WO 93/11161; e Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 6444-6448 (1993).

As referências a "Vh" ou uma "VH" referem-se à região variável de uma cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo um Fv, scFv, dsFv ou Fab. As referências a "Vl" ou uma "VL" referem-se à região variável de uma cadeia leve de imunoglobulina, incluindo de um Fv, scF, dsFv ou Fab. A frase "Fv de cadeia simples" ou "scFv" refere-se a um anticorpo em que os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve de um anticorpo de cadeia dupla tradicional foram unidos para formar uma cadeia. Tipicamente, um péptido ligador é inserido entre as duas cadeias para permitir a dobragem correcta e a criação de um local de ligação activo. 0 termo "péptido de ligação" inclui a referência a um péptido no interior de um fragmento de ligação do anticorpo (p. ex., fragmento Fv) que serve para ligar indirectamente o domínio variável da cadeia pesada ao domínio variável da cadeia leve. 0 termo "anticorpo parental" significa qualquer anticorpo de interesse a mutar ou modificar para se obter anticorpos ou fragmentos destes que se liguem ao mesmo epitopo do anticorpo parentérico, mas com maior afinidade. 0 termo "hotspot" significa uma porção de uma sequência nucleotídica de uma CDR ou de uma região estrutural de um domínio variável que é um local de variação natural particularmente elevada. Embora as CDR sejam elas próprias consideradas como sendo regiões de hipervariabilidade, aprendeu-se que as mutações não estão uniformemente distribuídas ao longo das CDR. Locais particulares, ou hotspots, foram identificados como localizações que sofrem mutações concentradas. Os hotspots são caracterizados por várias caracteristicas estruturais e sequências. Estes "motivos de hotspots" podem ser utilizados para identificar hotspots. Dois motivos com sequências de consenso que estão especificamente bem caracterizados são a sequência tetranucleotídica RGYW (SEQ ID NO:33) e a sequência de serina AGY (SEQ ID NO:34), em que R é A ou G, Y é C ou T, e W é A ou T. A "porção de direccionamento" é a porção de um imunoconjugado concebida para direccionar o imunoconjugado para uma célula de interesse. Tipicamente, a porção de direccionamento é um anticorpo, ou um fragmento de um anticorpo que mantém a capacidade de reconhecimento do antigénio, tal como um scFv, um dsFv, um Fab, ou um F (ab')2.

Tipicamente, uma imunoglobulina tem uma cadeia pesada e leve. Cada cadeia pesada e leve contém uma região constante e uma região variável, (as regiões são também conhecidas como "domínios"). As regiões variáveis da cadeia leve e pesada contêm uma região "estrutural" interrompida por três regiões hipervariáveis, também chamadas "regiões determinantes de complementaridade" ou "CDR". A extensão da região estrutural e das CDR foi definida. As sequências das regiões estruturais de diferentes cadeias leves ou pesadas são relativamente conservadas dentro de uma espécie. A região estrutural de um anticorpo, isto é, as regiões estruturais combinadas das cadeias leves e pesadas constituintes, serve para posicionar e alinhar as CDR no espaço tridimensional.

As CDRs são principalmente responsáveis pela ligação a um epitopo de um antigénio. As CDR de cada cadeia são tipicamente referidas como CDR1, CDR2 e CDR3, numeradas sequencialmente a partir do terminal N, e são também tipicamente identificadas pela cadeia em que a CDR particular está localizada. Assim, uma CDR3 de Vh está localizada no domínio variável da cadeia pesada do anticorpo em que é verificada, enquanto uma CDR1 de Vl é a CDR1 do domínio variável da cadeia leve do anticorpo em que é verificada. A frase "ligação dissulfureto" ou "ligação dissulfureto cisteína-cisteína" refere-se a uma interacção covalente entre duas cisteinas em que os átomos de enxofre das cisteinas são oxidados para formar uma ligação dissulfureto. A energia média de ligação de uma ligação dissulfureto é de cerca de 60 kcal/mol em comparação com 1-2 kcal/mol para uma ligação de hidrogénio. A frase "Fv estabilizado com dissulfureto" ou "dsFv" refere-se à região variável de uma imunoglobulina, em que existe uma ligação dissulfureto entre a cadeia leve e a cadeia pesada. No contexto da presente invenção, as cisteinas que formam a ligação dissulfureto estão dentro das regiões estruturais das cadeias de anticorpo e servem para estabilizar a conformação do anticorpo. Tipicamente, o anticorpo é modificado para introduzir cisteinas na região estrutural nas posições em que a substituição não interferirá com a ligação ao antigénio.

Um anticorpo imunologicamente reactivo com um determinado antigénio pode ser produzido através de métodos recombinantes, tais como selecção de bibliotecas de anticorpos recombinantes em fagos ou vectores semelhantes, ver, p. ex., Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1989); Ward, et al. , Nature, 341: 544-546 (1989); e Vaughan, et al. , Nature Biotech., 14: 309-314 (1996), ou através de imunização de um animal com o antigénio ou com ADN codificando o antigénio.

Uma "porção tóxica" é a porção de uma imunotoxina que torna a imunotoxina citotóxica para células de interesse.

Uma "porção terapêutica" é a porção de um imunoconjugado que se pretende que actue como agente terapêutico. 0 termo "agente terapêutico" inclui vários compostos actualmente conhecidos ou desenvolvidos mais tarde para actuar como anti-neoplásicos, anti-inflamatórios, citocinas, anti-infecciosos, activadores ou inibidores enzimáticos, modificadores alostéricos, antibióticos ou outros agentes administrados para induzir um efeito terapêutico desejado num paciente. 0 agente terapêutico pode também ser uma toxina ou um radioisótopo, em que o efeito terapêutico pretendido é, por exemplo, a morte de uma célula de cancro.

Um "marcador detectável" significa, em relação a um imunoconjugado, uma porção do imunoconjugado que tem a propriedade que torna a sua presença detectável. Por exemplo, o imunoconjugado pode ser marcado com um isótopo radioactivo que permita que as células em que o imunoconjugado está presente sejam detectadas em ensaios imuno-histoquimicos. 0 termo "porção efectora" significa a porção de um imunoconjugado que se pretende que tenha um efeito numa célula apontada pela porção de direccionamento ou para identificar a presença do imunoconjugado. Assim, a porção efectora pode ser, por exemplo, uma porção terapêutica, uma toxina, um marcador radioactivo ou um marcador fluorescente. 0 termo "imunoconjugado" inclui a referência a uma ligação covalente de uma molécula efectora de um anticorpo. A molécula efectora pode ser uma toxina.

Os termos "quantidade eficaz" ou "quantidade eficaz para" ou "quantidade terapeuticamente eficaz" incluem a referência a uma dosagem de um agente terapêutico suficiente para produzir um resultado desejado, tal como inibição da síntese proteica celular em, pelo menos, 50%, ou a morte da célula. O termo "toxina" inclui a referência a abrina, ricina, exotoxina A de Pseudomonas (PE), toxina da difteria (DT) , toxina botulínica, ou toxinas modificadas destas. Por exemplo, PE e DT são compostos altamente tóxicos que levam normalmente à morte através de toxicidade hepática. PE e DT, no entanto, são tipicamente modificadas para utilização como uma imunotoxina através da remoção do componente de direccionamento nativo da toxina (p. ex., o domínio Ia de PE ou a cadeia B de DT) e substituição por uma porção de direccionamento diferente, tal como um anticorpo. O termo "entrar em contacto" inclui a referência à colocação em associação física directa.

Um "plasmídeo de expressão" compreende uma sequência nucleotídica codificando uma molécula de interesse, que está operativamente ligada a um promotor.

Tal como aqui utilizados, "polipéptido", "péptido" e "proteína" são utilizados alternadamente e incluem a referência a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácidos em que um ou mais resíduos de aminoácidos é um análogo químico artificial de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, bem como a polímeros de ocorrência natural.

Os termos aplicam-se também a polímeros contendo substituições conservativas de aminoácidos de modo a que a proteína permaneça funcional. 0 termo "resíduo" ou "resíduo de aminoácido" ou "aminoácido" inclui a referência a um aminoácido que seja incorporado numa proteína, num polipéptido ou num péptido (colectivamente "péptido"). 0 aminoácido pode ser um aminoácido de ocorrência natural e, a menos que limitado de outro modo, pode englobar análogos conhecidos de aminoácidos naturais que podem funcionar de um modo semelhante como aminoácidos de ocorrência natural.

Os aminoácidos e análogos aqui referidos são descritos pelas designações abreviadas tal como se segue na Tabela A:

Tabela A: Nomenclatura de Aminoácidos

Uma "substituição conservativa", quando descreve uma proteína refere-se a uma mudança na composição de aminoácidos da proteína que não altera substancialmente a actividade da proteína. Assim, "variações conservativamente modificadas" de uma determinada sequência de aminoácidos referem-se a substituições de aminoácidos daqueles aminoácidos que não são críticos para a actividade da proteína ou substituição de aminoácidos com outros aminoácidos possuindo propriedades semelhantes (p. ex., ácidos, básicos, carregados positivamente ou negativamente, polares ou não polares, etc.) de modo a que as substituições de aminoácidos mesmo críticos não alterem substancialmente a actividade. As tabelas de substituições conservativas proporcionando aminoácidos funcionalmente similares são bem conhecidas na técnica. Os seguintes seis grupos da Tabela B contêm, cada um, aminoácidos que são substituições conservativas entre si:

Tabela B 1) Alanina (A), Serina (S) , Treonina (T); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M) , Valina (V); e 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y) , Triptofano (W) .

Ver também, Creighton, Proieins: Structures and Molecular Properties, W.H. Freeman and Company, New York (2nd Ed., 1992) . 0 termo "substancialmente semelhantes", no contexto de um péptido, indica que um péptido compreende uma sequência com pelo menos 90%, de preferência pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de referência ao longo de uma janela de comparação de 10-20 aminoácidos. A percentagem de identidade de sequência é determinada por comparação de duas sequências optimamente alinhadas ao longo de uma janela de comparação, em que a porção da sequência polinucleotidica na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, espaços) em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para um alinhamento óptimo das duas sequências. A percentagem é calculada determinando o número de posições em que a base do ácido nucleico ou o resíduo aminoácido idêntico ocorre em ambas as sequências para obter o número de posições com correspondência, dividindo o número de posições com correspondência pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para dar a percentagem de identidade de sequência.

Os termos "ligação", "conjugação", "união", "junção" ou "combinação" referem-se ao tornar dois polipéptidos numa molécula polipeptídica contígua. No contexto da presente invenção, os termos incluem a referência à junção de uma porção de anticorpo a uma PE da presente invenção. A ligação pode ser por meios químicos ou recombinantes. Os meios químicos referem-se a uma reacção entre a porção de anticorpo e a molécula de PE de modo a que exista uma ligação covalente formada entre as duas moléculas para formar uma molécula.

Tal como aqui utilizado, "recombinante" inclui a referência a uma proteína produzida utilizando células que não possuem, no seu estado nativo, uma cópia endógena do ADN capaz de expressar a proteína. As células produzem a proteína recombinante porque foram geneticamente alteradas através da introdução da sequência de ácido nucleico isolada apropriada. 0 termo inclui também a referência a uma célula ou ácido nucleico, ou vector, que tenha sido modificado pela introdução de um ácido nucleico heterólogo ou a alteração de um ácido nucleico nativo numa forma não nativa dessa célula, ou que essa célula seja derivada de uma célula assim modificada. Assim, por exemplo, as células recombinantes expressam genes que não são verificados dentro da forma nativa (não recombinante) da célula, expressam mutantes dos genes que se verificam na forma nativa, ou expressam genes nativos que, de outra forma, são expressos de forma anormal, subexpressos ou não expressos de todo.

Tal como aqui se utiliza, "ácido nucleico" ou "sequência de ácido nucleico" inclui a referência a um polímero de desoxirribonucleótidos ou ribonucleótidos quer na forma simples ou de cadeia dupla, e, a menos que de outro modo limitado, engloba análogos conhecidos de nucleótidos naturais que hibridam com nucleico ácidos de um modo semelhante aos nucleótidos de ocorrência natural. Salvo indicação em contrário, uma determinada sequência de ácido nucleico inclui a sua sequência complementar, bem como variantes conservativas, isto é, ácidos nucleicos presentes em posições de oscilação de codões e variantes que, quando traduzidas numa proteína, resultam numa substituição conservativa de um aminoácido.

Tal como aqui utilizado, "codificação" em relação a um ácido nucleico especificado, inclui a referência a ácidos nucleicos que compreendem a informação para a tradução para a proteína especificada. A informação é especificada através da utilização de codões. Tipicamente, a sequência de aminoácidos é codificada pelo ácido nucleico utilizando o código genético "universal". No entanto, variantes do código universal, tal como estão presentes nalgumas plantas, animais, e mitocôndrias fúngicas, na bactéria Mycoplasma capricolum (Proc. Nat '1 Acad. Sei. USA, 82: 2306-2309 (1985)), ou no ciliado Macronucleus, podem ser utilizadas quando o ácido nucleico é expresso usando a maquinaria da tradução destes organismos. A frase "fusão enquadrada" refere-se à ligação de duas ou mais sequências de ácido nucleico que codificam polipéptidos de modo a que a sequência de ácido nucleico ligada se traduza numa proteína de cadeia única que compreende as cadeias polipeptídicas originais.

Tal como aqui utilizado, "expressa" inclui a referência à tradução de um ácido nucleico numa proteína. As proteínas podem ser expressas e permanecer intracelulares, tornar-se um componente da membrana da superfície celular ou ser segregadas para a matriz ou o meio extracelular.

Por "célula hospedeira" entenda-se uma célula que pode suportar a replicação ou expressão do vector de expressão. As células hospedeiras podem ser células procariotas, tais como E. coli, ou células eucarióticas, tais como células de levedura, insecto, anfíbio, ou mamífero. A frase "biblioteca de apresentação fágica" refere-se a uma população de bacteriófagos, cada um dos quais contém um ADNc estranho fundido de forma recombinante enquadrado com uma proteína de superfície. 0 fago apresenta a proteína estranha codificada pelo ADNc na sua superfície. Após replicação num hospedeiro bacteriano, tipicamente E. coli, o fago que contêm o ADNc estranho de interesse é seleccionado através da expressão da proteína estranha na superfície do fago. 0 termo "idêntico" ou "percentagem de identidade" no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou de sequências polipeptídicas referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são a mesma ou têm uma percentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou nucleótidos que são os mesmos, quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima, medida utilizando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequências ou através de inspecção visual. A frase "substancialmente idênticas" no contexto de dois ácidos nucleicos ou polipéptidos, refere-se a duas ou mais sequências ou subsequências que têm pelo menos 60%, de preferência 65%, de maior preferência 70%, ainda de preferência 75%, ainda de maior preferência 80%, e ainda de maior preferência 90-95% de identidade de nucleótidos ou resíduos de aminoácidos, quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima, medida utilizando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequências ou através de inspecção visual. De preferência, a identidade substancial existe ao longo de uma região das sequências que tenha pelo menos cerca de 50 resíduos de comprimento, de maior preferência ao longo de uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, e ainda de preferência as sequências são substancialmente idênticas ao longo de pelo menos cerca de 150 resíduos. Numa forma de realização preferida, as sequências são substancialmente idênticas ao longo de todo o comprimento das regiões de codificação.

Para comparação de sequências, tipicamente uma sequência actua como sequência de referência, com a qual as sequências de teste são comparadas. Quando se utiliza um algoritmo de comparação de sequências, as sequências de teste e de referência são introduzidas num computador, são designadas as coordenadas de subsequência, se necessário, e são designados os parâmetros do programa do algoritmo de sequência. O algoritmo de comparação de sequências calcula então a percentagem de identidade de sequência para a ou as sequências de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa designados. O alinhamento óptimo de sequências para comparação pode ser realizado, p. ex., através do algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. , 2: 482 (1981), através do algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443 (1970), através do método de pesquisa de semelhança de Pearson & Lipman,

Proc. Nat ' 1. Acad. Sei. USA, 85: 2444 (1988), através de implementações computorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou através da inspecção visual (ver em geral, "Current Prolocols in Molecular Biology", F.M. Ausubel et al., eds., "Current Protocols", um empreendimento conjunto entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (1995 Suplemento) (Ausubel)).

Exemplos de algoritmos que são adequados para determinação da percentagem de identidade de sequência e semelhança de sequências são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que estão descritos em Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990) e Altschuel et al. Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1977), respectivamente. O suporte lógico para a realização de análises de BLAST está acessível ao público através do National Center for Biotechnology Information (disponível na internet digitando "http://wvw.ncbi" seguido de "nlm.nih.gov/"). Este algoritmo envolve primeiramente identificar pares de sequências de pontuação elevada (HSP) através da identificação de palavras curtas de comprimento W na sequência de busca, que correspondem ou satisfazem alguma pontuação limiar T de valor positivo quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento numa sequência da base de dados. T é referido como a pontuação limiar da palavra vizinha (Altschul et al., supra). Estes acertos de palavras vizinhas iniciais actuam como sementes para iniciar buscas para encontrar HSP mais longas contendo-os. Os acertos de palavras são então estendidos em ambas as direcções ao longo de cada sequência, tanto quanto a pontuação de alinhamento cumulativa poder ser aumentada. As pontuações cumulativas são calculadas utilizando, para sequências nucleotídicas, os parâmetros M (pontuação de retribuição para um par de resíduos com correspondência; sempre > 0) e N (pontuação de penalidade para resíduos sem correspondência: sempre < 0). Para as sequências de aminoácidos, é utilizada uma matriz de pontuações para calcular a pontuação cumulativa. A extensão dos acertos de palavras em cada direcção é interrompida quando: a pontuação do alinhamento cumulativa cai numa quantidade X do seu valor máximo alcançado; a pontuação cumulativa cai para zero ou abaixo, devido à acumulação de um ou mais alinhamentos de resíduos com pontuação negativa; ou a extremidade de qualquer uma das sequências é alcançada. Os parâmetros do algoritmo BLAST W, T, e X determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências nucleotídicas) utiliza por defeito um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as cadeias. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP utiliza por defeito um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver Henikoff &amp; Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89: 10915 (1989)).

Além do cálculo da percentagem da identidade de sequência, o algoritmo BLAST realiza também uma análise estatística da semelhança entre duas sequências (ver, p. ex., Karlin &amp; Altschul, Proc. Nat ' 1. Acad. Sei. USA, 90: 5873-5787 (1993)). Uma medida de semelhança proporcionada pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)), que proporciona uma indicação da probabilidade com que uma correspondência entre duas sequências nucleotídicas ou de aminoácidos ocorreria por acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado semelhante a uma sequência de referência se a menor probabilidade da soma numa comparação do ácido nucleico de teste com o ácido nucleico de referência for inferior a cerca de 0,1, de preferência inferior a cerca de 0,01, e de maior preferência inferior a cerca de 0,001.

Uma outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos ou polipéptidos são substancialmente idênticas é que o polipéptido codificado pelo primeiro ácido nucleico é imunologicamente reactivo de forma cruzada com o polipéptido codificado pelo segundo ácido nucleico, tal como descrito abaixo. Assim, um polipéptido é tipicamente substancialmente idêntico a um segundo polipéptido, por exemplo, quando os dois péptidos diferem apenas em substituições conservativas. Outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos são substancialmente idênticas é que as duas moléculas hibridam uma com a outra sob condições rigorosas, tal como é descrito abaixo. O termo "in vivo" inclui a referência a dentro do corpo do organismo a partir do qual foi obtida a célula. "Ex vivo" e "in vitro" significa fora do corpo do organismo a partir do qual foi obtida a célula. A frase "célula maligna" ou "malignidade" refere-se a tumores ou células tumorais que são invasivos e/ou capazes de sofrer metástase, ou seja, uma célula cancerosa.

Tal como aqui utilizado, "células de mamífero" inclui a referência a células derivadas de mamíferos incluindo humanos, ratos, ratinhos, cobaias, chimpanzés ou macacos. As células podem ser cultivadas in vivo ou in vitro. 0 termo "selectivamente reactivo" refere-se, em relação a um antigénio, à associação preferencial de um anticorpo, no todo ou em parte, com uma célula ou um tecido possuindo esse antigénio e não com células ou tecidos sem o antigénio. É, evidentemente, reconhecido que um certo grau de interacção não especifica pode ocorrer entre uma molécula e uma célula ou tecido não alvo. Contudo, reactividade selectiva pode ser distinguida como mediada através do reconhecimento especifico do antigénio. Embora anticorpos reactivos selectivamente se liguem ao antigénio, podem fazê-lo com baixa afinidade. Por outro lado, a ligação especifica resulta numa associação muito mais forte entre o anticorpo e células portadoras do antigénio que entre o anticorpo ligado e células sem o antigénio. A ligação especifica resulta tipicamente num aumento de mais de 2 vezes, de preferência mais de 5 vezes, de maior preferência mais de 10 vezes e ainda de preferência mais de 100 vezes na quantidade de anticorpo ligado (por unidade de tempo) a uma célula ou um tecido possuindo um antigénio alvo em comparação com uma célula ou um tecido sem o antigénio alvo. A ligação especifica a uma proteína sob tais condições requer um anticorpo que seja seleccionado pela sua especificidade para uma determinada proteína. Uma variedade de formatos de imunoensaio é apropriada para seleccionar anticorpos especificamente imunorreactivos com uma determinada proteína. Por exemplo, imunoensaios de ELISA em fase sólida são rotineiramente usados para seleccionar anticorpos monoclonais especificamente imunorreactivos com uma proteína. Ver Harlow &amp; Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Publications, New York (1988), para uma descrição dos formatos de imunoensaio e das condições que podem ser utilizadas para determinar imunorreactividade específica. 0 termo "condições imunologicamente reactivas" inclui a referência a condições que permitem que um anticorpo gerado contra um determinado epitopo se ligue a esse epitopo num grau detectavelmente maior, e/ou com a exclusão substancial de se ligar substancialmente a todos os outros epitopos. As condições imunologicamente reactivas são dependentes do formato da reacção de ligação do anticorpo e, tipicamente, são as utilizadas em protocolos de imunoensaio ou aquelas condições verificadas in vivo. Ver Harlow &amp; Lane, supra, para uma descrição dos formatos e condições de imunoensaio. De preferência, as condições imunologicamente reactivas empregues nos métodos da presente invenção são "condições fisiológicas" que incluem a referência a condições (p. ex., temperatura, osmolaridade, pH) que são típicas no interior de um mamífero vivo ou de uma célula de mamífero. Embora se reconheça que alguns desses órgãos estão sujeitos a condições extremas, o ambiente intra-organismo e intracelular reside normalmente cerca de pH 7 (ou seja, de pH 6,0 a pH 8,0, mais tipicamente de pH 6,5 a 7,5), contém água como solvente predominante, e existe a uma temperatura acima de 0°C e abaixo de 50°C. A osmolaridade está dentro do intervalo que é favorável à viabilidade e proliferação celulares.

EXOTOXINA A DE PSEUDOMONAS A exotoxina A de Pseudomonas ("PE") nativa é uma proteína monomérica extremamente activa (peso molecular de 66 kDa), segregada por Pseudomonas aeruginosa, que inibe a síntese proteica em células eucarióticas. A sequência da PE nativa (SEQ ID NO:1) é bem conhecida e está exposta, por exemplo, em SEQ ID NO:1 da Patente U.S. No. 5,602,095. O método de acção é a inactivação da ribosilação de ADP do factor de alongamento 2 (EF-2). A PE tem sido estudada há mais de 20 anos para utilização como agente terapêutico. A exotoxina contém três domínios estruturais que actuam em conjunto para causar citotoxicidade. O domínio Ia (aminoácidos 1-252) medeia a ligação celular. O domínio II (aminoácidos 253-364) é responsável pela translocação para o citosol e domínio III (aminoácidos 400-613) medeia a ribosilação do ADP do factor de alongamento 2. A função do domínio Ib (aminoácidos 365-399) permanece indefinida, embora se conheça uma grande parte dele, os aminoácidos 365-380, podem ser eliminados sem perda de citotoxicidade. Ver Siegall et ai., J. Biol. Chem., 264: 14256-14261 (1989).

Os termos "exotoxina de Pseudomonas" e "PE" tal como aqui utilizados referem-se tipicamente a uma PE que foi modificada a partir da proteína nativa para reduzir a ligação e a tomada através de LRP1/CD91 (o receptor da superfície celular ligado à toxina inteira), para eliminar problemas de dobragem, ou para reduzir toxicidade não específica. Numerosas dessas modificações são conhecidas na técnica e incluem, mas não estão limitadas a, eliminação do domínio Ia, várias deleções de aminoácidos nos domínios Ib, II e III, substituições de um único aminoácido e a adição de uma ou mais sequências no terminal carboxilo tais como KDEL (SEQ ID NO: 2) e REDL (SEQ ID NO:3). Ver Siegall et al. , supra. Fragmentos citotóxicos de PE incluem aqueles que são citotóxicos com ou sem subsequente processamento proteolítico ou outro na célula alvo (p. ex., como uma proteína ou pré-proteína).

Certos fragmentos citotóxicos de PE são conhecidos na técnica e são frequentemente referenciados pelo peso molecular do fragmento, que designa para a pessoa com conhecimentos na técnica a composição particular do fragmento de PE. Por exemplo, PE40 foi um dos primeiros fragmentos que foram estudados e utilizados como porção tóxica de imunotoxinas. 0 termo designa uma forma truncada de PE no domínio I, o domínio responsável pela ligação não específica. Ver, p. ex., Pai et ai., Proc. Nat '1 Acad. Sei. USA, 88: 3358-3362 (1991); e Kondo et al., J. Biol. Chem., 263: 9470-9475 (1988) . A eliminação de ligação não específica, no entanto, pode também ser conseguida através da mutação de certos resíduos do domínio Ia. A Patente U.S. 5,512,658, por exemplo, divulga que uma PE mutada em que o domínio Ia está presente mas em que os resíduos básicos do domínio Ia nas posições 57, 246, 247, e 249 são substituídos por resíduos ácidos (ácido glutâmico, ou "E")) apresenta citotoxicidade não específica grandemente diminuída. Esta forma mutante de PE é por vezes referida como "PE4E". O termo "PE38" refere-se a um fragmento citotóxico de PE composto pelos aminoácidos 253-364 e 381-613 de PE e possuindo um peso molecular de aproximadamente 38 kDa. Contém os domínios de translocação e ribosilação de ADP de EF, mas não a porção de ligação a células (Hwang J. et al., Cell, 48: 129-136 (1987)). PE38 é uma pro-proteína que é activada na sua forma citotóxica após processamento dentro de uma célula (ver, p. ex., Patente U.S. No. 5,608,039, e Pastan et al. , Biochim. Biophys. Acta, 1333: C1-C6 (1997)). A sequência de PE38 é bem conhecida na técnica, mas pode ser facilmente determinada pelo praticante, subtraindo os resíduos indicados da sequência conhecida de PE. As pessoas com conhecimentos estarão cientes de que, devido à degenerescência do código genético, a sequência de aminoácidos de PE38, das suas variantes, tais como PE38KDEL ou PE38QQR, e de outros derivados de PE aqui discutidos podem ser codificados por uma grande variedade de sequências de ácido nucleico, qualquer um dos quais pode ser expresso para resultar no polipéptido desejado. "PE35" é um fragmento de 35 kDa carboxi-terminal de PE em que os resíduos de aminoácidos 1-279 foram eliminados e a molécula começa com uma metionina na posição 280, seguido pelos aminoácidos 281-364 e 381-613 da PE nativa. PE35 e PE40 são divulgados nas Patentes U.S. 5,602,095 e 4,892,827.

Estudos determinaram também que mutações dos resíduos terminais de PE, REDLK (SEQ ID NO:5, resíduos 609-613) podiam ser variadas de modos que aumentasem a citotoxicidade do mutante resultante. Por exemplo, imunotoxinas produzidas com PE mutadas terminando nas sequências KDEL (SEQ ID NO:2), REEL (SEQ ID NO:32) ou RDEL (SEQ ID NO:3) eram muito mais citotóxicas para células alvo que imunotoxinas semelhantes produzidas com PE38 possuindo a sequência terminal nativa. Ver, Kreitman e Pastan, Biochem. J., 307 (Pt 1): 29-37 (1995). Repetições destas sequências podem também ser usadas. Ver, p. ex., Patentes U.S. 5,854,044; 5,821,238; e 5,602,095 e Publicação Internacional WO 99/51643. Embora PE terminando em KDEL (SEQ ID NO:2) sejam úteis para fins in vitro, provou-se que têm toxicidade não específica em animais e são menos preferidas para utilização in vivo.

Numa forma de realização preferida, o fragmento citotóxico de PE mantém pelo menos cerca de 10%, de preferência pelo menos cerca de 40%, de maior preferência cerca de 50%, ainda de preferência 75%, ainda de maior preferência pelo menos cerca de 90%, e ainda de maior preferência 95% da citotoxicidade de PE38. Em formas de realização particularmente preferidas, o fragmento citotóxico tem pelo menos a citotoxicidade de PE38, e de preferência tem mais. A. Variantes de PE Modificada de Forma Conservativa

Entende-se que a sequência da PE nativa e das variantes discutidas acima podem ter substituições conservativas e manter a capacidade citotóxica e, desejavelmente, antigenicidade reduzida em comparação com a sequência nativa da PE. Em formas de realização preferidas, variantes modificadas de PE ou fragmentos citotóxicos destas têm pelo menos 80% de semelhança de sequência, de preferência pelo menos 85% de semelhança de sequência, de maior preferência pelo menos 90% de semelhança de sequência, e ainda de preferência pelo menos 95% de semelhança de sequência ao nível dos aminoácidos, com a PE de interesse, tal como PE38 . O termo "variantes modificadas de forma conservativa" aplica-se tanto a sequências de aminoácidos como de ácido nucleico. Em relação a determinadas sequências de ácido nucleico, as variantes modificadas de forma conservativa referem-se às sequências de ácido nucleico que codificam sequências de aminoácidos idênticas ou essencialmente idênticas, ou se o ácido nucleico não codificar uma sequência de aminoácidos, a sequências de ácido nucleico essencialmente idênticas. Devido à degenerescência do código genético, um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codifica qualquer dado polipéptido. Por exemplo, os codões GCA, GCC, GCG e GCU codificam todos o aminoácido alanina. Assim, em cada posição em que uma alanina é especificada por um codão, o codão pode ser alterado para qualquer um dos codões correspondentes descritos sem alterar o polipéptido codificado. Tais variações dos ácidos nucleicos são "variações silenciosas", que são uma espécie de variações modificadas de forma conservativa. Cada sequência de ácido nucleico aqui que codifica um polipéptido descreve também qualquer possivel variação silenciosa do ácido nucleico. Um perito reconhecerá que cada codão num ácido nucleico (excepto AUG e TGG, que são vulgarmente os únicos codões para metionina e triptofano, respectivamente) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Assim, cada variação silenciosa de um ácido nucleico que codifica para um polipéptido está implícita em cada sequência descrita.

Quanto às sequências de aminoácidos, um perito reconhecerá que substituições, deleções ou adições individuais num ácido nucleico, péptido, polipéptido ou sequência proteica que alterem, adicionem ou eliminem um único aminoácido ou uma pequena percentagem de aminoácidos na sequência codificada é uma "variante modificada de forma conservativa", em que a alteração resulta na substituição de um aminoácido por um aminoácido quimicamente semelhante.

B. Ensaio da Citotoxicidade ou Antigenicidade de PE

As exotoxinas de Pseudomonas utilizadas na invenção podem ser ensaiadas quanto ao nível desejado de Citotoxicidade através de ensaios bem conhecidos dos peritos na técnica. Assim, fragmentos citotóxicos de PE e variantes modificadas de forma conservativa de tais fragmentos podem ser facilmente testados quanto à citotoxicidade. Um grande número de moléculas de PE candidatas pode ser ensaiado simultaneamente quanto à citotoxicidade através de métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, subgrupos de moléculas candidatas podem ser ensaiados quanto à citotoxicidade. Subgrupos das moléculas candidatas reagindo positivamente podem ser subdivididos continuamente e ensaiados novamente até ser identificado o ou os fragmentos citotóxicos desejados. Tais métodos permitem a pesquisa rápida de um grande número de fragmentos citotóxicos ou variantes conservativas da PE. A antigenicidade pode ser ensaiada através, por exemplo, dos métodos ensinados nos Exemplos aqui. C. Conjugação com uma Molécula de Direccionamento

Em formas de realização da invenção não recombinantes, uma molécula de direccionamento, tal como um anticorpo, é ligada a uma molécula de PE da presente invenção utilizando vários meios conhecidos dos peritos na técnica. Podem ser usados meios de ligação tanto covalente como não covalente com moléculas de PE da presente invenção. 0 procedimento para a ligação de uma molécula de PE a um anticorpo ou outra molécula de direccionamento ("TM") variará de acordo com a estrutura química da TM. Os polipéptidos contêm tipicamente uma variedade de grupos funcionais; p. ex, grupos ácido carboxílico (COOH), amina livre (-NH2) ou sulfidrilo (-SH), que estão disponíveis para reacção com um grupo funcional adequado num anticorpo, por exemplo, para resultar na ligação da molécula de PE.

Alternativamente, o anticorpo ou outra TM é derivado para expor ou para ligar grupos funcionais reactivos adicionais. A derivação pode envolver a ligação de qualquer uma de várias moléculas ligadoras, tais como as disponíveis em Pierce Chemical Company, Rockford Illinois.

PRODUÇÃO DE IMUNOCONJUGADOS

Os imunoconjugados da invenção incluem moléculas em que há uma ligação covalente de uma molécula de PE com um anticorpo ou outro agente de direccionamento. A escolha de um agente de direccionamento particular depende da célula particular a apontar. Com as moléculas de PE aqui proporcionadas, um perito pode facilmente construir uma variedade de clones contendo ácidos nucleicos funcionalmente equivalentes, tais como ácidos nucleicos que diferem na sequência mas que codificam a mesma PE e sequência de anticorpo. Assim, a presente invenção proporciona ácidos nucleicos codificando conjugados de anticorpos e PE e proteínas de fusão destes. A. Métodos Recombinantes

As sequências de ácido nucleico da presente invenção podem ser preparadas através de qualquer método adequado incluindo, por exemplo, clonagem de sequências apropriadas ou através de síntese química directa por métodos tais como o método de fosfotriéster de Narang et al., Meth. Enzymol., 68: 90-99 (1979); o método de fosfodiéster de Brown et al., Meth. Enzymol., 68: 109-151 (1979); o método de dietilfosforamidite de Beaucage et al. Tetra. Lett., 22: 1859-1862 (1981); o método de fosforamidite-triéster de fase sólida descrito por Beaucage &amp; Caruthers, Tetra. Letts., 22(20): 1859-1862 (1981), p. ex., utilizando um sintetizador automático tal como descrito em, por exemplo, Needham-VanDevanter et al., Nucl. Acids Res., 12: 6159-6168 (1984); e, o método de suporte sólido da Patente U.S. No. 4,458,066. A síntese química produz um oligonucleótido de cadeia simples. Este pode ser convertido em ADN de cadeia dupla através de hibridização com uma sequência complementar, ou através de polimerização com uma ADN-polimerase utilizando a cadeia simples como molde. Um perito reconhecerá que enquanto a síntese química de ADN está limitada a sequências de cerca de 100 bases, sequências mais longas podem ser obtidas através de ligação de sequências mais curtas.

Numa forma de realização preferida, as sequências de ácido nucleico da presente invenção são preparadas através de técnicas de clonagem. Exemplos de técnicas de clonagem e sequenciação apropriadas, e instruções suficientes para orientar os peritos através de muitos exercícios de clonagem são verificados em Sambrook et al., "MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL" (2a End.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)), Berger and Kimmel (eds.), "GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES", Academic Press, Inc., San Diego CA (1987)), ou Ausubel et al. (eds.), "CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY", Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY (1987). Informações sobre o produto dos fabricantes de reagentes biológicos e equipamento experimental proporcionam também informações úteis. Tais fabricantes incluem a empresa de produtos químicos SIGMA (Saint Louis, MO), R&amp;D Systems (Minneapolis, MN), Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories, Inc. (Paio Alto, CA), Chem Genes Corp.,

Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersberg, MD), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland) , Invitrogen, San Diego, CA, e Applied Biosystems (Foster City, CA), bem como muitas outras fontes comerciais conhecidas de um perito. Ácidos nucleicos codificando a PE nativa podem também ser modificados para formar os imunoconjugados da presente invenção. A modificação através de mutagénese dirigida ao local é bem conhecida na técnica. Os ácidos nucleicos codificando a PE podem ser amplificados através de métodos in vitro. Métodos de amplificação incluem a reacção em cadeia da polimerase (PCR), a reacção em cadeia da ligase (LCR), o sistema de amplificação baseado na transcrição (TAS), o sistema de replicação de sequências auto-sustentada (3SR). Uma grande variedade de métodos de clonagem, células hospedeiras, e metodologias de amplificação in vitro é bem conhecida dos peritos.

Numa forma de realização preferida, os imunoconjugados são preparados através da inserção do ADNc que codifica um anticorpo ou outra TM de escolha num vector que compreende o ADNc codificando uma PE desejada da invenção. A inserção é feita de modo a que o agente de direccionamento (para facilidade de discussão, a discussão aqui assumirá que o agente de direccionamento é um Fv, embora outros agentes de direccionamento possam ser substituídos com igual efeito) e a PE sejam lidos enquadrados, isto é, num polipéptido contínuo que contem uma região funcional de Fv e uma região funcional de PE. Numa forma de realização particularmente preferida, o ADNc codificando a PE da invenção é ligado a um scFv de modo a que a toxina fique localizada no terminal carboxilo do scFv. Noutras formas de realização preferidas, o ADNc codificando uma PE da invenção é ligado a um scFv de modo a que a toxina se localize no terminal amino do scFv.

Uma vez isolados e clonados os ácidos nucleicos codificando uma PE, anticorpo, ou um imunoconjugado da presente invenção, pode-se expressar a proteína desejada numa célula modificada de forma recombinante tal como bactérias, células vegetais, de levedura, de insecto e de mamífero. Espera-se que os peritos na técnica tenham conhecimento de numerosos sistemas de expressão disponíveis para expressão de proteínas, incluindo E. coli, outros hospedeiros bacterianos, de levedura, e várias células eucarióticas superiores, tais como as linhas celulares COS, CHO, HeLa e de mieloma. Não se tentará descrever em detalhe os vários métodos conhecidos para a expressão de proteínas em procariotas ou eucariotas. Em resumo, a expressão de ácidos nucleicos naturais ou sintéticos codificando as proteínas isoladas da invenção será tipicamente alcançada através da ligação operativa do ADN ou ADNc a um promotor (que ou é constitutivo ou indutível), seguido de incorporação numa cassete de expressão. As cassetes podem ser adequadas para replicação e integração quer em procariotas quer em eucariotas. Cassetes de expressão típicas contêm terminadores da transcrição e da tradução, sequências de iniciação e promotores úteis para regulação da expressão do ADN que codifica a proteína. Para obter expressão de nível elevado de um gene clonado, é desejável construir cassetes de expressão que contenham, no mínimo, um promotor forte para dirigir a transcrição, um local de ligação ao ribossoma para iniciação da tradução, e um terminador de transcrição/tradução. Para E. coli, isto inclui um promotor tal como os promotores T7, trp, lac, ou lambda, um local de ligação ao ribossoma e de preferência um sinal de terminação da transcrição. Para células eucarióticas, as sequências de controlo podem incluir um promotor e de preferência um estimulador derivado de genes de imunoglobulina, SV40, citomegalovirus, e uma sequência de poliadenilação, e podem incluir sequências dadoras e aceitadoras de união. As cassetes incorporando os ácidos nucleicos da invenção podem ser transferidas para dentro da célula hospedeira escolhida através de métodos bem conhecidos tais como transformação com cloreto de cálcio ou electroporação para E. coli e tratamento com fosfato de cálcio, electroporação ou lipofecção para células de mamífero. As células transformadas pelas cassetes podem ser seleccionadas pela resistência a antibióticos conferida por genes contidos nas cassetes, tais como os genes amp, gpt, neo e hyg.

Um perito reconhecerá que podem ser produzidas modificações num ácido nucleico codificando um polipéptido da presente invenção (i.e., PE ou um imunoconjugado formado a partir de uma PE da invenção) sem diminuir a sua actividade biológica. Algumas modificações podem ser feitas para facilitar a clonagem, expressão, ou incorporação da molécula de direccionamento numa proteína de fusão. Tais modificações são bem conhecidas dos peritos na técnica e incluem, por exemplo, codões de germinação, uma metionina adicionada ao terminal amino para proporcionar uma iniciação, um local, aminoácidos adicionais colocados em qualquer um dos terminais para criar locais de restrição convenientemente localizados ou aminoácidos adicionais (tais como poli-His) para auxiliar em passos de purificação.

Além dos métodos recombinantes, os imunoconjugados e as PE da presente invenção podem também ser construídos no todo ou em parte usando síntese peptídica padrão. A síntese em fase sólida dos polipéptidos da presente invenção de menos de cerca de 50 aminoácidos de comprimento pode ser alcançada através da ligação do aminoácido C-terminal da sequência a um suporte insolúvel, seguido pela adição sequencial dos aminoácidos restantes na sequência. Técnicas para síntese em fase sólida são descritas por Barany &amp; Merrifield, "THE PEPTIDES: ANALYSIS, SYNTHESIS, BIOLOGY". VOL. 2: "SPECIAL METHODS IN PEPTIDE SYNTHESIS", PART A, págs. 3-284; Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. , 85: 2149-2156 (1963), e Stewart et al. , "SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS", 2a ED., Pierce Chem. Co., Rockford, III. (1984). Proteínas de maior comprimento podem ser sintetizadas por condensação dos terminais amino e carboxilo de fragmentos mais curtos. Métodos de formação de ligações peptídicas por activação de uma extremidade terminal carboxilo (p. ex., através do uso do reagente de ligação N,N'-dicicilo-hexilcarbodiimida) são conhecidos dos peritos. B. Purificação

Uma vez expressos, os imunoconjugados e as PE recombinantes da presente invenção podem ser purificados de acordo com procedimentos padrão na técnica, incluindo precipitação com sulfato de amónio, colunas de afinidade, cromatografia em coluna, e semelhantes (ver, geralmente, R. Scopes, "PROTEIN PURIFICATION", Springer-Verlag, N.Y. (1982)). São preferidas composições substancialmente puras de pelo menos cerca de 90 a 95% de homogeneidade, e para usos farmacêuticos as mais preferidas têm 98 a 99% ou mais de homogeneidade. Uma vez purificados, parcialmente ou até à homogeneidade como desejado, se a utilizar terapeuticamente, os polipéptidos devem estar substancialmente livres de endotoxinas.

Os métodos para expressão de anticorpos de cadeia simples e/ou redobragem de uma forma activa apropriada, incluindo anticorpos de cadeia simples, a partir de bactérias tais como E. coli têm sido descritos e são bem conhecidos e são aplicáveis aos anticorpos da presente invenção. Ver, Buchner et ai., Anal. Biochem., 205: 263-270 (1992); Pluckthun, Biotechnology, 9: 545 (1991); Huse et al. Science, 246: 1275 (1989) e Ward et al. , Nature, 341: 544 (1989) .

Frequentemente, proteínas heterólogas funcionais de E. coli ou outras bactérias são isoladas a partir de corpos de inclusão e requerem solubilização utilizando fortes desnaturantes e subsequente redobragem. Durante o passo de solubilização, tal como é bem conhecido na técnica, um agente redutor deve estar presente para ligações dissulfureto separadas. Um tampão exemplar com um agente redutor é: Tris 0,1 M, pH 8, guanidina 6 M, EDTA 2 mM, DTE 0,3 M (ditiocritritol). A re-oxidação das ligações dissulfureto pode ocorrer na presença de reagentes tiol de baixo peso molecular na forma reduzida e oxidada, tal como descrito em Saxena et al., Biochemistry, 9: 5015-5021 (1970), e especialmente tal como descrito por Buchner et al., supra.

A renaturação é tipicamente conseguida através de diluição (p. ex., 100 vezes) da proteína desnaturada e reduzida em tampão de redobragem. Um tampão exemplar é Tris 0,1 M, pH 8,0, L-arginina 0,5 M, glutationa oxidada 8 mM, e EDTA 2 mM.

Como uma modificação do protocolo de purificação de anticorpos de duas cadeias, as regiões das cadeias pesada e leve são separadamente solubilizadas e reduzidas e depois combinadas na solução de redobragem. Um rendimento preferido é obtido quando estas duas proteínas são misturadas numa razão molar de modo a que não seja excedido um excesso molar de 5 vezes de uma proteína em relação à outra. É desejável adicionar excesso de glutationa oxidada ou de outros compostos de baixo peso molecular oxidantes à solução de redobragem após o baralhamento redox estar concluído.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E ADMINISTRAÇÃO

As composições imunoconjugadas desta invenção (i.e., PE ligada a um anticorpo no outro agente de direccionamento) são particularmente úteis para administração parentérica, tal como administração intravenosa ou administração numa cavidade corporal.

As composições para administração compreenderão, geralmente, uma solução do anticorpo e/ou imunoconjugado dissolvido num transportador farmaceuticamente aceitável, de preferência um transportador aquoso. Uma variedade de veículos aquosos pode ser utilizada, p. ex., solução salina tamponada e semelhantes. Estas soluções são estéreis e geralmente isentas de matéria indesejável. Estas composições podem ser esterilizadas através de técnicas de esterilização convencionais bem conhecidas. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis conforme necessário para aproximar às condições fisiológicas tais como ajuste do pH e agentes tampão, agentes de ajuste da toxicidade e semelhantes, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio e semelhantes. A concentração de proteína de fusão nestas formulações pode variar amplamente, e será seleccionada principalmente com base nos volumes de fluido, nas viscosidades, no peso corporal e semelhantes, de acordo com o modo de administração particular seleccionado e as necessidades do paciente.

Assim, uma composição típica compreendendo uma imunotoxina da presente invenção para administração intravenosa seria de cerca de 0,1 a 10 mg por paciente por dia. Podem ser utilizadas dosagens de 0,1 até cerca de 100 mg por paciente por dia. Os métodos actuais para preparação de composições administráveis serão conhecidos ou evidentes para os peritos na técnica e são descritos em mais detalhe em publicações tais como "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 19a ED., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1995) .

As composições compreendendo imunotoxinas da presente invenção podem ser administradas para tratamentos terapêuticos. Em aplicações terapêuticas, as composições são administradas a um paciente sofrendo de uma doença, numa quantidade suficiente para curar ou pelo menos parar parcialmente a doença e as suas complicações. Uma quantidade adequada para alcançar isto é definida como uma "dose terapeuticamente eficaz". Quantidades eficazes para esta utilização dependerão da gravidade da doença e do estado geral de saúde do paciente. Uma quantidade eficaz do composto é a que proporciona quer um alivio subjectivo do ou dos sintomas ou uma melhoria objectivamente identificável tal como observado pelo médico ou outro observador qualificado.

Administrações únicas ou múltiplas das composições são administradas dependendo da dosagem e frequência conforme requerido e tolerado pelo paciente. Em qualquer caso, a composição deve proporcionar uma quantidade suficiente das proteínas da presente invenção para tratar eficazmente o paciente. De preferência, a dosagem é administrada uma vez, mas pode ser aplicada periodicamente até ser obtido um resultado terapêutico ou até efeitos secundários garantirem a descontinuação da terapia. Geralmente, a dose é suficiente para tratar ou melhorar os sintomas ou sinais de doença sem produzir toxicidade inaceitável para o paciente.

Formulações parentéricas de libertação controlada de composições compreendendo os imunoconjugados da presente invenção podem ser produzidas como implantes, injecções oleosas, ou como sistemas particulados. Para uma perspectiva ampla dos sistemas de distribuição de proteínas ver, Banga, A.J., "THERAPEUTIC PEPTIDES AND PROTEINS: FORMULATION, PROCESSING, AND DELIVERY SYSTEMS", Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, PA, (1995). Sistemas particulados incluem microesferas, micropartícuias, microcápsulas, nanocápsulas, nanosferas, e nanopartículas. As microcápsulas contêm a proteína terapêutica como um núcleo central. Em microesferas a terapêutica é dispersa por toda a partícula. Partículas, microesferas e microcápsulas menores que cerca de 1 pm são geralmente referidas como nanopartículas, nanoesferas, e nanocápsulas, respectivamente. Os capilares têm um diâmetro de

aproximadamente 5 pm de modo a que apenas nanopartícuias sejam administradas por via intravenosa. As micropartículas são tipicamente cerca de 100 pm de diâmetro e são administradas por via subcutânea ou intramuscular. Ver, p. ex., Kreuter J., "COLLOIDAL DRUG DELIVERY SYSTEMS", J. Kreuter, ed., Mareei Dekker, Inc., New York, NY, págs. 219-342 (1994); e Tice &amp; Tabibi, "TREATISE ON CONTROLLED DRUG DELIVERY", A. Kydonieus, ed., Mareei Dekker, Inc. New York, NY, págs. 315-339 (1992).

Podem ser utilizados polímeros para a libertação controlada por iões de composições de imunoconjugados da presente invenção. Várias matrizes poliméricas degradáveis e não degradáveis para utilização na libertação controlada de fármacos são conhecidas na técnica (Langer R., Accounts Chem. Res., 26: 537-542 (1993)). Por exemplo, o copolímero de blocos, polaxâmero 407 existe como um líquido viscoso mas ainda móvel a baixas temperaturas, mas forma um gel semi-sólido à temperatura do corpo. Mostrou-se ser um veículo eficaz para a formulação e distribuição sustentada de interleucina-2 recombinante e urease (Johnston et al. , Pharm. Res., 9: 425-434 (1992); e Pec et al. , J. Parent.

Sei. Tech., 44(2): 58-65 (1990)). Alternativamente, tem sido utilizada hidroxiapatite como transportador para libertação controlada de proteínas (Ijntema et al. , Int. J. Pharm., 112: 215-224 (1994)). Ainda noutro aspecto, são utilizados lipossomas para libertação controlada bem como direccionamento de fármacos do fármaco com cápsula lipídica (Betageri et al. , "LIPOSOME DRUG DELIVERY SYSTEMS", Technomic Publishing Co. , Inc., Lancaster, PA (1993)). Numerosos outros sistemas de distribuição controlada de proteínas terapêuticas são conhecidos. Ver, p. ex., p. ex., Pat. U.S. No. 5,055,303, 5,188,837, 4,235,871, 4,501,728, 4,837, 028 4, 957,735 e 5, 019, 369, 5, 055,303; 5,514, 670; 5,413,797; 5,268,164; 5,004,697; 4,902,505; 5,506,206, 5,271,961; 5,254,342 e 5,534,496.

Entre as várias utilizações das imunotoxinas da presente invenção estão incluídas uma variedade de condições de doença causadas por células humanas específicas que podem ser eliminadas através da acção tóxica da proteína de fusão.

UTILIZAÇÕES IN VITRO

Também são aqui divulgados estojos para eliminação de células alvo fn vitro ou ex vivo utilizando PE da invenção. Por exemplo, imunotoxinas compreendendo uma PE da presente invenção podem ser utilizadas para purgar células alvo a partir de uma população de células numa cultura. Assim, por exemplo, as células cultivadas a partir de um paciente com um cancro expressando CD22 podem ser purgadas de células de cancro através do contacto da cultura com imunotoxinas que utilizem anticorpos anti-CD22 como porção de direccionamento.

Nalguns casos, as células alvo podem estar contidas dentro de uma amostra biológica. Uma "amostra biológica", tal como aqui utilizado, é uma amostra de tecido ou fluido biológico que contém células alvo e células não alvo. Tais amostras incluem, mas não estão limitadas a, tecido de biopsia, sangue e células sanguíneas (p. ex., glóbulos brancos). Uma amostra biológica é tipicamente obtida a partir de um eucariota multicelular, de preferência um mamífero tal como rato, ratinho, vaca, cão, cobaia, ou coelho, e de preferência um primata, tal como um macaco, chimpanzé, ou humano. De maior preferência, a amostra é de um humano.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Este Exemplo expõe materiais e métodos utilizados nalguns dos estudos subjacentes à presente invenção.

Preparação lisossómica de células Raji Células de linfoma de Raji Burkitt (1-3χ108) foram colhidas, lavadas duas vezes em PBS frio, uma vez em tampão de homogeneização (sacarose 250 mM, EDTA 1 mM) e ressuspensas em 2 mL de tampão de homogeneização. As células em suspensão foram lisadas por cavitação com azoto com uma bomba de rompimento de células de 45 mL (Parr Instrument Company, Moline, IL) arrefecida a 4°C e pressurizada com azoto gasoso a 150-200 psi durante 10 min. As células rompidas foram centrifugadas a 800 xg durante 10 min. O sobrenadante pós-nuclear (camada do meio) foi removido e vertido em camadas sobre uma solução de 8,5 mL de PERCOLL® a 2 7% almofadada numa camada de 1,2 mL de tampão de homogeneização 10χ num tubo de centrífuga UltraClear Beckman 16x76 (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA) e centrifugado a 4°C num rotor Beckman Tipo 50 Ti durante lha 36.000 xg. As fracções do gradiente de PERCOLL® foram recolhidas e depois ensaiadas individualmente quanto à actividade de β-hexosaminidase, tal como descrito (Schaub, B.E. et ai., Curr. Protoc. Cell. Biol., 15: 8.1-8.12 (2005)). As fracções com actividade de pico foram reunidas, transferidas para tubos de policarbonato 13x51 mm de espessura da parede e centrifugadas a 4°C utilizando um rotor S100 AT4-542 durante 30 minutos a 200.000 xg para remover o PERCOLL®. O sobrenadante foi recolhido e utilizado para digerir as imunotoxinas.

Digestão da proteases lisossómicas de B3(dsFv)-PE38 e sequenciação N-terminal dos fragmentos

As proteases lisossómicas purificadas catepsina B, catepsina D, e catepsina S (EMD Biosciences, San Diego, CA), ou a fracção lisossómica de células Raji foram utilizadas para digerir a imunotoxina B3(dsFv)-PE38. B3(dsFv)-PE38 (0,2 mg/mL) foi incubada, com 5 pg/mL das proteases lisossómicas purificadas catepsina (catepsinas B, D e S) ou com 30% (v/v) da fracção lisossómica de células

Raji a 37°C em tampão contendo MES 0,1 M (pH 5,5), NaCl 150 mM, DTT 2 mM, EDTA 2 mM, e Triton X-100 a 0,5%. A intervalos de tempo entre 0 e 60 h após o inicio da incubação, aliquotas foram removidas para tampão de amostra tris-glicina de SDS-PAGE e incubadas a 85°C durante 5 min. Metade de cada amostra foi corrida num gel de proteinas de acrilamida tris-glicina Novex 4-20% (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) e visualizadas utilizando o corante de proteinas Azul de Coomassie Microwave (Protiga Inc., Frederick, MD) . A amostra restante foi fraccionada através de electroforese em gel da mesma forma e depois electrotransferidas para uma membrana de PVDF (ProBlott; Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) num tampão CAPC 10 mM (pH 11) usando uma unidade de transferência semi-seca. Após transferência, a membrana foi rapidamente lavada com água, corada com Azul de Coomassie R-250 a 0,1% em ácido acético a 0,5%/metanol a 40% durante 2 min e, em seguida, descorada em metanol a 50% em água. As bandas de proteína foram excisadas da membrana e analisadas utilizando um sequenciador de proteínas Procise 494 CLC automatizado (Applied Biosystems, Inc.).

Mutações em HA22

As mutações em HA22 foram geradas utilizando mutagénese dirigida ao local Quikchange (Stratagene, La Jolla, CA) com iniciadores de mutagénese de Lofstrand Labs Limited (Gaithersburg, MD).

Purificação das imunotoxinas - as imunotoxinas foram purificadas tal como descrito (Pastan, I. et ai., Methods Mol. Biol., 248: 503-518 (2004)), excepto que foi adicionada glutationa oxidada, não reduzida, ao tampão de redobragem.

Linhas celulares

As linhas celulares de linfoma de Burkitt humanas positivas para CD22 (CA46, Daudi, Raji, e Ramos) foram obtidas na American Type Culture Collection (Manassas, VA) . A linha celular KOPN-8 ALL foi obtida do Dr. Alan Wayne no National Câncer Institute (Bethesda, MD) . A linha celular WSU-CLL [que pode, de facto, ser um derivado da linha celular REH ALL (Drexler, H.G. et ai., Leukemia, 16: 1868-1870 (2002))] foi obtida do Dr. A. Al-Katib (Wayne State University, Detroit, MI). Todas as linhas celulares foram cultivadas a 37°C com CO2 a 5% em meio RPMI-1640 suplementado com FBS a 10%, L-glutamina 2 mM, piruvato de sódio 1 mM, 100 U de penicilina, e 100 pg de estreptomicina (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA ).

Ensaios de citotoxicidade A sobrevivência celular de linhas celulares tratadas com imunotoxinas foi medida através do ensaio WST-8 utilizando o Estojo de Contagem de Células 8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), essencialmente tal como descrito no manual técnico. Resumidamente, 10.000 células/poço foram incubadas com toxina numa placa de 96 poços (Pastan, I. et ai., Methods Mol. Biol., 248: 503-518 (2004)) durante 48-72 h, após o que o reagente CCK-8 foi adicionado aos poços. As placas foram incubadas até os poços com a absorvância máxima a 450 nm atingirem valores de DO ~1. Ciclo-hexamida (concentração final de 10 pg/mL) foi utilizada como controlo para 100% de morte celular. Os valores foram normalizados entre a ciclo-hexamida e os controlos de PBS/HSA (0,2%) e ajustados a uma equação sigmóide padrão de quatro parâmetros com um declive variável utilizando o programa GraphPad PRISM® (v 2.00) (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA) para obter a concentração de imunotoxina à qual havia 50% de morte celular (IC50) . Células de pacientes com CLL e HCL foram ensaiadas tal como anteriormente descrito (Kreitman, R.J. et al. , Clin. Câncer Res., 6: 1476-1487 (2000)).

Resumidamente, as células de leucemia foram incubadas com imunotoxinas recombinantes durante 3 dias, depois tratou-se com 3H-leucina para avaliar a inibição da síntese proteica ou com WST-1 para avaliar a morte celular.

Análise estatística

Os valores de IC50 a partir de pares correspondentes de ensaios de citotoxicidade analisando o efeito de HA22 e HA22-LR na sobrevivência das linhas celulares Raji (n=10), Ramos (n=3), CA46 (n=5), KOPN8 (n=3), e WSU-CLL (n=4) foram comparados utilizando um teste t de duas caudas emparelhado.

Toxicidade em ratinho não especifica Fêmeas de ratinhos nus (5-6 semanas, 18-22 g) foram injectadas por via intravenosa com uma única dose de 2,0 mg/kg de HA22 ou HA22-LR variando de 2,5-20 mg/kg em 0,2 mL de PBS contendo HSA a 0,2%. Os ratinhos foram observados durante 10 dias. Todos os procedimentos envolvendo os ratinhos foram conduzidos de acordo com directrizes de National Institutes of Health tal como aprovadas por Animal Care and Use Committee of the National Câncer Institute.

Farmacocinética - Nove fêmeas de ratinhos Balb/c foram injectadas na veia da cauda com 10 pg de HA22 ou HA22-LR em 0,2 mL de PBS com HSA a 0,2%. Amostras de sangue foram tomadas a partir de três ratinhos em separado a intervalos de tempo de 2, 5, 10, 20, 30, e 60 min a partir do momento da injecção, e cada ratinho foi sangrado duas vezes. Grupos de três ratinhos foram sangrados a intervalos de tempo de 2 e 60 min, 5 e 30 minutos, ou 10 e 20 min. O soro foi colhido a partir das amostras de sangue e analisado através de ELISA (Bang S. et al., Clin. Câncer. Res., 11: 1545-1550 (2005)) em comparação com uma curva padrão da imunotoxina pura correspondente, para determinar a concentração de imunotoxina no soro de ratinho.

Actividade antitumoral de xenoenxertos de ratinho Quarenta fêmeas de ratinhos com imunodeficiência combinada grave (SCID) foram injectadas por via subcutânea com 107 células CA46 no dia 0, tal como descrito anteriormente (Kreitman, RJ et al. , Int. J. Câncer., 81: 148-155 (1999)). O volume do tumor foi medido regularmente com um paquímetro nas 6 semanas seguintes. Quando o tamanho médio atingiu ~120 mm3, 6 dias após o implante, os ratinhos foram divididos em cinco grupos de oito e injectados QOD *3 com 0,2 mL de PBS contendo HSA a 0,2% e HA22 (0,3 mg/kg) ou HA22-LR (1,0, 1,75, ou 2,5 mg/kg), ou deixados sem tratamento (apenas PBS/HSA a 0,2%) . Os ratinhos eram sacrificados quando os seus tumores excediam 1.000 mm3 ou no final da experiência de 10 semanas.

Exemplo 2

Este exemplo apresenta os resultados de estudos de clivagem por proteases lisossómicas de PE. As imunotoxinas são internalizadas em células através de endocitose mediada pelo alvo, e devem atingir o citosol para exercerem o seu efeito tóxico. Uma vez que os lisossomas são a principal via de degradação para macromoléculas exógenas, internalizadas, as imunotoxinas devem evitar a degradação lisossómica no seu caminho para o citosol (Fitzgerald, D., Semin. Câncer Biol., 7: 87-95 (1996)). Por conseguinte, foram realizados estudos para determinar se uma imunotoxina pode ser produzida através da identificação e remoção de locais de clivagem de proteases lisossómicas na imunotoxina.

Digestão de imunotoxinas por proteases lisossómicas

Para determinar a localização dos locais de clivagem de proteases lisossómicas dentro de imunotoxinas, foi necessária uma grande quantidade de uma imunotoxina altamente purificada. Uma grande reserva de imunotoxina B3(dsFv)-PE38, que contém o mesmo fragmento PE38 que HA22 mas com um Fv diferente como porção de direccionamento, estava disponível (Reiter, Y. et al., Câncer Res. , 54: 2714-2718 (1994)) . B3(dsFv)-PE38 foi incubada com extractos lisossómicos preparados a partir de células Raji ou com proteases lisossómicas purificadas catepsina B, catepsina D, ou catepsina S. Alíquotas da reacção foram removidas a intervalos entre 0 e 60 horas, e os fragmentos foram separados e visualizados através de SDS-PAGE redutor.

Cada gel mostrou duas bandas esperadas no tempo 0 que correspondem aos polipéptidos ligados por dissulfureto VL-PE38 e VH, que migram a aproximadamente 50 kDa e 12 kDa, respectivamente. A digestão de B3(dsFv)-PE38 com extracto lisossómico mostrou cinco fragmentos de clivagem de 38 kDa (Lys-1), 30 kDa (Lys-2), 27 kDa (Lys-3), 25 kDa (Lys-4), e 23 kDa (Lys-5) . A digestão com Catepsina B mostrou três fragmentos de 38 kDa (B-l), 30 kDa (B-2), e 25 kDa (B-3). A digestão com Catepsina D mostrou pelo menos cinco fragmentos: 36 kDa (D-l), 30 kDa (D-2), 15 kDa (D-3) , 14 kDa (D-4), e 13 kDa (D-5) . A digestão com Catepsina S mostrou quatro fragmentos: 38 kDa (S-l), 30 kDa (S-2), 25 kDa (S —3) , e 13 kDa (S-4) . As quatro digestões contêm vários fragmentos que migram com pesos moleculares semelhantes, sugerindo que os locais de clivagem podem ser semelhantes.

Para localizar os locais de clivagem, os fragmentos foram separados através de SDS-PAGE, imobilizados através de electrotransferência, e sequenciados utilizando degradação de Edman. As sequências N-terminais foram comparadas com a sequência de B3(dsFv)-PE38 para determinar as localizações dos locais de clivagem. As sequências dos vários fragmentos correspondem ao terminal N de B3(dsFv)-PE38 VL-PE38 (Lys-4, Lys-5, D-5, e S-4) . Os restantes fragmentos estão localizados nos domínios II ou Ib de PE38. Não se verificaram locais de clivagem no Fv ou domínio III de PE.

Remoção de regiões susceptíveis a proteases

Uma vez que existem inúmeras proteases lisossómicas com especificidade ampla e frequentemente sobreponível, e os locais observados agrupam-se num segmento limitado de PE38, os locais de clivagem foram eliminados através da produção de deleções para remover os locais.

Embora B3(dsFv)-PE38 fosse utilizado para estudar os locais de clivagem, já não é investigado para utilização terapêutica. Outra imunotoxina baseada em PE38, HA22, foi utilizada para estudar os efeitos das deleções do local. HA22 é uma variante mais activa optimizada por afinidade da imunotoxina BL22 anti-CD22 (Salvatore, G. et al., Clin. Câncer Res., 8: 995-1002 (2002)), e está actualmente em ensaios clínicos para o tratamento de malignidades de células B (leucemia linfocítica crónica [CLL], leucemia de células pilosas [HCL], e leucemia linfoblástica aguda [ALL]). Uma série de deleções removendo grandes segmentos dos domínios II e Ib de PE38 foi introduzida em HA22. As proteínas mutantes foram expressas, purificadas, e comparadas com HA22 in vitro utilizando ensaios de citotoxicidade em células Raji. A Figura 3 indica a porção da sequência de PE nativa restante em HA22 e noutras formas mutadas de PE (indicadas como M1-M5) criada no decurso dos presentes estudos, e as actividades de M1-M5 relativamente a HA22 em células Raji. A remoção dos resíduos 251 a 273 (Ml) ou 365 a 394 (M2) não afecta substancialmente a actividade da imunotoxina. Da mesma forma, a deleção dos resíduos 251 a 273 e 350 a 394, juntamente com a mudança de uma cisteína livre na posição 287 para serina (M3), produz uma imunotoxina totalmente activa. A mutação C287S combinada com a deleção dos resíduos 350 a 394 e 251 a 280 (M4), que elimina a clivagem de furina em Arg279, produz uma imunotoxina que é aproximadamente 5 vezes menos activa que HA22. Inesperadamente, um mutante com grandes deleções que removeram a maioria dos resíduos e todos os locais de clivagem do domínio II e Ib (M5) era ainda altamente activo. O mutante M5 retém apenas uma sequência de 11 resíduos (274-284) no domínio II contendo o local de reconhecimento da furina e clivagem Arg279. O mutante M5 HA22 foi renomeado como "HA22-LR" para indicar que é "resistente a lisossomas". Para verificar que HA22-LR é resistente a degradação lisossómica, foi tratado com extractos lisossómicos e examinado através de SDS-PAGE ao longo de 24 horas. Embora HA22 seja grandemente hidrolisado em fragmentos menores em 30 min e completamente fragmentado após 4 h, a proteólise de HA22-LR foi muito mais lenta, com hidrólise quase indetectável às 2 h e uma fracção considerável intacta detectável ainda detectável após 24 h.

Exemplo 3

Este exemplo expõe os resultados de estudos sobre a actividade de HA22-LR em linhas celulares positivas para CD22 .

A actividade de HA22-LR foi investigada em linhas de células tumorais adicionais positivas para CD22 e comparada com HA22 utilizando um teste t de duas caudas, emparelhado, entre os valores de IC50 resultantes (Tabela 1) . HA22-LR tinha actividade indistinguível de HA22 nas linhas celulares de linfoma Ramos (n=3), CA46 (n=5) e Daudi (n=3), mas tinha diferenças significativas contra a linha celular WSU-CLL (212% de actividade, p=0,01, n=4), a linha celular KOPN-8 ALL (22% de actividade, p=0,01, n=3) , e a linha celular Raji (49%, p=0,0002, n=10). Embora houvesse alguma variabilidade na actividade de HA22-LR, HA22-LR e HA22 tinham actividades geralmente semelhantes em linhas celulares positivas para CD22.

Tabela 1. Actividade de HA22 e HA22-LR em seis linhas celulares positivas para CD22

Exemplo 4

Este Exemplo expõe os resultados de estudos da actividade de HA22-LR em células malignas positivas para CD22 obtidas de fresco a partir de pacientes.

Para determinar se a nova imunotoxina mataria também células obtidas directamente a partir de pacientes, foi testada em células de 5 pacientes com CLL e 3 com HCL. Tal como mostrado na Tabela 2, a actividade foi observada para todas as populações de células de pacientes testadas com HA22-LR. Em LLC, as células malignas de todos os 5 pacientes foram mais sensíveis a HA22-LR que a HA22, numa média de mais de 17 vezes (p = 0, 009, Wilcoxon) . As IC50 para a inibição da síntese proteica variaram de <1 a 5,6 ng/mL. HA22-LR inibiu a síntese proteica em 55% a 1 ng/mL em células do paciente CLL #2 (IC50 < 1 ng/mL). Ensaios de morte celular em células de pacientes com CLL também mostraram mais sensibilidade a HA22-LR que a HA22. Embora as IC50 de HA22 em células de pacientes com CLL tenham variado amplamente de 8 a > 1000 ng/mL, as IC50 de HA22-LR variaram menos de 10 vezes. Em HCL, HA22-LR foi geralmente menos activa que HA22 em relação à inibição da síntese proteica. Ensaios de morte celular em duas das três populações de células de pacientes com HCL mostraram resultados semelhantes. Em resumo HA22-LR foi altamente citotóxica para células CLL e HCL positivas para CD22, mas entre as células CLL que apresentaram sensibilidade variável para HA22, a citotoxicidade de HA22-LR foi significativamente mais potente e mais uniforme.

Tabela 2. Citotoxicidade de HA22 e HA22-LR para células de Leucemia Linfocitica Crónica (LLC) e Leucemia de Células Pilosas (HCL) obtidas de fresco a partir de pacientes

Exemplo 5

Este Exemplo expõe os resultados de estudos de toxicidade e farmacocinética de HA22-LR em ratinhos.

Estudos de Toxicidade

Ratinhos nus foram injectados por via intravenosa com uma dose única de HA22-LR variando de 2,5 a 20 mg/kg e observados durante 10 dias. Não foi observada nenhuma morte através do nível de dose de 20 mg/kg (Tabela 3) . Não foram avaliadas doses mais elevadas. Em marcado contraste, e consistente com dados anteriores (Bang, S. et ai., Clin. Câncer Res. , 11: 1545-1550 (2005)), uma dose de 2,0 mg/kg de HA22 produziu morte em 100% (5/5) dos ratinhos. A LD50 de dose única i.v. de HA22-LR é superior a 20 mg/kg, indicando uma diminuição na toxicidade não específica de mais de 10 vezes relativamente a HA22.

Farmacocinética

Ratinhos Balb/c foram injectados com 10 pg de HA22 ou HA22-LR e sangrados a intervalos entre 2 e 60 min. A concentração de imunotoxina em soro de ratinho foi medida através de ELISA. Os dados foram ajustados a uma simples função exponencial de decaimento (Fig. 5) . A semivida (ti/2) de HA22 foi de 14,6 min (k=0, 047), enquanto a semivida de HA22-RL foi de 7,8 min (k=0,089).

Exemplo 6

Estes Exemplo expõe os resultados de estudos in vivo de HA22-LR em xenoenxertos em ratinhos.

Com base na comparação da actividade in vitro de HA22 e HA22-LR e a baixa toxicidade animal de HA22-LR, a eficácia de HA22-LR foi testada num modelo de tumor de xenoenxerto de ratinho. Os ratinhos SCID com tumores de xenoenxerto de CA46 com ~120 mm3 em média foram tratados por via intravenosa QOD *3 com PBS, HA22 a 0,3 mg/kg, ou HA22-LR a doses de 1,0, 1,75, ou 2,5 mg/kg. O tamanho do tumor foi medido regularmente durante até 40 dias (Fig. 6) e observado visualmente durante 10 semanas.

Os tumores de ratinhos tratados com PBS cresceram rapidamente até um tamanho médio maior que 1.000 mm3 no dia 26. Os ratinhos tratados nos dias 6, 8 e 10, com HA22 a 0,3 mg/kg, a dose máxima que pode ser dada aos ratinhos QOD *3 sem toxicidade, tiveram regressões que levaram o tamanho médio do tumor a um mínimo de ~52 mm3 no dia 12. Pelo dia 21 todos os tumores tinham retomado um crescimento rápido. A resposta tumoral à dose de 1,0 mg/kg de HA22-LR foi semelhante à resposta a HA22 a 0,3 mg/kg, mas HA22-LR a 1,75 mg/kg foi muito mais eficaz. No dia 14, 5/8 ratinhos tratados com HA22-LR a 1,75 mg/kg tinham tumores indetectáveis que permaneceram imperceptíveis durante a duração do estudo. Os outros tumores inicialmente encolheram mas cresceram até um tamanho médio de 54 mm3 no dia 40. A dose de 2,5 mg/kg de HA22-LR demonstrou uma notável actividade antitumoral. Em 7/8 ratinhos os tumores desapareceram completamente pelo dia 14 e não voltaram durante 10 semanas. Um tumor diminuiu até 10 mm3 no dia 14, mas aumentou até 30 mm3 no dia 40. Concluiu-se que a baixa toxicidade animal de HA22-LR permite que sejam dadas doses maiores de imunotoxina com segurança, o que aumenta drasticamente a actividade antitumoral da imunotoxina.

Exemplo 7

Este exemplo discute os resultados de estudos utilizando como porção de direccionamento um anticorpo que se liga a um antigénio designado mesotelina presente na superfície de muitos cancros.

Uma imunotoxina utilizando o anticorpo, conhecido como "SS1" (ver, p. ex., Patente U.S. No. 7.081,5118), como porção de direccionamento, e PE38 como porção toxina, foi testada num ensaio clinico de fase I em pacientes com mesotelioma ou cancro do ovário nos quais falharam as terapias normais (Hassan, R. et ai., Clin. Câncer Res., 13: 5144-5149 (2007)). Para comparar o efeito da utilização de uma PE da invenção resistente a lisossomas, a PE utilizada na imunotoxina HA22-LR discutida nos Exemplos anteriores foi fundida com o anticorpo SS1 para formar a imunotoxina SS1-PE-LR e testada em linhas celulares expressando mesotelina contra uma imunotoxina semelhante de SS1 fundida com PE38.

Os resultados são mostrados na Tabela 4. Tal como pode ser observado, para duas das linhas celulares, a citotoxicidade foi comparável, enquanto para uma linha celular, a imunotoxina com PE-RL foi 3,72 vezes mais citotóxica para as células que a imunotoxina produzida com PE38. Numa linha celular, a imunotoxina SS1-PE-LR tinha aproximadamente metade da citotoxicidade da imunotoxina PE38, indicando que seria bastante útil se, tal como a imunotoxina HA22-LR, pudesse ser dada em doses muito mais elevadas sem toxicidade. A imunotoxina SS1-PE-LR tinha valores de IC50 no intervalo de um único dígito de ng/mL em 5 das 6 linhas celulares testadas. Para uma linha celular, a imunotoxina SS1-PE-LR foi muito menos citotóxica para as células que a imunotoxina baseada em PE38. Estes resultados mostram que é provável que as imunotoxinas que utilizam PE-LR como porção tóxica sejam agentes terapêuticos úteis, mas, tal como a maioria dos agentes terapêuticos, não serão necessariamente úteis contra células de todos os cancros ou outros distúrbios. 0 praticante pode prontamente determinar se qualquer molécula quimérica particular, utilizando como porção toxina uma PE da invenção, será eficaz em células alvo, tais como as de um cancro de um paciente, através de uma biopsia das células alvo para as quais a molécula quimérica é dirigida e teste da molécula quimérica em células provenientes de biopsias para determinar se são susceptíveis de ter o seu crescimento inibido pela molécula quimérica, com um intervalo de IC50 num único dígito de ng/mL indicando que a inibição do crescimento é aceitável.

Tabela 4. Citotoxicidade da imunotoxina SS1-PE e SS1-PE-LR para células de linhas celulares expressando mesotelina.

Exemplo δ

Este Exemplo discute os resultados dos estudos expostos aqui . A deleção de locais susceptiveis a proteases em PE produziu uma forma menor de PE que, numa imunotoxina exemplar, HA22-LR, manteve excelente actividade citotóxica em linhas celulares positivas para CD22 e em células directamente isoladas de pacientes com HCL e CLL. Além disso, HA22-LR foi consideravelmente menos tóxica para ratinhos, demonstrando uma redução de mais de 10 vezes na toxicidade não especifica. Estudos anteriores em ratinhos demonstraram que HA22 tem uma LD50 de dose única de 1,33 mg/kg (Bang, S. et ai., Clin. Câncer Res., 11: 1545-1550 (2005)). Os estudos subjacentes à presente invenção mostraram que uma única dose intravenosa de 2,0 mg/kg de HA22 matou 5/5 ratinhos, mas doses de HA22-LR até 20 mg/kg não matou qualquer um dos ratinhos injectados. Esta grande diminuição da toxicidade animal permitiu a administração de doses de tratamento muito mais elevadas, que levou a uma actividade anti-tumoral grandemente aumentada. A toxicidade não especifica de imunotoxinas em ratinhos é principalmente o resultado de danos no fígado (Kreitman, R.J. et al., Blood, 83: 426-434 (1994); Onda, M. et al., J. Immunol., 165: 7150-7156 (2000); Onda, M. et al., J. Immunol., 163: 6072-6077 (1999); Onda, M. et al., Câncer Res., 61: 5070-5077 (2001)), e a toxicidade, em pacientes, é também devida em parte à toxicidade hepática (Kreitman, R.J. et al., J. Clin. Oncol., 23: 6719-6729 (2005); Hassan, R. et al., Clin. Câncer Res., 13: 5144-5149 (2007); Kreitman, R.J. et al. , N. Engl. J. Med., 345: 241-247 (2001); Kreitman, R.J. et al., J. Clin. Oncol., 18: 1622-1636 (2000)) . A toxicidade do fígado de ratinho de LMB-2 (uma imunotoxina direccionada para o receptor da interleucina-2), e, por extensão, de todas as imunotoxinas PE38, está associada à acumulação da imunotoxina em células Kupffer no fígado, o que leva à libertação localizada de TNF-α e hepatotoxicidade grave (Onda, M. et al., J. Immunol., 165: 7150-7156 (2000)). A baixa toxicidade não específica de HA22-LR indica que não tem elementos de HA22, presumivelmente os segmentos removidos dos domínios II e Ib, responsáveis pela absorção pelas células Kupffer e/ou estimulação da libertação de TNF-α. Os segmentos removidos, no entanto, não são essenciais para toxicidade direccionada anti-CD22, uma vez que HA22-LR retém actividade anti-tumoral semelhante a HA22.

Um outro factor que pode contribuir para a diferença na toxicidade não específica é a diferença entre as semividas de HA22 e HA22-LR (Fig. 5), que em si é provavelmente devida à filtração e remoção mais eficientes de HA22-LR (51,0 kDa) do que de HA22 (63,3 kDa) pelos glomérulos no rim (Brenner, B.M. et al., Am. J. Physiol., 234: F455-F460 (1978)). A diferença de 2 vezes na semivida sozinha é, no entanto, insuficiente para explicar a diferença >10 vezes na toxicidade não especifica. Os esforços anteriores para reduzir a toxicidade não especifica das imunotoxinas têm demonstrado que a redução do ponto isoeléctrico (pi) do Fv nas imunotoxinas LMB-2, B3(dsFv)-PE38, ou SS1P diminui a sua toxicidade não especifica em aproximadamente 2 a 3 vezes em ratinhos (Onda, M. et al., J. Immunol., 163: 6072-6077 (1999); Onda, M. et al., Câncer Res., 61: 5070-5077 (2001)). Esta observação não conta para a diferença entre HA22 e HA22-LR, uma vez que as duas construções têm um Fv idêntico e o pi de HA22-LR é ligeiramente maior relativamente ao pi de HA22 (pIHA22=5,26 e pIHA22-LR=5,63). Além disso, a diferença de 2 a 3 vezes na toxicidade observada para esta estratégia é também muito menor que a diferença >10 vezes entre HA22 e HA22-LR.

Para produzir a imunotoxina HA22-LR, os locais de clivagem por proteases lisossómicas dentro de PE38 foram determinados e suprimidos. A imunotoxina B3(dsFv)-PE38 foi digerida tanto com extractos lisossómicos como Catepsinas B, D, e S, que foram implicadas em processamento de antigénios (Pluger, E.B. et al., Eur. J. Immunol., 32: 467-476 (2002); Zhang, T. et al., Immunology, 100: 13-20 (2000); Deussing, J. et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95: 4516-4521 (1998); Nakagawa, T.Y. et al. , Immunity, 10: 207-217 (1999); Shi, G.P. et al., Immunity, 10: 197-206 (1999)). Verificou-se que a clivagem por proteases lisossómicas de imunotoxinas baseadas em PE estava concentrada nos domínios II e Ib do fragmento de toxina PE38. Trabalhos anteriores com PE nativa mostraram que o domínio Ib é altamente susceptível a proteólise limitada com quimiotripsina, serina-proteinase estafilocóccica, pepsina A e subtilisina (Bourdenet, S. et al., Eur. J. Biochem., 192: 379-385 (1990)), confirmando que o domínio Ib é facilmente acessível a proteases. Os resultados aqui mostram que o domínio II em PE38 é também acessível a proteases enquanto o domínio III é menos facilmente clivado, provavelmente devido a uma estrutura mais compacta e estável. A informação da análise da clivagem foi usada para produzir uma série de deleções na imunotoxina HA22 que, na construção denominada "M5", removeu a maior parte dos domínios II e Ib, deixando apenas um pequeno trecho de 11 aminoácidos do domínio II (Fig. 3) . Este fragmento de 11 resíduos é composto pela sequência de aminoácidos RHRQPRGWEQL (SEQ ID NO:11) e contém um local de clivagem da protease furina que é importante para o processamento intracelular e activação da toxina nativa (Ogata, M. et al., J. Biol. Chem. , 265: 20678-20685 (1990); Jinno, Y. et al., J. Biol. Chem., 264: 15953-15959 (1989)). Esta construção, renomeada HA22-LR para enfatizar a sua maior resistência a proteases lisossómicas, é constituída por um dsFv anti-CD22 ligado a um fragmento de 25 kDa de PE (PE25) contendo o fragmento de 11 resíduos do domínio II e todo o domínio III. Quando testada em várias linhas celulares expressando CD22, a actividade de HA22-LR era semelhante à da imunotoxina HA22 a partir da qual foi derivada.

Estudos anteriores mostraram que o domínio Ib não é essencial para a actividade de imunotoxinas de PE (Siegall, CB et al., J. Biol. Chem., 264: 14256-14261 (1989); Kihara, A. e Pastan, I., Bioconjug. Chem., 5: 532-538 (1994);

Debinski, W. et al. , Mol. Cell. Biol., 11: 1751-1753 (1991); Kuan, C.T. e Pastan, I., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93: 974-978 (1996); Prior, T.I. et al., Biochemistry, 31: 3555-3559 (1992)). Foi proposto, no entanto, que o domínio II desempenha um papel-chave na translocação da membrana durante a intoxicação de PE (Hwang, J. et al., Cell, 48: 129-136 (1987); Prior, T.I. et al., Biochemistry, 31: 3555-3559 (1992); Taupiac, M.P. et al., Mol.

Microbiol., 31: 1385-1393 (1999); Wedekind, J.E. et al., J. Mol. Biol., 314: 823-837 (2001); Méré, J. et al., J. Biol.

Chem., 280: 21194-21201 (2005)). Os resultados aqui relatados indicam que o principal componente da actividade de translocação do domínio II pode estar localizado num curto trecho de resíduos em volta do local de clivagem da furina. Os dados mostrando uma diminuição de 5 vezes na actividade do mutante M4, que elimina o local de clivagem da furina, e o trabalho anterior (Jinno, Y. et al., J.

Biol. Chem., 264: 15953-15959 (1989)) indicam que a clivagem por furina desempenha um papel importante na citotoxicidade de PE. Uma possibilidade adicional é que a resistência de HA22-LR à degradação lisossómica pode compensar qualquer perda de actividade de translocação, permitindo que HA22-LR sobreviva por mais tempo dentro da célula. Os alvos da superfície celular das imunotoxinas e o tipo de célula alvo podem também influenciar o seu tráfico intracelular e o acesso ao citosol. HA22-LR tinha citotoxicidade semelhante ou ligeiramente menor em comparação com HA22 em células com elevada expressão de CD22, incluindo linhas celulares positivas para CD22 e células HCL frescas. No entanto, a sua citotoxicidade nas células CLL era mais potente e mais uniforme do que a de HA22. Isto pode ser devido à resistência de HA22-LR à degradação lisossómica levando a maior sobrevivência intracelular relativamente a HA22. É improvável que isto fosse simplesmente porque HA22-LR sobrevive mais tempo que HA22 no meio durante a incubação de 3 dias utilizada nos estudos, uma vez que outras experiências mostraram que HA22 tem excelente estabilidade no soro e no meio de cultura celular. É possível que a digestão por proteases lisossómicas seja um importante mecanismo de resistência à imunotoxina para células CLL, e que a molécula HA22-LR supere esta resistência. A digestão por proteases lisossómicas estaria também presente em células com elevada expressão de CD22, mas pode ser limitante do tratamento apenas em CLL, onde a expressão de CD22 é baixa e o número relativamente pequeno de moléculas internalizadas limita a actividade da imunotoxina. Além disso, a actividade de HA22-LR em CLL é muito semelhante à observada para HA22 em HCL, sugerindo que HA22-LR deve ser melhor desenvolvida como potencial tratamento para esta doença.

Além das toxicidades não específicas, outro factor importante limitando a utilidade das imunotoxinas é o desenvolvimento de anticorpos que reagem com a toxina e neutralizam a sua actividade. Outro trabalho do laboratório dos presentes inventores descreveu recentemente uma imunotoxina mutante, HA22-8X, que é significativamente menos imunogénica em ratinhos, porque muitos, mas não todos, os epitopos de células B foram removidos. Felizmente, a maior parte dos restantes epitopos de células B em HA22-8X estão localizados nas regiões do domínio II suprimido em HA22-LR. A combinação das mutações em ambas estas moléculas produzirá uma imunotoxina que é ainda menos imunogénica. HA22-LR tem várias vantagens sobre HA22 que se espera sejam aplicáveis a outras imunotoxinas de PE, mas parece especialmente promissora para o tratamento de CLL. A toxicidade não especifica de HA22-LR em ratinhos é mais de 10 vezes menor que a de HA22. A utilização de HA22-LR deve, portanto, contribuir para evitar efeitos secundários relacionados com o tratamento e permitir que os pacientes recebam doses mais elevadas para um melhor resultado terapêutico em humanos. Além disso, as deleções utilizadas para gerar HA22-LR eliminam epitopos de anticorpos conhecidos e devem ajudar a limitar a geração de anticorpos neutralizantes, permitindo que sejam dados aos pacientes mais ciclos de tratamento. Relativamente à HA22, HA22-LR tem também actividade bastante reforçada e mais uniforme contra células LLC derivadas de pacientes, e geralmente actividade semelhante em linhas celulares positivas para CD22 e células de pacientes de HCL. Por estas razões, HA22-LR representa um avanço importante no desenvolvimento de imunotoxinas.

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS <110> Pastan, Ira H. Weldon, John FitzGerald, David O Governo dos Estados Unidos da América representado pelo Secretário do Departamento de Saúde e Serviços Humanos <120> Deleções no Domínio II da Exotoxina A de Pseudomonas Que Removem Epitopos Imunogénicos

<130> 015280-545100PC <140> WO PCT/US08/75296 <141> 2008-09-04

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Exotoxina A de Pseudomonas (PE) isolada e mutada compreendendo uma sequência da fórmula: R1n-FCS-R2n-R3n-domínio funcional III de PE, em que: n = 0 ou 1 independentemente para cada um de R1, R2 e R3; R1 = 1 a 10 resíduos de aminoácidos; FCS = uma sequência de resíduos de aminoácidos de clivagem de furina, sequência essa que é clivável por furina e tem uma extremidade amino e uma extremidade carboxilo, em que a FCS: a) é representada pela fórmula P4-P3-P2-P1, em que P4 é um resíduo de aminoácido na extremidade amino, PI é um resíduo de aminoácido na extremidade carboxilo, Pl é um resíduo de arginina ou de lisina, e a referida sequência é clivável na extremidade carboxilo de Pl por furina; b) (i) compreende ainda os resíduos de aminoácidos representados por P6-P5 na referida extremidade amino, (ii) compreende ainda os resíduos de aminoácidos representados por Pl'-P2' na referida extremidade carboxilo, (iii) além de que Pl é um resíduo de arginina ou de lisina, P2' é triptofano, e P4 pode ser arginina, valina ou lisina, desde que se P4 não for arginina, então P6 e P2 são resíduos básicos, e (iv) a referida sequência é clivável na extremidade carboxilo de Pl por furina; c) é seleccionada a partir de SEQ ID NO: 12- 20; d) é SEQ ID NO: 10, ou uma versão truncada desta compreendendo RQPR (SEQ ID NO: 21); ou e) é SEQ ID NO: 11, ou uma versão truncada desta compreendendo RSKR (SEQ ID NO: 26); R2 = 1 a 10 aminoácidos; e R3 = 1 ou mais resíduos contíguos dos resíduos 365-394 de SEQ ID NO: 1; sendo o domínio funcional III de PE os resíduos 395-613 de SEQ ID NO: 1, opcionalmente compreendendo (i) substituições num ou mais resíduos correspondendo a 609-613 de SEQ ID NO: 1, (ii) uma substituição de arginina por glicina, alanina, valina, leucina, ou isoleucina numa posição correspondendo à posição 490 de SEQ ID NO: 1, (iii) uma substituição de um ou mais resíduos correspondendo a resíduos seleccionados a partir de D403, R412, R427, E431, R432, R458, D461, R467, R505, R513, E522, R538, E548, R551, R576, K590, e L597 de SEQ ID NO: 1 por alanina, glicina, serina ou glutamina, resíduos esses de SEQ ID NO: 1 que mantêm a imunogenicidade de um epitopo ou subepitopo do domínio III de PE, ou (iv) uma combinação de qualquer um de (i) — (iii), em que a PE mutada não inclui os resíduos 1 a 273 e 285 a 364 de SEQ ID NO: 1.
2. 2. PE mutada da reivindicação 1, em que n = 0 para R3.
3. 3. PE mutada da reivindicação 1, em que a FCS é conjugada ou fundida directamente com o domínio funcional III de PE.
4. 4. PE mutada da reivindicação 1, em que o domínio funcional III de PE consiste na sequência de resíduos 395-613 de SEQ ID NO: 1.
5. 5. PE mutada da reivindicação 1, em que o domínio funcional III de PE compreende (i) substituições num ou mais resíduos correspondendo a 609-613 de SEQ ID NO: 1, (ii) uma substituição de arginina por glicina, alanina, valina, leucina, ou isoleucina numa posição correspondendo à posição 490 de SEQ ID NO: 1, (iii) uma substituição de um ou mais resíduos correspondendo a resíduos seleccionados a partir de D403, R412, R427, E431, R432, R458, D461, R467, R505, R513, E522, R538, E548, R551, R576, K590, e L597 de SEQ ID NO: 1 por alanina, glicina, serina ou glutamina, resíduos esses de SEQ ID NO: 1 que mantêm a imunogenicidade de um epitopo ou subepitopo do domínio III de PE, ou (iv) uma combinação de qualquer um de (i) — (iii) .
6. 6. Molécula quimérica compreendendo: (a) uma citocina, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, citocina, anticorpo ou fragmento de anticorpo esse que se liga especificamente a um antigénio ou receptor na superfície de uma célula, conjugado ou fundido com (b) uma PE mutada de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a molécula quimérica não inclui os resíduos 1 a 273 e 285 a 364 de SEQ ID NO: 1.
7. 7. Molécula quimérica da reivindicação 6, em que ainda (a) é um anticorpo ou fragmento deste que mantém a capacidade de reconhecimento do antigénio.
8. 8. Molécula quimérica da reivindicação 7, em que o referido anticorpo ou fragmento deste se liga a um antigénio alvo seleccionado a partir de mesotelina ou CD22 .
9. 9. Molécula quimérica para utilização em inibição do crescimento de uma célula alvo possuindo um exterior, a molécula quimérica compreendendo: (a) uma citocina, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, citocina, anticorpo ou fragmento de anticorpo esse que se liga especificamente a um antigénio ou receptor no exterior da referida célula, conjugado ou fundido com (b) uma PE mutada de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a molécula quimérica não inclui os resíduos 1 ao 273 e 285 a 364 de SEQ ID NO: 1.
10. 10. Molécula quimérica da reivindicação 9, em que ainda (a) é um anticorpo ou fragmento deste que mantém a capacidade de reconhecimento do antigénio.
11. 11. Molécula quimérica da reivindicação 10, em que o referido anticorpo ou fragmento deste se liga a um antigénio alvo seleccionado a partir de mesotelina ou CD22 .
12. 12. Ácido nucleico isolado, o referido ácido nucleico codificando a PE mutada de qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
13. 13. Ácido nucleico isolado da reivindicação 12, em que ainda o referido ácido nucleico codifica uma citocina, um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga especificamente a um antigénio ou receptor na superfície de uma célula, citocina, anticorpo ou fragmento de anticorpo este que é fundido directamente ou através de um ligador peptidico à referida PE mutada.
14. 14. Ácido nucleico isolado da reivindicação 13, em que o referido ácido nucleico codifica um anticorpo ou fragmento deste que mantém a capacidade de ligação ao antigénio.
15. 15. Ácido nucleico isolado da reivindicação 14, em que o referido anticorpo ou fragmento deste se liga a um antigénio alvo seleccionado a partir de mesotelina ou CD22 . Lisboa,