PT1868738E

PT1868738E - Revestimentos funcionalizados com tiol e método para produção dos mesmos

Info

Publication number: PT1868738E
Application number: PT06726473T
Authority: PT
Inventors: Jas Pal Singh Badyal; Wayne Christopher Edward Schofield
Original assignee: Surface Innovations Ltd
Priority date: 2005-04-15
Filing date: 2006-03-24
Publication date: 2011-01-17
Also published as: EP1868738A1; EP2343134A1; DE602006019073D1; ES2358343T3; GB0507612D0; US8470407B2; GB2437478A; WO2006109014A1; GB0716237D0; ATE492355T1; EP1868738B1; EP2343134B1; GB2437478B; US20090311555A1

Description

ΕΡ 1 868 738/ΡΙ DESCRIÇÃO "Revestimentos funcionalizados com tiol e método para produção dos mesmos" 0 presente invento refere-se à produção de revestimentos que contêm grupos funcionais tiol. A funcionalização superficial de objectos sólidos é um tema de importância tecnológica considerável, uma vez que proporciona um meio eficaz em termos de custo para melhorar o desempenho do substrato sem afectar as propriedades globais da massa. Por exemplo, a ligação de biomoléculas tais como ADN ou proteínas é de grande interesse técnico, permitindo a construção de arranjos biológicos que estão a ter aplicação em áreas de estudo tão diversas quanto computação (Aldeman, M. Science 1994, 266, 1021; Frutos, A. G. et âl., Nuc. Acids Res. 1997, 25, 4748), pesquisa de fármacos (Debouck, C. et al., Nature Genet. 1999, 1 (suppl.) 48), investigação do cancro (Van't Veer, L. J. et al. Nature 2002, 415, 530) e na elucidação do genoma humano (McGlennen, R. C. Clinicai Chemistry 2001, 47, 393).

Adicionalmente, uma superfície de tiol proporciona um substrato versátil quimicamente que permite a modificação da superfície pela aplicação de químicas baseadas em solução amplamente utilizadas incluindo, mas não limitadas a, a reacção de Mannich, a formação de pontes de dissulfureto, adição nucleófila, reacção com aldeídos, reacção com halogenetos de alquilo, reacção com cetonas, reacção com metais nobres e preciosos (tais como ouro e prata), a formação de sulfuretos e a oxidação ou redução da funcionalidade de tiol. Métodos existentes de ligar tióis a superfícies sólidas incluem auto-montagem de mercapto-silano (Levicky, R. et al., WO 2004113872, auto-montagem de tiol sobre ouro utilizando grupos tiol em ambas as extremidades da molécula de ligador (Tivansky, A. V. et al., J. Phys. Chem. B. 2005, 109, 5398), e a imobilização de ligadores contendo tiol a outras superfícies funcionalizadas (Steichen, M. et al., Electrochemistry Communications 2005, 7, 416; Lucarelli et al., Biosensors and Bioelectronics 2005, 20, 2001). Todas estas abordagens enfermam de inconvenientes incluindo o 2 ΕΡ 1 868 738/ΡΤ envolvimento de múltiplos passos de processo, especificidade de substrato, e o requisito de química em fase de solução.

Outro método de formação de uma funcionalidade de tiol numa superfície compreende o tratamento de uma superfície de polímero, tal como polietileno, com um plasma de gás contendo enxofre, tal como sulfureto de hidrogénio. Contudo, estas abordagens conduzem à geração de uma vasta gama de grupos funcionais na superfície tais como sulfuretos e epissulfuretos (Muguruma, H. et ai., Chemistry Letters 1996, 4, 283) . A funcionalização de superfícies por polimerização por plasma de onda contínua é uma via adicional pela qual tióis têm sido ligados a superfícies sólidas. Esta abordagem enferma do inconveniente de uma fraca retenção estrutural, com superfícies exibindo sulfonação acrescida e/ou uma perda de funcionalidade de tiol em comparação com os seus precursores monoméricos (Roh, J. H. et al., Journal of Adhesion Science and Technology, 2002, 16, 1529; Thyen, R. et al. Pedido Internacional PCT WO 2001076773.

Os polímeros de plasma são por isso frequentemente considerados como estruturalmente diferentes em comparação com polímeros convencionais, dado que possuem níveis elevados de reticulação e carecem de uma unidade de repetição regular (Yasuda, H. Plasma Polymerisation Academic Press: New York, 1985). Isto pode ser atribuído ao ambiente de plasma que gera toda uma gama de intermediários reactivos que contribuem para uma ausência global de selectividade química. Contudo, constatou-se que pulsar a descarga eléctrica na escala de tempo dos ms-ps pode melhorar significativamente a retenção estrutural das espécies monoméricas de origem (Panchalingam, V. et al., Appl. Polym. Sei. 1994, 54, 123; Han, L. M. et al., Chem. Mater., 1998, 10, 1422; Timmons et al., Patente dos E.U.A. n.° US 5 876 753) e em alguns casos têm sido sintetizados polímeros lineares convencionais (Han, L. M. et al., J. Polym. Sei., Part A: Polym. Chem. 1998, 36, 3121) . Sob tais condições, considera-se que descargas de plasma curtas repetitivas controlam o número e o tempo de vida de espécies activas criadas durante o período de descarga, ao qual depois se seguem percursos reaccionais convencionais (e.g. polimerização) que ocorrem durante o período desligado (Ryan, Μ. E. et al., Chem. Mater., 1996, 8, 37). 3 ΕΡ 1 868 738/ΡΤ A preparação de superfícies funcionalizadas com tiol por polimerização por plasma de onda contínua foi anteriormente noticiada utilizando etanotiol (Maguruma, H. et al. Chemistry Letters 1996, 4, 283). No entanto, a retenção da estrutura de monómero foi fraca e as superfícies revestidas exibiram níveis baixos de funcionalidade de tiol utilizável. 0 nível inadequado observado de desempenho da amostra era grandemente devido à estrutura do monómero utilizado. 0 etanotiol carece de um grupo funcional, tal como uma funcionalidade acrilato ou alceno, que possa ser facilmente polimerizado por percursos reaccionais convencionais durante o período desligado do plasma pulsado. Assim, de modo a que a deposição destes monómeros ocorra, têm de ser aplicadas condições de plasma relativamente severas, suficientes para iniciar a polimerização através de grupos funcionais normalmente não polimerizáveis (e.g. porções alquilo). Condições claramente capazes de romperem e tornarem a ligar estas estruturas insaturadas umas às outras são igualmente capazes de destruir a funcionalidade de tiol desejada. Isto conduz inevitavelmente ao fraco grau de retenção de monómero observado em experiências anteriores. Para conseguir a deposição bem sucedida de uma superfície contendo tiol, tem de ser utilizada uma metodologia combinando não só técnicas de plasma pulsado mas também a selecção de uma estrutura de monómero polimerizável adequado.

Os requerentes constataram que a polimerização por plasma pulsado de monómeros contendo funcionalidades de tiol de fórmula geral (I) ou fórmula geral (Ia) pode potencialmente ultrapassar as limitações de técnicas existentes para formação de superfícies funcionalizadas com tiol. Compostos de fórmula (I) ou fórmula (Ia) possuem grupos funcionais insaturados (tais como alceno, acrilato, metacrilato e fenilo) que podem sofrer percursos de polimerização convencionais durante o período desligado do plasma pulsado com impacto negligenciável na porção tiol desejada. Em comparação com a especialidade anterior, as películas resultantes exibem uma retenção quase total de funcionalidade de monómero e constatou-se que são capazes dos níveis de desempenho exigentes requeridos por aplicações tais como a produção de microarranjos de ADN. 4 ΕΡ 1 868 738/ΡΤ

De acordo com presente invento, é proporcionado um método para aplicar um revestimento contendo tiol reactivo a um substrato, o referido método incluindo submeter o referido substrato a uma descarga de plasma na presença de um composto de fórmula (I) ou de fórmula (Ia): 4 ΕΡ 1 868 738/ΡΤ

R3 (I)

(la) onde X é uma ou mais cadeias alquileno lineares ou ramificadas opcionalmente substituídas ou um ou mais grupos arilo; R1, R2 ou R3 são opcionalmente hidrogénio, grupos hidrocarbilo ou heterocíclicos substituídos e m é um inteiro superior a 0; Rn é um número de grupos hidrocarbilo ou heterocíclicos opcionalmente substituídos, onde n é 0-5, e caracterizado por após o revestimento contendo tiol ser aplicado ao substrato, o referido método incluir o passo de derivatização dos grupos tiol com um reagente, seguida por eliminação do reagente do revestimento sob condições tais que a derivatização da superfície contendo tiol é reversível para criar uma superfície regravável.

Como aqui utilizado, o termo "hidrocarbilo" inclui grupos alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo e aralquilo. O termo "arilo" refere-se a grupos cíclicos aromáticos tais como fenilo ou naftilo, em particular fenilo. O termo "alquilo" refere-se a cadeias lineares ou ramificadas de átomos de carbono, adequadamente de 1 a 20 átomos de carbono de comprimento. Os termos "alcenilo" e "alcinilo" referem-se a cadeias insaturadas lineares ou ramificadas possuindo adequadamente de 2 a 20 átomos de carbono. Estes grupos podem ter uma ou mais ligações múltiplas. Assim, exemplos de grupos alcenilo incluem alenilo e dienilo.

Substituintes opcionais adequados para grupos hidrocarbilo R1, R2, R3 e grupos X alquileno/arilo são grupos 5 ΕΡ 1 868 738/ΡΤ que são substancialmente inertes durante o processo do invento. Podem incluir grupos halo tais como fluoro, cloro, bromo e/ou iodo. Substituintes halo particularmente preferidos são fluoro.

Numa concretização preferida do invento, X é uma porção compreendendo um grupo éster adjacente a um grupo hidrocarbilo ou heterociclico opcionalmente substituído, R4. Assim, numa concretização particular, o composto de fórmula (I) é um composto de fórmula (II):

Em particular, R1, R2, R3 e R4 são seleccionados independentemente entre hidrogénio ou alquilo, e em particular, entre hidrogénio ou Ci-6 alquilo, tal como metilo. Assim, numa concretização particularmente preferida, o composto de fórmula (II) é um composto de fórmula (III) : a funcionalidade de tiol desejada está ligada a um grupo acrilato facilmente polimerizado (CH2=CH-C02-) através de um ligador de cadeia de hidrocarboneto alquilo saturado, R4, onde n é um inteiro de 1 a 20: ]m

Η O (III)

Um exemplo particular de um composto de fórmula (III), onde m=l e n=l, é acrilato de 2-mercaptoetilo.

Noutra concretização particularmente preferida, o composto de fórmula (II) é um composto de fórmula (Illa): a funcionalidade de tiol desejada está ligada a um grupo metacrilato facilmente polimerizado (CH2=C (CH3)-C02-) através de um ligador de cadeia de hidrocarboneto alquilo saturado, R4, onde n é um inteiro de 1 a 20: 6 ΕΡ 1 868 738/ΡΤ Me Η

m

Um exemplo particular de um composto de fórmula (Illa), onde m=l e onde n=l, é metacrilato de 2-mercaptoetilo.

Noutras concretizações particularmente preferidas do invento, por referência ao composto de fórmula (I), R1, R2 e R3 são outra vez seleccionados independentemente entre hidrogénio ou alquilo, e em particular, entre hidrogénio ou Ci-6 alquilo, tal como metilo. Assim, noutra concretização particular, o composto de fórmula (I) é um composto de fórmula (IV):

m (IV) onde X é como definido acima e m é um inteiro superior a 0.

Compostos de fórmula (IV) particularmente preferidos são vinilbenzenos de fórmula (V), onde X é um anel aromático di-substituido:

onde o anel pode estar substituído em orto, meta ou para.

Um exemplo particular de um composto de fórmula (V) é 4-mercaptoestireno.

Noutro exemplo particularmente preferido do composto de fórmula (IV), X é uma cadeia de hidrocarboneto alquilo saturado. Assim, o composto de fórmula (IV) é um composto de fórmula (V) onde n é um inteiro de 1 a 20, por exemplo de 1 a 10 e preferivelmente 8. 7 ΕΡ 1 868 738/ΡΤ

Um exemplo particular de um composto de fórmula (Va), onde m=l e n=l, é alilmercaptano.

As condições exactas sob as quais a deposição por plasma pulsado do composto de fórmula (I) ocorre de um modo eficaz variarão dependendo de factores tais como a natureza do monómero, o substrato, o tamanho e arquitectura da câmara de deposição de plasma etc. e serão determinadas utilizando métodos de rotina e/ou as técnicas aqui depois ilustradas. Em geral porém, a polimerização é adequadamente efectuada utilizando vapores ou goticulas atomizadas de compostos de fórmula (I) a pressões de 0,01 a 999 mbar, adequadamente a cerca de 0,2 mbar. No entanto, são conhecidos e utilizados na especialidade plasmas à pressão atmosférica e a pressão subatmosférica para deposição de polímeros por plasma.

Uma descarga luminescente é depois iniciada por aplicação de uma voltagem de alta frequência, por exemplo a 13,56 MHz. Os campos aplicados são adequadamente de uma potência média de até 50 W.

Os campos são adequadamente aplicados durante um período suficiente para proporcionar o revestimento desejado. Em geral, este será de 30 segundos a 60 minutos, preferivelmente de 1 a 15 minutos, dependendo da natureza do composto de fórmula (I) e do substrato etc.

Adequadamente, a potência média da descarga de plasma pulsada é baixa, por exemplo inferior a 0,05 W/cm3, preferivelmente inferior a 0,025 W/cm3 e muito preferivelmente inferior a 0,0025 W/cm3. O regime de pulsagem que fornecerá tais descargas de potência média baixa variará dependendo da natureza do substrato, do tamanho e da natureza da câmara de descarga etc. Contudo, arranjos de pulsagem adequados podem em qualquer caso ser determinados por métodos de rotina. Uma 8 ΕΡ 1 868 738/ΡΤ sequência típica é uma na qual a energia está ligada durante de 1 ps a 100 ps, e desligada durante de 100 ps a 20000 ps.

Numa concretização do invento, faz-se variar o regime de pulsagem durante o decurso da deposição do revestimento de modo a permitir a produção de revestimentos gradativos. Por exemplo, pode-se utilizar um regime de pulsagem de potência média elevada no início de tratamento de uma amostra para produzir um revestimento sub-superfície insolúvel, altamente reticulado, que adere bem ao substrato. Um regime de pulsagem de potência média baixa pode depois ser adoptado para conclusão do ciclo de tratamento, produzindo uma camada superficial exibindo níveis elevados de funcionalidade de tiol do monómero retida sobre a referida sub-superfície bem aderente. Será de esperar que um tal regime melhore a durabilidade e a adesão do revestimento completo, sem sacrificar qualquer das propriedades de superfície desejadas (i.e. funcionalidade de tiol de superfície reactiva).

Plasmas adequados para utilização no método do invento incluem plasmas de não equilíbrio tais como os gerados por frequências áudio, radiofrequências (RF) ou frequências de microondas. Noutra concretização o plasma é gerado por um dispositivo de cátodo oco. Ainda noutra concretização, o

plasma pulsado é produzido por corrente contínua (DC). O plasma pode operar a pressão baixa, subatmosférica ou atmosférica, como conhecido na especialidade. O monómero pode ser introduzido no plasma como um vapor ou uma pulverização atomizada de gotículas de líquido (W003101621 e WO03097245, Surface Innovations Limited). O monómero pode ser introduzido no equipamento de deposição por plasma pulsado continuamente ou de um modo pulsado, por exemplo, através de uma válvula de gás de acção intermitente. O substrato ao qual o revestimento portador de tiol é aplicado será preferencialmente localizado substancialmente no interior do plasma pulsado durante a deposição do revestimento. Porém, o substrato pode alternativamente ser localizado fora do plasma pulsado, evitando assim danos excessivos para o substrato ou revestimento em crescimento O monómero será tipicamente excitado directamente dentro da descarga de plasma. Contudo, podem-se utilizar 9 ΕΡ 1 868 738/ΡΤ métodos de deposição por plasma "remotos" como são conhecidos na especialidade. Nos referidos métodos o monómero entra no equipamento de deposição substancialmente "a jusante" do plasma pulsado, reduzindo assim os efeitos potencialmente nocivos do bombardeamento por espécies de alta energia, de vida curta, tais como iões. 0 plasma pode compreender o composto monomérico sozinho, na ausência de outros compostos ou em mistura por exemplo com um gás inerte. Plasmas consistindo de composto monomérico sozinho podem ser conseguidos como aqui depois ilustrado, evacuando primeiro o vaso reactor tanto quanto possível, e depois purgando o vaso reactor com o composto orgânico durante um período suficiente para assegurar que o vaso está substancialmente isento de outros gases. A temperatura na câmara de plasma é adequadamente elevada o suficiente para permitir que monómero suficiente na fase gasosa entre na câmara de plasma. Esta dependerá do monómero e será convenientemente utilizada a temperatura ambiente. No entanto, podem ser requeridas em alguns casos temperaturas elevadas por exemplo de 25 a 250°C.

Em concretizações alternativas do invento, para além do precursor do revestimento de polímero de plasma, estão presentes materiais adicionais no interior do equipamento de deposição por plasma. Os materiais adicionais podem ser introduzidos no equipamento de deposição do revestimento continuamente ou de um modo pulsado, por exemplo, através de uma válvula de gás de acção intermitente.

Os referidos materiais aditivos podem ser inertes e actuar como tampões sem qualquer incorporação da sua estrutura atómica no polímero de plasma em crescimento (exemplos adequados incluem os gases nobres). Um tampão deste tipo pode ser necessário para manter uma pressão de processo requerida. Alternativamente, o tampão inerte pode ser requerido para manter a descarga de plasma. Por exemplo, a operação de plasmas de descarga luminescente à pressão atmosférica (APGD, atmospheric pressure glow discharge) requer frequentemente grandes quantidades de hélio. Este diluente de hélio mantém o plasma por meio de um mecanismo de Ionização de Penning sem ficar incorporado no revestimento depositado. 10 ΕΡ 1 868 738/ΡΤ

Noutras concretizações do invento, os materiais aditivos possuem a capacidade para modificar e/ou ser incorporados no material formador de revestimento e/ou no revestimento depositado por plasma resultante. Exemplos adequados incluem outros gases reactivos tais como halogéneos, oxigénio e amoníaco.

Em concretizações alternativas do invento, os materiais aditivos podem ser outros monómeros. Os revestimentos resultantes compreendem copolimeros como são conhecidos e descritos na especialidade. Monómeros adequados para utilização no método do invento incluem monómeros orgânicos (e.g. estireno), inorgânicos, de organo-silicio e organo-metálicos. O invento proporciona adicionalmente um substrato possuindo sobre ele um revestimento contendo tiol, obtido por um processo como acima descrito. Um tal substrato pode incluir qualquer sólido, particulado, ou substrato poroso ou artigo acabado, consistindo de quaisquer materiais (ou combinação de materiais) como são conhecidos na especialidade. Exemplos de materiais incluem, mas não limitados a, qualquer um ou uma qualquer combinação de fibras tecidas ou não tecidas, fibras naturais, fibras sintéticas, metal, vidro, cerâmico, semicondutores, materiais celulósicos, papel, madeira ou polímeros tais como politetrafluoroetileno, polieteno ou poliestireno. Numa concretização particular, a superfície compreende um material de suporte, tal como um material polimérico, utilizado em análise bioquímica.

Numa concretização do invento o substrato é revestido através de um equipamento de bobina a bobina. Este processo pode ser contínuo. Numa concretização, o substrato é transportado por e através de um equipamento de revestimento actuando de acordo com este invento. A polimerização por plasma pulsado do invento é deste modo um método sem solvente para funcionalização de superfícies sólidas com grupos tiol. O método do invento pode resultar num produto totalmente revestido com um revestimento de polímero funcionalizado com tiol. 11

ΕΡ 1 868 738/PT

Num aspecto alternativo do invento o revestimento de polímero funcionalizado com tiol é apenas aplicado a domínios de superfície seleccionados. A restrição do revestimento de polímero funcionalizado com tiol a domínios de superfície específicos pode ser conseguida limitando os meios de produção de revestimento do método aos referidos domínios de superfície específicos. Numa concretização deste aspecto do invento, a restrição espacial acima mencionada é conseguida por deposição por plasma do revestimento funcionalizado com tiol através de uma máscara ou matriz. Isto produz uma amostra exibindo regiões cobertas com polímero funcionalizado com tiol justapostas com regiões que não exibem qualquer funcionalidade de tiol.

Um meio alternativo de restringir a funcionalização com tiol a domínios de superfície específicos inclui: depositar o polímero funcionalizado com tiol sobre toda a superfície da amostra ou artigo, antes de tornar áreas seleccionadas destes não funcionalizadas com tiol. Esta remoção/danificação selectiva espacialmente do polímero funcionalizado com tiol pode ser conseguida utilizando numerosos meios como são descritos na especialidade. Métodos adequados incluem, mas não estão limitados a, gravação com feixe de electrões e exposição a radiação ultravioleta através de uma máscara. 0 padrão de material não transmissor que a máscara possui é deste modo transferido para áreas de funcionalização com tiol.

Após o revestimento funcional de tiol ter sido aplicado ao substrato, o grupo tiol pode ser adicionalmente derivatizado conforme requerido. Em particular, pode ser feito reagir com outro tiol, tal como uma cadeia de oligonucleótido terminada em tiol, para formar uma ligação de ponte de dissulfureto. A reacção de derivatização pode ser efectuada na fase gasosa, quando os reagentes o permitem, ou num solvente tal como água ou um solvente orgânico. Exemplos destes solventes incluem álcoois (tais como metanol), e tetra-hidrofurano. A derivatização pode resultar na imobilização de reagente contendo tiol na referida superfície. Se a derivatização for endereçada espacialmente, como é conhecido 12 ΕΡ 1 868 738/ΡΤ na especialidade, isto resulta na estampagem quimica da superfície. Um caso preferido de uma superfície de tiol estampada com biomoléculas contendo tiol é um microarranjo biológico. Um caso particularmente preferido é um no qual a biomolécula contendo tiol é uma cadeia de ADN, resultando num microarranjo de ADN. Outra concretização preferida é uma na qual a biomolécula contendo tiol é uma proteína ou seu fragmento, resultando num microarranjo de proteína.

Superfícies funcionalizadas com tiol produzidas de acordo com o invento foram derivatizadas com uma variedade de reagentes contendo tiol (e.g. derivatizados com cadeias de oligonucleótido, proteínas e açúcares). Adicionalmente, estas superfícies funcionalizadas com tiol produzidas de acordo com o invento permitiram a construção de microarranjos de ADN por um procedimento que se mostra em diagrama no Esquema 1.

Assim numa concretização adicional, o invento proporciona um método para a imobilização de um reagente contendo tiol numa superfície, o referido método incluindo a aplicação de um revestimento contendo tiol reactivo à referida superfície por um método de deposição por plasma acima descrito, e depois contacto da superfície de revestimento com uma solução do referido reagente contendo tiol sob condições tais que o agente contendo tiol reage com os grupos tiol na superfície.

Uma concretização adicional inclui o referido método de derivatização de um revestimento contendo tiol com um reagente contendo tiol utilizando o método acima descrito, e depois eliminação do referido reagente contendo tiol ligado sob condições tais que o reagente contendo tiol é removido reversivelmente do revestimento contendo tiol. Adicionalmente, o revestimento contendo tiol produzido neste invento poderá ser de novo derivatizado com agentes contendo tiol várias vezes, criando uma superfície regravável.

Numa concretização adicional do método, os revestimentos contendo tiol produzidos de acordo com o invento podem ser derivatizados com reagentes contendo metais nobres ou preciosos. Os referidos reagentes podem ser de natureza particulada, exemplos incluem, mas não estão limitados a soluções coloidais de nanopartículas de ouro ou prata. 13 ΕΡ 1 868 738/ΡΤ

Constatou-se que a polimerização por plasma pulsado de acordo com o invento é um meio eficaz para funcionalização de substratos sólidos com grupos tiol. As superfícies funcionalizadas resultantes são passíveis de químicas convencionais de derivatização de tiol. 0 invento será agora descrito em particular através de exemplos com referência aos desenhos apensos nos quais: A Figura 1 mostra os espectros de XPS de (a) uma bolacha de silício, (b) uma camada de polímero de plasma pulsado de alilmercaptano (Pp = 40 W; ton = 100 ps; t0ff = 4 ms; tempo de deposição = 10 min), e (c) um oligonucleótido de adn (Sonda I) depositado a partir de uma solução 200 nM sobre a superfície de polímero de plasma pulsado de alilmercaptano. A Figura 2 mostra os espectros de infravermelhos de (a) o monómero alilmercaptano, (b) a camada de polímero de plasma pulsado de alilmercaptano (Pp = 40 W; ton = 100 ps; toff = 4 ms; tempo de deposição = 10 min), e (c) um oligonucleótido de ADN (Sonda I) depositado a partir de uma solução 200 nM sobre (b). A Figura 3 é um gráfico mostrando a variação na concentração de azoto atómico (% de N) na superfície da camada de poli(alilmercaptano) de plasma pulsado após imobilização de ADN Sonda I em função da concentração da solução. A Figura 4 mostra imagens de microscopia de fluorescência de arranjos de ADN micro-localizados (micro-spotted) produzidos sobre as camadas de polímero de plasma pulsado de alilmercaptano: (a) oligonucleótido Sonda II; (b) oligonucleótido Sonda II subsequentemente hibridizado com oligonucleótido Sonda III; e (c) oligonucleótido Sonda I e IV em padrão alternante e subsequentemente hibridizados com oligonucleótido Sonda III. A Figura 5 demonstra a intensidade de fluorescência na superfície de camadas de polímero de plasma pulsado de alilmercaptano: (a) após eliminação e re-imobilização de oligonucleótido de ADN Sonda II; e (b) após a remoção de 14 ΕΡ 1 868 738/ΡΤ oligonucleótido de ADN Sonda III hibridizado do oligonucleótido de ADN Sonda I ligado à superfície e subsequente reexposição a uma solução de Sonda III, onde o revestimento por plasma é poli(alilmercaptano) e a lâmina comercial revestida a tiol foi fornecida por CEL Associates, Inc. (Pearland, Texas). A Figura 6 mostra Sonda II de ADNcs (cadeia simples) marcado com Cy5 imobilizado sobre pérolas de poliestireno tratadas funcionalizadas com alilmercaptano. Examinadas por (a) microscopia de visível, e (b) microscopia de fluorescência. 0 Esquema 1 mostra um método do invento para permitir a hibridização de ADN sobre superfícies: (a) Funcionalização da superfície com tiol por polimerização de alilmercaptano por plasma pulsado, (b) Imobilização ADNcs terminado em tiol sobre a superfície de polímero de plasma pulsado por química de formação de pontes de dissulfureto, e (c) Hibridização de ADNcs marcado com Cy5 complementar com o ADNcs imobilizado na superfície.

Os exemplos seguintes pretendem ilustrar o presente invento mas não pretendem limitar o mesmo:

Exemplo 1 A polimerização por plasma de alilmercaptano (Aldrich, 80%, H2C=CH(CH2) SH, purificado por vários ciclos de freeze-pump-thaw) foi realizada num reactor de vidro cilíndrico sem eléctrodos (diâmetro 5 cm, volume 520 cm3, pressão de base 3 x 1CT2 mbar, taxa de vazamento = 1 χ 1CT9 mol s-1) fechado numa gaiola de Faraday. A câmara estava provida de uma entrada de gás, um medidor de pressão de termopar e uma bomba rotativa de duplo efeito a 30 L min-1 ligada a uma ratoeira de frio de azoto líquido. Todas as junções estavam isentas de gordura. Um enrolamento de cobre de 4 mm enrolado externamente estendeu-se 8 - 15 cm desde a entrada de gás com 9 voltas. A impedância de saída de uma fonte de energia de RF de 13,56 MHz foi adaptada à carga de gás parcialmente ionizado com uma rede de adaptação L-C. No caso da deposição por plasma pulsado, a fonte de RF foi accionada a partir de um 15 ΕΡ 1 868 738/ΡΤ gerador de sinal externo, e a forma do impulso monitorizada com um osciloscópio de raios catódicos. 0 reactor foi limpo esfregando com detergente, enxaguamento com água, propan-2-ol e secagem numa estufa. 0 reactor foi adicionalmente limpo com um plasma de ar a 0,2 mbar operando a 40 W durante um periodo de 30 min. Cada substrato foi limpo por ultra-sons numa mistura 50:50 de ciclo-hexano e propan-2-ol durante 10 min e depois colocado no centro do reactor sobre uma placa de vidro plana. A análise de XPS das camadas de poli(alilmercaptano) de plasma confirmaram a presença apenas de carbono e enxofre na superfície, sem qualquer sinal visível de Si(2p) a partir do substrato de silício subjacente, Figura 1 e Tabela 1. O pico de S(2p) correspondente para a pelicula de polimero de plasma pulsado ocorreu para uma energia de ligação de 163,7 eV, indicando um tiol como a principal espécie de enxofre presente (Moulder, J. F.; Stickle, W. F.; Sobol, P. E.; Bomben, K. D. Handbook of X-ray Photoelectron Spectroscopy, Perkin Elmer Corporation: Eden Prairie, MN, 1992; Terasaki, N.; Akiyama, T.; Yamada, N. Langmuir 2002, 18, 8666).

Tabela 1.

Percentagem atómica por XPS para camadas de alilmercaptano depositadas por plasma pulsado Superfície Abundância elementar % de C % de N % de O % de P % de S Alilmercaptano, polimero de plasma pulsado 76 ± 1 0 0 0 24 ± 1 Alilmercaptano, teórico 75 0 0 0 25 Oligonucleótido Sonda I, sobre polímero de plasma de alilmercaptano 46 ± 1 10 ± 1 24 ± 1 4 ± 1 16 ± 1 Oligonucleótido Sonda I, teórico 49 13 32 5 <1

Utilizou-se espectroscopia de infravermelhos para avaliar a estrutura molecular das películas de poli(alilmercaptano) de plasma pulsado e os oligonucleótidos imobilizados subsequentemente, Figura 2. Para o monómero alilmercaptano, foram efectuadas as atribuições de banda seguintes: extensão C-H de alilo (3080 cm-1); extensão CH2 de alilo (3031 cm-1); extensão CH2 de alquilo (2891 cm-1); extensão S-H de tiol (2555 cm-1); extensão C=C de alilo (1634 16 ΕΡ 1 868 738/ΡΤ cm-1) (Lin-Vien, D. et al. The Handbook of Infrared and Raman Characteristic Frequencies of Organic Molecules, Academic Press: New York, 1991). Todas as bandas associadas ao monómero alilmercaptano eram claramente discerníveis após polimerização por plasma pulsado, excepto para os atributos da ligação dupla carbono-carbono de alilo que desapareceram durante a polimerização. A presença continuada da banda de infravermelho pertencente ao atributo tiol confirmou que a retenção estrutural do grupo tiol tinha ocorrido durante as condições de pulsagem eléctrica.

Exemplo 2 A imobilização de ADN a superfícies de alilmercaptano polimerizadas por plasma pulsado implicou imersão; oligonucleótido Sonda I (Tabela 2) num tampão de cloreto de sódio/citrato de sódio (NaCl 3 M, Na.Citrato 0,3 M - 2h20, pH 4,5, Aldrich) até uma concentração final entre 50 nM e 400 nM foi imobilizado sobre a película de polímero de plasma pulsado. A solução tamponada de oligonucleótido foi colocada sobre superfícies de poli(alilmercaptano) de plasma pulsado preparadas de fresco utilizando uma ponta de pipeta. As superfícies foram subsequentemente incubadas durante 16 horas à temperatura ambiente numa câmara humidificada (64% de humidade relativa) para impedir que os pontos secassem (quando os solutos secos das gotas são transportados para as suas orlas, conduzindo a uma distribuição de concentração não uniforme) e depois lavaram-se três vezes utilizando água e solução tampão. As superfícies de pontos localizados (spotted) foram depois secas com azoto gasoso para assegurar que ficavam isentas de solvente e de poeiras.

Tabela 2.

Sequências de oligonucleótidos utilizadas no estudo (sintetizadas pela Sigma-Genosys Ltd.). Oligonucleótido marcador Sequência de Bases (5' para 3') Fluoróforo Ligador Sonda I GCTTATCGAGCTTTC N/A 5'-HS-(CH2)6- Sonda II GCTTATCGAGCTTTC 3'-[CY5]- 5'-HS-(CH2) 6- Sonda III GAAAGCTCGATAAGC 5'-[CY5]- N/A Sonda IV CGAATAGCTCGAAAG N/A 51-HS-(CH2) 6- 17 ΕΡ 1 868 738/ΡΤ A análise de XPS de camadas de poli(alilmercaptano) de plasma pulsado expostas a oligonucleótido Sonda I indicaram a presença de vários elementos incluindo carbono, azoto, oxigénio, enxofre (como sulfureto ou centros de dissulfureto, Energia de Ligação: 161,4 eV) e centros fosforosos, Figura 1 e Tabela 1. Não foi detectada qualquer evidência de sódio ou cloro das soluções de tampão. Um desvio na energia de ligação do pico S(2p) foi atribuído à imobilização bem sucedida do oligonucleótido Sonda I na superfície, Esquema 1. No entanto, a formação intra-polímero e inter-polímero de pontes de dissulfureto na camada de poli(alilmercaptano) de plasma pulsado poderão também ter contribuído para este pico de dissulfureto. A elevação correspondente na intensidade do pico N(ls) a ~400 eV indicou também ligação de ADNcs à superfície de poli(alilmercaptano) de plasma pulsado. Pôde-se fazer variar a densidade de empacotamento de ADNcs na superfície diluindo a solução com tampão, Figura 3. Para a oligonucleótido Sonda I de ADNcs sob investigação, constatou-se que a concentração na superfície de azoto (% de N) estava correlacionada com o grau de diluição. Níveis de saturação na superfície corresponderam a diluições acima de 150 nM.

Exemplo 3

Foram gerados microarranjos de ADNcs sobre camadas de poli(alilmercaptano) de plasma pulsado obtidas de fresco utilizando um dispositivo de microarranjo robotizado (Genetix Inc.) equipado com pinos micro-maquinados que entregaram consistentemente amostras de ~1 nL (solução de ADNcs tamponada 200 nM) sobre lâminas de vidro revestidas a poli (alilmercaptano) de plasma pulsado (18 χ 18 χ 0,17 mm, BDH) em localizações designadas. Puderam ser obtidos por rotina pontos circulares com diâmetros variando de 100 - 125 pm e com um espaçamento de impressão mínimo de 110 pm. Após localização dos pontos, as lâminas com oligonucleótido de ADN imobilizado foram mantidas numa câmara de humidade (64% de humidade relativa) durante 24 horas a 60°C. Finalmente, as lâminas foram removidas e lavadas com solução tampão e quantidades abundantes de água. No processo de localização de pontos foram utilizadas as Sondas I, II e IV. 18 ΕΡ 1 868 738/ΡΤ

Microarranjos de ADNcs e superfícies de Sonda I e IV totalmente imobilizadas foram subsequentemente expostas a uma solução de hibridização de Sonda III em tampão de hibridização (consistindo de SSC 6x pH 7, Solução de Denhardt 5x (1% de BSA (albumina de soro de bovino), 2% de Ficoll 400, e 2% de polivinilpirrolidona (PVP)), 0,5% de dodecilsulfato de sódio (SDS), e ADN de esperma de salmão truncado (55 pg/mL) até uma concentração final de 400 nM. Duas pequenas tiras de fita adesiva foram afixadas ao longo da orla das lâminas das Sonda I e IV funcionalizadas com oligonucleótido de ADNcs e depois cobriram-se com um lamela de vidro de lâmina de microscópio limpa. A cavidade formada entre o chíp e a lamela de vidro foi depois cheia lentamente com 10 ]iL da solução de hibridização por força capilar. Esta lâmina foi depois incubada numa câmara de hibridização humidificada (100 pL de água foram colocados na proximidade do chíp) imersa num banho de água a 55°C durante 2 horas. Depois, removeu-se a lamela de vidro, lavou-se o chíp três vezes com solução tampão e depois com quantidades abundantes de água e soprou-se até á secura com azoto gasoso.

Investigou-se a eliminação dos oligonucleótidos ligados do chíp colocando este numa solução ebuliente de (a) TrisCl 200 nM pH 7,0, SSC 0,lx e 0,1% (p/v) de SDS durante 10 min ou (b) 0,1% (p/v) de SDS durante 10 min de modo a remover os oligonucleótidos marcados.

Utilizou-se microscopia de fluorescência para avaliar a viabilidade de produzir microarranjos utilizando camadas de polímero de plasma pulsado de alilmercaptano como substrato. O mapeamento por fluorescência dos arranjos resultantes foi efectuado com um microscópio Dilor Labram utilizando um laser de He-Ne de 20 mW com um comprimento de onda de 632,817 nm (corresponde à frequência de excitação do fluoróforo Cy5) e uma polarização de 500:1, que se fez passar através de uma rede de difracção de 1800 linhas mm-1. No caso da imobilização de oligonucleótido Sonda II, foi obtida uma imagem fluorescente de um arranjo de pontos com um diâmetro médio de 125 mícron e um espaçamento de impressão de 150 mícron de acordo com os parâmetros de localização de pontos utilizados, Figura 4a. No caso dos arranjos hibridizados, obteve-se um padrão similar sobre a superfície, porém, o tamanho do ponto tinha aumentado para um diâmetro de 150 mícron e os pontos tinham uma densidade de sinal no limite exterior não homogénea, Figura 5b. 19 ΕΡ 1 868 738/ΡΤ Não foi detectado qualquer sinal mensurável de hibridização não especifica a partir do oligonucleótido de controlo não complementar (Sonda IV), Figura 4c. Foi também observado que menos de 5% dos oligonucleótidos de ponte de dissulfureto se desprenderam do suporte sólido quando tratados com sais de hibridização utilizados neste exemplo, durante 48 horas à temperatura ambiente.

Exemplo 4 investigou-se a reusabilidade comparativa de chips de alilmercaptano preparados no Exemplo 2 e chips de vidro revestidos a tiol comerciais (CEL Associates, Pearland, Texas), por eliminação dos oligonucleótidos ligados dos chips por colocação numa solução ebuliente de (a) TrisCl 200 nM pH 7,0, SSC 0,lx e 0,1% (p/v) de SDS durante 10 min ou (b) 0,1% (p/v) de SDS durante 10 min.

Investigaram-se ambos os tipos de chip por eliminação; utilizando lavagens de alta estringência e baixa estringência para remover da superfície oligonucleótidos imobilizados e hibridizados, respectivamente. Após primeira situação, da remoção dos oligonucleótidos imobilizados seguida por outro conjunto de procedimentos de imobilização, a intensidade de fluorescência caiu apenas 5% em relação à primeira experiência quando se utilizaram como substrato camadas de plasma pulsado de polímero de alilmercaptano, Figura 5a. De facto, o chip pôde ser utilizado 5 vezes sem perda significativa de sondas imobilizadas. O mesmo não sucedeu com as lâminas comerciais que exibiram uma diminuição de desempenho comparativamente rápida. Observou-se um resultado similar para a reusabilidade dos chips no que se refere a experiências de desnaturação / re-hibridização, Figura 5b.

Exemplo 5

Depositou-se alilmercaptano sobre pérolas de poliestireno (Biosearch Technologies, Inc.) como descrito acima. Estas pérolas funcionalizadas com tiol foram depois derivatizadas com cadeias de ADN marcadas de modo fluorescente como descrito acima. A derivatização foi confirmada por microscopia de fluorescência, Figura 6.

Lisboa, 2011-01-10

Claims

ΕΡ 1 868 738/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Método para aplicação de um revestimento contendo tiol reactivo a um substrato, o referido método incluindo submeter o referido substrato a uma descarga de plasma na presença de um composto de fórmula (I) ou de fórmula (Ia): R1

R3 (I)

(la) onde x é uma ou mais cadeias alquileno lineares ou ramificadas opcionalmente substituídas ou um ou mais grupos arilo; R1, R1 ou R2 são opcionalmente hidrogénio, grupos hidrocarbilo ou heterocíclicos substituídos, e m é um inteiro superior a 0; Rn é um número de grupos hidrocarbilo ou heterocíclicos opcionalmente substituídos, onde n é 0-5, e caracterizado por após o revestimento contendo tiol ser aplicado ao substrato, o referido método incluir o passo de derivatização dos grupos tiol com um reagente, seguida por eliminação do reagente do revestimento sob condições tais que a derivatização da superfície contendo tiol é reversível para criar uma superfície regravável. R1

R3 O (II) onde R é um grupo hidrocarbilo ou heterocíclico opcionalmente substituído. 1 Método de acordo com a reivindicação 1 onde o 2 composto contendo tiol reactivo de fórmula (I) é um composto de fórmula (II) ΕΡ 1 868 738/ΡΤ 2/5
3. Método de acordo com a reivindicação 2 onde o composto de fórmula (II) é um composto de fórmula (III)

onde n=l-20.
4. Método de acordo com a reivindicação 2 onde o composto de fórmula (II) é um composto de fórmula (Illa) H

m Η O (ma) onde n=l-20.
5. Método de acordo com a reivindicação 1 onde o composto contendo tiol de fórmula (I) é um composto de fórmula (IV) Im (IV)
6. Método de acordo com a reivindicação 5 onde o composto de fórmula (IV) é um composto de fórmula (V) ΕΡ 1 868 738/ΡΤ 3/5
7. Método de acordo com a reivindicação 5 onde o composto de fórmula (IV) é um composto de fórmula (Va) H

H (Va) onde n=l-20.
8. Método de acordo com a reivindicação 1 onde a descarga de plasma é pulsada.
9. Método de acordo com a reivindicação 8 onde a potência média da descarga de plasma pulsada é inferior a 0,05 W/cm3.
10. Método de acordo com a reivindicação 8 onde a descarga de plasma pulsada é aplicada tal que a energia está ligada durante de 1 ps a 100 ps, e desligada durante de 100 ps a 20000 ps.
11. Método de acordo com a reivindicação 8 onde a descarga de plasma pulsada é aplicada tal que o regime de pulsagem se altera de um modo controlado ao longo do decurso de uma deposição de revestimento simples.
12. Método de acordo com a reivindicação 1 onde a descarga de plasma contém o composto de fórmula (I) na ausência de qualquer outro material.
13. Método de acordo com a reivindicação 1 onde materiais adicionais para além do composto de fórmula (I) são adicionados à descarga de plasma.
14. Método de acordo com a reivindicação 13 onde os referidos materiais adicionais são inertes e não são incorporados no revestimento de produto contendo tiol reactivo.
15. Método de acordo com a reivindicação 13 onde os referidos materiais adicionais são não inertes e possuem a capacidade para modificar e/ou ser incorporados no revestimento de produto contendo tiol reactivo. ΕΡ 1 868 738/ΡΤ 4/5
16. Método de acordo com a reivindicação 15 onde a utilização dos referidos materiais adicionais não inertes resulta num revestimento de copolimero que contém funcionalidade de tiol reactivo.
17. Método de acordo com a reivindicação 1 onde a introdução do composto de fórmula (I) e/ou de quaisquer materiais adicionais na descarga de plasma é pulsada.
18. Método de acordo com a reivindicação 1 onde o composto de fórmula (I) e/ou quaisquer materiais adicionais são introduzidos na descarga de plasma na forma de goticulas de liquido atomizado.
19. Método de acordo com a reivindicação 1 onde o meio para aplicar o revestimento é um equipamento de deposição por plasma equipado com um sistema de bobina a bobina.
20. Método de acordo com a reivindicação 1 onde a câmara de deposição por plasma está aquecida.
21. Método de acordo com a reivindicação 1 onde o passo da derivatização ou reacção dos grupos tiol do revestimento é realizado com um reagente contendo tiol.
22. Método de acordo com a reivindicação 21 onde uma solução do referido reagente contendo tiol é posta em contacto com a superfície sob condições nas quais a funcionalidade de tiol do reagente contendo tiol reage com grupos tiol na superfície.
23. Método de acordo com a reivindicação 22 onde a imobilização da solução de tiol é endereçada espacialmente sobre a superfície contendo tiol reactivo, tal que a imobilização de tiol ocorre apenas em localizações espaciais determinadas. 24. método de acordo com as reivindicações 21 ou 22 no qual o tiol é uma biomolécula terminada em tiol.
25. Método de acordo com a reivindicação 24 onde a superfície modificada é utilizada para hibridização de adn. ΕΡ 1 868 738/ΡΤ 5/5
26. Método de acordo com a reivindicação 1 onde o revestimento contendo tiol produzido pelo método é feito reagir com um reagente contendo metais nobres ou preciosos tais como ouro e prata.
27. Método de acordo com a reivindicação 1 onde o revestimento de polímero funcionalizado com tiol é aplicado a domínios específicos na superfície de substrato, por exemplo num padrão.
28. Método de acordo com a reivindicação 1 onde o substrato é qualquer um ou uma qualquer combinação de metal, vidro, semicondutor, cerâmico, polímero, fibras tecidas ou não tecidas, fibras naturais, material ou pó celulósico.
29. Método de acordo com a reivindicação 1 onde R1, R2 e/ou R3 incluem substituintes fluoro, cloro, bromo e/ou iodo.
30. Método de acordo com a reivindicação 3 onde 0 composto de fórmula III, onde m=l e n=l, é acrilato de 2- mercaptoetilo. 31. Método de acordo com a reivindicação 4 onde 0 composto de fórmula Illa, onde m=l e n=l, é metacrilato de 2-mercaptoetilo. 32. Método de acordo com a reivindicação 6 onde 0 composto de fórmula V é 4-mercaptoestireno. 33. Método de acordo com a reivindicação 7 onde 0 composto de fórmula va, onde m=l e n=l, é alilmercaptano. 34. Método de acordo com a reivindicação 9 onde a potência média da descarga de ; plasma pulsada é inferior 3. 0, 0025 W/cm3. 35. Substrato possuindo sobre ele um revestimento contendo tiol, obtido por um processo de acordo com a reivindicação 1. Lisboa, 2011-01-10 EP 1 868 738/PT 1/7 FIGURA 1 INTENSIDADE/CONTAGENS

ENERGIA DE LIGAÇÃO/eV ΕΡ 1 868 738/ΡΙ 2/7 FIGURA 2

NÚMERO DE ONDA/cm -1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1 I i Τ' 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 ΕΡ 1 868 738/ΡΤ 3/7 FIGURA 3

Ο 100 200 300 400 Concentração da solução de ADN Sonda I (nM) ΕΡ 1 868 738/ΡΤ 4/7 FIGURA 4

ΕΡ 1 868 738/ΡΤ 5/7 FIGURA 5 Η Π) π Έ ο υ

Ν.° de impressões de imobilização de Sonda II na superfície (b)

1 2 3 4 N.° de impressões de hibridização ΕΡ 1 868 738/ΡΤ 6/7 FIGURA 6 Υ (μιη) Comprimento Υ (μπι)

am inti Comprimento X (μιη) 400 SOO ΕΡ 1 868 738/ΡΤ 7/7 ESQUEMA 1 Ρ