PT1805510E - Estratégia terapêutica para o tratamento de doenças autoimunes e doenças degenerativas - Google Patents

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PT1805510E
PT1805510E PT05777835T PT05777835T PT1805510E PT 1805510 E PT1805510 E PT 1805510E PT 05777835 T PT05777835 T PT 05777835T PT 05777835 T PT05777835 T PT 05777835T PT 1805510 E PT1805510 E PT 1805510E
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Maria Luisa Ashdown
Martin Leonard Ashdown
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Immunaid Pty Ltd
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Description

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DESCRIÇÃO "ESTRATÉGIA TERAPÊUTICA PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS AUTOIMUNES E DOENÇAS DEGENERATIVAS"
CAMPO DA INVENÇÃO Várias doenças têm sido ligadas à produção de células efetoras. É apresentada na presente invenção a descoberta que a quantidade de células efetoras é ciclica nestas doenças. Adicionalmente, é apresentada na presente invenção o uso de um agente no fabrico de um fármaco para o tratamento de doenças, como as doenças autoimunes, doenças degenerativas e doença de rejeição de transplantes (do transplante contra o hospedeiro). São igualmente apresentados na presente invenção, métodos para a determinação do momento em que é necessária a administração da terapêutica. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Doenças autoimunes Várias doenças autoimunes surgem quando as células de tecidos específicos se tornam alvos dos linfócitos T (para uma revisão ver Santamaria, 2001). Em vários exemplos, os linfócitos T causam danos diretos nos tecidos através de processos de citotoxicidade mediados por células que envolvem Fas, perforina, ou ambas. A lise mediada por perforina necessita de uma interação reconhecida entre o recetor específico de antigénio de uma célula T e o seu antigénio específico (normalmente um péptido), em que estes são apresentados numa molécula de MHC na membrana plasmática da célula alvo. A citotoxicidade mediada por Fas envolve a ligação de Fas na célula alvo, através do ligando Fas (FasL) das células T, mas não necessita de uma interação reconhecida entre o linfócito efetor e o seu 2 alvo; e por isso, tem o potencial para causar danos colaterais. Noutros casos, os linfócitos T matam os seus alvos através da secreção de citoquinas que se podem ligar aos recetores proapoptóticos na célula alvo. Noutros casos, os linfócitos autorreativos matam os seus alvos indiretamente, pelo aumento da sua suscetibilidade a mecanismos de apoptose não mediados por linfócitos, pela promoção do recrutamento de células inflamatórias adicionais para o tecido alvo (i.e. macrófagos citotóxicos), ou pela condução da diferenciação de células autorreativas B em células plasmáticas, que segregam auto-anticorpos .
Muito do que é atualmente conhecido acerca das vias efetoras da autoimunidade foi aprendido a partir de modelos espontâneos e experimentais de doenças autoimunes. A diabetes mellitus do tipo 1 (T1D), em ratinhos diabéticos não obesos (NOD), é um modelo prototípico de autoimunidade espontânea, específica de orgãos. Os ratinhos NOD desenvolvem espontaneamente uma forma autoimune de diabetes, muito semelhante a T1D humana, que resulta na destruição das células β pancreáticas por linfócitos T.
Os estudos em ratinhos NOD, deficientes em células T CD8+ indicam que a lesão inicial nas células β em T1D é realizada por células T CD8+ citotóxicas. Vários modelos transgénicos de T1D demonstraram que as células T CD8 + podem matar facilmente as células β expressando neoantigénios transgénicos. Wong et al. (1999) demonstraram que existe uma subpopulação de células T CD8+ que reconhece um péptido derivado da insulina, nas ilhas dos ratinhos NOD jovens. Adicionalmente, estudos de imunopatologia de pâncreas de indivíduos diabéticos humanos e em recetores de transplantes de pâncreas geneticamente idênticos, sugeriram 3 que a destruição de células β na T1D humana possa ser também causada, pelo menos em parte, por células T CD8+ efetoras (Bottazzo et al., 1985).
As células T CD8+ efetoras estão também envolvidas nas doenças autoimunes espontâneas da tiróide. A tiroidite de Hashimoto, por exemplo, resulta da destruição das células foliculares da tiróide por células T CD8+ (Bretz et al., 1999) . Foi também reportado que o início da tiroidite induzida por iodo em ratinhos NOD e NOD-H2h4 necessita da contribuição de células T CD8+ (Verma et al., 2000) . Como no caso de T1D, o desenvolvimento de doenças autoimunes da tiróide, as células T CD4+ também estão envolvidas. A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um protótipo experimental de uma doença autoimune, que modela a esclerose múltipla humana e que se desenvolve em estirpes de roedores, após a imunização com a proteína básica da mielina, antigénio proteolítico ou proteína mielínica de oligodendrócitos (MOG). Os fatos sugerem que as células T CD8+ desempenham um papel na progressão da doença e na sua gravidade (revisto em Goverman, 1999). A proteína mielínica básica é processada pela via do MHC de classe I, e o péptido derivado de MOG ativa as células T CD8+ encefalotigénicas in vivo. Existem também evidências para um envolvimento da expansão clonal de células T CD8+ em lesões ativas de esclerose múltipla (Babbe et al., 2000).
Em muitas doenças autoimunes, os linfócitos T funcionam como os efetores indiretos da autoimunidade, ao conduzirem à diferenciação de linfócitos B em células plasmáticas que segregam autoanticorpos, ou por libertarem para o meio autoanticorpos das células alvo. Estas doenças incluem, entre outras, a anemia hemolítica autoimune, purpura 4 trombociopénica autoimune, a doença de Graves, o sindrome de Goodpasture, miasténia grave, pemphigus vulgaris e lúpus.
Doença de rejeição de transplante (transplante contra o hospedeiro) A doença de rejeição de transplantes (transplante contra o hospedeiro) é um processo multietápico. Foi já demonstrado que as células T efetores desempenham um papel fulcral na indução da doença. Durante a "fase de indução" as células T efetoras detetam disparidades aloantigénicas, ativando-se em seguida e expandindo-se clonalmente (a "fase de expansão"). Em seguida estas células T libertam citoquinas e possivelmente quimoquinas (por exemplo a proteina inflamatória de macrófagos la), resultando no recrutamento de outros tipos de células (macrófagos, granulócitos, células natural killer, etc.) na "fase de recrutamento". Finalmente, as células T e os outros tipos de células medeiam a patologia associada à doença de rejeição de transplante (a "fase efetora") (do transplante contra o hospedeiro) (para uma revisão ver Murphy e Blazar, 1999).
Tem havido muito ênfase no delinear dos mecanismos efetores da doença de rejeição de transplante. As células T, e outras células, medeiam primariamente as suas funções efetoras através de quer FasL, perforina-granzima-B ou TNF. 0 uso recente de ratinhos knockout, demonstrou um papel crucial, para cada uma destas vias, na fase efetora da doença de rejeição de transplante. FasL e perforina-granzima-B aparentam ser criticas para a patologia de orgãos sólidos, enquanto que o TNF parece mediar o desgaste/perda de peso associados à doença de rejeição de transplante. TNF também aparenta ser induzido, em conjunto com outras citoquinas, após o condicionamento (Hill et al., 5 1997) - demonstrando que as citoquinas produzidas, quer pelo dador quer pelo recetor, afetam a doença de rejeição de transplante. Ratinhos knockout do recetor de TNF e o uso de anticorpos anti-TNF demonstraram conferir proteção em modelos de doença de rejeição de transplante (Speiser et al., 1997) .
Doenças degenerativas
Apesar de doenças degenerativas, como a doença de
Alzheimer, não serem classicamente consideradas como sendo mediadas por inflamação ou pelo sistema imunitário, em alguns casos, o sistema imunitário pode desempenhar um papel importante no processo degenerativo. Adicionamente, tornou-se claro que o próprio sistema imunitário pode ter efeitos benéficos em doenças consideradas degenerativas do sistema nervoso. Foram desenvolvidas abordagens imunoterapêuticas, desenhadas para induzir a resposta imunitária humoral, para o tratamento da doença de
Alzheimer. Em modelos animais, também foi mostrado que a imunoterapia desenhada para induzir a resposta imunitária celular, pode ser benéfica em lesões do sistema nervoso central, apesar de as células T poderem ter tanto um efeito benéfico como prejudicial dependendo no tipo de resposta induzida nas células T (Monsonego and Weiner, 2003) . Células T regulatórias
Vários estudos forneceram provas sólidas da existência de uma população, de ocorrência natural, de células T regulatórias/supressoras, a qual, após uma estimulação in vitro mediada por Tor, suprime a proliferação de células T efetoras (von Herrath e Harrison, 2003). Estas células são centrais para o controlo da homeostase das células T e na modulação das respostas imunes a autoantigénios, células cancerígenas, patogénios e aloantigénios. 6
As células T regulatórias constituem uma percentagem de 10% das células T CD4+ na periferia de ratinhos jovens não suscetiveis a doenças autoimunes. Esta proporção aparenta ser reduzida em ratinhos geneticamente suscetiveis a doenças autoimunes como a diabetes (Salomon et al., 2000). Foi demonstrado que a transferência de células T regulatórias evita um leque variado de doenças autoimunes experimentais, incluindo diabetes, encefalomielite autoimune experimental, e colite (Salomon et al., 2000; Wu et al., 2002; Rohm et al., 2002; Read et al., 2000). Adicionalmente, foi demonstrado que a depleção de células T regulatórias exacerba várias doenças experimentais autoimunes, incluindo artrite induzida por colagénio (Morgan et al., 2003)). Em humanos, foi identificada uma população análoga de células T regulatórias CD4+ CD25+, no sangue periférico e no timo (Jonuliet et al., 2001; Annunziato et al., 2002). O potencial das células T regulatórias regularem ativamente doenças autoimunes e a doença de rejeição de transplante, induzindo tolerância a longo prazo, tem uma grande aplicação potencial, como estratégia para a indução de tolerância a longo-prazo. O aproveitamento das células T regulatórias tem sido dificultado por uma incapacidade de expansão e caracterização desta subpopulação mais pequena de células T, uma população de células ainda mais reduzida em animais e doentes suscetiveis a doenças autoimunes. Por exemplo, estudos recentes sugeriram, que pode ser impossível a reversão da diabetes de origem autoimune, após o seu inicio, por as células T autorreativas, se tornarem resistentes à supressão durante a fase ativa da doença. Esforços anteriores para a expansão de células T regulatórias ex vivo não têm sido bem sucedidos na geração 7 de uma expansão clinicamente suficiente, nem na demonstração de eficácia in vivo (Fu et al., 2004) . O número reduzido de células T regulatórias CD4+ CD25+, o seu fenótipo anérgico e a diversidade da especificidade dos antigénios, apresentam os maiores desafios para o recrutamento desta população tolerogénica potente, para o tratamento de doenças autoimunes e a rejeição de transplantes. A WO 2005/070090 fornece métodos para a produção de uma composição enriquecida em células T regulatórias para um autoantigénio especifico predeterminado, e as resultantes composições e métodos de uso. Num dos exmeplos, a WO 2005/070090 fornece um método de modulação de uma reação autoimune num indivíduo por (a) se obter uma população de células compatíveis com o indivíduo/ (b) se produzir uma composição enriquecida em células T regulatórias específicas para autoantigénios, de preferência para autoantigénios predeterminados; e (c) se introduzir a referida composição, no referido sujeito, de forma a se modular a reação autoimune no referido indivíduo.
Marcadores inflamatórios de fase aguda
Medições de certas concentrações de proteínas no plasma na fase aguda podem ter valor de diagnóstico ou prognóstico, de acordo com as situações clínicas específicas. A proteína da fase aguda, melhor conhecida, é a proteína reativa C (CRP) . CRP é uma proteína do plasma, que aumenta no sangue com a inflamação causada por certas doenças. O nível de CRP no plasma do sangue pode aumentar até ao máximo de 1000 vezes com a inflamação. Doenças que normalmente conduzem a mudanças evidentes em CRP incluem infeções bacterianas e virais, trauma, cirurgia, queimaduras, doenças inflamatórias, doença coronária e vascular e cancro avançado. A maioria das proteínas da fase aguda são sintetizadas por hepatócitos, algumas são produzidas por outros tipos de células, incluindo monócitos, células endoteliais, fibroblastos e adipócitos. As proteínas da fase aguda incluem amiloide A do soro (SAA) , CRP e componente da amiloide P de soro (SAP). A resposta imediata de CRP e SAA a estímulos, em conjunto com o seu intervalo alargado de concentrações e facilidade de medição automática, deram lugar à utilização dos niveis de CRP e SAA no plasma para a monitorização com precisão da severidade da inflamação e a eficácia da gestão da doença durante determinadas condições de doença. 0 J. Immunol., 2002, 169:4982-4989 refere que o imunossupressor 15-deoxispergualina funciona através da inibição da expansão das células T CD4+. A Arch. Neurol., 1997, 54:485-8 apresenta uma melhoria da demência no seguimento de uma terapia citotóxica.
Estudos anteriores não têm em conta que o sistema imunitário, incluindo as populações de células efetoras, são ciclicas (oscilando em números) de uma forma repetitiva e diferencial nas doenças autoimunes e durante a rejeição de transplante. Adicionalmente, estudos anteriores não têm em conta que a resposta imunitária, incluindo populações de células regulatórias, são ciclicas em estados de doenças degenerativas. É apresentada na presente invenção a descoberta destes ciclos, e por isso, o uso de um agente no fabrico de um medicamento para o tratamento destas doenças. 9
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Os atuais inventores descobriram surpreendentemente que, o número de células efetoras bem como o de células regulatórias, é ciclico durante os estados de doença que se caracterizem pela presença de células efetoras. Este ciclo ocorre numa base regular, com expansão das células efetoras contra um antigénio alvo, sendo seguido pela expansão de células regulatórias dirigidas contra as células efetoras. Com o controlo das células efetoras pelas células regulatórias, o número de ambos os tipos de células diminui, o que por sua vez é seguido do mesmo ciclo, devido à presença continua do antigénio. 0 conhecimento deste ciclo pode ser usado para tratar doenças nas quais é conhecido que a emergência das células efetoras é prejudicial para o doente. Os exemplos destas doenças são doenças autoimunes e rejeição de transplantes. Mais especificamente, o tratamento de um doente pode ser ajustado no tempo, de forma a evitar que ocorra a expansão das células efetoras, e/ou os números das células efetoras sejam reduzidos ou abolidos.
Por isso, num primeiro aspeto, a presente invenção fornece um método ou uso como o definido nas reivindicações em anexo.
No que diz respeito a doenças autoimunes, apesar de não se pretender ficar limitado pela teoria, a expansão das células efetoras, contra um antigénio próprio alvo, é aparentemente seguida pela expansão das células regulatórias, direcionadas contra as células efetoras. Com o controlo das células efetoras pelas células regulatórias, o número e/ou atividade de ambos os tipos de células diminuem, o que por sua vez é seguido do mesmo ciclo devido 10 ao esforço contínuo do sistema imunitário do doente para atacar os antigénios alvo próprios.
Preferencialmente, o marcador do sistema imunitário é um marcador inflamatório de fase aguda. Mais preferencialmente, o marcador de fase inflamatória aguda é escolhido de um grupo constituído por amiloide A do soro, amiloide P do soro e a proteína reativa C.
Preferencialmente, o agente é administrado, entre a altura em que os níveis do marcador de fase inflamatória aguda atingiram o seu ponto mais baixo, e antes do marcador atingir o máximo no ciclo seguinte.
De preferência, o marcador do sistema imunitário reflete o número e/ou a atividade das células regulatórias, e/ou o número e/ou a atividade das células efetoras.
Numa outra apresentação, o marcador do sistema imunitário é a temperatura corporal. No que diz respeito a esta apresentação, é preferível que o agente seja administrado quando a temperatura do corpo atinja o seu ponto mais baixo, e antes que a temperatura atinja o seu máximo no ciclo seguinte.
De preferência, as células T efetoras são células T CD8 + CD4-. Preferencialmente, o agente é administrado entre o momento em que os números de células T CD8+ CD4- estão no seu ponto mais reduzido, e quando os números das células T CD8+ CD4- não estão ainda no seu ponto máximo no ciclo seguinte. Mais preferencialmente, o agente é administrado na altura em que os números das células T CD8+ CD4- estão no seu ponto mais baixo do ciclo ou no início do aumento nos ciclos seguintes. 11
De preferência, as células T regulatórias são células T CD4+ CD8-. Preferencialmente, o agente é administrado aproximadamente no momento em que, ou mesmo antes de, o número de células T CD4+CD8- ter atingido o máximo.
No que diz respeito ao aspeto acima, o agente inibe a produção de, limita a função de, e/ou destrói as células efetoras, sendo o agente selecionado a partir do grupo constituído por fármacos antiproliferativos, fármacos antimetabólicos, radiação, dsRNA e anticorpos que inibam a produção, limitam a função de e/ou a atividade das células efetoras. De preferência, o fármaco anti-proliferativo é selecionado de um grupo constituído por: taxol, vincristina, vinblastina e vinblastina anidrica.
Um exemplo de um anticorpo preferido é um anticorpo anti-CD8+. A observação de que o sistema imunitário é ciclico, durante o estado de doença, caracterizado pela presença de células efetoras, pode também ser usado como um indicador da presença de uma doença deste tipo. Estes procedimentos de diagnóstico, seriam particularmente úteis para analisar um doente, para a recorrência do estado de doença (como uma doença autoimune) no seguimento do tratamento, ou para analisar se um determinado doente é suscetível à doença (como nos casos em que o indivíduo foi anteriormente identificado como possuindo um alelo de um gene que o predispõe a uma doença autoimune) para o surgimento da doença. É também apresentado na presente invenção um método para analisar o ciclo de células efetoras e/ou células 12 regulatórias para diagnosticar uma doença caracterizada pela produção de células efetoras, consistindo o método na monitorização do doente, ou amostras obtidas dele, para a deteção de flutuações em pelo menos uma de: a) número e/ou atividade das células efetoras, b) número de células regulatórias e/ou atividade, c) uma molécula associada à doença, e/ou d) um marcador do sistema imunitário, caracterizado por qualquer uma das hipóteses, a) a d) , indicar que a doença está presente. É também apresentado, na presente invenção, o uso de um ensaio, que deteta um marcador do sistema imunitário para analisar o ciclo de células efetoras e/ou células regulatórias, para determinar quando um agente deve ser administrado a um doente que sofra de uma doença, caracterizada pela produção de células efetoras. 0 marcador é, de preferência, um marcador de fase inflamatória aguda. 0 marcador de faase inflamatória aguda é de preferência selecionado de um grupo constituído por: amiloide A do soro, amiloide P do soro e a proteína reativa C. É também apresentado na presente invenção o uso de um ensaio, o qual deteta os números de células efetoras e/ou atividade para analisar o ciclo das células efetoras e/ou células regulatórias, para determinar quando um agente deve ser administrado a um doente que sofra de uma doença, caracterizada pela produção de células efetoras. 0 ensaio deteta preferencialmente o número de células T CD8+CD4-. 13
Igualmente descrito na presente invenção é o uso de um ensaio que deteta os números de células regulatórias e/ou atividade para analisar o ciclo das células efetoras e/ou regulatórias para determinar quando um agente deve ser administrado a um doente que sofra de uma doença caracterizada pela produção de células efetoras. 0 ensaio deteta preferencialmente o número de células T CD4+CD8-. É igualmente apresentado na presente invenção o uso de um ensaio que deteta uma molécula associada a uma doença, caracterizada pela produção de células efetoras, para analisar o ciclo de células efetoras e/ou células regulatórias, para determinar quando um agente deve ser administrado para tratar a doença. É igualmente apresentado, na presente invenção, um kit para ser usado na análise do ciclo de células efetoras e/ou células regulatórias, para determinar quando o agente deve ser administrado a um doente sofrendo de uma doença caracterizada pela produção de células efetoras, sendo que o kit consiste em pelo menos um reagente para a monitorização no doente, ou em amostras obtidas deste, das flutuações em pelo menos um de: a) número e/ou atividade das células efetoras, b) número e/ou atividade de células regulatórias, c) uma molécula associada à doença, e/ou d) um marcador do sistema imunitário. 0 kit inclui, de preferência, instruções escritas para a realização do método de acordo com a invenção incluindo a referência para o número preferido de amostras a serem analisadas, e o tempo de intervalo entre a análise das amostras. 14
Os presentes inventores descobriram igualmente, e de forma surpreendente, que tanto os números das células efetoras, como das células regulatórias, obedecem a ciclos, durante uma doença degenerativa. Este ciclo ocorre numa base regular, com a expansão das células efetoras contra um antigénio alvo, sendo seguido pela expansão das células regulatórias, dirigidas contra as células efetoras. Com o controlo das células efetoras pelas células regulatórias, os números de ambos os tipos de células diminuem, o que por sua vez é seguido pelo mesmo ciclo, devido à presença continua ou remoção incompleta do antigénio. 0 conhecimento deste ciclo pode ser usado para o tratamento de doenças, nas quais seja conhecido que o aumento das células regulatórias é prejudicial para o doente. Mais especificamente, o tratamento de um doente pode ser realizado no intervalo de tempo adequado, de forma a que não ocorra a expansão das células regulatórias, e/ou os números de células regulatórias sejam reduzidos ou abolidos.
Exemplos de doenças degenerativas incluem a doença de
Alzheimer, e doença associada a priões.
Apesar de não se desejar limitar pela teoria, a expansão das células efetoras contra um antigénio alvo, é aparentemente seguida pela expansão das células regulatórias dirigidas contra as células efetoras. Apesar de tradicionalmente não serem consideradas como sendo doenças caracterizadas pela produção de um antigénio, as doenças degenerativas como a doença de Alzheimer e doenças relacionadas com priões são causadas por, pelo menos em parte, níveis elevados de uma proteína (s) (antigénica) 15 particular. Existem provas de que a resposta imunitária pode ser aumentada contra tais proteínas, e foram sugeridas abordagens para a produção de vacinas para o tratamento de doenças degenerativas e doenças relacionadas com priões. Com o controlo das células efetoras pelas células regulatórias, os números e/ou atividade de ambos os tipos de células diminuem, o que por sua vez é seguido pelo mesmo ciclo, devido à presença continua, ou remoção incompleta do antigénio, o que resulta numa resposta imunitária oscilatória, mas ineficaz. 0 tempo adequado para a administração do agente é entre o momento em que os niveis do marcador de fase inflamatória aguda atingiram o máximo e antes do marcador começar a aumentar no ciclo seguinte. 0 marcador de fase inflamatória aguda é mais preferivelmente escolhido de entre, mas não limitado a, o grupo constituído por amiloide A do soro, amiloide P do soro e proteína reativa C. 0 marcador de sistema imunitário reflete preferencialmente o número e/ou a atividade das células regulatórias, e/ou o número e/ou atividade das células efetoras.
Numa outra apresentação, o marcador do sistema imunitário é a temperatura corporal. No que diz respeito a esta apresentação, é preferível que o agente seja administrado quando a temperatura corporal atingiu o máximo e antes que a temperatura do corpo comece a subir no ciclo seguinte.
Numa outra apresentação, o doente é monitorizado para detetar um aumento e/ou atividade das células regulatórias, através da análise dos níveis de células T CD4+CD8-. No que diz respeito a esta apresentação, é preferível que o agente seja administrado entre o momento em que os números de 16 células T CD4+CD8- estejam no seu valor mínimo e antes que as células T CD4+CD8- atinjam o máximo no ciclo seguinte. O agente é preferencialmente administrado quando os números de células T CD4+CD8- estão no seu mínimo ou comecem a aumentar no ciclo seguinte.
Numa outra apresentação, o doente é monitorizado para detetar um aumento do número e/ou atividade das células efetoras pela análise dos níveis de células T CD8+CD4-. No que diz respeito a esta apresentação, é preferível que o agente seja administrado aproximadamente quando, ou imediatamente antes, os números das células CD8+CD4- tenham atingido o máximo.
No que diz respeito a aspetos da invenção que se relacionam com doenças degenerativas, o agente inibe a produção de, limita a função de, e/ou destrói, as células regulatórias, sendo o agente escolhido do grupo constituído por fármacos anticancerígenos como fármacos antiproliferativos, fármacos antimetabólicos, radiação, dsRNA e anticorpos, os quais inibem a produção e/ou atividade das células regulatórias. 0 fármaco antiproliferativo é preferencialmente escolhido a partir do grupo constituído por, mas não limitado a, taxol, vincristina, vinblastina e vinblastina anídrica. Os exemplos de anticorpos preferíveis incluem, mas não se limitam a, anti-CD4+, anti-CTLA-4 (antigénio-4 citotóxico associado a linfócitos), anti-GITR (recetor do fator de necrose tumoral induzida por glucocorticóides), anti-CD28 e anti-CD25. A observação de que o sistema imunitário é cíclico, durante uma doença degenerativa, pode também ser usada como um indicador da presença desta doença. Estes métodos de diagnóstico seriam particularmente úteis para a análise de 17 um doente para a recorrência de um estado de doença no seguimento do tratamento, ou para analisar um doente previamente determinado como sendo suscetível à doença para a emergência da doença. É igualmente descrito na presente invenção um método para analisar o ciclo das células efetoras e/ou células regulatórias, para diagnosticar uma doença degenerativa, sendo que o método inclui a monitorização no doente, ou nas amostras obtidas deste, de flutuações em pelo menos um dos: a) números e/ou atividade de células efetoras, b) números e/ou atividade das células regulatórias, c) uma molécula associada à doença, e/ou d) um marcador do sistema imunológico, no qual um ciclo de qualquer uma das opções de a) a d), indica que a doença possa estar presente.
Os presentes inventores determinaram igualmente que o tratamento de uma doença degenerativa pode ser melhorado (ou um aumento das hipóteses de um tratamento bem sucedido) quando uma vacina é administrada na altura apropriada. Nestes casos, a vacina aumenta a resposta imunitária inata contra a doença. Isto será muito provavelmente o resultado do aumento do número e/ou atividade das células efetoras. Apesar de as células regulatórias serem teoricamente produzidas em último lugar, a melhoria do sistema imunitário permite ao doente controlar adequadamente a doença, antes da emergência das células regulatórias.
Numa outra apresentação, a vacina é administrada no momento em que os níveis das células efetoras estão a aumentar. Numa outra apresentação, a vacina é administrada quando os níveis de uma molécula associada à doença comecem a diminuir. Numa outra apresentação, a vacina é administrada 18 quando os níveis de um marcador inflamatório de fase aguda comecem a aumentar. É igualmente descrito na presente invenção, o uso de um ensaio, o qual deteta um marcador do sistema imunitário, para analisar o ciclo das células efetoras e/ou células regulatórias para determinar quando um agente ou vacina deve ser administrado a um doente sofrendo de uma doença degenerativa. 0 marcador é preferencialmente um marcador inflamatório de fase aguda. 0 marcador de fase inflamatória aguda é mais preferencialmente escolhido de entre o grupo constituído por: amiloide A do soro, amiloide P do soro e proteína reativa C. É igualmente descrito o uso de um ensaio que deteta o número e/ou atividade das células efetoras para analisar o ciclo de células e/ou atividade das células efetoras e/ou células regulatórias, para determinar quando um agente ou vacina deve ser administrado a um doente que sofra de uma doença degenerativa. 0 ensaio deteta preferencialmente o número de células T CD8+CD4-. É igualmente descrito na presente invenção o uso de um ensaio, o qual deteta o número e/ou atividade das células regulatórias, para analisar o ciclo das células efetoras e/ou células regulatórias, para determinar quando um agente ou vacina deve ser administrado a um doente que sofra de uma doença degenerativa. 19 0 ensaio deteta preferencialmente o número de células T CD4+CD8-. É igualmente descrito na presente invenção o uso de um ensaio, o qual deteta uma molécula associada a uma doença degenerativa para analisar o ciclo de células efetoras e/ou células regulatórias para determinar quando um agente ou vacina devam ser administrados para tratar a doença.
Na presente invenção é igualmente descrito o uso de um agente para o fabrico de um medicamento para administração a um doente que sofra de uma doença degenerativa, caracterizado por o agente ser administrado no momento escolhido, de forma a que a atividade das células efetoras não seja reduzida significativamente. 0 agente inibe preferencialmente a produção de, limita a produção de, e/ou destrói, as células regulatórias. É igualmente descrito na presente invenção um kit que, quando usado para analisar o ciclo das células efetoras e/ou células regulatórias, serve para determinar quando um agente ou vacina deve ser administrado a um doente que sofra de uma doença degenerativa, o qual contém pelo menos um reagente para a monitorização no doente, ou em amostras obtidas deste, para a deteção de flutuações em pelo menos um de: a) números e/ou atividade de células efetoras, b) números e/ou atividade das células regulatórias, c) uma molécula associada com a doença, e/ou d) um marcador do sistema imunitário. 0 kit inclui de preferência instruções escritas para a realização do método da invenção incluindo referências ao 20 número preferido de amostras para serem analisadas e o periodo entre a análise das amostras.
Como referido na presente invenção, os inventores notaram que as flutuações em numerosos fatores indicam que o sistema imunitário está em ciclo nos doentes que sofram de uma doença caracterizada pela produção de células efetoras, bem como em doenças degenerativas. Estes fatores incluem marcadores inflamatórios de fase aguda. Estes fatores estão associados, diretamente ou indiretamente, a um estado geral do sistema imunitário incluindo, mas não necessariamente limitados a, produção de células efetoras e/ou a sua atividade, produção de células regulatórias e/ou a sua atividade, e/ou produção de células B e/ou atividade.
Será do conhecimento do especialista que doenças como doenças autoimunes e doenças degenerativas têm um efeito complexo no doente. Adicionalmente, as variações naturais entre indivíduos, associadas a fatores como o seu genótipo, nutrição, fitness, estado de doença atual e anterior, todos influenciam como um individuo em particular responde a um estado de doença. Assim, os indivíduos exibirão variações na periodicidade ou comprimento de onda ou frequência do ciclo do seu sistema imunitário dependendo do seu estado de doença. Adicionalmente, tal como o ciclo menstrual, a duração do ciclo pode variar ligeiramente num individuo devido à variação natural e/ou fatores ambientais. Por isso, a variação individual pode pelo menos ser encontrada no que diz respeito a, por exemplo, i) a duração do ciclo, ii) os números absolutos das células efetoras ou regulatórias durante o ciclo, ou iii) os níveis dos marcadores inflamatórios de fase aguda durante o ciclo. Tal variação pode ser exagerada em doentes com uma doença 21 avançada, em que o sistema imunitário do doente foi testado durante um tempo considerável.
Como resultado, é muito provável que seja desejável a monitorização, durante um tempo suficiente, para seguir padrões nas flutuações, entre e intra ciclos, e por isso, qualquer tempo suficiente que seja necessário para o tipo celular relevante, ou marcador destes, para determinar o máximo e/ou o mínimo. Isto assegura que a dinâmica do ciclo do sistema imunitário de um doente particular é conhecida. 0 doente é preferencialmente monitorizado durante um período de pelo menos 7 dias, de preferência pelo menos 14 dias, e com maior preferência, pelo menos 21 dias, mais preferencialmente pelo menos 28 dias. Pode igualmente ser desejável a monitorização do doente por períodos mais longos, como pelo menos 35 dias, pelo menos 42 dias, pelo menos 49 dias, ou mesmo períodos mais longos.
Uma exceção à monitorização do doente durante um período razoável de tempo surge quando o método é usado para tratar a rejeição de um transplante. Neste caso, a exposição das células efetoras pode resultar rapidamente na rejeição do transplante. Por isso, quando se trata, por exemplo, de uma doença de transplante contra o hospedeiro é preferível que a monitorização dos doentes comece imediatamente, ou pouco depois de receber o transplante, e as células efetoras sejam o alvo do primeiro ciclo imunitário. Por exemplo, numa das apresentações preferidas, a monitorização começa cerca de um dia após a receção do transplante e continua, durante pelo menos 15 dias, mais preferencialmente, durante pelo menos 21 dias.
Em geral, é preferível que vários fatores sejam monitorizados ao mesmo tempo. Isto deve-se a, devido aos 22 fatores descritos acima, ser improvável que cada fator tenha um perfil de ciclo perfeito, particularmente ao longo de um número de ciclos, para de forma rotineira fornecer uma indicação clara do momento apropriado para administrar o agente. Apesar da análise de inúmeros fatores ao longo do tempo poder ser cara, e possa causar pelo menos algum inconveniente ao doente, as doenças como as doenças autoimunes e doenças degenerativas podem ser fatais. Por isso, é vantajosa a obtenção do maior conhecimento possivel no que diz respeito ao ciclo do sistema imunitário num determinado doente, antes do doente ser tratado.
Adicionalmente, apesar da análise do ciclo de diferentes fatores em alguns doentes poder resultar em perfis complexos, tendo em conta as orientações dadas na presente invenção, está bem dentro das capacidades do profissional de saúde, a análise dos dados de monitorização, para determinar o momento ótimo para administração do agente.
Um fator que adiciona complexidade, será se o doente adquiriu recentemente uma doença ou um trauma não relacionado com a doença a ser tratada. Por exemplo um doente a ser tratado para uma doença autoimune pode também contrair o virus da gripe comum. A presença do virus da gripe resultará, por exemplo, num aumento dos marcadores inflamatórios da fase aguda, independentemente do ciclo destes marcadores, o qual está a ocorrer de acordo com a doença autoimune. Outras doenças que podem causar complicações na monitorização do ciclo das células efetoras/regulatórias e no seu uso, em métodos de acordo com a presente invenção, incluem outras infeções e cancro. De acordo com isso, é desejável que a monitorização do doente para qualquer fator possa resultar em niveis elevados de, por exemplo, marcadores inflamatórios de fase 23 aguda para garantir que o fator a ser monitorizado, reflete verdadeiramente o ciclo das células efetoras/regulatórias, resultante da doença a ser tratada.
Adicionalmente, é preferível que o doente seja monitorizado, tão frequentemente quanto possível, de forma a garantir que o ciclo de um determinado doente é adequadamente caracterizado. Naturalmente isto vai garantir que o agente é administrado, no momento apropriado, e que quaisquer variações pequenas em, por exemplo números ou atividade das células efetoras/regulatórias, ou marcadores destes, não é mal interpretado. 0 doente é monitorizado de preferência pelo menos a cada três dias, sendo adicionalmente preferível pelo menos a cada 2 dias, sendo especialmente preferível pelo menos a cada dia. A monitorização pode ocorrer mais frequentemente, por exemplo a cada 12 horas, quando o ciclo está a atingir uma fase em que é provável que o momento seja apropriado para administrar o agente. 0 doente é preferencialmente um mamífero. Este mamífero é preferivelmente um humano.
Como será aparente, as características preferidas de um aspeto de acordo com a presente invenção são aplicáveis a vários outros aspetos da invenção.
Ao longo de toda a especificação a palavra "inclui", ou variações como "incluem" ou "incluindo", serão entendidas como indicando a inclusão de um elemento, número inteiro ou passo referido, ou grupo de elementos, números inteiros ou passos, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, número inteiro ou passo, ou grupo de elementos, números inteiros ou passos. 24 A invenção é descrita em seguida, através dos exemplos não limitativos seguintes, e em referência as figuras anexas.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS ANEXOS
Figura 1. Proteína reativa C e amiloide A do soro em função do tempo na Sra. FO.
Figura 2. Amiloide A do soro e IL-2 em função do tempo na Sra. FO.
Figura 3. Amiloide A do soro e o marcador cancerígeno CA125 em função do tempo na Sra. FO.
Figura 4. Proteína reativa C e C3 em função do tempo na Sra. FO. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Técnicas e definições gerais A menos que seja especificamente definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos na presente invenção deverão ser considerados como tendo o mesmo significado como entendido normalmente por alguém especialista (e.g. em cultura de tecidos, genética molecular, imunologia, imunohistoquímica, química de proteínas e bioquímica). A menos que indicado em contrário, as técnicas de proteínas recombinantes, cultura de tecidos, e imunológicas utilizadas na presente invenção são procedimentos padrão, bem conhecidos do especialista. Estas técnicas estão descritas e explicadas na literatura, em fontes como, J. Perbal, A Praticai Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press 25 (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Praticai Approach, Volumes 1 e 2, IRL Press (1991) , D.M. Glover and B.D. Hames (editores), DNA Cloning: A Praticai Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 e 1996) , e F.M. Ausubel et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, incluindo todas as atualizações até ao presente), Ed Harlow e David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), and J.E. Coligan et al. (editores) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluindo todas as atualizações até ao presente).
Como usado neste documento, os termos "tratar" ou "tratamento" incluem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz suficiente para reduzir ou eliminar pelo menos um sintoma da doença. "Células efetoras" incluem, mas não estão necessariamente limitadas a, à população de células T conhecida por células T CD8+. "Células regulatórias" incluem, mas não estão necessariamente limitadas a, uma subpopulação das células T CD4+. Tais células podem ser também referidas pelos especialistas como "células supressoras". As células regulatórias podem atuar quer diretamente sobre as células efetoras, ou podem exercer os seus efeitos sobre as células efetoras, através de outros mecanismos.
As células CD4+ exprimem o marcador conhecido dos especialistas como CD4. Tipicamente o termo "células T CD4+", como usado na presente invenção, não se refere a células que também exprimam CD8. Contudo, este termo inclui 26 células T que também exprimam outros marcadores antigénicos, como CD25.
Como usado na presente invenção, o termo "inibe a produção de, limita a função de, e/ou destrói", quando em referência à exposição das "células efetoras" ao agente, significa que o número e/ou atividade, das células efetoras é reduzida pelo agente. É especialmente preferível que o agente erradique completamente o número, e/ou a atividade, das células efetoras.
Como usado na presente invenção, o termo "inibe a produção de, limita a função de, e/ou destrói", quando em referência à exposição das "células regulatórias" ao agente, significa que o número e/ou atividade das células regulatórias é reduzido pelo agente. É especialmente preferível que o agente erradique completamente o número e/ou atividade das células regulatórias.
Como usado no presente documento o termo "doença caracterizada pela produção de células efetoras" refere-se a qualquer doença caracterizada por o número ou atividade das células efetoras desempenhar um papel no prolongamento do estado de doença. Estas doenças são ou i) tipicamente caracterizadas por uma resposta imunitária contra antigénios próprios, conhecidas normalmente por doenças autoimunes, ou ii) envolvem a resposta imunitária de um doente durante o transplante de orgãos/tecidos/células de um dador adequado.
Como usado na presente invenção, o termo "doença autoimune" refere-se a qualquer doença na qual o corpo produza uma resposta imunogénica (i. e. sistema imunitário) contra um qualquer constituinte do seu próprio tecido. Por outras 27 palavras, o sistema imunitário perde a sua capacidade de reconhecer qualquer tecido ou sistema dentro do corpo como "próprio" e marca-o e ataca-o como se fosse estranho. As doenças autoimunes podem ser classificadas naquelas em que é afetado predominantemente um orgão (e. g. anemia hemolítica e tiroidite autoimune) e aquelas em que o processo de doença autoimune é difuso ocorrendo em vários tecidos (e. g. Lupus erythematosus sistémico). Exemplos de doenças autoimunes incluem, mas não se limitam a, artrite reumatóide, esclerose múltipla, lupus erithematosus, miastenia grave, escleroderma, doença de Crohn, colite ulcerosa, doença de Hashimoto, doença de Graves, sindroma de Sjogren, falha poliendócrina, vitiligo, neuropatia periférica, sindrome poliglandular autoimune do tipo I, glomerulonefrite aguda, doença de Addison, hipoparatiroidismo idiopático de adulto (AOIH), alopécia total, doença de Celiac, hepatite crónica ativa, sindroma de CREST, dermatomiosite, cardiomiopatia dilatada, sindroma de eosinofilomialgia, epidermolisis bullosa acquisita (EBA), arterite de célula gigante, sindroma de Guillain-Barr, hemocromatose, púrpura de Henoch-Schonlein, nefropatia idiopática de IgA, diabetes mellitus insulino-dependente (IDDM), artrite reumatóide juvenil, sindroma de Lambert-Eaton, dermatose linear de IgA, miocardite, narcolepsia, vasculite necrotizante, sindroma de Lupus neonatal (NLE), sindroma nefrótico, pemfigoide, pemphigus, polimiosite, colangite esclerótica primária, glomerulonefrite rapidamente progressiva, sindroma de Reiter, sindroma do homem rigido, doença inflamatória intestinal, osteoartrite e tiroidite. 0 termo "transplante" e variações deste refere-se à inserção de um transplante no hospedeiro, quer o transplante seja alogeneico (quando o dador e o recetor 28 tenham diferentes origens genéticas mas sejam da mesma espécie) , ou xenogeneico (no qual o dador e o recetor são de espécies diferentes) . Por isso, num cenário tipico, o hospedeiro é humano e o transplante é um isotransplante, derivado de um humano com a mesma, ou diferente, origem genética. Num outro cenário, o transplante é derivado de uma espécie diferente daquela que é transplantada, como um coração de babuino transplantado para um recetor humano, e incluindo animais de espécies muito afastadas filogeneticamente, por exemplo, uma válvula de coração de porco, ou células das ilhas β ou células neuronais de outro animal, num hospedeiro humano. Podem ser transplantadas células, tecidos e/ou orgãos, cujos exemplos incluem, mas não se limitam a, células isoladas, como as células de ilhas; tecidos como membrana amniótica do recém-nascido, medula óssea, células hematopoiéticas precursoras, e tecido ocular, como tecido da córnea; e orgãos, como pele, coração, figado, baço, pâncreas, lóbulo da tiróide, pulmão, rim, orgãos tubulares (e. g. intestino, vasos sanguíneos, ou esófago), etc. Os orgãos tubulares podem ser usados para substituir porções danificadas do esófago, vasos sanguíneos ou o dueto biliar. Os transplantes de pele podem ser usados não apenas para queimaduras, mas também como cobertura do intestino danificado ou para fechar certos defeitos, como uma hérnia do diafragma. 0 transplante é derivado de qualquer fonte mamífera, incluindo humana, quer sejam cadáveres ou dadores vivos. 0 transplante é, preferencialmente, medula óssea, ou um orgão como o coração.
Como usado na presente invenção, "rejeição de transplante" ou variações deste termo referem-se à resposta imunitária produzida pelo sistema imunitário do hospedeiro contra o transplante, resultando finalmente na rejeição do 29 transplante pelo hospedeiro. Existem geralmente dois tipos de "rejeição de transplante", nomeadamente transplante contra o hospedeiro e hospedeiro contra o transplante.
Como usado na presente invenção, o termo "transplante contra o hospedeiro" refere-se a um ataque imunológico no recetor por parte de células do dador, conduzindo frequentemente à rejeição das células transplantadas. Apesar de as células transplantadas poderem ser de qualquer tipo celular, normalmente os únicos tecidos transplantados que albergam suficientes células imunitárias para causar a doença do transplante contra o hospedeiro, são o sangue e a medula óssea.
Como usado na presente invenção, o termo "doença de rejeição de hospedeiro contra o transplante" refere-se a reações de um hospedeiro mediadas por linfócitos contra células alogeneicas ou xenogeneicas adquiridas sob a forma de transplante ou de outra forma, que conduzam a lesões ou/e destruição das células transplantadas. Esta é a base comum da rejeição do transplante.
Como usado na presente invenção, o termo "doença degenerativa" é uma doença que resulta na perda de células. Preferencialmente, a doença degenerativa é uma doença neurodegenerativa a qual se caracteriza pela perda de células nervosas. As doenças neurodegenerativas relevantes para a presente invenção são a doença de Alzheimer, e doenças relacionadas com priões como a doença de Creutzfeldt-Jakob, doença de Alper, Kuru, sindrome de Gersymann-Straussler-Scheinker, insónia fatal hereditária, scrapie, encefalopatia transmissível do leite, doença de desgaste crónico e encefalopatia espongiforme bovina. Numa 30 outra apresentação, a doença degenerativa é uma "doença relacionada com a amiloide", e é a doença de Alzheimer. O termo "marcador do sistema imunitário" refere-se geralmente a qualquer molécula ou fator que forneça uma indicação do estado e/ou atividade do sistema imunitário. Estes marcadores podem estar diretamente ligados à atividade e/ou produção de células regulatórias e/ou efetoras, e/ou podem fornecer uma indicação mais geral da resposta global do sistema imunitário a um antigénio. Exemplos de um marcador do sistema imunitário adequado incluem marcadores inflamatórios de fase aguda, como a proteina reativa C e amiloide A do soro. Outro exemplo de um marcador do sistema imunitário são os indicadores da destruição celular, como por exemplo, mas não limitado a, colesterol e β-2-microglobulina no soro. O colesterol e a β-2-microglobulina são componentes integrais das membranas celulares. Em particular, a β-2-microglobulina é a molécula acessória do recetor de maior histocompatibilidade de classe I, ou recetor MHC-I. Consequentemente, com o ciclo da resposta imunitária contra a doença, associado à destruição das células alvo, os niveis destas duas moléculas no soro dos doentes que sofrem destas doenças, estão frequentemente aumentados. Assim, oscilações nos indicadores da destruição celular, como colesterol e β-2-microglobulina, pode também ser útil na determinação do inicio ou fim do ciclo da resposta imunitária. Naturalmente que, com a presente descoberta de que o sistema imunitário obedece a um ciclo numa doença caracterizada pela produção de células efetoras, bem como em doentes que sofram de uma doença degenerativa, o especialista pode facilmente identificar marcadores adicionais úteis nos métodos de acordo com a presente invenção. 31
Como usado na presente invenção, o termo "uma molécula associada à doença" refere-se a qualquer molécula a qual esteja ligada ao estado de doença. Numa das apresentações preferidas, o marcador é uma proteína. Marcadores proteicos deste género são bem conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, os níveis do péptido β-amiloide pode ser um marcador da doença de Alzheimer, e as proteínas priónicas, na sua conformação β podem ser um marcador de doenças relacionadas com priões.
Como usado na presente invenção, o termo "a atividade das células efetoras não é reduzia significativamente" significa que o momento da administração do agente (para o tratamento de uma doença degenerativa) é tal que o agente exerce um efeito proporcionalmente maior contras as células regulatórias do que contra as células efetoras. É claramente preferido que o agente seja administrado num momento em que o rácio do efeito contra as células regulatórias, face ao efeito contra as células efetoras, seja máximo.
Como usado na presente invenção, "cíclico", "em ciclo" ou "ciclo" ou variações destes, referem-se a oscilações repetitivas de um indicador (número de células, atividade, marcador de doença, marcador do sistema imunitário, etc.), no qual o indicador muda periodicamente de um máximo para um mínimo.
Como usado na presente invenção, o termo "analisar o ciclo das células efetoras e/ou regulatórias" refere-se à determinação das células, marcadores e/ou moléculas definidas para se obter uma apreciação do estado do ciclo num determinado momento. 0 número de pontos temporais analisado, o período entre cada análise e a duração do 32 tempo da análise são, preferencialmente, suficientes para determinar quando o agente deve ser administrado. A "amostra" refere-se a um material suspeito de conter células regulatórias, células efetoras, marcadores do sistema imunológico e/ou moléculas associadas com a doença. A amostra pode ser usada como obtida diretamente da fonte ou na sequência de pelo menos um passo de purificação (parcial). A amostra pode ser preparada em qualquer meio conveniente, que não interfira com o método de acordo com a presente invenção. A amostra é tipicamente uma solução aquosa ou fluido biológico como descrito com maior detalhe em seguida. A amostra pode ser derivada de qualquer fonte, como fluido fisiológico, incluindo sangue, soro, plasma, saliva, sputum, fluido da lente ocular, zaragatoa da boca, suor, fezes, urina, fluido de ascite, muco, fluido sinovial, fluido peritoneal, exsudado transdérmico, exsudados faringico, lavagem broncoalveolar, aspirações traqueais, fluido cerebrospinal, sémen, muco cervical, secreções vaginais ou da uretra, fluido amniótico e similares. A amostra é preferencialmente sangue ou uma fração deste. 0 pretratamento pode envolver, por exemplo, preparar o plasma a partir de sangue, diluir fluidos viscosos e similares. Os métodos de tratamento podem envolver filtração, destilação, separação, concentração, inativação dos compostos que interferem, e a adição de reagentes. A seleção e pretratamento das amostras biológicas antes da execução dos testes é bem conhecida no estado da técnica e não carece de ser descrita em maior detalhe.
Para os objectivos da presente invenção, o termo "anticorpos", a menos que especificado em contrário, inclui fragmentos de anticorpos, os quais mantêm a sua atividade 33 de ligação ao analito alvo. Fragmentos deste género incluem os fragmentos Fv, F(ab') e F(ab')2, bem como anticorpos de cadeia simples (scFv). Adicionalmente, os anticorpos e os seus fragmentos podem ser anticorpos humanizados, por exemplo como o descrito em EP-A-239400.
Marcadores de fase inflamatória aguda
Alguns marcadores de fase inflamatória aguda, aumentam inicialmente, durante uma resposta imunitária (referidos daqui em diante como marcadores positivos de fase inflamatória aguda), enquanto que outros, decrescem inicialmente, durante uma resposta imunitária (referidos daqui em diante como marcadores negativos de fase inflamatória aguda). Os marcadores de fase inflamatória aguda são também referidos no estado da técnica como reagentes de fase aguda ou proteínas de fase aguda. 0 especialista estará desperto para os vários ensaios que podem ser usados para monitorizar os marcadores de fase inflamatória aguda.
Exemplos de marcadores positivos de fase inflamatória aguda incluem, mas não se limitam a, proteína reativa C, amiloide A do soro, componente de amiloide P do soro, proteínas do complemento como C2, C3, C4, C5, C9, B, inibidor de Cl e proteína de ligação C4, fibrinogénio, fator de von Willebrand, al-antitripsina, cxl-antiquimiotripsina, cx2-antiplasmina, cofator II de heparina, inibidor I do ativador de plasminogénio, haptoglobina, hemopexina, ceruloplasmina, dismutase de superóxido dependente de manganês, cxl-glicoproteína acídica, hemeoxigenase, proteína de ligação à manose, proteína I de leucócitos, lipoproteína (a), proteína de ligação ao lipopolissacárido, e interleuquinas como IL-1, IL-2, IL-β, IL-10 e os seus recetores respetivos. 34
Exemplos de marcadores negativos de fase inflamatória aguda incluem, mas não se limitam a, albumina, prealbumina, trasnferina, apoAI, apoAII, glicoproteina HS a2, inibidor de inter-cx-tripsina, glicoproteina rica em histidina. A amiloide A do soro (SAA) foi descoberta como sendo um componente do plasma que partilha a antigenicidade com a amiloide AA, o principal componente fibrilhar dos depósitos de amiloide AA reativos. Foi demonstrado que SAA é um reagente da fase aguda cujo nivel no sangue é elevado até 1000 vezes ou mais como parte da resposta do corpo a várias lesões, incluindo trauma, infeção e inflamação.
Os niveis de SAA podem ser determinados como conhecido do estado da técnica, ver por exemplo Weinstein et al (1984), Liuzzo et al (1994), 0'Hara et al (2000), Kimura et al (2001) e 0'Hanlon et al (2002). A proteína reativa C (CRP) é uma proteína importante na resposta positiva de fase aguda, e a sua concentração no soro pode aumentar até 1000 vezes durante a resposta de fase aguda. A CRP é um pentâmero constituído por cinco subunidades idênticas, cada uma com um peso molecular de cerca de 23500.
Os níveis da proteína reativa C podem ser determinados usando técnicas conhecidas do estado da técnica, as quais incluem, mas não se limitam a, aquelas descritas em Senju et al (1983), Weinstein et al (1984), Price et al (1987),
Liuzzo et al (1994), Eda et al (1998), Kimura et al (2001) e 0'Hanlon et al (2002). 35
As proteínas do complemento são um grupo de pelo menos 20 componentes imunologicamente distintos. Estas circulam normalmente no sangue sob a sua forma inativa. São capazes de interagir sequencialmente com complexos antigénio-anticorpo, entre si e com as membranas celulares de uma forma complexa, mas adaptável, para destruir vírus e bactérias, e patologicamente, mesmo com as células próprias do hospedeiro. Níveis anormais das proteínas do complemento no soro podem ser devidos a doenças hereditárias ou adquiridas. Pelo menos os níveis de C3 e C4 em circulação reflectem um equilíbrio entre o consumo do complemente devido à formação do complexo imunológico e o aumento da síntese devido à resposta de fase aguda. Os métodos para medir os níveis de proteínas do complemento são bem conhecidos no estado da técnica.
Os níveis de diferentes interleuquinas podem também ser determinados usando procedimentos conhecidos do estado da técnica tais como usando o kit de ensaio de citoquinas ProteoPlex™ (EMD Biosciences Inc., CA, USA).
Agentes A presente invenção relaciona-se de forma abrangente com o uso de três tipos diferentes de agentes. Estes são: 1) agentes que sejam específicos para células efetoras (como anticorpos específicos para CD8+) que podem ser usados para o tratamento de doenças caracterizadas pela produção de células efetoras, 2) agentes que são específicos para células regulatórias (com anticorpos específicos para CD4+) que podem ser usados para o tratamento de uma doença degenerativa, e 36 3) agentes não seletivos, os quais influenciam as células efetoras e regulatórias, contudo, o momento da administração do agente dita o tipo de célula que é afetado.
Agentes para o tratamento de ima doença caracterizado pela produção de células efetoras 0 agente pode ser qualquer fator ou tratamento que resulte, seletivamente ou não-seletivamente na destruição, limitação da função de, ou na inibição da produção de células efetoras. Por exemplo, um anticorpo D8+ especifico pode ser usado especificamente contra células T CD8+. Contudo, em alguns casos, um agente não seletivo pode ser usado, como um fármaco antiproliferativo, um fármaco antimetabólico ou radiação, cada um deles atuando contra as células em divisão. Em particular, como sucede com outros tipos de células, as células efetoras são particularmente vulneráveis à destruição por fármacos antimitóticos (antiproliferativos) ou venenos do fuso acromático (e. g. vinblastina ou paclitaxel) quando em divisão e especificamente em mitose. 0 termo "fármaco antiproliferativo" e "fármaco antimetabólico" é um termo bem entendido no estado da técnica e refere-se a qualqure composto que destrua as células em divisão ou as iniba de prosseguirem proliferação adicional. Fármacos antiproliferativos incluem, mas não se limitam a , mecloetamina, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalano, metotrexato, fluorouracilo, floxuridina, citarabina, mercaptopurina, tioguanina, pentostatina, vinblastina , vinblastina anidra, vincristina, etopósido, tenipósido, datinomicina, daunorubicina, doxorubicina, belomicina, plicamicina, mitomicina, L- -asparaginase, cisplatina, mi toxantrona, hidróxiureia, procarbazina, 37 mitotano, aminoglutetimida, prednisona, caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroprogesterona, acetato de megestrol, dietilostilobestrol, estradiol de etinilo, tamoxifeno, propionato de testosterona, isótopos radioativos, cadeia A de rícino, taxol, toxina diftérica, colquicina e exotoxina A de Pseudomonas.
Os agentes são normalmente administrados em forma de dosagem que estão normalmente acessíveis ao médico especialista e são geralmente administradas nas suas quantidades normalmente prescritas (como por exemplo, as quantidades descritas no Physician's Desk Reference, 55a Edição, 2001, ou as quantidades descritas na brochura do fabricante para o uso daquele agente).
Numa outra apresentação, o agente é administrado como uma única injeção de bolus. Numa outra apresentação, o agente é administrado por infusão. O período da infusão pode ser, por exemplo, pelo menos 3 horas, pelo menos 12 horas ou pelo 24 horas.
Um outro exemplo de um agente que pode ser administrado num método de acordo com a presente invenção é dsRNA. dsRNA é usado em interferência de RNA (RNAi) o que é um fenómeno no qual, após a introdução numa célula, o mRNA homólogo do dsRNA é especificamente degradado de forma a que a síntese dos produtos génicos seja suprimida. Exemplos de um agente deste género causando RNAi incluem, mas não se limitam a, uma sequência de pelo menos 70% de homologia à sequência de ácidos nucleicos do gene alvo ou uma sequência hibridizável sob condições estringentes, RNA contendo uma porção de dupla-cadeia com um comprimento de pelo menos 10 nucleótidos ou variantes destes. Exemplos de genes alvo 38 incluem, mas não se limitam a, um gene necessário para a replicação ou sobrevivência de uma célula efetora.
Pode igualmente ser utilizado um dsRNA contendo um comprimento de cerca de 20 bases (e. g., representativamente cerca de 21 a 23 bases) ou menos que cerca de 20 bases, chamado siRNA no estado da técnica. A expressão de siRNA nas células pode suprimir a expressão de um gene alvo do siRNA. Numa outra apresentação, um agente capaz de causar RNAi pode ter uma estrutura curta em forma de gancho com uma porção coesiva na extremidade 3' (shRNA; short hairpin RNA) . Como usado na presente invenção, o termo "shRNA" refere-se a uma molécula de cerca de 20 ou mais pares de bases na qual o RNA de cadeia simples contém uma sequência de bases parcialmente palindrómica e forma a estrutura de cadeia dupla nesse local (i. e. uma estrutura em gancho). Os shRNA podem ser sintetizados quimicamente de forma artificial. Em alternativa, os shRNA podem ser produzidos pela ligação de cadeias sense e antisense de uma sequência de DNA em direções reversas e sintetizando RNA in vitro com uma polimerase T7 de RNA usando o DNA como modelo. O comprimento da parte de dupla-cadeia não é limitado em particular, mas é preferencialmente de cerca de 10 ou mais nucleótidos, e mais preferentemente cerca de 20 ou mais nucleótidos. A extremidade protuberante 3' coesiva pode ser preferencialmente DNA, sendo preferível que seja DNA com um comprimento de pelo menos 2 nucleótidos e sendo adicionalmente preferível DNA com um comprimento de 2-4 nucleótidos.
Um agente capaz de causar RNAi útil para a presente invenção pode ser sintetizado artificialmente (quimicamente ou bioquimicamente) ou ocorrer naturalmente. Não existe diferença substancial em termos do efeito da presente 39 invenção. Um agente sintetizado quimicamente é preferencialmente purificado por cromatografia liquida ou similar.
Um agente capaz de causar RNAi usado na presente invenção pode também ser produzido in vitro. Neste sistema de sintese, pode ser usada uma polimerase T7 de RNA e um promotor T7 para sintetizar RNA sense e antisense a partir de um modelo de DNA. Estes RNA são emparelhados e em seguida introduzidos numa célula. 0 dsRNA pode ser fornecido a um doente usando qualquer método conhecido do estado da técnica. Exemplos de métodos para o fornecimento de dsRNA a um doente estão descritos em, por exemplo, US 20040180357 US 20040203024 e 20040192629.
Agentes para o tratamento de uma doença degenerativa
Quando se trata uma doença degenerativa, o agente pode ser qualquer fator ou tratamento que resulte, seletivamente ou não seletivamente, numa destruição, limitação da função, ou na inibição da produção de células regulatórias. Por exemplo, um anticorpo especifico para CD4+ poderia ser usado para especificamente atacar as células T CD4+. Contudo, nalguns casos poderia ser igualmente usado um agente não seletivo, como um fármaco antiproliferativo, um fármaco antimetabólico ou radiação, cada um deles dirigido contra células em divisão. Em particular, bem como com outros tipos de células, as células efetoras são particularmente vulneráveis à destruição com fármacos antimitóticos (antiproliferativos) ou venenos contra o fuso acromático (e. g. vinblastina ou paclitaxel) quando em divisão e especificamente em mitose. 40
Para além da referência a anticorpos específicos contra CD8+, cada um dos agentes mencionados acima é igualmente útil para o tratamento de uma doença degenerativa. No que diz respeito a dsRNA, a molécula de dsRNA pode ser específica de mRNAs expressos apenas em células regulatórias.
Estudos recentes sugerem que as células CD4+CD25+ desempenham um papel importante na regulação das células imunitárias dirigidas contra os antigénios próprios (Salomon et al, 2000; Suri-Payer e Cantor, 2001). Adicionalmente, foi demonstrado que o direcionamento do ataque às células T CD4+D25+ aumenta a capacidade de um animal controlar o crescimento tumoral (Onizuka et al., 1999; Shimizu et al., 1999; Sutmuller et al., 2001). Da mesma forma, as células T CD4+CD25+ podem estar a agir como células regulatórias, no contexto usado na presente invenção. A atividade de células T CD4+D25+ pode ser reduzida através de anti-GITR, anti-CD28 e/ou anti-CTLA-4 (Read et al., 2000; Takahashi et al., 2000; Shimizu et al., 2002). Assim, estes anticorpos podem ser úteis como agentes para o seu uso nos métodos de acordo com a presente invenção.
Monitorização dos doentes
Na maior parte dos casos, é necessário determinar empiricamente o período de tempo em que o agente deve ser administrado, em doentes em diferentes fase da doença uma vez que a cinética das suas respostas imunitárias pode variar. Outros fatores, com a saúde geral do indivíduo e/ou o contexto genético do indivíduo terão igualmente impacto no momento apropriado para a administração do agente. 41 Técnicas conhecidas do estado da técnica podem ser usadas para a monitorização de uma população crescente de células efetoras durante o "ciclo". Amostras seriadas de sangue podem ser colhidas e analisadas quantitativamente para determinar, por análise de FACS, subtipos de células T (como CD4+ e/ou CD8+).
Pode ser necessária uma monitorização muito frequente, por exemplo, tão frequente quanto a cada poucas horas, para garantir que o momento correto é escolhido para a administração do agente. A monitorização é conduzida de preferência pelo menos a cada 48 horas. A monitorização é preferivelmente conduzida a cada 24 horas. A monitorização é optimalmente continuada, para determinar a ação do agente. Ablação reduzida, ressurgimento das células efetoras ou regulatórias (dependendo do estado de doença a ser tratado) pode significar que o método de acordo com a presente invenção deve ser repetido. Estes ciclos repetidos de tratamento podem gerar memória imunológica. É por isso possivel que a presente invenção, usada de um modo repetitivo, possa conferir algum efeito profilático protectivo.
Vacinas
As vacinas usadas na presente invenção resultarão numa resposta imunitária contra uma proteina (antigénio) caracteristica de uma doença degenerativa. Uma vacina deste género irá conter, pelo menos, um antigénio, ou um polinucleótido que codifique o referido antigénio. A vacina pode ser fornecida sob qualquer forma conhecida do estado da técnica, como por exemplo, mas não se limitando a, uma vacina de DNA, ingestão de um organismo transgénico 42 expressando o antigénio, ou uma composição contendo o antigénio.
Como usado na presente invenção, um "antigénio" é uma seguência polipeptidica gue contém um epitopo gue é capaz de produzir uma resposta imunitária contra a doença. São conhecidos, no estado da técnica, antigénios capazes de gerar uma resposta imunitária contra uma doença degenerativa. Exemplos desses estão descritos em WO 2005/072777 e Gelinas et al. (2004) para gerar uma resposta imunitária para o tratamento da doença de Alzheimer, e em WO 2005/034995 para gerar uma resposta imunitária para o tratamento de doenças relacionadas com priões. O antigénio pode ser fornecido de qualquer forma conhecida do estado da técnica, que conduza a uma ersposta imunitária. Um antigénio pode ser, por exemplo, nativo, recombinante ou sintético.
As vacinas podem ser preparadas a partir de um ou mais antigénios. A preparação de vacinas que contêm um antigénio são conhecidas do especialista. Estas vacinas são preferencialmente preparadas como injectáveis, ou orais, quer sob a forma de soluções liquidas ou suspensões; podem também ser preparadas sob formas sólidas adequadas para serem solubilizadas ou suspensas em liquido antes da injeção ou consumo oral. A preparação pode também ser emulsionada, ou a proteina ser encapsulada em lipossomas. O antigénio é frequentemente misturado com agentes de suporte/excipientes que sejam farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente ativo. Agentes de suporte/excipientes adequados são, por exemplo, água, 43 cloreto de sódio, dextrose, glicerol, etanol, ou similar e combinações destes.
Adicionalmente, e se desejado, a vacina pode conter quantidades menores de substâncias auxiliares como agentes de humedecimento ou emulsionantes, agentes tampão de pH e/ou adjuvantes que melhorem a eficácia da vacina.
As vacinas contêm tipicamente um adjuvante. Como usado na presente invenção, o termo "adjuvante" significa uma substância que aumenta a resposta imunitária a um antigénio, de forma não especifica. Exemplos de adjuvantes, que possam ser eficazes incluem, mas não se limitam a: N-acetilo-muramilo-L-treonilo-D-isoglutamina (tre-MDP), N-acetilo-nor-muramilo-L-alanilo-D-isoglutamina (CGP 11637, referido como nor-MDP), N-acetilinurailo-L-alanilo-D-isoglutaminilo-L-alanino-2-(1'-2'-dipalmitoílo-sn-glicero-3-hidróxifosforilóxi)-etilamina (CGP 19835A, referido como MTP-PE), e RIBI, os quais contêm três componentes extraídos de bactérias, lípido A monofosforilo, dimicolato de trialose e esqueleto da parede celular (MPL+TDM+CWS) numa emulsão de 2% esqualeno/Tween80. Exemplos adicionais de adjuvantes incleum hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de potássio de alumínio (alum), endotoxina bacteriana, lípido X, Corynebacterium parvum (Propionobacterium acnes), Bordetella pertussis, polirribonucleótidos, alginato de sódio, lanolina, lisolecitina, vitamina A, saponina, lipossomas, levamisol, DEAE-dextrano, copolímeros bloqueados ou outros adjuvantes sintéticos. Adjuvantes deste tipo estão comercialmente disponíveis de várias fontes, por exemplo, Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N. J.) ou adjuvante incompleto e completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, Michigan). 44 A proporção de antigénio e adjuvante pode variar ao longo de um intervalo alargado, desde que ambos estejam presentes em quantidades eficazes. Por exemplo, o hidróxido de aluminio pode estar presenet numa quantidade de cerca de 0,5% da mistura da vacina (AI2O3 em forma de base) . As vacinas são formuladas, de forma conveniente, para conterem uma concentração final do polipéptido antigénico num intervalo entre 0,2 a 200 yg/mL, de preferência de 5 a 50 yg/mL, sendo particularmente preferível 15 yg/mL.
Após a formulação, a vacina pode ser incorporada num contentor estéril o qual é em seguida selado e armazenado a uma baixa temperatura, por exemplo 4°C, ou pode ser liofilizado. A liofilização permite um armazenamento a longo prazo numa forma estabilizada.
As vacinas são convencionalmente administradas parentericamente, por injeção, por exemplo, quer subcutaneamente ou intramuscularmente. Formulações adicionais que sejam adequadas para outros modos de administração incluem supositórios e, em alguns casos, formulações orais. Para supositórios, agenets de suporte tradicionais podem incluir, por exemplo, polialquilenoglicóis ou triglicéridos; supositórios deste tipo podem ser formados a partir de misturas contendo o ingrediente ativo num intervalo de 0,5% a 10%, de preferência 1% a 2%. As formulações orais incluem excipientes usados normalmente, como por exemplo, manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio e similares, de pureza farmacêutica. Estas composições assumem a forma de soluções, suspensões, comprimidos, cápsulas, formulações de libertação retardada ou pós, e contêm entre 10% a 95% do 45 ingrediente ativo, de preferência entre 25% e 70%. No caso de a vacina ser liofilizada, o material liofilizado pode ser reconstituído antes da administração, e. g. sob a forma de uma suspensão. A reconstituição é preferencialmente realizada em tampão.
As cápsulas e comprimidos para administração oral podem ser fornecidas ao doente com uma cobertura entérica, incluindo por exemplo, Eudragit "S", Eudragit "L", acetato de celulose, ftalato de acetato de celulose ou hidróxipropilometilo celulose. A vacinação de DNA envolve a introdução direta in vivo do DNA codificante do antigénio nos tecidos de un indivíduo para a expressão do antigénio pelas células do tecido do indivíduo. Estas vacinas são chamadas na presente invenção "vacinas de DNA" ou "vacinas baseadas em ácido nucleico". As vacinas de DNA são descritas em US 5,939,400, US 6,110,898, WO 95/20660 e WO 93/19183, sendo que as suas invenções são aqui incorporadas integralmente como referência.
Até ao momento, a maioria das vacinas de DNA nos sistemas de mamífero tem tirado partido de promotores virais derivados de citomegalovirus (CMV). Estes têm tido uma boa eficiência tanto na inoculação na pele e no músculo, num número variado de espécies de mamífero. Um fator conhecido por afetar a resposta imunitária obtida após uma imunização de DNA é o método de administração do DNA, por exemplo, vias parentéricas podem ter taxas reduzidas de trasnferência génica e produzem uma variabilidade considerável na expressão génica. A inoculação de plasmídeos a alta velocidade, usando uma pistola de DNA, aumenta as respostas imunitárias de ratinhos, 46 presumivelmente devido a uma maior eficiência de transfeção do DNA e uma mais eficaz apresentação dos antigénios por parte das células dendriticas. Os vetores usados na presente invenção que contêm a vacina baseada em ácidos nucleicos podem também ser introduzidos no hospedeiro desejado através de outros métodos conhecidos do estado da técnica, e. g. transfeção, eletroporação, microinjeção, transdução, fusão celular, EAE dextrano, precipitação de fosfato de cálcio, lipofeção (fusão de lisossomas), ou um transportador de um vetor de DNA.
Podem ser construídas plantas transgénicas produzindo um polipéptido antigénico, utilizando procedimentos bem conhecidos do estado da técnica. Várias vacinas comestíveis derivadas de plantas estão atualmente em desenvolvimento tanto para patogénios humanos como animais. As respostas imunitárias também resultaram de imunização oral com plantas transgénicas produzindo partículas semelhantes a vírus (VLPs), ou vírus quiméricos de plantas que apresentem epitopos antigénicos. Foi sugerido que a forma particulada destes VLPs ou vírus quiméricos, possa resultar numa maior estabilidade do antigénio no estômago, aumentando efetivamente a quantidade de antigénio disponível para absorção no intestino.
EXEMPLOS
Exemplo 1
Fornecidos em seguida são exemplos de ensaios típicos usados para monitorizar alguns marcadores inflamatórios de fase aguda.
Proteína reativa C 47 A proteína reativa C foi medida usando um DADE Behring Dimension RxL Chemistry Analyser, com reagentes e calibradores fornecidos por DADE Behring Diagnostics (Sydney, Austrália) (reagente N° Catálogo DF-34, calibrador N° catálogo DC-34). 0 método CRP é baseado numa técnica de ensaio imunológico de turbidimetria de partícula melhorada. Partículas de latex cobertas com anticorpos contra a proteína reativa C agregam na presença de proteína reativa C na amostra. 0 aumento da turbidez, o qual acompanha a agregação é proporcional à concentração da proteína reativa C.
PRECISÃO INTRA-ENSAIO PRECISÃO INTER-ENSAIO MEDIA mg/L cv N MÉDIA mg/L CV N 3,4 4,3% 20 4,6 5, 6% 64 57,5 2,3% 20 37,0 3, 0% 64 225, 8 2,0% 20 Intervalo de Referência: 0-5 mg/L Intervalo analítico: 0,5 - 500 mg/L
Recetor da Interleuquina 2 (IL2R) 0 recetor da citocina interleuquina 2 (IL2R) é medido através de um ensaio imunológico enzimático automático (EIA) comercial quimioluminescente usando um Immulite Analyser da Diagnostic Products Corporation (Los Angeles, CA, USA).
Este é um ensaio imunológico competitivo que usa uma IL2R marcada com fosfatase alcalina como marcador e dioxetano de adamantilo enquanto substrato luminescente para a enzima ALP.
Todos os reagentes e calibradores são fornecidos sob a forma de kit pela DPC - n° de catálogo LKIPZ.
Desempenho analítico: 48 48 Média DP cv % Nível 1 213 U/mL 13 6,1 Nível 2 752 U/mL 49 6, 5 Nível 3 2463 U/mL 189 7,7 Intervalo analítico: 5-7,500 U/mL Intervalo de referência: 223/710 U/mL* * estudo realizado em 87 indivíduos aparentemente saudáveis.
Interleuquina 6 um ensaio automático Products A citoquina interleuquina 6 é medida através de imunológico enzimático (EIA) quimioluminescente usando um Immulite Analyser da Diagnostic Corporation (Los Angeles, CA, USA) .
Este é um ensaio imunológico competitivo usando a IL-6 acoplada à fosfatase alcalina como marcador e dioxetano de adamantilo como substrato luminescente para a enzima ALP.
Todos os reagentes e calibradores são fornecidos sob a forma de um kit pela DPC - número de catálogo LK6PZ.
Desempenho analítico Média DP CV % Nível 1 88 pg/mL 4,5 5,1 Nível 2 230 pg/mL 12,2 5,3 Nível 3 638 pg/mL 46, 6 7,3 Intervalo analítico: 2-1000 pg/mL Intervalo de referência: < 4,1 pg/mL* * estudo realizado em 60 voluntários aparentemente saudáveis.
Interleuquina 10 A citoquina interleuquina 10 é medida através de um ensaio imunológico enzimático (EIA) quimioluminescente automático usando um Immulite Analyser da Diagnostic Products Corporation (Los Angeles, CA, USA) . 49
Este é um ensaio imunológico competitivo usando a IL-10 acoplada à fosfatase alcalina como marcador e dioxetano de adamantilo como substrato luminescente para a enzima ALP.
Todos os reagentes e calibradores são fornecidos sob a forma de um kit pela DPC - número de catálogo LKXPZ.
Desempenho analítico: Média DP CV % Nível 1 18,2 pg/mL 1,8 9, 9 Nível 2 46,0 pg/mL 2,2 co ^r1 Nível 3 177 pg/mL 8 LO ^r1 INTERVALO ANALÍTICO : 5-1000 pg/mL INTERVALO DE REFERÊNCIA: <9,1 pg/mL* * estudo realizado em 55 adultos aparentemente saudáveis.
Amiloide A do soro
Partículas de poliestireno cobertas com anticorpos dirigidos a SAA humana são aglutinadas quando misturadas com amostras contendo SAA. A intensidade da dispersão da luz no nefelómetro depende da concentração do analito na amostra e consequentemente a sua concentração pode ser determinada através de diluições de um padrão de concentração conhecida.
IMPRECISÃO: CV 4,7% @ 192 mg/L N=404 CV 2,8% @ 7,0mg/mL O ^r1 II INTERVALO DE REFERÊNCIA: Numa população com níveis de CRP normais no soro (percentil 95 = 5,0 mg/L N=483) o percentil 95 para o SAA látex N foi determinado ser 6,4 mg/L. INTERVALO ANALÍTICO: 3,0 - 200 mg/L_
Complemento C3 O método automático usado para medir a concentração do complemento C3 em amostras de soro através da análise nefelométrica usando um analisador DADE Behring ProSpect com reagentes e calibradores fornecidos por DADE Behring Diagnostics (Sydney, Austrália). 50 A solução de antigénio solúvel (amostra) e os anticorpos específicos (antisoro n° de catálogo OSAP 15) são misturados nas cuvettes de reação. Os complexos anticorpo-antigénio insolúveis formam-se imediatamente, produzindo turbidez na mistura e aumento a quantidade de dispersão de luz da solução. No seguimento de um período de incubação, a absorvância da solução é medida no comprimento de onda analítico.
IMPRECISÃO: CV 5,5% Θ 1,05 g/L \—1 KO II £ CV 3,2% Θ 2,70 g/L \—1 KO II £ INTERVALO DE REFERÊNCIA: 0,81 - 1,85 g/L. INTERVALO ANALÍTICO: 0,10 - 3,5 g/L
Complemento C4 O método automático usado para medir a concentração do complemento C4 em amostras de soro através da análise nefelométrica usando um analisador DADE Behring ProSpect com reagentes e calibradores fornecidos por DADE Behring Diagnostics (Sydney, Austrália). A solução de antigénio solúvel (amostra) e os anticorpos específicos (antisoro n° de catálogo OSAO 15) são misturados nas cuvettes de reação. Os complexos anticorpo-antigénio insolúveis formam-se imediatamente, produzindo turbidez na mistura e aumento a quantidade de dispersão de luz da solução. No seguimento de um período de incubação, a absorvância da solução é medida no comprimento de onda analítico.
IMPRECISÃO: CV 4,7% @ 0,20 g/L \—1 KO II £ CV 3,8% @ 0,53 g/L \—1 KO II £ INTERVALO DE REFERÊNCIA: 0,10 - 0,40 g/L. INTERVALO ANALÍTICO: 0,03 - 1,50 g/L
Exemplo 2
Como é do conhecimento do especialista, existem semelhanças entre uma doença autoimune e cancro. Mais especificamente, uma doença autoimune é caracterizada por uma resposta 51 imunitária contra antigénios próprios. Da mesma forma, o sistema imunitário de um doente com cancro reconhece a sobrexpressão de antigénios (antigénios cancerígenos) por células cancerosas e aumentam a resposta imunitária contra estas células. Contudo, pelo menos em algumas circunstâncias, a resposta imunitária às células cancerosas não controla eficazmente o cancro, resultando na persistência da doença. Assim, o ciclo do sistema imunitário em doentes de cancro, é um modelo adequado para mostrar um ciclo semelhante em indivíduos com uma doença autoimune. 0 doente era uma mulher de 71 anos de idade, aqui referida como "Sra. FO". Anteriormente, a Sra. FO foi diagnosticada com cancro de ovário, foi submetida a cirurgia e vários ciclos de quimioterapia padrão. A doente apresentava niveis elevados de CA125 a 200 U/mL antes da participação no estudo de monitorização. A doente foi monitorizada (colheitas de sangue) a cada segunda, quarta e sexta-feira, durante 4 semanas. Foi descrita uma oscilação regular e praticamente sincronizada com uma periodicidade 7/14 dias, mostrando uma correlação forte entre as medições de CRP, SAA e IL-2 no soro (ver figuras 1 e 2) . Adicionalmente, a figura 3 que mostra as medições de CRP e CA125 com o tempo, as oscilações de CRP e CA125 estão fora de fase, indicando uma relação inversa entre o sistema imunitário e o marcador cancerígeno. A figura 4 mostra a relação com o tempo entre SAA e o fator de complemento C3. É de notar que os dois picos C3 maiores estão aproximadamente separados 14 dias e coincidem com picos alternantes de SAA, os quais estão igualmente separados aproximadamente 14 dias. 52
Exemplos adicionais de ciclos do sistema imunitário em doentes com cancro são descritos em WO 2005/040816.
Exemplo 3 É executada uma pesquisa por um dador adequado para um doente com glomerulonefrite crónica, necessitando de um alotransplante renal de cadáver. O alotransplante é executado através de procedimentos cirúrgicos padrão. Após se completar o alotransplante, são monitorizados os niveis de amiloide A do soro do doente. Quando os niveis de SAA começam a aumentar, isto indica que uma resposta imunitária está a ser desenvolvida contra o transplante, caracterizada pela produção de células efetoras contra o transplante (também referida, no estado da técnica, como rejeição).
Um exemplo de niveis de SAA e de proteína reativa C (CRP) após um alotransplante renal de cadáver é descrito por Maury e Teppo (1984) . Como pode ser visto na figura 4 de Maury e Teppo (1984), existe aproximadamente um período de 15 dias entre os níveis máximos de CRP e SAA ligados a episódios de rejeição, após o transplante, indicando que as células efetoras se encontram em ciclo no doente estudado. A vinblastina é administrada intravenosamente a uma dose padrão como 3-4 mg/m2 (Casciato e Lowitz, 1995) , à medida que os níveis de SAA começam a subir. Neste caso, a vinblastina vai atacar as células em divisão, como as células efetoras, aliviando o episódio de rejeição.
Exemplo 4
Num doente com artrite juvenil crónica são monitorizados os níveis de SAA. Após o estabelecimento de um ciclo claro e evidente nos níveis de SAA, é administrada vincristina, 53 usando uma dosagem padrão, à medida que os níveis de SAA começam a aumentar. Neste caso, a vincristina vai afetar as células em divisão, como as células efetoras, neste ponto do ciclo imunitário, aliviando os sintomas da doença.
Um exemplo de ciclo de níveis de proteína SAA num doente com artrite juvenil crónica é descrito por Elliott et al., (1997). Como pode ser visto na figura 2 de Elliott et al., (1997), existe aproximadamente um período de 14 dias entre os níveis máximos de SAA. Se a monitorização for executada com maior frequência, é expectável que um ciclo semelhante se torne mais visível igualmente para os níveis de CRP.
Exemplo 5
Os níveis de proteína reativa C são monitorizados num doente com doença de Alzheimer. Após o estabelecimento de um ciclo claro e evidente dos níveis de proteína reativa C é administrada vincristina, usando uma dosagem padrão, na altura em que a proteína reativa C atingiu o máximo. Neste caso, a vincristina vai atuar sobre as células em divisão, como as células regulatórias, neste ponto do ciclo imunitário, aliviando os sintomas da doença.
Referências cruzadas a pedidos relacionados A presente aplicação reivindica prioridade sobre o pedido provisório de patente n° 2004905118, apresentado a 8 de setembro de 2004.
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Lisboa, 17 de Abril de 2012

Claims (9)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para analisar o ciclo do sistema imunitário para a determinação de quando um agente deve ser administrado a um doente que sofra de uma doença caracterizada pela produção de células T efetoras ou uma doença degenerativa, o método compreendendo a monitorização no doente, ou em amostras obtidas dele, de flutuações em pelo menos um dos seguintes fatores: a) os números e/ou atividade das células T efetoras, b) números e/ou atividade das células T regulatórias, c) um marcador molecular associado a uma doença, e/ou d) um marcador de sistema imunitário; na qual a doença é caracterizada pela produção de células T efetoras: (i) a doença ser uma doença autoimune ou rejeição do transplante; (ii) o agente inibe a produção, limita a função de e/ou atividade das células T efetoras, sendo selecionado de um grupo composto por fármacos antiproliferativos, fármacos antimetabólicos, radiação, dsRNA e anticorpos; e (iii) o momento em que o agente deve ser administrado é quando, ou imediatamente antes, as células T efetoras começarem a sua expansão clonal, de forma a que a expansão das células T efetoras não ocorra, e/ou os números de células T efetoras são reduzidas ou abolidas; e caracterizado por se a doença for uma doença degenerativa: 2 (i) a doença ser uma condição que resulta na perda de células, e ser a doença de Alzheimer ou uma doença relacionada com priões; e (ii) o agente: (a) inibe a produção, limita a função de e/ou a atividade de células T regulatórias, sendo selecionado a partir do grupo constituído por fármacos antiproliferativos, fármacos antimetabólicos, radiação, dsRNA e anticorpos; e o momento em que o agente deve ser administrado é tal que o agente exerça um efeito proporcionalmente maior contra as células T regulatórias do que contra as células T efetoras; ou (b) é uma vacina, e o momento em que a vacina deva ser administrada é tal que a vacina aumente a resposta imunitária inata, produzindo números e/ou atividade aumentados das células T efetoras, antes da emergência de células T regulatórias.
2. Método da reivindicação 1, caracterizado por o marcador do sistema imunitário é um marcador inflamatório de fase aguda.
3. Método da reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado por o doente estar a sofrer de uma doença, caracterizada pela produção de células T efetoras, e caracterizado por o agente ser administrado entre quando os niveis de um marcador inflamatório de fase aguda tenham chegado ao seu ponto mais reduzido e antes do marcador atingir o máximo no próximo ciclo. 3
4. Método de acordo com uma das reinvindicações 1 a 3, caracterizado por as células T efetoras são células T CD8+CD4-.
5. Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por as células T regulatórias serem células T CD4+CD8-.
6. Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o doente ser monitorizado por um periodo de pelo menos 7 dias.
7. Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, no qual o doente é monitorizado pelo menos a cada 3 dias.
8. Uso de um agente que inibe a produção, limita a função de e/ou a atividade de células T efetoras no fabrico de um medicamento para o tratamento de uma doença caracterizada pela produção de células T efetoras, sendo que o tratamento inclui: i) analisar o ciclo do sistema imunitário pela monitorização de um doente que sofra da doença, para identificar flutuações em pelo menos uma de a) número e/ou atividade de células T regulatórias, b) número e/ou atividade de células T efetoras, c) um marcador maolecular associada à doença e/ou d) um marcador do sistema imunitário, e ii) expondo o doente a um agente para o tratamento da doença, caracterizado por: 4 (a) a doença ser uma doença autoimune ou rejeição de transplante: (b) o agente é escolhido a partir do grupo constituído por fármacos antiproliferativos, fármacos antimetabólicos, radiação, dsRNA e anticorpos; e (c) o agente ser administrado aquando, ou imediatamente antes, de as células T efetoras se expandirem clonalmente de forma a que a expansão das células T efetoras não ocorra, e/ou números de células T efetoras são reduzidas ou abolidas.
9. Uso de um agente para o fabrico de um fármaco para o tratamento de uma doença degenerativa, o tratamento consistindo: i) analisando o ciclo do sistema imunitário através da monitorização de um doente que sofre da doença para a deteção de flutuações em pelo menos uma: a) número e/ou atividade de células T regulatórias, b) número e/ou atividade de células T efetoras, c) um marcador molecular associado à doença, e/ou d) um marcador do sistema imunitário, e ii) expondo o doente a um agente que trate a doença, caracterizado por: (a) a doença é uma condição que resulta na perda de células e é uma doença Alzheimer ou uma doença relacionada com priões; e (b) o agente: (i) inibe a produção, limita a função e/ou atividade das células T regulatórias e é selecionado do grupo 5 consistindo por um fármaco antiproliferativo, fármacos antimetabólicos, radiação, dsRNA e anticorpos; e o momento da administração do agente é tal que o agente exerça um efeito proporcionalmente superior contra as células T regulatórias do que contra as células T efetoras; ou (ii) é uma vacina; e o momento da administração da vacina é tal que a vacina aumenta a resposta imunitária inata, produzindo números mais elevados e/ou maior atividade de células T efetoras, antes do aparecimento das células T regulatórias. Lisboa, 17 de Abril de 2012
PT05777835T 2004-09-08 2005-09-08 Estratégia terapêutica para o tratamento de doenças autoimunes e doenças degenerativas PT1805510E (pt)

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