PT1758609E - Vacina contra hpv16 e hpv18 e, pelo menos, outro tipo de hpv seleccionado de hpv31, 45 ou 52 - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "VACINA CONTRA HPV16 E HPV18 E, PELO MENOS, OUTRO TIPO DE HPV SELECCIONADO DE HPV31, 45 OU 52" A presente invenção refere-se a vacinas contra papilomavirus humanos.

Antecedentes da Invenção

Os papilomavirus são pequenos vírus tumorais de ADN, que são altamente específicos para a espécie. Até agora, mais de 100 genótipos de papilomavirus humanos individuais foram descritos. Os HPV são geralmente específicos para a pele (e. g., HPV-1 e 2) ou superfícies mucosas (e. g., HPV-β e 11) e, normalmente, causam tumores benignos (verrugas) que persistem por diversos meses ou anos. Tais tumores benignos podem ser penosos para os indivíduos envolvidos, no entanto, tendem a não ameaçar a vida, com algumas excepções.

Alguns HPV estão também associados com cancros, conhecidos como tipos de HPV oncogénicos. A associação positiva mais forte entre um cancro HPV e humano é aquela que existe entre o HPV-16 e HPV-18 e o carcinoma cervical. O cancro cervical é a malignidade mais comum nos países em desenvolvimento, com cerca de 500 000 novos casos a ocorrer no mundo em cada ano.

Outros HPV de particular interesse com respeito a cancro são os tipos 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82, 1 26, 53 e 66.

Partículas semelhantes a vírus HPV (VLP) foram sugeridas como potenciais vacinas para o tratamento de HPV. Foi demonstrado que uma vacina bivalente, utilizando VLP, é eficaz na prevenção da infecção com HPV tipos 16 e 18 em mulheres jovens (Lancet, vol. 364, edição 9447, Novembro de 2004, páginas 1757 - 1765). 0 documento WO 03/077942 divulga uma composição de vacina composta por uma mistura de proporção igual de HPV 16, 18, 31 e 45. Há ainda uma necessidade de uma vacina que proteja contra múltiplos tipos de HPV (e. g., > 2). A presente invenção trata desta necessidade.

Resumo da invenção A presente invenção refere-se a uma composição imunogénica compreendendo VLP de HPV 16 e 18 e, pelo menos, um outro tipo de cancro por HPV, sendo o outro tipo de cancro seleccionado da lista consistindo nos HPV tipo 31, 45 e 52, em que a dose das VLP de, pelo menos, um outro tipo de cancro, é reduzida em relação à do HPV 16 ou 18. A invenção refere-se, ainda, a uma composição imunogénica como definido acima, em combinação com um adjuvante e/ou veículo. A invenção refere-se, ainda, a uma vacina compreendendo uma composição imunogénica como definido acima, com um excipiente 2 farmaceuticamente aceitável. A invenção refere-se, ainda, a um método de prevenir a infecção e/ou doença por HPV, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade desta uma composição ou vacina como acima definido. A invenção refere-se, ainda, a um método para produzir uma composição imunogénica como definido acima, compreendendo a mistura de VLP de HPV 16 e 18 com, pelo menos, um outro tipo de cancro por HPV, sendo o outro tipo de cancro seleccionado da lista consistindo em HPV de tipos 31, 45 e 52, em que a dose das VLP de, pelo menos, um outro tipo de cancro é reduzida em relação ao do HPV 16 ou 18.

Os aspectos acima da invenção podem também empregar capsómeros de HPV, em vez de VLP.

Descrição Detalhada A requerente determinou, surpreendentemente que as VLP de HPV 16 e 18 proporcionam protecção cruzada contra a infecção e/ou doença por determinados outros tipos de cancro por HPV, isto é, HPV 31, HPV 45 e HPV 52. São fornecidos dados nestes exemplos. A protecção cruzada pode ser considerada como a protecção proporcionada por uma vacina contendo um tipo de HPV contra infecção (incidente ou persistente) e/ou doença causada por um tipo de HPV diferente. A infecção incidente e persistente é definida como no artigo de Lancet por Harper et al., Vol. 364, 3 edição 9447, Novembro de 2004, págs. 1757 - 1765. A protecção cruzada pode ser avaliada considerando-se a eficácia da vacina (V.E.), em que a V.E. é a % da melhoria na protecção contra a infecção pela vacina, em comparação com um grupo placebo para um determinado tipo.

Por conseguinte, as vacinas HPV compreendendo as VLP de HPV 16 e 18, podem ser formuladas utilizando uma dose mais baixa de VLP de outro (não HPV 16/18) tipo de cancro (31, 45 ou 52) do que seria de outro modo necessário na ausência de VLP de HPV 16 e 18, embora se consiga ainda a mesma resposta protectora contra infecção incidente e/ou persistente por HPV para esse outro tipo. A redução da dose de VLP de outro tipo de cancro, num cenário de vacina multivalente, sem impacto significativo na protecção causada por esses outros tipos, pode ser vantajosa quando a quantidade total de antigénio pode ser limitada; por exemplo, por restrições físicas, químicas ou reguladoras. Permite, também, que sejam produzidas mais doses de uma vacina para uma determinada quantidade de antigénio e pode, potencialmente, reduzir o custo total da vacina. A dose das VLP aqui é adequadamente a quantidade de VLP, medida em peso.

Em outras palavras, para se obter a mesma resposta protectora contra infecção e/ou doença incidente e/ou persistente, a dose das VLP (não HPV 16/HPV 18) de "outro tipo de cancro", que necessita de ser utilizada em combinação com VLP de HPV 16 e HPV 18, pode ser reduzida em comparação com o nível que é necessário na ausência deste tipo de VLP 16 e/ou 18. 4 deste modo, a uma composição 16 e 18 e, pelo menos, um o outro tipo de cancro HPV de tipo 31, 45 e 52, um outro tipo de cancro é A invenção refere-se, imunogénica compreendendo VLP de HPV outro tipo de cancro HPV, sendo seleccionado da lista consistindo nos em que a dose das VLP do pelo menos reduzida em relação à do HPV 16 ou 18.

Num aspecto alternativo, a invenção refere-se a uma composição imunogénica compreendendo VLP de HPV 16 e 18 e pelo menos um outro tipo de cancro por HPV, sendo o outro tipo de cancro seleccionado da lista consistindo em HPV de tipos 31, 45 e 52, em que a dose das VLP de pelo menos um outro tipo de cancro é reduzida em relação à que de outro modo seria requerida, na ausência de VLP de HPV 16 e 18, para produzir a mesma protecção contra a infecção por HPV incidente e/ou persistente por esse outro tipo de cancro.

Num aspecto, a dose da VLP (não HPV 16, 18) do outro tipo de cancro é suficiente para fornecer protecção contra infecção incidente e/ou persistente por esse tipo e, em num aspecto da invenção, a protecção contra, pelo menos, uma infecção incidente.

Num aspecto da invenção, a composição da invenção é adequada para a protecção de infecção e/ou doença em indivíduos humanos.

Uma dose adequada pode ser determinada por, por exemplo, experiências em humanos, tais como as aqui descritas nos exemplos. 5 A protecção vs. infecção incidente e/ou persistente por um dado tipo de HPV, tais como HPV 16, 18, 31, 45 ou 52, por exemplo, é adequadamente, protecção em 50% de uma população vacinada contra a infecção por aquele tipo e, num aspecto da invenção, é protecção em 60%, num outro aspecto, protecção em 70%, num outro aspecto, protecção em 80%, num outro aspecto, protecção em 90%, num outro aspecto, protecção em 95%, num outro aspecto, protecção em 96%, num outro aspecto, protecção em 97%, num outro aspecto, protecção em 98%, num outro aspecto, protecção em 99% e ainda num outro aspecto, protecção em 100%.

Adequadamente, esta protecção é avaliada durante um período de, pelo menos, 6 meses, tal como durante um período de , pelo menos, 9 meses, pelo menos, 1 ano, pelo menos, 18 meses, adequadamente, durante um período de 2 anos ou mais do que 2 anos. Num aspecto da invenção, a protecção é vista contra infecção ou doença causada por HPV 16 e/ou HPV 18 e, num aspecto, a infecção e/ou doença por HPV 16 e HPV 18. A prevenção da infecção pode ser avaliada por análise de espécies de HPV presentes em indivíduos vacinados, por exemplo, por análise PCR e/ou técnicas de hibridação, tais como as descritas nos documentos WO03014402 e W09914377, aqui incorporados por referência.

Quando a composição imunogénica da invenção compreende VLP de HPV 16 e 18, então as VLP de tipo de cancro não HPV 16/18 é tipo 31, ou tipo 45 ou tipo 52, ou uma sua combinação destes. Num aspecto, a composição imunogénica da invenção compreende as VLP de HPV 16, 18, 31 e 45. Num aspecto, a composição 6 imunogénica da invenção compreende VLP de HPV 16, 18, 31 e 52.

Num aspecto, a composição imunogénica da invenção compreende VLP de HPV 16, 18, 45 e 52. Num aspecto, a composição imunogénica da invenção compreende VLP de HPV 16, 18, 31, 52 e 45. Quando existem 2 ou mais VLP de outros tipos de cancro (e. g., 31 e 45, 31 e 52, 45 e 52), então pelo menos um destes dos outros tipos de cancro está presente numa dose que é reduzida relativamente à de HPV 16 ou HPV 18.

Num aspecto, a dose de HPV 31 é reduzida em relação à de HPV 16.

Num aspecto, a dose de HPV 52 é reduzida em relação à de HPV 16.

Num aspecto, a dose de HPV 45 é reduzida em relação à de HPV 18.

Adequadamente, as composições imunogénicas, como definido acima, fornecem protecção contra infecção incidente e/ou infecção persistente e/ou doença causada por HPV 16, HPV 18 e um ou mais dos outros tipos de HPV (31, 45 ou 52) presentes nos grupos listados acima, tal como a infecção incidente.

Quando uma composição imunogénica da invenção compreende VLP de HPV 16, mas não VLP de HPV 18, então, adequadamente, o tipo de cancro das VLP de HPV 16/18 é o tipo 31 e/ou o tipo 52.

Quando uma composição imunogénica da invenção compreende VLP de HPV 18, mas não VLP de HPV 16, então, adequadamente, o tipo de cancro não HPV 16/18 é o tipo 45. 7

Num aspecto da invenção, a composição compreende VLP de HPV 16 e 18, em combinação com VLP de um ou ambos os HPV 31 e HPV 45.

Num aspecto da invenção, a composição compreende, pelo menos, VLP de HPV 16, em combinação com VLP de HPV 31. A composição da invenção pode compreender, além das VLP em dose reduzida, outras VLP de HPV em qualquer dose adequada. Por exemplo, a composição da invenção pode compreender tipos de cancro de "alto risco" adicionais, tais como um ou mais de HPV 33, 35, 39, 51, 56, 58, 59, 66 ou 68.

Num aspecto, a composição pode compreender tipos adicionais chamados de tipos de "verrugas genitais", tais como HPV 6 e/ou 11, ou chamados de tipos de "pele", tais como HPV 5 e/ou 8. Num aspecto, as VLP adicionais estão presentes na mesma dose ou superior à da HPV 16 e/ou HPV 18.

Num aspecto da invenção, a composição compreende VLP de HPV 39 e/ou HPV 51 e a dose de pelo menos uma destas, é reduzida em relação à de HPV 16 e/ou HPV 18.

Num aspecto, a quantidade de VLP adicional é seleccionada de modo a fornecer algum grau de protecção contra infecção ou doença em relação ao(s) tipo(s) adicional(ais).

Certas composições da invenção, individualizadas abaixo, compreendem a seguinte dose de VLP: Número da Composição VLP de HPV 16 (pg) VLP de HPV 18 (pg) VLP de HPV 31 (pg) VLP de HPV 45 (pg) 1 20 20 10 10 2 20 30 10 10 3 20 30 20 20 4 30 20 10 10 5 30 20 20 20

Adequadamente, não há interferência significativa ou biologicamente importante entre as VLP de HPV da composição da invenção, de modo que a vacina VLP combinada da invenção é capaz de oferecer protecção eficaz contra a infecção por cada tipo de VLP de HPV representado na vacina. Adequadamente, a resposta imunitária contra um dado tipo de VLP da combinação é de, pelo menos, 50% da resposta imunitária do mesmo tipo de VLP, quando medida individualmente, de um modo preferido, 100% ou, substancialmente, 100%. Para respostas aos componentes de VLP de HPV 16 e HPV 18, a vacina combinada da invenção estimula, de um modo preferido, uma resposta imunitária, que é de, pelo menos, 50% da proporcionada por uma vacina de VLP de HPV 16/HPV 18 combinados. Adequadamente, a resposta imunitária, produzida pela vacina da invenção é a um nivel em que o efeito protector de cada tipo de VLP é ainda observado. A resposta imunitária pode adequadamente ser medida, por exemplo, por respostas de anticorpo, empregando-se técnicas convencionais, tais como ELISA e por experiências clínicas, como aqui descrito.

Num aspecto, a composição da invenção não compreende uma proteína de choque térmico ou um seu fragmento. 9

Num aspecto, a composição da invenção não compreende uma proteína ou péptido L2 de HPV. Em outro aspecto, a composição da invenção compreende uma proteína ou péptido L2 de HPV.

As VLP de HPV e os métodos para a produção de VLP são bem conhecidos na técnica. As VLP são, tipicamente, construídas pelas proteínas estruturais LI e, opcionalmente, L2 do vírus, ver, por exemplo, os documentos WO9420137, W09629413 e WO9405792. Quaisquer VLP de HPV adequadas podem ser utilizadas na presente invenção, tais como VLP de LI ou LI + L2. A formação de VLP pode ser avaliada por técnicas padrão, tais como, por exemplo, microscopia electrónica e dispersão dinâmica de luz laser.

Num aspecto da invenção, as VLP é uma VLP somente de Ll. A VLP podem compreender a proteína Ll de comprimento total.

Num aspecto da invenção, a proteína Ll utilizada para formar as VLP, é uma proteína Ll truncada. As proteínas Ll de HPV truncadas são divulgadas, por exemplo, no documento US6361778, aqui incorporado por referência. Num aspecto, a truncagem remove um sinal de localização nuclear. Num outro aspecto, a truncagem é uma truncagem no terminal C. Num outro aspecto adicional, a truncagem no terminal C remove menos do que 50 aminoácidos, adequadamente, de um modo preferido, menos do que 40 aminoácidos. Adequadamente, a sequência de Ll de HPV 16 começa no segundo codão da metionina, por exemplo, como mostrado na sequência a seguir, ou posições análogas dos outros tipos de HPV. Onde a VLP é uma VLP de HPV 16, então, num aspecto, a truncagem no terminal C remove 34 aminoácidos da sequência Ll de 10 HPV 16. Onde a VLP é uma VLP de HPV 18, então, num aspecto, a truncagem de terminal C remove 35 aminoácidos da sequência LI de HPV 18.

Num aspecto, a sequência HPV 16 é a seguinte: MSLWLPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVARTNIYYHAGTSRLLAVGHPYFPIKICPNNNKI 60 LVPKVSGLQYRVFRIHLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGISGH 120 PLLNKLDDTENASAYAANAGVDNRECISMDYKQTQLCLIGCKPPIGEHWGKGSPCTNVAV 180 NPGDCPPLELJNTVIQDGDMVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDICTSICKYPDYIKMVSE 240 PYGDSLFFYLRREQMFVRHLFNRAGAVGENVPDDLYIKGSGSTANLASSNYFPTPSGSMV 300 TSDAQIFNKPYWLQRAQGHNNG1CWGNQLFVTVVDTTRSTNMSLCAAISTSETTYKNTNF 360 KEYLRHGEEYDLQFIFQLCKITLTADVMTYIHSMNSTILEDWNFGLQPPPGGTLEDTYRF 420 VTSQA1ACQKHTPPAPKEDPLKK.YTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQ 471 A sequência HPV 16 pode também ser a divulgada nos documentos WO9405792 ou US6649167, por exemplo, adequadamente truncada. Os truncados adequados são truncados numa posição equivalente à mostrada acima, como avaliado pela comparação de sequência.

Num aspecto, a sequência HPV 18 é a seguinte sequência: MALWRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFRVPAGGGNKQ 60

Dl PKVS A YQYRVFRVQLPDPNKFG LPDNSIYNPETQRLVWACVG VEIGRGQPLGVGLSGH 120 PFYNKLDDTESSHAATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPL 180 SQGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSAD 240 PYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTMGDTVPPSLYIKGTGMRASPGSCVYSPSPSGSIV 300 TSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLT1CASTQSPVPGQYDATK 360 FKQYSRHVEEYDLQF1FQLCTITLTADVMSY1HSMNSSILEDWNFGVPPPPTTSLVDTYR 420 FVQSVAITCQKDAAPAENKDPYDKLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQ 472 É descrita uma sequência HPV 18 alternativa no documento W09629413, que pode ser adequadamente truncada. Os truncados 11 adequados sao truncados numa posição equivalente à mostrada acima, como avaliado pela comparação de sequência.

Outras sequências de HPV 16 e HPV 18 são bem conhecidas na técnica e podem ser adequadas para utilização na presente invenção.

As truncaqens adequadas de HPV 31, HPV 45 e HPV 52 podem também ser feitas, adequadamente, removendo-se as partes de terminal C equivalentes da proteína LI das descritas acima, como estimado pelo alinhamento de sequência.

As proteínas LI truncadas são divulgadas, por exemplo, nos documentos WO 9611272 e US6066324, aqui incorporados por referência.

Num aspecto, as proteínas LI truncadas são derivadas da proteína Ll, adequadamente funcionais, capazes de provocar uma resposta imunitária (se necessário, quando adequadamente auxiliada), sendo a referida resposta imunitária capaz de reconhecer VLP consistindo da proteína Ll de comprimento total e/ou do tipo HPV de que a proteína Ll é derivada.

As VLP da invenção podem também compreender outros tipos de derivados de proteína funcionais, incluindo mutantes das proteínas Ll de HPV de comprimento total ou truncadas, tais como mutantes de deleção, substituição ou inserção. A proteína Ll ou derivado pode também ser uma proteína de fusão, tal como a fusão da proteína Ll com L2 ou uma proteína precoce. A proteína ou derivado de proteína funcional Ll é capaz de formar uma VLP e a formação de VLP pode ser avaliada por técnicas convencionais, tais como, por exemplo, microscopia electrónica e dispersão 12 dinâmica de luz laser.

As VLP podem ser produzidas em qualquer substrato de célula adequado, tal como células de levedura ou células de insecto, e. g., células de baculovirus, e as técnicas para preparação das VLP são bem conhecidas na técnica, tais como os documentos WO9913056 e US6245568 e suas referências, cujo conteúdo completo é por este meio incorporado por referência.

Num aspecto, as VLP são produzidas por técnicas de desmontagem e remontagem, que podem proporcionar VLP de papilomavírus mais estáveis e/ou homogéneas. Por exemplo, McCarthy et al., 1998, "Quantitative Disassembly and Reassembly of Human Papillomavirus Type 11 Viruslike Particles in Vitro", J. Virology 72(1):33-41, descreve a desmontagem e remontagem de VLP de LI recombinantes de HPV 11, purificadas de células de insectos, de modo a se obter uma preparação homogénea de VLP. Os documentos WO9913056 e US6245568 também descrevem processos de desmontagem/remontagem para produzir VLP de HPV.

Num aspecto, as VLP de HPV da invenção são produzidas como descrito nos documentos WO9913056 ou US6245568.

As VLP da invenção podem ser combinadas com um adjuvante ou imunoestimulante, tal como, mas não limitado a, lípido A destoxifiçado de qualquer fonte e derivados não tóxicos de lipido A, saponinas e outros reagentes capazes de estimular uma resposta do tipo TH1. É há muito tempo sabido que o lipopolissacárido (LPS) enterobacteriano é um potente estimulador do sistema imunitário, embora a sua utilização em adjuvantes tenha sido reduzida pelos 13 seus efeitos tóxicos. Um derivado não tóxico de LPS, o monofosforil lípido A (MPL), produzido por remoção do grupo carbo-hidrato do núcleo e do fosfato da glicosamina de término reduzido, foi descrito por Ribi et al., (1986, Immunology and

Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, págs. 407 - 419) e tem a seguinte estrutura:

Uma outra versão destoxifiçada de MPL resulta da remoção da cadeia acilo da posição-3 da cadeia principal de dissacárido e é chamada monofosforil lípido A 3-O-Desacilado (3D-MPL). Ele pode ser purificado e preparado pelos métodos ensinados no documento GB 2122204B, cuja referência também descreve a preparação de difosforil lípido A e suas variantes 3-O-desaciladas.

Num aspecto, o 3D-MPL está na forma de uma emulsão tendo um tamanho de partícula pequeno, inferior a 0,2 pm de diâmetro e seu método de preparação é descrito no documento WO 94/21292. As 14 formulações aquosas compreendendo monofosforil lípido A e um tensioactivo foram descritas no documento WO9843670A2.

Os adjuvantes derivados de lipopolissacárido bacteriano, a serem formulados nas composições da presente invenção, podem ser purificados e processados de fontes bacterianas ou, alternativamente, estes podem ser sintéticos. Por exemplo, o monofosforil lípido A purificado é descrito em Ribi et al., 1986 (supra) e o monofosforil 3-0-Desacilado ou derivado de difosforil lípido A derivado de Salmonella sp. é descrito nos documentos GB 2220211 e US 4912094. Outros lipopolissacáridos sintéticos foram descritos (Hilgers et al., 1986, Int. Arch. Allergy Immunol., 79(4): 392-6; Hilgers et al., 1987, Immunology, 60(1) : 141-6; e EP 0 549 074 Bl) . Num aspecto, o adjuvante de lipopolissacárido bacteriano é 3D-MPL.

Por conseguinte, os derivados de LPS, que podem ser utilizados na presente invenção, são aqueles imunoestimulantes que são de estrutura semelhante à de LPS ou MPL ou 3D-MPL. Num outro aspecto da presente invenção, os derivados de LPS podem ser um monossacarído acilado, que é uma sub-parte da estrutura de MPL acima.

As saponinas são mostradas em: Lacaille-Dubois, M e Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 págs. 363 - 386). As saponinas são glicosídeos esteróides ou triterpenos, largamente distribuídos nos reinos animal, vegetal e marinho. As saponinas são observadas por formarem soluções coloidais em água que produzem espuma com agitação e por precipitarem colesterol. Quando as saponinas estão próximas das membranas celulares, elas criam estruturas semelhantes a poros na membrana, que fazem com 15 que a membrana rebente. A hemólise de eritrócitos é um exemplo deste fenómeno, que é uma propriedade de certas, no entanto, não todas, as saponinas.

As saponinas são conhecidas como adjuvantes em vacinas para administração sistémica. A actividade adjuvante e hemolitica das saponinas individuais tem sido extensamente estudada na técnica (Lacaille-Dubois e Wagner, supra). Por exemplo, Quil A (derivado da casca da árvore sul americana Quillaja Saponaria Molina) e as suas fracções são descritas no documento US 5057540 e "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2): 1 - 55; e documento EP 0362279 BI. As estruturas particulares, denominadas Complexos Imunitários Estimulantes (ISCOMS), compreendendo fracções de Quil A, são hemoliticas e têm sido utilizadas na preparação de vacinas (Morein, B., documentos EP 0109942 Bl; W096/11711; W096/33739). As saponinas hemoliticas QS21 e QS17 (fracções de Quil A purificadas por HPLC) foram descritas como potentes adjuvantes sistémicos e o método da sua produção é descrita na Patente US N° 5057540 e documento EP 0362279 Bl. Outras saponinas que foram utilizadas em estudos de vacinação sistémica incluem aquelas derivadas de outras espécies de planta, tais como Gypsophila e Saponaria (Bomford et ai., Vaccine, 10(9): 572 -577, 1992).

Um sistema melhorado envolve a combinação de um derivado de lipido A não tóxico e um derivado de saponina, particularmente a combinação de QS21 e 3D-MPL, como divulgado no documento WO 94/00153, ou uma composição menos reactogénica, em que QS21 é extinto com colesterol, como divulgado no documento WO 96/33739. 16

Num aspecto, o adjuvante é uma formulação adjuvante particularmente potente, envolvendo QS21 e 3D-MPL numa emulsão de óleo em água, é descrito no documento WO 95/17210.

Por conseguinte, numa forma de realização da presente invenção, é proporcionado uma composição com adjuvante com lípido A destoxicado ou um derivado não tóxico de lípido A, de um modo mais preferido, auxiliado com um monofosforil lípido A ou seu derivado.

Num aspecto, a composição compreende, adicionalmente, uma saponina, de um modo mais preferido, QS21.

Num aspecto, a formulação de adjuvante, compreende, adicionalmente, uma emulsão de óleo em água. A presente invenção também fornece um método para produzir uma formulação de vacina, compreendendo a mistura de uma VLP da presente invenção em conjunto com um excipiente farmaceuticamente aceitável, tal como 3D-MPL.

Os componentes adicionais que estão, de um modo preferido, presentes numa composição com adjuvante de acordo com a presente invenção, incluem detergentes não-iónicos, tais como os octoxinóis e ésteres de polioxietileno como aqui descrito, particularmente t-octilfenóxipolietoxietanol (Triton X-100) e monooleato de polioxietileno sorbitano (Tween 80); e sais biliares ou derivados do ácido eólico, como aqui descrito, em particular, desoxicolato ou taurodeoxicolato de sódio. Num aspecto, a formulação adjuvante compreende 3D-MPL, Triton X-100, Tween 80 e dioxicolato de sódio, que podem ser combinados com uma VLP de HPV, para fornecer uma vacina adequada. 17

Numa forma de realização da presente invenção, a composição compreende uma formulação adjuvante vesicular compreendendo colesterol, uma saponina e um derivado de LPS. A este respeito, a formulação adjuvante pode compreender uma vesícula unilaminar compreendendo colesterol, tendo uma bicamada lipídica compreendendo, adequadamente, dioleoilfosfatidilcolina, em que a saponina e o derivado de LPS são associados com, ou embutidos, dentro da camada lipídica. De um modo mais preferido, estas formulações adjuvantes compreendem QS21 como a saponina e 3D-MPL como o derivado de LPS, em que a relação de QS21:colesterol é de 1:1 a 1:100 peso/peso e, de um modo mais preferido, 1:5 peso/peso. Tais formulações adjuvantes são descritas no documento EP 0822831 B, cuja divulqação é aqui incorporada por referência.

Num aspecto, as composições da invenção são utilizadas em combinação com alumínio e são adequadamente adsorvidas ou parcialmente adsorvidas em adjuvantes de alumínio. Adequadamente, o adjuvante é um sal de alumínio, que, num aspecto, está em combinação com 3D MPL, tal como fosfato de alumínio e 3D MPL. Em outro aspecto, o adjuvante é hidróxido de alumínio, opcionalmente em combinação com 3D MPL.

Noutro aspecto, a composição é a combinação de VLP com um sal de alumínio ou com um sal de alumínio + 3D MPL. Num aspecto da invenção, o sal de alumínio é hidróxido de alumínio. A composição da invenção pode também compreender alumínio ou um composto de alumínio como um estabilizador.

A presente invenção refere-se, geralmente, a combinações de VLP. No entanto, entende-se que o componente essencial da VLP 18 seja uma proteína Ll. As proteínas LI associam-se para formar pentâmeros (capsómeros) que, então, formam mosaicos (se reúnem) para formar VLP. Como tal, a presente invenção refere-se, também, a composições imunogénicas como descrito acima, compreendendo as proteínas Ll ou capsómeros compreendendo proteínas Ll, em lugar das VLP, como aqui descrito. Adequadamente, as proteínas Ll são capazes de estimular uma resposta imunitária protectora. Adequadamente, as proteínas Ll são conformacionalmente correctas.

Para evitar dúvida, a invenção refere-se, também, deste modo, à utilização de derivados Ll funcionais, como descrito acima, tais como Ll truncados, mutantes de deleção, substituição ou inserção e proteínas de fusão, adequadamente as que são capazes de provocar uma resposta imunitária capaz de reconhecer um vírus HPV. Os capsómeros compreendendo tais proteínas são também incluídos na presente invenção. Os capsómeros como agentes imunogénicos são descritos, por exemplo, no documento WO 0204007. O documento WO 9901557 também divulga composições contendo o capsómero de HPV. As proteínas, derivados e capsómeros de Ll podem ser utilizados do mesmo modo como descrito para os VLP acima.

Assim, a invenção pode ser vista como relacionando-se com uma composição imunogénica compreendendo uma proteína Ll, ou seu derivado funcional, de HPV 16 e 18 e pelo menos um outro tipo de cancro por HPV, sendo o outro tipo de cancro seleccionado da lista consistindo em HPV tipo 31, 45 e 52, em que a dose da proteína Ll ou seu derivado, do pelo menos um outro tipo de cancro, é reduzida em relação à de HPV 16 ou 18. 19

Assim, a invenção pode ser vista como relacionando-se com uma composição imunogénica compreendendo um capsómero de HPV de HPV 16 e 18 e pelo menos um outro tipo de cancro de HPV, sendo o outro tipo de cancro seleccionado da lista consistindo de HPV tipos 31, 45 e 52, em que a dose do capsómero do pelo menos um outro tipo de cancro é reduzida em relação à de HPV 16 ou 18.

Num aspecto, a invenção refere-se a uma composição imunogénica, como discutido acima, em combinação com um excipiente farmaceuticamente aceitável. Os excipientes adequados são bem conhecidos na técnica e incluem tampões e água, por exemplo.

As composições e vacinas da invenção podem ser proporcionadas e distribuídas por qualquer uma de várias vias, tais como a via oral, tópica, subcutânea, mucosa (tipicamente intravaginal), intravenosa, intramuscular, intranasal, sublingual, intradérmica e supositório.

Num aspecto da invenção, a composição ou vacina pode ser formulada ou co-administrada com um antigénio precoce de HPV, por exemplo, um antigénio seleccionado da lista consistindo nos El, E2, E3, E4, E5, E6, E7 e E8 de HPV. Num aspecto alternativo, a vacina pode não ter um antigénio precoce de HPV, por exemplo, um antigénio seleccionado da lista consistindo nos El, E2, E3, E4, E5, E6, E7 e E8 de HPV.

Opcionalmente, a composição formulada ou co-administrada Adequadamente, estes antigénios protecção contra outras doenças, doenças sexualmente transmitidas, ou vacina pode, também, ser com antigénios não-HPV. não-HPV podem proporcionar de um modo muito preferido, tais como o vírus do herpes 20 simplex, EBV, clamídia e HIV. Particularmente, prefere-se que a composição ou vacina compreenda gD ou um seu truncado de HSV, adequadamente, um truncado de terminal C de HSV-2 conhecido como gD2t. Deste modo, a composição ou vacina proporciona protecção contra HPV e HSV. A dosagem da composição ou componentes da vacina variará com a condição, sexo, idade e peso do indivíduo, a via de administração e o HPV da vacina. A quantidade pode também ser variada com o número de tipos de VLP. Adequadamente, a distribuição é de uma quantidade de vacina adequada para gerar uma resposta imunologicamente protectora. Adequadamente, cada dose de vacina compreende de 1-100 pg de cada VLP, num aspecto, 5-80 pg, num outro aspecto 5-30 pg de cada VLP, num outro aspecto, 5-20 pg de cada VLP, com ainda outros aspectos sendo especificamente 5 pg, 6 pg, 15 pg ou 20 pg.

As doses adequadas para utilização em humanos incluem, tipicamente, 20-40 pg de VLP de HPV e HPV 18, com doses reduzidas dos outros tipos de cancro por HPV (31, 45, 52), como aqui descrito, adequadamente num nível menor do que 20 pg por VLP, adequadamente num nível que é capaz de provocar uma resposta imunitária protectora em, pelo menos, alguns indivíduos vacinados.

Outras doses adequadas para utilização em humanos podem compreender quantidades menores de HPV 16 e/ou 18, desde que estas doses sejam protectoras de humanos, como pode ser avaliado utilizando as experiências aqui descritas. Tais doses podem ser apropriadas quando as VLP da invenção são combinadas com adjuvantes fortes, por exemplo. 21

Num aspecto, a composição da invenção compreende 20 pg de HPV 16, 20 pg de HPV 18 e entre 5-18 pg de cada VLP do outro tipo de cancro (31, 45 ou 52), por exemplo, 5-15 pg e, num outro aspecto, especif icamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 14 ou 15 pg de VLP de cada tipo de cancro de HPV 16/18.

Num aspecto, a composição da invenção compreende 10-15 pg de HPV 16, 10-15 pg de HPV 18 e entre 5-9 pg de cada VLP do outro tipo de cancro (31, 45 ou 52) e num aspecto especif icamente 5, 6, 7, 8 ou 9 pg de VLP de cada tipo de cancro não-HPV 16/18.

Num aspecto, a proporção em peso de VLP de HPV 16 para VLP de outro tipo de cancro (31, 45, ou 52) está na faixa de 1:0,9 - 1:0,1 (HPV 16: outro tipo), adequadamente na faixa de 1:0,9 - 1:0,3, adequadamente 1:0,8 - 1:0,4.

Num aspecto, a relação em peso de VLP de HPV 18 para VLP de outro tipo de cancro (31, 45 ou 52) é de 1:0,9 - 1:0,1 (HPV 18: outro tipo), adequadamente, na faixa de 1:0,9 - 1:0,3, adequadamente 1:08, - 1:0,4.

Em outras palavras, uma dose reduzida é, adequadamente, de 10 - 90% da dose de VLP de HPV 16 ou HPV 18 e, num aspecto, é de 20 - 80% da dose de VLP de HPV 16 ou HPV 18, num outro aspecto, de 30 - 70%, ainda noutro aspecto, de 30 - 60% e, especificamente, de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%,70%, 80% ou 90% da dose de HPV 16 ou HPV 18.

Num aspecto, a composição é adequadamente utilizada para evitar uma ou mais de: infecção por HPV-16 e/ou HPV-18, infecção persistente por HPV-16 e/ou HPV-18 e neoplasia cervical 22 associada com HPV-16 e/ou HPV-18.

Adequadamente, a utilização da composição imunogénica da invenção é feita para evitar neoplasia cervical e/ou infecção incidente e/ou infecção persistente associadas com infecção por outros tipos oncogénicos (não HPV 16, 18).

Adequadamente, a composição imunogénica da invenção é utilizada na imunização activa de adultos e adolescentes femininas da idade de 10 anos em diante. Para todas as composições e vacinas da invenção , a composição ou vacina é adequadamente utilizada para a vacinação de meninas adolescentes com a idade de 10-15, de um modo preferido, de 10-13 anos. A composição ou vacina pode também ser administrada a mulheres adultas mais velhas, em seguida, a um esfregaço de Pap anormal ou após cirurgia em após a remoção de uma lesão causada por HPV ou que sejam soronegativas e ADN negativas para tipos de cancro por HPV. Mulheres de 10-55 anos são outro grupo alvo adequado. Em outro aspecto, a vacina pode ser utilizada em meninas e mulheres de todas as idades, desde bebés e, num outro aspecto, pode ser dada em meninos ou homens. Num outro aspecto, a vacina pode ser utilizada terapeuticamente em mulheres que são soropositivas para o vírus HPV.

Num aspecto, a composição da invenção é utilizada para evitar ou tratar cancro cervical ou os estados doentios CIN I, CIN II ou CIN III causados por infecção por HPV.

Num aspecto, a vacina é distribuída num regime de 2 ou 3 doses, por exemplo, num regime de 0, 1 mês, um regime de 0, 2 meses, um regime de 0, 2, 6 meses ou um regime de 0,1 e 6 meses, respectivamente. Adequadamente, o regime de vacinação 23 incorpora uma injecçao de reforço após 3 a 10 anos ou 5-10 anos, tal como, de um modo preferido 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 anos.

Num aspecto, a composição ou vacina da invenção é uma formulação de vacina liquida, embora a vacina possa ser liofilizada e reconstituída antes da administração. As formulações tópicas, tais como cremes intravaginais, podem também ser utilizadas, por exemplo. O ensinamento de todas as referências do presente pedido, incluindo pedidos de patente e patentes concedidas, é aqui totalmente incorporado por referência.

As composições e vacinas da invenção compreendem certos componentes de HPV como exposto acima. Num outro aspecto da invenção, a vacina consiste essencialmente em ou consiste nos referidos componentes. A presente invenção é por este meio ilustrada por referência aos seguintes exemplos não-limitativos, relativos à protecção cruzada por VLP de HPV 16 e HPV 18 e que mostram a produção de VLP de HPV:

Exemplo 1

Mulheres saudáveis entre as idades de 15 e 25 anos foram imunizadas com uma mistura de VLP de LI de HPV 16 e HPV 18. As mulheres do alistamento eram: 1) soronegativas para HPV-16 e HPV-18; 2) negativas para infecçao por HPV de alto risco da cérvix (detectada por PCR de HPV); 3) tinham tido 6 ou menos

parceiros sexuais durante a vida e 4) tinham esfregaços PAP normais . A mistura compreendeu, por dose de 0,5 mL, 20 pg de VLP de Ll de HPV-16, 20 pg de VLP de LI de HPV-18 e foi auxiliada com 500 pg de hidróxido de alumínio e 50 pg de 3D MPL. O grupo placebo foi injectado com apenas 500 pg de hidróxido de alumínio. A eficácia da vacina (V.E.) contra os tipos de cancro de HPV de alto risco foi avaliada, em que a V.E. é a % da melhoria da protecção contra infecção pela vacina, em comparação com um grupo placebo. A protecção cruzada foi avaliada detectando-se a presença de ácido nucleico específico para vários tipos oncogénicos das vacinas e grupo de controlo. A detecção foi realizada utilizando técnicas como as descritas no documento W003014402 e suas referências, particularmente para amplificação não-específica de ADN de HPV e subsequente detecção de tipos de ADN empregando um sistema LiPA, como descrito no documento W099/14377 e em Kleter et ai., [Journal of Clinicai Microbiology (1999), 37 (8): 2508 -2517], cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência.

Qualquer método adequado pode, no entanto, ser utilizado para a detecção do ADN de HPV numa amostra, tal como PCR específico para o tipo, empregando iniciadores específicos para cada tipo de HPV de interesse. Os iniciadores adequados são conhecidos dos especialistas na técnica ou podem ser facilmente construídos, visto que as sequências dos tipos de HPV oncogénicos são conhecidas. 25 todos A eficácia da vacina foi avaliada contra infecções para os 12 tipos de cancro de alto risco, tipos filogeneticamente relacionados com HPV-16 (os grupos de: 31, 35 e 58; 31, 33, 35, 52 e 58) e tipos f ilogeneticamente relacionados com HPV-18 (45 e 59).

Uma análise inicial foi realizada num "ITT" (Coorte de Intenção de Tratar, representando todos os indivíduos que receberam, pelo menos, uma dose da vacina) . Estes dados são mostrados na Tabela 1.

Os resultados apresentados nas Tabelas 2 e 3 relacionam-se com o grupo "ATP" (de acordo com o protocolo) para aqueles doentes que satisfizeram todos os critérios da experiência. A Tabela 2 é uma análise do ponto médio com dados retirados de todos os doentes no ponto de tempo em que, pelo menos, 50% do coorte tinha 18 meses após sua primeira vacinação. A Tabela 3 dá os resultados finais, sendo todos os dados de indivíduos com 18 meses após primeira vacinação (mês 0). No grupo ATP, todos os doentes receberam 3 doses de vacina a 0, 1 e 6 meses e foram soronegativos aos 6 meses.

Como demonstrado pelos dados apresentados na tabela 1, a imunização com uma mistura de VLP de HPV16 e HPV18 forneceu protecção cruzada evidente contra outros tipos de HPV. Neste ponto, os tamanhos das amostras são demasiado pequenos para fornecer uma análise estatística rigorosa, no entanto, os dados demonstram uma tendência positiva e sugerem que a imunização com VLP de HPV16 e HPV18 será eficaz contra infecção com outros tipos de HPV.

Isto foi confirmado à medida que o estudo prosseguia. 26

Detalhes do protocolo sao adicionalmente descritos no Exemplo 3. A Tabela 2 demonstra que HPV 16 e HPV 18 fornecem protecção cruzada estatisticamente significativa contra os tipos de grupo de cancro de alto risco 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68. A Tabela 3 demonstra que, excepto para os tipos relacionados com HPV-18 (que mostram uma tendência muito forte), existe uma protecção cruzada estatisticamente significativa contra os grupos de: HPV 31, 35, 58; HPV 31, 33, 35, 52, 58; e os 12 tipos de alto risco (não HPV-16/18) avaliados. A análise posterior dos dados experimentais indicou que a vacina de HPV 16 e 18 combinados, utilizada nos Exemplos 1, fornece protecção cruzada estatisticamente significativa contra a estatística de infecção incidente por HPV 31 (eficácia da vacina 75,1%, p = 0, 007). Embora o tamanho da amostra não permita ainda que conclusões estatisticamente significativas sejam extraídas sobre outros tipos, os dados sobre os outros tipos, tais como 39, 45, 51 e 52, demonstram uma tendência positiva e sugerem que a imunização com VLP de HPV16 e HPV18 será eficaz contra infecção com outros tipos de HPV.

Os dados apresentados no Exemplo 3 fornecem mais dados obtidos no mesmo estudo e concentram-se na protecção cruzada proporcionada contra certos tipos específicos. 27 2 8

Tabela 1 Tipos de HPV analisados Número de mulheres infectadas (grupo vacina) \ mulheres infectadas (grupo de vacina) = A Número de mulheres infectadas (grupo placebo) \ mulheres infectadas (grupo placebo) = B \ eficácia vacina 1 - (A/B) x 100, ajustado para tamanho relativo de vacina e grupo placebo 95¾ limites de confiança -limite inferior 95¾ limites de confiança -limite superior P HPV 31, 35, 58 5 U 11 2,4 55,1 -29,1 84,4 0,127 HPV 31, 33, 35, 52, 58 17 3,8 24 5,4 30,3 -29,7 62,6 0,252 HPV 45, 59 3 0,7 6 1,3 50,6 -97,7 87,6 0,309 HPV 31, 33, 35,39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 27 6,3 40 9,4 34,6 -6,5 59,9 0,086 As amostras foram retiradas a 9, 12, 15 e 18 meses dos doentes e testadas quanto à infecção por HPV pelos tipos especificados acima.

Tabela 2 - Eficácia da vacina após três doses na prevenção de infecções heterólogas incidentes

Tabela 2: Eficácia da vacina contra infecção por tipos filogeneticamente relacionados de HPV-16, tipos filogeneticamente relacionados de HPV-18, tipos filogeneticamente relacionados de HPV-16 e/ou HPV-18 e todos os tipos de alto risco, exclusivamente do coorte ATP - HPV-16 e HPV-18 (6 - 18 meses)

Tipo de Infecção Taxa de ataque Eficácia da vacina Vacina Placebo N n AR N n AR * 95¾ IC Valor de p HPV-16 relacionado 433 12 2,8 438 24 5,5 49,4 0,2 74,4 0,060 HPV-16 relacionado* 423 29 6,9 423 46 10,9 37,0 1,6 59,6 0,052 HPV-18 relacionado 442 9 2,0 449 16 3,6 42,9 -27,9 74,5 0,223 HPV-16/18 433 21 4,9 438 41 9,4 48,2 13,8 68,9 0,012 relacionado HPV-16/18 423 34 8,0 423 56 13,2 39,3 9,0 59,5 0,019 relacionado* Alto Risco** 385 53 13,8 386 88 22,8 39,6 17,7 55,7 0,001 N = número de indivíduos em coorte específico

n = número de indivíduos com infecção incidente por HPV

AR = Taxa de ataque = n/N 95% Cl = 95% de intervalo de confiança limite inferior = 1 - exp (log (arv / arp) + 1,96 * sqrt (1/nv ~1/Nv + 1/np ~ 1/Np) limite superior = 1 - exp (log (arv / arp) - 1,96 * sqrt (1/nv ~1/Nv + 1/np ~ 1/Np)) quando o número de casos da vacina = 0: limite inferior* = 1 - exp (log (arv* / arp*) + 1,96 * sqrt (1/(nv + 0,5) - 1/(Nv + 0,5) + 1/(np + 0,5) - 1/(Np + 0,5))) limite superior* = 1- 1 - exp (log (arv* / arp*) - 1,96 * sqrt (1/(nv + 0,5) - 1/(Nv + 0,5) + 1/(np + 0,5) - 1/(Np + 0,5)))

com: arv = taxa de ataque em receptores de vacina arp = taxa de ataque em receptores de placebo nv = número de casos de receptores de vacina Nv = número de casos e não casos em receptores de vacina np = número de casos em receptores de placebo Np = número de casos e não casos em receptores de placebo HPV-16 relacionado: tipos filogeneticamente relacionados de HPV-16 tipos 35, 31, 58, sem considerar outros tipos de HPV 3 Ο

HPV-16 relacionado*: tipos filogeneticamente relacionados de HPV-16 35, 31, 58, 33, 52, sem considerar outros tipos HPV

HPV-18 relacionado: tipos filogeneticamente relacionados de HPV-18 45, 59, sem considerar outros tipos de HPV

HPV-16 e/ou HPV-18 relacionados: tipos filogeneticamente relacionados HPV-16 e/ou HPV-18, sem considerar outros tipos de HPV HPV-16 e/ou HPV-18 relacionados*: tipos filogeneticamente relacionados HPV-16 e/ou HPV-18 35, 31, 58, 33, 52, 45, 59, sem considerar outros tipos de HPV ** = tipos de alto risco exclusivos de HPV-16 e HPV-18

Tabela 3

Tipos de HPV analisados Número total de número de indivíduos com informação disponível por grupo Número de mulheres infectadas (grupo vacina) % mulheres infectadas (grupo vacina) = A Número de mulheres infectadas (grupo placebo) % de mulheres infectadas (grupo placebo) = B % eficácia vacina, 1 -(A/B) x 100, ajustado para tamanho relativo de grupo de vacina e placebo 95¾ de limites de confiança -limite inferior 95¾ de limites de confiança -limite superior P HPV 31,35,58 412 11 2,7 26 6,3 57,9 15,9 78,9 0,012 HPV 31, 33, 35, 52, 58 403 28 6,9 48 12,2 43,0 11,0 63,5 0,015 HPV 45, 59 421 10 2,4 15 3,6 33,5 -46,3 69,8 0,319 HPV31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 368 58 15,8 90 25,3 37,7 16,2 53,6 0,002

As amostras foram retiradas aos 18 meses dos doentes e testadas quanto a ínfecção por HPV pelos tipos especificados acima.

Exemplo 2

As VLP de HPV 16 e HPV 18 podem ser produzidas do seguinte modo:

Exemplo 1 A combinação das VLP de LI de HPV 16 e de HPV 18 é aqui detalhada. As proteínas de LI de outros genótipos HPV podem ser prontamente produzidas por métodos semelhantes, já conhecidos na técnica. A Preparação de VLP de LI de HPV16/18 A produção de VLP de HPV 16 e HPV 18 foi realizada utilizando protocolos convencionais - por exemplo, ver documento WO9913056. As proteínas HPV 16/18 foram expressas em células de Trichoplusia ni (High Five™) (numa densidade de -350000 células/mL) infectadas com Baculovírus recombinante (MOI de 0,3) codificando o gene de interesse LI de HPV 16 ou 18. As células foram recolhidas, aproximadamente, 72 horas após infecção. 4.1 B Colheita de Células/extracção de antigénio

O antigénio (Ll—16/18) foi extraído de células Hi5 num processo de três etapas de concentração, extracção, clarificação. A etapa de concentração remove até 90% do meio de cultura e foi realizada por filtragem de fluxo tangencial. A 32 etapa de extracção foi realizado com um tampão hipotónico (Tris a 2 0 mM, pH 8,5). Um volume igual ao volume da cultura foi utilizado para realizar a extracção. Foi utilizado um tempo de contacto de no minimo meia hora sob agitação suave. A clarificação foi realizada por filtragem de fluxo tangencial. C Purificação O processo de purificação foi realizado em temperatura ambiente. Foi adicionado β-mercaptoetanol (4% p/p) ao extracto, de modo a desmontar as VLP em capsómeros, para ambos os antigénios, Ll-16/18 . Foi adicionado glicerol até uma concentração p/p de 10% precisamente antes da adição de β-mercaptoetanol.

Todos os tampões utilizados foram filtrados em filtros de 0,22 pm antes do armazenamento a 2 °C-8 °C. Antes de cada realização da purificação, as matrizes de gel são sanitizadas e equilibradas com tampão apropriado antes da aplicação da amostra.

Os regimes de purificação são fornecidos para a purificação separada de LI de tanto HPV 16 como 18. Estes esquemas são amplamente semelhantes e envolvem as etapas de:

Cromatografia de troca aniónica (Dimetilaminoetil - DMAE),

Cromatografia de troca aniónica (trimetilaminoetil - TMAE),

Cromatografia de hidroxiapatite, 33

Filtragem nanométrica (Planova),

Ultrafiltração,

Cromatografia de interacção hidrofóbica (empregando Octil Sepharose) para HPV 18 ou Cromatrografia de troca aniónica (DEAE) para HPV 16; e

Filtragem estéril. 4.1.1 Especificamente: 4.1.2 Cl Purificação de antigénio Ll-18

4.1.2.1 Cromatografia de troca aniónica DMAE 0 extracto clarificado (proteína numa concentração de ~ 1 g/mL, com a proteína LI a -150 mg/mL) é aplicado a uma coluna de troca aniónica (DiMetilAminoEtil). A eluição é realizada com tampão (Tris a 20 mM|NaCl a 200 mM|4% de β-mercaptoetanol BME) , pH 7,9 ± 0,2. O antigénio é eluído em, aproximadamente, 5 volumes de coluna e o perfil de eluição é monitorizado a 280 nm.

4.1.2.2 Cromatografia de troca aniónica TMAE O eluído da primeira etapa é diluído com 1 volume de H20/BME a 4%. O eluído diluído é, então, aplicado a uma segunda coluna de troca aniónica (TriMetilAminoEtil). A eluição é realizada com 34 tampão (20 mM de Tris|NaCl a 200 mM|4% BME) , pH 7,9 ± 0,2. O antigénio é eluído em, aproximadamente, 4 volumes de coluna e o perfil de eluição é monitorizado a 280 nm. 4.1.2.3 Cromatografia de hidroxiapatite O eluído da etapa TMAE é aplicado a uma coluna de hidroxiapatite (HA) . Após aplicação da amostra, o gel é eluído com, aproximadamente, 2,5 volumes de coluna de tampão (NaH2PC>4 a 100 mMINaCl a 30 mM|4% de BME), pH 6,0 ± 0,2. 4.1.2.4 Filtragem nanométrica (Planova) 0 eluído de HA é diluído de modo a alcançar as seguintes condições: tampão (NaH2P04 a 25 Mm|NaCl a 10 mM|4% de BME), pH 7,5 ± 0,2.

Em seguida é filtrado sucessivamente num pré-filtro de 0,2 pm e num filtro Planova 15N de 0,12 m2. A filtragem é realizada em constante pressão de 200 mbar ± 20 mbar. 4.1.2.5 Ultrafiltração A ultrafiltração é realizada com um sistema de ultrafiltração de fluxo tangencial, equipado com membranas de poliétersulfona (cassete Centramate 0,1 m2, 100 kD) . 35 0 eluído da Planova é tratado para alcançar as seguintes condições: (NaH2P04 a 100 mM|NaCl a 30 mM|4% de BME) , pH 6,0 ± 0,2; em seguida, é carregado no sistema, concentrado 5 vezes e diafiltrado com injecção continua de ~10 volumes de partida de tampão (NaH2P04 a 20 mM|NaCl a 500 mM), pH 6,0 ± 0,2. 4.1.2.6 Cromatografia de interacção hidrofóbica (Octil Sepharose) O permeato da ultrafiltração é aplicado numa coluna de Octil Sepharose.

Esta etapa de cromatografia é realizada no modo negativo com, aproximadamente, 5 volumes de coluna de tampão (Na3P04 a 20 mM|NaCl a 500 mm), pH 6,0 ± 0,2. 4.1.2.7 Filtragem estéril A solução de antigénio Ll-18 purificada é esterilizada por filtragem em uma membrana de 0,22 pm. 36 4.1.3 4.1.4 C2 Purificação de antigénio Ll-16

4.1.4.1 Cromatografia de troca aniónica DMAE 0 extracto clarificado é aplicado a uma coluna de troca aniónica (DiMetilAminoEtil) . A eluição é realizada com tampão (Tris a 20 mM|NaCl a 180 mM|4% de BME), pH 7,9 ± 0,2. O antigénio é eluido em, aproximadamente, 4 volumes de coluna e o perfil de eluição é monitorizado a 280 nm.

4.1.4.2 Cromatografia de troca aniónica TMAE

O eluido da primeira etapa é diluído com 1 volume de H2O/BME a 4%. O eluido é, então, aplicado a uma segunda coluna de troca aniónica (TriMetilAminoEtil). A eluição é realizada com tampão (20 mM de Tris|NaCl a 180 mM|4% de BME), pH 7,9 ± 0,2. O antigénio é eluido em, aproximadamente, 5 volumes de coluna e o perfil de eluição é monitorizado a 280 nm. 4.1.4.3 Cromatografia de hidroxiapatite (HA) O eluido da etapa TMAE é aplicado a uma coluna HA. Após a aplicação da amostra, o gel é eluido com, aproximadamente, 3 volumes de coluna de tampão (NaH2P04 a 100 mm|NaCl a 30 mM|4% de BME), pH 6,0 ± 0,2. 37 4.1.4.4 Filtragem nanométrica (Planova) 0 eluído HA é diluído a fim de alcançar as seguintes condições: tampão (NaH2P04 a 25 mM|NaCl a 10 mM|4% de BME) , pH 7,5 ± 0,2. Em seguida é filtrado sucessivamente num pré-filtro de 0,2 pm e num filtro 15N Planova de 0,12 m2. A filtragem é realizada em pressão constante de 200 mbar ± 20 mbar. 4.1.4.5 Ultrafiltraçao A ultrafiltraçao é realizada com um sistema de ultrafiltração de fluxo tangencial (cassete Centramate 0,1 m2, 100 kD) . O eluído Planova é tratado para alcançar as seguintes condições: (NaH2P04 a 100 mM|NaCl a 30 mM|4% de BME), pH 6,0 ± 0,2; em seguida é isolado no sistema, concentrado 5 vezes e diafiltrado com injecção contínua de ~10 volumes de partida de tampão (NaH2P04 a 20 mM|NaCl a 500 mM), pH 6,0 ± 0,2.

4.1.4.6 Cromatografia de troca aniónica DEAE O eluído de ultrafiltração é ajustado à condutividade do tampão de equilíbrio, (Na3P04 a 20 mM|NaCl 250 mM) , pH 6,0 ± 0,2 e aplicado numa coluna de troca aniónica (DiEtilAminoEtil). A eluição é realizada com tampão (NaH2P04 a 20 mM|NaCl a 500 mM) , pH 6,0 ± 0,2. O antigénio é eluído em, aproximadamente, 3 volumes de coluna e o perfil de eluição é monitorizado a 280 nm. 38 4.1.4.7 Filtragem estéril A solução de antigénio Ll-16 purificado é esterilizada numa membrana de 0,22 μιη. C3

Cada tipo de VLP é adsorvido independentemente para produzir um monovalente adsorvido concentrado.

Preparação de VLP16 monovalente adsorvido concentrado: 60 pg de VLP purificadas de HPV16 são adsorvidas em 150 pg de Al3+ de AI (OH) 3, num pH de 6,0 ± 0,2, durante uma hora à temperatura ambiente com agitação suave. Este monovalente adsorvido concentrado é armazenado a +4 °C. A adsorção é verificada centrifugando a preparação e quantificando as VLP do sobrenadante.

Preparação de VLP18 monovalente adsorvido concentrado: 60 pg de VLP purificadas de HPV18 são adsorvidas em 150 pg de Al3+ de Al(OH)3, num pH de 6,0 ± 0,2, durante uma hora à temperatura ambiente com agitação suave. Este monovalente adsorvido concentrado é armazenado a +4 °C. A adsorção é verificada centrifugando a preparação e quantificando as VLP do sobrenadante. 39 D Preparação da vacina final:

Os monovalentes adsorvidos concentrados, preparados pelo método acima, podem ser combinados para formar uma suspensão contendo 20 pg de cada VLP por dose. A vacina final é armazenada a +4 °C. A adição das VLP de outros tipos de cancro pode ser feita como apropriado, em concentração adequada, de acordo com a presente invenção. As sequências destes tipos são bem conhecidas na técnica e as VLP compreendendo tais proteínas podem ser prontamente expressas pela pessoa especialista.

Os volumes adsorvidos combinados ou volumes adsorvidos individuais, podem ser ainda misturados com adjuvantes, tais como 3D-MPL.

Exemplo 3

Os detalhes precisos da experiência realizada são proporcionados em Harper et al., the Lancet. 13 de Nov de 2004; 364 (9447) :1757-65.

Em resumo, mulheres saudáveis entre as idades de 15 e 25 anos foram imunizadas com uma mistura de VLP de LI de HPV 16 e HPV 18. As mulheres no alistamento foram: 1) soronegativas para HPV-16 e HPV-18; 2) negativas para infecção por HPV de alto risco da cérvix (detectada por PCR de HPV); 3) tinham tido 6 ou menos parceiros sexuais durante a vida e 4) tinham tido esfregaços PAP normais. 40 A mistura consistiu, por 0,5 mL de dose, de 20 pg de VLP de LI HPV-16, 20 pg de VLP de Ll de HPV-18 e foi adjuvada com 50 pg de hidróxido de alumínio e 50 pg de MPL 3D. O grupo placebo foi injectado com apenas 500 pg de hidróxido de alumínio.

As VLP de HPV 16 consistem em 471 aminoácidos, de proteína Ll de HPV truncada no terminal C, com uma deleção de 34 aminoácidos. As VLP de HPV 18 consistem numa proteína de Ll de HPV de 472 aminoácidos truncados no terminal C, com uma deleção de 35 aminoácidos. A eficácia da vacina (V.E.) contra certos tipos de HPV de cancro foi avaliada, em que a V.E. é a % de melhoria na protecção contra infecção pela vacina, em comparação com um grupo placebo. A protecção cruzada foi avaliada detectando a presença de ácido nucleico específico para vários tipos oncogénicos das vacinas e grupo de controlo. A detecção foi realizada empregando-se técnicas como descritas no documento W003014402 e suas referências, particularmente para a amplificação não específica de ADN de HPV e subsequente detecção dos tipos de ADN, utilizando um sistema LiPA, como descrito no documento W099/14377 e em Kleter et al., [Journal of Clinicai Microbiology (1999), 37(8): 2508-2517], cujo teor completo é aqui especificamente incorporado por referência.

Qualquer método adequado pode, no entanto, ser utilizado para a detecção do ADN de HPV numa amostra, tal como um PCR específico de tipo, utilizando iniciadores específicos para cada tipo de HPV de interesse. Os iniciadores adequados são conhecidos da pessoa especialista ou podem ser facilmente 41 construídos, dado que as sequências dos tipos de HPV oncogénicos são conhecidas.

Em detalhe, a secção de métodos do documento de Lancet é reproduzida aqui a seguir, para completar:

Harper et al., the Lancet. 13 Novembro de 2004; 364 (9447): 1757-65 - detalhes experimentais. O objectivo primário deste estudo foi avaliar a eficácia da vacina na prevenção de infecção com HPV-16, HPV-18, ou ambos (HPV—16/18), entre os meses 6 e 18 nos principiantes que mostraram inicialmente ser soronegativos para HPV-16/18 por ELISA e negativos para ADN de HPV-16/18 por PCR. Os objectivos secundários incluíram: avaliação da eficácia da vacina na prevenção de infecção persistente com HPV-16/18 e a avaliação da eficácia da vacina na prevenção de lesões intraepiteliais escamosas de baixo grau (LSIL) , citologicamente confirmadas, lesões intraepiteliais escamosas de alto grau (HSIL) e LSIL (CIN 1) histologicamente confirmadas, cancro de célula escamosa HSIL (CIN 2 ou 3) ou adenocarcinoma associado com infecção por HPV-16/18 entre os meses 6 e 18 e meses 6 e 27. A prevenção de citologia de células escamosas atípicas de significância indeterminada (ASCUS), associada com infecção por HPV-16/18, foi adicionada post-hoc às análises efectuadas.

Fez-se também uma análise exploratória dos pontos finais histopatológicos CIN 1 e 2, associados com o ADN de HPV-16/18 detectado por PCR em tecido lesionado. Outros objectivos incluíram a estimativa da imunogenicidade, segurança e tolerância da vacina. 42

Os investigadores da América do Norte (Canadá e EUA) e Brasil recrutaram mulheres para este estudo de eficácia, através de anúncios ou participação prévia num estudo de epidemiologia de secção-transversal de HPV, gue ocorreu entre Julho e Dezembro de 2000.

Para cada um dos 32 locais de estudo, uma junta de recapitulação institucional aprovou o protocolo, formas de consentimento e aperfeiçoamentos. As mulheres assinaram consentimentos escritos separados para participação no estudo e colposcopia. Para as com menos de 18 anos, o consentimento dos pais e o assentimento da participante foram obrigatórios.

Houve duas fases de estudo: uma fase inicial para vacinação e acompanhamento, que foram concluídas no mês 18; e uma fase de extensão de acompanhamento cega, que foi concluída no mês 27.

As mulheres elegíveis para a fase inicial (meses 0-18) incluíram mulheres saudáveis com a idade de 15-25 anos, que não tinham tido mais do que seis parceiros sexuais, nenhuma história de um teste Pap anormal ou tratamento ablativo ou excisional da cérvix e nenhum tratamento em andamento para condilomas externos; e que eram citologicamente negativas, soronegativas para anticorpos de HPV-16 e HPV-18 por ELISA e negativas-ADN-HPV por PCR para 14 tipos de HPV de alto risco (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68), não mais do que 90 dias antes da entrada do estudo.

As mulheres que completaram a fase inicial do estudo mais cedo e que não tiveram terapia ablativa ou excisional da cérvix, ou histerectomia após alistamento, foram elegíveis para participar da fase de extensão do estudo (meses 18-27) . 43

Procedimentos

Cada dose da vacina de partículas semelhantes a vírus de HPV-16/18 bivalente (GlaxoSmithKline Biologicals, Rixensart, Bélgica) continha 20 pg de partículas semelhantes a vírus de LI de HPV-16 e 20 pg de partícula semelhante a vírus de LI de HPV-18. Cada tipo de partícula semelhante a vírus foi produzida em substrato de células de Spodoptera frugiperda Sf-9 e Trichoplusia ni HI-5, com o adjuvante AS04 contendo 500 pg de hidróxido de alumínio e 50 pg de monofosforil lípido A 3-desacilado (MPL, Corixa, Montana, EUA), fornecido num frasco de monodose. O placebo continha 500 pg de hidróxido de alumínio por dose e era de aparência idêntica à vacina HPV-16/18. Cada participante do estudo recebeu uma dose de 0,5 mL de vacina ou placebo ao mês 0, mês 1 e 6 meses.

Os provedores de cuidados da saúde obtiveram espécimes cervicais com uma escova e espátula cervicais (lavados em PreservCyt, Cytyc Corporation, Boxborough, MA, EUA) para teste de citologia e o teste de rastreio de ADN de HPV e meses 6, 12 e 18. Nos meses 0 e 6 e, subsequentemente a cada 3 meses, as mulheres auto-obtiveram amostras cervicovaginais com duas zaragatoas sequenciais (colocados em PreservCyt) para teste de ADN de HPV [DM Harper, WW Noll, DR Belloni and BF. Cole,

Randomized clinicai trial of PCR-determined human papillomavirus detection methods: self-sampling versus clinician-directed- biologic concordance and women's preferences. Am J Obstet Gynecol 186 (2002), p. 365-373]. Um laboratório central (Quest

Diagnostics, Teterboro, NJ, EUA) informou os resultados das citologias (ThinPrep, Cytyc Corporation) pela utilização do sistema de classificação Bethesda 1991. 44

As directrizes de protocolo recomendaram colposcopia após dois relatórios de ASCUS ou um relatório de células glandulares atípicas de significância indeterminada, LSIL ou HSIL, carcinoma de célula escamosa, adenocarcinoma in situ ou adenocarcinoma. Estas directrizes também recomendarem biopsia para quaisguer lesões suspeitas. 0 laboratório de histologia central preparou um diagnóstico inicial dos espécimes de tecido fixado com formalina para controlo clínico. Um painel de três patologistas fez um subsequente diagnóstico consensual para lesões associadas com HPV-16 e HPV-18 com o sistema CIN. Este diagnóstico de consenso também incluiu a recapitulação das secções retiradas na ocasião da microdissecação para detecção por PCR de ADN de HPV das lesões.

0 ADN de HPV isolado do espécime de citologia (MagNaPure Total Nucleic Acid System, Roche Diagnostics, Almere, Holanda) e do espécime de biopsia cervical (extracção com proteinase K) foi amplificado de uma alíquota de ADN total purificado com os iniciadores de largo espectro SPF10, que amplificam uma região de 65 pb do gene LI [B Kleter, LJ van Doorn, J ter Schegget et al., Novel short-fragment PCR assay for highly sensitive broad-spectrum detection of anogenital human papillomaviruses. Am J Pathol 153 (1998), p. 1731-1739: LJ van Doorn, W Quint, B

Kleter et al. , Genotyping of human papillomavirus in liquid cytology cervical specimens by the PGMY line blot assay and the SPF(IO) line probe assay. J Clin Microbiol 40 (2002), p. 979-983 e WG Quint, G Scholte, LJ van Doorn, B Kleter, PH Smits e J. Lindeman, Comparative analysis of human papillomavirus infections in cervical scrapes and biopsy specimens by general SPF(10) PCR and HPV genotyping. j Pathol 194 (2001), p. 51-58]. 45

Os produtos de amplificação foram detectados por um imunoensaio de enzima para ADN. 0 ensaio de sonda em linha (ensaio de genotipagem LiPA Kit HPV INNO LiPA HPV, versão de sistema 1 SPF-10, Innogenetics, Gent, Bélgica, produzido por Labo

Bio-medical Products, Rijswijk, Holanda) detectou 25 genotipos de HPV (6, 11, 16, 18, 31, 33, 34, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70 e 74) [B Kleter, LJ van

Doorn, L Schrauwen et al., Development and clinicai evaluation of a highly sensitive PCR-reverse hybridization line probe assay for detection and Identification of anogenital human papillomavirus. J Clin Microbiol 37 (1999), p. 2508-2517].

Qualquer espécime que era positivo por imunoensaio de enzima para ADN foi testado por PCR de HPV-16 e HPV-18 especifico para o tipo. Os iniciadores de PCR específicos de tipo de HPV-16 amplificaram um segmento de 92 pb do gene E6/E7 e os iniciadores de PCR específicos do tipo HPV-18 amplificaram um segmento de 126 pb do gene Ll [MF Baay, WG Quint, J Koudstaal et al., Comprehensive study of several general and type-specific primer pairs for detection of human papillomavirus DNA by PCR in paraffin-embedded cervical carcinomas. J Clin Microbiol 34 (1996) , p. 745-747] .

Definiu-se infecção cervical incidente com HPV-16/18 como, pelo menos, um resultado de PCR positivo para HPV-16 ou HPV-18 durante a experiência e infecção persistente com HPV-16/18 como, pelo menos, dois ensaios de PCR para ADN-HPV positivos para o mesmo genótipo virai separado por, pelo menos, 6 meses [H Richardson, G Kelsall, P Tellier et al., The natural history of type-specific human papillomavirus infections in female university students. Câncer Epidemiol Biomarkers Prev 12 (2003), p. 485-490 e AB Moscicki, JH Ellenberg, S Farhat e J. Xu, Persistence of human papillomavirus infection in HlV-infected 46 and - uninfected adolescent girls: risk factors and differences, by phylogenetic type. J Infect Dis 190 (2004), p. 37-45]. Os resultados de teste de ADN-HPV foram cancelados pelos investigadores durante o estudo e os diagnósticos citológicos e histológicos foram somente revelados para fins de controlo clinico. As análises incluíram resultados de ADN HPV-16/18 para espécimes cervicais e espécimes cervicais e cervicovaginais combinados auto-obtidos.

Colheu-se soro dos participantes do estudo nos meses 0, 1, 6, 7, 12 e 18 para avaliação da imunogenicidade. 0 teste sorológico para os anticorpos para partículas semelhantes a vírus de HPV-16 e HPV-18 foi por ELISA. As partículas semelhantes a vírus de HPV-16 e HPV-18 recombinantes foram utilizadas como antigénios de revestimento para detecção de anticorpo (ver apêndice web http://image. thelancet.com/extras/04artl0103webappendix.pdf). A soropositividade foi definida como um título maior do que, ou igual ao, título do exclusão de ensaio estabelecido em 8 unidades de ELISA/mL para HPV-16 e 7 unidades de ELISA/mL para HPV-18. Os títulos naturais típicos foram determinados pela utilização de amostras de sangue obtidas de mulheres do estudo de epidemiologia precedente, que foram constatadas serem soropositivas para HPV-16 ou HPV-18 por ELISA.

As mulheres registaram os sintomas experimentados durante os primeiros 7 dias após vacinação em cartões diários com uma escala de três graus de intensidade do sintoma. Adicionalmente, elas informaram o pessoal de estudo, em entrevista, de todos os eventos adversos dentro dos primeiros 30 dias após vacinação. Informações sobre eventos adversos sérios e gravidez foram recolhidos durante todo o estudo. Métodos estatísticos

Presumindo-se uma taxa de incidência cumulativa de 6% de ambas as infecções tipo HPV-16 e HPV-18 durante 12 meses, estima-se que 500 mulheres por grupo de tratamento forneceriam 80% da capacidade para estimar um limite inferior de Cl de 95% de eficácia da vacina acima de zero. Presumiu-se uma taxa de retenção de 80% durante 18 meses. Análises interinas quanto à eficácia, segurança e imunogenicidade foram realizadas somente para fins de planeamento de estudo futuro; o método de 0'Brien e Fleming foi utilizado para ajustar o valor para a análise final após as análises interinas ocorridas (total = 0,05; teste de dois lados) [PC 0'Brien e TR. Fleming, A multiple testing procedure for clinicai trials. Biometrics 35 (1979), p. 549- 556] . A aleatorização de bloco, estratificada, de acordo com algoritmos validados, foi centralizada com um sistema de aleatorização da internet. A estratificação foi de acordo com a idade (15-17, 18-21, e 22-25 anos) e a região (América do Norte e Brasil). A cada dose de vacina foi atribuído um número escolhido aleatoriamente, baseado em informação específica de participante, introduzida no sistema de aleatorização computadorizada pelo pessoal do estudo. A alocação de tratamento permanece escondida dos investigadores e das mulheres participantes num estudo de acompanhamento de longo-termo.

Os coortes de intenção de tratar e de acordo com o protocolo são mostrados na figura, em que as razões para a exclusão das análises são listadas por ordem de classificação; as mulheres que atenderam a mais do que um critério de exclusão foram somente contadas uma vez, de acordo com os mais elevados 48 critérios de classificação. Refere-se aos conjuntos de participantes introduzidos nas análises de intenção de tratar e de acordo com o protocolo como coortes, embora a informação utilizada para restringir a inclusão do indivíduo no de acordo com o protocolo foi somente conhecida após o acompanhamento.

Fizeram-se análises de eficácia para o de "acordo com o protocolo" e com "intenção de tratar". 0 cálculo da eficácia da vacina na análise de "acordo com o protocolo" de 18 meses foi baseado na proporção de participantes com infecção por HPV-16/18 nos grupos vacinados versus placebo. A eficácia da vacina foi definida como 1 menos a relação entre estas duas proporções; 95% das Cl mediram a precisão das estimativas de eficácia. Os valores de p foram calculados com o teste exacto de Fisher de dois lados. As taxas correspondentes foram expressas como os números de casos com o resultado dividido pelos números de participantes sob risco. 0 coorte de 18-meses de "acordo com o protocolo" incluiu mulheres alistadas que receberam três doses programadas de vacina e satisfizeram o protocolo como descrito na figura. 0 cálculo da eficácia da vacina nas análises de "intenção de tratar" e de "acordo com o protocolo" de 27 meses foi baseado no modelo de risco proporcional de Cox, empregando o tempo para ocorrência dos casos com infecção por HPV-16/18 dos grupos vacinados versus placebo. Isto permitiu o controlo para os dados de tempo de pessoa acumulados de cada grupo. A eficácia da vacina foi calculada utilizando-se 1 menos a relação de risco e os valores de p calculados utilizando o teste de classificação log. As taxas correspondentes foram expressas como o número de casos dividido pelo tempo-pessoa total. Todas as mulheres alistadas, que receberam, pelo menos, uma dose de vacina ou 49 placebo, que eram negativas para ADN-HPV de alto risco no mês 0 e tinham alguns dados disponíveis para medição do resultado, foram incluídas no coorte de "intenção de tratar". 0 coorte de "acordo com o protocolo" de 27 meses incluiu resultados do coorte de "acordo com o protocolo" de 18 meses e resultados que ocorreram durante a fase de extensão (de 18 meses a 27 meses). 0 cálculo dos valores de p para a análise de segurança foi realizado utilizando comparações de teste exacto de Fisher. 0 coorte para análise de segurança incluiu todas as mulheres alistadas, que receberam, pelo menos, uma dose de vacina ou placebo e satisfizeram as exigências mínimas de protocolo especificadas (ver figura a seguir:). 50

_ψ 540 incluídas no coorte ÂTP (análise de segurança) 20 excluídas 10 administração de vacina concomitante 9 administração de dose de placebo como substituição para frasco perdido/danificado 1 código de aleatorização rompido no sítio 541 incluídas no coorte ATP (análise de segurança) 12 excluídas 11 administração vacina concomitante 1 código aleatorização rompido no sítio 366 incluídas no coorte ATP (análise eficácia da vacina) para os meses 6 -18, 27 HPV -16/18 incidentes análise primária Infecções 174 excluídos da análise de 6 -18 meses 2 critérios de eligibilidade não satisfeitos, 79 inicialmente seropositivos para HPV -16/18; positivos para DNA HPV de alto risco; de citologia anormal 0 administração de medicamento violando protocolo 41 não atendendo programa de vacina 9 faltando resultados DNA HPV ou resultados de soroiogia na avaliação 7 tiveram resultados DNA HPV -16/18 a 6 meses 36 desistiram antes do mês 18 _±_ 355 incluídas no coorte ATP (análise eficácia da vacina) para os meses 6 -18, 27 HPV -16/18 incidente análise primária Infecções 186 excluídos da análise dos meses 6 -18 6 critérios de elegibilidade não atendidos 73 seropositivos inicialmente para HPV -16/18 positivo para DNA HPV de alto risco; ou citologia anormal 1 administração medicamento violando protocolo administração produto sanguíneo 45 não atendendo programa de vacina 12 não tendo resultados de DNA HPV ou resultados de soroiogia da avaliação 18 tinham resultados de DNA HPV -16/18 positivo a 6 meses 31 desistiram antes mês 18 _Φ 336 completaram visita mês 21 209 completaram visita mês 24 81 completaram visita mês 27 _s_ 291 completaram visita mês 21 188 completaram visita mês 24 59 completaram visita mês 27 384 incluídas no coorte ATP para os meses 344 incluídas no coorte ATP para os meses 6-18 6-18 Imunogenicidade de análise secundária Imunogenicidade de análise secundária 156 excluídos 197 excluídos 2 critérios de eligibilidade não satisfeitos 6 critérios de eligibilidade não atendidos 23 inicialmente seropositivos ou de status 20 inicialmente seropositivos ou de status anticorpo desconhecido anticorpo desconhecido 0 administração medicamento violando 1 administração de medicamento violando protocolo *— —*> protocolo administração de produto 40 tinham resultados de DNA HPV -16/18 sanguíneo positivos durante o período de estudo 85 tinham resultados de DNA HPV -16/18 52 não atenderam o programa de vacina positivos durante o período de estudo 35 não atenderam programa de amostragem 51 não atenderam o programa de vacina de sangue 29 nao atenderam o programa de amostragem 4 dados sorológicos faltando de sangue 5 dados sorológicos faltando 51 A imunogenicidade foi avaliada num subconjunto do coorte de segurança de "acordo com o protocolo", que incluiu mulheres com resultados de sorologia nos meses 0, 7 e 18, que receberam todas três doses de vacina de estudo ou placebo de acordo com o programa, satisfizeram o programa de amostragem de sangue e não se tornaram positivas para ADN-HPV-16/18 durante a experiência. As taxas de soropositividade entre os grupos de vacina e placebo foram comparados com o teste exacto de Fisher (p < 0,001 julgado significativo). Os títulos médios geométricos foram comparados com ANOVA e teste Kruskal-Wallis. A aleatorização de bloco e análises estatísticas foram realizadas com SAS versão 8.2 (SAS Institute, Cary, North Carolina).

Resultados

Os resultados da análise inicial sobre a protecção cruzada são apresentados no pedido de patente W02004/056389, cujo conteúdo completo é aqui incorporado por referência.

Análise adicional

Foi realizada uma análise num grupo "ATP" (de "acordo com o protocolo") para aqueles doentes que atenderam a todos os critérios da experiência. No grupo ATP todos os doentes receberam 3 doses de vacina a 0, 1 e 6 meses e eram soronegativos aos 6 meses. 52

Como demonstrado pelos dados apresentados na Tabela 4, a imunização com uma mistura de VLP de HPV16 e HPV18 forneceu protecção cruzada estatisticamente significativa contra a infecção incidente por HPV tipos 31, 52 e 45, em comparação com o controlo.

Protecção cruzada estatisticamente significativa contra infecção incidente foi também observada contra o grupo de todos os tipos relacionados com HPV 16 (HPV-31, 33, 35, 52 e 58) e o grupo de todos os tipos de alto risco, excluindo 16 e 18 (HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68).

Protecção cruzada estatisticamente significativa contra infecção persistente foi também observada contra os tipos 31 e 52 (ver tabela 5) e foi também observada contra o grupo de todos tipos relacionados com HPV 16 (ver Tabela 5).

Protecção cruzada estatisticamente significativa foi também observada contra anormalidades citológicas associadas com HPV 52, ver tabela 6. Protecção estatisticamente significativa foi também observada contra anormalidades citológicas associadas com o grupo de todos os tipos relacionados com HPV 16 (HPV-31, 33, 35, 52 e 58) e o grupo de todos os tipos de alto risco, excluindo 16 e 18 (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68) . 53

Tabela 4

Eficácia contra Infecções Incidentes com Tipos Relacionados com 16/18*

Tipo HPV | Vacina 'Controlo r ™ , " . —""Ί Eficácia Vacina I N AH N AR /O :j Valor P BPV-31 | 1 0,2 10 2,4 90,0 ;j HPV-33 | 6 1,4 6 í,4 4,2 | 1,000 HFV-35 | ! i 0,2 _______________L.,.......... 3 0,7 66,5 j 0,624 : HPV-5 2 f 6 1,4 16 3,9 63,0 | 0,031 HPV-58 | 5 1 j·**· 5 1,2 9,0 | 1,000 HPY^5 j Õ o,o· 5 1,2 100,0 | 0,032 HPV-59 | 4 | 0,9 2 0,5 400,5 | 0,448 Todos relacionados 16 £ I "TV ίίϊ 4,0· ] 32 8,1 51,1 | 0,017 Todos relacionados 18 t 4 1,0 7 1,7 43,0 | 0,384 : Todos HR \ 32 9,0 53 15,6 i 42,3 í 0,011 [excepto 16/18] | ________ * Amostras cervicais coorte ATP. 54

Tabela 5

Eficácia contra Infecções Persistentes com Tipos Relacionados com 16/18*

Relacionados com

L

f \ Relacionados com 16 , f Γ is4 Tipo HPV V acina Controlo Eficácia Vacina N AR N AR n/ Λϊ Valor P .............. HPV-31 s 2 0,48 9 2,15 0,030 HPV-33 3 0,71 5 ÍJ8 40,2 0,476 KPV-3S l 0,24 í 0,24 I 6,4 0,998 HPV-52 5 1,20 21 5,10 j '77,1 0,001 HPV-S8 4 0,9$ 6 | 1,42 34,1 0,515 HPV-4S Ϊ 0,24 4 [ Θ,94 75,4 0,174 HPV-59 3 0,71 0 0,00 - 0,083 Todos relacionados 16 II. 2, -fL 30 7,6 65,1 0,002 Todos relacionados 18 4 i,õ 4 1,0 1,0 0,989 Todos HR (excepto 16118) 36 10,1 46 13,5 27,1 0,155 * Todas as amostras; coorte ATP 55

Tabela 6

Eficácia contra Anormalidades Citológicas Determinado com Tipos Relacionados com 16/18*

Todos relacionados 16 5 1,2 18 4,6 72,8 | 0,005 I [Todos relacionados 18 4 1.0 4 1,0 0,2 1 1,000 | [ Todos HR (excepto 16/18) 10 2,8 | 30 8,8 68,2 | <ô,oôí | * Coorte ATP

Nas tabelas 4, 5 e 6,

N = número de indivíduos no coorte específico AR = taxa de ataque = n(número de indivíduos com infecção incidente, infecção persistente ou anormalidade citológica HPV, como apropriado para a tabela)/N % Eficácia da vacina é 1 - (A/B) x 100, ajustado para tamanho relativo de grupo vacina e placebo, em que A = % de mulheres do grupo de vacina com infecção incidente, infecção persistente apropriado para a tabela ou anormalidade citológica, como 56 incidente, apropriado Β = % de mulheres do grupo placebo com infecção infecção persistente ou anormalidade citológica, como para a tabela

Lisboa, 05 de Dezembro de 2012 57

Claims (18)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composição imunogénica, compreendendo VLP ou capsómeros de HPV 16 e 18 e pelo menos um outro tipo de cancro por HPV, sendo o outro tipo de cancro seleccionado da lista consistindo nos HPV tipos 31, 45 e 52, em que a dose das VLP ou capsómero do pelo menos um outro tipo de cancro é reduzida em relação à de HPV 16 ou 18.
2. 2. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o outro tipo de cancro é HPV 31.
3. 3. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o outro tipo de cancro é HPV 45.
4. 4. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o outro tipo de cancro é HPV 52.
5. 5. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que os outros tipos de cancro são HPV 31 e HPV 45.
6. 6. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que os outros tipos de cancro são HPV 31 e HPV 52.
7. 7. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que os outros tipos de cancro são HPV 52 e HPV 45.
8. 8 . Composição de acordo com a reivindicação 1, em que os outros tipos de cancro são HPV 31, HPV 45 e HPV 52 . 1
9. 9. Composição imunogénica de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a composição compreende 10 pg ou mais de VLP ou capsómero de HPV 16 e/ou HPV 18 e de 2-9 pg de VLP ou capsómero do outro tipo de cancro.
10. 10. Composição imunogénica de acordo com qualquer das reivindicações 1-8, em que a composição compreende 20 pg ou mais de VLP ou capsómeros de HPV 16 e/ou HPV 18 e de 5-15 pg de VLP ou capsómero do outro tipo de cancro.
11. 11. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 10, em que a composição compreende 10 pg de VLP ou capsómero do outro tipo de cancro.
12. 12. Composição imunogénica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, em combinação com um adjuvante.
13. 13 . Composição de acordo com a reivindicação 12, em que o adjuvante é um sal de alumínio
14. • 14 . Composição de acordo com a reivindicação 13, em que o adjuvante é hidróxido de alumínio.
15. 15. Composição de acordo com a reivindicação 12, em que o adjuvante é um derivado de lípido A.
16. 16 . Composição de acordo com a reivindicação 15, em que 0 adjuvante é 3D MPL.
17. 17. Composição de acordo com a reivindicação 16, em que o adjuvante é 3D MPL e hidróxido de alumínio. 2
18. 18. Vacina, compreendendo uma composição imunogénica de acordo um com qualquer das reivindicações anteriores com excipiente farmaceuticamente aceitável. Lisboa, 05 de Dezembro de 2012 3