PT1962883E

PT1962883E - Meios e métodos para mediar interferência proteica

Info

Publication number: PT1962883E
Application number: PT06830822T
Authority: PT
Inventors: Joost Schymkowitz; Frederic Rousseau
Original assignee: Vzw Vib; Univ Bruxelles
Priority date: 2005-12-22
Filing date: 2006-12-22
Publication date: 2012-12-21
Also published as: SI1962883T1; ES2395380T3; DK1962883T3; RS52602B

Description

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DESCRIÇÃO "MEIOS E MÉTODOS PARA MEDIAR INTERFERÊNCIA PROTEICA" Âmbito da invenção

Esta invenção situa-se no âmbito da proteómica funcional e em particular no âmbito da agregação proteica. A invenção divulga um método para interferir com a função de uma proteína alvo e usa uma molécula não natural, desenhada pelo utilizador, designada como interferente, que tem especificidade para uma proteína alvo e que induz a agregação após contato com a referida proteína alvo. Esta invenção também divulga essas moléculas interferentes e o seu uso em aplicações terapêuticas.

Antecedentes da invenção A Biologia está a entrar numa era emocionante provocada pelo aumento de ampla informação do genoma. Como as abordagens de sequenciação do genoma e genómica funcional de alto rendimento geram mais e mais informação, os investigadores necessitam de novas formas para conseguirem mais informação biológica relevante. A genómica funcional, em particular, está a fazer rápido progresso na atribuição de significado biológico a dados genómicos. A informação codifiçada no genoma compreende genes, os produtos de proteínas que medeiam a maior parte das funções nos organismos e elementos de controlo. Pensa -se que as proteínas são os mais importantes efetores nas células, embora recentemente ARNs não codificantes tenham sido identificados como desempenhando um importante papel nos processos de regulação. Várias questões chaves da biologia são centrais para continuar os projetos do genoma e são relevantes para 2 qualquer organismo celular, desde bactérias aos humanos. Um desafio é entender como os genes, que estão codificados num genoma, operam e interagem para produzir um sistema vivo complexo. Um desafio relacionado é determinar a função de todos os elementos da sequência do genoma. As ferramentas da genómica funcional permitiram várias abordagens sistemáticas, que podem fornecer respostas a algumas questões básicas para a maioria dos genes dos genomas, incluindo quando é que um gene é expresso, onde é que o seu produto está localizado, com que outros produtos genéticos interagem e que fenótipo resulta se o gene sofrer uma mutação. Análises fenotipicas de mutantes têm sido uma forte abordagem para determinar a função genética. A função dos genes pode ser alterada através de deleções no gene, mutagénese de inserção e interferência de ARN (ARNi) . ARNi é um desenvolvimento relativamente recente para reduzir a expressão de genes. Este segue relatos de genes silenciadores em plantas e outros organismos modelo, e é baseado na observação desde C. elegans que a adição de ARN de cadeia dupla (dsARN) a células interfere muitas vezes com a função genética de um modo especifico da sequência. Em muitos casos, o nivel de redução funcional não pode ser inteiramente controlado, é incompleto, o nivel de especificidade não é totalmente previsível e em alguns organismos o ARNi não funciona (e.g. na levedura Candida albicans) . É óbvio que a genómica funcional mudou a forma como a biologia é feita e ainda assim esta área ainda se encontra no seu início em termos de pormenor da complexidade subjacente aos sistemas biológicos, tal como a complexa rede da regulação genética, interações proteicas e reações bioquímicas que constituem uma célula. Existe claramente uma necessidade de desenvolver tecnologias inovadoras, especialmente na área da proteómica funcional, com o 3 objetivo de acelerar descobertas e maximizar o potencial oferecido pelos métodos complementares na genómica funcional. Seria desejável ter uma tecnologia flexivel, que possa focar-se diretamente na função biológica de uma proteína particular extracelular ou intracelular, em vez de se focar no mARN que a traduz ou manipular o gene que a codifica.

Pensa-se que a conversão de proteínas normalmente solúveis em proteínas insolúveis conformacionalmente alteradas seja um processo causativo em várias doenças, tais como por exemplo a ocorrência do péptido beta-amiloide na doença de Alzheimer e na angiopatia amiloide cerebral, depósitos de alfa-sinucleina em corpos Lewy na doença de Parkinson, priões na doença de Creutzfeldt-Jacob, superóxido dismutase na esclerose amiotrófica lateral e tau nos emaranhados neurofibrilares na demência temporal frontal e doença de Pick. Até agora, a agregação proteica tem sido estudada principalmente como um fenómeno causador de doença não desejável e é largamente aceite que a agregação mediada por beta-cruzamento é o mecanismo de agregação que ocorre mais frequentemente e o mais relevante biologicamente. A agregação beta cruzada é o termo usado para indicar que a agregação é nucleada por via da formação de folhas beta intermoleculares, para a qual cada molécula no agregado contribui com uma cadeia idêntica que tipicamente compreende pelo menos três aminoácidos contíguos. Existem agora dados abundantes para mostrar que cadeias individuais interagem para formar uma folha beta intermolecular e que esta estrutura forma a estrutura central do agregado. As regiões autoassociadas nas proteínas alvo podem ser determinadas por programas informáticos, tal como o TANGO, que foi desenvolvido para prever a propensão de agregação de péptidos e de proteínas. Uma forma específica de agregação, nomeadamente a fibra amiloide altamente 4 ordenada, já está a ser explorada na técnica para uso potencial nas ciências dos materiais. Para além disso, a W003102187 (Scegen, Pty Ltd) divulga um método para aumentar a atividade de uma molécula fundindo a referida molécula a uma sequência de translocação da membrana, em que a molécula quimérica resultante é sujeita a automontagem originando um agregado de peso molecular mais elevado. A US20050026165 (Areté Associates) divulga o uso de péptidos conformacionais, capazes de interagir com a conformação de folha beta de proteínas insolúveis tais como priões, como uma ferramenta de diagnóstico para doenças de priões. A técnica anterior também descreve mutações antimórficas ou negativas dominantes das proteínas. A inibição da função da proteína através dessas mutações foi também descrita para fins terapêuticos. A US2003/0064384 sugere um bloqueio da ação da beta-catenina através de mutantes negativos dominantes desta proteína, que podem ser usados no tratamento do cancro. A EP1325930 divulga um antagonismo da ação da prolactina por mutantes N-terminais do recetor da prolactina, o que pode ser usado para o tratamento de tumores. Sellman et al. descrevem o tratamento de agentes patogénico através de mutantes negativos dominantes, i.e. do envenenamento pela toxina do antraz causado pelo Bacilus anthraxis. Os quatro mutantes inibidores identificados, são mutantes em 3 pontos e um mutante de deleção (Sellman et al., Science 292: 695-697 (2001)) .

Resumo da Invenção A presente invenção relaciona-se com uma tecnologia para a agregação proteica controlada e induzida de proteínas alvo específicas. A invenção também fornece moléculas concebidas de novo, aqui designadas como moléculas interferentes, que compreendem pelo menos uma região de agregação, cuja referida região de agregação é derivada de uma proteína 5 alvo. Numa forma de realização preferida, a molécula interferente compreende pelo menos uma região de autoassociação que está fundida a uma porção que previne a agregação da referida região de autoassociação. Após contato entre uma proteína alvo escolhida e uma molécula interferente especificamente concebida, uma coagregação específica ocorre entre o alvo e o interferente, resultando numa regulação negativa ou supressão funcional da função biológica para a referida proteína alvo. Esta supressão da proteína é condicional em presença de agregados, que são induzidos pela presença da molécula interferente. Uma vantagem adicional é que a força da interferência proteica pode ser controlada experimentalmente variando o número de regiões de agregação na molécula interferente. A invenção não só fornece uma ferramenta eficiente para a regulação negativa da função biológica de uma proteína extra ou da intracelular específica, como também tem importantes aplicações terapêuticas, na agricultura e de diagnóstico.

Legendas das Figuras

Figura 1: Interferência proteica em E. coli usando expressão recombinante de 4 diferentes construções interferentes, que visam enzimas específicas envolvidas na biossíntese de aminoácidos. A parte B de cada molécula interferente consiste em 3 sequências sintéticas de autoassociação, separadas por ligantes de 2 aminoácidos e uma região específica de autoassociação derivada da enzima. As regiões de autoassociação (sintéticas e específicas) estão acopladas à proteína NusA, que serve como uma porção para prevenir a agregação (id est parte A da molécula interferente) das regiões de autoassociação.

Figura 2: Células de S. Cerevisiae com uma cópia endógena do tipo selvagem da URA3 foram transformadas com o plasmídeo vazio, o plasmídeo com apenas uma sequência 6 agregadora ou o plasmídeo com a construção de fusão agregador-Ura3. As células foram crescidas durante a noite em meio contendo glucose, lavadas e posteriormente colocadas em placa em meio contendo glucose (esquerda) ou galatose (direita) . 5 pL de diluições de 10 vezes são colocados em placa (D06oo=l como a concentração mais alta).

Figura 3: Células de C. albicans com duas cópias endógenas do tipo selvagem de TUPI foram transformadas com o plasmideo vazio e com o plasmídeo com a construção de fusão interfor-Tupl. As células foram crescidas durante a noite em meio contendo glucose, lavadas e posteriormente 20 colónias foram colocadas em meio contendo glucose (esquerda) ou casaminoácido (direita). O painel de cima são aqueles com um plasmídeo vazio, o painel de baixo com a construção interferente ("+ aggreg-TUPl" significa a construção interferor-TUPl). As fotografias foram tiradas após 4 dias de crescimento.

Objetivos e descrição detalhada da invenção

Na presente invenção nós desenvolvemos um processo para a regulação negativa da função biológica de uma proteína através do uso de moléculas interferentes, que possuem especificidade para uma proteína alvo. Após contacto com uma proteína alvo, coagregação ocorre entre a molécula interferente e o alvo. A agregação retira o alvo do seu ambiente solúvel e resulta numa redução funcional da proteína alvo. O objeto da invenção é definido nas reivindicações. A invenção fornece um método para a regulação negativa da função biológica de uma proteína (em que o método não é aplicado em humanos ou animais) , compreendendo contactar a referida proteína com uma molécula de ocorrência não 7 natural compreendendo pelo menos uma região de autoassociação isolada da referida proteína.

Noutra forma de realização, a invenção fornece um método para a regulação negativa da função biológica de uma proteína, compreendendo contactar a referida proteína com uma molécula de ocorrência não natural consistindo pelo menos numa região de autoassociação isolada da referida proteína. A invenção fornece também um método para a regulação negativa da função biológica de uma proteína (em que o método não é aplicado em humanos ou animais) compreendendo contactar a referida proteína com uma molécula de ocorrência não natural compreendendo pelo menos uma região de autoassociação isolada da referida proteína, em que o domínio de autoassociação está fundido a uma porção que previne a agregação da referida região de autoassociação. A invenção fornece também um método para a regulação negativa da função biológica de uma proteína (em que o método não é aplicado em humanos ou animais), compreendendo contactar a referida proteína com uma molécula de ocorrência não natural consistindo pelo menos numa região de autoassociação isolada da referida proteína em que o domínio de autoassociação está fundido a uma porção que previne a agregação da referida região de autoassociação.

A invenção fornece também um método para a regulação negativa da função biológica de uma proteína (em que o método não é aplicado em humanos ou animais) que compreende contactar a referida proteína com uma molécula de ocorrência não natural que compreende a parte A e a parte B, em que i) a parte A é um péptido, ou um domínio proteico ou uma esfera de agarose que previne a agregação da parte B e ii) a parte B, que compreende pelo menos 1 região de autoassociação que consiste em pelo menos 3 aminoácidos contíguos e em que a referida região é isolada da referida proteína, cuja função é para ser regulada negativamente, e em que um ligante está opcionalmente presente entre as partes A e B. A invenção fornece também um método para a regulação negativa da função de uma proteína (em que o método não é aplicado em humanos ou animais) compreendendo contactar a referida proteína com uma molécula de ocorrência não natural, que compreende a parte A e a parte B, em que i) parte A é um péptido, ou um domínio de proteína ou uma esfera de agarose, que previne a agregação da parte B de modo a que a parte B esteja em contacto direto com o solvente em que a referida molécula e a referida proteína estão presentes e ii) a parte B, que compreende pelo menos 1 região de autoassociação, em que a referida região consiste em pelo menos 3 aminoácidos contíguos e em que a referida região é isolada da referida proteína, cuja função é ser regulada negativamente, e em que um ligante está opcionalmente presente entre as partes A e B.

Noutra forma de realização, a parte B da molécula de ocorrência não natural compreende pelo menos 2 regiões de autoassociação, em que pelo menos uma das referidas regiões é derivada da referida proteína, cuja função é ser interferida. 0 termo 'molécula de ocorrência não natural' refere-se ao facto de que tal molécula interferente é feita pelo homem. Por exemplo, quando uma molécula interferente é um polipéptido (isto é, ambas as partes A e B são péptidos) , esse polipéptido é concebido isolando a parte B de uma proteína alvo (isto é, a região de autoassociação) e 9 acoplando a referida parte B a uma parte A que pode ser derivada (i) de outra proteína ou (ii) da mesma proteína alvo e nesse caso a referida parte A não está presente imediatamente adjacente à parte B. Ainda por outras palavras, a região de autoassociação derivada do alvo fundido a uma porção (quando o interferente é um polipéptido, a referida porção também é um polipéptido) que previne a agregação da região de autoassociação, é diferente de uma fusão de ocorrência natural entre as partes A e B pelo menos num aminoácido natural. Tipicamente, essa molécula interferente não existirá como um polipéptido contíguo numa proteína codificada por um gene num genoma não recombinante.

Deve ser evidente que moléculas de interferência podem ser concebidas numa forma modular, pela introdução de repetição e alterando a ordem das partes A e B. Uma lista não limitativa das seguintes combinações é: um interferente com a estrutura A-B, um interferente com a estrutura B-A, um interferente com a estrutura A-B-A, um interferente com a estrutura B-A-B, um interferente com a estrutura A'-B-A" e um interferente com a estrutura B'-A-B", em que um ligante (espaçador) está opcionalmente presente entre as partes A, A', A" e B, B', B". A, A' e A" são diferentes de porções semelhantes (por exemplo, diferentes sequências de peptídicas) . B, B' e B" são sequências de autoassociação diferentes ou semelhantes (por exemplo, B é uma sequência de autoassociação derivada de uma proteína alvo e B' é uma sequência de autoassociação sintética).

Ainda por outras palavras, a invenção fornece um método para a regulação negativa da função biológica de uma proteína (em que o método não é aplicado em humanos ou animais) , que compreende contactar a referida proteína com uma molécula compreendendo pelo menos uma região de 10 autoassociação isolada da referida proteína, em que a referida região de autoassociação está fundida a uma porção que previne a agregação da referida região de autoassociação, de modo a que a referida região de autoassociação esteja em contacto direto com o solvente, em que a referida molécula e a referida proteína estão presentes.

Pelo que foi referido acima, deve ser claro que a referida 'porção' é equivalente ao termo parte A e a parte B é equivalente à expressão 'pelo menos uma região de autoassociação ' . A expressão 'regulação negativa da função de uma proteína' significa que a atividade biológica normal de uma proteína é reduzida (inibida, regulada negativamente, reduzida e perturbada, são palavras aqui equivalentes) ou que a proteína é retirada do seu ambiente biológico natural (por exemplo, uma proteína que é residente normal do retículo endoplasmático não está presente através da regulação negativa da sua função). Portanto, aplicando o método da invenção, a função de uma proteína é perturbada através da agregação da referida proteína, contactando a referida proteína com a molécula não natural da presente invenção. A referida molécula não natural é aqui designada como 'interferência' ou a 'molécula interferente'. A agregação refere-se ao facto de uma proteína, que é normalmente solúvel, ser modificada para uma proteína insolúvel ou numa proteína agregada no seu ambiente biológico normal através de contacto direto ou ligação a um interferente. A expressão 'regulação negativa da função de uma proteína' pode também ser intercambiada com a expressão 'reduzir a função da proteína' ou 'interferir negativamente com a função da proteína'. A regulação negativa da função de uma proteína pode também significar que uma proteína deixa de 11 estar presente numa forma solúvel na célula ou que uma proteína deixa de estar presente numa forma solúvel no seu ambiente biológico normal (por exemplo, localização (sub)celular ou extracelular). Para além disso, pode também significar que a proteína agregada é degradada através de mecanismos de eliminação naturais da célula e deixa de ser detetada na sua forma solúvel ou insolúvel. Para além disso, pode significar também que uma proteína recetora transmembranar deixa de se conseguir ligar ao seu ligante normal através da agregação induzida pela interferência da referida proteína transmembranar. Portanto, a regulação negativa da função de uma proteína pode também significar que uma proteína que é residente normal, por exemplo, da mitocôndria deixa de estar aí presente através do método de interferência proteica. Numa forma de realização específica, a 'regulação negativa da função de uma proteína' ou 'a interferência negativa com a função de uma proteína' ou 'a redução da função de uma proteína' é pelo menos de 20%, pelo menos de 30%, pelo menos de 40%, pelo menos de 50%, pelo menos de 60%, pelo menos de 70%, pelo menos de 80%, pelo menos de 90% , pelo menos de 95 %, ou mesmo até uma perda de 100% da função, comparada com a função (100%) normal da proteína. A função de uma proteína ou a ausência de uma proteína no seu ambiente biológico normal (localização) pode ser convenientemente determinada por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, dependendo da proteína alvo de interesse, a função pode ser determinada através da medição da atividade enzimática reduzida. A presença reduzida de uma proteína na sua localização biológica normal pode, por exemplo, ser medida pela falta de formação de um complexo, a falta de ocorrência de uma proteína alvo num compartimento subcelular, a presença da proteína alvo na forma solúvel, a presença da proteína alvo numa forma 12 agregada (insolúvel é aqui um termo equivalente). Em alternativa, o efeito da regulação negativa de uma proteína alvo pode ser medido num ensaio celular (por exemplo, perdas ou ganhos de crescimento, perdas ou ganhos de invasão, perdas ou ganhos de atividade proteolítica).

Numa forma de realização particular essa atividade biológica normal (ou função normal, ou localização normal) de uma proteína pode ser interferida intracelularmente ou extracelularmente. ΛIntracelularmente' refere-se à localização de uma proteína dentro da célula de um organismo ou hospedeiro (por exemplo, o citoplasma, a mitocôndria, o lisossoma, o vacúolo, o núcleo, o cloroplasto, o retículo endoplasmático (ER), a membrana celular, a membrana mitocondrial, a membrana do cloroplasto, ...)· 'Extracelularmente' refere-se não só à localização de uma proteína no meio extracelular da célula, mas também se refere a proteínas que contactam com o meio extracelular, tal como proteínas ancoradas à membrana, uma proteína transmembranar, etc. Exemplos não limitativos de proteínas extracelulares são proteínas secretadas (por exemplo, proteases, anticorpos e citoquinas presentes no sangue ou plasma) ou proteínas presentes na matriz extracelular (por exemplo, mataloproteínas da matriz e proteínas transmembranares (por exemplo, recetor do fator de crescimento)). Células ou hospedeiros que podem ser alvos com o método da invenção compreendem células procarióticas e eucarióticas. Exemplos não limitativos são vírus, bactérias, leveduras, fungos, protozoários, plantas e mamíferos, incluindo humanos.

Deve ser evidente que o método de regulação negativa da função biológica de uma proteína pode ser usado para 13 interferir com a função biológica com 1, 2, 3, 4, 5 ou até mais proteínas em simultâneo. Particularmente, uma vez que a parte B compreende pelo menos uma região de autoassociação, a parte B pode, por exemplo, compreender diferentes regiões de autoassociação, cada uma especifica para uma proteína diferente. 0 interferente usado para interferir com a função biológica de pelo menos uma proteína alvo, não está presente naturalmente na natureza e pode ser produzida através de síntese química ou através da expressão de proteínas recombinantes ou através de uma combinação da última.

Portanto, uma molécula interferente compreende pelo menos uma região de autoassociação (portanto a parte B compreende pelo menos uma região de autoassociação). Uma 'região de autoassociação' é aqui definida como uma sequência contígua de aminoácidos que possui uma elevada tendência para formar uma montagem molecular firme com sequências idênticas ou bastante relacionadas. A expressão 'ter uma elevada tendência para formar uma montagem molecular firme' pode também ser interpretada como 'ter uma elevada afinidade'. Afinidade é normalmente convertida em valores de dissociação (valores de Kd). Valores de Kd entre o interferente e a proteína alvo estão tipicamente situados entre as gamas micromolares e nanomolares, mas podem ser sub-nanomolares ou supra-micromolares. Exemplos de regiões de autoassociação são as regiões de folha beta intermoleculares, elementos alfa-helicoidais, ansas de gancho de cabelo, sequências transmembranares e sequências de sinal. Numa forma de realização particular, pelo menos uma região de autoassociação está presente na parte B. Noutra forma de realização particular, pelo menos duas regiões de autoassociação estão presentes na parte B. Noutra forma de realização particular, 3, 4, 5, 6 ou mais regiões de autoassociação estão presentes na parte B. As 14 regiões de autoassociação referidas podem ser interligadas através de uma região de ligação (por exemplo, um espaçador de cerca de 2 até cerca de 4 aminoácidos) . Uma (ou pelo menos uma) região de autoassociação presente na parte B é derivada de uma proteina alvo. Numa forma de realização particular, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais regiões de autoassociação na parte B são derivadas de uma proteina alvo. Noutra forma de realização particular, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais regiões de autoassociação na parte B são derivadas de mais do que 1 proteina alvo. Noutra forma de realização particular, as pelo menos duas regiões de autoassociação presentes na parte B são derivadas da mesma proteina alvo. A proteina alvo é aqui definida como a proteina com a qual se quer interferir com a sua função. Assim, de modo a tornar a parte B especifica para pelo menos uma proteina, pelo menos uma região de autoassociação na parte B deve ser 'derivada da' proteina alvo ou pelo menos uma região de autoassociação deve estar presente na referida proteina alvo. "Derivado de" significa que pelo menos uma região de autoassociação contígua deve ser idêntica ou homóloga na sequência de aminoácidos em relação a uma região contígua da referida proteína alvo. Numa forma de realização preferida, a referida, pelo menos uma, região de autoassociação , é pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% idêntica à região de autoassociação presente na referida região da proteína alvo. É preferível que a extensão de uma região de autoassociação consista em pelo menos 3 aminoácidos contíguos. Numa forma de realização preferida, a região mencionada consiste em cerca de 3 até cerca de 30 aminoácidos. Numa outra forma de realização preferencial, a referida região consiste em cerca de 3 até cerca de 25 aminoácidos. Numa forma de 15 realização particularmente preferida, a referida região consiste em cerca de 5 até cerca de 20 aminoácidos.

As regiões de autoassociação presentes na parte B da molécula interferente também podem ser determinadas e isoladas a partir de proteínas que não a proteína alvo e as referidas regiões de autoassociação são acopladas a pelo menos uma região de autoassociação derivada da proteína alvo, opcionalmente com um espaçador (ou ligante) entre as referidas regiões de autoassociação. Por exemplo, as regiões de autoassociação que podem ser utilizadas podem derivar das regiões de autoassociação de proteínas que normalmente não ocorrem no hospedeiro em que a regulação negativa da função biológica de uma proteína alvo é realizada (assim, algumas regiões de autoassociação na parte B podem ser tiradas de um organismo não relacionado). A natureza das regiões de autoassociação determina o nível de inibição (id est a força da inibição) de uma proteína alvo através de agregação induzida. Mais do que uma região de autoassociação pode ser usada de uma proteína alvo numa molécula interferente mas também as regiões de autoassociação sintéticas ou as regiões de autoassociação derivadas de uma proteína alvo diferente podem ser usadas em combinação com uma ou mais regiões de autoassociação de uma proteína alvo.

Numa forma de realização particular, tais regiões de autoassociação consistem numa sequência sintética que não deriva de proteínas existentes e, portanto, não ocorre na natureza. Exemplos de tais regiões de autoassociação sintéticas são descritos em López de la Paz M. et al (2002) PNAS 99, 25, p.16053, tabela 1.

Se pelo menos uma região de autoassociação (id est a parte B da molécula interferente) tiver caráter hidrofóbico 16 (devido às suas propriedades indutoras de agregação) é preferencialmente fundida (ou ligada ou acoplada, que são termos equivalentes) a uma porção (id est a parte A da molécula interferente) que previne a agregação da referida região de autoassociação e expõe a referida região de autoassociação em contacto direto com o solvente no qual o interferente está presente. Como tal, em certas formas de realização, a parte A tem uma função de solubilização para manter a parte B em solução. Em tais formas de realização, a referida parte A é, por exemplo, um péptido, um dominio de proteina, uma proteína (preferencialmente diferente da proteína alvo, ver exemplo 2), uma estrutura de glicosilação, um grupo químico (hidrofílico) ou uma ciclodextrina ou seu derivado. Em certas outras formas de realização, a referida parte A é uma esfera de agarose, uma esfera de látex, uma esfera de celulose, uma esfera magnética, uma esfera de sílica, uma esfera de poliacrilamida, uma microesfera, uma esfera de vidro ou qualquer outro suporte sólido (e.g. poliestireno, plástico, membrana de nitrocelulose, vidro).

Nas moléculas de interferência, a parte B e a parte A podem ser opcionalmente ligadas (ou acopladas) por meio de uma região ligante (um espaçador é uma palavra equivalente). A referida região ligante pode ser, por exemplo, uma ligação não natural feita por síntese química (por exemplo, um ligante flexível tal como uma cadeia de alcano substituída com hidroxi, dextrano polietileno glicol ou o ligante pode também consistir em homólogos de aminoácidos) ou o referido ligante pode existir de aminoácidos naturais tais como uma poli (treonina) ou poli (serina) . Preferencialmente, quando o ligante compreende aminoácidos, o comprimento da referida região do ligante está compreendido entre cerca de 3 e cerca de 15 aminoácidos, mais preferencialmente entre cerca de 5 e cerca de 10 aminoácidos. Frequentemente, um ligante 17 flexível pode ser escolhido mas prevê-se que um ligante rígido também funciona. Sequências de ligante flexível podem ser conseguidas da natureza, na maior parte das vezes, tais regiões ligam domínios em proteínas que ocorrem naturalmente, tais como o ligante entre os domínios SH2 e SH3 de src tirosina quinase ou o ligante entre os domínios BRCT de BRCA1. 0 termo "contactar" refere-se ao processo no qual o interferente e a proteína alvo interagem. Numa forma, o interferente é adicionado (por exemplo, o interferente está presente numa concentração específica numa solução) a uma amostra compreendendo a proteína alvo. Numa outra forma, a molécula interferente é injetada num organismo que compreende a proteína alvo. Entrar em contacto pode também ser realizado, por exemplo, através do processo de transformação de uma célula compreendendo a proteína alvo, por exemplo, uma célula isolada, por exemplo, em cultura de células, um microrganismo unicelular ou uma célula ou uma variedade de células num organismo multicelular. A transformação implica que a molécula interferente seja introduzida num hospedeiro (por exemplo, uma célula) através de transfecção vulgarmente conhecida ou métodos de transformação (por exemplo, por técnicas de transferência genética, incluindo fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, eletroporação, microinjeção, métodos virais, a utilização de lipossomas catiónicos (ver, por exemplo, Feigner, P.L. et al (1987), Proc. Natl Acad. Sei USA 84, 7413), formulações de lípidos catiónicos comercialmente disponíveis, por exemplo, Tfx 50 (Promega) ou Lipofectamin2000 (Life Technologies), bombardeamento de partículas, etc.). A molécula interferente pode ser codificada por um vetor recombinante (por exemplo, um plasmídeo, cosmídeo, vetor virai) e pode ser sintetizada no interior de um hospedeiro. Numa forma de realização 18 alternativa, a molécula interferente pode ser introduzida numa célula através de entrega mediada por transportador, por exemplo, transportadores lipossomais ou nano-partículas ou por injeção. Em ainda outra forma de realização alternativa, a molécula interferente pode entrar numa célula através de uma sequência que medeia a penetração celular (ou translocação celular). Neste último caso, a molécula interferente é adicionalmente modificada através de ligação recombinante ou sintética de uma sequência de penetração celular. Assim, a molécula interferente (por exemplo, como um polipéptido) pode ser adicionalmente fundida ou quimicamente acoplada a uma sequência facilitadora da transdução de proteínas de fusão ou quimicamente acopladas para dentro de células procarióticas ou eucarióticas. Sequências facilitadoras da transdução de proteínas são conhecidas pelo perito da técnica e incluem, mas não se limitam a, Domínios de Transdução de Proteínas. Preferencialmente, a referida sequência é selecionada a partir do grupo que compreende a proteína TAT de HIV, uma sequência poliarginina, penetratina, e pep-1. Ainda outros péptidos permeáveis a células vulgarmente usados são divulgados em Joliot A. e Prochiantz A. (2004) Nature Cell Biol: 6 (3) 189-193.

Numa forma de realização particular, o interferente consiste essencialmente em aminoácidos. Em algumas formas de realização, as sequências das partes A e B da molécula interferente são derivadas da mesma proteína alvo. Em outras formas de realização, o interferente é uma molécula quimérica significando que as sequências das partes A e B são derivadas de proteínas diferentes, por exemplo, a parte A é derivada de uma proteína e, pelo menos uma região de agregação da parte B é derivada da proteína alvo. Um "Polipéptido" refere-se a um polímero no qual os monômeros são aminoácidos e estão unidos através de ligações amida, 19 alternativamente referido como um péptido. Quando os aminoácidos são alfa aminoácidos, tanto o isômero L-ótico como o isômero D-ótico podem ser usados. Adicionalmente, os aminoácidos não naturais, por exemplo, beta-alanina, fenilglicina e homoarginina são também incluídos. Aminoácidos comummente encontrados que não são codificados por genes também podem ser usados na presente invenção. Todos ou parte dos aminoácidos usados nas interferências podem ser D ou L-isômeros. Além disso, outros peptidomiméticos também são úteis na presente invenção. Especificamente, referimos e incorporamos aqui a revisão do desenvolvimento e uso dos peptidomiméticos como antagonistas para interações proteína-proteína de Sillerud LO e Larson RS (2005) Curr Protein Pept Sei. 6(2):151-69. Além disso, D-aminoácidos podem ser adicionados à sequência de péptidos para estabilizar as caraterísticas de girar (especialmente no caso da glicina). Numa outra abordagem, miméticos de viragem alfa, beta, gama ou delta (tais como alfa, beta, gama ou delta di-péptidos podem ser empregues para imitar motivos estruturais e características de viragem num péptido e, em simultâneo, proporcionar estabilidade da proteólise e melhorar outras propriedades, tais como, por exemplo, estabilidade conformacional e solubilidade.

Isolamento de uma região de autoassociação a partir de uma proteína alvo:

As sequências de autoassociação são muitas vezes hidrofóbicas, mas nem sempre é este o caso. Por exemplo, as regiões de autoassociação de priões leveduras são bastante polares. De facto, a agregação beta-cruzada de uma região de aminoácidos derivada de um polipéptido ou proteína pode ser iniciada quando (1) tem uma hidrofobicidade elevada (2) tem uma boa propensão de folha-beta, (3) tem uma carga líquida baixa e (4) é exposto a solvente. Portanto, as 20 regiões proteicas de autoassociação ("segmento" é um termo equivalente para "região") são na maioria das vezes ocultadas na posição dobrada e não estão expostas ao solvente. O último é confirmado pela descoberta experimental que em muitas proteínas globulares, a agregação ocorre durante a redobragem ou sob condições nas quais os estados desnaturados ou parcialmente dobrados estão significativamente presentes, isto é, a concentração elevada ou como resultado de condições destabilizadoras ou mutações.

Baseado nestas descobertas, foram desenvolvidos algoritmos de computador que são capazes de prever as regiões de autoassociação ("agregação-β de fragmentos ou segmentos" é uma expressão equivalente) nas proteínas. Um desses algoritmos, TANGO, é baseado num algoritmo de mecânica estatística que considera os três parâmetros fisico-quimicos acima descritos mas considera também a competição entre diferentes conformações estruturais: agregados de folha-beta, alfa-hélice, ansa-beta, e o estado dobrado (Fernadez-Escamilla, AM et al (2004) Nat. Biotechnol. 22, 1302-1306, especialmente a secção de Métodos nas páginas 1305 e 1306 são aqui especif icamente incorporadas como referência e também as Notas suplementares 1 e 2 do mesmo artigo para mais detalhes nos métodos e conjuntos de dados usados para calibração e o teste do algoritmo TANGO). Assim, as regiões de autoassociação , presentes nas proteínas alvo são obtidas por algoritmos de computador tal como TANGO. As regiões de autoassociação são frequentemente ocultadas dentro do núcleo das proteínas alvo10, blindando de forma eficaz o péptido em relação à associação intermolecular por uma barreira de energia correspondente à estabilidade das proteínas alvo11. No seu ambiente normal (por exemplo, citoplasma, matriz extracelular) a proteina alvo tem ajuda de chaperonas moleculares que assistem a 21 proteína na preservação da sua forma monomérica, funcional12. 0 modelo usado pelo algoritmo TANGO6 é concebido para prever a agregação- -beta em péptidos e proteínas e consiste num espaço de fase que abrange a espiral aleatória e as conformações nativas, bem como outros estados conformacionais principais, nomeadamente ansa-beta, alfa-hélice e agregado-beta. Todo o segmento de um péptido pode povoar cada um destes estados de acordo com uma distribuição de Boltzman. Por conseguinte, para prever as regiões de autoassociação de um péptido, TANGO calcula simplesmente a função de partição do espaço de fase. Para estimar a tendência de agregação de uma sequência específica de aminoácidos, são tomados os seguintes pressupostos: (i) num agregado ordenado de folhas-beta, a principal estrutura secundária é a cadeia-beta. (ii) as regiões envolvidas no processo de agregação estão totalmente ocultadas, pagando assim, por completo, os custos e ganhos de solvatação, entropia total e otimizar o seu potencial de ligação H (isto é, o número de ligações de H feitas no agregado está relacionado com o número de grupos de dadores que são compensados pelos aceitadores. Um excesso de dadores ou aceitadores permanecem insatisfeitos). (iii) cargas complementares na janela selecionada estabelecem interações eletroestáticas favoráveis, e a carga líquida total do péptido dentro mas também fora da janela desfavorece a agregação. TANGO pode ser acedido na internet em http://tango.embl.de/. 0 algoritmo Zyggregator é outro exemplo (Pawar AP et al (2005) J. Mol. Biol. 350, 379-392) . Estes algoritmos identificam sequências propensas à agregação por compararem os valores de propensão à agregação de uma dada sequência de aminoácidos com uma propensão média calculada a partir de um conjunto de sequências de comprimento semelhante. 22

Na presente invenção, estimamos que uma região de autoassociação identificada numa proteína alvo com um valor TANGO de 5% corresponde a um risco de agregação in vitro de 95%6. Nós calculámos que 85% das proteínas do proteoma humano que não estão relacionadas com doença têm pelo menos uma região com um valor TANGO acima do limite determinado experimentalmente de 5%. Isto mostra que embora mais de 85% das proteínas humanas contenha pelo menos uma região de autoassociação simples essa agregação é prevenida devido à estabilidade normal da proteina e à assistência por parte da maquinaria chaperona. A presente invenção isola estas regiões de autoassociação das proteínas alvo para a preparação das moléculas de interferência, as quais são usadas para a indução específica da agregação proteica. A parte B das moléculas de interferência compreende pelo menos 1 região de agregação e pelo menos 1 região de agregação é derivada de uma proteína alvo. É possível controlar a força da interferência proteica (a força da interferência proteica é, por exemplo, a % da perda da função biológica de uma proteína alvo quando a referida proteína é posta em contacto com uma molécula interferente específica) , através da incorporação de mais do que uma região de agregação de uma proteína alvo na parte B da molécula interferente. De facto, as regiões de agregação derivadas de uma proteína alvo com um valor TANGO baixo (tipicamente entre 5% até cerca de 20%) podem ser repetidas na parte B do interferente para 2, 3, ou 4 ou mais regiões de agregação. Como uma forma de realização alternativa, 1, 2 ou 3 ou 4 ou mais regiões de agregação diferentes com um valor TANGO baixo, derivadas da mesma proteína podem ser incorporadas dentro da parte B do interferente. Tal como outra forma de realização alternativa, 1, 2, 3, 4 ou mais regiões de agregação sintéticas (portanto, não derivadas da proteína alvo) podem ser combinadas com 1, 2, 3, 4 ou mais regiões de agregação derivadas da proteína alvo na parte B 23 para melhorar a regulação negativa de uma proteína alvo com um valor TANGO baixo. A invenção fornece uma molécula de ocorrência não natural, capaz de agregar uma proteína alvo. Numa forma de realização particular, a referida molécula não natural é proteica de natureza. Proteica significa que a molécula compreende L-aminoácidos ou D-aminoácidos ou uma mistura de L- e D-aminoácidos ou uma combinação de aminoácidos naturais e peptidomiméticos. A invenção fornece uma molécula de ocorrência não natural, compreendendo pelo menos uma região de autoassociação isolada a partir de um domínio proteico capaz de ser solúvel em água, em que a referida região de autoassociação está fundida a uma porção que previne a agregação da referida região de autoassociação . A invenção também fornece uma molécula de ocorrência não natural compreendendo pelo menos uma região de autoassociação isolada a partir de um domínio proteico capaz de ser solúvel em água, em que a referida região de autoassociação está fundida a uma porção que previne a agregação da referida região de autoassociação, de modo que a referida região de autoassociação está em contacto direto com o solvente onde esteja presente. A invenção também fornece uma molécula de ocorrência não natural, consistindo em pelo menos uma região de autoassociação isolada a partir de um domínio proteico capaz de ser solúvel em água, em que a referida região de autoassociação está fundida a uma porção que previne a agregação da referida região de autoassociação. 24 A invenção também fornece uma molécula de ocorrência não natural, consistindo em pelo menos uma região de autoassociação isolada a partir de um domínio proteico capaz de ser solúvel em água, em que a referida região de autoassociação está fundida a uma porção que previne a agregação da referida região de autoassociação , de modo que a referida região de autoassociação está em contacto direto com um solvente quando esteja presente.

Numa forma de realização particular essa porção é, por exemplo, um péptido, uma esfera de agarose, um domínio proteico ou uma proteína. Noutra forma de realização particular, a referida molécula de ocorrência não natural, que compreende pelo menos duas regiões de autoassociação , na qual pelo menos uma região de autoassociação é derivada de uma proteína alvo.

Por outras palavras, a invenção fornece uma molécula de ocorrência não natural, que compreende a parte A e a parte B, em que i) a parte A compreende uma região, tal como um péptido, domínio proteico, proteína ou esfera de agarose, prevenindo a agregação da parte B, e ii) a parte B, que compreende pelo menos 1 região de autoassociação , em que a referida região consiste em pelo menos 3 aminoácidos contíguos e em que a referida região se encontra isolada em relação à referida proteína, cuja função deve sofrer interferência, e em que um ligante está opcionalmente presente entre as partes A e B.

Ainda por outras palavras, a invenção fornece uma molécula de ocorrência não natural, que compreende a parte A e a parte B, em que i) a parte A compreende uma região, tal como um péptido, domínio proteico ou esfera de agarose, prevenindo a agregação da parte B, e ii) a parte B, que compreende pelo menos 1 região de autoassociação, 25 consistindo em pelo menos 3 aminoácidos contíguos e em que pelo menos uma região de autoassociação é isolada de uma proteína, cuja função deve sofrer interferência, e em que a referida região é isolada em relação a um domínio da referida proteína que é capaz de ser solúvel em água, e em que um ligante está opcionalmente presente entre as partes A e B, e em que a parte B está em contacto direto com o ambiente em que a referida molécula e a referida proteína estão presentes.

Ainda por outras palavras, a invenção fornece uma molécula de ocorrência não natural, que compreende a parte A e a parte B em que i) a parte A compreende uma região, tal como um péptido, domínio proteica ou esfera de agarose, prevenindo a agregação da parte B, e ii) a parte B que consiste em pelo menos 1 região de autoassociação, consistindo em pelo menos 3 aminoácidos contíguos e em que a referida região de autoassociação é isolada de uma proteína, cuja função deve sofrer interferência e em que a referida região é derivada de um domínio da referida proteína, que é capaz de ser solúvel em água, e em que um ligante está opcionalmente presente entre as partes A e B, e em que a parte B está em contato direto com o ambiente em que a referida molécula e a referida proteína estão presentes. A expressão 'isolada (ou forma derivada) de um domínio da referida proteína que é capaz de ser solúvel em água' significa que uma região de autoassociação é uma sequência de aminoácidos contíguos isolada de um domínio solúvel de uma proteína. 0 último também significa que as regiões de autoassociação derivadas de regiões transmembranares ou regiões de autoassociação derivadas de sequências de sinal são especificamente excluídas no âmbito das reivindicações 26 destes produtos de moléculas de interferência nessas formas de realização.

Na presente invenção, a pelo menos uma região de autoassociação da molécula interferente (id est a parte B da molécula interferente), está 'em contacto direto' com o meio ambiente (por exemplo, solvente, citosol) no qual a referida molécula interferente está presente. A importância disto vai ser clarificada. Em proteínas globulares, as sequências de autoassociação (também designadas como 'regiões de nucleação de agregação') são geralmente ocultadas no núcleo hidrofóbico da proteina globular e como tal, mantidas protegidas do solvente por uma densa rede de interações cooperativas, estabilizando o estado nativo. Por isso, em circunstâncias normais não existe 'contacto direto' entre a referida região de autoassociação e o meio ambiente (por exemplo o solvente) . Só quando a proteina é desdobrada, por exemplo quando é sintetizada no ribossoma ou destabilizada por mutação, mudanças de temperatura, pH ou perda de uma chaperona especifica, favorecendo assim o estado desdobrável, as suas regiões de autoassociação vai ser expostas ao meio ambiente. As regiões de autoassociação são normalmente ocultadas dentro das proteínas (com o objetivo de prevenir a agregação) e na molécula interferente não natural as referidas regiões de autoassociação foram isoladas e expostas ao meio ambiente, através da ligação das referidas regiões a uma porção que previne a agregação (id est a parte A da molécula interferente). Ainda por outras palavras, uma molécula interferente não natural não se dobra numa estrutura globular e por isso a, pelo menos uma, região de autoassociação (id est a parte B) na molécula interferente não natural está em contacto direto com o solvente em que a referida molécula interferente está presente. Portanto, 'em 27 contacto direto' refere-se ao oposto de 'estar ocultado e mantido protegido de' .

Numa forma de realização especifica, as moléculas interferentes que compreendem pelo menos uma região de autoassociação derivada de um domínio de proteína solúvel, são polipéptidos.

Numa outra forma de realização específica, a invenção fornece um vetor recombinante compreendendo um polinucleótido que codifica tais moléculas interferentes.

Numa outra forma de realização específica, as moléculas interferentes da invenção são usadas como um medicamento.

Aplicações terapêuticas das moléculas interferentes As proteínas são responsáveis por atividades biológicas que variam desde numerosas reações enzimáticas, transdução de sinais até fornecer estrutura. Alterações na estrutura da proteína, abundância ou atividade estão na origem de muitas doenças. Muitos fármacos atuam por meio de interferência específica com uma ou um número limitado de proteínas. A presente invenção fornece um método para desenvolver uma nova classe de compostos capazes de interferir especificamente com uma proteína alvo à escolha. Estes novos compostos são designados como interferentes.

Assim, ainda numa outra forma de realização, a invenção fornece o uso de uma molécula de ocorrência não natural como um medicamento, compreendendo pelo menos uma região de autoassociação derivada de um domínio proteico capaz de ser solúvel em água, em que a referida região de autoassociação é fundida com uma porção que previne a agregação da referida região de autoassociação. 28

Ainda noutra forma de realização, a invenção fornece o uso de uma molécula de ocorrência não natural como um medicamento, compreendendo pelo menos uma região de autoassociação derivada de um dominio proteica capaz de ser solúvel na água, em que a referida região de autoassociação é fundida com uma porção que previne a agregação da referida região de autoassociação, de modo que a referida região de autoassociação está em contato direto com o solvente em que a referida molécula está presente.

Ainda por outras palavras, a invenção fornece o uso de uma molécula de ocorrência não natural como um medicamento, que compreende a parte A e a parte B em que i) a parte A compreende uma região, tal como um péptido ou dominio proteico que previne a agregação da parte B, e ii) a parte B compreende pelo menos 1 região de autoassociação na qual a referida região compreende pelo menos 3 aminoácidos contíguos derivados da proteina alvo e em que um ligante está opcionalmente presente entre as partes A e B.

Ainda por outras palavras, a invenção fornece o uso de uma molécula de ocorrência não natural como um medicamento, que compreende a parte A e a parte B em que i) a parte A compreende uma região, tal como um péptido ou dominio proteico que previne a agregação da parte B, e ii) a parte B compreende pelo menos uma região de autoassociação em que a referida região compreende pelo menos 3 aminoácidos contíguos derivados da proteína alvo e em que um ligante está opcionalmente presente entre as partes A e B e em que a parte B está em contato direto com o solvente em que a molécula interferente está presente.

As referidas moléculas interferentes podem ser usadas no tratamento de doenças e/ou na produção de um medicamento para tratar doenças, tais como cancro, associadas com a 29 expressão aberrante de pelo menos uma proteína alvo, tal como uma proteína oncogénica. 0 termo "expressão aberrante" refere-se, por exemplo, à (sobre)expressão de uma proteína oncogénica no caso de cancro, também inclui a expressão de uma proteína negativa dominante, a localização indesejada de uma proteína específica ou de uma união variante de uma proteína específica, a expressão indesejada de uma união variante de uma proteína específica, maior atividade de uma proteína mutante ou maior atividade de uma proteína específica.

Numa forma de realização particular, a "expressão aberrante" refere-se à presença indesejada de uma proteína com modificação pós-translacional ou à presença indesejada de uma proteína sem modificação pós-translacional. As modificações pós-translacionais alteram as propriedades físico-químicas dos aminoácidos modificados, e, como tal, têm o potencial de alterar a tendência de agregação de um determinado segmento de polipéptido que pode ser explorado para visar especificamente a forma que tem a maior tendência de agregação. Portanto, se uma modificação pós-translacional diminui significativamente a tendência de agregação da região de autoassociação, então a interferência será mais eficiente com a proteína não modificada. Pelo contrário, no caso de modificações pós-translacionais que aumentam a tendência de agregação da região de autoassociação, então a interferência será mais eficiente com a proteína modificada. Com base apenas na hidrofobicidade, é assumido que modificações tais como fosforilação e glicosilação vão diminuir a tendência de agregação, ao passo que a ligação de lipídios vai aumentar a tendência de agregação. A proteína alvo para a qual a molécula interferente da invenção é dirigida pode estar associada a uma condição 30 patológica. Por exemplo, a proteína pode ser uma proteína associada a agente patogénico, por exemplo, uma proteína virai, uma proteína associada a tumor, ou uma proteína associada a doença autoimune. Num aspeto, a invenção expõe um método para tratar um indivíduo em risco de ou sofrendo de uma proliferação celular indesejada, por exemplo, proliferação de células malignas ou não malignas. O método inclui: fornecer uma molécula interferente, por exemplo um interferente com uma estrutura como aqui descrita, em que a referida molécula interferente é capaz de interferir com (inibindo) a função e/ou a presença de uma proteína que promoveu a proliferação celular indesejada e administrar o referido interferente a um indivíduo, preferencialmente um indivíduo humano, tratando deste modo o indivíduo.

Numa forma de realização preferida, a proteína é um fator de crescimento ou um recetor de fator de crescimento, uma quinase (por exemplo, uma proteína tirosina, serina ou treonina-quinase), uma proteína adaptadora, uma proteína da superfamília de recetor acoplado a proteína G, ou um fator de transcrição. Numa forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função biológica da proteína PDGF-beta, e pode, portanto, ser usada para tratar um indivíduo com ou em risco de um distúrbio caracterizado pela expressão indesejada de PDGF-beta, por exemplo, cancro dos testículos e do pulmão. Numa outra forma de realização preferida, o interferente inibe (reduz) a função e/ou a presença da proteína Erb-B, e pode, portanto, ser usado para tratar um indivíduo com ou em risco de um distúrbio caracterizado pela expressão indesejada de Erb-B, por exemplo, cancro da mama. Numa outra forma de realização preferida, o interferente inibe a função (ou "interfere com a função" o que é equivalente) de (ou interfere com a presença de) a proteína Src, e pode portanto ser usado para tratar um indivíduo com ou em risco de um distúrbio 31 caracterizado pela expressão indesejada de Src, por exemplo, cancros do cólon. Numa outra forma de realização preferida, o interferente inibe a função e/ou presença da proteina CRK, e pode portanto ser usado para tratar um indivíduo com ou em risco de um distúrbio caracterizado pela expressão indesejada CRK, por exemplo, cancros do cólon e do pulmão. Numa outra forma de realização preferida, o interferente interfere com a função e/ou presença da proteina GRB2, e pode portanto ser usado para tratar um indivíduo com ou em risco de um distúrbio caracterizado pela expressão indesejada de GRB2, por exemplo, carcinoma das células escamosas. Numa outra forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função e/ou presença do gene RAS, e pode portanto ser usada para tratar um indivíduo com ou em risco de um distúrbio caracterizado pela expressão indesejada de RAS, por exemplo, cancros pancreático, do cólon e do pulmão, e leucemia crónica. Numa outra forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função e/ou presença da proteína MEKK, e pode portanto ser usada para tratar um indivíduo com ou em risco de um distúrbio caracterizado pela expressão indesejada de MEKK, por exemplo, carcinoma das células escamosas, melanoma ou leucemia. Numa outra forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função e/ou presença da proteína JNK, pode portanto ser usada para tratar um indivíduo com ou em risco de um distúrbio caracterizado pela expressão indesejada de JNK, por exemplo, cancros do pâncreas ou da mama. Numa outra forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função e/ou presença da proteína RAF, e pode portanto ser usada para tratar um indivíduo com ou em risco de um distúrbio caracterizado pela expressão indesejada de RAP, por exemplo, cancro do pulmão ou leucemia. Numa outra forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com 32 a função e/ou presença da proteína Erkl/2, e pode portanto ser usada para tratar um indivíduo com ou em risco de um distúrbio caracterizado pela expressão indesejada de Erkl/2, por exemplo, cancro do pulmão. Numa outra forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função e/ou presença da proteína PCNA (p21), e pode portanto ser usada para tratar um indivíduo com ou em risco de um distúrbio caracterizado pela expressão indesejada de PCNA, por exemplo, cancro do pulmão. Numa outra forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função e/ou presença da proteína MYB, e pode portanto ser usada para tratar um indivíduo com ou em risco de um distúrbio caracterizado pela expressão indesejada de MYB, por exemplo, cancro do cólon ou leucemia mieloide crónica. Numa forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função e/ou presença da proteína c-MYC, e pode portanto ser usada para tratar um indivíduo com ou em risco de um distúrbio caracterizado pela expressão indesejada de c-MYC, por exemplo, linfoma de Burkitt ou neuroblastoma. Numa outra forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função e/ou presença da proteína JUN, e pode portanto ser usada para tratar um indivíduo com ou em risco de um distúrbio caracterizado pela expressão indesejada de JUN, por exemplo, cancros do ovário, da próstata ou da mama. Numa outra forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função e/ou presença da proteína FOS, e pode portanto ser usada para tratar um indivíduo com ou em risco de um distúrbio caracterizado pela expressão indesejada de FOS, por exemplo, cancros da pele ou da próstata. Numa outra forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função e/ou presença da proteína BCL-2, e pode portanto ser usada para tratar um indivíduo com ou em risco de um distúrbio caracterizado pela expressão indesejada de BCL-2, por exemplo, cancros do pulmão ou da 33 próstata ou linfoma não-Hodgkin. Numa outra forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função e/ou presença da proteína Ciclina D, e pode portanto ser usada para tratar um indivíduo com ou em risco de um distúrbio caracterizado pela expressão indesejada de Ciclina D, por exemplo, cancros do esófago e do cólon. Numa outra forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função e/ou presença da proteína VEGF, e pode portanto ser usada para tratar um indivíduo com ou em risco de um distúrbio caracterizado pela expressão indesejada de VEGF, por exemplo, cancros do esófago e do cólon ou angiogénese patológica. Numa forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função e/ou presença da proteína EGFR, e pode portanto ser usada para tratar um indivíduo com ou em risco de um distúrbio caracterizado pela expressão indesejada de EGFR, por exemplo, cancro da mama. Numa outra forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função e/ou presença da proteína Ciclina A, e pode portanto ser usada para tratar um indivíduo com ou em risco de um distúrbio caracterizado pela expressão indesejada de Ciclina A, por exemplo cancros do pulmão e cervical. Numa outra forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função e/ou presença da proteína Ciclina E, e pode portanto ser usada para tratar um indivíduo com ou em risco de um distúrbio caracterizado pela expressão indesejada de Ciclina E, por exemplo, cancros do pulmão e da mama. Numa outra forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função e/ou presença da proteína WNT-1, e pode portanto ser usada para tratar um indivíduo com ou em risco de um distúrbio caracterizado pela expressão indesejada de WNT-1, por exemplo carcinoma basocelular. Numa outra forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função e/ou presença da proteína Beta-catenina, e pode 34 portanto ser usada para tratar um indivíduo com ou em risco de um distúrbio caracterizado pela expressão indesejada de beta-catenina, por exemplo, adenocarcinoma ou carcinoma hepatocelular. Numa outra forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função e/ou presença da proteína c-MET, e pode portanto ser usada para tratar um indivíduo com ou em risco de um distúrbio caracterizado pela expressão indesejada de c-MET, por exemplo, carcinoma hepatocelular. Numa outra forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função e/ou presença da proteína quinase C (PKC) proteína, e pode portanto ser usada para tratar um indivíduo com ou em risco de um distúrbio caracterizado pela expressão indesejada de PKC, por exemplo, cancro da mama. Numa outra forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função e/ou presença da proteína NFKappa-B, e pode portanto ser usada para tratar um indivíduo com ou em risco de um distúrbio caracterizado pela expressão indesejada de NFKappa-B, por exemplo, cancro da mama.

Numa outra forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função e/ou presença da proteína STAT3, e pode portanto ser usada para tratar um indivíduo com ou em risco de um distúrbio caracterizado pela expressão indesejada de STAT3, por exemplo, cancro da próstata. Numa outra forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função e/ou presença da proteína survivina, e pode portanto ser usada para tratar um indivíduo com ou em risco de um distúrbio caracterizado pela expressão indesejada survivina, por exemplo, cancro cervical ou do pâncreas. Numa outra forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função e/ou presença da proteína Her2/Neu, e pode portanto ser usada para tratar um indivíduo com ou em risco de um distúrbio caracterizado pela expressão indesejada de 35

Her2/Neu, por exemplo, cancro da mama. Numa outra forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função e/ou presença da proteina topoisomerase I, e pode portanto ser usada para tratar um individuo com ou em risco de um distúrbio caracterizado pela expressão indesejada de topoisomerase I, por exemplo, cancros do ovário e do cólon. Numa outra forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função e/ou presença da proteina topoisomerase II alfa, e pode portanto ser usada para tratar um individuo com ou em risco de um distúrbio caracterizado pela expressão indesejada de topoisomerase II, por exemplo cancro da mama e do cólon.

Num outro aspeto, a invenção pode ser usada para tratar um individuo, por exemplo, um humano, em risco ou que sofre de uma doença ou distúrbio que pode beneficiar da inibição da angiogénese, por exemplo, cancro. 0 método inclui: fornecer uma molécula interferente, por exemplo, uma molécula interferente com uma estrutura aqui descrita, molécula interferente essa que pode inibir (ou interferir com a função de) uma proteina que medeia a angiogénese e administrar a molécula interferente a um individuo, tratando desse modo o individuo. Numa forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função e/ou presença da proteina alfa v-integrina, e pode portanto ser usada para tratar um individuo com ou em risco de um distúrbio caracterizado por alfa v-integrina indesejada, por exemplo, tumores do cérebro ou tumores de origem epitelial. Numa forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função e/ou presença da proteina recetora Flt-1, e pode portanto ser usada para tratar um individuo com ou em risco de um distúrbio caracterizado por recetores de Flt-1 indesejados, por exemplo, cancro e artrite reumatoide. Numa outra forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com 36 a função e/ou presença da proteína tubulina, e pode portanto ser usada para tratar um indivíduo com ou em risco de um distúrbio caracterizado por tubulina indesejada, por exemplo cancro e neovascularização da retina.

Num outro aspeto, a invenção pode ser usada para tratar um indivíduo infetado com um vírus, ou em risco ou a sofrer de um distúrbio ou doença associada a uma infeção virai. 0 método inclui: fornecer uma molécula interferente, por exemplo, uma molécula interferente com uma estrutura aqui descrita, molécula interferente essa que é homóloga e pode silenciar, uma proteína virai ou uma proteína celular que medeia a função virai, por exemplo, entrada ou crescimento; e administrar a referida molécula interferente a um indivíduo, de preferência um indivíduo humano, tratando deste modo o indivíduo. Como tal, a invenção fornece métodos para usar interferentes para o fabrico de um medicamento para tratar doentes infetados por viroses, incluindo o Papilomavírus Humano, vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), vírus da Hepatite B (HBV), vírus da Hepatite A (HAV), vírus da Hepatite C (HCV), Vírus Sincicial Respiratório (RSV), vírus Herpes Simplex, Citomegalovírus (CMV), vírus Epstein Barr (EBV), um Rinovírus, Vírus do Nilo Ocidental, vírus da Encefalite transmitido por carraças, vírus do Sarampo (MV) ou poliovírus.

Num outro aspeto, a invenção pode ser usada para tratar um indivíduo infetado com um agente patogénico, por exemplo, um agente patogénico bacteriano, amébico, parasítico ou fúngico. 0 método inclui: fornecer uma molécula interferente, por exemplo, uma molécula interferente com uma estrutura aqui descrita, em que a referida molécula interferente é capaz de interferir com a função de uma proteína patogénica derivada do referido agente patogénico e administrar a referida molécula interferente a um 37 indivíduo, de preferência um indivíduo humano, tratando deste modo o indivíduo. A proteína alvo do agente patogénico pode ser uma envolvida no crescimento, síntese da parede celular, síntese proteica, transcrição, metabolismo energético (por exemplo, ciclo de Krebs) ou produção de toxinas. Assim, a presente invenção fornece um método para tratar doentes infetados com, por exemplo, Plasmodium falciparum, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Staphylococcus aureus, Streptococccus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Chlamydia pneumonaie ou Mycoplasma pneumoniae.

Num outro aspeto, a invenção pode ser usada para tratar um indivíduo, por exemplo, um humano em risco de, ou a sofrer de uma doença ou distúrbio caracterizado por uma resposta imune indesejada, por exemplo, doença ou distúrbio inflamatório, ou doença ou distúrbio autoimune. 0 método inclui: fornecer uma molécula interferente, por exemplo, uma molécula interferente com uma estrutura aqui descrita, molécula interferente essa que é capaz de inibir (regulação negativa) a função e/ou presença de uma proteína que medeia uma resposta imune indesejada, e administrar a referida molécula interferente a um indivíduo, tratando deste modo o indivíduo. Numa outra forma de realização preferida, a doença ou distúrbio é uma isquemia ou lesão de reperfusão, por exemplo, reperfusão isquémica ou lesão associada a enfarte agudo do miocárdio, angina instável, "bypass" cardiopulmonar, intervenção cirúrgica (por exemplo, angioplastia, tal como angioplastia coronária transluminal percutânea), uma resposta a um órgão ou tecido transplantado (por exemplo transplante cardíaco ou tecido vascular), ou trombólise. Numa outra forma de realização preferida, a doença ou distúrbio é restenose, por exemplo, restenose associada a intervenção cirúrgica (por exemplo, 38 angioplastia, tal como angioplastia coronária transluminal percutânea). Numa outra forma de realização preferida, a doença ou distúrbio é Doença Inflamatória Intestinal, por exemplo, Doença de Crohn ou Colite Ulcerativa. Numa outra forma de realização preferida, a doença ou distúrbio é inflamação associada a uma infeção ou lesão. Numa outra forma de realização preferida, a doença ou distúrbio é asma, lúpus, esclerose múltipla, diabetes, por exemplo, diabetes tipo II, artrite, por exemplo, reumatoide ou psoriática. Numa outra forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função de uma integrina ou co-ligando da mesma, por exemplo, VLA4, VCAM, ICAM. Numa outra forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função de uma selectina ou coligando da mesma, por exemplo P-selectina, E-selectina (ELAM), L-selectina, ou glicoproteina (PSGL1) P-selectina. Numa outra forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função de um componente do sistema do complemento, por exemplo, C3, C5, C3aR, C5aR, C3 convertase, C5 convertase. Numa outra forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função de uma quimiocina ou recetor da mesma, por exemplo, TNF-a, IL-la, IL-1, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, 11-8, TNFRI; TNFRII, IgE, SCYA11 ou CCR3.

Num outro aspeto, a invenção pode ser usada para tratar um indivíduo, por exemplo, um humano em risco de, ou sofrendo de dor aguda ou dor crónica. 0 método inclui fornecer uma molécula interferente, por exemplo, uma molécula interferente com uma estrutura aqui descrita, molécula interferente essa que é capaz de interferir com uma proteina que medeia o processamento da dor e administrar a referida molécula interferente a um indivíduo, tratando deste modo o indivíduo. Numa outra forma de realização preferida, a molécula interferente interfere com a função 39 de um componente de um canal iónico. Numa outra forma de realização particularmente preferida, a molécula interferente interfere com a função de um ligando ou recetor neurotransmissor.

Num outro aspeto, a invenção pode ser usada para tratar um indivíduo, por exemplo, um humano em risco de, ou sofrendo de uma doença ou distúrbio neurológico. 0 método inclui fornecer uma molécula interferente, por exemplo, uma molécula interferente com uma estrutura aqui descrita, molécula interferente essa que é capaz de interferir com uma proteína que medeia uma doença ou distúrbio neurológico e administrar a referida molécula interferente a um indivíduo, tratando deste modo o indivíduo. Em formas de realização particulares, as referidas doenças (ou distúrbios) que podem ser tratados incluem a Doença de Alzheimer (neste caso a molécula interferente interfere com a função de uma secretase que conduz ao processamento de APP, por exemplo, uma proteína envolvida no complexo gama-secretase (por exemplo, proteína presenilina 1 ou 2, uma proteína Aphl, nicastrina, BACE1 ou BACE2). 0 interferente inibe o processamento de APP e previne a formação de beta amiloide insolúvel. A mesma estratégia pode ser usada para prevenir e/ou tratar outras doenças neurodegenerativas tais como a doença de Huntington, uma ataxia espinocerebelar (por exemplo SCA1, SCA2, SCA3 (doença de Machado-Joseph), SCA7 ou SCA8).

Assim, num aspeto a invenção fornece um método para a produção ou fabrico de um medicamento ou uma composição farmacêutica, compreendendo pelo menos uma molécula interferente e além disso misturar a referida molécula interferente com um transportador farmaceuticamente aceitável. Numa forma de realização preferida, a molécula interferente é um polipéptido e pode ser feita 40 sinteticamente ou como uma proteína recombinante. A proteína recombinante pode ser fabricada usando sistemas de expressão recombinante compreendendo células bacterianas, células de levedura, células animais, células de inseto, células vegetais ou animais ou plantas transgénicas. A proteína recombinante pode ser purificada por qualquer procedimento de purificação de proteína convencional perto da homogeneidade e/ou misturada com aditivos. A administração de uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula interferente pode ser por meio de administração via oral, inalação, por via transdérmica ou parentérica (incluindo intravenosa, intratumoral, intraperitoneal, intramuscular, intracavidade e subcutânea). O composto ativo pode ser administrado sozinho ou preferencialmente formulado como uma composição farmacêutica. Uma dose unitária vai normalmente conter 0,01 até 500 mg, por exemplo 0,01 até 50 mg, ou 0,01 até 10 mg, ou 0,05 até 2 mg de composto ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. Doses unitárias são normalmente administradas uma ou mais vezes por dia, por exemplo 2, 3, ou 4 vezes por dia, sendo o mais frequente 1 até 3 vezes por dia, de modo que a dose diária total seja normalmente na gama de 0,0001 até 10 mg/kg; assim, uma dose total diária adequada para um adulto de 70 Kg é de 0,01 até 700 mg, por exemplo 0,01 até 100 mg, ou 0,01 até 10 mg ou mais frequentemente 0,05 até 10 mg. É preferível que o composto ou um seu sal farmaceuticamente aceitável seja administrado na forma de uma composição de dose unitária, tal como uma dose unitária oral, parentérica, transdérmica, ou composição de inalação. Tais composições são preparadas por mistura e são adequadamente adaptadas para administração oral, inalação, transdérmica ou parentérica, e como tal pode ser na forma de 41 comprimidos, cápsulas, preparações liquidas orais, pós, grânulos, losangos, pós reconstituiveis, soluções ou suspensões injetáveis e de infusão ou supositórios ou aerossóis.

Os comprimidos e cápsulas para administração oral são normalmente apresentados numa dose unitária, e contêm excipientes convencionais tais como agentes ligantes, filtros, diluentes, agentes de comprimidos, lubrificantes, desintegrantes, corantes, aromatizantes e agentes molhantes. Os comprimidos podem ser revestidos de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Enchedores adequados para usar incluem celulose, manitol, lactose e outros agentes semelhantes. Desintegrantes adequados que incluem amido, polivinilpirrolidona e derivados do amido, tais como glicolato de amido sódico. Lubrificantes adequados incluem, por exemplo, estearato de magnésio. Agentes molhantes adequados farmaceuticamente aceitáveis incluem lauril sulfato de sódio. Estas composições orais sólidas podem ser preparadas por métodos convencionais de mistura, enchimento, comprimidos ou afins. Operações de mistura repetidas podem ser usadas para distribuir o agente ativo nas composições que empregam grandes quantidades de enchedores. Tais operações são, como é evidente, convencionais na técnica.

As preparações liquidas orais podem ser na forma de, por exemplo, suspensões aquosas ou oleosas, soluções, emulsões, xaropes, ou elixires, ou podem ser apresentadas como um produto seco para reconstituição com água ou outro veiculo adequado antes de ser usado. Essas preparações liquidas podem conter aditivos convencionais, tais como agentes de suspensão, por exemplo sorbitol, xarope, metil celulose, gelatina, hidroxietilcelulose, carboximetil celulose, gel de estearato de alumínio ou gorduras hidrogenadas 42 comestíveis, agentes emulsionantes, por exemplo, lecitina, monooleato de sorbitano, ou acácia; veículos não aquosos (que podem incluir óleos comestíveis), por exemplo, óleo de amêndoa, óleo de coco fracionado, ésteres de óleo, tais como ésteres de glicerina, propileno glicol, ou álcool etílico; conservantes, por exemplo p-hidroxibenzoato de metilo ou propilo ou ácido sórbico, e se desejado condimentos convencionais ou agentes aromatizantes ou de coloração. Formulações orais também incluem formulações de libertação retardada convencionais, tais como comprimidos ou grânulos com um revestimento entérico.

Preferencialmente, as composições para inalação são apresentadas para administração para o trato respiratório, como pó para inalação ou um aerossol ou uma solução para um nebulizador, ou como um pó microfino para insuflação, sozinho ou em combinação com um transportador inerte, tal como lactose. Nesse caso, as partículas de composto ativo têm adequadamente diâmetros de menos de 50 microns, preferencialmente menos do que 10 microns, por exemplo entre 1 e 5 microns, tal como entre 2 e 5 microns. Em alternativa, nanopartículas revestidas podem ser usadas, com um tamanho de partícula entre 30 e 500 mm. Uma dose de inalação favorecida será na gama entre 0,05 até 2 mg, por exemplo 0,05 até 0,5 mg, 0,1 até 1 mg ou 0,5 até 2 mg.

Para administração parentérica, as formas de dosagem unitárias de fluido são preparadas contendo um composto da presente invenção e um veículo estéril. O composto ativo, dependendo do veículo e da concentração, pode ser suspendido ou dissolvido. As soluções parentéricas são normalmente preparadas dissolvendo o composto num veículo e esterilizando por filtro antes de encher um frasco pequeno ou ampola adequados e selar. Vantajosamente, adjuvantes tais como anestésico local, conservantes e agentes de 43 tamponação, são também dissolvidos no veiculo. Para aumentar a estabilidade, a composição pode ser congelada após enchimento do frasco e da água ter sido removida sob vácuo. Suspensões parentéricas são preparadas substancialmente da mesma forma, exceto que quando o composto é suspenso no veiculo em vez de ser dissolvido e esterilizado pela exposição ao óxido de etileno antes da suspensão no veiculo estéril. Vantajosamente, um tensioativo ou um agente molhante é incluido na composição para facilitar a distribuição uniforme do composto ativo. Quando apropriado, podem ser incluídas pequenas quantidades de broncodilatores, por exemplo, aminas simpaticomiméticas tais como isoprenalina, isoetarina, salbutamol, fenilefrina e efedrina, derivados de xantina tais como teofilina e aminofilina e corticosteroides, tais como prednisolona e estimulantes adrenais, tais como ACTH.

Como na prática comum, as composições vão ser normalmente acompanhadas de instruções escritas ou impressas para uso no tratamento médico em causa.

Numa forma de realização preferida a molécula interferente compreende adicionalmente um domínio de transdução de proteína. Foi mostrado que uma série de pequenos domínios proteicos, denominados domínios de transdução de proteínas (PTDs) , atravessam as membranas biológicas eficientemente e independentemente de transportadores ou recetores específicos, e promovem a libertação de péptidos e proteínas dentro das células. Por exemplo, a proteína TAT do vírus da imunodeficiência humana (HIV-1) é capaz de libertar proteínas biologicamente ativas in vivo. De modo semelhante, a terceira hélice alfa do homeodomínio de Antennapedia, e a proteína VP22 do vírus herpes simplex promovem a libertação de péptidos ou proteínas ligados covalentemente nas células (revisto em Ford KG et al (2001) 44

Gene Ther. 8, 1-4) . A libertação de proteína baseada num pequeno transportador peptídico antipático, Pep-1, é eficiente na libertação de uma variedade de péptidos e proteínas em várias linhas celulares numa forma completamente biologicamente ativa, sem a necessidade de um prévio acoplamento químico covalente (Morris MC et ai, (2001) Nat. Biotechnol. 19, 1173-1176). A capacidade das proteínas quiméricas VP22 para se espalharem a partir da célula primariamente transduzida para as células vizinhas pode melhorar as abordagens da terapia genética (Zender L et al (2002,) Câncer Gene Ther. 9, 489-496). Sequências, facilitando a transdução de proteínas são conhecidas do especialista na técnica e incluem, mas não estão limitadas aos Domínios de Transdução de Proteína. Preferencialmente, a referida sequência é selecionada a partir do grupo compreendendo a proteína TAT do HIV, uma sequência poliarginina, penetratina e pep-1. Ainda outros péptidos comumente usados permeáveis à célula (péptidos tanto naturais como artificiais) são divulgados em Joliot A. e Prochiantz A. (2004) Nature Cell Biol. 6 (3) 189-193.

Um segundo aspeto de uma composição farmacêutica é o uso de uma sequência nucleotídica que codifica as moléculas interferentes. No caso de ser usada uma sequência de ácido nucleico que codifica a molécula interferente, o referido medicamento é preferencialmente pretendido para a libertação do referido ácido nucleico dentro da célula, num tratamento de terapia genética. Um grande número de métodos de libertação são bem conhecidos para dos especialistas na técnica. Preferencialmente, os ácidos nucleicos são administrados para usos de terapia genética in vivo ou ex vivo. Os sistemas de libertação de vetor não virai incluem plasmídeos de ADN, ácido nucleico nu, e ácido nucleico complexado com um veículo de libertação tal como um 45 lipossoma. Sistemas de libertação do vetor virai incluem virus de ADN e ARN, que possuem ou genomas integrado ou epissomais após libertação na célula. Métodos de libertação não virai de ácidos nucleicos incluem lipofecção, microinjeção, biolistica, virossomas, lipossomas, imunolipossomas, policatião ou conjugados lipido:ácido nucleico, ADN nu, viriões artificiais, e absorção de ADN melhorada por agentes. A lipofecção é descrita em, por exemplo, Pat. US No. 5, 049, 386, Pat US No. 4, 946, 787; e Pat. US No 4,897,355 e reagentes de lipofecção são vendidos comercialmente (por exemplo, Transfectam™ e Lipofectin™) . Lipidos catiónicos e neutros, que são adequados para uma eficiente lipofecção de reconhecimento de recetor de polinucleótidos incluem aqueles de Flegner, WO 91/17424, WO 91/16024. A libertação pode ser para células (administração ex vivo) ou tecidos alvo (administração in vivo). A preparação dos complexos lipido:ácido nucleico, incluindo lipossomas alvo tais como os complexos imunolipídicos, é bem conhecida dos especialistas na técnica (ver, por exemplo, Crystal, 1995; Blaese et al., 1995; Behr, 1994; Remy et al., 1994; Gao e Huang, 1995; Pat. U.S. Nos. 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, e 4,946,787). O uso de sistemas baseados em ARN ou ADN virais para a libertação de ácidos nucleicos, tira partido dos processos altamente desenvolvidos de direcionamento de um virus para células especificas no organismo e circulação da carga útil virai para o núcleo. Os vetores virais podem ser administrados diretamente a doentes (in vivo) ou podem ser usados para tratar células in vitro e as células modificadas são administradas aos doentes (ex vivo) . Sistemas convencionais de base virai para a libertação de ácidos nucleicos incluem, entre outros, vetores 46 retrovirais, lentivírus, adenovirais, adenoassociados e vetores de vírus herpes simplex para transferência de genes. Vetores virais são atualmente o método mais eficiente e versátil de transferência genética em células e tecidos alvo. A integração no genoma hospedeiro é possível com retrovírus, lentivírus, e métodos de transferência de genes de vírus adeno-associados, muitas vezes resultando na expressão a longo prazo do transgene inserido. Adicionalmente, elevadas eficiências de transdução foram observadas em muitos tipos de células diferentes e tecidos alvo. Em casos em que a expressão transiente do ácido nucleico é preferida, sistemas baseados em adenovírus, incluindo vetores adenovirais de replicação deficiente, podem ser usados. Vetores baseados em adenovírus são capazes de uma eficiência muito elevada de transdução em muitos tipos de células e não necessitam de divisão celular. Com tais vetores, foram obtidos elevados títulos e níveis de expressão. Este vetor pode ser produzido em grandes quantidades num sistema relativamente simples. Vetores de virus adeno-associados ("AAV"), incluindo vetores de vírus adeno-associados recombinantes, são também usados para transduzir células com ácidos nucleicos alvo, por exemplo, na produção in vitro de ácidos nucleicos e péptidos, e para procedimentos de terapia genética in vivo e ex vivo (ver, por exemplo, Patente U.S. No. 4,797,368; WO 93/24641; Kotin, 1994; A construção de vetores AAV recombinantes está descrita em várias publicações, incluindo Pat. U.S. No. 5,173,414; Hermonat & Muzyczka, 1984; Samulski et al.,1989).

Vetores de terapia genética podem ser distribuídos in vivo pela administração a um indivíduo doente, tipicamente por administração sistémica (por exemplo, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratraqueal, subdérmica, 47 ou infusão intracraniana) ou aplicação tópica. Numa forma de realização especifica, a invenção prevê também o uso de um método de terapêutica genética hidrodinâmica.

Terapia genética hidrodinâmica é divulgada na US6627616 (Mirus Corporation, Madison) e envolve a libertação intravascular de ácidos nucleicos não virais que codifica um interferente em que a permeabilidade dos vasos é aumentada através, por exemplo, da aplicação de um aumento da pressão dentro dos referidos vasos ou através da coadministração de compostos que aumentam a permeabilidade dos vasos tais como, por exemplo, a papaverina.

Alternativamente, os vetores podem ser aplicados a células ex vivo, tais como células explantadas de um indivíduo doente (por exemplo, linfócitos, aspirados de medula óssea, biópsia de tecido) ou as células estaminais hematopoiéticas de um dador universal, seguido pela reimplantação das células num doente, geralmente após seleção das células que possuem o vetor incorporado. PAG 26 A transfecção de células ex vivo para diagnóstico, pesquisa, ou para terapia genética (por exemplo, via reinfusão das células tranfectadas para o organismo hospedeiro) é bem conhecida dos especialistas na técnica. Numa forma de realização preferida, as células são isoladas do organismo do sujeito, transfectadas com um ácido nucleico (gene ou cADN), e reinfundidas de volta no organismo do sujeito (por exemplo, doente). Vários tipos de células adequadas para transfecção ex vivo, são bem conhecidos dos especialistas na técnica (ver, por exemplo, Freshney et al., 1994 e as referências ai citadas para uma discussão em como isolar e cultivar células dos doentes). 48

Ainda noutra forma de realização, o método de interferência proteica da invenção, pode ser usado para determinar a função de uma proteína numa célula ou num organismo sendo capaz de mediar a interferência proteica. A célula pode ser uma célula procariótica ou pode ser uma célula eucariótica ou pode ser uma linha celular, por exemplo, uma célula vegetal ou uma célula animal, tal como uma célula de um mamífero, por exemplo, uma célula embriónica, uma célula estaminal pluripotente, uma célula tumoral, por exemplo, uma célula de teratocarcinoma ou uma célula infetada por vírus. 0 organismo é preferencialmente um organismo eucariótico, por exemplo, uma planta ou um animal, tal como um mamífero, em particular um humano. A proteína alvo, para a qual a molécula interferente da invenção é dirigida, pode estar associada a uma condição patológica. Por exemplo, a proteína pode ser uma proteína associada a um agente patogénico, por exemplo, uma proteína virai, uma proteína associada a tumor ou uma proteína associada a doença autoimune. A proteína alvo também pode ser um gene heterólogo expresso numa célula recombinante ou num organismo geneticamente modificado. Inibindo a função dessa proteína, pode obter-se informação valiosa e benefícios terapêuticos no campo agrícola ou no campo da medicina ou da medicina veterinária. Numa forma de realização particularmente preferida, o método da invenção é usado com uma célula eucariótica ou um organismo não humano eucariótico, exibindo um fenótipo de redução de uma proteína alvo específica, compreendendo uma expressão parcialmente deficiente de pelo menos uma proteína alvo endógena, em que a referida célula ou organismo é contactado com pelo menos uma molécula interferente, capaz de inibir a função, de pelo menos uma proteína alvo endógena ou com um vetor, que codifica pelo menos a molécula interferente, capaz de interferir com a função 49 e/ou presença de, pelo menos, uma proteína endógena. Deve notar-se que a presente invenção também permite uma redução específica do alvo de várias proteínas endógenas diferentes, devido à especificidade da molécula interferente.

Fenótipos de redução específica de proteínas de células ou organismos não humanos, particularmente de células humanas ou de mamíferos não humanos, podem ser usados em procedimentos analíticos, por exemplo, na análise funcional e/ou fenotípica de processos fisiológicos complexos, tais como, análise de proteomas. Por exemplo, podem preparar-se fenótipos de redução das proteínas humanas em células cultivadas que são consideradas serem reguladores de processos de união alternativos. Entre estas proteínas estão, particularmente, os membros da família do fator união SR, por exemplo, ASF/SF2, SC35, SRp20, SRp40 ou SRp55. Mais ainda, pode analisar-se o efeito das proteínas SR nos perfis de mARN de genes de união alternativamente predefinidos, tais como CD44.

Usando tecnologias de redução à base de proteínas aqui descritas, a expressão de uma proteína alvo endógena pode ser inibida numa célula alvo ou num organismo alvo. A proteína endógena pode ser complementada por um ácido nucleico alvo exógeno, que codifica a proteína alvo ou uma variante ou uma forma mutante da proteína alvo, por exemplo um gene ou um cADN, que pode opcionalmente ser fundido a sequências adicionais de ácido nucleico, que codifica um péptido detetável ou polipéptido, por exemplo, um marcador de afinidade, particularmente um marcador de afinidade múltiplo. Formas variantes ou mutantes da proteína alvo diferem da proteína alvo endógena por diferirem da proteína endógena através de substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos de um ou múltiplos aminoácidos. As formas 50 variantes ou mutadas podem ter a mesma atividade biológica que a proteina alvo endógena. Por outro lado, a proteina alvo variante ou mutada pode também ter uma atividade biológica, que difere da atividade biológica da proteina alvo endógena, por exemplo, uma atividade parcialmente anulada, uma atividade completamente anulada, uma atividade aumentada, etc. A complementação pode ser conseguida por coexpressão do polipéptido codificado pelo ácido nucleico exógeno, por exemplo uma proteina de fusão compreendendo a proteina alvo e o marcador de afinidade e a molécula interferente para reduzir a proteina endógena na célula alvo. Esta coexpressão pode ser conseguida usando um vetor de expressão adequado, expressando ambos os polipéptidos codificados pelo ácido nucleico exógeno, por exemplo, a proteina alvo modificada com marcador e a molécula interferente ou alternativamente usando uma combinação de vetores de expressão ou em alternativa a molécula interferente pode contactar a célula alvo a partir do exterior da célula. Proteínas e complexos proteicos que são sintetizados de novo na célula alvo vão conter a proteina exógena, por exemplo, a proteina de fusão modificada. Com o objetivo de evitar a supressão da função da proteína exógena com a molécula interferente, a proteína exógena tem de ter suficientes diferenças de aminoácidos na região de agregação que é selecionada para desenhar a molécula interferente. Alternativamente, a proteína alvo endógena pode ser complementada pelas proteínas correspondentes de outras espécies, ou a proteína alvo endógena pode ser complementada por uma forma de união da referida proteína alvo. A combinação de redução de uma proteína alvo e recuperação usando uma mutada, por exemplo, o alvo exógeno parcialmente anulado tem vantagens, comparado com o uso de uma célula reduzida. Mais ainda, este método é particularmente adequado para identificar domínios funcionais da proteína alvo. 51

Numa outra forma de realização preferida, é realizada uma comparação, por exemplo, de perfis da expressão de genes e/ou proteomas e/ou caracteristicas fenotípicas de pelo menos duas células ou organismos. Estes organismos são selecionados a partir de: (i) uma célula de controlo ou organismo de controlo sem a inibição da proteina alvo, (ii) uma célula ou organismo com a inibição da proteina alvo e (iii) uma célula ou organismo com inibição da proteina alvo mais a complementação da proteina alvo através do ácido nucleico alvo exógeno, que codifica a referida proteina alvo.

Os métodos da invenção são também adequados num procedimento de identificação e/ou caracterização de agentes farmacológicos, por exemplo identificando novos agentes farmacológicos de uma coleção de substâncias de teste e/ou mecanismos de caracterização da ação e/ou efeitos colaterais de agentes farmacológicos conhecidos. Portanto, a presente invenção também se relaciona com um sistema para identificação e/ou caracterização de agentes farmacológicos atuando em pelo menos uma proteina alvo compreendendo: (a) uma célula eucariótica ou um organismo não humano eucariótico capaz de expressar pelo menos um gene alvo endógeno que codifica a referida proteina alvo, (b) pelo menos uma molécula interferente capaz de inibir a expressão do referido pelo menos um gene alvo endógeno, e (c) uma substância teste ou uma coleção de substâncias de teste, em que as propriedades farmacológicas da referida substância de teste ou da referida coleção são para ser identificadas e/ou caracterizadas. Mais ainda, o sistema acima descrito compreende preferencialmente: (d) pelo menos um ácido nucleico alvo exógeno, que codifica a proteina alvo ou uma variante ou uma forma mutada ou uma forma de união da proteina alvo, em que a referida proteina alvo exógena difere da proteina alvo endógena ao nivel dos 52 aminoácidos das regiões de agregação, de modo que a função da proteína alvo exógena é substancialmente menos inibida pela molécula interferente do que a expressão da proteína endógena.

Mais ainda, a invenção compreende também células e organismos compreendendo uma molécula interferente. Um organismo pode, por exemplo ser uma planta transgénica que carrega a informação genética que codifica um interferente. Tal planta transgénica é, numa forma de realização preferida, uma planta silenciada (id est na qual uma proteína alvo particular é regulada negativamente, devido à presença de um interferente especifico num subconjunto de células ou órgãos ou presente em todas as células e órgãos da referida planta). Células que compreendem um interferente podem ser produzidas contactando as referidas células ou pela eletroporação das referidas células com uma molécula interferente particular. Numa forma de realização particular, as células compreendendo um interferente são geradas por transfecção (ou transformação) em que o interferente é codificado por um vetor de expressão recombinante, tal como um plasmídeo ou um vetor virai.

ISOLAMENTO: SEPARAÇÃO E DETEÇÃO

Noutra forma de realização, a invenção fornece um método para isolar uma proteína a partir de uma amostra compreendendo contactar a referida amostra com uma molécula de ocorrência não natural compreendendo pelo menos uma região de autoassociação presente na referida proteína e isolando o complexo molécula coagregada-proteína resultante da referida amostra.

Ainda numa outra forma de realização, a invenção fornece um método para isolar uma proteína de uma amostra compreendendo contactar a referida amostra com uma molécula 53 de ocorrência não natural compreendendo pelo menos uma região de autoassociação isolada da referida proteína em que a referida região de autoassociação é fundida a uma porção que previne a agregação da referida região de autoassociação e isolando o resultante complexo molécula coagregada-proteína da referida amostra.

Ainda numa outra forma de realização, a invenção fornece um método para isolar uma proteína a partir de uma amostra compreendendo contactar a referida amostra com uma molécula de ocorrência não natural compreendendo pelo menos uma região de autoassociação isolada da referida proteína em que a referida região de autoassociação é fundida à porção que previne a agregação da referida região de autoassociação de modo a que a região de autoassociação está em contacto direto com o solvente em que a referida região de autoassociação fundida à referida porção e a referida proteína estão presentes e isolando o resultante complexo molécula coagregada-proteína da referida amostra.

Por outras palavras, a invenção fornece um método para o isolamento de uma proteína a partir de uma amostra compreendendo: contactar a referida proteína com uma molécula de ocorrência não natural que compreende a parte A e a parte B, em que i) a parte A compreende um péptido, domínio proteico ou esfera de agarose, prevenindo a agregação da parte B, e ii) a parte B que compreende pelo menos 1 região de autoassociação em que a referida região consiste de pelo menos 3 aminoácidos contíguos e em que a referida região está isolada da referida proteína e em que o ligante está opcionalmente presente entre as partes A e B e isolar o complexo molécula coagregada-proteína resultante da referida amostra. 54

Ainda por outras palavras a invenção fornece um método para o isolamento de uma proteina de uma amostra, compreendendo: contactar a referida proteina com uma molécula de ocorrência não natural que compreende a parte A e a parte B, em que i) a parte A compreende um péptido, dominio proteico ou esfera de agarose, prevenindo a agregação da parte B, e ii) a parte B, que compreende pelo menos 1 região de autoassociação em que a referida região consiste em pelo menos 3 aminoácidos contiguos e em que a referida região é isolada a partir da referida proteina e em que um ligante está opcionalmente presente entre as partes A e B e, em que a parte B está em contacto direto com o meio ambiente, em que a referida molécula e proteina estão presentes e isolar o resultante complexo molécula coagregada-proteína da referida amostra.

Ainda por outras palavras, a invenção fornece um método para o isolamento de uma proteina de uma amostra, compreendendo: contactar a referida proteina com uma molécula de ocorrência não natural que compreende a parte A e a parte B, em que i) a parte A compreende um péptido, dominio proteico ou esfera de agarose, prevenindo a agregação da parte B, e ii) a parte B que consiste em pelo menos 1 região de autoassociação em que a referida região consiste em pelo menos 3 aminoácidos contiguos e em que a referida região é isolada da referida proteina e em que o ligante está opcionalmente presente entre as partes A e B e, em que a parte B está em contacto direto com o meio ambiente, em que a referida molécula e proteina estão presentes e 55 isolar o resultante complexo molécula coagregada- proteína da referida amostra.

Ainda por outras palavras, a invenção fornece um método para o isolamento de uma proteina de uma amostra, compreendendo: contactar a referida proteina com uma molécula de ocorrência não natural que compreende a parte A e a parte B, em que i) a parte A compreende um péptido, dominio proteico ou esfera de agarose, prevenindo a agregação da parte B, e ii) a parte B que consiste em pelo menos 1 região de autoassociação em que a referida região consiste em pelo menos 3 aminoácidos contíguos e em que a referida região é isolada da referida proteína e em que o ligante está opcionalmente presente entre as partes A e B e isolar o resultante complexo molécula coagregada- proteína da referida amostra.

SEPARAÇÃO

Numa outra forma de realização, o método de isolamento de pelo menos uma proteína compreende adicionalmente a separação de pelo menos uma proteína de uma amostra.

Uma aplicação da separação de pelo menos uma proteína de uma amostra é a remoção (ou depleção) de proteínas altamente abundantes de uma amostra. De facto, o maior desafio na descoberta e validação de proteínas alvo é como dissecar especificamente amostras de proteínas complexas (por exemplo, plasma, urina, fluido cerebrospinal) e medir vestígios alvo. As proteínas abundantes são muitas vezes da ordem de 6-10 de magnitude mais concentradas do que proteínas de baixa abundância. Portanto, proteínas altamente abundantes devem ser retirada para detetar e medir vestígios de proteínas com importância médica. Uma 56 vez que a albumina, IgG, antitripsina, IgA, transferrina e haptoglobina perfazem aproximadamente 90% do conteúdo total de proteínas no soro humano, é uma necessidade crítica para ferramentas de diagnóstico, esgotar rapidamente estas proteínas abundantes não desejadas e revelar os biomarcadores proteicos menos abundantes, de baixo peso molecular. Vários métodos são já usados na técnica; 1) imunoglobulina G (IgG) como reagentes de afinidade para capturar e separar proteínas alvo abundantes, 2) imunoglobulina gema (IgY) são anticorpos tipo IgG isolados a partir da gema do ovo de aves imunizadas, 3) o prefracionamento é usado para separar a mistura de proteínas dentro de diferentes frações para remover certas proteínas na mistura original, e 4) proteína A e proteína G são proteínas da parede celular bacteriana com uma especificidade para anticorpos IgG, por isso as resinas de afinidade para proteína A e proteína G proporcionam a remoção de IgG e 5) microesferas de IgG e IgY são usadas para a deteção de proteínas.

DETEÇÃO

Numa outra forma de realização específica, o método de isolamento de pelo menos uma proteína compreende ainda a deteção de pelo menos uma proteína no referido complexo molécula-proteína. A deteção pode ser realizada pela separação do complexo molécula interferente-proteína alvo por, por exemplo, eletroforese, cromatografia em coluna, filtração, atração electroestática, atração magnética ou paramagnética, espectrometria de massa e afins.

As tecnologias de biodeteção mais amplamente usadas são baseadas no uso de anticorpos. Os anticorpos reconhecem e ligam-se a outras moléculas com base na sua forma e 57 propriedades físico-quimicas. Os anticorpos são altamente adequados para detetar pequenas quantidades de proteínas alvo na presença de misturas complexas de proteínas. A presente invenção mostra que o uso das moléculas interferentes (a parte B tem especificidade e reconhecimento para pelo menos uma proteína específica) é uma alternativa ao uso de anticorpos (como o elemento de reconhecimento) para a captura específica de proteínas alvo. Na verdade, moléculas interferentes podem ser usadas em numerosas aplicações nas quais os anticorpos são tipicamente usados. Para nomear apenas alguns, são previstas aplicações em diagnóstico, microanálises, forense e na deteção específica de agentes patogénicos.

Para as aplicações de deteção e separação da invenção, é preferível que a parte B da molécula interferente seja ligada a um transportador que é aqui designado como parte A. Um transportador pode ser uma superfície plana tal como um plástico ou nitrocelulose ou coluna cromatográfica mas é preferencialmente uma esfera, tal como microesferas. Uma discussão geral dos vários tipos de esferas e microesferas que servem o propósito de serem parte A da molécula interferente é descrita nas páginas 9 e 10 da US6682940 e é aqui especificamente incorporada como referência.

Numa forma de realização particular, a parte A da molécula interferente é um transportador tipo hidrato de carbono tipo, por exemplo celulose ou agarose. A parte B pode ser ligada de forma covalente ao referido hidrato de carbono transportador com um agente de ligação cruzada tal como glutaraldeído.

Numa outra forma de realização particular, a parte A é um suporte tal como celulose, vidro, polímero sintético. A ligação covalente entre a parte A e parte B pode ser 58 realizada por via de resíduos de aminoácidos da parte B e uma azida, carbodiimida, isocianato e outros derivados químicos presentes na parte A.

Ainda noutra forma de realização particular, parte A é uma microesfera de vidro silanizada porosa. A parte B pode ser covalentemente ligada à parte A por via dos seus grupos amina de péptidos (por reação de Schiff seguida pela redução com boro-hidreto de sódio) para grupos aldeído formados por oxidação com periodato dos grupos glic idoxipropilsilano quimicamente ligados a átomos de sílica (este acoplamento está descrito em Sportsman and Wilson (1980) Anal. Chem. 52, 2013-2018).

Numa forma de realização específica, a parte A transportadora é envolvida por uma película proteica à qual a parte A está ligada por reticulação (ver reivindicações 1-50 e exemplos relacionados com o transportador na US4478946).

Numa outra forma de realização específica, a parte A é uma esfera fluorescente tal como uma partícula de látex fluorescente. A patente US4550017 e, especialmente na sua página 4, descreve os componentes fluorescentes que podem ser usados para o fabrico das esferas fluorescentes.

Numa outra forma de realização específica, as esferas na parte A, variam em tamanho e também podem conter ou ser impregnadas com corantes fluorescentes. Devido à variedade de tamanhos e corantes das esferas, múltiplas proteínas podem ser detetadas e quantificadas numa única reação. Os procedimentos para o desenvolvimento de tais esferas estão descritos em US6159748. 59

Ainda noutra forma de realização particular, o acoplamento entre a parte A (a esfera) e a parte B é por via de uma poli(treonina), uma poli(serina), dextrano ou poli(etilenoglicol). Os exemplos 6, 7, 8 e 9 da US6399317 ilustram como este acoplamento pode ser realizado.

Ainda noutra forma de realização particular, a parte A é uma esfera magnética. As esferas magnéticas, acoplamento entre esferas magnéticas e um agente proteico e os seus usos estão descritos na página 8 do pedido US6489092.

Definições A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui usados, têm o mesmo significado como comummente entendido pelos especialistas comuns na técnica aos quais a invenção pertence. Embora todos os métodos e materiais similares ou equivalentes aos aqui descritos possam ser usados na prática ou para testar esta invenção, são descritos os métodos e materiais preferidos. Para os procedimentos da presente invenção, são definidos abaixo os seguintes termos.

Os artigos "um" e "uma" são aqui usados para referir um ou mais do que um (i.e. pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, "uma proteína alvo" significa uma proteína alvo ou mais do que uma proteína alvo.

Como aqui usado, o termo "cerca de" refere-se a uma quantidade, nível, valor, dimensão, número ou quantidade que variam em 30%, de preferência em 20% e mais preferencialmente, em 10% em relação a uma quantidade, nível, valor, dimensão, tamanho ou quantidade de referência. 60 "Reagente bifuncional de ligação cruzada" significa um reagente que contém dois grupos reativos, o reagente tendo assim a capacidade de ligar covalentemente dois elementos tais como a parte A e a parte B de uma molécula interferente. Os grupos reativos num reagente de reticulação pertencem tipicamente às classes dos grupos funcionais incluindo ésteres de succinimidilo, maleimidas e haloacetamides tais como iodoacetamidas. Ao longo desta especificação, a menos que o contexto exija algo diferente, as palavras "compreende", "compreendem" e "compreendendo" serão entendidas para implicar a inclusão de um passo ou elemento estabelecido ou grupo de etapas ou elementos, mas não a exclusão de qualquer outro passo ou elemento ou grupo de passos ou elementos.

Por "vetor de expressão" ou "vetor recombinante" entende-se qualquer elemento genético autónomo capaz de dirigir a sintese de uma molécula interferente codificada pelo vetor. Tais vetores de expressão são conhecidos dos praticantes na técnica.

Por "derivado" entende-se uma molécula interferente que foi derivada da sequência básica por modificação, por exemplo pela conjugação ou complexação com outras porções químicas (e.g. pegilação) ou por técnicas de modificação pós-translacional como seriam entendidas na técnica. O termo "derivado" também inclui no seu âmbito alterações que foram feitas a uma sequência parente incluindo adições ou deleções que fornecem moléculas funcionalmente equivalentes.

Por "quantidade efetiva", no contexto da modulação de uma atividade ou de tratamento ou prevenção de uma condição, entende-se a administração dessa quantidade de uma molécula interferente a um indivíduo com necessidade dessa 61 modulação, tratamento ou profilaxia, quer numa dose única ou como parte de uma série, que é eficaz para a modulação daquele efeito ou para tratamento ou profilaxia daquela condição. A quantidade efetiva vai variar dependendo do estado de saúde e condição fisica do indivíduo a ser tratado, do grupo taxonómico do indivíduo a ser tratado, da formulação da composição, da avaliação da situação médica e outros fatores relevantes. Espera-se que a quantidade se situe numa gama relativamente ampla que pode ser determinada através de ensaios de rotina.

Por "isolado" entende-se o material que é substancialmente ou essencialmente isento de componentes que normalmente o acompanham no seu estado nativo. Por exemplo, um "polipéptido isolado", como aqui usado, refere-se a um polipéptido, que foi purificado em relação às sequências que o flanqueiam num estado de ocorrência natural, e.g. uma sequência de autoassociação que foi removida das sequências que são normalmente adjacentes à referida sequência. Uma sequência autoassociada (opcionalmente acoplada a uma porção que previne a agregação) pode ser por síntese química de aminoácidos ou pode ser gerada por produção recombinante. 0 termo "oligonucleótido" como aqui usado refere-se a um polímero composto por uma variedade de unidades de nucleótidos (desoxiribonucleótidos ou ribonucleótidos ou variantes estruturais relacionadas ou análogos sintéticos dos mesmos) ligados por ligações fosfodiéster (ou variantes estruturais relacionadas ou análogos sintéticos dos mesmos). Um oligonucleótido é normalmente bastante curto no comprimento, geralmente desde cerca de 10 até 30 nucleótidos, mas o termo pode referir-se a moléculas de qualquer comprimento, embora o termo "polinucleótido" ou "ácido nucleico" seja normalmente usado para grandes 62 oligonucleótidos. 0 termo "polinucleótido" ou "ácido nucleico" como aqui usado designa mARN, ARN, cARN, cADN ou ADN. 0 termo refere-se normalmente a oligonucleótidos com mais de 30 nucleótidos em comprimento. O termo "polinucleótido recombinante" como aqui usado refere-se a um polinucleótido formado in vitro por manipulação do ácido nucleico numa forma normalmente não encontrada na natureza. Por exemplo, o polinucleótido recombinante pode ser na forma de um vetor de expressão. Geralmente, esses vetores de expressão incluem o ácido nucleico regulador transcricional e transducional operacionalmente ligado à sequência de nucleótidos.

Por "operacionalmente ligado" entende-se que esses ácidos nucleicos reguladores transcricionais e transducionais estão posicionados em relação a um polinucleótido que codifica o polipéptido, de tal maneira que o polinucleótido é transcrito e o polipéptido é traduzido.

Os termos "sujeito" ou "indivíduo" ou "doente", usados aqui indistintamente, referem-se a qualquer sujeito, particularmente a um sujeito vertebrado, e ainda mais particularmente a um sujeito mamífero, para quem a terapia ou profilaxia é desejada. Animais vertebrados adequados que se inserem no âmbito da invenção incluem, mas não estão restringidos a primatas, aves, peixes, répteis, animais de criação (e.g. ovelhas, vacas, cavalos, burros, porcos), animais de teste em laboratório (e.g. coelhos, ratinhos, ratos, porcos da índia, hamsters), animais de companhia (e.g. gatos, cães) e animais selvagens em cativeiro (e.g., raposas, veados, cães australianos selvagens). Contudo, será entendido que os termos supracitados, não implicam que os sintomas estejam presentes. 63

Por "transportador farmaceuticamente aceitável" entende-se um enchedor sólido ou liquido, substância diluente ou de encapsulamento, que pode ser usada de uma forma segura em administração tópica ou sistémica a um doente. "Polipéptido", "péptido" e "proteína" são aqui usados indistintamente para referir um polímero de resíduos aminoácidos e variantes e análogos sintéticos do mesmo. Assim, estes termos aplicados a polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos é um aminoácido sintético de ocorrência não natural, tal como um análogo químico de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, assim como polímeros de aminoácidos de ocorrência natural.

Por "polipéptido recombinante" entende-se um polipéptido feito usando técnicas recombinantes, i.e., através da expressão de um polinucleótido recombinante ou sintético. Quando o polipéptido quimérico ou a porção biologicamente ativa do mesmo é produzida de forma recombinante, é também preferivelmente substancialmente livre de meio de cultura, i.e., o meio de cultura representa menos de cerca de 20%, mais preferencialmente menos de cerca de 10%, e o mais preferido, menos do que cerca de 5% do volume da preparação da proteína. O termo "identidade de sequência" é aqui usado para referir a extensão em que as sequências são idênticas numa base de nucleótido-a-nucleótido ou numa base de aminoácido-a-aminoácido ao longo de uma janela de comparação. Assim, uma "percentagem de identidades de sequência" é calculada por comparação de duas sequências alinhadas otimamente através de uma janela de comparação, determinando o número de posições em que a base de ácidos nucleicos idêntica (e.g., A, T, C, G, I) ou os resíduos de aminoácidos idênticos 64 (e.g., Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Vai, Leu, lie, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gin, Cys e Met) ocorre em ambas as sequências, para produzir um número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação (i.e., o tamanho da janela), e multiplicando o resultado por 100, para produzir a percentagem de identidade das sequências. Para os fins da presente invenção, "identidade de sequência" será entendida como significando a "percentagem correspondente", calculada com o programa informático DNASIS (Versão 2.5 para Windows; disponível na Hitachi Software engineering Co., Ltd., South San Francisco, Calif., USA) usando as definições padrão como as usadas no manual de instruções que acompanha o software. "Similaridade" refere-se à percentagem de aminoácidos que são idênticos ou constituem substituições conservativas. Do mesmo modo, podem ser determinadas usando programas de comparação de sequências, tal como o GAP (Deveraux et al. 1984, Nucleic Acids Research 12, 387-395). Desta maneira, sequências de comprimento semelhante ou substancialmente diferente daqueles aqui citados podem ser comparadas pela inserção de lacunas no alinhamento, tais lacunas sendo determinadas por exemplo pelo algoritmo de comparação usado por GAP. O termo "comparação" significa alteração do genótipo de um organismo, por exemplo uma bactéria, levedura ou planta, pela introdução de um ácido nucleico endógeno ou estranho. Vetores para transformação incluem plasmídeos, retrovírus e outro vírus animais, YACs (cromossoma artificial de levedura), BACs (cromossoma artificial bacteriano) e afins. Por "vetor" é entendido uma molécula de polinucleótido, preferencialmente uma molécula de ADN derivada, por exemplo, de um plasmídeo, bacteriófago, levedura ou vírus, dentro do qual pode ser inserido ou clonado um 65 polinucleótido. Um vetor contém preferencialmente um ou mais locais de restrição únicos e podem ser capazes de replicação autónoma numa célula hospedeira definida, incluindo uma célula alvo ou tecidos ou uma célula progenitora ou tecido da mesma, ou ser integrável com o genoma do hospedeiro definido, de modo a que a sequência clonada seja reprodutível. Em conformidade, o vetor pode ser um vetor de replicação autónoma, i.e., um vetor que existe como uma identidade extracromossómica, a replicação da qual é independente da replicação cromossómica, e.g., um plasmídeo linear ou circular fechado, um elemento extracromossómico, um minicromossoma, ou um cromossoma artificial. 0 vetor pode conter qualquer significado para assegurar a autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, é integrado num genoma e replicado juntamente com o(s) cromossoma(s) dentro dos quais foram integrados. Um sistema de vetores pode compreender um só vetor ou plasmídeo, dois ou mais vetores ou plasmídeos, que juntos contêm o ADN total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira ou um transposão. A escolha de um vetor vai depender tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor é introduzido. Numa forma de realização preferida, o vetor é preferencialmente um vetor virai ou derivado de vírus, que é operacionalmente funcional no animal e preferencialmente em células de mamíferos. 0 vetor também pode incluir um marcador de seleção, tal como um gene de resistência a antibiótico que pode ser usado para a seleção de transformantes adequados. Exemplos de tais genes resistentes são conhecidos dos peritos da técnica e incluem o gene nptll, que confere resistência ao antibiótico canamicina e G418 (Geneticina®) e o gene hph que confere resistência ao antibiótico higromicina B. 66 A menos que definido de outra maneira, todos os termos técnicos e cientificos aqui usados têm o mesmo significado como comummente entendido por um especialista comum da técnica, a quem esta invenção pertence. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser usados na prática ou nos testes da presente invenção, métodos e materiais úteis são descritos abaixo. Os materiais, métodos, e exemplos são apenas ilustrativos e não tencionam ser limitativos. Outras caracteristicas e vantagens da invenção serão evidentes pela descrição detalhada e pelas reivindicações.

Exemplos 1. Desenho de uma molécula interferente peptídica sintética Nós construímos uma molécula interferente em que a parte B consiste em três regiões de autoassociação sintéticas com pequenos ligantes de dois aminoácidos (STLIVL-QN-STVIFE-QN-STVIFE) interligando as regiões de autoassociação. As referidas três regiões de autoassociação são hexapéptidos, que possuem uma forte tendência para agregar, ver Fig. 1 para o desenho da molécula interferente. Nota: no texto desta invenção, todas as sequências de aminoácidos estão retratadas, começando pela parte amino-terminal e lendo na direção da parte carboxi-terminal - assim, "STLIVL" lê-se como "NH2-STLIVL-C00H"). A parte B da molécula interferente sintética foi fundida com o N terminal a uma porção (parte A) , que previne a agregação e põe as regiões de autoassociação em contacto direto com o meio ambiente (aqui o citosol de E. coli) . (A Fig. 1 retrata a estrutura do desenho do interferente sintético). A referida porção é a proteína NusA, que é frequentemente usada como um marcador de solubilização na produção da proteína recombinante . A molécula interferente sintética resultante (estrutura A e 67 B) pode ser feita e purificada de uma forma recombinante na E. coli. Nós mostrámos que a sobre-expressão da molécula interferente sintética (sem qualquer sequência de autoassociação específica para uma proteína particular de E. coli) não previne o crescimento bacteriano. Portanto, as células BL21 de E. coli foram transformadas com a construção do interferente sintético, presente no plasmídeo pETM60 (oferta de G. Stier, EMBL) . No mais recente plasmídeo os interferões estão sob controle do promotor T7 quimérico (ver secção de materiais e métodos) . Os recombinantes cresceram até uma densidade de 0,6 OD, o interferente foi expresso após a adição de 0,5 μΜ de IPTG durante 3 horas a 37°C e a suspensão bacteriana foi plaqueada sobre placas de aqar. As placas foram inspecionadas após 12h de incubação a 37°C e mostraram um abundante crescimento bacteriano.

Num próximo passo uma sequência liqante flexível ("KPGAAKG" - retratado como 'ligação' na figura 1) foi acoplada à terminação COOH da construção do interferente sintético para permitir a fusão das sequências de autoassociação, derivadas da proteína alvo. 2. Interferência proteica em procariontes

No presente exemplo, proteínas de E. coli foram escolhidas para serem reguladas negativamente, das quais uma interferência proteica funcional confere uma característica selecionável. Proteínas alvo do proteoma de E. coli foram selecionadas com uma localização citosólica e a presença de uma região de agregação com um elevado resultado TANGO adequado. Uma vez que auxotrofia condicional para um único aminoácido pode ser convenientemente testada usando meio de 68

crescimento com uma composição controlada, nós selecionámos quatro enzimas candidatas envolvidas na sintese de isoleucina (UniProt15 entrada: ILVI_ECOLI), metionina (UniProt15 entradas: METE_ECOLI e METK_ECOLI) e leucina (UniProt15 entrada: LEU1_EC0LI). As sequências de autoassociação baseadas no valor da predição TANGO das quatro proteínas alvo foi para ILVI_ECOLI: "GVVLVTSG", resultado TANGO: 44, para METE_ECOLI: "LLLTTYF", resultado TANGO: 32, METK_ECOLI: ""LTLLV", resultado TANGO: 20 e LEU1_EC0LI: "LAFIG", resultado TANGO: 15. A informação genética para a molécula interferente sintética do exemplo 1 foi fundida com a sequência de ADN codificando as respetivas regiões autoassociadas das quatro enzimas biossintéticas, resultando em quatro moléculas interferentes especificas. Para mostrar a interferência proteica in vivo (que é essencialmente uma coagregação entre o interferente especifico (para uma enzima biossintética) e a própria enzima biossintética), procedemos da seguinte maneira. E. coli foram transformadas com o plasmideo, compreendendo as respetivas construções interferentes e crescidas em meio rico, até ao inicio da fase de crescimento exponencial, quando a expressão da proteina interferente foi induzida com IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranosido). A expressão da proteina foi deixada prosseguir até 37°C, as células foram colhidas, lavadas com uma solução salina para remover o excesso de IPTG e meio rico e foram colocadas em placas de ágar contendo meio M9 minimo, completado com vinte aminoácidos de ocorrência natural (chamado meio completo M9) e em meio M9 minimo com todos os aminoácidos, exceto aquele em que a auxotrofia está a ser testada (chamado seleção M9) . Foi mostrado que em três das quatro enzimas alvo, uma redução funcional total pôde ser alcançada, i.e. foram encontradas condições, nas quais as bactérias formaram colónias no M9 completo, mas não nas placas de agar do seleção M9. A 69 expressão das construções interferentes e a sua presença exclusiva na fase insolúvel do lisado celular foram confirmadas por "western blot". Para as quatro enzimas aqui testadas, é observada uma clara relação entre a sua sensibilidade para a abordagem da coagregação e a sua propensividade de agregação prevista, de acordo com o algoritmo TANGO, confirmando assim a qualidade das previsões do TANGO, como também a sua relevância num contexto celular funcional. A proteina ILVI, que tem o resultado TANGO mais alto, foi quase totalmente reduzida pela expressão de vazamento do promotor T7 na ausência de qualquer IPTG, e uma hora de sobre-expressão induzida, leva a uma redução funcional total. As enzimas METE e METK apresentam um resultado TANGO intermédio e não foram afetadas por uma hora de sobre-expressão do interferente. Contudo, após três horas de indução de IPTG, a função foi completamente perdida e nenhuma formação de colónia pôde ser detetada. 0 resultado de agregação mais fraco foi observado para a enzima LEU1 e a sobre-expressão, neste caso, produziu apenas uma modesta regulação negativa da sua atividade. Notavelmente, a redução funcional das enzimas alvo é reversível. Quando as células carregadas com um nível alto de material interferente sobre-expressado foram colocadas em placa de agar LB, elas exibiram um crescimento de colónia normal. Quando estas colónias foram copiadas para seleção M9, um crescimento normal foi de novo observado. Isto indica que durante o crescimento de colónias, os agregados foram perdidos, restabelecendo a rede celular para normal. 3. Interferência proteica de alvos compreendendo regiões de autoassociação com um baixo valor de autoassociação Regiões de autoassociação são muitas vezes ladeadas ou contêm resíduos carregados, tais como R, K, D, e E mas também P e G (chamados resíduos de aminoácidos porteiros) 70 (ver Rousseau, Serrano & Schymkowitz (2006) How Evolutionary Pressure Against Protein Aggregation Shaped Chaperone Specificity, J Mol Biol, doi:10.1016/j.jmb.2005.11.035). Estes resíduos porteiros reduzem a propensão para autoassociação das sequências a que estão associados. Com vista a otimizar a sensibilidade da parte B de uma molécula interferente para coagregar com uma dada proteína alvo, a região de autoassociação da proteína alvo que está incluída na parte B do interferente pode ser mutada para que os resíduos acima mencionados sejam substituídos por resíduos que promovam a agregação, tais como L, V, I, F, W, Y, mas também podem ser incluídos outros resíduos que podem aumentar a propensão a autoassociação da região de autoassociação. A região de autoassociação mutada (derivada da proteína alvo) que está incluída na parte B da molécula interferente tem uma homologia de sequência de pelo menos 60%, preferencialmente pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80% e o mais preferencialmente pelo menos 90%, com a região de autoagregação da proteína alvo. Para além disso, alguns aminoácidos são neutros em termos de agregação, e substituir esses aminoácidos por aminoácidos que favorecem a agregação vai aumentar a tendência de autoassociação de uma região (por exemplo S, T, C mas também Q, N, Η, M podem ser substituídos por resíduos propensos à agregação, tais como L, V, I, F, W, Y. Estas moléculas integradoras otimizadas aumentam a interferência proteica dos alvos com um valor de agregação baixo previsto. No exemplo 2 foi mostrado que a interferência proteica da enzima LEU1 de E. coli é menos eficiente. Neste exemplo otimizámos a molécula interferente com uma especificidade para a enzima LEU1. A sequência de autoassociação identificada na LEU1 é "LAFIG". A última sequência é ladeada pelos resíduos porteiros "...DYDLEALAFIGKQQEE..." portanto, a fim de melhorar mutacionalmente a sequência alvo, empregámos uma estratégia 71 baseada em degenerar per como se segue: "primers" complementares são concebidos para terem uma sobreposição de 20-25 pb em cada lado do códão que vai ser mutado para permitir um emparelhamento dos "primers" do modelo. Um códão degenerativo é introduzido incorporando uma proporção equimolar das quatro bases durante a síntese do "primer" (o chamado códão NNS) . Usando o protocolo de PCR Quickchange com este primer degenerativo, uma biblioteca contendo as 20 mutações pontuais da posição de flanqueamento é obtida. Esta biblioteca é amplificada em células ToplO (Invitrogen) e o ADN de plasmídeo purificado usando o kit miniPrep (Qiagen). Para testar se a eficiência de redução é aumentada, os interferentes mutantes (a conceção é realizada como no exemplo 2) contra o alvo LEU1 são transformados em células BL21 (Invitrogen) e colocados em placas de agar. Numa placa de 96 poços, contendo 0,2 mL de LB + antibiótico por poço, cada poço é inoculado, selecionando colónias individuais. A placa é incubada a 37°C até ser alcançada uma DO de 0,6, quando a expressão dos interferentes mutantes é induzida adicionando 0,5 μΜ de IPTG durante 3 horas a 37°C. O conteúdo completo de cada poço, exceto 1 pL é colocado em placa num meio mínimo seletivo, que contém todos os aminoácidos exceto leucina. Para clones que mostrem gradações diferentes de crescimento deficiente nas placas seletivas, reagente TempliPhi (GE Health Science) é adicionado para amplificação de ADN e a placa é transferida para o equipamento de sequenciamento. A informação da sequência fornece-nos o espectro total de moléculas interferentes mutadas por LEU1 otimizada. 4. Uso de moléculas interferentes para a depleção da imunoglobulina G do soro

Nesta experiência de depleção, uma esfera de agarose é escolhida como uma porção (parte A) , à qual regiões de autoassociação derivadas de uma proteína alvo são fundidas 72 por meio de ligação química aminoreativa. Tais materiais de agarose estão disponíveis comercialmente, tal como Sefarose™ 4 Fast Flow da GE Healthcare. A imunoglobulina G humana tem duas regiões tango fortes (I) IIVAVVIATAVAAIVAAVVALIY e II) LTVLLLLASA), que podem ser usadas como regiões de autoassociação. Uma vez que escalas de despesa de péptidos com comprimento em aminoácidos, péptidos são concebidos para conter 10 frações de aminoácidos da primeira região alvo. As sequências alvo (regiões de autoassociação) são precedidas com sequências de ligação ADPRGAAEGA e sintetizadas com extremidades desprotegidas, para manter o grupo amino N-terminal reativo. As sequências concebidas são a) ADPRGAAEGAIIVAVVIATA, b) ADPRGAAEGAVVIATAVAAI, c) ADPRGAAEGAIVAAVVALIY (a) , b) e c) compreendem decapéptidos derivados de uma região tango forte I) e d) ADPRGAAEGALTVLLLLASA compreende a região tango II) . Para depleção, lOmL de soro são incubados com 1 mg de péptido imobilizado a 25, 30, 37 e 45°C durante 1 hora. Esferas de agarose são recolhidas por centrifugação e o soro é removido, as esferas de agarose são lavadas em tampão PBS para remover as restantes impurezas. As esferas são subsequentemente transferidas para um tampão SDS e incubadas a 95°C durante 10 minutos e extensivamente centrifugadas. A presença de IgG é investigada usando SDS-PAGE. A identidade do alvo é confirmada usando espetrometria de massa. 5. Uso de moléculas interferentes para deteção As moléculas interferentes foram concebidas para a deteção específica de 3 proteínas recombinantes comercialmente disponíveis (citrato sintase de coração de suíno (Roche), beta-galactosidase de E. coli (Sigma) e glucose-6-fosfato desidrogenase de Leuconostoc masenteroides (Sigma). Para isso num primeiro passo as regiões de autoassociação foram 73 determinadas com o algoritmo TANGO a partir das seguintes proteínas alvo: a) Citrato sintase (CISY_PIG): "ALFWLLVT" (valor TANGO 60) b) Beta-galactosidase (BGAL_ECOLI): "AVIIWSLGN" (valor TANGO 30) e "ALAVVLQ" (valor TANGO 42), e c) Glucose-6-fosfato desidrogenase (G6PD_LEUME): "AFVDAISAVYTA" (valor TANGO 41).

Num passo seguinte a biotina foi ligada pela amina terminal às 4 regiões de autoassociação diferentes resultando em 4 quatro moléculas interferentes diferentes: i) biotina-ALFWLLVT com uma especificidade para citrato sintase, ii) biotina-AVIIWSLGN e biotina-ALAVVLQ com uma especificidade para a beta-galactosidase e iii) biotina-AFVDAISAVYTA com uma especificidade para glucose-6-fosfato desidrogenase. Péptidos biotinilados foram adquiridos na Jerine Petide Technologies. Note-se que o desenho do interferente: biotina - região de autoassociação corresponde à estrutura A-B em que a biotina (parte A) previne a agregação da região de autoassociação (parte B) e põe a região de autoassociação em contacto direto com o solvente (PBST) em que a referida biotina - região de autoassociação está presente.

Dotblots individuais foram preparados por aplicação de 0,3 mg de cada proteína alvo em membrana de nitrocelulose, seguido por secagem com ar e incubação durante a noite em 1% BSA-PBST (PBS com 0,1 % de Tween-20) para bloquear sítios de ligação não específicos. A membrana foi imersa numa solução 10 mM de péptido de deteção biotinilado e incubada durante 3 horas à temperatura ambiente com agitação. Após lavagem repetida com tampão, a ligação do péptido à proteína foi confirmada por visualização da 74 porção de biotina usando estreptavidina-HRP (Peroxidase de Rábano, Pierce) e deteção quimioluminescente usando um sistema de câmara CCD. 6. Uso de moléculas interferentes contra VEGF de murino para o tratamento de angiogénese patológica da retina A neovascularização da retina é a principal causa de cegueira no mundo e a angiogénese patológica da retina é uma via final comum que conduz à perda de visão em doenças tais como retinopatia da prematuridade (ROP), retinopatia diabética e degradação da mácula relacionada com a idade. É conhecido que o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é um dos fatores chave no desenvolvimento de angiogénese patológica. Nós estudamos o efeito das moléculas interferentes em dois modelos de retinopatia induzida em murino. Num primeiro modelo ratinhos neonatos (com uma vasculatura da retina imatura) são expostos a hiperóxia, resultando na obliteração dos vasos sanguíneos em desenvolvimento que fornecem oxigénio à retina. Quando os ratinhos retornam à normoxia, a retina, distalmente aos vasos ocluidos, torna-se isquémica, induzindo a produção de VEGF e resultando por último na neovascularização reprodutível e quantificável proliferativa da retina (o modelo é pormenorizado em Pierce EA et al (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. 92(3)905-9, ver procedimentos experimentais na página 905 - modelo de rato. Em resumo, filhotes de rato com 7 dias (P7) em conjunto com as suas mães a amamentarem, são sujeitos a hiperóxia (75% de oxigénio) em câmaras de oxigénio especialmente concebidas, durante 5 dias, sem abrir as gaiolas. Ao P12, os animais regressaram ao ar ambiente até P17, quando as retinas foram avaliadas quanto à resposta neovascular máxima. Ao P12, metade dos animais são tratados com uma molécula interferente contra VEGF e metade são deixados não tratados. Metade dos ratos tratados receberam interferente 75 VEGF por via de injeção intravenosa enquanto a outra metade do grupo tratado recebeu interferente VEGF por via de injeção periocular (a injeção periocular ou intravitrea é realizada como descrito em Shen J et ai (2006) Gene Therapy, publicação avançada online de 29 de Setembro). Três moléculas interferentes diferentes contra a isoforma VEGF165 de murino são usados numa concentração variando de 1-10 0 μρ/ηϋΟ. a) REAG-FLLSWVHWTLALLLYLHH-GGEERAG; esta molécula interferente tem a estrutura A-B-A' de uma molécula interferente. A região de autoassociação derivada de VEGF165 (sublinhado) de murino é flanqueada por regiões de solubilização A (REAG e GGEERAG), ou por outras palavras as regiões A e A' previnem a agregação da região de autoassociação (parte B da molécula interferente). b) STVIIE-GGAG-NHVTLS-GGAGQ-FLLSWVHWTLALLLYLHH-GE-RAG; esta molécula interferente tem uma estrutura B-A de uma molécula interferente. A parte de solubilização A (GERAG) é mostrada em itálico. A parte B tem a seguinte estrutura: STVIIE (=região de autoassociação sintética) - GGAG (=um ligante) - NHVTLS(= região de autoassociação sintética) -GCAGQ(=um ligante) - FLLSWVHWTLALLLYLHHG(= a região de autoassociação derivada de VEGF165 de murino). c) STVIIE-GGAG-FLLSWVHWTLALLLYLHH-GERAG; esta molécula interferente tem a estrutura B-A de uma molécula interferente. A parte A de solubilização (GERAG) é mostrada em itálico. A parte B tem a seguinte estrutura: STVIIE (=região de autoassociação sintética) - GGAG (=um ligante entre as regiões de autoassociação) - FLLSWVHWTLALLLYLHH (=a região de autoassociação derivada de murino VEGF165). 76

Ao P17, ratos anestesiados foram perfundidos através do ventrículo esquerdo com 1 mL de solução salina tamponada com fosfato contendo 50 mg de fluoresceína-dextrano com peso molecular 2xl06. Os olhos foram removidos e fixados em 4% paraformaldeído durante 3 (olho direito) ou 24 horas (olho esquerdo). Dos olhos direitos removeram-se as lentes, e cortaram-se as retinas periféricas para permitir a montagem em plano com gelatina-glicerol. As montagens planas das retinas foram analisadas por microscopia de fluorescência. Os olhos esquerdos são embebidos em parafina e secções seriadas de 6 μιη são cortadas sagitalmente em toda a córnea, paralelamente ao nervo ótico, e coradas com hematoxilina-eosina. A resposta neovascular proliferativa é quantificada por contagem do número de novos vasos (=tufos) e o número de células endoteliais estendidas desde a membrana limitante interna da retina dentro do vítreo nas secções cruzadas sagitais coradas. A técnica angiográfica usando perfusão de fluoresceína-dextrano é usada em conjunto com este método de contagem para análise rápida das retinas ou como um sistema alternativo de gradação para avaliação quantitativa. Num segundo modelo de retina, a neovascularização é mimetizada experimentalmente por trombose venosa induzida por laser na retina. O modelo é descrito em Saito Y et al. (1997) Curr. Eye Res. 16(1): 26- 33. Chi-Chun Lai et al (2005) Acta Ophtalmologica Scandinavica 83:590-594 descrevem na secção de materiais e métodos nas páginas 591-592 que o modelo pode ser quantificado. A aplicação de moléculas interferentes VEGF é realizada como aqui descrito anteriormente. 7. Interferência proteica numa linha de células humanas A modulação da apoptose (indução ou supressão) é fácil de monitorizar num sistema celular. É conhecido que a estauropurina induz a apoptose num modo dependente de p53. 77

Assim, a regulação negativa de p53 ou a regulação negativa de proteínas que aumentam a função da p53 (por exemplo, ASPP1) suprime a apoptose induzida por estauropirina em linhas de células animais (por exemplo, humano). Vetores de expressão recombinantes, que codificam moléculas interferentes, são construídos com base no desenho da molécula interferente sintética descrita no exemplo 1, exceto que a parte A, a proteina NusA, é mudada para a proteina verde fluorescente (GFP) e que o promotor é um promotor constitutivo de mamífero tal como o promotor CMV ou actina. A sequência de autoassociação para p53 é ILTIITLE (a qual tem um valor tango de 72) e esta sequência é adicionalmente compreendida na parte B do interferente sintético conduzindo a um molécula interferente com uma especificidade para p53. A sequência de autoassociação para ASPP1 é MILTVFLSN (a qual tem um valor tango de 63) e esta sequência é adicionalmente compreendida na parte B da molécula interferente sintética que conduz a uma molécula interferente com uma especificidade para ASPPl. Células HeLa são cultivadas, e transfectadas com os vetores recombinantes. A GFP (parte A) permite a visualização das moléculas interferentes sobre-expressasdas. A adição de 1 μΜ de estaurosporina às células de controlo transfectadas e não transfectadas induz uma resposta apoptótica diferencial. 8. Interferência proteica do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) em peixe-zebra

As moléculas interferentes foram desenvolvidas de modo a dirigir a VEGF de peixe zebra. A inativaçao específica (através de agregação) da VEGF secretada pode ser seguida pela perturbação do desenvolvimento vascular em embriões de peixe-zebra. 78

Num primeiro passo, as regiões de autoassociação presentes na proteína VEGF de peixe-zebra foram determinadas com o algoritmo TANGO, A região de agregação com o mais alto valor TANGO é NH2-FLAALLHLSA-COOH. Com base nesta sequência de autoassociação nós desenvolvemos quatro moléculas interferentes sintéticas:

Interferente A: NH2-RLFAALLRFLAALLHLSAR-COOH Interferente B: NH2-RFLAALLHLSARLFAALLR-COOH Interferente C: NH2-RYLAILAGIRFLAALLR-COOH Interferente D: NH2-RYLAILAGIRFLAALLHLSAR-COOH Interferente E: (NH2-EALVVYLIQLAGR-COOH) serviu como sequência de controlo e é derivada de uma sequência controlo e é derivada de uma sequência fora desta região de TANGO elevada.

Note-se que os interferentes A,B e D compreendem toda a região TANGO enquanto que o interferente C compreende somente uma parte da região TANGO. As sequências derivadas das regiões TANGO estão sublinhadas.

Estas moléculas interferentes foram adicionadas a um meio de embriões de peixe-zebra transgénicos Tg(flil:EGFP)Y' em diferentes concentrações. Os peixes-zebra transgénicos Tg(flilEGFP)Y' expressam Proteína Verde Fluorescente (GFP) melhorada nas suas células endoteliais, os referidos peixes são descritos em Lawsom ND e Weinstein BM (2002) Dev. Biol. 248, 307-318) são fornecidos por Zebrafish International

Resource Center (Universidade de Oregon) e são mantidos como descrito no livro de peixe-zebra, um guia para o uso de peixe-zebra (Danio rerio) em laboratório, Univ. Oregon Press. Eugene, 1994). 79

Embriões sem córion com 20 horas pós fertilização (hpf) foram dispostos em placas de 24 poços (10 embriões/poço) e expostos a várias concentrações das moléculas interferentes selecionadas (começando em 50 μΜ) durante 24 horas. Os embriões vivos foram analisados às 28 e 48 hpf (horas pós fertilização) usando imagem confocal realizada usando um microscópio de varrimento de laser LSM510 da Zeiss.

Embora monitorizando o desenvolvimento de diferentes estruturas vasculares, nós prestámos particular atenção a (i) a estrutura da aorta dorsal (DA), veia cardinal posterior (PCV), (ii) o surgimento dos vasos intersomiticos (ISV) e a formação de plexos vasculares (PV) na região posterior do tronco. Um resumo das experiências dependentes da dose é mostrado na Tabela 1. É claro que os interferentes A e C induzem claros defeitos vasculares no desenvolvimento de larvas de peixe-zebra. Surpreendente é o facto de as moléculas interferentes serem absorvidas pelas larvas de peixe-zebra através da pele e que nenhuma injeção dos interferentes é necessária. Os interferentes B e D precisam de ser administrados a concentrações ainda mais baixas de modo a ser possível monitorizar os defeitos vasculares específicos. 9. Interferência proteica na levedura Sacharomyces cerevisiae

Usámos a redução da enzima Ura3 de levedura para mostrar que a interferência proteica funciona em eucariotas porque a inativação dirigida (através da agregação) da proteína Ura3 dá uma leitura fácil. A enzima Ura3 de S. cerevisiae é uma enzima essencial envolvida na via da biossíntese de uracilo. Por isso, os mutantes de S. cerevisiae sem o gene Ura3 não são capazes de crescer em meio sem uracilo mas o crescimento pode ser restaurado pela adição de uracilo ao 80 meio. Num primeiro passo, as regiões de autoassociação presentes na proteína Ura3 foram determinadas com o algoritmo TANGO. A região de autoassociação (ou a região de agregação) com o melhor valor TANGO é NH2-VIGFIAQ-COOH (valor TANGO: 74). Esta sequência peptídica foi usada para gerar uma construção de expressão interferente. Para clonar a sequência de autoassociação que codifica este péptido enquadrado com a construção de interferente sintético (ver exemplo 1) usámos os seguintes dois oligonucleótidos:

URA3aggregatorFor:5'CCTCTAGAATGAAAGAAATTTTGGCTGTAG 3' e URA3aggregatorRev: 5' CCGTCGACTTÃ AGC TTG AGC AAT AAA GCC GAT AAC GCCAGCAGCGCCCGGTTTAGCAGC3'

Os sítios de restrição Xbal e Sall estão sublinhados. O codão de iniciação da proteína NusA é realçado a negrito. O codão de paragem é indicado a itálico e a sequência que codifica os sete aminoácidos de Ura3 é indicada a negrito.

Como modelo para o PCR nós usámos o plasmídeo pETM60 (dado por G. Stier, EMBL) que contém a proteína NusA acoplada à construção de interferente sintético/ligante (ver exemplo 1). Este vetor contém um promotor T7, confere resistência à canamicina e fornece uma expressão N-terminal tag de seis histidinas. O produto de pCR resultante foi subclonado no vetor pBEVY/GT (Miller CA 3a, Martinat MA e Hyman LE (1988) Nucleic Acids Res. 26: 3577-3583) usando os sítios de restrição Xbal e Sal1. Neste vetor, a "sequência de autoassociação NusA-interferente sintético-ligante-Ura3" -cassetes de expressão estava sob o controlo do promotor GALl/10 de S. cerevisiae. O marcador de seleção deste vetor é o gene TRP1. 81

Construções verificadas por sequência com e sem o ADN que codifica os sete aminoácidos de Ura3 (derivados da região de autoassociação) foram introduzidos na estirpe PVD2 de S. cerevisiae por transformação e a seleção dos transformantes foi baseada na complementação de trpl. A estirpe PVD2 é derivada da estirpe W303-1A (Thomas BJ e Rothstein R. (1989) Cell 56, 619-630) mas a estirpe PDV2 é transformada com alelos do tipo selvagem de ambos HIS3 e URA3. A estirpe PVD2 é ainda auxotrófica para leucina (LEU2) , triptofano (TRP1) e adenina {ADE2). Os transformantes foram selecionados em meio SDglu-Trp (meio de levedura minimo com 2% de glucose mas sem triptofano). As colónias foram reaplicadas em placas de SDglu-Trp fresco para colónias simples. Duas colónias independentes foram crescidas durante a noite em meio SDglu-Trp liquido. A DOgoo da cultura foi então ajustada para 1 e 5 microlitros de uma diluição seriada de 10 vezes foram aplicados em placas SDglu-Ura-Trp (meio SD com 2% de glucose mas sem uracilo e sem triptofano) ou SDgal-Ura-Trp (meio SD com 2% de galactose mas sem uracilo e sem triptofano). O resultado desta experiência é mostrado na Fig. 2. Esta experiência foi repetida três vezes com resultados semelhantes. A expressão do vetor vazio pBEVY/GT ou o vetor expressando somente a construção de interferente sintética NusA (sem uma sequência de autoassociação de ura3) não mostra qualquer inibição em meio sem uracilo. A expressão da construção NusA-interferente sintético- região de associação Ura3, no entanto, inibe fortemente o crescimento em meio sem uracilo (quando o uracilo é adicionado ao meio de crescimento não há qualquer defeito de crescimento), mostrando que a proteina Ura3 endógena é especialmente inativada por interferência proteica. 10. Interferência proteica na levedura Candida albicans 82 A Candida albicans causa 40% das infeções fúngicas em humanos. Este parasita comensal processa um número de fatores de virulência. Para além da capacidade para aderir a todos os tipos de plásticos (um grande problema nas unidades de cuidados intensivos) ou para a produção de lipases e proteinases, é a capacidade de adotar várias morfologias que tem sido estudada mais extensivamente dado que é um dos principais fatores de virulência. Muitos fatores de transcrição podem induzir a transição de células tipo levedura para hifas ou pseudohifas. Outros fatores de transcrição são necessários para manter as células numa forma tipo levedura. Um exemplo desses repressores da formação de hifas é Tupi. Como um exemplo de interferência proteica em Candida albicans nós usámos a proteina Tupi como alvo. A regulação negativa da função biológica de Tup 1 deve induzir a formação de hifas. Num primeiro passo, as regiões de autoassociação presentes na proteina Tupi foram determinadas com o algoritmo TANGO. A região de autoassociação (ou a região de agregação) com o melhor valor TANGO (valor TANGO: 30) é NH2-VISVAVSL-COOH. Este péptido foi usado para gerar uma construção de expressão de interferente. Para clonar a sequência de autoassociação que codifica este péptido enquadrado com a construção de interferente sintético do exemplo 1, nós usámos os dois oligonucleótidos seguintes: TUPlaggregatorFor: 5*TTGTACAMTATCCGTATGTGCCTGACTACGCAATGGCTCAGTGGCAGAAC 3' s TUP 1 aggregaíõfRêv: S‘ GCGCTAGC JTA AGC TAG GGA TAC AGC GAC TGA OAT GAC GCCAGCAGCGCCCGGTTTA 3%

Os sitios BsrGl e Nhe 1 estão sublinhados. O codão de paragem é representado em itálico e a sequência inversa que codifica o péptido alvo é representada a negrito. 83 Nós usámos o plasmídeo pETM60 contendo a construção NusA -interferente sintético (do exemplo 1) como modelo para o PCR. 0 produto de PCR resultante foi subclonado no plasmideo pPCKl-GFP (Barelle CJ, Manson CL, MacCallum DM, Odds, F, Gow NAR, Brown AJP, Yeast 21:333-340, 2004) usando os sitios de restrição BsrGl e Nhe1. Neste vetor, a construção interferente foi clonada enquadrada com o gene GFP presente no vetor e a cassete de expressão de interferente resultante de "GFP-interferente sintético-ligante-"região de autoassociação Tupi") está sob o controlo do promotor PCK1. Na última construção, a proteína verde fluorescente (GFP) é substituída por NusA e GFP serve como parte A da molécula interferente. O promotor PCK1 é fortemente induzido em meio contendo casaminoácidos e reprimido em meio contendo glucose (Leuker CE, Sonneborn A, Delbruck S, Ernst JF, Gene 192: 235-240, 1997). Plasmídeos de sequência verificada foram então transformado na estirpe de C. albicans CA14 (Fonzi WA, Irwin MY. Genetics 134: 717-728, 1993). Os transformantes foram selecionados em SDglu-ura (meio mínimo de levedura compreendendo 2% de glucose mas sem uracilo). Os transformantes foram crescidos durante a noite em glucose contendo meio mínimo, as células foram diluídos para obter cerca de 20 células/100 microlitros e este volume foi colocado em placas de agar SDglu-ura ou SDcasaminoácido-ura. A morfologia da colónia foi avaliada após 4 e 6 dias de crescimento (ver Fig. 3), Como pode ser visto na Fig. 3, a regulação negativa de Tup 1 ocorre em meio com casaminoácidos e a formação de hifas é claramente visível no bordo da colónia. A formação de hifas não é vista nos transformantes de controlo ( (plasmídeo pPCKl-GFP sem a cassete de expressão de interferente) ) nem no meio compreendendo glucose. O exemplo mostra que Tup 1 endógena é especificamente inativada por interferência proteica. 11. Aplicação de interferência proteica em plantas 84 Nós demonstrámos interferência proteica em células de tabaco By2 usando células BY2 já transformadas com vários genes de fusão GFP (os referidos genes são representados na Tabela 2). Uma lista dos referidos genes de Arabidopsis thaliana em conjunto com as suas correspondentes regiões de autoassociação identificados e os valores de tango são representados na tabela 2.

Moléculas interferentes específicas contra cada um dos alvos da tabela 2 são desenhadas com base na molécula interferente sintética descrita no exemplo 1, exceto gue a proteína NusA é mudada pela Proteína Vermelha Fluorescente (RFP) e que a parte B compreende adicionalmente as regiões de autoassociação dos alvos indicados na tabela 2.

Construções que codificam as referidas moléculas interferentes específicas são introduzidas em vetores apropriados para sobre-expressão usando tecnologia Gateway™ (InVitrogen Life Technologies), Para este fim, um conjunto de vetores binários compatíveis Gateway para transformação de plantas foram desenvolvidos. Para a sobre-expressão é usado o vetor pK7WGD2 no qual o gene é posto sob o controlo do promotor p35S. Para transformações de células vegetais é aplicado o sistema de vetor ternário. É usado o plasmídeo pBBRlMCS-5.virGN54D como vetor ternário. 0 plasmídeo binário é introduzido na estirpe de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 já carregando o plasmídeo ternário por eletrotransformação. Cultura de BY-2 fresca é estabelecida antes da transformação com a construção particular. BY-2 com 5 dias é inoculado 1:10 e crescido durante três dias (28°C, 130 rpm, escuro). A cultura líquida de Agrobacterium tumefaciens transformada com pK7WGD2-GUS (vetor controlo), pK7WGD2-interferente 1 (por exemplo, específico para aurora 1, pK7WGD2-interferente 2 85

(por exemplo específico para aurora 2) etc. etc. é estabelecido dois dias antes da transformação de BY-2. Uma ansa de bactérias do meio sólido é inoculada em 5 mL de meio líquido LB com os antibióticos (rifampicina, gentamicina, estreptomicina e espetinomicina) , A cultura é crescida durante dois dias (28 °C, 130 rpm) . A transformação de BY-2 é realizada em placas de Petri vazias (0 4,6 cm) com o método de cocultura. BY-2 com três dias (3 mL) é pipetado para placas e são adicionados 50 ou 200 μ]1 de suspensão. As placas são suavemente misturadas e deixadas repousar numa bancada laminar no escuro durante três dias. Após cocultura as células são colocadas em meio sólido BY-2 com as seleções (50 μρ/ηίΙΟ de canamicina, e 500 μρ/ιτΛ de vancomicina e 500 μρ/ιτΛ de carbenicilina para matar o excesso de bactérias) . As placas são seladas com fita Millipore e incubadas a 28 °C no escuro durante aproximadamente duas semanas após o que os calli se tornam visíveis. A eficiência da interferência proteica (aqui a agregação entre a construção GFP e a construção RFP) é visualizada por verificação da expressão de GFP, RFP e a colocalização de GFP e RFP sob microscópio de fluorescência.

Material e métodos relacionados com os exemplos 1 e 2

Construções, células e meios

As moléculas interferentes foram clonadas no vetor pETM60 (fornecido por G. Stler, EMBL.) Este vetor está sob controlo da T7 ARN polimerase (a polimerase RNA T7 está sob controlo de elementos reguladores de operão lac de E. coli), confere resistência a canamicina e fornece uma expressão tag N-terminal de seis histinas seguidas por NusA. Uma série de oligos de sobreposição que codificam a 86 sequência da parte B do interferente foi usada para criar um "gene sintético" por PCR. Este gene foi ligado no pRTM60 via sitios de restrição de Ncol e BamHl. Os genes de interferente foram criados por PCR da parte B do interferente, usando um oligo anticodificante longo para incluir a sequência para o ligante flexivel e a região de autoassociação (o engodo) no C-terminal. Estes foram ligados no pETM60 por via dos sitios de restrição Ncol e BAMH1. Todos os oligos foram comprados na Sigma-Genosys, todas as enzimas de restrição na Fermantas, e as ligações foram realizadas usando o Kit de Ligação Rápida da Roche. Células BL21 (DE3) quimicamente competentes foram produzidas internamente e transformadas seguindo os protocolos padrão seguintes. Placas de agar LB padrão foram preparadas. E todas as placas de agar continham 50 μg/mL de canamicina. Placas M9 completas foram preparadas suplementando o meio M9 padrão com todos os 20 aminoácidos (50 μg/mL) e nucleótidos adenina, guanina, uracilo e xantina (20 μg/mL). As placas M9 selecionadas eram idênticas a M9 completo em todos menos um aminoácido. Para controlar a possível degradação de aminoácidos após armazenamento, as placas foram preparadas um dia antes de usar. O LB foi preparado seguindo protocolos padrão e a canamicina foi incluída a 50 μρ/πύΐ. Todos os aminoácidos foram comprados na Sigma, a canamicina e a IPTG na Duchefa.

Protocolos Células BL21 (DE3) foram transformadas com as construções de expressão, colocadas em placa sobre agar LB mais vanamicina e incubada a 37°C durante a noite. Foi usada uma única colónia para inocular 10 mL de LB mais canamicina e esta foi crescida durante a noite a 37°C, com agitação. No 87 dia seguinte, esta cultura foi usada para inocular 10 mL de LB mais canamicina 1:100 e isto foi crescido até uma D0600 de 0,6 ser obtida. As culturas foram então divididas em duas; adicionou-se IPTG (50 μΜ) a uma cultura para induzir a expressão de interferente, e ambas as culturas foram adicionalmente incubadas a 37°C durante o desejado tempo de expressão. As células foram então recolhidas por centrifugação e lavadas duas vezes (por ressuspensão e centrifugação) com solução salina (0,85% p/v NaCl). As células foram então ressuspendidas em solução salina para dar uma D0600 final de 0,05, e 200 mL desta suspensão de células foram plaqueadas em placas de agar. As placas de agar foram incubadas a 37°C durante a noite e o crescimento da colónia verificou-se no dia seguinte. Quando necessário, as colónias foram retiradas com um palito estéril para placas com agar fresco.

TABELAS

Embriões com 48 hpf com fenótipo vascular indicado Interfe rente Cone. % de embriões afetados Aorta dorsal fina PCV anormal Atraso no surgimen to VP anormal Número de embriões analisad os E 50 μΜ - - • • - 10 A 2,5 μΜ 80% 20% 40% 20% 20% 10 B 1 μΜ Maioria dos embriões morreu 10 C 2 μΜ 20% 20% 20% 20% 20% 10 D 2,5 μΜ Maioria dos embriões morreu 10

Tabela 1: Resumo dos efeitos dose-resposta de diferentes moléculas interferentes VEGF (usadas na amostra 8) na vasculatura de peixe-zebra

Gene Valor Tango

AtFH5 95,7956 AtFH5 75,3155 AtFH6 80,8913 AtFH6 64,3993 AtMAP65-3 55,9959 AURORAI 51,1964 AURORAI 19,4128 AUR0RA2 35,8169 AUR0RA2 20,1483 AUR0RA3 78,0306 AUR0RA3 16,6145 TPLATE 73.2511 TPLATE 20,4469 TPLATE 15,3765

Tabela 2: Proteínas deri

Região de autoassociação VFWLILFSGLLVITL 1I1AWVTAVSTFLLAALFFLC FFFFYIFFSVSVSS AIVISVGIVTLGMLSALAFFLY QFIWM YLILEYAA YGYFY

VYL1LEYAVRG

YGYFY

IFLIL

FGWF

SIfAILTLW

GFWVGVLYYPF

IWTIA s de Arabidopsis thaliana, identificadas em regiões de autoassociação e valores tango correspondentes 89

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Lisboa, 6 de Dezembro de 2012

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma molécula de ocorrência não natural capaz de regular negativamente a função biológica de uma proteina, compreendendo pelo menos uma região de agregação β exposta ao meio ambiente e derivada da referida proteina que é para ser regulada negativamente, em que a referida região de agregação β é fundida com uma porção que previne a agregação da referida região de agregação β, para uso como medicamento, em que a referida molécula é obtenível desde que a parte A compreendendo uma região, tal como um péptido, dominio proteico, esferas de proteina ou agarose prevenindo a agregação da parte B, e a parte B que compreende pelo menos 1 região de agregação β e em que a referida região é derivada da referida proteina que é para ser regulada negativamente.

2. A molécula para uso de acordo com a reivindicação 1 em que a referida porção é um péptido, um domínio proteico ou uma esfera de agarose.

3. A molécula para uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em que a referida região de agregação β consiste em pelo menos 5 aminoácidos contíguos.

4. A molécula para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 3 em que o ligante está presente entre a referida região de agregação β e a referida porção.

5. Molécula para uso de acordo com a reivindicação 4 em que o referido ligante é um polipéptido ou é de natureza não polipeptídica. 2

6. A molécula para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 5 em que a referida molécula é um polipéptido e é codificada por uma sequência de nucleótidos presente num vetor recombinante e que, após transformação para uma célula ou organismo, produz o referido polipéptido na referida célula ou orqanismo.

7. A molécula para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 6, para uso no tratamento de cancro.

8. A molécula para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 6, para uso no tratamento de infeção por um aqente patoqénico.

9. Molécula de ocorrência não natural compreendendo pelo menos uma região de agregação β isolada de um dominio proteico capaz de ser solúvel em água em que a referida região de agregação β é exposta ao meio ambiente e é fundida com uma porção que previne a agregação da referida região de agregação beta, em que a referida molécula é obtenível desde que a parte A compreendendo uma região, tal como um péptido, dominio proteico, esferas de proteina ou agarose prevenindo a agregação da parte B, e a parte B que compreende pelo menos 1 região de agregação β e em que a referida região é derivada de uma proteina cuja função é para ser interferida com.

10. Molécula de acordo com a reivindicação 9 em que a referida porção é um péptido, um dominio proteica ou uma esfera de agarose.

11. Molécula de acordo com a reivindicação 9 ou 10, em que a região de agregação β e a porção que previne a agregação 3 são de outra proteína, ou são da mesma proteína mas não imediatamente adjacentes a essa proteína.

12. Vetor recombinante compreendendo um polinucleótido que codifica um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 até 11.

13. Molécula ou vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 até 12 para uso como medicamento.

14. Método para isolar uma proteína a partir de uma amostra compreendendo contactar a referida amostra com uma molécula compreendendo pelo menos uma reqião de agreqação β exposta ao meio ambiente e isolada em relação à referida proteína, em que a referida região de agregação β é fundida com uma porção que previne a agregação da referida região de agregação β, e isolando o complexo molécula coagregada-proteína resultante em da referida amostra, em que a referida molécula é obtenível desde que a parte A compreendendo uma região, tal como um péptido, domínio proteico, esfera de proteína ou agarose previne a agregação da parte B, e a parte B que compreende pelo menos 1 região de agregação β e em que a referida região é derivada da referida proteína a ser isolada.

15. Método de acordo com a reivindicação 14 em que a referida porção é um péptido, um domínio proteico ou uma esfera de agarose.

16. Método de acordo com a reivindicação 14 ou 15 compreendendo adicionalmente a deteção de uma proteína na referida amostra. 4

17. Método para regular negativamente a função biológica de uma proteína compreendendo contactar a referida proteína com uma molécula de ocorrência não natural compreendendo pelo menos uma região de agregação β exposta ao meio ambiente, presente na referida proteína e fundida a uma porção que previne a agregação da referida região de agregação beta, em que o método não é realizado em humanos e animais, em que a referida molécula é obtenível desde que a parte A compreendendo uma região, tal como um péptido, domínio proteico, esfera de proteína ou agarose previne a agregação da parte B, e a parte B que compreende pelo menos 1 região de agregação β e em que a referida região é derivada da referida proteína a ser regulada negativamente. Lisboa, 6 de Dezembro de 2012