PT1937281E - Modulação dos níveis de expressão de trpv - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "MODULAÇÃO DOS NÍVEIS DE EXPRESSÃO DE TRPV"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a composições para o tratamento e/ou a prevenção de afecções relacionados com altos níveis de expressão e/ou actividade do receptor de potencial transitório vanilóide-1 (TRPV1). Serão mitigados, entre outros, afecções oculares tais como desconforto e sensibilidade alterada da córnea após cirurgia refractiva, utilização de lentes de contacto, olhos secos e retinopatia diabética.

Também são proporcionados métodos e composições para o tratamento e/ou a prevenção de afecções anormais da pele e dos folículo pilosos mediados por níveis elevados de expressão e/ou actividade de TRPVl, tais como alopecia. A invenção proporciona a utilização da tecnologia de ARNi para regular negativamente a expressão de TRPVl.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A interferência de ARN refere-se ao processo de silenciamento génico pós-transcripcional específico de sequência mediado por ARN pequenos de interferência (siRNA). Após a descoberta do fenómeno em plantas no início dos 90, Andy Fire e Craig Mello demonstraram que o ARN de cadeia dupla (dsRNA) inibia de maneira específica e selectiva a expressão génica de maneira extremamente eficaz em Caenorhabditis elegans (Fire et al., 1998, Potent and specific genetic interference by double stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 391:806). A sequência da primeira cadeia (ARN sense) coincidia com a da região correspondente do ARN mensageiro (ARNm) alvo. A segunda cadeia (ARN 2 antisense) era complementar ao ARNm. 0 dsRNA resultante resultou ser várias ordens de magnitude mais eficaz que as correspondentes moléculas de ARN de cadeia única (em particular, ARN antisense). 0 processo de ARNi começa quando a enzima, DICER, encontra dsRNA e corta-o em pedaços denominados ARN pequenos de interferência (siRNA). Esta proteína pertence à família das nucleases RNase III. Um complexo de proteínas reúne estes restos de ARN e utiliza seu código como guia para buscar e destruir qualquer ARN na célula com uma sequência de emparelhamento, tal como ARNm alvo (veja-se Bosher & Labouesse, 2000, RNA interference: genetic wand and genetic watchdog. Nat Cell Biol, 2000, 2 (2):E31, e Akashi et al., 2001, Suppression of gene expression by RNA interference in cultured plant cells. Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 11(6):359).

Em tentativas de utilizar ARNi para o silenciamento génico reconheceu-se que as células de mamífero desenvolveram diversos mecanismos protectores contra infecções virais que poderiam dificultar a utilização desta abordagem. De facto, a presença de níveis extremamente baixos de dsRNA virai provoca uma resposta de interferão, resultando numa supressão da tradução não específica global, o que por sua vez provoca a apoptose (Williams, 1997, Role of the double-stranded RNA-activated protein kinase (PKR) in cell regulation. Biochem Soc Trans, 25(2):509; Gil & Esteban, 2000, Induction of apoptose by the dsRNA-dependent protein kinase (PKR): mechanism of action. Apoptosis, 5(2): 107-14).

Em 2000 foi reportado que dsRNA inibia especificamente 3 genes no ovócito de ratinho e embrião de fase inicial. A interrupção da tradução, e portanto uma resposta de PKR, não foi observada à medida que os 3 embriões continuaram a se desenvolver (Wianny & Zernicka-Goetz, 2000, Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol, 2(2):70). A investigação na Ribopharma AG (Kulmbach, Alemanha) demonstrou que a funcionalidade de ARNi em células de mamífero, utilizando dsRNA pequeno (20-24 pares de bases) desactivava genes em células humanas sem iniciar a resposta de fase aguda. Estes resultados foram confirmados por experiências similares levadas a cabo por outros grupos de investigação. (Elbashir et al., 2001, RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev, 15(2): 188; Caplen et al., 2001, Specific inhibition of gene expression by small double stranded RNAs in invertebrate and vertebrate Systems. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 98: 9742). Em testes realizados numa variedade de linhas de células de ratinho e humanas de cancro e normais, determinou-se que o ARN small hairpin (shRNA) pode silenciar genes de maneira tão eficaz como seus homólogos de siRNA (Paddison et al., 2002, Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev, 16(8):948). Recentemente, demonstrou-se que outro grupo de ARN pequenos (21-25 pares de bases) mediava a regulação negativa da expressão génica. Estes ARN, ARN pequenos regulados temporariamente (stRNA), regulam a sincronização da expressão génica durante o desenvolvimento em Caenorhabditis elegans (para revisão veja-se Banerjee & Slack, Control of developmental timing by small temporal RNAs: a paradigm for RNA-mediated regulation of gene expression. Bioessays, 2002, 24(2): 119-29 e Grosshans & Slack, 2002, Micro-RNAs: small is plentiful. J Cell Biol, 156(1):17).

Os cientistas têm utilizado ARNi em vários sistemas, incluindo Caenorhabditis elegans, Drosophila, 4 tripanossomas e outros invertebrados. Vários grupos apresentaram recentemente a supressão específica da biossintese de proteínas em diferentes linhas de células de mamífero (especificamente em células HeLa) demonstrando que ARNi é um método que pode ser aplicado amplamente para o silenciamento génico in vitro. Com base nestes resultados, ARNi tornou-se rapidamente numa ferramenta bem reconhecida para validar (identificar e designar) a função génica. 0 ARNi que emprega oligonucleótidos de dsRNA pequenos proporcionará um entendimento da função de genes que estão sequenciados só parcialmente. 0 receptor de potencial transitório vanilóide-1 (TRPVl), também denominado receptor vanilóide 1 (VR-1), é um canal catiónico dependente de ligando sensível a capsaicina, que foi descoberto pela primeira vez em 1997 (Caterina et al. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 23 de Outubro de 1997; 389(6653):816-24) . TRPVl é expresso principalmente em neurónios sensoriais e serve como detector molecular de calor, capsaicina, protões e endovanilóides (Caterina MJ & Julius D. The vanilloid receptor: a molecular gateway to the pain pathway. Annu Rev Neurosci., 2001;24:48 7-517; Montell et al. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev., 2002, 16(8): 948-58.; Baumann TK & Martenson ME. Extracellular protons both increase the activity and reduz the conductance of capsaicin-gated channels. J Neurosci. 2000; 20:RC80).

Quando TRPVl é activada por agonistas tais como capsaicina e outros factores tais como calor, acidose, produtos de lipoxigenase ou anandamida, o cálcio entra na célula e iniciam-se os sinais de dor. A activação do canal induz a libertação de neuropéptidos desde 5 terminais nervosos sensoriais centrais e periféricos, resultando na sensação de dor, inflamação neurogénica, e às vezes, contracção do músculo liso e tosse. As evidências recentes sugerem um papel de TRPVl na dor, tosse, asma e incontinência urinária (Jia et al., TRPVl receptor: a target for the treatment of pain, cough, airway disease and urinary incontinence. Drug News Perspect. Abril 2005;18(3): 165-71).

Devido ao facto de que tanto a sensibilidade como a densidade de expressão de TRPVl são potenciadas durante estados inflamatórios (Di Marzo et al., Endovanilloid signaling in pain. Curr Opin Neurobiol. Agosto 2002;12(4): 372-9), a regulação negativa da expressão e/ou actividade de TRPVl é uma estratégia terapêutica promissora para fármacos analgésicos inovadores. Na verdade, a administração intraperitoneal de bloqueadores de TRPVl selectivos em ratinhos demonstrou atenuar a nocicepção química e térmica e a hiperalgesia (Garcia-Martinez et al., Attenuation of thermal nociception and hyperalgesia by VRl blockers. Proc Natl Acad Sei USA. 19 de Fevereiro de 2002; 99(4) :2374-9) . A função do canal de TRPVl é regulada positivamente por vários mediadores endógenos presentes em estados inflamatórios, que reduzem o limiar para a activação do canal. Portanto, foi demonstrado recentemente que o comportamento relacionado com a dor aguda provocada por meio da força iónica elevada suprime-se em ratinhos sem TRPVl e inibe-se por meio de iodoresiniferatoxina, um potente antagonista de TRPVl (Ahern et al., Extracellular cations sensitize and gate capsaicin receptor TRPVl modulating pain signaling. J Neu-rosci. 25 de Maio de 2005; 25(21):5109-16). Além disso, a prostaglandina E2 (PGE2) e prostaglandina l2 (PGI2) demonstraram aumentar ou sensibilizar respostas 6 de TRPVl através de seus respectivos receptores EPi ou IP (Moriyama et al., Sensitization of TRPVl by EP1 and IP reveals peripheral nociceptive mechanism of prostaglandins. Mol Pain. 17 de Janeiro de 2005; 1(1):3), o que sugere pela primeira vez que a sensibilização da actividade de TRPVl através da activação de EPi ou IP poderia ser um mecanismo importante subjacente nas acções nociceptivas periféricas de PGE2 ou PGI2. O documento WO 2004/042046 mostra que o siRNA dirigido contra VRl pode utilizar-se no tratamento de dor crónica, distúrbios de sensibilidade associados ao receptor VRl e inflamação, tumores, incontinência urinária e prurido associados a VR.

Os nociceptores polimodais são o tipo de nociceptores mais abundante encontrados na córnea. Existem evidências farmacológicas de que estas fibras de receptor expressam o receptor TRPVl porque respondiam a capsaicina, calor e ácido. Além disso, doses elevadas de capsaicina inactivam a activação de nociceptores polimodais da córnea ao calor e ácido enquanto que a resposta mecânica permanece não afectada. Isto sugere que os receptores TRPVl presentes nos terminais nervosos polimodais da córnea foram inactivados selectivamente. Portanto, é provável que uma parte importante da resposta nociceptiva aguda à lesão da córnea e as sensações de dor sustentada que acompanham aos processos inflamatórios e irritante neste tecido estão mediados pela activação de TRPVl.

Evidências recentes também demonstram que tanto a insulina como IGF-I potenciam as correntes de membrana mediadas por TRPVl em sistemas de expressão heterólogos e neurónios de gânglios da raiz dorsal cultivadas (Van Buren et al.r Sensitization and translocation of TRPVl by insulin and IGF-I. Mol Pain. 27 de Abril de 2005; 7 1(1):17). A potenciação de correntes de membrana resulta tanto de um aumento da sensibilidade do receptor como da traslocação de TRPVl desde o citosol até a membrana plasmática. Foi observado um aumento de IGF-1 no soro (Merimee et al., Insulin-like growth factors. Studies in diabetics with and without retinopathy. N. Engl. J. Med., 1983; 309:527-530; Grant et al., Insulin-like growth factors in vitreous. Studies in control and diabetic subjects with neovascularization. Diabetes, 1986; 35: 416-420) e o corpo vitreo e fluido intraocular (Grant et al., 1986; Inokuchi et al., Vitreous leveis of insulin-like growth factor-I in patients with proliferative diabetic retinopathy. Curr. Eye Res., 2001; 23:368-371) de pacientes com retinopatia diabética. Além disso, os niveis de IGF-I no vitreo estão correlacionados com a presença e gravidade da neovascularização da retina diabética associada à isquemia (Meyer-Schwickerath et al., Vitreous leveis of the insulinlike growth factors I and II, and the insulin-like growth factor binding proteins 2 and 3, increase in neovascular eye disease. Studies in nondiabetic and diabetic subjects. J Clin Invest., 1993;92(6):2620-5). No entanto, a fonte do aumento de IGF-1 ocular em retinopatia é controvertida e desconhece-se a contribuição relativa de qualquer de IGF-1 endógeno ou IGF-1 sérico (Ruberte et al., Increased ocular leveis of IGF-1 in transgenic mice lead to diabetes-like eye disease. J Clin invest. Abril de 2004,-113 (8):1149-57). A modulação dos niveis de TRPVl poderia ajudar no controlo da retinopatia diabética mediada por igf-i.

Embora descrito originariamente em neurónios sensoriais, foi detectado agora TRPVl em várias populações de células de pele humanas e compartimentos epiteliais do foliculo piloso (HF) humano, 8 principalmente a bainha radicular externa (ORS) e matriz capilar (Bodo et al., A hot new twist to hair biology: involvement of vanilloid receptor-1 (VRl/TRPVl) signaling in human hair growth control. Am J Pathol. Abril de 2005; 166(4):985-98) . A estimulação de TRPVl em cultura de órgãos e queratinócitos de ORS humanos cultivados inibe a proliferação, induz a apoptose, eleva a concentração de cálcio intracelular, regula positivamente inibidores do crescimento capilar endógenos conhecidos e regula negativamente promotores do crescimento capilar conhecidos, confirmando desse modo o TRPVl como participante inovador significativo no controlo do crescimento capilar humano (Bodo et al., 2005) .

As evidências mencionadas anteriormente apontam para a inibição de TRPVl como um tratamento eficaz para afecções oculares mediadas por um excesso de expressão e/ou actividade de TRPVl, tais como desconforto e sensibilidade alterada da córnea após cirurgia refractiva, utilização de lentes de contacto e olhos secos. A relação funcional entre TRPVl e IGF-I destaca a importância da regulação negativa de TRPVl para o tratamento de retinopatia diabética mediada por níveis elevados de IGF-I. O papel desempenhado por TRPVl no crescimento do folículo piloso humano e queratinócitos selecciona como alvo a TRPVl como bom candidato a ser inibido para o tratamento de estados anómalos da pele e o folículo piloso, tal como a alopecia.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Na presente invenção descreve-se a utilização de siNA dirigido contra TRPVl na preparação de um medicamento de acordo com a reivindicação 1. A utilização baseia-se na regulação negativa da expressão de uma ou mais formas de splice do gene TRPVl. A 9 inibição (regulação negativa) pode realizar-se por meio da utilização de resíduos de ácido nucleico de cadeia dupla, denominados siNA ou AN pequeno de interferência que se dirigem na interferência com a expressão de ARNm de ou uma ou mais formas de splice do gen TRPVl. Os siNA são preferentemente siRNA, embora também se incluem ácidos nucleicos modificados ou entidades similares quimicamente sintetizadas dentro do âmbito da invenção. 0 receptor TRPVl, como outros canais e proteínas de membrana, é produzido dentro da célula e é transportado em direcção a periferia por meio do transporte axónico centrífugo. Não obstante, existe a possibilidade de que TRPVl também seja sintetizado nos terminais nervosos sensoriais, sendo inserido localmente na membrana da parte transdutora dos terminais. Portanto, sem querer estar ligado a nenhuma teoria, sugere-se que o bloqueio da síntese local de TRPVl através da administração tópica de siNA dirigido a silenciar especificamente o gene encarregado da expressão de TRPVl poderia levar a uma inactivação parcial ou completa de fibras nociceptoras polimodais da córnea contra estímulos químicos por meio de estímulos exógenos ou endógenos e a uma redução ou eliminação de sua actividade de impulsos associada a lesão e inflamação.

Num primeiro aspecto da presente invenção refere-se a utilização de siNA na preparação de um medicamento para utilização num método de tratamento de uma afecção anómala ocular e/ou de folículo piloso caracterizado por um aumento da expressão e/ou actividade de TRPVl de acordo com a reivindicação 1.

Um segundo aspecto da presente invenção refere-se a um composto de siNA que selecciona como alvo a TRVPl que compreende uma sequência de nucleótidos 10 complementar à sequência de nucleótidos de SEQ ID N°: 65.

Outro aspecto da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende um composto de siNA que selecciona como alvo a TRPVl que compreende uma sequência de nucleótidos complementar à sequência de nucleótidos de SEQ ID N°: 65. A afecção de acordo com a invenção é uma afecção ocular anómala, tais como sensibilidade alterada da córnea após cirurgia refractiva, utilização de lentes de contacto, olhos secos, retinopatia diabética e outras patologias oculares.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 apresenta números de registo de GenBank que correspondem aos quatro transcritos de TRPVl produzidos por meio de splice alternativo. A figura 2 mostra fragmentos de ADN pequenos da sequência génica alvo elegidos como sequências alvo preferidas do siNA da invenção. A figura 3 mostra moléculas de siNA preferidas da invenção. A figura 4. Efeito da aplicação tópica de uma gota de 10 μΐ de solução de capsaicina 0,1 mM no olho direito e de 10 μΐ de solução salina isotónica estéril no olho esquerdo de cobaias. Foram analisados movimentos de coçar e esfregar (A), lacrimação (B) e hiperemia conjuntival (C). A figura 5. Efeito atenuante de ON3 sobre a resposta de comportamento a capsaicina tópica 0,1 mM. Foram analisados movimentos de coçar e esfregar (A), lacrimação (B) e hiperemia conjuntival (C). A figura 6. Redução média do número de movimentos de coçar/lavar em todos os animais estudados, 11 apresentados em valores absolutos (gráfico superior) e como percentagem da redução no lado tratado a partir do lado controlo, nos diversos dias após o tratamento. A figura 7. Configuração de câmara de registo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Num primeiro aspecto, a invenção refere-se ao utilização de siNA na preparação de um medicamento para utilização num método de tratamento de uma afecção anómala ocular caracterizado por um aumento da expressão e/ou actividade de TRPV1 de acordo com a reivindicação 1. A utilização pode compreender inibir a expressão de TRPVl num paciente. 0 termo inibição se utiliza para indicar uma redução ou regulação negativa da expressão ou actividade. Preferentemente, a afecção ocular é seleccionada do grupo que compreende desconforto e sensibilidade alterada da córnea após cirurgia refractiva, utilização de lentes de contacto, olhos secos, retinopatia diabética e outras patologias oculares.

Um gene se "selecciona como alvo" por um siNA de acordo com a presente invenção quando, por exemplo, a molécula de siNA reduz ou inibe selectivamente a expressão do gene. A frase "reduz ou inibe selectivamente" tal como se utiliza no presente documento abrange siNA que efectuam a expressão de um gene. Como alternativa, um siNA selecciona como alvo a um gene quando o siNA híbrida em condições restringentes com o transcrito génico.

Numa forma de realização, o siNA de acordo com a invenção é siRNA.

Foram identificados quatro variantes de transcrito que correspondem a TRPVl. Na figura 1 são apresentados números de registo de GenBank que correspondem aos 12 quatro transcritos de TRPVl produzidos por meio de splice alternativo. Preferentemente, o siNA selecciona como alvo uma forma de splice de TRPVl seleccionada do grupo que tem números de registo de GenBank NM_080704, NM_ 018727, NM_080706, NM_080705.

Na figura 2 são mostradas sequências de oligonucleótidos seleccionadas contra as quais se dirige ARNi de acordo com o primeiro aspecto da invenção. As sequências apresentadas são as sequências de ADN seleccionadas como alvo pelo siNA. Portanto, a invenção utiliza duplex de AN com sequências complementares às sequências de ADN indicadas. Portanto, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, o siNA selecciona como alvo uma sequência seleccionada de SEQ ID N° 1 a SEQ ID N° 81 ou a uma sequência que compreende uma sequência seleccionada de SEQ ID N° 1 a SEQ ID N° 81. Assim, o siNA é complementar a uma sequência seleccionada de SEQ ID N° 1 a SEQ ID N° 81 ou a uma sequência que compreende uma sequência seleccionada de SEQ ID N° 1 a SEQ ID N° 81.

De acordo com a invenção, pode utilizar-se uma pluralidade de espécies de siNA. Numa forma de realização, a pluralidade de espécies de siNA pode seleccionar como alvo a mesma espécie de ARNm, em outra forma de realização, pode seleccionar como alvo diferentes espécies.

As sequências apresentadas na figura 2 não são limitativas. De acordo com a invenção, o ADN alvo não necessita estar precedido necessariamente por AA ou CA. Além disso, o ADN alvo poderia estar constituído por sequências incluídas na figura 2 flanqueadas por qualquer sequência contígua.

Também se descreve um composto de siNA que selecciona como alvo TRVPl que compreende uma sequência de nucleótidos complementar a uma sequência de 13 nucleótidos seleccionada de SEQ ID N° 1 a 44 ou SEQ ID N° 46 a 81 tal como se mostra na figura 2. Numa forma de realização, a SEQ preferida é a SEQ ID N° 65.

Também se descreve um composto de sína que selecciona como alvo a TRVP1 que compreende uma sequência de nucleótidos complementar a uma sequência de nucleótidos seleccionada de SEQ ID N° la 44 ou SEQ ID N° 46 a 81 para utilização no tratamento de uma doença caracterizada por um aumento da expressão e/ou actividade de TRPVl, o siNA compreendendo uma sequência de nucleótidos complementar a uma sequência de nucleótidos seleccionada de SEQ ID N° 1 a 44 ou SEQ ID N° 46 a 81.

Também se descreve uma composição farmacêutica que compreende uma sequência de nucleótidos complementar a uma sequência de nucleótidos seleccionada de SEQ ID N° 1 a 44 ou SEQ ID N° 46 a 81.

Por exemplo, as moléculas de siNA compreendem sequências de nucleótidos seleccionadas do grupo de SEQ ID N° 82 a 162. Por exemplo, as moléculas de siNA compreendem sequências de nucleótidos seleccionadas do grupo de SEQ ID N° 82 a 122 ou 123 a 162.

Por exemplo, as moléculas de siNA compreendem nucleótidos não emparelhados (overhanging).

Também se descreve um método para inibir a expressão e/ou a actividade de TRPVl ex vivo em células ou tecido que compreende tratar a ditas células ou tecido com o composto que compreende uma sequência de nucleótidos complementar a uma sequência de nucleótidos seleccionada de SEQ ID N° 1 a 44 ou SEQ ID N° 46 a 81 de modo que se inibe a expressão de TRVPl.

Também se descreve um método de tratamento de uma doença caracterizada por um aumento da expressão e/ou da actividade de TRPVl, que compreende administrar siNA para inibir a expressão do gene TRPVl num paciente, em 14 que o estado patológico é seleccionado do grupo que compreende uma afecção ocular anómala, tal como sensibilidade alterada da córnea após cirurgia refractiva, utilização de lentes de contacto, olhos secos, retinopatia diabética e outras patologias oculares, assim como também um estado anómalo do foliculo piloso tal como alopecia.

Os termos "tratar" ou "tratamento" tal como são utilizados no presente documento descrevem a gestão e o cuidado de um paciente para os propósitos de combater a doença e inclui a administração do principio activo a indivíduos sintomáticos, por exemplo para prevenir a aparição dos sintomas ou complicações, isto é profilaxia. - Desenho de siNA.

Escolhe-se um fragmento pequeno da sequência génica alvo (por exemplo, 19-40 nucleótidos de comprimento) como sequência alvo do siNA da invenção. Numa forma de realização, o siNA é um siRNA. Em tais formas de realização, o fragmento pequeno da sequência génica alvo é um fragmento do ARNm do gene alvo. Em formas de realização preferidas, os critérios para escolher um fragmento de sequência do ARNm do gene alvo para ser uma molécula de siRNA candidata incluem 1) uma sequência do ARNm do gene alvo que é pelo menos de 50-100 nucleótidos desde a extremidade em 5' ou 3' da molécula de ARNm nativa, 2) uma sequência do ARNm do gene alvo que tem um conteúdo em G/C de entre 30% e 70%, o mais preferentemente aproximadamente 50%, 3) uma sequência do ARNm do gene alvo que não contém sequências repetitivas (por exemplo, AAA, CCC, GGG, TTT, AAAA, CCCC, GGGG, TTTT), 4) uma sequência do ARNm do gene alvo que é acessível no ARNm e 5) uma sequência do ARNm do gene alvo que é única para o gene alvo. O 15 fragmento de sequência do ARNm do gene alvo pode cumprir com um ou mais dos critérios identificados anteriormente. Em formas de realização em que um fragmento do ARNm do gene alvo cumpre sem chegar à totalidade dos critérios identificados anteriormente, a sequência nativa pode ser alterada de maneira que o siRNA está de acordo com mais dos critérios do que o faz o fragmento do ARNm do gene alvo. Em formas de realização preferidas, o siRNA tem um conteúdo em G/C inferior a 60% e/ou carece de sequência repetitiva.

Na prática, o gene seleccionado é introduzido como sequência de nucleótidos num programa de predição que leva em consideração todas as variáveis descritas anteriormente para o desenho de oligonucleótidos óptimos. Este programa examina qualquer sequência de nucleótidos de ARNm para determinar regiões susceptiveis de ser seleccionadas como alvo pelo siRNA. 0 resultado desta análise é uma pontuação de possíveis oligonucleótidos de siRNA. As pontuações mais altas são utilizadas para desenhar oligonucleótidos de ARN de cadeia dupla (normalmente 21 pb de comprimento, embora outros comprimentos também são possíveis) que se preparam normalmente por meio de síntese química.

Além do siNA que é complementar à região alvo de ARNm, podem utilizar-se sequências degeneradas de siNA de acordo com a invenção para seleccionar como alvo a regiões homólogas. O documento W02005/045037 descreve o desenho de moléculas de siNA para seleccionar como alvo a tais sequências homólogas, por exemplo por meio da incorporação de pares de base não canónicas, por exemplo, emparelhamentos erróneos e/ou pares de base oscilante, que podem proporcionar sequências alvo adicionais. Nos exemplos em que se identificam emparelhamentos erróneos podem se utilizar pares de base não canónicas (por exemplo, emparelhamentos 16 erróneos e/ou bases oscilantes) para gerar moléculas de siNA que seleccionam como alvo a mais de uma sequência génica. Num exemplo não limitativo são utilizados pares de base, não canónicas, tais como pares de base UU e CC para gerar moléculas de siNA que podem seleccionar como alvo a sequências para diferenciar alvos que compartem homologia de sequência.

Em formas de realização preferidas, as moléculas de siNA utilizadas de acordo com a invenção seleccionam como alvo a uma sequência seleccionada de SEQ ID Nos: 1-81 (figura 2).

As moléculas de siNA preferidas utilizadas de acordo com a invenção são de cadeia dupla. Numa forma de realização, as moléculas de siNA de cadeia dupla compreendem extremidades cegas. Em outra forma de realização, as moléculas de siNA de cadeia dupla compreendem nucleótidos não emparelhados (overhanging) (por exemplo, sequências não emparelhadas (overhangs) de 1-5 nucleótidos, preferentemente sequências não emparelhadas (overhangs) de 2 nucleótidos). Numa forma de realização especifica, os nucleótidos não emparelhados (overhangs) situam-se na extremidade 3'. Noutra forma de realização especifica, os nucleótidos não emparelhados (overhangs) situam-se na extremidade 5'. Qualquer tipo de nucleótidos pode ser parte da sequência não emparelhada {overhang). Numa forma de realização, o nucleótido ou os nucleótidos não emparelhados (overhangs) são ácidos ribonucleicos. Noutra forma de realização, o nucleótido ou os nucleótidos não emparelhados (overhangs) são ácidos desoxirribonucleicos. Numa forma de realização preferida, o nucleótido ou os nucleótidos não emparelhados (overhangs) são nucleótidos de timidina. Em outra forma de realização, o nucleótido ou os nucleótidos não emparelhados (overhangs) são 17 nucleótidos modificados ou não clássicos. 0 nucleótido ou os nucleótidos não emparelhados (overhangs) podem ter ligações internucleotidicas não clássicas (por exemplo, distinto da ligação fosfodiéster).

Em formas de realização preferidas, as moléculas de siNA utilizadas de acordo com a invenção compreendem sequências de nucleótidos seleccionadas de SEQ ID Nos: 82-162 (figura 3). Em outra forma de realização preferida, as composições de dsRNA da invenção são qualquer de SEQ ID Nos: 82-162. A invenção também abrange a utilização de siNA que são de 40 nucleótidos ou menos e compreendem uma sequência de nucleótidos de qualquer de SEQ ID Nos: 82-162 assim como também composições de dsRNA que são de 40 nucleótidos ou menos e compreendem uma sequência de nucleótidos de qualquer de SEQ ID Nos: 82-162 hibridada com seu complemento. Numa forma de realização, o siNA é de 21-30 nucleótidos e compreende uma qualquer de SEQ ID Nos: 82-162. - Síntese de siNA.

Podem sintetizar-se siNA para utilização de acordo com a invenção por meio de qualquer método conhecido na técnica. Preferentemente se sintetizam quimicamente ARN utilizando fosforamiditas de ribonucleósido protestadas apropriadamente e um sintetizador de ADN/ARN convencional. Adicionalmente, podem se obter siRNA a partir de fornecedores de síntese de oligos de ARN comerciais, incluindo, mas não limitado a, Proligo (Hamburg, Alemanha), Dharmacon Research (Lafayette, CO, E.U.A.), Glen Research (Sterling, VA, E.U.A.), ChemGenes (Ashland, MA, E.U.A.), e Cruachem (Glasgow, RU), Qiagen (Alemanha), Ambion (E.U.A.) e Invitrogen (Escócia). Como alternativa, podem se expressar moléculas de siNA da invenção em células por meio da transfecção das células com vectores que contêm a 18 sequência de siNA de complemento inversa sob o controlo de um promotor. Uma vez expresso, o siNA pode ser isolado da célula utilizando técnicas bem conhecidas na técnica.

Em formas de realização em que o siRNA é um dsRNA, uma etapa de hibridação (annealing) é necessária se são obtidas moléculas de ARN de cadeia única. Em resumo, combinam-se 30 μΐ de cada solução 50 μΜ de oligo de ARN em acetato de potássio 100 mM, HEPES-KOH 30 mM pH 7,4, acetato de magnésio 2 mM. Então incuba-se a solução durante 1 minuto a 90°C, se centrífuga durante 15 segundos e incuba-se durante 1 hora a 37°C.

Em formas de realização em que o siRNA é um ARN de short hairpin (shRNA); as duas cadeias da molécula de siRNA podem estar conectadas por meio de uma região de ligação (por exemplo, um ligante nucleotídico ou um ligante não nucleotídico). - Modificação química de siNA.

Os siNA utilizados de acordo com a invenção podem conter um ou mais nucleótidos modificados e/ou ligações não fosfodiéster. As modificações químicas bem conhecidas na técnica podem aumentar a estabilidade, disponibilidade e/ou captação celular do siNA. O perito será consciente de outros tipos de modificação química que podem se incorporar em moléculas de ARN (veja-se as publicações internacionais WO03/070744 e WO2005/045037 para uma revisão de tipos de modificações). Numa forma de realização, podem se utilizar modificações para proporcionar resistência melhorada à degradação ou captação melhorada. Exemplos de tais modificações incluem ligações internucleotídicas de fosforotioato, 2'-O-metilrribonucleótidos (especialmente na cadeia sense de um siRNA de cadeia dupla), 2'-desoxi-fluororribonucleótidos, 2'-desoxirribonucleótidos, 19 nucleótidos de "base universal", 5-C-metilnucleótidos, incorporação desoxiabásica invertida (veja-se geralmente o documento GB2406568).

Em outra forma de realização, podem se utilizar modificações para potenciar a estabilidade do siRNA ou para aumentar a eficácia de selecção como alvo. As modificações incluem ligação cruzada química entre as duas cadeias complementares de um siRNA, modificação química de uma extremidade 3' ou 5' de uma cadeia de um siRNA, modificações de açúcares, modificações de nucleobases e/ou modificações da estrutura principal, ribonucleótidos 2'-fluoro-modifiçados e 2'-desoxirribonucleótidos (veja-se geralmente a publicação internacional WO2004/029212).

Em outra forma de realização, podem se utilizar modificações para aumentar ou reduzir a afinidade pelos nucleótidos complementares no ARNm alvo e/ou na cadeia de siNA complementar (veja-se geralmente a publicação internacional W02005/044976) . Por exemplo, um nucleótido de pirimidina não modificada pode se substituir por uma 2-tio, 5-alquinil, 5-metil ou 5-propinilpirimidina. Adicionalmente, uma purina não modificada pode se substituir por uma 7-desaza, 7-alquil ou 7-alquenilpurina.

Em outra forma de realização, quando o siNA é um siRNA de cadeia dupla, os nucleótidos não emparelhados (overhangs) no nucleótido da extremidade 3' são substituídos por desoxirribonucleótidos (veja-se geralmente Elbashir et al., 2001, Genes Dev, 15:188). - Formulações e vias de administração.

As moléculas de siNA utilizadas de acordo com a invenção e as formulações ou composições das mesmas são administradas por via tópica (por exemplo, localmente) 20 ao olho, e a administração é ocular, por exemplo, por meio de gotas oculares.

Por exemplo, uma molécula de siNA pode compreender um veículo de administração, incluindo lipossomas, para a administração a um sujeito. Podem estar presentes portadores e diluentes e seus sais em formulações farmaceuticamente aceitáveis. Podem administrar-se moléculas de ácido nucleico a células por meio de uma variedade de métodos conhecidos para o perito na especialidade, incluindo, mas não limitado a, encapsulamento em lipossomas, por meio de iontoforese, ou por meio de incorporação em outros veículos, tais como polímeros biodegradáveis, hidrogéis, ciclodextrinas, poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) e microesferas de PLCA, nanocápsulas biodegradáveis e microesferas bioadesivas, ou por meio de vectores proteináceos. Em outra forma de realização, as moléculas de ácido nucleico da invenção também podem se formular ou formar complexos com polietilenimina e derivados da mesma, tais como derivados de polietileniminopolietilenoglicol-N-acetilgalactosemina (PEI-PEG-GAL) ou polietilenimino-polietilenoglicol-tri-N-acetilgalactosemina (PEI-PEG-triGAL).

Uma molécula de siNA utilizada de acordo com a invenção pode formar complexos com agentes disruptivos de membrana e/ou um lípido catiónico ou uma molécula lipídica auxiliar.

Os sistemas de administração descritos no presente documento incluem, por exemplo, géis aquosos e não aquosos, cremes, emulsões múltiplas, microemulsões, lipossomas, pomadas, soluções aquosas e não aquosas, loções, aerossóis, bases e pós de hidrocarbonetos, e podem conter excipientes tais como solubilizantes, potenciadores da permeação (por exemplo, ácidos gordos, ésteres de ácidos gordos, álcoois gordos e aminoácidos) 21 e polímeros hidrófilos (por exemplo, policarbófilo e polivinilpirrolidona). Numa forma de realização, o portador farmaceuticamente aceitável é um lipossoma ou um potenciador transdérmico.

Uma formulação farmacêutica tal como descreve-se no presente documento está numa forma adequada para a administração, por exemplo, administração sistémica ou local, numa célula ou um sujeito, incluindo, por exemplo, um ser humano. As formas adequadas dependem em parte da utilização ou a via de introdução. Outros factores são conhecidos na técnica, e incluem considerações tais como toxicidade e formas que evitam que a composição ou formulação exerçam seu efeito.

Também se descrevem composições preparadas para o armazenamento ou a administração que incluem uma quantidade farmaceuticamente eficaz dos compostos desejados num diluente ou portador farmaceuticamente aceitável. Conhecem-se bem na técnica farmacêutica diluentes ou portadores aceitáveis para utilização terapêutico. Por exemplo, podem se proporcionar conservantes, estabilizadores, colorantes e agentes aromatizantes. Estes incluem benzoato de sódio, ácido sórbico e ésteres do ácido p-hidroxibenzóico. Além disso, podem se utilizar antioxidantes e agentes de suspensão.

Uma dose farmaceuticamente eficaz é aquela dose requerida para prevenir, inibir a ocorrência, ou tratar (aliviar um sintoma até certo grau, preferentemente todos os sintomas) de um estado patológico. A dose farmaceuticamente eficaz depende do tipo de doença, a composição utilizada, a via de administração, o tipo de mamífero que se está a tratar, as características físicas do mamífero específico em consideração, a medicação concorrente e outros factores que os peritos na técnica médica reconhecerão. 22

Geralmente, é administrada uma quantidade entre 0,1 mg/kg e 100 mg/kg de peso corporal/dia de princípios activos.

As formulações tal como se descrevem no presente documento podem se administrar em formulações de dosagem unitária que contêm veículos, adjuvantes e/ou portadores farmaceuticamente aceitáveis não tóxicos convencionais. Também se descrevem no presente documento formulações que podem estar numa forma adequada para utilização oral, por exemplo, como comprimidos, trociscos, pastilhas para chupar, suspensões aquosas ou oleosas, grânulos ou pós dispersáveis, emulsão, cápsulas duras ou moles, ou xaropes ou elixires. Podem se preparar as composições pretendidas para utilização oral de acordo com qualquer método conhecido na técnica para o fabrico de composições farmacêuticas e tais composições podem conter um ou mais de tais agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes ou agentes conservantes com o fim de proporcionar preparações farmaceuticamente atractivas e apetecíveis. Os comprimidos contêm o princípio activo em mistura com excipientes farmaceuticamente aceitáveis não tóxicos que são adequados para o fabrico de comprimidos.

Estes excipientes podem ser, por exemplo, diluentes inertes; tais como carbonato de cálcio, carbonato de sódio, lactose, fosfato de cálcio ou fosfato de sódio; agentes de granulação e desintegrantes, por exemplo, amido de milho ou ácido algínico; agentes aglutinantes, por exemplo amido, gelatina ou goma arábica; e agentes lubrificantes, por exemplo, estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco. Os comprimidos podem estar não revestidos ou podem estar revestidos por meio de técnicas conhecidas. Em alguns casos tais revestimentos podem se preparar 23 por meio de técnicas conhecidas para atrasar a desintegração e absorção no tracto gastrointestinal e proporcionar desse modo uma acção sustentada durante um periodo mais longo. Por exemplo, pode se empregar um material de atraso de tempo tal como monoestearato de glicerilo ou diestearato de glicerilo.

Também podem se apresentar formulações para utilização oral como cápsulas de gelatina dura em que o principio activo está misturado com um diluente sólido inerte, por exemplo, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio ou caulino, ou como cápsulas de gelatina mole em que o principio activo está misturado com água ou um meio oleoso, por exemplo, óleo de amendoim, parafina liquida ou óleo de oliva.

As suspensões aquosas contêm os materiais activos numa mistura com excipientes adequados para o fabrico de suspensões aquosas. Tais excipientes são agentes de suspensão, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose, hidropropilmetilcelulose, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto e goma arábica; agentes dispersantes ou humectantes podem ser um fosfátido que é produzido de maneira natural, por exemplo, lecitina, ou produtos de condensação de um óxido de alquileno com ácidos gordos, por exemplo estearato de polioxietileno, ou produtos de condensação de óxido de etileno com álcoois alifáticos de cadeia longa, por exemplo, heptadecaetilenoxicetanol, ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos gordos e um hexitol tal como monooleato de polioxietilensorbitol, ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos gordos e anidridos de hexitol, por exemplo monooleato de polietilenosorbitano. As suspensões aquosas também podem conter um ou mais conservantes, por exemplo p-hidroxibenzoato de etilo ou 24 n-propilo, um ou mais agentes colorantes, um ou mais agentes aromatizantes e um ou mais agentes edulcorantes, tais como sacarose ou sacarina.

Podem se formular suspensões oleosas por meio da suspensão dos princípios activos num óleo vegetal, por exemplo óleo de amendoim, óleo de oliva, óleo de gergelim ou óleo de coco, ou num óleo mineral tal como parafina líquida. As suspensões oleosas podem conter um agente espessante, por exemplo, cera de abelha, parafina dura ou álcool cetílico. Podem se adicionar agentes edulcorantes e agentes aromatizantes para proporcionar preparações orais apetecíveis.

Estas composições podem se conservar por meio da adição de um antioxidante, tal como ácido ascórbico.

Os grânulos e pós dispersáveis adequados para a preparação de uma suspensão aquosa por meio da adição de água proporcionam o princípio activo em mistura com um agente dispersante ou humectante, agente de suspensão e um ou mais conservantes. Agentes dispersantes ou humectantes adequados são exemplificados pelos já mencionados anteriormente. Também podem estar presentes excipientes adicionais, por exemplo agentes edulcorantes, aromatizantes e colorantes.

As composições farmacêuticas descritas no presente documento também podem estar em forma de emulsões óleo em água. A fase oleosa pode ser um óleo vegetal ou um óleo mineral ou misturas dos mesmos. Os agentes de emulsão adequados podem ser gomas que são produzidos de maneira natural, por exemplo, goma arábica ou goma tragacanto, fosfátidos que são produzidos de maneira natural, por exemplo lecitina de soja, e ésteres ou ésteres parciais derivados de ácidos gordos e hexitol, anidridos, por exemplo monooleato de sorbitano, e produtos de condensação dos ditos ésteres parciais com 25 óxido de etileno, por exemplo, monooleato de polioxietilenosorbitano. As emulsões também podem conter agentes edulcorantes e aromatizantes.

Podem se formular xaropes e elixires com agentes edulcorantes, por exemplo glicerol, propilenoglicol, sorbitol, glicose ou sacarose. Tais formulações também podem conter um emoliente, um conservante e agentes aromatizantes e colorantes. As composições farmacêuticas podem estar em forma de uma suspensão oleaginosa ou aquosa injectável estéril.

Esta suspensão pode se formular de acordo com a técnica conhecida utilizando aqueles agentes dispersantes ou humectantes adequados e agentes de suspensão que foram mencionados anteriormente.

Uma preparação injectável estéril também pode ser uma suspensão ou solução injectável estéril num solvente ou diluente parentericamente aceitável não tóxico, por exemplo, como uma solução em 1,3-butanodiol. Entre os solventes e veículos aceitáveis que podem se empregar estão água, solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotónica. Além disso, são empregados convencionalmente óleos fixos, estéreis como solvente ou meio de suspensão. Para este propósito pode se empregar qualquer óleo fixo suave incluindo mono ou diglicéridos sintéticos. Além disso, são utilizados ácidos gordos tais como ácido oleico na preparação de injectáveis.

As moléculas de ácido nucleico descritas no presente documento também podem se administrar em forma de supositórios, por exemplo, para a administração rectal do medicamento. Estas composições podem se preparar misturando o medicamento com um excipiente não irritante adequado que é sólido a temperaturas ordinárias, mas líquido à temperatura rectal e, portanto, fundirá no recto para liberar o medicamento. 26

Tais materiais incluem manteiga de cacau e polietilenoglicóis.

As moléculas de ácido nucleico descritas no presente documento podem se administrar parentericamente num meio estéril. 0 medicamento, dependendo do veiculo e da concentração utilizados, pode suspender-se ou dissolver-se no veiculo. Vantajosamente, podem se dissolver no veiculo adjuvantes tais como anestésicos locais, conservantes e agentes de tamponamento.

Entende-se que o nivel de dose especifico para qualquer sujeito particular depende de uma variedade de factores incluindo a actividade do composto especifico empregado, a idade, o peso corporal, a saúde geral, o sexo, a dieta, o tempo de administração, a via de administração e a taxa de excreção, a combinação de fármacos e a gravidade da doença particular a submeter a terapêutica.

Para a administração a animais não humanos, a composição também pode se adicionar à água para beber ou à comida do animal. Pode ser conveniente formular as composições de água para beber e comida do animal de modo que o animal toma numa quantidade terapeuticamente apropriada da composição junto com sua dieta. Também pode ser conveniente apresentar a composição como uma mistura prévia para adicionar-se a água para beber ou a comida.

As moléculas de ácido nucleico descritas no presente documento também podem se administrar a um sujeito em combinação com outros compostos terapêuticos para aumentar o efeito terapêutico global. A utilização de compostos múltiplas para tratar uma indicação pode aumentar os efeitos benéficos enquanto que se reduz a presença de efeitos secundários. 27

Como alternativa, certas moléculas de siNA descritas no presente documento podem se expressar dentro de células a partir de promotores eucariotas. Podem se administrar vectores recombinantes que podem expressar as moléculas de siNA e persistir nas células alvo. Como alternativa, podem se utilizar vectores que proporcionam expressão transitória de moléculas de ácido nucleico. Tais vectores podem se administrar repetidamente conforme seja necessário. Uma vez expressa, a molécula de siNA interage com o ARNm alvo e gera uma resposta de ARNi. A administração de vectores que expressam moléculas de siNA pode ser sistémica, tal como administração intravenosa ou intramuscular, por meio da administração a células alvo retiradas de um sujeito seguido da reintrodução no sujeito, ou por meio de qualquer outro meio que permitiria a introdução na célula alvo desejada.

Procedimento experimental

Síntese de siNA

Uma etapa de hibridação é necessária quando se trabalha com moléculas de ARN de cadeia única. É crítico que todas as etapas de manipulação se realizem em condições livre de RNase, estéreis. Para hibridar os ARN, em primeiro lugar devem ser quantificados os oligos por meio de absorção de UV a 260 nanómetros (nm). O seguinte protocolo com base em Elbashir et al. (2001) se utiliza então para hibridar: • tomar alíquotas por separado e diluir cada oligo de ARN até uma concentração de 50 μΜ. • Combinar 30 μΐ de cada solução de oligo de ARN e 15 μΐ de 5X tampão de hibridação. A concentração de tampão final é: acetato de potássio 100 mM, HEPES-KOH 30 mM pH 7,4, acetato de magnésio 2 mM. O volume final é de 75 μΐ. 28 • Incubar a solução durante 1 minuto a 90°C, centrifugar o tubo durante 15 segundos, deixar repousar durante 1 hora a 37°C, então utilizar a temperatura ambiente. A solução pode se armazenar congelada a -20°C e se congela-descongela até 5 vezes. A concentração final de duplex de siRNA é normalmente de 20 μΜ.

Como alternativa, podem se adquirir a partir dos fornecedores dsRNA já hibridado.

Também podem se utilizar ácidos nucleicos quimicamente modificados. Por exemplo, um resumo dos tipos de modificação que podem ser utilizados se proporciona no documento W003/070744, o conteúdo do qual se incorpora no presente documento como referência. Presta-se atenção particular às páginas 11 a 21 desta publicação. Outras possíveis modificações são tal como foram descritas anteriormente. O perito será consciente de outros tipos de modificação química que podem se incorporar nas moléculas de ARN.

Sistema "in vitro"

Foi detectada a expressão de TRPVl em fibras de nervos sensoriais cutâneos, mastócitos, queratinócitos epidérmicos, vasos sanguíneos dérmicos, a bainha radicular interna e o infundíbulo de folículos pilosos, sebócitos diferenciados, condutos de glândulas sudoríparas e a parte secretora das glândulas sudoríparas ecrinas por meio de ensaios de imunorreactividade (Stander et al., 2004). Após a reacção em cadeia da polimerase por meio de transcriptase inversa e análise de imunotransferência tipo Western, foi detectado TRPVl em mastócitos e queratinócitos de pele humana (Stander et al., 2004). Recentemente, as células dendríticas também demonstraram que expressam TRPVl (Basu & Srivastava, 29 2005) e se desenvolveram modelos de células neuronais com células que expressam TRPVl (Lilja & Forsby, 2004) .

Culturas celulares que expressam o qene alvo TRPVl são utilizadas para uns testes preliminares da especificidade de interferência de siRNA. As células são incubadas com os correspondentes duplex de siRNA e é levada a cabo o análise da regulação negativa da expressão do gene alvo. Para associar o silenciamento de siRNA a fenótipos específicos em células cultivadas, é necessário demonstrar a redução da proteína seleccionada como alvo ou pelo menos demonstrar a redução do ARNm seleccionado como alvo.

Podem se quantificar níveis de ARNm do gene alvo por meio de PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) . Além disso, podem se determinar os níveis de proteína numa variedade de modos bem conhecidos na técnica, tais como análise de imunotransferência tipo Western com anticorpos específicos contra o alvo, que permitem monitorizar directamente a redução da proteína seleccionada como alvo.

Transfecção de duplex de siRNA em culturas celulares Vários exemplos de técnicas bem conhecidas na técnica são como segue: pode se realizar uma única transfecção de duplex de siRNA utilizando um lípido catiónico, tal como reagente de transfecção RNAiFect (Qiagen) e reagente Lipofectamine 2000 (Invitrogen) e um ensaio para o silenciamento 24, 48 e 72 horas após a transfecção.

Pode se realizar um protocolo de transfecção típica tal como segue: para um poço de uma placa de 6 poços, transfecta-se utilizando 100 nM como concentração final de siRNA. Seguindo o protocolo de RNAiFect, semeia-se em placa o dia antes da transfecção, 2-4 x 105 células por poço em 3 ml de um 30 meio de crescimento apropriado, que continha DMEM, soro a 10%, antibióticos e glutamina, e incubam-se as células em condições de crescimento normais (37°C e 5% de C02) . No dia da transfecção, as células têm que estar em 30-50% de confluência. Diluem-se 15 ul de duplex de siRNA 20 uM (correspondente à concentração final 100 nM) em 85 ul de tampão EC-R, para proporcionar um volume final de 100 ul, e mistura-se por meio de agitação com vórtice. Para a formação de complexos são adicionados 19 ul de reagente de transfecção RNAiFect até obter o siRNA diluído e se misturam por meio de pipeta ou agitando com vórtice. Após a incubação das amostras durante 10-15 minutos a temperatura ambiente para permitir a formação de complexos de transfecção, são adicionados os complexos gota a gota nas células com 2,9 ml de meio de crescimento fresco com baixo conteúdo em antibióticos. Após agitar as placas para assegurar a distribuição uniforme dos complexos de transfecção, incubam-se as células em condições de crescimento normais. Ao dia seguinte, retiram-se os complexos e adiciona-se meio de crescimento completo e fresco. Para monitorizar o silenciamento génico, são recolhidas as células às 24, 48 e 72 horas após a transfecção. O protocolo do reagente Lipofectamine 2000 é bastante similar. O dia antes da transfecção são semeadas em placa 2-4 x 105 células por poço em 3 ml de um meio de crescimento apropriado, que contém DMEM, soro a 10%, antibióticos e glutamina, e incubam-se as células em condições de crescimento normais (37°C e 5% de C02) . No dia da transfecção, as células têm que estar em 30-50% de confluência. Diluem-se 12,5 ul de duplex de siRNA 20 uM (correspondente à concentração final 100 nM) em 250 ul de DMEM, para proporcionar um volume final 262,5 ul, e misturam-se. Além disso, diluem-se 6 ul de 31

Lipofectamine 2000 em 250 ul de DMEM e misturam-se. Após uma incubação de 5 minutos a temperatura ambiente, combinam-se o oligómero diluído e o Lipofectamine diluído para permitir a formação de complexos durante uma incubação de 20 minutos a temperatura ambiente. Depois de isto são adicionados os complexos gota a gota nas células com 2 ml de meio de crescimento fresco com baixo conteúdo em antibióticos e misturam-se suavemente mexendo suavemente a placa para frente e para trás, para assegurar a distribuição uniforme dos complexos de transfecção. Incubam-se as células em condições de crescimento normais e ao dia seguinte, retiram-se os complexos e adiciona-se meio de crescimento completo e fresco. Para monitorizar o silenciamento génico, são recolhidas as células às 24, 48 e 72 horas após a transfecção. A eficácia da transfecção pode depender do tipo de célula, mas também do número de passagens e a confluência das células. Também são críticos o tempo e a maneira de formação de complexos de siRNA-lipossomas (por exemplo, inversão versus agitação com vórtice). As baixas eficácias de transfecção são a causa mais frequente do silenciamento não satisfatório. Uma boa transfecção não é um assunto trivial e necessita se examinar cuidadosamente cada linha de células nova que a ser utilizada. A eficácia da transfecção pode ser testada transfectando genes indicadores, por exemplo um plasmídeo de expressão de EGFP conduzido por CMV (por exemplo, de Clontech) ou um plasmídeo de expressão de B-Gal, e então avalia-se por meio de contraste de fases e/ou microscopia de fluorescência ao dia seguinte.

Testes de duplex de siRNA

Dependendo da abundância e o tempo de vida (ou renovação) da proteína seleccionada como alvo, um 32 fenótipo silenciado pode se tornar evidente após 1 a 3 dias, ou inclusive mais tarde. Em casos em que não se observa nenhum fenótipo, pode se observar a diminuição da proteína por meio de imunof luorescência ou imunotransferência tipo Western.

Após as transf ecções, as fracções de ARN total extraídas de células são pré-tratadas com DNase I e são utilizadas para a transcrição inversa utilizando um iniciador aleatório. É levada a cabo uma amplificação por PCR com um par de iniciadores específicos que cobrem pelo menos uma união exão-exão com o propósito de controlar a amplificação de pré-ARNm. Também se necessita como controlo a RT/PCR de um ARNm não seleccionado como alvo. A diminuição eficaz da redução ainda indetectável de ARNm da proteína alvo pode indicar que pode existir na célula uma grande reserva de proteína estável. Como alternativa, pode se utilizar a amplificação por PCR em tempo real para testar de um modo mais exacto o desaparecimento ou redução de ARNm. A PCR por meio de transcriptase inversa (RT) em tempo real quantifica a quantidade inicial do molde da maneira mais específica, sensível e reproduzível. A PCR em tempo real monitoriza a fluorescência emitida durante a reacção como indicador da produção de amplicões durante cada ciclo de PCR, num aparelho lightcycler. Este sinal aumenta em proporção directa com a quantidade de produto de PCR numa reacção. Por meio do registo da quantidade de emissão de fluorescência em cada ciclo, é possível monitorizar a reacção de PCR durante a fase exponencial em que o primeiro aumento significativo da quantidade de produto de PCR está correlacionado com a quantidade inicial do molde alvo.

Para verificar o padrão de interferência do gene TRPV1 nas culturas de células, realiza-se uma qRT-PCR 33 de acordo com o protocolo do fabricante. Para a qRT-PCR quantitativa, são utilizados aproximadamente 250-500 ng de ARN total para a transcrição reversa seguida da amplificação por PCR com iniciadores específicos para TRPVl na mistura de reacção que contém Master SYBR. Green I. As condições de PCR básicas compreendem uma etapa inicial de 30 min. a 91°C, seguido de 40 ciclos de 5 s a 95°C, 10 s a 62°C e 15 s a 72°C. Pode se utilizar a quantificação de ARNm de b-actina como controlo para a normalização de dados. As comparações da expressão génica relativas funcionam melhor quando a expressão génica do controlo interno/endógeno elegido é mais abundante e permanece constante, em proporção com o ARN total, entre as amostras. Por meio da utilização de um controlo endógeno invariante como referência activa, a quantificação de um alvo de ARNm pode se normalizar para as diferenças na quantidade de ARN total adicionado a cada reacção. As curvas de amplificação obtidas com o lightcycler são analisadas em combinação com o ARN do kit controlo, que selecciona como alvo ao molde de ARN de citocina transcrito in vitro, de acordo com o protocolo do fabricante. Com o fim de avaliar a especificidade do produto de PCR amplificado realiza-se uma análise de curvas de fusão. As curvas de fusão resultantes permitem a discriminação entre dímeros de iniciadores e produto de PCR específico.

Estudos em animais O efeito do silenciamento in vivo de moléculas de sína sobre níveis de expressão de TRPVl pode se testar num modelo de córnea de cobaia tal como o descrito por Brock et al. Tetrodotoxin-resistant impulses in single nociceptor nerve terminais in guinea-pig cornea. J Physiol. 1 de Outubro de 1998; 512 (Pt 1):211-7. 34 0 procedimento básico consiste na instilação da molécula de siNA que a ser testada, contida num pequeno volume, na superfície da córnea de cobaia. Os olhos contralaterais são tratados com o veículo só e podem se utilizar como controlos em cada experiência para que não exista um fenómeno simpático com o outro olho. Devem se suprimir múltiplas experiências no mesmo animal. Podem se levar a cabo registos extracelulares da actividade eléctrica de axões sensoriais de córnea de cobaia controlo ou tratada com siNA tal como descreve-se em Brock et al. em 1998. Basicamente, olhos de cobaias (150-300 g, sacrificadas com 100 mg kg-1 de pentobarbitona I.P.) são colocados numa câmara de registo e perfundem com solução salina fisiológica da seguinte composição (mM): Na+, 151; K+, 47; Ca2+, 2; Mg2+, 1,2; Cl-, 144; H2P03-, 1,3; HC03-, 16,3; e glicose, 9,8. Esta solução se gaseifica com 95% de 02 -5% de C02 (a pH 7,4) e mantém-se a 31-33°C. O nervo óptico e os nervos ciliares associados são arrastados para dentro de um eléctrodo estimulador de sucção. Os parâmetros de estímulo são modificados tal como seja requerido por todo a experiência (largura de pulso, 0-1-0,5 ms, 5-30 V). Um eléctrodo de registo de vidro (diâmetro exterior da ponta, 50 μιη) cheio com solução salina fisiológica é aplicado à superfície do epitélio corneai com sucção leve. A actividade eléctrica é registada através de um amplificador AC (Neurolog NL104, Digitimer Ltd, Welwyn Garden City, RU; aumento, 2000; filtro de alta frequência fixo a 0,1 Hz) e os resultados digitalizam-se a 44 kHz e são armazenados numa fita magnética utilizando um gravador PCM (A. R. Vetter Co. Inc., Rebersburg, PA, E.U.A.). Os registos somente são realizados desde lugares em que os impulsos nervosos são facilmente distinguidos do ruído (10 μν de pico a pico quando realiza-se um filtro de baixa 35 frequência a 3-5 kHz). Em muitos lugares na córnea, a actividade eléctrica não provocada ou espontânea é registada ou os sinais são pequenos demais para se analisar. A perfusão interna do eléctrodo de registo é conseguida por meio da inserção de um tubo de plástico fino até dentro de 200 μπι da ponta de eléctrodo (veja-se Brock & Cun-nane, 1995, Effects of Ca2+ e K+ channel blockers on nerve impulses recorded from postganglionic sympathetic nerve terminais. The Journal of Physiology 489, 389-402). Um sistema de aquisição de dados MacLab (ADInstruments Pty Ltd, Castle Hill, NSW, Austrália) é utilizado para digitalizar (frequências de amostragem, 10-20 kHz) sinais electrofisiológicos registados previamente numa fita. Antes da digitalização, os sinais são filtrados utilizando um filtro de baixa frequência (corte, 3-5 kHz). Realiza-se a análise posterior com o programa de computador Igor Pro (Wavemetrics, Lake Oswego, OR, E.U.A.). Podem se quantificar niveis de ARNm de TRPVl por meio de PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) enquanto que pode se monitorizar directamente a redução dos niveis de proteina numa variedade de modos bem conhecidos na técnica, tais como análise de imunotransferência tipo Western com anticorpos específicos contra o alvo.

Pode monitorizar-se a regulação negativa da expressão de TRPVl por meio de siNA no foliculo piloso por meio dos seguintes modelos representativos sem excluir outros modelos de animais na técnica: - Transfecção do foliculo piloso de ratinho in vivo. Com anestesia geral, corta-se o pelo da pele dorsal de ratinhos Balb/c de 50 dias de idade (Charles River, Wilmington, MA) e trata-se com uma creme depilatório ou máquina de barbear (Neet; Premier Consumer Products, Inc., Englewood, NJ) durante 5 min. Em diferentes momentos após a depilação, são aplicados 36 por via tópica 50 ml de lipoplex que contêm 50 mg de lipido e quantidades diferentes de siRNA individuais junto com 10 mg de pCMV-b-gal a 1 cm2 de pele dorsal em aliquotas de 5 ml utilizando uma micropipeta ao longo de 90 min. As quantidades de ADN são similares aos estudos publicados previamente. Trata-se a pele controlo com um siRNA desordenado junto com 10 mg de plasmideo nu ou 50 mg de lipido só. A pele transfectada é recolhida 24 ou 48 h após a transfecção, e é corada para determinar a actividade de b-gal. - Modelo de xenoenxerto. Ratinhos macho CB-17 Icr-scid/scid de quatro semanas de idade (Charles River, Wilmington, MA) são mantidos em condições livre de patogénios. É enxertado couro cabeludo fetal humano (20 semanas de gestação de Advanced Bio-science Resources, Alameda, CA), ou couro cabeludo adulto humano a partir de cirurgia cosmética no prazo de 24 h da recolhida. Realiza-se a cirurgia de enxerto numa capela de fluxo laminar utilizando procedimentos estéreis. Os ratinhos com mistura de ketamina-xilazina são anestesiado, após o que corta-se o pelo na dorso. Os pedaços de pele medindo lxl cm são enxertados num leito de tamanho similar que foi preparado retirando pele de ratinho abaixo da fáscia. Os enxertos de pele humana (normalmente dois por ratinho) são mantidos no lugar com sutura de monofilamento não absorvível 6-0. Os transplantes são recobertos com petrolato e são cobertos com Tegaderm (3M Health Care Ltd. (St. Paul, MN)), e penso estéril. Retiram-se as vendas após duas a três semanas, e deixam-se cicatrizar os enxertos durante duas a três semanas adicionais antes de proceder com as experiências. - Transfecção de xenoenxertos humanos in vivo. Antes da transfecção depilam-se os xenoenxertos. Alguns enxertos também tratam-se com creme de ácido retinóico 37 a 0,05% (Retin-A, Johnson & Johnson, Raritan, NJ) a cada dois dias durante uma semana. No dia da transfecção os ratinhos são anestesiados e os xenoenxertos são pré-hidratados com PBS durante 15 min. Após 75 mg de lipido pFx-1 e 30 mg de pCMV-b-gal com ou sem siRNA individuais em OPTI-MEM serem misturados, a mistura é pipeteada por via tópica em aliquotas de 5 ml (total de 75 ml) à pele enxertada a cada dois dias durante três dias. São utilizadas doses superiores de ADN e lipossomas em transfecções humanas versus de ratinho devido ao estrato córneo mais grosso, que poderia absorver potencialmente o lipoplex e evitar a administração adequada ao foliculo. A pele é recolhida 48 h após a transfecção e trata-se para determinar a actividade de b-gal.

Ensaios histoquimicos. Fixam-se amostras de tecido de ratinho e humano em formaldeido a 2%/glutaraldeído a 0,2% preparado recentemente em PBS a 4°C durante 2-4 h, então são lavados em três trocas de PBS a temperatura ambiente durante 1 h. Incuba-se o tecido fixo a 37°C durante a noite em 1 mg ml-1 de X-gal em PBS. Então o tecido é lavado com PBS, é fixo em formalina, e é incrustado em parafina. Secções de 5 mm são contra-coradas com vermelho nuclear rápido. Podem se corar também biopsias fixas com anticorpos específicos para testar a inibição da expressão de TRPVl. Realiza-se a coloração tal como foi notificado anteriormente. Alguns cortes de biopsia são mantidos em ARN later (Ambion) e trata-se para a purificação de ARN. O ARN total é analisado utilizando iniciadores/sondas específicos para determinar a interferência específica após tratamentos com siRNA individuais.

EXEMPLOS 38

Exemplo 1 A fim de determinar se a resposta de comportamento à aplicação tópica do agonista de TRPVl capsaicina foi modificada por meio de tratamento prévio com siRNA preparado contra TRPVl de cobaia, foram levadas a cabo experiências em cobaias machos, adultos. 1- Efeito de capsaicina tópica.

Trataram-se duas cobaias com gota de 10 μΐ de uma solução de capsaicina 0,1 mM no olho direito e 10 μΐ de solução salina isotónica estéril no olho esquerdo.

Nos seguintes 5 min. após a aplicação tópica foram medidos os seguintes parâmetros: - frequência de pestanejo - tempo de fechamento do pálpebra - movimentos de coçar (com a extremidade traseira) e movimentos de esfregar (com a pata dianteira) dirigidos ao olho tratado.

Após este período de 5 min. foram avaliados os seguintes parâmetros: - hiperemia conjuntival e edema palpebral - lacrimação (com uma tira de Schirmer mantida 3 min. no saco subconjuntival).

Realizaram-se experiências às 9:00 am durante 4 dias consecutivos. Trataram-se ambos os olhos simultaneamente com a solução correspondente, e se mediram os parâmetros simultaneamente por meio de um observador independente para cada olho. Todos os parâmetros medidos eram superiores no olho tratado com capsaicina quando foram comparados com o controlo (tratado com solução salina). Os parâmetros que foram alterados da maneira mais constante eram o número de movimentos de coçar/esfregar, hiperemia e lacrimação. A figura 4 resume os resultados obtidos em 2 animais. É evidente que capsaicina provocou movimentos 39 de coçar/esfregar, hiperemia conjuntival e lacrimação que estavam ausentes no lado tratado com solução salina. Além disso, não foi observada dessensibilização a aplicações repetidas durante dias sucessivos. 2- Efeito do oligonucleótido 3 (0N3), que corresponde a SEQ ID N° 146 com sequências não emparelhadas (overhangs) dTdT em ambas as extremidades 3', na resposta a capsaicina. 0 efeito atenuante de 0N3 sobre a resposta de comportamento a capsaicina tópica foi explorado inicialmente num grupo de 4 cobaias. Foram aplicados por via tópica duas doses de 15 μΐ de uma solução que continha ο 0N3 ao olho direito (olho tratado) às 9:00 am durante os dias 0, 1 e 2. Às 3:00 pm durante os dias 1, 2, 3, 4, 7, 8 e 9, foram aplicados 10 μΐ de solução de capsaicina 0,1 mM a ambos os olhos e mediu-se a resposta de comportamento ao medicamento em cada olho, de acordo com os métodos descritos anteriormente.

Tal como é mostrado na figura 5, ON3 provocou uma redução da resposta de comportamento (número de movimentos de coçar/esfregar) à aplicação de capsaicina em comparação com os animais não tratados. Esta redução foi estabelecida gradualmente, começando no dia 2 e aumentando em dias sucessivos. Sete dias após o tratamento, ainda estavam presentes as diferenças na resposta entre olhos tratados com ON3 e não tratados. Ao contrário, a secreção de lágrimas não era diferente entre ambos os olhos. A figura 6 resume a redução média do número de movimentos de coçar/esfregar em todos os animais estudados, apresentada em valores absolutos (gráfico superior) e como percentagem de redução no lado tratado a partir do lado controlo, nos diversos dias após o tratamento. 40

Exemplo 2

Olhos de cobaias profundamente anestesiadas foram dissecados de suas órbitas e foram colocados numa câmara de registo dividida. Perfundiu-se continuamente o olho com solução fisiológica da seguinte composição (mM) : Na+, 151; K+, 4,7; Ca2 + , 2; Mg2 + , 1,2; Cl-, 144,5; H2P03-, 1,3; HC03-, 16,3; glicose, 7,8. Gasificou-se esta solução com carbogénio (95% de 02, 25% de C02) a pH 7,4 e foi mantida a aproximadamente 34°C com um dispositivo Peltier. A actividade das fibras nervosas da córnea individuais foi registada a partir dos nervos ciliares na parte traseira do olho. A configuração de registo é mostrada esquematicamente na figura 7.

Olhos controlo: foi registada a actividade neural a partir de 20 fibras polimodais obtidas de 10 olhos de cobaia identificados por sua resposta à estimulação mecânica e por sua resposta a um jacto de gás que continha C02 (98%). Em cada fibra foi aplicada uma sequência de estímulos: uma gota de capsaicina 0,1 mM seguida de esfregação 30 s mais tarde. Solução salina quente a 45°C durante 1 min., pulso de C02 aplicado durante 30 s. Entre cada estimulo se deixou uma pausa de 5 min. Foram aplicadas três destas sequências por fibra individual com um intervalo de 15 min. entre ciclos de estimulação. Realizou-se a quantificação da resposta medindo o número total de impulsos provocados por cada estimulo durante o período de estimulação.

Olhos tratados: em 5 cobaias, trataram-se ambos os olhos com 15 μΐ de uma solução que continham ON3 às 9:00 am a cada dois dias durante três dias consecutivos, no quarto dia, foram enucleados ambos os olhos e foram estudados "in vitro" tal como foi descrito anteriormente. 41

Foram identificadas nestes olhos nove fibras como fibras nociceptoras polimodais. 0 mesmo protocolo de estimulação utilizado para os olhos controlo, em especial estímulos de capsaicina, calor e C02 aplicados sequencialmente com uma pausa de 5 min. entre estímulos, repetiu-se três vezes por fibra. A quantificação da resposta a cada um de estes estímulos mostrou que o número de impulsos provocados era significativamente inferior em animais tratados com 0N3. A redução da resposta em comparação com os olhos controlo era: de 60% para a estimulação com capsaicina, de 56% para a estimulação com calor e de 40% para a estimulação ácida. 42

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • WO 2004042046 A [0011] • WO 2005045037 A [0040] [0047] • WO 03070744 A [0047] [0077] • GB 2406568 A [0047] • WO 2004029212 A [0048] • WO 2005044976 A [0049]

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Claims (18)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma dose farmaceuticamente eficaz de siNA dirigido contra TRPVl na preparação de um medicamento para utilização no tratamento de uma afecção ocular caracterizada por um aumento da expressão e/ou actividade de TRPVl, em que o dito medicamento é administrado por via tópica na superfície da córnea.

2. A utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a administração é por meio da utilização de gotas oculares.

3. A utilização de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que a afecção ocular é seleccionada do grupo que compreende desconforto e sensibilidade alterada da córnea após cirurgia refractiva, utilização de lentes de contacto, olhos secos, retinopatia diabética e outras patologias oculares.

4. A utilização de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o siNA é siRNA.

5. A utilização de acordo com a reivindicação 4, em que o siRNA é dsRNA ou shRNA.

6. A utilização de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o siNA compreende um oligonucleótido modificado em que a dita modificação é seleccionada de ligações internucleotídicas de fosforotioato, 2'-0- metilrribonucleótidos, 2'-desoxi- fluororribonucleótidos, 2'-desoxirribonucleótidos, nucleótidos de "bases universais", 5-C- metilnucleótidos, incorporação de um resíduo 2 desoxiabásico invertido, ligação cruzada entre as duas cadeias complementares de um siRNA, modificação química de uma extremidade 3' ou 5' de uma cadeia de um siRNA, modificações de açúcares, modificações de nucleobases e/ou modificações da cadeia principal, ribonucleótidos 2'-fluoro-modifiçados e 2'-desoxirribonucleótidos, substituição de um nucleótido de pirimidina não modificada por uma 2-tio, 5-alquinil, 5-metil ou 5-propinilpirimidina ou substituição de uma purina não modificada por uma 7-desaza, 7-alquil ou 7-alcenilpurina.

7. A utilização de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que se utiliza uma pluralidade de espécies de siNA.

8. A utilização de acordo com a reivindicação 7, em que a dita pluralidade de espécies selecciona como alvo a mesma espécie de ARNm.

9. A utilização de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o siNA selecciona como alvo uma sequência seleccionada de SEQ ID Nos 1 a SEQ ID Nos 81 ou uma sequência que compreende uma sequência seleccionada de SEQ ID Nos 1 a SEQ ID Nos 81.

10. A utilização de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que as moléculas de siNA da invenção compreendem sequências de nucleótidos seleccionadas do grupo de SEQ ID Nos 82 a SEQ ID Nos 162.

11. A utilização de acordo com a reivindicação 10, em que moléculas de siNA contêm sequências nucleotídicas não emparelhadas (overhangs) na extremidade 3'. 3 12. siNA dirigido contra TRPV1 para utilização no tratamento de uma afecção ocular caracterizado por um aumento da expressão e/ou actividade de TRPVl, em que é administrado o dito siNA, em que o dito medicamento é administrado por via tópica na superfície da córnea.

13. Um composto de siNA que selecciona como alvo a TRPVl que compreende uma sequência de nucleótidos complementar à sequência de nucleótidos da SEQ ID N°: 65.

14. Um composto de siNA de acordo com a reivindicação 13, que compreende a sequência de nucleótidos descrita na SEQ ID N°: 146 .

15. Um composto de siNA de acordo com a reivindicação 14, que compreende a SEQ ID N° 146 com sequências nucleotídicas não emparelhadas (overhangs) em ambas as extremidades em 3', em que ambas as sequências não emparelhadas são dTdT. 16. 0 siNA de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 15, em que o siNA é siRNA. 17. 0 siNA de acordo com a reivindicação 16, em que o siRNA é dsRNA ou shRNA. 18. 0 siNA de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 17, em que o siNA compreende um oligonucleótido modificado em que a dita modificação é seleccionada de ligações internucleotídicas de fosforotioato, 2'-0-metilrribonucleótidos, 2'-desoxi- fluororribonucleótidos, 2'-desoxirribonucleótidos, nucleótidos de "bases universais", 5-C- metilnucleótidos, incorporação de resíduos desoxi 4 abásicos invertidos, ligação cruzada entre as duas cadeias complementares de um siRNA, modificação química de uma extremidade 3' ou 5' de uma cadeia de um siRNA, modificações de açúcares, modificações de nucleobases e/ou modificações da estrutura principal, ribonucleótidos 2'-fluoro-modifiçados e 2'-desoxirribonucleótidos, substituição de um nucleótido de pirimidina não modificada por uma 2-tio, 5-alquinil, 5-metil ou 5-propinilpirimidina ou substituição de uma purina não modificada por uma 7-desaza, 7-alquil ou 7-alcenilpurina.

19. Um siNA de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 18 para utilização como um medicamento.

20. A utilização de uma dose farmaceuticamente eficaz de siNA de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 18 na preparação de um medicamento para utilização num método de tratamento de uma afecção ocular caracterizada por um aumento da expressão e/ou actividade de TRPVl, em que o dito medicamento é administrado por via tópica na superfície da córnea.

21. Um siNA de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 18 para utilização no tratamento de uma afecção ocular caracterizado por um aumento da expressão e/ou actividade de TRPVl, em que o dito siNA é administrado por via tópica na superfície da córnea.

22. Uma composição farmacêutica que compreende um composto de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 18.