PT1694338E - Utilização de miméticos da superóxido dismutase e de glutationa redutase sob a forma de fármacos anticancerosos - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DE MIMÉTICOS DA SUPERÓXIDO DISMUTASE E DE GLUTATIONA REDUTASE SOB A FORMA DE FÁRMACOS ΑΝΤΙ CANCEROSOS" A presente invenção diz respeito à utilização de um mimético químico da enzima superóxido dismutase (SOD), em particular o Mangafodipir, para inibir o crescimento tumoral e potencializar os efeitos de tratamentos antitumorais nas células tumorais ao mesmo tempo que inibem os seus efeitos tóxicos nas células normais. A expressão: "formas reactivas do oxigénio" (FRO) engloba um conjunto de derivados reduzidos do oxigénio, como o anião superóxido (02”~) , o peróxido de hidrogénio (H2O2) ou o radical hidroxiló (OH-) . Estes derivados são no,Pmalmente gerados pelo metabolismo celular, em particular nas mitocôndrias, quando da redução do oxigénio molecular em H20. Eles são, além disso, produzidos em quantidades importantes em determinadas condições, por exemplo quando da exposição aos raios ionizantes ou aos raios ultravioletas, ou da exposição a certos produtos químicos.

Como as formas reactivas do oxigénio são muito tóxicas, as células dispõem de diferentes meios para as neutralizar. De entre esses meios de destoxificação figuram, em particular, enzimas "anti-oxidantes" de entre as quais se citará as superóxido dismutases (SOD; EC 1.15.1.1) que catalisam a dismutação do anião superóxido em peróxido de hidrogénio +02, e as enzimas que intervêm em seguida na destoxificação do peróxido de hidrogénio, tais como a catalase (EC 1.11.1.6) que catalisa a dismutação do peróxido de hidrogénio (2 H202 -» 02 + 2 H20), a glutationa--peroxidase (EC 1.11.1.9) que catalisa a redução do 2 peróxido de hidrogénio pela glutationa reduzida (GSH), produzindo glutationa oxidada (GSSG) e água (2 GSH + H202 —> GSSG + 2 H20) , e a glutationa-redutase (EC 1.8.1.7} que regenera o GSH de acordo com a reacção GSSG + NADPH + H4 —> 2 GSH + NADP4.

Quando a produção de formas reactivas do oxigénio excede as capacidades de destoxificação da célula, os efeitos tóxicos desses derivados manifestam-se e podem induzir danos importantes' ao nível dos constituintes celulares tais como as proteínas, os lípidos membranares ou o ADN. 0 stress oxidante assim gerado desempenha um papel principal no aparecimento e no desenvolvimento de diversas doenças, em especial de patologias inflamatórias e auto--imunes e de cancros. É no presente momento geralmente admitido que as formas reactivas do oxigénio intervêm na patogénese de numerosos cancros. No entanto, parece que os seus efeitos põem em jogo mecanismos complexos, que estão longe de ser elucidados.

Em quantidades subletais, as FRO podem favorecer o aparecimento de cancros, por exemplo ao provocarem mutações ao nível das regiões codificadoras ou das regiões reguladoras, ou ao inibirem, ou pelo contrário ao estimularem a expressão de genes implicados na regulação da proliferação ou da diferenciação celulares, ou da apoptose. Foi, assim, proposto utilizar auto-oxidantes no quadro de tratamentos curativos ou preventivos de diferentes cancros. Por exemplo, uma alimentação suplementada com anti--oxidantes, em especial com a vitamina E, foi preconizada com o objectivo de prevenir o cancro. 3

Para fortes concentrações, as FRO podem induzir directamente a morte celular, em particular ao provocarem reacções de peroxidação lipídica e proteica, que podem favorecer a despolarização mitocondrial e, assim, acelerar as fases efectoras da apoptose. Esta activação da apoptose pelas FRO pode constituir um meio de destruir as células tumorais.

Por exemplo, os tratamentos por radioterapia assentam essencialmente na indução de uma sobreprodução de FRO nas células tumorais. De igual modo, numerosas moléculas utilizadas na quimioterapia dos cancros induzem nas células uma sobreprodução de FRO, que seria responsável, pelo menos em parte, pelo efeito antitumoral destas células.

As moléculas anticancerosas que podem induzir uma produção de FRO, podem pertencer a diferentes classes terapêuticas. Citar-se-ão, em particular, agentes intercalantes, por exemplo antraciclinas, tais como a doxorubicina, que inibe à replicação e induz lesões do ADN; inibidores da topoisomerase-2 tais como o etoposido que induz fracturas do ADN; antimetabolitos como o 5-fluoro--uracilo; agentes electrófilos tais como a mitomicina C e derivados da platina [cisplatina (YOKOMIZO et al., Câncer Res, 55: 4293-4296 1995), e oxaplatina]; venenos do fuso como os taxanos; e anti-receptores hormonais tais como o tamoxifeno (FERLINI et al., Br J Câncer, 79, 257-263, 1999).

No entanto', uma das principais limitações à utilização destas moléculas anticancerosas resulta do facto de a sua acção poder também levar à morte de células normais e conduzir a lesões, por vezes irreversíveis, com consequências muito prejudiciais. 4 A maior parte das moléculas anticancerosas destroem, preferencialmente, as células que se dividem rapidamente. A sua toxicidade em relação às células saudáveis é, portanto, geralmente, menor do que em relação às células tumorais. No entanto, existem em certos tecidos células cuja taxa de divisão é muito rápida e que são, por consequência, particularmente sensíveis aos efeitos tóxicos dos anticancerosos. Trata-se, em especial, . de células hematopoiéticas em vias de diferenciação da medula óssea. A mielotoxicidade constitui a mais frequente das toxicidades associadas à quimioterapia e encontra-se associada com a maior parte dos tratamentos antitumorais. Ela toca essencialmente os leucócitos e as plaquetas, e traduz-se em particular por uma leucopenia que aumenta o risco infeccioso nos pacientes tratados.

Certas moléculas anticancerosas apresentam, além disso, uma citotoxicidade que visa mais especificamente certos tecidos ou órgãos. A titulo de exemplos: as antraciclinas, tais como a doxorubicina, apresentam um efeito cardiotóxico que resultaria da produção de FRO que levaria a uma peroxidação das estruturas lipidicas do retículo sarcoplásmico e das mitocondrias, e um disfuncionamento destes organitos; a bleomicina possui uma forma de toxicidade pulmonar, igualmente atribuída à produção de.FRO, e que pode conduzir a uma fibrose pulmonar intersticial irreversível.

Foram propostas diferentes estratégias para diminuir estes efeitos secundários dos tratamentos anticancerosos.

No caso de uma citotoxicidade que se refere mais particularmente a determinados tipos celulares, foi proposto utilizar agentes citoprotectores, e em particular agentes susceptíveis de neutralizar as FRO, tais como a 5 N-acetil cisteina (DOROSHOW et al. J. Clin. Invest., 68, 1053-1064, 1981) ou, mais recentemente, a SOD ou miméticos desta enzima. Por exemplo, o pedido de patente de invenção PCT/WO 97/49390 propõe a utilização de um quelato de manganês derivado de dipiridoxal, o MnDPDP, para prevenir os efeitos cardiotóxicos das antraciclinas; o pedido de patente de invenção PCT/WO 02/060383 diz respeito à capacidade de dois quelatos de manganês derivados de porfirina, o MnTBAP e o ΜηΤΜ-4-PiP, para proteger as células do epitélio pulmonar dos efeitos tóxicos da radioterapia e da bleomicina; este pedido de patente de invenção refere igualmente que esses derivados são susceptíveis de inibir de maneira selectiva a proliferação de células de adenocarcinoma pulmonar, sem afectar a de células epiteliais ou endoteliais normais. 0 pedido de patente de invenção WO 84/049222 A descreveu a actividade antitumoral do mimético do superóxido de dismutase CuDIPS, eventualmente em associação com outros agentes antitumorais.'

Para reduzir as consequências dos efeitos citotóxicos das, moléculas anticancerosas em relação às células hematopoiéticas, utilizam-se, de uma maneira geral, factores de crescimento hematopoiéticos, a fim de reduzir a duração da. leucopenia e o risco infeccioso que daí resulta. A utilização de agentes citoprotectores é limitada pelo risco de falta de selectividade desses agentes, como consequência da taxa de divisão rápida das células hematopoiéticas.. Actualmente, o único agente citoprotector utilizado para reduzir a- leucopenia é a amifostina, que· é um precursor fosforilado de um antíoxidante com um grupo tiol, e cuja selectividade resulta da sua penetração 6 preferencial nas células não tumorais onde liberta a molécula activa.

Os Inventores começaram a ensaiar os efeitos de diferentes moléculas, conhecidas pela sua capacidade para neutralizarem em diferentes níveis a produção de FRO, sobre a proliferação de diferentes linhas de células tumorais, assim com sobre a viabilidade dessas células tumorais e a de leucócitos humanos normais; ensaiaram em seguida, da mesma maneira, os efeitos destas moléculas sobre as propriedades citostáticas e citotóxicãs de agentes de quimioterapia antitumoral conhecidos por induzirem a produção de FRO.

As moléculas de antioxidantes que foram ensaiadas são. as seguintes: a N-acetil cisteína (NAC) (referência), que é um antioxidante, captor de radicais livres, e precursor da glutationa intracelular; o CuDIPS (Cu[II]-[diisopropilsalicilato]) (referência) que é um mimético químico da CuZn SOD (MC KENZIE et al., Br. J. Pharmacol. 127, 1159-1164, 1999); ο MnTBAP (Μη(III) tetraquis (5, 10, 15, 20-ácido benzóico) porfirina) (referência), que é um mimético químico da MnSOD (PASTERNACK et al., Inorg. Biochem, 15, 261-267, 1981) assim como da catala-se e da glutationa peroxidase (pedido de patente de invenção PCT/WO 01/12327); o MnDPDP (manganês dipiridoxil fosfato (Mn-DPDF), igualmente denominado Mangafodipir (DC1), que é um mimético químico da MnSOD assim como a catala-se e da glutationa redutase (pedido de patente de invenção PCT/WO 02/087579). 7

Os inventores observaram que o tratamento com a NAC induz um aumento da proliferação das células tumorais, enquanto que o tratamento com o MnTBAP, o CuDIPS, ou o MnDPDP induz uma redução desta proliferação. No que diz respeito à viabilidade celular, a NAC não exerce qualquer efeito sobre esta última, quer se trate de células tumorais ou de leucócitos humanos normais. 0 MNTBAP ou o CuDIPS diminuem a viabilidade das células tumorais e, igualmente, muito embora numa medida menor, a. dos leucócitos humanos normais. Pelo contrário, o MnDPDP diminui a viabilidade das células tumorais, mais, de maneira surpreendente, não influência a dos leucócitos humanos normais.

No caso da associação destas moléculas antioxidantes com agentes antitumorais, os Inventores observaram que a NAC inibe os efeitos citostáticos e citotóxicos destes agentes sobres as células tumorais, enquanto que o MnTBAP, o CuDIPS e o MnDPDP os aumentam.

Os efeitos da NAC, do MnTBAP, e do CuDIPS sobre a citotoxicidade dos agentes antitumorais em relação aos leucócitos normais são análogos aos observados nas células tumorais; pelo contrário, o MnDPDP diminui a citotoxicidade dos agentes antitumorais sobre os leucócitos humanos normais, inversamente ao efeito observado no caso das células tumorais. É evidente, por consequência, que o MnDPDP é susceptivel de induzir ou de potenciar um stress oxidante quimio-induzido ao nível das células tumorais, ao mesmo tempo que preserva a viabilidade dos leucócitos normais.

Os Inventores ensaiaram igualmente os efeitos da NAC, do MnTBAP, do CuDIPS e do MnDPDP, administrados 8 isoladamente ou associados com um agente de quimioterapia antitumoral, sobre o desenvolvimento de tumores in vivo no murganho.

Observaram-se que a administração de NAC induzia um aumento do volume tumoral, enquanto que a administração de MnTBAP, de CuDIPS ou de MnDPDP diminuiu o volume dos tumores. Em associação com um agente antitumoral, a NAC bloqueia o efeito inibidor deste agente sobre o crescimento tumoral, enquanto que o MnTBAP, o CuDIPS ou o MnDPDP aumentam este efeito inibidor.

Essas propriedades singulares do mangafodipir, em relação às de outros antioxidantes, e em particular de outros miméticos de SOD ensaiado, aparecem ligadas à sua dupla actividade de mimético de superóxido dismutase e da glutationa redutase. A presente invenção tem por objecto a utilização do Mangafodipir (MnDPDP) como principio activo antitumoral e protector dos leucócitos, para a obtenção de um medicamento destinado a um tratamento anticanceroso.

De acordo com um modo de realização preferido da presente invenção, o Mangafodipir é utilizado em associação com um outro agente antitumoral, escolhido de entre a doxorubicina, a mitomicina C, o etoposido, os derivados da platina, o tamoxifeno, os taxanos, o 5-fluoro-uracilo, o irinotecan (inibidor da topo-isomerase-1), a gemcitabina (anti-metabolito), o endoxan (agente electrofilo alquilan-te), a estreptozotocina (agente electrofilo não-alquilan-te), a bleomicina (agente de cisão do ADN) , e a vincristina (veneno do fuso). 9

Devido à simultaneidade do seu efeito citotóxico e citostático em relação às células tumorais, e do seu efeito protector em relação aos leucócitos normais, o Mangafodipir permite aumentar significativamente o índice terapêutico dos medicamentos anticancerosos aos quais ele se encontra associado. Com efeito, exerce com estes medicamentos anticancerosos uma acção sinérgica antitumoral, ao mesmo tempo que protege os leucócitos dos efeitos deletérios da quimioterapia. A presente invenção tem igualmente por objecto uma composição farmacêutica que compreende Mangafodipir associado com um outro agente antitumoral, tal como definido na reivindicação 3.

Para a realização prática da presente invenção, o Mangafodipir será geralmente utilizado em formulações que permitem a administração de uma dose de princípio activo compreendida entre 1 e 100 mg/kg/dia. Podem no entanto ser utilizadas doses mais elevadas tendo em conta a reduzida toxicidade deste produto. É evidente que o perito na especialidade pode adaptar essas doses em função das particularidades de cada paciente e da patologia em questão.

Estas formulações podem ser administradas por diferentes vias, por exemplo por via oral, ou por injecções, em particular por injecções subcutâneas, intramusculares ou intravenosas. Poderão ser encaradas outras vias de administração se elas aumentarem a eficácia, a biodisponibilidade ou a tolerância dos produtos. A via mais apropriada pode ser escolhida pelo perito na especialidade em função da formulação utilizada. 10 A presente invenção será melhor compreendida por meio de um complemento de descrição que vai seguir-se, a qual se refere a exemplos que mostram as propriedades antitumorais do Mangafodipir e os seus efeitos citoprotectores sobre os leucócitos normais.. EXEMPLO 1 : INFLUÊNCIA DE DIVERSAS MOLÉCULAS ANTIOXIDANTES SOBRE AS PROPRIEDADES PROLIFERATIVAS BASAIS DE CÉLULAS TUMORAIS.

Realizaram-se ensaios de proliferação celular in vitro, sobre as linhas celulares seguintes : CT26 (carcinoma do cólon do murganho, ATCC (American Type Culture Collection) n.° 2638), Hepa 1-6 (hepatoma do fígado do murganho, ATCC n.° 1830), A 549 (carcinoma do pulmão humano, ATCC n. 185). Estas linhas foram previamente cultivadas, num incubador húmido à temperatura de 37°C sob 5% de C02, em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)/Glutamax-I contendo 10% de soro fetal de vitela e antibióticos [penicilina (lOOU/ml)/estreptomicina (100 μg/τnl) ] (LIFE TECHNOLOGIES,· Cergy Pontoise, França). Todas estas linhas celulares foram ensaiadas regularmente para excluir qualquer infecção com micoplasmas.

Para o ensaio de proliferação, semearam-se as células (2 x 104 células/cavidade) em placas com 96 cavidades (COSTAR, Corning, Inc. NY, EUA) e incubaram-se durante 48 horas em meio completo a que se adicionaram concentrações crescentes de 0 a 400 μιη, de N-Acetil-Cisteína (NAC, SIGMA), Saint-Quentin Fallavier, França), de MnTBAP (mimético da MnSOD ; CALBIOCHEM, Paris, França) , de CuDIPS (mimético da Cu/Zn SOD ; SIGMA, Saint-Quentin Fallaviet, França) ou de Mangafodipir (MnDPDP ou TELASCAN, AMERSHAM 11 HEALTH, Amersham, GB. A NAC, o MnTBAP e o CuDIPS não entram na protecção reivindicada.

Determinou-se' a proliferação celular mediante incubação celular mediante incubação das células durante 16 horas com a [3H]-timidina (ΙμΟί/cavidade).

Os resultados destas experiências, sobre diferentes linhas tumorais, para a NAC, o MnTBAP, o CuDIPS e o MNDPDP encontram-se ilustrados nas figuras 1, 2, 3 e 4, respectivamente.

Legenda das figuras 1, 2, 3 e 4:

Em abcissas: concentração em antioxidante (em μΜ),

Em ordenadas: radioactividade da [3H]-timidina em cpm.

Observa-se um aumento da proliferação das células tumorais em resposta ao tratamento com a NAC (figura 1) . Este aumento da proliferação é de 73% para as células Hepa 1-6, na presença de 100 μΜ de NAC e de 45 e 47% na presença de 400 μΜ para as células tumorais A 549 e CT26, respectivamente.

Pelo contrário, o tratamento das células tumorais Hepa 1-6, CT26 e A 549 com o MnTBAP (figura 2), o CuDIPS (figura 3) ou o MnDPDP (TESLASCAN, figura 4) reduz de maneira dose dependente a sua proliferação. Esta redução da proliferação celular atinge cerca de 90% na presença de 400 μΜ de uma destas três moléculas. EXEMPLO 2 : EFEITOS DA NAC, DO CuDIPS, DO MnTBAP E DO MnDPDP SOBRE A VIABILIDADE DE LINHAS TUMORAIS OU DE LEUCÓCITOS HUMANOS NORMAIS. 12

Realizaram-se ensaios de viabilidade in vitro, em resposta ao tratamento com a NAC, o CuDIPS, o MnTBAP ou o MnDPDP sobre linhas celulares do exemplo 1 assim como sobre leucócitos humanos normais. Estes últimos foram obtidos em voluntários saudáveis, após consentimento esclarecido, mediante recolha de sangue venoso recolhido sobre anticoagulante (heparinato de litio). Os glóbulos vermelhos assim lisados por choque osmótico por intermédio de uma solução hipotónica de acetato de potássio e cultivaram-se os leucócitos nas condições descritas no exemplo 1.

Para os ensaios de viabilidade, semearam-se as células (2 x 104 células/cavidade) em placas de 96 cavidades (COSTAR, Corning, Inc. NY, EUA) e incubaram-se durante 48 horas, em meio completo a que se adicionaram concentrações crescentes de 0 a 400 μη, de NAC, de MnTBAP, de CuDIPS ou de MnDPDP. Avaliou-se a viabilidade celular por redução de um sal de metiltiazol-tetrazólio {MTT ; SIGMA) em formazano. Expuseram-se as células a 20 μΐ de MTT (5 mg/miem PBS) e incubaram-se durante 4 horas à temperatura de 37°C. Em seguida, retiraram-se 150 μΐ de meio- de cada cavidade e a reacção foi revelada pela adição de 100 μΐ de DMSO (SIGMA). Analisou-se a absorvância para cada cavidade a 550 nm e a 630 nm com um leitor de placa ELISA. Determinou-se o número de células viáveis pela diferença entre a absorvância a 550 nm e a absorvância a 630 nm.

Os resultados destas experiências para .as linhas tumorais CT26, Hepa 16 e A549, assim como para os leucócitos normais encontram-se ilustrados nas figuras 5, 6, 7 e 8, para a NAC, o MnTBAP, o CuDIPS e o MnDPDP, respectivamente.

Legenda das figuras 5 a 8: 13

Em abcissas: concentração em antioxidante (em μΜ) ,

Em ordenadas: DO a 550 nm - DO a 630 nm.

Observa-se que o tratamento com a NAC das células tumorais Hepa 1-6, CT26, e A549 ou dos leucócitos humanos normais não exerce qualquer efeito sobre a viabilidade, celular (figura 5).

Pelo contrário, o tratamento das células tumorais Hepa 1-6, CT26 e A549 com o MnTBAP (figura 6) ou o CuDIPS (figura 7) diminui de maneira dose dependente a viabilidade das células tumorais. A viabilidade das células tumorais Hepa 1-6, CT26 e A549 é reduzida de 62%, 75% e 37%, respectivamente, por 400 μΜ de MnTBAP, e de 74%, 85% e 50%, respectivamente, por 400 μΜ de CuDIPS. No entanto, o tratamento dos leucócitos humanos normais com o MnTBAP e o CuDIPS induziu igualmente uma diminuição da viabilidade celular, a qual atingiu um máximo de 18% e 50%, respectivamente.

Finalmente, se o MnDPDP (Mangafodipir ou TESLASCAN, figura 8) reduzir igualmente de maneira dose dependente a viabilidade das células tumorais Hepa 1-6, CT26 e A549, ele não influência a viabilidade dos leucócitos humanos normais, e isto qualquer que seja a dose de mangafodipir utilizada. EXEMPLO 3 : EFEITOS DA NAC, DO CuDIPS, DO MnTBAP E DO MnDPDP SOBRE AS PROPRIEDADES ANTI-PROLIFERATIVAS E CITOTÓXICAS DE MOLÉCULAS UTILIZADAS NA QUIMIOTERAPIA DE CANCROS.

Utilizaram-se as moléculas antitumorais seguintes : oxiplatina (que pertence à família da cisplatina) ; taxol ; 14 5-fluoro-uracilo ; que são conhecidas por induzirem a produção de FRO nas células tumorais. Efectuaram-se, para cada uma destas moléculas, ensaios de proliferação e de viabilidade celular, na ausência de moléculas antioxidantes, ou na presença de concentrações crescentes de NAC, de MnTBAP, de CuDIPS ou de MnDPDP. 1) Efeitos sobre as propriedades antiproliferativas:

Efectuaram-se os ensaios de proliferam-se sobre as linhas tumorais CT26, Hepa 16 e A549, de acordo com o protocolo descrito no exemplo 1.

Oxaliplatina:

Utilizou-se a oxaliplatina (ELOXATINA ou [(IR,2R)-1,2--ciclo-hexanodiamina-Ν,Ν'][oxalato(2-)-0,O']platina (II); SANOFI-PHARMA, Paris, França) em todos os ensaios para uma concentração de 10 μΜ.

Os resultados dos ensaios de proliferação celular das linhas tumorais CT26, Hepa 16 e A549 encontram-se ilustrados nas ' figuras 9, 10, 11 e 12, para a NAC, o MnTBAP, o CuDIPS e o MnDPDP, respectivamente.

Legenda das figuras 9 a 12:

Em abcissas : presença (+) ou ausência (-) de oxaliplatina ; concentração de antioxidante (em μΜ),

Em ordenadas : radioactividade da [3H] timidina em cpm. 0 tratamento das linhas tumorais Hepa 1-6, CT26 e A549 com 10 μΜ de oxaliplatina sozinha diminui a proliferação 15 das células tumorais de 70%, 91% e 93%, respectivamente (figuras 9 a 12). A NAC reduz de maneira dose dependente o efeito citostático da oxaliplatina o que acontece qualquer que seja o tipo de células tumorais (figura 9).

Pelo contrário, o MnTBAP (figura 10), o CuDIPS (figura 11) e o MnDPDP (figura 12) aumentam de maneira dose dependente as propriedades antiproliferativas da oxaliplatina.

Taxol:

Utilizou-se o taxol (PACLITAXEL ; BRISTOL-MYERS--SQUIBB, Paris, França) em todos os ensaios para uma concentração de 10 μΜ.

Os resultados dos ensaios de proliferação das linhas tumorais CT26, Hepa 16 e A549 encontram-se ilustrados nas figuras 13, 14, 15 e 16, para a NAC, o MnTBAP, o CuDIPS e o MnDPDP, respectivamente.

Legenda das figuras 13 a 16:

Em abcissas : presença (+) ou ausência (-) de taxol; concentração de antioxidante (em μΜ),

Em ordenadas : radioactividade da [3H] timidina em cpm. A incubação com o taxol reduziu respectivamente a proliferação das células tumorais A549, Ct26 ou Hepa 1-6 de 85%, 71% e 65%, (figuras 13 a 16}. 16 A adição de NAC reduziu de maneira dose dependente o efeito citostático do taxol sobre as células tumorais (figura 13).

Pelo contrário, a adição dos três miméticos de SOD [MnTBAP (figura 14), CuDIPS (figura 15) ou de MnDPDP (figura 16)] aumenta o efeito citostático do taxol de maneira dose dependente. 5-FloroUracilo (5-Fu) :

Utilizou-se o 5-fluoroUracilo (5-Fu) (5-fluoro-l,2,34-tetra-hidro-2,5-pirimidinadiona ou fluoro-uracilo; ICN PHARMACEUTICAL FRANCE, Orsay, França) em todos os ensaios para uma concentração de 50 μΜ.

Os resultados dos ensaios de proliferação das linhas tumorais CT26, Hepa 16 e A549 encontram-se ilustrados nas figuras 17, 18, 19, 20, para a NAC, o MnTBAP, o CuDIPS e o MnDPDP, respectivamente.

Legenda das figuras 17 a 20:

Em abcissas : presença (+) ou ausência (-) de 5-FU; concentração de antioxidante (em μΜ),

Em ordenadas : radioactividade da [3H] timidina em cpm. A incubação das células tumorais com o 5-Fu reduziu a proliferação das células tumorais Hepa 1-6, CT26 e A549 de 91%, 91% e 85%, respectivamente (figuras 17 a 20).

Tal como para a oxaliplatina e o TAXOL, a NAC inibe o efeito citostático do 5-FU sobre as 1 células tumorais 17 (figura 17) enquanto que os três miméticos de SOD [MnTBAP (figura 18), CuIPS (figura 19) e MnDPDP (TESLASCAN, figura 20)] o aumentam. 2) Efeitos sobre a viabilidade celular :

Efectuaram-se os ensaios de viabilidade sobre as linhas tumorais CT26, Hepa 16 e A549, assim como sobre os leucócitos humanos normais, de acordo com o protocolo descrito no exemplo 2.

Oxaliplatina:

Utilizou-se a oxaliplatina para uma concentração de 10 μΜ no caso de células tumorais e para uma concentração de 1 mM no caso de leucócitos normais.

Os resultados encontram-se ilustrados nas figuras 21, 22, 23 e 24 para a NAC, o MnTBAP, o CuDIPS e o MnDPDP, respectivamente.

Legenda das figuras 21 a 24 :

Em abcissas : presença (+) ou ausência (-) de oxaliplatina ; concentração de antioxidante (em μΜ),

Em ordenadas : DO a 550 nm - DO a 630 nm. 0 tratamento com a oxaliplatina sozinha diminui em média a viabilidade das células tumorais Hepa 1-6, CT25 e A549 de 50%, 27% e 28%, respectivamente, e a dos. leucócitos normais de cerca de 50% (figuras 21 a 24). A NAC diminui de maneira dose dependente os efeitos citotóxicos da oxaliplatina sobre todos os tipos de células 18 tumorais, assim como sobre os leucócitos normais (figura 21) . 0 MnTBAP (figura 22), o CuDIPS (figura 23) e o MnDPDP (figura 24) aumentam de maneira dose dependente as propriedades citotóxicas da oxaliplatina sobre as células tumorais.

Sobre os leucócitos normais, o MnTBAP (figura 22) e o CuDIPS (figura 23), respectivamente, aumentam igualmente as propriedades citotóxicas da oxaliplatina ; pelo contrário, o MnDPDP (figura 24) inibe, tal modo a NAC, o efeito citotóxico da oxaliplatina.

Taxol:

Utilizou-se o taxol para uma concentração de 10 μΜ no caso de células tumorais e para uma concentração de 20 μΜ no caso.de leucócitos normais.

Os resultados encontram-se ilustrados nas figuras 24, 26, 27 e 28 para a NAC, o MnTBAP, o CuDIPS e o MnDPDP, respectivamente.

Legenda das figuras 25 a 28:

Em abcissas : presença (+) ou ausência (-) de taxol; concentração de antioxidante (em μΜ),

Em ordenadas : DO a 550 nm - DO a 630 nm. 0 tratamento com o taxol sozinho diminui, em média, a viabilidade das células tumorais Hepa 1-6, CT26 e A549 em, respectivamente, 25%, 50% e 47%, em média e a dos leucócitos normais em cerca de 50% (figuras 25 a 28). 19 A adição de NAC não influência a actividade citotóxica do taxol sobre as células tumorais e diminui a mesma sobre os leucócitos normais (figura 25). A adição de MnTBAP (figura 26), de CuDIPS (figura 27) ou de MnDPDP (figura 28) aumenta a actividade citotóxica do taxol sobre as células tumorais. Sobre os leucócitos normais, o MnTBAP, não exerceu praticamente qualquer influência sobre o efeito citotóxico do taxol (figura 26) e o CuDIPS (figura 27), aumenta esse efeito citotóxico; pelo contrário, o MnDPDP (figura 28) inibe tal como a NAC o efeito citotóxico do taxol. ' 5-FloroUracilo (5-Fu) :

Utilizou-se o (5-Fu) para uma concentração de 50 μΜ no caso das células tumorais, e numa concentração de 40 mM no caso dos leucócitos normais.

Os resultados encontram-se ilustrados nas Figuras 29, 30, 31 e 32, para a NAC, o MnTBAP, o CuDIPS e o MnDPDP, respectivamente.

Legenda das figuras 29 a 32:

Em.abcissas : presença (+) ou ausência (-) de 5-FU; concentração de antioxidante (em μΜ),

Em ordenadas : DO a 550 nm - DO a 630 nm. O tratamento com o 5-Fu sozinho diminui, em média, a viabilidade das células tumorais Hepa 1-6, CT26 e A549 de, respectivamente, 65%, 85% e 25%, e a dos leucócitos normais de cerca de 19% (figuras 29 a 32). 20 A adição de NAC não modifica a actividade citotóxica do 5-FU sobre as células tumorais, e diminui a mesma sobre os leucócitos normais (figura 29). A adição de MnTBAP (figura 30), de CuIPS (figura 31) ou de MnDPDP (figura 32) aumenta a actividade citotóxica do 5-FU sobre as células tumorais. Sobre os leucócitos normais, o MnTBAP, exerce apenas uma influência muito reduzida sobre efeito citotóxico do 5-FU (figura 30); o CuDIPS (figura 31) aumenta este efeito citotóxico; pelo contrário, o MnDPDP (figura 32) inibe-o. EXEMPLO 4: MODULAÇÃO DOS EFEITOS DAS FORMAS OXIGENADAS REACTIVAS SOBRE O ADN PELA NAC, O CuDIPS, O MnTBAP OU O MnDPDP. A molécula de ADN é um dos alvos principais do efeito antitumoral dos derivados da platina tais como a cisplatina ou a oxaliplatina. Os derivados da platina reagem com o ADN modificando a sua estrutura terciária. Metaloporfirinas catiónicas são agentes conhecidos para poder interactuar com o ADN.

Demonstrou-se recentemente que metaloporfirinas com propriedades que imitam a SOD podiam potencializar os efeitos deletérios das FRO sobre a estrutura do ADN.

Utilizou-se o plasmideo pcDNA3.1 (INVITROGEN) purificado para analisar as alterações potenciais do ADN em resposta à adição de moléculas utilizadas na quimioterapia dos cancros na presença, ou na ausência de moduladores de enzimas antioxidantes. Este ADN foi em seguida guardado à temperatura de -20°C em lOmM de TRIS, 1 ri de EDTA até à sua utilização. 21

Incubou-se o ADN plasmidico com oxaliplatina para uma razão molar de 0,50 num volume final de 50 μΐ. Adicionaram--se então ο MnTBAP (5μΜ), o CuDIPS (5μΜ), o Mangafodipir (5μΜ) ou a NAC (5mM) à solução. Realizou-se a produção de anião superóxido mediante adição de 200μΜ de xantina (SIGMA) e 1U de xantina oxidase (SIGMA). Realizou-se a incubação na obscuridade à temperatura de 37°C e durante 24 horas. No final do período de incubação, submeteram-se alíquotas de 10μ1 a uma electroforese em gel de agarose a 0,8% e detectaram-se mediante coloração com brometo de etídio. Analisaram-se em seguida os geles mediante densitometria (VILBER LOURMAT, Marnes-la-Vallée, França).

Os resultados encontram-se ilustrados na figura 33.

Legenda da Figura 33: A: Presença (+) ou ausência (0) do plasmídeo,-concentração em oxaliplatina (em μΜ); presença (+) ou ausência (0) de xantina e de xantina oxidase (X/XO); presença {+) ou ausência (0) de NAC. B : Presença (+) ou ausência (0) do plasmídeo; concentração em oxaliplatina (em μΜ); presença (+) ou ausência (0) de xantina e de xantina oxidase (X/XO); presença ( + ) ou.ausência (0) de antioxidante (Teslacan, MnTBAP, CuDIPS ou NAC). A incubação de ADN plasmidico com xantina e xantina oxidase (X/XO) gera aniões superóxidos que alteram a forma negativa sobre-enrolada ADN (ADN sob forma I) e favorece a forma circular (ADN sob forma II). Este fenómeno é inibido pela neutralização das FRO pela NAC. 22 A incubação do ADN plasmídico com a oxaliplatina induziu uma alteração dose dependente da estrutura do ADN máximo em relação a X/oxaliplatina de 0,5. Nestas condições, deixou de se observar a forma sobre-enrolada e aparece uma banda correspondente à forma III (forma linear). A razão forma I/forma II é ainda mais baixa se incubarmos conjuntamente o ADN plasmídico com o sistema X/XO e pequenas doses de oxaliplatina. A incubação com a NAC diminui os danos provocados ao ADN.

Em um segundo tempo, avaliaram-se os efeitos dos miméticos de SOD sobre as alterações do ADN induzidas pela oxaliplatina sozinha ou associada às FRO. A incubação do ADN plasmídico com Mangafodipir induziu de per si danos no ADN tal como mostra o aumento da proporção de forma II em relação ao plasmídio não tratado. Este efeito é amplificado quando se adicionam quer aniões superóxidos, quer oxaliplatina, e é máximo quando Mangafodipir, FRO e oxaliplatina são incubados conjuntamente com o ADN plasmídico. Aí, ainda, certos antioxidantes tais como a NAC inibem parcialmente as alterações do ADN.

Observou-se um efeitos similar quando se utiliz.ou o CuDIPS e, numa medida menor, quando se utilizou o MnTBAP como mimético de SOD. EXEMPLO 7: EFEITOS ANTITUMORAIS DA NAC, DO CuDIPS, DO MnTBAP E DO MnDPDP ASSOCIADOS OU NÃO COM UMA QUIMIOTERAPIA ANTICANCEROSA NO MURGANHO.

Calculou-se a actividade antitumoral in vivo ' de diversos tratamentos antioxidantes. Para essas, experiências, utilizaram-se murganhos fêmeas BALB/c (para a injecção de células tumorais CT-26) ou C57/BL6) (para a 23 injecção de células tumorais Hepa 1-6) com a idade de 6 a 8 semanas. (IFFA CREDO, L'Arbresles, França). Injectaram-se dois milhões de células tumorais no dorso dos animais por via subcutânea. Quando o tamanho do tumor atingiu 200 a 500 min3, os animais receberam uma injecção única de 20 mg/kg de oxaliplatina (ELOXATINA®) ou de uma solução salina.

Trataram-se os murganhos em seguida por via intraperitoneal, duas horas após a injecção de oxaliplatina ou de solução salina, com 10 mg/kg de Mangafodipir, de MnTBAP ou de CuDIPS, ou com 150 mg/kg de NAC, ou com uma solução salina. A injecção dos diferentes antioxidantes prosseguiu durante um mês (três injecções por semana para as mesmas doses). Um grupo de murganhos inoculados com células tumorais não foi tratado.

Mediu-se o tamanho dos tumores de três em três dias. Calculou-se o volume tumoral como segue : vt (mm3) = (LxW2)/2, em que L é a dimensão mais longa e W é a dimensão mais curta do tumor em mm. Incluíram-se quinze murganhos em cada grupo.

Os resultados da experiência baseada sobre a injecção de células tumorais de carcinoma eólico CT26 em murganhos BALB/C encontram-se ilustrados na Figura 34.

Legenda da Figura 34: (♦) testemunhas, (M.) oxaliplatina, (▲) teslacan, (Φ) oxaliplatina + teslacan,. (o) NAC,

( 6) oxaliplatina + NAC (Δ) MnTBAP, 24 (D) oxaliplatina + MnTBAP, (IP) CuDIPS, ( £ ) oxaliplatina + CuDIPS. O volume dos tumores encontra-se indicado em ordenadas; em abcissas indica-se o número de dias após a injecção da oxaliplatina ou da solução salina.

Observa-se que a injecção de NAC a murganhos não tratados com a oxaliplatina induziu um aumento de 44% dos volumes tumorais após um mês, em relação aos murganhos que não receberam NAC.

Enquanto que a administração de oxaliplatina divide por dois os volumes tumorais em relação aos animais não tratados, a administração de NAC a murganhos tratados com oxaliplatina bloqueia totalmente o efeito inibidor da oxaliplatina sobre o crescimento tumoral.

Pelo contrário, a injecção de miméticos químicos de SOD como o MnTABP, o CuDIPS ou o Mangafodipir diminui respectivamente de 59%, 28% e 54% o volume dos tumores a um mês em relação aos animais não tratados. Além disso, os três miméticos de SOD administrados aos murganhos tratados com oxaliplatina diminuem respectivamente de 35%, 31% e 63% o volume dos tumores a um mês em relação aos animais tratados apenas com a oxaliplatina.

Os resultados da experiência baseada na injecção de células Hepa 1-6 em murganhos C57BL/6 encontram-se ilustrados na Figura 35.

Legenda da Figura 35: (♦) testemunhas, 25 (&.) oxaliplatina, (A) teslacan, (·*) oxaliplatina + teslacan, (o) NAC, ( % ) oxaliplatina + NAC (Δ) MnTBAP, (n) oxaliplatina + MnTBAP, {&) CuDIPS, (Í) oxaliplatina + CuDIPS. 0 volume dos tumores encontra-se indicado em ordenadas; em abcissas indica-se o número de dias após a injecção da oxaliplatina ou da solução salina.

Observa-se ainda que a injecção de NAC induziu um aumento de 50% dos volumes tumorais após um mês, em relação aos murganhos que não receberam NAC. Enquanto que a administração de oxaliplatina divide por quatro os volumes tumorais em relação aos animais não tratados, a administração de NAC a murganhos tratados com a oxaliplatina bloqueia totalmente o efeito inibidor da oxaliplatina sobre o crescimento tumoral. Pelo contrário, a injecção de miméticos químicos de SOD como o MnTBAP, o CuDIPS ou o Mangafodipir diminui de, respectivamente, 42%, 9% e 34%, o volume dos tumores a um mês em relação aos animais não tratados. Além disso, se a administração conjunta de MnTBAP e de CuDIPS com a oxaliplatina não aumentar de maneira significativa o efeito antitumoral da oxaliplatina, a administração de MnDPDP a murganhos tratados com a oxaliplatina diminui de 63% o volume dos tumores a um mês em relação aos animais tratados apenas com a oxaliplatina (Figura 35).

Lisboa, 30 de Dezembro de 2008

Claims (3)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de Mangafodipir como principio activo antitumoral e protector de leucócitos para a obtenção de um medicamento destinado a um tratamento anticanceroso.

2. Utilização de acordo com a reivindicação. 1, caracterizada pelo facto de se utilizar o Mangafodipir em associação com um agente antitumoral susceptivel de induzir nas células uma produção de formas reactivas do oxigénio, escolhido de entre a doxorubicina, a mitomicina C, o etoposido, os derivados de platina, o tamoxifeno, o taxol, o 5-fluoro-uracilo, o irinotecan, a gemcitabina, o endoxan, a estreptozotocina, a bleomicina e a vincristina.

3. Composição farmacêutica que contém Mangafodipir, associado a um agente antitumoral escolhido de entre a mitomicina C, o etoposido, os derivados de platina, o tamoxifeno, o 5-fluoro-uracilo, o irinotecan, a gemcitabina, o endoxan, a estreptozotocina, a bleomicina e a vincristina. Lisboa, 30 de Dezembro de 2008