PT1651769E - Utilização de construções compreendendo motivos de sequências de recombinação para intensificar a expressão genética em musgo - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"UTILIZAÇÃO DE CONSTRUÇÕES COMPREENDENDO MOTIVOS DE SEQUÊNCIAS DE RECOMBINAÇÃO PARA INTENSIFICAR A EXPRESSÃO GENÉTICA EM MUSGO" A presente invenção refere-se a métodos e materiais para melhorar a expressão genética em células eucarióticas, particularmente em células de plantas compreendidas em musgos, como células de protonema de musgo. A amplificação genética para melhorar a expressão de proteínas recombinantes em culturas de células de mamífero é uma estratégia geralmente utilizada (Herlitschka et al. (1996) Protein Expr. Purif. 8, 358-364; Ringold et al. (1981) J. Mol. Appl.).

Em plantas, conduzir estratégias de amplificação genética é problemático devido a eventos de silenciamento que podem ser desencadeados por integrações de múltiplas cópias de DNA heterólogo (Asaad et al. (1993) Plant Mol Bíol. 22, 1067-1085). Recentemente têm sido desenvolvidas estratégias para amplificação genética em plantas para ultrapassar estas limitações. O elemento genético de actuação cis aps foi isolado de uma região espaçadora não transcrita de DNA ribossómico de tabaco. Este elemento espaçador foi fundido a genes repórter de interesse e originou um número de cópias aumentado do gene heterólogo de interesse e níveis mais elevados de expressão de proteínas heterólogas daqueles (Borisjuk et al. (2000) Nature Blotechnol. 18, 1303-1306). 2

Foi descrita outra estratégia por Klimuyk et al. que envolveu a expressão de proteínas heterólogas via processamento trans (WO 02/097080).

Até à data pouco se sabe acerca da correlação entre número de cópias e expressão de genes heterólogos em plantas transgénicas de musgo. A utilização de musgos para a produção de proteínas recombinantes é uma tecnologia bem estabelecida (EP1206561, Gorr et al. 2001, Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 363 Suplemento: R 85). Tipicamente, quaisquer desde 1 até cerca de 50 cópias do plasmideo de transformação podem ser integradas no genoma de tecido de musgo transformado (Schaefer (2002) Annu. Rev. Plant Biol. 5_3, 477-501). Dependendo da concepção das construções de transformação empregue, pode ocorrer recombinação homóloga, isto é, um evento de integração dirigido, e/ou recombinação heteróloga, isto é, um evento de integração aleatório ou não dirigido. Assim, utilizando sequências de DNA (isto é, compreendidas por sequências codificadoras ou não codificadoras) para a transformação que são homólogas a sequências de DNA genómico de um musgo, podem obter-se um ou mais eventos de recombinação homóloga via integração do DNA introduzido ou de transformação no locus genómico do DNA homólogo. A utilização de sequências de DNA (isto é, compreendidas por sequências codificadoras ou não codificadoras) para a transformação que não têm qualquer homologia apreciável com uma sequência de DNA genómico de um musgo pode dar origem a um ou mais eventos de recombinação heteróloga via integração do DNA introduzido aleatoriamente no genoma. O musgo é o único sistema vegetal que exibe elevada frequência de recombinação homóloga (Strepp et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95, 4368-4373; Schaefer (2002) Annu. Rev. 3

Plant Biol. 53_, 477-501). Este atributo aparentemente único dos musgos tem sido utilizado para a introdução dirigida de genes. No entanto, a amplificação da expressão genética por aumento do número de cópias de plasmideos de interesse, para gerar niveis mais elevados de proteina por unidade de massa de tecido de musgo transformado de modo estável, ainda não foi descrita até ao presente.

Surpreendentemente, verificou-se que a transformação, tipicamente co-transformação, de células (protoplastos) de tecido de musgo com pelo menos duas sequências heterólogas de ácidos nucleicos compreendendo pelo menos um conjunto de sequências de recombinação origina um aumento do número de cópias integradas de construções de ácidos nucleicos heterólogos em tecido regenerado, como células compreendidas em protonema de musgo, o que, por sua vez, está correlacionado com um aumento dos niveis de expressão de proteínas.

Em consequência, um objectivo da invenção consiste em proporcionar um método melhorado para a produção de proteínas de interesse em células compreendidas em tecido de musgo.

De acordo com a presente invenção é proporcionado um método de amplificação da expressão genética numa célula de planta de musgo, que compreende: 1) proporcionar pelo menos uma primeira construção de ácido nucleico heteróloga compreendendo pelo menos uma sequência de nucleótidos heteróloga operativamente ligada a um promotor, em que a referida construção é flanqueada na sua extremidade 5' por uma primeira 4 sequência de recombinação e é flanqueada na extremidade 3' da referida construção por uma segunda sequência de recombinação na mesma orientação da primeira; 2) proporcionar pelo menos uma segunda construção de ácido nucleico heteróloga compreendendo pelo menos uma sequência de nucleótidos heteróloga operativamente ligada a um promotor, em que a referida construção é flanqueada na sua extremidade 5' pela referida segunda sequência de recombinação e é flanqueada na extremidade 3' da referida construção pela referida primeira sequência de recombinação na mesma orientação da segunda, e 3) transformar na célula da planta de musgo pelo menos a referida primeira e a referida segunda construções de ácidos nucleicos heterólogas. 0 profissional apreciará que depois de as referidas pelo menos duas construções heterólogas serem transformadas na célula da planta de musgo, como um protoplasto de musgo, por exemplo, um protoplasto de Physcomitrella patens, que então é permitido regenerar em protonema de musgo, por exemplo, de Physcomitrella patens, sofrerão recombinação entre si muitas vezes. Este processo, depois de iniciado na célula da planta de musgo, aumenta ai o número de cópias de construções de DNA de transformação integradas da invenção.

Assim, noutro aspecto da invenção é proporcionado um protonema de musgo, preferivelmente protonema de Physcomitrella patens, compreendido por células estavelmente transformadas, mais preferivelmente co- 5 transformadas, com pelo menos duas construções complementares da invenção.

Por fim, aumentos significativos do nivel da proteina heteróloga de interesse a partir do pelo menos um gene heterólogo de interesse são mensuráveis acima dos niveis de proteína que são mensuráveis em células de protonema de musgo de construções de transformação convencionais sem as caracteristicas das construções da invenção. A pelo menos primeira e a pelo menos segunda sequências de recombinação formam um conjunto complementar que permite a recombinação entre si das construções da invenção. Naturalmente, o profissional apreciará que podem ser empregues construções da invenção nas quais podem ser utilizados um ou mais conjuntos complementares de sequências de recombinação, dependendo de quantas das sequências de nucleótidos de interesse iguais ou diferentes é pretendido utilizar para a produção de proteínas, como 1, 2, 3, 4 ou 5 ou mais conjuntos. Preferivelmente utiliza-se um único conjunto complementar de sequências de recombinação, por conveniência.

Noutro aspecto da invenção é proporcionado um conjunto de vectores de ácidos nucleicos adequados para amplificar a expressão genética numa célula de planta de musgo, em que o referido conjunto de vectores de ácidos nucleicos compreende: i) pelo menos uma primeira construção de ácido nucleico heteróloga compreendendo pelo menos uma sequência de nucleótidos heteróloga operativamente ligada a um promotor, em que a referida construção é flanqueada na sua extremidade 5' por uma primeira sequência de recombinação e é flanqueada na extremidade 3' da referida construção por uma segunda sequência de recombinação na mesma orientação 6 da primeira, e ii) pelo menos uma segunda construção de ácido nucleico heteróloga compreendendo pelo menos uma sequência de nucleótidos heteróloga operativamente ligada a um promotor, em que a referida construção é flanqueada na sua extremidade 5' pela referida segunda sequência de recombinação e é flanqueada na extremidade 3' da referida construção pela referida primeira sequência de recombinação na mesma orientação da segunda.

Assim, as duas construções compreendem sequências de recombinação complementares semelhantes localizadas em diferentes sitios que permitem a recombinação entre si das construções in situ em células de protonema de musgo transformadas compreendidas no protonema de musgo, por exemplo, protonema de Physcomitrella patens. Preferivelmente, as construções da invenção estão em forma linear.

Essas construções podem ser utilizadas para transformar protoplastos de musgo em pelo menos dois eventos de transformação separados, em que um primeiro evento de transformação está separado de um segundo evento de transformação no tempo, ou as construções da invenção podem ser co-transformadas em protoplastos de musgo que então é permitido regenerarem protonema de musgo. Preferivelmente, o evento de transformação compreende a co-transformação de protoplastos de musgo com pelo menos duas construções da invenção, como descrito acima. A sequência de recombinação utilizada em construções da invenção pode ser qualquer sequência seleccionada de qualquer organismo, tal como de DNA genómico de plantas, tal como de DNA genómico, cDNA, regiões de intrões ou exões 7 ou regiões não codificadoras, ou qualquer combinação desses, por exemplo, de Physcomítrella patens. DNA genómico adequado para utilização como sequência de recombinação pode compreender DNA de um exão ou de um intrão ou um hibrido dos dois. Preferivelmente, a sequência de recombinação é formada por DNA de um intrão ou região não codificadora de DNA. Como discutido aqui, a orientação das duas sequências de recombinação flanqueadoras é preferivelmente a mesma orientação, por exemplo, na direcção 5' para 3' ou na direcção 3' para 5' nas duas construções de transformação, apesar de a localização real das sequências de recombinação nas duas construções ser diferente entre elas, como aludido acima. Naturalmente, o profissional apreciará que as construções heterólogas da invenção compreenderão sequências de recombinação em posição e orientação apropriadas que permitem a ocorrência de eventos de recombinação entre as duas. As sequências de nucleótidos de recombinação das construções da invenção podem ter qualquer comprimento, desde que sejam capazes de causar ou permitir a ocorrência de eventos de recombinação. Comprimentos adequados para as sequências de recombinação empregues em construções da invenção variam entre 25 - 1000 nucleótidos de comprimento ou mais; entre 25 - 650

nucleótidos de comprimento; entre 50 - 650 nucleótidos de comprimento; entre 100 - 400 nucleótidos de comprimento, ou entre 200 - 400 nucleótidos de comprimento, por exemplo, com cerca de 200 +/- 50 nucleótidos de comprimento. O profissional apreciará que o comprimento das sequências de recombinação de construções da invenção pode variar, dependendo da concepção.

Noutro aspecto da invenção é proporcionada uma célula de musgo compreendendo o conjunto de vectores de ácidos 8 nucleicos da invenção, protonema de musgo compreendido pelas referidas células de musgo e/ou plantas de musgo compreendendo o conjunto de vectores de ácidos nucleicos da invenção, particularmente uma célula de protonema de musgo, protonema de musgo compreendido por células de protonema compreendendo o conjunto de vectores de ácidos nucleicos da invenção e/ou plantas de musgo compreendendo o conjunto de vectores de ácidos nucleicos da invenção que são Physcomitrella patens. Aspectos particulares da invenção serão agora descritos mais pormenorizadamente. 0 termo "heterólogo" é utilizado no sentido lato abaixo para indicar que o gene/sequência de nucleótidos em questão foi introduzido em protoplastos de musgo utilizando engenharia genética, isto é, por intervenção humana. Um gene heterólogo pode aumentar a expressão de uma proteína de interesse a partir de um gene equivalente endógeno, isto é, um que normalmente realiza a mesma função ou uma função semelhante, ou a sequência inserida pode ser adicional ao gene endógeno ou outra sequência. Ácido nucleico heterólogo a uma célula pode ser de ocorrência não natural em protoplastos de musgo desse tipo, variedade ou espécie. Assim, o ácido nucleico heterólogo pode compreender uma sequência codificadora de um tipo particular de organismo ou derivada daquele, como de uma espécie de mamífero, por exemplo, de espécie humana, ovina, bovina, equina ou porcina, colocada no contexto de um protoplasto de musgo, como um protoplasto derivado de Physcomitrella patens. Outra possibilidade é uma sequência de ácido nucleico ser colocada num protoplasto de musgo no qual ela própria ou um homólogo se encontra naturalmente, mas em que a sequência de ácido nucleico está ligada e/ou é adjacente a ácido 9 rrucleico que não ocorre naturalmente na célula ou células desse tipo ou espécie ou variedade de planta, tal como operativamente ligada a uma ou mais sequências reguladoras, como uma sequência promotora, para controlo da expressão. "Gene", a menos que o contexto imponha em contrário, refere-se a qualquer ácido nucleico que codifica informação genética para tradução num péptido, polipéptido ou proteína. "Vector" é definido de modo a incluir, inter alia, qualquer plasmídeo, cosmídeo, fago ou vector virai em forma linear ou circular de filamentação dupla ou simples, que pode ou não ser auto-transmissível ou mobilizável, e que pode transformar um hospedeiro procariótico ou eucariótico e existe de forma extra-cromossómica (por exemplo, plasmídeo de replicação autónoma com uma origem da replicação). Estão especificamente incluídos vectores vaivém, pelos quais se pretende significar um veículo de dna capaz, naturalmente ou por concepção, de replicação em dois organismos hospedeiros diferentes, que podem ser seleccionados de actinomicetos e espécies relacionadas, bactérias e células eucarióticas (por exemplo, de plantas superiores, musgos, mamífero, levedura ou fúngicas). "Vector de expressão" refere-se a um vector no qual um ácido nucleico está sob o controlo e operativamente ligado a um promotor ou outros elementos reguladores apropriados para transcrição numa célula-hospedeiro, como uma célula microbiana ou um protoplasto de musgo. 0 vector pode ser um vector de expressão bifuncional que funciona em múltiplos hospedeiros. No caso de DNA genómico ou subgenómico, este pode conter o seu próprio promotor ou outros elementos 10 reguladores, e no caso de cDNA, este pode estar sob o controlo de um promotor ou outros elementos reguladores apropriados para expressão na célula-hospedeiro.

Um "promotor" é uma sequência de nucleótidos a partir do qual pode ser iniciada a transcrição de DNA operativamente ligado a jusante (isto é, na direcção 3' no filamento sentido de DNA de filamentação dupla). "Operativamente ligado" significa reunido como parte da mesma molécula de ácido nucleico, adequadamente posicionado e orientado para transcrição a ser iniciada a partir do promotor. 0 termo "indutivel" aplicado a um promotor é bem compreendido pelos profissionais Essencialmente, a expressão sob o controlo de um promotor indutivel é "ligada" ou aumentada em resposta a um estimulo aplicado. A natureza do estimulo varia entre promotores. Alguns promotores indutiveis causam niveis baixos ou não detectáveis de expressão (ou ausência de expressão) na ausência do estimulo apropriado. Outros promotores indutiveis causam expressão constitutiva detectável na ausência do estimulo. Qualquer que seja o nivel de expressão na ausência do estimulo, a expressão a partir de qualquer promotor indutivel é aumentada na presença do estimulo correcto. A invenção também abrange a utilização de uma variante de qualquer uma destas sequências. Uma proteína variante partilha homologia ou é idêntica à totalidade ou a parte das sequências discutidas acima. Em termos gerais, qualquer que seja o termo utilizado aqui, variantes podem ser: 11 (i) variantes homólogas de ocorrência natural da proteína relevante, (ii) variantes homólogas geradas artificialmente (derivados) que podem ser preparadas pelo profissional à luz da presente divulgação, por exemplo, por mutagénese dirigida a sítios ou aleatória ou por síntese directa. Preferivelmente, o ácido nucleico variante, que codifica o polipéptido variante, é gerado directa ou indirectamente (por exemplo, via um ou mais passos de amplificação ou replicação) a partir de um ácido nucleico original. Alterações na sequência de ácido nucleico podem produzir um derivado por via de uma ou mais adições, inserções, deleções ou substituições de um ou mais nucleótidos do ácido nucleico, conduzindo à adição, inserção, deleção ou substituição de um ou mais aminoácidos no polipéptido codificado. A mutação desejável pode consistir em mutagénese aleatória ou dirigida a sítios, de modo a alterar a actividade (por exemplo, especificidade) ou estabilidade do polipéptido codificado. Alterações podem ser feitas via variação conservativa, isto é, substituição de um resíduo hidrófobo, como isoleucina, valina, leucina ou metionina, por outro, ou a substituição de um resíduo polar por outro, como lisina por arginina, ácido aspártico por glutâmico ou asparagina por glutamina. Também estão incluídas variantes com substituições não conservativas. Em regiões que são críticas na determinação da conformação ou actividade dos péptidos, essas alterações podem conferir ao polipéptido propriedades vantajosas, por exemplo, estabilidade ou especificidade alterada. 12 A semelhança ou homologia no caso de variantes é preferivelmente estabelecida via comparações de sequências efectuadas utilizando FASTA e FASTP (ver Pearson & Lipman, 1988. Methods in Enzymology 183: 63-98). Os parâmetros são preferivelmente ajustados, utilizando a matriz por defeito, do modo seguinte:

Gapopen (penalidade para o primeiro residuo num

hiato): -12 para proteínas/ -16 para DNA

Gapext (penalidade para resíduos adicionais num

hiato): -2 para proteínas/ -4 para DNA KTUP comprimento das palavras: 2 para proteínas/ 6 para DNA.

Homologia pode ser ao nível da sequência de nucleótidos e/ou sequência de aminoácidos codificada. Preferivelmente, a sequência de ácido nucleico e/ou aminoácidos partilha pelo menos cerca de 75% ou 80% de identidade, muito preferivelmente pelo menos cerca de 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade. A homologia também pode ser avaliada utilizando uma metodologia de sondagem (Sambrook et al., 1989). Uma fórmula comum para calcular as condições de restrição requeridas para se obter hibridização entre moléculas de ácidos nucleicos com uma homologia de sequências especificada é: Tf = 81,5°C + 16,6Log [Na+] + 0,41 (% G+C) - 0,63 (% formamida) - 600/#bp no duplex. Como ilustração da fórmula acima, utilizando [Na+] = [0, 368] e 50-% de

formamida, com um teor GC de 42% e uma dimensão média da sonda de 200 bases, a Tf é 57°C. A Tf de um duplex de DNA diminui em 1 - 1,5°C com cada decréscimo de 1% da homologia. Assim, alvos com mais do que cerca de 75% de 13 identidade de sequências serão observados utilizando uma temperatura de hibridização de 42°C.

Utilização em plantas de musgo

Como descrito abaixo, nos seus vários aspectos, a invenção será geralmente implementada em protoplastos de musgo, utilizando ácidos nucleicos que codificam proteínas de interesse.

Promotores adequados que operam em protoplastos de musgo incluem o Virus do Mosaico da Couve Flor 35S (CaMV 35S) . Outros exemplos são divulgados na página 120 de Lindsey & Jones (1989) "Plant Biotechnology in Agriculture" @ Pub. OU Press, Milton Keynes, R.U. O promotor pode ser seleccionado de modo a incluir um ou mais motivos ou elementos de sequências que conferem controlo regulador quanto ao desenvolvimento e/ou especifico para tecidos da expressão. Promotores indutiveis de plantas incluem o promotor induzido por etanol de Caddick et al. (1998) Nature Biotechnology 16_: 177-180.

Um terminador é contemplado como uma sequência de DNA na extremidade de uma unidade de transcrição que sinaliza a terminação da transcrição. Estes elementos são sequências não traduzidas 3' contendo sinais de poliadenilação, cuja função é causar a adição de sequências de poliadenilato à extremidade 3' de transcritos primários. Para expressão em células de plantas, a sequência terminadora da transcrição da nopalina sintase (A. Depicker et al., 1982, J. of Mol. & Applied Gen. 1: 561-573) pode servir de sinal de terminação da transcrição, tal como o terminador de CaMV 35S (Tõpfer et al. (1987) NAR 15, 5890) . 14

Se desejado, marcadores genéticos seleccionáveis podem ser incluídos em construções convencionais adicionais, como plasmídeos circulares, ou em construções adicionais de DNA linearizadas que são co-transformadas numa célula de musgo da invenção, como as que conferem fenótipos seleccionáveis, como resistência a antibióticos ou herbicidas (por exemplo, canamicina, higromicina, fosfinotricina, clorsulfurão, metotrexato, gentamicina, espectinomicina, imidazolinonas e glifosato). A presente invenção também proporciona métodos que compreendem a introdução dessas construções compreendendo sequências heterólogas apropriadas numa célula de planta de musgo e/ou indução da expressão de uma construção da invenção numa célula de planta de musgo, por aplicação de um estímulo adequado, por exemplo, um indutor exógeno eficaz. Células de plantas de musgo adequadas incluem o protoplasto de musgo e células compreendidas no protonema, como as derivadas de Physcomitrella patens. 0 ácido nucleico pode ser introduzido em protoplastos de musgo utilizando qualquer tecnologia adequada, como captação de DNA mediada por PEG, como descrito aqui, bombardeamento de partículas ou microprojécteis (US 5100792, EP-A-444882, EP-A-434616), microinjecção (WO 92/09696, WO 94/00583, EP 331083, EP 175966, Green et al. (1987) "Plant Tissue and Cell Culture", Academic Press), electroporação (EP 290395, WO 8706614 Gelvin Debeyser), outras formas de captação directa de DNA (DE 4005152, WO 9012096, US 4684611), captação de DNA mediada por lipossomas (por exemplo, Freeman et al. Plant Cell Physiol. 29: 1353 (1984)) ou o método de aplicação de vórtice (por exemplo, Kindle, PNAS U.S.A. 87: 1228 (1990d). Métodos 15 físicos para a transformação de células de plantas são revistos em Oard, 1991, Biotech. Adv. 9_: 1-11. São preferidos electroporação, captação de DNA mediada por PEG e captação directa de DNA. É especialmente preferido o procedimento de captação de DNA mediada por PEG modificado, divulgado aqui nos exemplos. A escolha particular de uma tecnologia de transformação será determinada pela sua eficiência para transformar certas espécies de musgo, bem como a experiência e preferência do profissional que implementa a invenção com uma metodologia particular de eleição. Será claro para o profissional que a escolha particular de um sistema de transformação para introduzir ácido nucleico em protoplastos de musgo não é essencial para a invenção. No entanto, é preferida a utilização do sistema de transformação de DNA mediada por PEG como descrito aqui.

Assim, vários aspectos da presente invenção proporcionam um método de transformação de um protoplasto de musgo, envolvendo a introdução de uma construção heteróloga à base de ácido nucleico da invenção, como descrito aqui, num protoplasto de musgo e regeneração do protoplasto em tecido de protonema, e causando ou permitindo a expressão de proteína a partir das construções da invenção. Assim, o profissional poderá esperar que a expressão da proteína dirigida para o citosol ou outros compartimentos celulares possa ser melhorada por utilização de construções e métodos da invenção. Preferivelmente, proteínas recombinantes produzidas pelos métodos da invenção são segregadas para o meio a partir de tecido de protonema transformado de modo estável. 16

Assim, ao empregar as pelo menos duas construções da invenção, como descrito aqui, podem ser geradas linhas de produção albergando elevados números de cópias do gene alvo, o que, por sua vez, origina elevados rendimentos proteicos durante o período de cultura num biorreactor adequado.

Escolha de genes a intensificar

Genes de interesse incluem os que codificam proteínas que são, elas próprias, medicamentos naturais, como agentes farmacêuticos ou produtos veterinários. Ácidos nucleicos heterólogos podem codificar, inter alia, genes de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal. Os polipéptidos produzidos podem ser utilizados para a produção de polipéptidos que podem ser purificados a partir daqueles para utilização noutra aplicação. Essas proteínas incluem mas não estão limitadas à proteína do retinoblastoma, p53, angiostatina e leptina. De igual modo, os métodos da invenção podem ser utilizados para produzir proteínas reguladoras de mamífero. Outras sequências de interesse incluem proteínas, hormonas, como hormona estimulante do folículo, factores de crescimento, citoquinas, albumina do soro, hemoglobina, colagénio, taumatina, proteínas do tipo taumatina, factores de crescimento epidérmico, como VEGF, heterodímeros, anticorpos, imunoglobulinas, anticorpos de fusão e anticorpos de cadeia simples.

Expressão de genes alvo

Em termos gerais, ácidos nucleicos heterólogos podem ser expressos por qualquer processo apropriado utilizado na 17 área, ou podem ser transcritos ou expressos do modo seguinte: (i) expressão de dna "nu", por exemplo, compreendendo um promotor operativamente ligado à sequência heteróloga numa construção da invenção, (ii) expressão a partir de um vector de expressão, como um vector de replicação. Em termos gerais, os profissionais são bem capazes de construir vectores e de conceber protocolos para expressão genética recombinante. Podem ser escolhidos ou construídos vectores adequados contendo sequências reguladoras apropriadas, incluindo sequências promotoras, fragmentos terminadores, sequências de poliadenilação, sequências intensificadoras, genes marcadores e outras sequências, consoante o apropriado. Para mais pormenores ver, por exemplo, "Molecular Cloning: a Laboratory Manual": 2a edição, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ou "Current Protocols in Molecular Biology", Segunda Edição,

Ausubel et al. editores, John Wiley & Sons, 1992.

Como discutido acima, os presentes inventores mostram que expressão intensificada a partir de construções da invenção introduzidas (preferivelmente em níveis elevados) nos protoplastos de um musgo, preferivelmente a elevada densidade celular, como Physcomitrella patens, cujas construções são integradas no genoma, dá origem a mRNA transcrito.

Assim, num aspecto da invenção, é divulgada a utilização de um protoplasto de musgo transformado capaz de gerar mRNA 18 que codifica uma proteina alvo gerada por transcrição a partir de uma construção de ácido nucleico introduzida da invenção incluindo a sequência de nucleótidos alvo operativamente ligada a um promotor, cuja construção é introduzida na célula de um organismo.

Assim, o "ácido nucleico introduzido" incluirá a sequência de ácido nucleico heteróloga como uma sequência de DNA proporcionada na forma de uma construção da invenção que é capaz de dar origem à produção de proteina extracelular num nivel elevado relativamente ao nivel da produção de proteína normalmente associado a expressão transgénica estável da referida sequência de DNA. Num aspecto da invenção, a sequência de ácido nucleico heteróloga pode codificar uma proteína que é composta por um péptido de sinal e/ou trânsito acoplado à sequência proteica ou polipeptidica de eleição. 0 repórter pode ser qualquer proteína detectável, como um gene marcador, habitualmente utilizada na área, como GUS, GFP, luciferase, etc. Preferivelmente, o repórter é um marcador não invasivo, como GFP ou luciferase.

Naturalmente, o profissional reconhecerá que mais do que uma sequência de ácido nucleico heteróloga pode ser utilizada na ou em cada construção da invenção, apesar de ser preferido uma única sequência em cada caso. Múltiplos vectores (cada um incluindo uma ou mais sequências de nucleótidos que codificam a proteína heteróloga de eleição) podem ser introduzidos nos protoplastos de musgo via métodos de captação de DNA mediada por PEG, como descrito aqui. Isto pode ser útil para produzir, por exemplo, múltiplas subunidades, por exemplo, de uma enzima. 19

Numa forma de realização adicional da invenção podem obter-se niveis elevados de proteínas completas e correctamente reunidas consistindo em múltiplas subunidades por influência da estequiometria das diferentes sequências de ácidos nucleicos codificadoras integradas no genoma. A quantidade de proteina apropriadamente reunida que consiste em múltiplas subunidades depende da estequiometria das subunidades ao nivel proteico. No caso de subunidades a serem dirigidas para compartimentos diferentes via péptidos de sinal, por exemplo, para a via secretora, a estequiometria é não só influenciada pela expressão derivada, por exemplo, de sinais promotores e de transcrição, mas também pelo sinal de direccionamento e processamento do sinal de direccionamento, por exemplo, clivagem apropriada do péptido de sinal. Neste aspecto da invenção, a utilização de quantidades não equimolares das sequências de ácidos nucleicos que codificam para as diferentes subunidades pode ser apropriada para proteínas multiméricas, por exemplo, para imunoglobulinas. Assim, podem obter-se quantidades não equimolares de ácidos nucleicos codificadores que originam uma estequiometria apropriada de múltiplas subunidades de uma proteína dimérica ou multimérica proporcionando construções apropriadamente concebidas da invenção que permitem a reunião correcta das diferentes subunidades.

Como descrito nos Exemplos abaixo, a expressão de sequências heterólogas utilizando métodos da invenção, quando introduzidas deste modo, pode originar níveis muito elevados do polipéptido alvo ao longo do período de expressão, que geralmente será vários dias, dependendo dos métodos precisos e materiais empregues. Por utilização dos 20 métodos da invenção como descritos aqui podem obter-se niveis elevados de produção de polipéptidos heterólogos de construções incorporadas de modo estável da invenção a partir de protonema transformado, preferivelmente co-transformado, regenerado. Todas as referências discutidas aqui, tanto quanto podem ser necessárias para suplementar a presente divulgação, são incorporadas aqui na sua totalidade por referência. A invenção será agora adicionalmente descrita com referência às seguintes Figuras e Exemplos não limitadores. À luz destes, outras formas de realização da invenção ocorrerão aos profissionais.

EXEMPLOS Métodos e Materiais

Material vegetal

Utiliza-se a estirpe de tipo selvagem de Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. (Reski et al. 1994). É uma subcultura da estirpe 16/14 que foi recolhida por H.L.K. Whitehouse em Gransden Wood, Huntingdonshire, R.U., e propagada por Engel (1968) .

Construção de vectores Construção de pRTlOlVEGF C3 cDNA de factor de crescimento vascular endotelial humano 121 (VEGFi2i) sem sequência líder é excisado, na forma de um fragmento Ndel-Sall, de pCYTEXP-VEGFm (GBF, Braunschweig, Alemanha) . Este fragmento é submetido a tratamento das extremidades pela reacção de Klenow e é introduzido em 21 pRTIOl (Tõpfer et al. 1987) no sítio de restrição Smal, para formar o plasmídeo pRTlOlVEGF C3. Nesta construção, o cDNA de VEGF121 menos a sequência líder foi colocado a jusante do promotor CaMV 35 S e por trás do terminador do CaMV (Gorr, 1999) .

Construção de pRTlOlTPVEGF C3 A sequência para o péptido de sinal do VEGF (sinal de triagem para secreção) é clonada em pRTlOlVEGF C3. O cDNA do péptido de sinal é amplificado a partir do plasmídeo pRTIOl P21 (Gorr, 1999) utilizando o "primer" 5' MOB323 (5'-ATACTCGAG G.M GAT GM CTT TTCTGCCTG TCT TSG-3 », SEQ ID NO 1) contendo um lado de restrição Xho I e o "primer" 3' MOB349 (5 ' -CTG CCA TGG GTG CAG COT GQG ACC AC-3 ', SEQ ID NO 2) contendo um lado de restrição NcoI. O DNA amplificado é digerido com Xhol e Ncol e é ligado em pRTlOlVEGF C3 (digerido com Xhol / Ncol), dando origem a pRTlOlTPVEGF C3. 0 plasmídeo resultante contém as sequências codificadoras para o péptido de sinal do VEGF e VEGFm na estrutura sob o controlo do promotor CaMV 35 S.

Procedimento de clonaqem para a primeira sequência de recombinação 5' em pRT99 A sequência 5' de 250 pares de bases do 5o intrão: (5'-GÇQ GAAATGTTCAGAGTT A AGCG AAAT C AÇMGTAAAAGA- '3 ATTG GAAGCAGAAG AATT ITT GAGCAG CT GTTCTTAATTCACG CAACGACAACG CTATTAACTGTATSTGTA GACGATGCACnTCGTACIXíAAQGCWCTAAATTTATTATATCCCTTCATAACTACAGGGAAGGCGGAAATCACA- AAACTATTÕGTACCTACSTACTAGASCCTCCAGÔATCAAACATAAGAGTGA .MC ACTÔG AC e -3', SEQ ID NO 3) do gene alfa 1,3-fucosiltransferase de

Physcomitrelia patens é amplificada a partir de DNA genómico de Physcomitrella patens por PCR com verificação por Pfu (Promega, Alemanha) utilizando o "primer" a montante Recl_SalI_SacII (5'— GAG GTC ΘΑΟCCGCSG MA TGT TCA GAG-3 ', SEQ ID NO 4) e o "primer" a jusante Recl_SmaI (5'- 22 CTCCCOGOG TCGftSTGTTTCACTC-3 ', SEQ ID NO 5). Após restrição do produto de amplificação resultante com Sali e Smai, é clonado no vector pRT99 (Tõpfer et al. 1988) (digerido com Sali e Smai). O plasmideo resultante pRT99Recl contém a primeira sequência de recombinação 5'.

Procedimento de clonagem para a segunda sequência de recombinação 3' em pRT99Recl A sequência 3' de 208 pares de bases do 5o intrão: (5' — ©GGACCCMSCGTAAÔAASTCTTATGAAMAGTTACCTCACAr

SATTMAACTAAACATA66A AAATACCAAT^ACÍCCÂATGTGTCJ^TGAGATTAAGíKTTGACTAACATGAAAft-TATAA ATATTGACGGMTGAAA<3AMTTÀS AAMCAG6ACCTÔTAGAWGTAAGAGATÀGATTCT TGAGTTA GAM€ACyvAATGATTGTCC-3', SEQ ID NO 6) do gene alfa 1,3- fucosiltransferase de Physcomitrella patens é amplificada a partir de DNA genómico de Physcomitrella patens por PCR com verificação por Pfu (Promega, Alemanha) utilizando o "primer" a montante Recll_SmaI (5'-GAGCCCGGG ACCCAAGCQTAAGMG-3 ', SEQ ID NO 7) e o "primer" a jusante Recll_Sacll_SsTll (5’— TCTGA<5CTCGCGCGGACAATCATTTGTGTTTC— 3 ' , SEQ ID NO 8). Após restrição do produto de amplificação resultante com Smai e SstI, é clonado no vector pRT99Recl (digerido com Smai e SstI). O plasmideo resultante pRT99Recll contém a primeira sequência de recombinação 5' e a segunda 3'.

Construção de pRT99TPVEGFRecl A cassete de expressão contendo o promotor CaMV 35S, TPVEGF121 e terminador CaMV 35S é excisada, na forma de um fragmento PstI, de pRTlOlTPVEGF C3. Este fragmento é submetido a tratamento das extremidades pela reacção Klenow e é introduzido no plasmideo digerido com Smai e desfosforilado pRT99Recll, dando origem ao plasmideo pRT99TPVEGFRecl. 23

Procedimento de clonagem para a segunda sequência de recombinação 5' em pRT99 A sequência 3' de 208 pares de bases do 5o intrão: (5' — 6G©ACCCAAGC^»TAAOAAÍ3TCTTÂTGAAAAAôTTAÇCT caca* GãTTAAAAÇTAAAÇATASOA AMTÁbCAATSCÂCT€CAATGT5TCA4TGAGAtTMC-í>CTtâACTAACAT" ÇAAAATATÂÂ ATATTCACCSMT^AAÇMATTAGAAMCASSACCTGTA^TTSTMGAéAÍASATTCT TQAQJ- TAGAAACACAAATGATTGTGC-3', SEQ ID NO 6) do gene alfa 1,3-fucosiltransferase de Physcomitrella patens é amplificada a partir de DNA genómico de Physcomitrella patens por PCR com verificação por Pfu (Promega, Alemanha) utilizando o "primer" a montante Rec2_SalI_SacII (5'- GAÕ(3TOOACCCOGGG AGGCMGCG TAAGM0-3', SEQ ID NO 9) e o "primer" a jusante Rec2_SmaI (5'- TGTCCC<3G6 AGA ATC ATTTGTGTTTC-3', SEQ ID NO 10). Após restrição do produto de amplificação resultante com Sall e Smal, é clonado no vector pRT99 (Tõpfer et al. 1988) (digerido com Sal I e Smal). O plasmideo resultante pRT99Rec2 contém a segunda sequência de recombinação 5'.

Procedimento de clonagem para a primeira sequência de recombinação 3' em pRT99Rec2 A sequência 5' de 250 pares de bases do 5o intrão: (5'- GCSGAAATGTTCAGAQTTMGCGAMTCACMCTAAAAGA- OAnbbAAÇCAéAAÇAATT TTTGÂOCAGCTGTTCTTAAITCACSCMCOí^CMCGCTATTAACTQTATÇTGTA-GACGAT GMCTTtCGTACTSM.éSÇATCTAMTTTATTATATCGGTTCATftÂCTAfíA00CAAfíSOÍj 6-AMt€ACAMACTÂT7B8TACCTAÇ6TACTACAGCCTôCA0eATCSAAACATAASAGTQA MCACTS8ACC -3', SEQ ID NO 3) do gene alfa 1,3-f ucosiltransf erase de Physcomitrella patens é amplificada a partir de DNA genómico de Physcomitrella patens por PCR com verificação por Pfu (Promega, Alemanha) utilizando o "primer" a montante Rec22_SmaI (5'-GAS CCC6GGAAA.TGTTCAGAQTTA AGCQ-3 ', SEQ ID NO 11) e o "primer" a jusante Rec22_SacII_Sstl (5'-TCT GAGCTCCCGCGOTCCAOTGTTTGACTGTTATG-3', SEQ ID NO 12). 24

Após restrição do produto de amplificação resultante com Smal e SstI, é clonado no vector pRT99Rec2 (digerido com Smal e SstI). 0 plasmideo resultante pRT99Rec22 contém a segunda sequência de recombinação 5' e a primeira 3'.

Construção de pRT99TPVEGFRec2 A cassete de expressão contendo o promotor CaMV 35S, TPVEGFm e terminador CaMV 35S é excisada, na forma de um fragmento PstI, de pRTlOlTPVEGF C3. Este fragmento é submetido a tratamento das extremidades pela reacção Klenow e é introduzido no plasmideo digerido com Smal e desfosforilado pRT99Rec22, dando origem ao plasmideo pRT99TPVEGFRec2. A restrição de pRT99TPVEGFRecl e Rec2 com SacII ou SalI e SstI dá origem a linearização da primeira e da segunda sequências de ácidos nucleicos heterólogas, compreendendo as sequências de recombinação, e as sequências de ácidos nucleicos heterólogas de interesse, compreendendo um promotor operativamente ligado àquelas. As sequências de ácidos nucleicos heterólogas linearizadas são utilizadas para transformação de células de musgo.

Condições de cultura padrão

As plantas crescem de forma axénica, em condições esterilizadas, em meio Knop modificado liquido inorgânico simples (1000 mg/L de Ca(N03)2 x 4H20 250 mg/L de KC1, 250 mg/L de KH2PC>4, 250 mg/L de MgSC>4 x 7 H20 e 12,5 mg/L de FeS04 X 7 H20; pH 5,8 (Reski e Abel 1985)). As plantas crescem em balões Erlenmeyer de 500 mL, contendo 200 mL de meio de cultura, e os balões são agitados num agitador Certomat R (B. Braun Biotech International, Alemanha) ajustado para 120 rpm. As condições na câmara de crescimento são 25 +/- 3°C e um regime de luz:escuridão de 16:8 horas. Os balões são iluminados por cima através de 25 duas lâmpadas fluorescentes (Osram L 58 W / 25), dando origem a 35 pmols-1nf2. As culturas são subcultivadas uma vez por semana via desintegração utilizando um homogeneizador Ultra-Turrax (IKA, Staufen, Alemanha) e inoculação de dois novos balões Erlenmeyer de 500 mL contendo 100 mL de meio Knop fresco.

Isolamento de protoplastos

Pré-cultura de tecido de musgo para isolamento óptimo de protoplastos. Musgos (especialmente Physcomitrella patens) podem ser pré-cultivados em diferentes condições para se obterem rendimentos óptimos de protoplastos: I. Rother et al. 1994 cultivaram tecido de musgo durante 7 dias em meio Knop com teor reduzido (10%) de Ca(NC>3)2. As culturas são filtradas 3 ou 4 dias após a desintegração e são transferidas para meio Knop fresco com teor reduzido (10%) de Ca(N03)2. II. Em vez da redução de Ca(N03)2, o meio para a pré-cultura pode ser suplementado com tartarato de amónio 5 mM, ou o pH pode ser alterado para 4,5 (em culturas líquidas com valores não controlados de pH obtém-se um pH médio de 5,8 para meio Knop modificado). As culturas são filtradas 3 ou 4 dias após a desagregação de tecido e são transferidas para meio Knop fresco (suplementado com tartarato de amónio 5 mM ou alterado para pH 4,5). III. Hohe e Reski (2002) optimizaram as condições de cultura num biorreactor semi-contínuo para obterem rendimentos elevados de protoplastos. Obtêm-se protoplastos isolados com altos rendimentos por suplementação de meio Knop modificado (Reski e Abel 26

1983) com 460 mg/L de tartarato de amónio ou sob valores controlados de pH com um valor desejado de 4,5 (em culturas em biorreactor com valores não controlados de pH obtém-se um pH médio de 5,8 para meio Knop modificado).

Foram descritos diferentes protocolos para o isolamento de protoplastos (Grimsley et al. 1977; Schaefer et al. 1991; Rother et al. 1994; Zeidler et al. 1999; Hohe e Reski 2002, Protocol Schaefer 2001) e para transformação (Schaefer et al. 1991; Reutter e Reski 1996, Protocol Schaefer 2001) para Physcomitrella patens.

Para o trabalho apresentado aqui utiliza-se uma modificação/combinação dos métodos previamente descritos:

Após filtração, protonemas de musgo são pré-incubados em manitol 0,5 M. Passados 30 minutos, adiciona-se à suspensão Driselase 4% (Sigma, Deisenhofen, Alemanha). A Driselase é dissolvida em manitol 0,5 M (pH 5,6-5,8), é centrifugada a 3600 rpm durante 10 minutos e esterilizada por passagem num filtro de 0,22 pm (Millex GP, Millipore Corporation, E.U.A.). A suspensão, contendo 1% Driselase (concentração final), é incubada no escuro à TA e agitada suavemente (obtêm-se os melhores rendimentos após 2 horas de incubação) (Protocol Schaefer 2001). Faz-se passar a suspensão por crivos (Wilson, CLF, Alemanha) com dimensões dos poros de 100 pm e 50 pm. A suspensão é centrifugada em tubos de centrífuga esterilizados, e protoplastos são sedimentados à TA durante 10 minutos a 55 g (aceleração de 3; abrandamento a 3; Multifuge 3 S-R, Kendro, Alemanha) (Protocol Schaefer 2001) . Os protoplastos são suavemente 27 suspensos de novo em meio W5 (CaCl2 x 2H2O 125 mM; NaCl 137 mM; glucose 5,5 mM; KC1 10 mM; pH 5,6; 660-680 mOsm; esterilizados por filtração). A suspensão é novamente centrifugada à ta durante 10 minutos a 55 g (aceleração de 3; abrandamento a 3; Multifuge 3 S-R, Kendro, Alemanha). Os protoplastos são suavemente suspensos de novo em meio W5 (Rother et al. 1994). Para a contagem de protoplastos, um pequeno volume da suspensão é transferido para uma câmara Fuchs-Rosenthal.

Protocolo de transformação

Para a transformação, protoplastos são incubados em gelo no escuro durante 30 minutos. Subsequentemente, os protoplastos são sedimentados por centrifugação à TA durante 10 minutos a 55 g (aceleração de 3; abrandamento a 3; Multifuge 3 S-R, Kendro). Os protoplastos são novamente suspensos em meio 3M (CaCl2 x 2H20 15 mM; 0,1% MES; manitol 0,48 M; pH 5,6; 540 mOsm; esterilizados por filtração, Schaefer et al. 1991) a uma concentração de 1,2 x 106 protoplastos / mL (Reutter e Reski 1996) . Distribuem-se 250 μΐ desta suspensão de protoplastos num novo tubo de centrífuga esterilizado, adicionam-se 50 pL de solução de DNA de ambas as construções, pRT99TPVEGFRecl e pRT99VEGFRec2, e o vector contendo o marcador de selecção (DNA purificado em coluna em H20 (Qiagen, Hilden, Alemanha) ; 10-100 pL; quantidade de DNA de 30 pg por construção; 10 pg do vector contendo o marcador de selecção) e por fim adicionam-se 250 pL de solução de PEG (40% PEG 4000; manitol 0,4 M; Ca(N03) 2 0, 1 M; pH 6 após autoclavagem). A suspensão é imediata mas suavemente misturada e depois é incubada durante 6 minutos à TA com mistura suave ocasional. A suspensão é diluída progressivamente por adição de 1, 2, 3 e 4 mL de meio 3M. A 28 suspensão é centrifugada a 20°C durante 10 minutos a 55 g (aceleração de 3; abrandamento a 3; Multifuge 3 S-R, Kendro). O grânulo é novamente suspenso em 3 mL de meio de regeneração. O procedimento de selecção é realizado como descrito por Strepp et al. (1998).

Análise de DNA A análise de DNA de plantas transformadas de modo estável é realizada como descrito por Strepp et al. (1998). A estimativa do número de cópias é efectuada por análise de coloração "Southern" e comparação com uma planta transformada de modo estável contendo uma cópia do DNA heterólogo.

Ensaios

Quantificação de VEGFm recombinante O VEGF121 recombinante expresso por plantas de musgo transformadas de modo estável é quantificado por ELISA (R&D Systems, Wiesbaden, Alemanha). O ensaio ELISA é realizado de acordo com as instruções do fabricante. As amostras podem ser diluídas para quantificação.

Resultados

Para plantas transformadas de modo estável, a estimativa de elevado número de cópias de construções integradas está correlacionada com elevados rendimentos da proteína recombinante. 29

Literatura

Engel PP (1968) "The induction of biochemical and morphological mutants in the moss Physcomitrella patens". Am J Bot 55, 438-446.

Gorr G (1999) "Biotechnologische Nutzung von Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G.". Dissertação, Universidade de Hamburgo.

Grimsley NH, Ashton NW e Cove DJ (1977) "The production of somatic hybrids by protoplast fusion in the moss, Physcomitrella patens". Mol Gen Genet 154, 97-100.

Hohe A, Reski R (2002) "Optimisation of a bioreactor culture of the moss Physcomitrella patens for mass production of protoplasts". Plant Sei 163, 69-74.

Reski R, Abel WO (1985) "Induction of budding on chloronemata and caulonemata of the moss, Physcomitrella patens, using isopentenyladenine". Planta 165, 354-358.

Reski R, Faust M, Wang X-H, Wehe M, Abel WO (1994) "Genome analysis of the moss Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G.". Mol Gen Genet 244, 352-359.

Rother S, Hadeler B, Orsini JM, Abel WO e Reski R (1994) "Fate of a mutant macrochloroplast in somatic hybrids". J Plant Physiol 143, 72-77.

Reutter K e Reski R (1996) "Production of a heterologous protein in bioreactor cultures of fully differentiated moss plants". Plant Tissue Culture and Biotechnology 2, 142-147. 30

Schaefer D, Zryd J-P, Knight CD e Cove DJ (1991) "Stable transformation of the moss Physcomitrella patens". Mol Gen Genet 226, 418-424.

Schaefer DG (2001) "Principies and protocols for the moss Physcomitrella patens". http://www.unil.ch/lpc/docs/PPprotocols2001.pdf

Strepp R, Scholz, S, Kruse, S, Speth V e Reski, R (1998) "Plant nuclear gene knockout reveals a role in plastid division for the homologue of the bacterial cell division protein FtsZ, an ancestral tubulin". Proc Natl Acad Sei USA 95, 4368-4373. Tõpfer R, Matzeit V, Gronenborn B, Schell J e Steinbiss H-H (1987) "A set of plant expression vectors for transcriptional and translational fusions". NAR 15, 5890. Tõpfer, R, Schell, J e Steinbiss,H-H (1988) "Versatile cloning vectors for transient gene expression and direct gene transfer in plant cells". NAR 1_6, 8725. 31

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> greenovation Biotech GmbH <120> Método de Produção de Proteínas <130> 1061 <140> 03017343.9 <141> 2003-07-31 <16 0> 12 <170> Patentln versão 2.1

<210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: "Primer" MoB323 <400> 1 atâclãgagg asgálgasci ttlcstgoctg tcttgg

<210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: "Primer" MoB349 <400> 2 dgecaággg fgcâgccfgg gaosag .26

<210> 3 <211> 250 <212> DNA <213> Physcomitrella patens <220> <221> intrão <222> (1)..(250) 32 <223> sequência 5' do 5o intrão do gene alfa 1,3-fucosiltransferase <400> 3 gcgaaatcac aactaaaaga gattggaagc agaagaattt 60 cacgcaacga caacgctatt aactgtatgt gtagacgatg 120 ctaaatttat tatatccctt cataactaga ggcaaggcgg 180 cctacgtact acagcctcca ggatcaaaca taagagtgaa 240 250 gcggaaatgt tcagagttaa ttgagcagct gttcttaatt cactttcgta ctgaagggat aaatcacaaa actattggta acactggacc <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição da Sequência Artificial: "Primer" a Montante Recl_salI_SacII <400> 4 gaggtegôcc cg cggaaatg ttcaga g 21

<210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: "Primer" a Jusante Recl_smal <400> 5 aclc 24

<210> 6 <211> 208 <212> DNA <213> Physcomitrella patens <220> <221> intrão <222> (1)..(208) <223> sequência 3' do gene alfa 1,3-fucosiltransferase <400> 6 gggacccaag cgtaagaagt cttatgaaaa agttacctca cagattaaaa ctaaacatag 60 · gaaaatacca atgcactcca atgtgtcaat gagattaacg cttgactaac atgaaaatat 120 aaatattcac cgaatgaaag aaattagaaa acaggacctg tagattgtaa gagatagatt 180 cttgagttag aaacacaaat gattgtcc 208 33 < 210 > 7 <211> 25 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: "Primer" Montante Recll Smal <400> 7gagacq|gga eccaagcgls agaag <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Sequência Artificial 25 <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: "Primer" Recll_sacii_SsTii a Jusante <400> 8tctgsg Dtc d cg cgpçaat caltlgtgt te 32 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Sequência Artificial

<220> <223> Descrição da Sequência Artificial: "Primer" Montante Rec2 Sall SacII a <400> 9gaggtcgacc c?gcggasxcs agcgtsagaa g 31 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: "Primer" Rec2 Smal a Jusante <400> 10tcfcecggfp caalcattg tg 34

< 210 > 11 <211> 28 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: "Primer" montante Rec22 Smal <400> 11 gâgcccsggga sstgttcagei gíla^gcg

<210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> a Jusante

<223> Descrição da Sequência Artificial: "Primer" Rec22 SacII SstI <400> 12 tdgagdcc fsgcpgtccgg tgtttcactc tíatg

Lisboa, 30 de Março de 2011

Claims (16)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método de amplificação da expressão genética numa célula de planta de musgo, que compreende: 1) proporcionar pelo menos uma primeira construção de ácido nucleico heteróloga compreendendo pelo menos uma sequência de nucleótidos heteróloga operativamente ligada a um promotor, em que a referida construção é flanqueada na sua extremidade 5' por uma primeira sequência de recombinação e é flanqueada na extremidade 3' da referida construção por uma segunda sequência de recombinação na mesma orientação da primeira; 2) proporcionar pelo menos uma segunda construção de ácido nucleico heteróloga compreendendo pelo menos uma sequência de nucleótidos heteróloga operativamente ligada a um promotor, em que a referida construção é flanqueada na sua extremidade 5' pela referida segunda sequência de recombinação e é flanqueada na extremidade 3' da referida construção pela referida primeira sequência de recombinação na mesma orientação da segunda, e 3) transformar na célula da planta de musgo pelo menos a referida primeira e a referida segunda construções de ácidos nucleicos heterólogas.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a referida pelo menos primeira construção e a referida pelo menos segunda construção são co-transformadas num protoplasto de musgo.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que a referida primeira construção e a referida 2 segunda construção são compreendidas por pelo menos um conjunto de sequências de recombinação complementares.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que as sequências de recombinação são derivadas ou seleccionadas de DNA genómico, cDNA, intrão, uma região não codificadora ou um exão, ou qualquer combinação destes.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que a sequência de recombinação é seleccionada de um intrão ou região não codificadora.

6. Método de acordo com a reivindicação 4 ou reivindicação 5, em que o comprimento das sequências de recombinação vai desde 25 até 1000 nucleótidos.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o comprimento das sequências de recombinação está situado entre 50-650 nucleótidos.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o comprimento das sequências de recombinação está situado entre 100-400 nucleótidos.

9. Conjunto de vectores de ácidos nucleicos adequados para amplificar a expressão genética numa célula de planta de musgo, em que o referido conjunto de vectores de ácidos nucleicos compreende: i) pelo menos uma primeira construção de ácido nucleico heteróloga compreendendo pelo menos uma sequência de nucleótidos heteróloga operativamente ligada a um promotor, em que a referida construção é flanqueada na sua extremidade 5' por uma 3 primeira sequência de recombinação e é flanqueada na extremidade 3' da referida construção por uma segunda sequência de recombinação na mesma orientação da primeira, e ii) pelo menos uma segunda construção de ácido nucleico heteróloga compreendendo pelo menos uma sequência de nucleótidos heteróloga operativamente ligada a um promotor, em que a referida construção é flanqueada na sua extremidade 5' pela referida segunda sequência de recombinação e é flanqueada na extremidade 3' da referida construção pela referida primeira sequência de recombinação na mesma orientação da segunda.

10. Conjunto de vectores de ácidos nucleicos de acordo com a reivindicação 9, em que as construções são construções de DNA lineares.

11. Célula de musgo transformada com um conjunto de vectores de ácidos nucleicos como definido na reivindicação 9 ou 10.

12. Célula de musgo de acordo com a reivindicação 11, que é um protoplasto de musgo ou uma célula de protonema de musgo.

13. Célula de musgo de acordo com a reivindicação 12 que é derivada de Physcomitrella patens.

14. Tecido de protonema de musgo compreendido por células transformadas com um conjunto de vectores de ácidos nucleicos como definido na reivindicação 9 ou 10. 4

15. Utilização de células de protonema de musgo transformadas com um conjunto de vectores de ácidos nucleicos como definido na reivindicação 9 ou 10 na produção de proteínas a partir daquelas.

16. Utilização de acordo com a reivindicação 15 de células de protonema de musgo derivadas ou seleccionadas de Physcomitrella patens que são transformadas com um conjunto de vectores de ácidos nucleicos como definido na reivindicação 9 ou 10. Lisboa, 30 de Março de 2011