PT1590005E - Conjugados de ácidos (4s,8s)- e (4r,8r)-4-p-benzil-8- metil-3,6,9-triaza-sp 3/sp n, sp 6/sp n, sp 9/sp ntricarboximetil- 1,11-undecanóico enantiomericamente puros com biomoléculas, método para a sua preparação e sua utilização para a produção de agen - Google Patents

Description

1

DESCRIÇÃO "CONJUGADOS DE ÁCIDOS (4S,8S)- E (4R,8R)-4-P-BENZIL-8-METIL-3,6,9-TRIAZA-SP 3/SP N, SP 6/SP n, SP 9/SP N-TRICARBOXIMETIL—1,11—UNDECANÓICO ENANTIOMERICAMENTE PUROS COM BIOMOLÉCULAS, MÉTODO PARA A SUA PREPARAÇÃO E SUA UTILIZAÇÃO PARA A PRODUÇÃO DE AGENTES FARMACÊUTICOS" A invenção diz respeito aos objectos referidos nas reivindicações: conjugados de ácido (4S,8S)- e (4R,8R)-4-p-benzil-8-metil-3,6,9-triaza-3N, 6N, 9N-tricarboxometol-l,11-undecanóico enantiomericamente puros com biomoléculas, a processos para a sua preparação e à sua utilização para a preparação de composições farmacêuticas para radiodiagnóstico, radioterapia ou diagnóstico por NMR. A utilização de radiofármacos para fins de diagnóstico e fins terapêuticos é já conhecida há algum tempo em pesquisas biológicas e médicas. Em particular, os radiofármacos são utilizados para se apresentarem em determinadas estruturas, tais como, por exemplo, o esqueleto, os órgãos ou os tecidos. A aplicação em diagnóstico pressupõe a utilização de tais agentes radioactivos, os quais são especificamente enriquecidos após a sua aplicação nas estruturas dos pacientes, o qual se pretende examinar. Estes agentes radioactivos localmente enriquecidos podem então ser monitorizados por meio da utilização de detectores adequados, por exemplo, câmaras de cintilação ou outros processos de registo adequados ou transformados em gráficos de cintilação. 0 tipo e a intensidade relativa dos agentes radioactivos detectados permitem identificar o local de uma estrutura que contém o 2 agente radioactivo e a presença de anomalias na estrutura e na função, alterações patológicas, etc..

De igual modo, os radiofármacos são administrados como agentes terapêuticos a pacientes para irradiar determinados tecidos patológicos ou áreas. Um tal tratamento requer a produção de agentes terapêuticos radioactivos que se acumulem em determinadas estruturas, órgãos ou tecidos. A empresa IDEC Pharmaceuticals Corp. desenvolveu para terapia com radiofármacos de linfoma não Hodgkin o fármaco

Zevalin® (veja- se, v.g., Câncer (2002) Fev 15 ; 94, (4 Supl.): 1349-57) i . 0 ião de radiação é, neste caso, 90γ emissor de β, o qual estão ligados por um agente quelante (derivado do ácido dietilenotriamina-penta-acético substituído com metilo, (MX-DTPA)) a um anticorpo específico do tumor.

Nos dias de hoje, a ressonância magnética nuclear (NMR) constitui um método de diagnóstico amplamente utilizado para avaliação de imagens ín vivo, no qual se pode representar a medição das propriedades magnéticas dos protões de água nos vasos sanguíneos do corpo e nos tecidos do corpo (incluindo tumores). Neste caso são utilizados agentes de contraste, que influenciam os parâmetros NMR do protão no corpo (tais como os tempos de relaxamento T1 e T2) que provocam um aumento no contraste nas imagens resultantes, tornando estas imagens legíveis. Assim sendo, surgem os complexos de iões paramagnéticos, tais como complexos que contêm galodínio (v.g., Magnevist®) , os quais devido ao efeito dos iões paramagnéticos diminuem os tempos de relaxamento.

Tanto os iões paramagnéticos, tais como Gd3+, Mn2+, Cr3+, Fe3+ e Cu2+, como muitos radionuclidos metálicos não 3 podem ser administrados sob a forma de soluções livres, devido ao facto de serem muito tóxicos. Para transformar estes iões adequados para aplicação in vivo, como regra estes iões são transformados em complexos. Por exemplo, no documento EP-A-0 071 564 encontra-se descrito o sal meglumina do complexo de galodinio(III) do ácido dietilenotriaminapenta-acético como agente de contraste para tomografia NMR. Foi aprovada a escala mundial uma preparação que contém este complexo, sob a designação Magnevist®, como o primeiro agente de contraste para NMR. Este agente de contraste é distribuído extracelularmente após administração por via intravenosa e é excretado por secreção glomerular renal. Não é observada na prática a passagem de membranas celulares intactas. O Magnevist® é particularmente adequado para a visualização de áreas patológicas (tais como inflamação, tumores).

Os agentes radioterapêuticos e agentes de contraste conhecidos não são utilizados de um modo satisfatório para todas as aplicações. Muitos destes agentes são distribuídos ao longo do espaço extracelular do corpo. Para aumentar a eficácia destes agentes em diagnósticos in vivo e em terapia, está a tentar confirmar-se a sua especificidade e selectividade, por exemplo, em alvejar células, ou para aumentar as áreas desejadas e as estruturas do corpo. Uma melhoria destas propriedades, por exemplo, é alcançada por meio do acoplamento de complexos de metais com biomoléculas, em conformidade com a abordagem "direccionamento do fármaco". Como biomoléculas refere-se proteínas do plasma, anticorpos ou seus fragmentos, hormonas, factores de crescimento e substratos de receptores e enzimas (v.g., documento WO 97/12850, Institut 4 fur Diagnostikforschung na FU Berlin). Até à presente data, por vezes a especificidade do tumor (enriquecimento do tumor) não é suficientemente elevada, qualidade esta que é particularmente útil em radioterapia e constitui um objectivo importante. É ainda desejável disponibilizar meios para o diagnóstico e tratamento que possuam uma especificidade elevada de direccionamento, bem como uma estabilidade elevada in vivo para a maior parte dos complexos de iões metálicos tóxicos.

Assim sendo, constitui um objecto da invenção proporcionar novos meios para o radiodiagnóstico, o diagnóstico por NMR e radioterapia que não apresentem as desvantagens supramencionadas e, em particular, que possuam uma estabilidade elevada in vivo, uma boa compatibilidade e, acima de tudo, possuam propriedades específicas dos órgãos. Por um lado, o tempo de retenção deverá ser suficiente nos tecidos tumorais ou órgãos, para se obter, com doses reduzidas, a qualidade de imagens necessária para um diagnóstico e tratamento eficientes e/ou uma irradiação suficiente. No entanto, por outro lado, deverá apresentar uma eliminação posterior dos metais a partir do corpo tão rápida e completa quanto possível. Além do mais, os agentes de contraste de NMR exibem uma relaxividade elevado do protão, pelo que, através de um aumento da intensidade do sinal, permitem a redução da dose.

Foram já realizadas diversas tentativas para melhorar as características de derivados de DTPA bioligados por meio da introdução de substituintes.

Cummins et al. descrevem uma síntese detalhada de derivados de DTPA substituídos com metilo, aos quais é 5 possível acoplar, por exemplo, anticorpos ("A Convenient Synthesis of Bifunctional Chelating Agents Based on Diethylenetriaminepentaacetic Acid and Their Coordination Chemistry with Yttrium", Bionconjugate Chemistry, (1991), 180-186. Brechbiel et al., "Synthesis of (l-(p-isothiocyanatobenzyl) derivatives of DTPA and EDTA. Antibody Labeling and Tumor-Imaging Studies.", Inorg. Chem. (1986), 25, 2772-2781). No pedido de invenção n° WO 88/01618 de Gansow et al., encontra-se descrito DTPA, o qual possui um substituinte metilo na posição 8 e substituintes benzilo para-funcionalizados na posição 4.

O composto I é designado por MX-DTPA, mx-DTPA ou também 1B4M-H5DTPA.

No pedido de patente de invenção WO 01/41743, da empresa IDEC Pharmaceuticals Corporation, encontra-se descrita uma síntese regiosselectiva do composto I, a qual tem início a partir de (S)-p-nitrofenilalanina protegida com Boc e uma diamina mono-protegida. O centro estereogénico na posição 4 neste composto está configurado conforme descrito em (S), e o centro estereogénico na posição 8 não é definido. 6

Conforme referido antes, o MX-DTPA é um componente da preparação ZEVALIN® para o tratamento do linfoma não Hodgkin. Também aqui se utiliza uma mistura de (4S,8R)- e (4S,8S)-MX-DTPA como ligando quelante. McMurry et ai. (J. Med. Chem., (1998), 41, 3546-3549) descrevem que DTPA substituído com ciclo-hexilo, o qual é substituído com nitrobenzilo, possui uma configuração preferida, devido à estrutura rígida e volumosa do anel ciclo-hexano. Assim, o composto II (e tal também é válido para o enantiómero) possui uma estabilidade superior in vitro e in vivo do que o composto III. 6 NO*

m

Embora o MX-DTPA (I) tenha sido bem estudado e tenha apresentado propriedades aceitáveis, v.g., aumento da estabilidade do complexo, em comparação com o DTPA não substituído, é ainda desejável aumentar a estabilidade in vivo do complexo com metais e proporcionar meios para o diagnóstico e tratamento disponíveis que exibam uma segurança tão elevada quanto possível.

Concluiu-se, surpreendentemente, que os derivados de MX-DTPA, nos quais foi introduzido enantiosselectivamente o substituinte metilo relativamente pequeno (posição 8), com uma configuração adequada, possuem uma estabilidade 7 termodinâmica in vitro significativamente superior do que a mistura diastereomérica (IV) (ver infra).

HOQC

HOQC R λ n 4

/X

COOM COOH 1

COOM

'XõQH COOH V a

/'"""'“X /V/ SV CCOH! V NaX* GQ0H

Via

HQOC N 4 N

HOOC

R *v ' -.;í:

I

HOQC'' X exM"'/xçool V. XíOOH '‘‘COOS-

Vb .-'X /~'\ /™T\ / \ N i VI b /'X :j\i" GOOH \

aOOH

V

COOH 9

Concluiu-se que os substituintes metilo e benzilo deverão estar presentes sob a configuração (4S,8S) (veja-se o composto Va) ou (4R,8R) (veja-se o composto Vb), para se alcançar o efeito positivo descrito. As configurações (4S,8R) e (4R,8S) (veja-se os compostos Via e VIb) proporcionam uma estabilidade do complexo diminuída. Numa experiência exemplificativa impressionante demonstrou-se que uma mistura de um equivalente do composto Va (R = -N02), Via (R = -N02) e sal Gd(III) formou praticamente exclusivamente o complexo GD do composto Va. Além disso, a constante de estabilidade termodinâmica para o composto Va, logKy = 24,7 ± 0,7, a qual é claramente superior à constante de estabilidade da mistura de diastereómeros IV (logKy = 22,5 (J. Med. Chem. (1998), 41, 3546-3549)). Concluiu-se também que a radiotoxicidade do complexo de metal do composto Va in vivo é inferior em comparação com a do composto Via.

Este resultado é inesperado e surpreendente, uma vez que os substituintes metilo na posição 8 proporcionam uma estrutura que não é rígida, "organizada no espaço" ou volumosa, como é no caso do substituinte ciclo-hexilo dos compostos II e III. Assim, seria de esperar que todos os quatro estereoisómeros possuíssem praticamente as mesmas características de complexação. Conforme já descrito antes, no entanto, concluiu-se que, em comparação, os compostos Va e Vb possuem caracteristicas de complexação melhores do que os compostos Via e VIb.

Além do mais, os compostos da invenção exibem uma boa relaxividade e uma boa solubilidade em água pelo que são adequados como meios farmacêuticos, em particular para 10 radiodiagnóstico e diagnóstico por NMR, bem como para radioterapia.

Assim, a invenção diz respeito a conjugados de fórmulas estruturais Vila e Vllb

em que o símbolo Z representa um átomo de hidrogénio ou um equivalente de ião metálico de um elemento com um número atómico 21-29, 31, 32, 37-39, 42-44, 46, 47, 49^ 58-71, 75, 77, 82 ou 83, o símbolo A representa um grupo -COO-, o símbolo R representa uma biomolecula ligada através de um grupo funcional ou um radical alquilo (C1-C25) , de cadeia linear ou ramificada, saturado ou insaturado, o qual é facultativamente interrompido com um a seis átomos de 0, ou grupos fenileno, -NHCO-, -CONH-,

e/ou -NH-(C=S)-NH e é facultativamente substituído em qualquer posição com um a seis grupos carboxilo, grupos hidroxilo, grupos amino ou outros grupos funcionais, pelos quais as biomoléculas pode ser ligadas e seus sais com 11 bases orgânicas ou inorgânicas, desde que o radical alquilo possua pelo menos uma biomolécula ligada por meio de um grupo funcional e que pelo menos dois símbolos Z representem um equivalente de ião metálico. 0 símbolo R pode representar um radical alquilo que possui entre 1 e 25 átomos de carbono (o qual possui a ele ligado pelo menos um grupo funcional que contém uma biomolécula). Este radical alquilo pode ser de cadeia linear ou ramificada, saturado ou insaturado (v.g.:

e possui entre um e seis grupos carboxilo, hidroxilo e/ou amino (por exemplo: 12

12 OH VN/* oh

Mt, * w

"'W

.COOH

.COOH

y^^COOH V -v ,COOH .......

,.--χ .^CÕOH YOH

V -X ✓ r

M OH OH

OH

/

NH, 0

,c f / v\. /\ γ oh COOH

"COOH

OOH

COOH cni pelo menos um outro grupo funcional de ligação, ou posou 1 que pode estar ligado à biomolécula, tal como um grupo carboxilo» carboxilo activado, amino, nitro, isocianato, isotiocianato, hidrazina, semi-carbazida, tio-semi-carbazida, cloroacetamina, bromoacetamida, iodoacetamida, acrilo, acilamino, anidridos mistos, azida, cloreto de ácido, hidróxido, cloreto de sulfonilo, vinil-sulfona, carbodiimida, maleimida, dioxo ou outro grupo funcional de ligação (v.g.: 13 13 τ % H f J, / K "·'·· 1 0 ** 0 \ H Λ 1 V"" -N- V '~Q v 1 0 radical alquilo (C1-C25) pode ser facultativamente substituído com um a seis átomos de 0, e interrompido com um grupo fenileno, -NHC0-, -CONH-, -0-(C0)-NH-,

e/ou -NH-(C=S)-NH (v.g.: 14

'Ον ,/\ % Ο -'°·'· ----^ 0·'······^^ •Ο., χ^·-, t ^ ΝΗ* 1 V -Tf %;

Vv y^' ffi

-^0^-

H

W

*CQQH \ \ Q/Vv N 1 ct 15 ά·

~. Η >ί 3 pw-^r-· r Λ ο ο ^ olP proprio um 0 si^bolo R também pode representar « Kí-ivi lo activado, grupo funcional, tal como carboxilo, caroux amino, nitro, isocianato, iSotiocianato, hidrazina, semicarbazida, tio-semicarbazida, cloroacetamida, bromoacetamida, iodoacetamida, acrilo, acilamino, anidridos mistos, azida, cloreto de ácido, brometo de ácido, hidróxido, cloreto de sulfonilo, vinilsulfona, carbodiimida, maleimida ou diazo (v.ç·' 16

Ou um outro grupo funcional de ligação ao qual está ligada a biomolécula.

Diversos dos grupos de ligação possíveis anteriores permitem uma reacção selectiva com grupos funcionais das biomoléculas no intervalo óptimo de pH, por exemplo, a adição em grupos -SH (cisteina na biomolécula) , exclusiva de grupos -SH, v.g., uma maleimida ((compostos 2,5-dioxo-2,5-di-hidro-pirrol-l-il), veja-se antes) ou bromoacetamida, no caso de o acoplamento ter lugar num intervalo de pH fracamente acidico.

Como grupo carboxilo activado refere-se os grupos carboxilo anteriores que são transformados de modo a facilitar a reacção com uma biomolécula. Tais grupos nos quais é possível efectuar a activação são conhecidos, sendo possível referir, por exemplo, os descritos por M. e A. Bodanszky, "The Practice of Peptide Synthesis", Springerverlag 1984. Como exemplos refere-se aductos de ácido carboxílico com carbodiimidas ou ésteres activados, tais como hidroxibenzotriazole. Mais preferencialmente, o grupo carboxilo é seleccionado entre 17

e

Os ésteres activados dos compostos descritos antes são preparados conforme é conhecido na especialidade. No caso de isot iocianatos ou de oí-haloacetatos, os precursores de amino terminal correspondentes são convertidos por meio de métodos descritos na literatura com tiofosgénio ou halogenetos de ácido 2-halo-acético. Além disso, a reacção com ésteres adequadamente transformados de N-hidroxi-succinimida, tais como:

também é possível (Hal = halogéneo).

De um modo geral, para este fim, é possível utilizar todos os métodos convencionais de activação de ácidos carboxílicos conhecidos na especialidade. No caso de um grupo amida que contém um substituinte R, este irá ser preparado, por exemplo, por meio da reacção de um ácido carboxilico activado com uma amina. A activação do ácido 18 carboxílico é efectuada por métodos convencionais. Como exemplos de reagentes de activação adequados refere-se diciclo-hexilcarbodiimida (DCC), cloridrato de l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC), hexafluorofosfato de benzotriazol-l-iloxitris-(dimetilamino)-fosfónio (BOP) e hexafluorofosfato de 0-(benzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetra-metil-urónio (HBTU) e de preferência DCC. Também é possível a adição de catalisadores 0-nucleofílicos, v.g., N-hidroxi-succinimida (NHS) ou N-hidroxibenzotriazole.

No caso de o substituinte ser uma função ácido carboxílico, então este pode ser utilizado sob uma forma protegida (v.g., sob a forma de um éster benzílico), podendo a remoção do grupo protector efectuada depois por hidrogenólise.

Uma função ácido carboxílico de um grupo funcional adequado deverá ser normalmente activada, em primeiro lugar, e depois ligada a uma biomolécula adequada (para uma descrição da biomolécula, veja-se infra). De preferência, utiliza-se intermediários éster activos, os quais são então atacados por um grupo nucleofílico da biomolécula. Deste modo, obtém-se uma ligação covalente entre a biomolécula e o composto de fórmula estrutural I. De preferência, como ésteres activados refere-se os ésteres de N-hidroxi-succinimida, os ésteres de paranitrofenol ou os ésteres de pentafluorofenol. No caso de o grupo funcional se encontrar sob a forma de isotiocianato ligado à biomolécula, então é preferencialmente utilizada no início uma amina terminal, a qual, se necessário, pode estar protegida com um grupo protector adequado. Como grupos protectores refere-se os utilizados em química de péptidos. Após a remoção do grupo protector, o isotiocianato pode ser produzido por reacção 19 na amina principal terminal com tiofosgénio. A este é possível adicionar os grupos nucleofílicos da biomolécula. A síntese dos conjugados é normalmente efectuada de tal modo que seja gerado, em primeiro lugar, um ligando ou complexo de quelação transformado ou funcionalizado, o qual é então ligado à biomolécula. No entanto, no caso de se utilizar biomoléculas preparadas sinteticamente, também é possível que o ligando ou complexo de quelação de acordo com a invenção seja acoplado à biomolécula durante a síntese da biomolécula. Tal pode ser efectuado, por exemplo, durante a sintese sequencial de oligopéptidos no dispositivo automatizado de síntese. Se necessário, a adição de grupos de protecção habituais na síntese da biomolécula adequado pode ser introduzida nos compostos de acordo com a invenção. Tais irão então fazer parte da separação nos algoritmos de síntese normais do sintetizador.

Os compostos da invenção contêm pelo menos dois centros quirais (posições 4 e 8) . 0 radical R também pode conter um ou vários centros quirais suplementares, os quais podem não ser diferenciados na descrição e nas reivindicações os enantiómeros diferentes, mas os compostos referidos compreendem ambos os enantiómeros e, na presença de múltiplos estereocentros, compreendem todos os diastereómeros possíveis e suas misturas. 0 termo "biomolécula" designa aqui qualquer molécula que ocorra naturalmente, por exemplo, no corpo, os que sejam produzida de um modo sintético e que possua uma estrutura semelhante. Além do mais, designa ainda moléculas biológicas capazes de ocorrer no corpo ou interagir com a estrutura, de um modo tal que, por exemplo, os conjugados se acumulem em determinados locais desejados do corpo. 20

Neste caso, o termo "corpo" designa qualquer corpo vegetal ou animal, sendo particularmente preferencial os corpos animais e de seres humanos.

Em particular, as biomoléculas são moléculas que ocorrem em organismos vivos, as quais são utilizadas como produtos de selecção evolutiva por interacção ordenada e complexa de tarefas especificas para o organismo e constituem a base das suas funções básicas (alteração de material e de forma, reprodução, equilíbrio energético) . Nas biomoléculas as moléculas maiores (proteínas, ácidos nucleicos, polissacáridos, lípidos, etc.) são constituídas por componentes simples (aminoácidos, nucleobases, monossacáridos, ácidos gordos, etc.). As macromoléculas adequadas também são designadas por biopolímeros.

De um modo vantajoso, a biomolécula, por exemplo, uma estrutura de polipeptido de aminoácidos com cadeias laterais e com o grupo reactivo dos compostos Vila' e Vllb' (ver infra) pode ser submetida a reacção. Como tais cadeias laterais refere-se, por exemplo, os grupos carboxilo de resíduos de ácido aspártico e de ácido glutâmico, os grupos amino de resíduos lisina, os grupos aromáticos de resíduos tirosina e histidina e os grupos sulfidrilo de resíduos cisteína. É possível consultar uma descrição sobre biomoléculas com diversos exemplos na obra "Chemie der Biomolekule" de TU-Graz (H. Berthold et al. , Institut fur Organische Chemie, TU-Graz, 2001), e também através da internet na página www.orgc.tu-graz.ac.at.

Para formar os conjugados da invenção são particularmente adequadas as biomoléculas seguintes: 21

Biopolímeros, proteínas, tais como as proteínas que possuem uma função biológica, HSA, BSA, etc., proteínas e péptidos que se acumulam em determinados locais do organismo (por exemplo, em receptores, membranas celulares, canais, etc.), péptidos cliváveis por proteases, péptidos sintéticos com pontos de quebra pré-determinados (v.g., ésteres lábeis, amidas, etc.), péptidos que são cliváveis por metaloproteases, péptidos com ligadores fotocliváveis, péptidos com grupos cliváveis por agentes oxidativos (oxidases), péptidos com aminoácidos naturais ou não naturais, glicoproteinas (glicopéptidos) , proteínas de sinal, proteínas anti-virais e apoptose, biopolímeros sinteticamente modificados, tais como biopolímeros transformados com ligadores, metalopriteases oxidase modificadas e transformadas, etc., hidratos de carbono (mono- a poli-sacáridos), tais como açucares transformados, açúcares cliváveis no organismo, ciclodextrinas e seus derivados, amino-açúcares, quitosano, polissulfatos e derivados do ácido acetilneuramínico, anticorpos, tais como anticorpos monoclonais, fragmentos de anticorpo, anticorpos monoclonais, minicorpos, cadeias individuais (incluindo as quais são repetidas com fragmentos ligadores) , glóbulos vermelhos sanguíneos e outros componentes sanguíneos, marcadores de cancro (v.g., CAA) e substâncias de adesão a células (v.g., derivados de Lewis X e anti-Lewis X), fragmentos de ADN e ARN, tais como ADN e ARN transformados (também com bases não naturais (por exemplo, os encontrados pelo procedimento SELEX), ARN e ADN sintético (também com bases não naturais) ANP (Hoechst) e anti-sentido, β-aminoácidos (Seebach), vectores de amina para a introdução em células, aminas biogénicas, fármacos, produtos 22 oncológicos, polímeros sintéticos, os quais são dirigidos para um alvo biológico (v.g, um receptor), esteróides (naturais e modificados), prostaglandinas, taxol e seus derivados, endotelinas, alcaloides, ácido fólico e seus derivados, lípidos bioactivos, gorduras, ésteres de ácidos gordos, mono-, di- e tri-glicéridos sinteticamente modificados, lipossomas obtidos a partir da superfície, micelas provenientes de ácidos gordos naturais ou provenientes de compostos perfluoroalquilo, porfirinas, texafrina estendida, porfirinas, citocrómos, inibidores, neuramidase, neuropéptidos, imunomoduladores, tais como FK 506, CAPE e gliotoxina, endoglicosidases, substratos activados por enzimas, tais como calmodolina-cinase, caseína-cinase II, glutationa-S-transferase, heparinase, metaloproteinase de matriz, receptor de β-insulina-cinase, UDP-galactose 4-epimerase, fucosidases, proteínas G, galactosidases, glicosidases, glicosiltransferases e xilosidase, antibióticos, vitaminas e análogos de vitamina, hormonas, intercalodores de ADN, nucleósidos, nucleótidos, lectinas, vitamina B12, Lewis X e associados, psoraleno, antibióticos dieno-trieno, carbaciclinas, VEGF (factor de crescimento endotelial vascular), somatostatina e seus derivados, derivados de biotina, anti-hormonas, proteínas e produtos sintéticos específicos de tumores, polímeros que se acumulam em áreas acidicas ou básicas do corpo (distribuição controlado pelo pH) , mioglobina, apomioglobina, etc., péptidos neurotransmissores, factor de necrose tumoral, péptidos que se acumulam em tecidos inflamados, reagentes do conjunto sanguíneo, proteínas de transporte de aniões e catiões, poliésteres (v.g., de ácido láctico), poliamidas e polifosfatos. 23 A maior parte das biomoléculas supramencionadas encontram-se comercialmente disponíveis, por exemplo, pelas empresas Merck, Alderich, Sigma, Calibochem ou Bachem.

Além disso, conforme descrito para todas as moléculas, nos documentos WO 96/23526 e WO 01/08712, são utilizados "grupos de ligação a proteínas do plasma" ou "grupos de ligação a alvos".

Além disso, os compostos de fórmulas estruturais Vila e b podem ser conjugados com todas essas moléculas, as quais são convertidas com corantes fluorescentes para se determinar a sua localização dentro da célula por microscopia de epifluorescência. Além disso, os compostos podem ser conjugados praticamente com quaisquer fármacos, sendo depois monitorizado, após administração, o transporte do fármaco dentro do organismo por técnicas de NMR ou cintigrafia. Também é possível que os novos conjugados de acordo com a invenção, provenientes dos compostos contenham outras moléculas suplementares, as quais foram conjugadas nas biomoléculas de fórmulas estruturais Vila e b e nas biomoléculas. 0 termo "biomolécula", tal como aqui utilizado, compreende ainda todas as moléculas encontradas em sistemas biológicos e as moléculas que sejam biocompatíveis (ver também a definição anterior de biomoléculas) . A relaxividade do novo complexo paramagnético de acordo com a invenção é tão elevada que este é particularmente adequado para diagnóstico por NMR.

Os compostos de acordo com a invenção ligam-se a proteínas. Esta propriedades faz que seja possível que estes complexos, ligados a proteínas do plasma, se sanguínea, mantenham durante mais tempo na corrente 24 permitindo assim a representação de espaços vasais. Além do mais, também torna possivel a representação de locais de permeabilidade aumentada, tal como, por exemplo, é o caso de tumores. Esta permeabilidade vascular aumentada constitui uma base para terapia de tumores com complexos metálicos radioactivos. 0 fármaco deixa os vasos para dentro do tumor, permanece nos tecidos e expõe este tecido à sua radiação terapeuticamente eficaz. A ligação à proteína do plasma permite ainda o diagnóstico por meio de imagem para a localização de enfartes ou necrose, como resultado da acumulação de substâncias de acordo com a invenção no enfarte ou na necrose. A detecção, localização e monitorização de necrose ou de enfarte constitui uma área importante da medicina. Assim, o enfarte do miocárdio provoca, não imediatamente, uma não capacidade de recuperação de tecido disfuncional, mas dá inicio a um processo dinâmico que se estende ao longo de um período alargado (semanas a meses) . A doença possui cerca de três fases, as quais não estão forçosamente separadas entre si, mas que se sobrepõem. A primeira fase compreende o desenvolvimento de enfarte do miocárdio, nas 24 horas seguintes ao ataque, nas quais a destruição progride de um modo semelhante a uma onda de choque (fenómeno de frente de onda) desde o subendocárdio até ao miocárdio. A segunda fase, na qual já existe enfarte, compreende a estabilização de uma área na qual se dá a formação de fibras (fibrose), como processo de cura. A terceira fase tem início a cura total do enfarte, após todos os tecidos destruídos terem sido substituídos por 25 tecido de cicatrização de fibras. Durante este periodo, tem lugar uma reestruturação extensa.

Para a avaliação do enfarte do miocárdio, é crucial conhecer a extensão da porção de tecido no enfarte que é definitivamente perdida com o enfarte e em que lugar teve lugar essa perda, uma vez que o tipo de terapia depende deste conhecimento.

Os enfartes não ocorrem apenas no miocárdio, mas também em outros tecidos, tais como no cérebro ou nos rins.

Durante o enfarte possa ser tratado até uma determinada extensão, na necrose, a morte de tecido localizado, apenas é possível prevenir as consequências prejudiciais para o resto do organismo ou pelo menos reduzi-las. A necrose pode ser desenvolvida de diversos modos: por lesões, químicos, deficiência em oxigénio ou por radiação. Tal como no caso de enfartes, o conhecimento da extensão e da natureza da necrose é importante para procedimentos médicos futuros. A produção dos conjugados de acordo com a invenção de fórmulas estruturais Vila e b é efectuada de um modo convencional, em que os compostos de fórmulas estruturais Vila' e VIIb'

vira virb 26 em que o símbolo Z' possui as significações definidas para o símbolo Z ou representa um grupo protector de carboxilo, o símbolo R' representa um grupo funcional e o símbolo A representa -Coo-, se adequado após a remoção dos grupos protectores de carboxilo, são submetidos a reacção com uma biomolécula e, depois (facultativamente após a remoção dos grupos protectores de carboxilo) , os ácidos resultantes são submetidos a uma reacção convenciona pelo menos com um óxido metálico ou um sal metálico de um elemento com números atómicos 21-29, 31, 32, 37-39, 42-44, 46, 47, 49, 58-71, 75, 77, 82 ou 83, e, subsequentemente, se desejado, submetidos a conversão dos átomos de hidrogénio acídicos existentes com ácidos inorgânicos e/ou orgânicos ou com aminoácidos em sais fisiologicamente toleráveis. A reacção com a biomolécula por ser efectuada quelatos metálicos (em que o símbolo Z' representa equivalentes iónicos metálicos) , com agentes de quelação (em que o símbolo Z' representa hidrogénio) ou com agentes de quelação protegidos (em que o símbolo Z' representa grupos protectores de carboxilo) de fórmulas estruturais VII'a e VII'b, de modo que a remoção dos grupos protectores e/ou a introdução dos iões metálicos desejados tenha lugar, dependendo mo modo de reacção seleccionado.

Como grupos protectores de carboxilo Z' refere-se grupos alquilo inferior, arilo e aralquilo, tais como grupos metilo, etilo, propilo, butilo, fenilo, benzilo, difenilmetilo, trifenilmetilo, bis(4-nitrofenil)-metilo e trialquilsililo. A remoção dos grupos protectores Z' é efectuada de um modo conhecido, por exemplo, por hidrólise, hidrólise alcalina do éster, de preferência com metais alcalinos numa 27 27 solução uma , aquosa-alcoólica, a uma temperatura compreendida entre 0°C e 50°C, ou, no caso de ésteres benzílicos, por hidrogenação catalítica, e, no caso de ésteres t-butílicos, por hidrólise ácida, por exemplo, com ácido clorídrico ou ácido trifluoroacético (Protective Groups in Organic Synthesis, 2a Edição, T.W. Greene and P.G. M. Wutz, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1991). A preparação dos conjugados de acordo com a invenção de fórmulas estruturais Vila e Vllb é descrita pelo seguinte exemplo do composto 1 seleccionado, em que o símbolo Z' representa t-butilo.

0 composto 1 é convertido no composto VII'a por meio de hidrólise alcalina e subsequente tratamento de permuta iónica com um ácido carboxílico livre. 0 composto 1 é formado a partir de triamina 2 por reacção de alquilação com éster terc-butílico do ácido bromoacético numa mistura de acetonitrilo/água, utilizando carbonato de potássio como base. 28

£, 0 composto 2 pode ser preparado por redução da amida 3 com complexo borano-tetra-hidrofurano. Utilizando as condições conforme, por exemplo, descritas em J. Amer. Chem. Soc., (1990), 9608.

A amida 3 é preparada por meio da reacção da diamina 4 duplamente protegida com Boc, utilizando ácido trifluoroacético e diclorometano.

4 29 A formação da amida 4 é efectuada de acordo com métodos conhecidos pelos especialistas na matéria, por exemplo, por activação com ácido com - cloreto de oxalilo: J. Org. Chem., 29: 843 (1964) - cloreto de tionilo: Helv., 42: 1653 (1959) - carbodiimida: Helv. 46: 1550 (1963) - carbodiimida/hidroxi-succinimida: J. Am. Chem. Soc. 86: 1839 (1964) e também J. Org. Chem. 53: 3583 (1988); Synthesis 453 (1972) método de anidrido: 2-etoxi-l-etoxicarbonil-l,2-di- hidroquinolina: J. Am. Chem. Soc. 90: 1651 (1986); Int. J. Pept. Prot. Res., 26: 493 (1985); Am. Soc. 73: 3547 (1951) - método imidazolida: Am. Soc. 91: 2691 (1969), J. Med.

Chem. 1996, 392596; Tetrahedron Letters 1994, 35, 5981; Bioorg. Med. Letters 1996, 6, 55; J. Chem. Soc.

Commun. 1994, 201, a partir do ácido 5 comercialmente disponível e da amina mono-protegida 6.

O composto 6 é obtido por redução da azida 7 com hidrogénio e Pd/C, em acetato de etilo. Τ ο composto 7 provém da reacção de substituição do mesilato 8 com azida de sódio.

HjC? '0

H

"O

0 mesilato 8 é obtido por reacção do álcool 9 com cloreto de metano-sulfonilo.

9 0 álcool 9 é o produto da reacção de 2-amino-l-propanol (10), comercialmente disponível, com dicarbonato de di-terc-butilo [(Boc)20] em tetra-hidrofurano.

0 grupo nitro no composto 1 é utilizado, após a sua transformação no grupo amino, como local de ligação directa para as biomoléculas, por exemplo, por meio da formação de 31 amida com o auxílio de ésteres activados ou aminação redutiva com grupos carbonilo ou, após conversão, para grupos reactivos selectivos. Estas reacções de conversão são bem conhecidas pelos especialistas na matéria.

Assim, Gansow (EP 484 984) e Meares (US 4622420) descrevem halogenoacetamidas de agentes de complexação aciclicos que são utilizadas para o acoplamento com grupos -SH ou -NH2.

Por acoplamento selectivo com grupos amino é possível obter o grupo isotiocianato. A sua representação e conversão com aminas nas tioureias adequadas encontram-se descritas, por exemplo, na patente de invenção norte-americana n° US 4680338 da Immumedics. A reacção com hidrazidas para se obter as tio-semicarbazidas encontra-se descrita no pedido de patente de invenção n° WO 95/15335 da Neorx Corp.

Por reacção selectiva com grupos -SH obtém-se maleimidas. A sua representação e conversão encontram-se descritas, por exemplo, na patente de invenção norte-americana n° US 5273743 e no documento EP 446 071 da Hybritech ou no documento EP 345 723 da Nihon Medi-Physics. A introdução dos complexos de iões metálicos desejados para a produção de materiais para o diagnóstico por NMR pode ser efectuada de um modo idêntico ao descrito nas patentes de invenção EP 71564, EP 130934 e DE-OS 34 01 052. Além disso, o óxido metálico ou sal metálico (por exemplo, um cloreto, um nitrato, um acetato, um carbonato ou um sulfato) do elemento desejado pode ser dissolvido ou colocado em suspensão em água e/ou num álcool inferior (tal como metanol, etanol ou isopropanol) e convertido na 32 solução ou suspensão da quantidade equivalente de agente de complexação de acordo com a invenção. A neutralização de grupos carboxilo livres possivelmente presentes é efectuada com o auxilio de bases inorgânicas (v.g., hidróxidos, carbonatos ou bicarbonatos) de metais, tais como sódio, potássio, litio, magnésio ou cálcio, e/ou de bases orgânicas, tais como aminas primárias, secundárias e terciárias, tais como etanolamina, morfolina, glucamina, N-metil- e N,N-dimetil-glucamina, e de aminoácidos básicos, tais como lisina, arginina ou ornitina ou amidas originais de aminoácidos neutros ou acidicos.

Para a preparação de compostos de complexo neutros é possível adicionar à base desejada, por exemplo, sais de complexo ácidos numa solução ou suspensão aquosa até se atingir um ponto neutro. A solução resultante pode então ser evaporada até à secura sob uma pressão hipobárica. É por vezes vantajoso precipitar os sais neutros formados por meio da adição de solventes miscíveis em água, tais como álcoois inferiores (metanol, etanol, isopropanol, etc.), cetonas inferiores (acetona e semelhantes), para se precipitar éteres polares (tetra-hidrofurano, dioxano, 1,2-dimetoxietano e semelhantes) e para se obter cristais facilmente isoláveis e purificados. Como vantagem suplementar, concluiu-se que é possível adicionar a base desejada durante a formação do complexo à mistura de reacção, poupando assim um passo. No caso de o agente de complexação ser utilizado para a preparação de compostos para radiodiagnóstico ou de radioterapêuticos, então o método para a preparação dos agentes de complexação encontra-se descrito na obra "Radiotracers for Medicai 33

Applications", Vol I, CRC Press, Boca Raton, Florida (1983) .

Poderá ser desejável preparar o complexo imediatamente antes da sua utilização, em particular no caso de ser utilizado como radiofármaco. Assim sendo, a invenção também diz respeito a um estojo para a preparação de radiofármacos, o qual compreende um composto de fórmula estrutural Vila ou Vllb, em que o símbolo Z representa um radioisótopo. A invenção diz ainda respeito a composições farmacêuticas que compreendem, pelo menos, um composto fisiologicamente compatível de fórmula estrutural Vila ou Vllb, facultativamente com aditivos convencionais galénicos. A preparação dos agentes farmacêuticos de acordo com a invenção é efectuada de um modo conhecido pelos especialistas na matéria, por meio da suspensão ou dissolução dos compostos de complexo de acordo com a invenção - se necessário sob adição dos aditivos galénicos habituais - a um meio aquoso, e, se necessária, subsequente esterilização da solução ou suspensão. Como aditivos adequados refere-se, por exemplo, tampões fisiologicamente inofensivos (tais como trometamina), aditivos de agentes de complexação ou complexos fracos (tais como ácido dietilenotriaminanimapentaacético ou os correspondentes complexos metálicos dos novos complexos de Ca) ou, se necessário, electrólitos, tais como cloreto de sódio, ou, se necessário, anti-oxidantes, tais como ácido ascórbico.

Caso seja pretendida a administração por via entérica, ou para outros fins, das suspensões ou soluções de acordo com a invenção em água ou outra solução fisiológica de sal, então estas são misturadas com um ou vários excipientes galénicos habituais [v.g., metil-celulose, lactose, 34 manitol] e/ou tensioactivos [v.g.r lectinia, Tween®, Myrj®] e/ou aromatizantes para mascarar o paladar [v.g., óleos etéreos].

Regra geral, também é possível preparar os agentes farmacêuticos da invenção sem isolar os sais de complexo. Para cada caso, é necessário um cuidado especial para a realização da etapa de quelação de um modo tal que os sais e as soluções de sal da invenção sejam praticamente isentas da toxicidade dos iões metálicos não complexados.

Tal pode ser efectuado, por exemplo, com o auxílio de indicadores de cor, tais como cor-de-laranja de xilenol, pelo controlo durante o processo de preparação. Assim sendo, a invenção também diz respeito a métodos para a preparação de compostos de complexo e dos seus sais. Como precaução final, refere-se a purificação do sal de complexo isolado.

As composições farmacêuticas de acordo com a invenção compreendem, de preferência, entre 1 mol e 1,3 mol/L do sal do complexo e são normalmente utilizadas em quantidades de 0,5 pMol/Kg-5 mmol/Kg. São utilizadas em administração por via entérica e parentérica. Os compostos de complexo de acordo com a invenção são utilizados 1. Como compostos para o diagnóstico por NMR sob a forma dos seus complexos com iões paramagnéticos de elementos com números atómicos de 21-29, 42, 44 e 58-70. Como iões adequados refere-se, por exemplo, os iões de crómio (III), ferro (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), praseodímio (III), neodímio (III), samário (III) e itérbio (III). Devido ao seu momento magnético forte, para o diagnóstico por NMR, são preferíveis os iões de gadolínio 35 (III), térbio (III), disprósio (III), hólmio (III), érbio (III), manganês (II) e ferro (III). 2. Para radiodiagnóstico e radioterapia sob a forma dos seus complexos com radioisótopos de elementos com números atómicos 26, 27, 29, 31, 32, 37-39, 43, 46, 47, 49, 61, 62, 64, 67, 70, 71, 75, 77, 82 e 83. As composições de acordo com a invenção satisfazem diversos requisitos para a sua adequabilidade como agente de contraste para tomografia de ressonância nuclear. Assim, são notavelmente adequados, por administração por via oral ou parentérica, para aumentar a intensidade do sinal como da imagem de tomografia de ressonância nuclear. Também apresentam um nível elevado de eficácia, o qual é necessário para carregar o corpo com quantidades tão reduzidas de substâncias exógenas quanto possível, e uma boa compatibilidade, a qual é necessária para manter a natureza não invasiva dos estudos. A boa solubilidade em água e a reduzida osmolalidade das composições da invenção permitem a sua preparação em soluções extremamente concentradas, mantendo a sua carga volumétrica em circulação dentro de limites aceitáveis e para suportar a diluição provocada pelos fluidos corporais, isto é, os agentes de diagnóstico de NMR possuem um teor em água 100 a 1000 vezes superior ao de espectroscopia de NMR. Além do mais, as composições de acordo com a invenção possuem uma elevada estabilidade in vitro, mas também uma surpreendente elevada estabilidade in vivo, de um modo tal que, no intervalo de tempo para o qual estes agentes são excretados, apenas tenha lugar uma libertação ou permuta muita lenta dos complexos que não estejam covalentemente ligados aos iões - os quais são tóxicos. 36

De um modo geral, as composições da invenção para utilização como agentes de diagnóstico por NMR são apresentadas em quantidades compreendidas entre 0,0001 e 5 mmol/kg e de preferência entre 0,005 e 0,5 mmol/kg. Mais pormenores são apresentados, v.g., por H.-J. Weinmann et al., Am. J. of Roentgenology 142, 619 (1984).

Doses pequenas (inferiores a 1 mg/kg de massa corporal) de agentes para o diagnóstico por NMR específicos para órgãos são utilizadas, por exemplo, para detectar tumores e enfarte do miocárdio. Em particular, são adequadas dosagens reduzidas dos complexos de acordo com a invenção para utilização em radioterapia e radiodiagnóstico. Assim, são utilizadas dosagens para fins terapêuticos e de diagnóstico compreendidas entre 0,5 pM/kg e 5 μΜ/kg e de preferência entre 50 pM/kg e 500 nMol/kg. Normalmente, em termos do ião metálico radioactivo, são utilizadas concentrações molares inferiores em cerca de 100 a 100000 vezes do que as utilizadas para agentes de quelação e agentes de quelação-bioconjungados, de um modo tal que esteja presente um excesso de agente de quelação e/ou de agente de quelação-bioconjungados.

Além do mais, os complexos de acordo com a invenção podem ser utilizados, de um modo vantajoso e in vivo, como reagentes de susceptibilidade e como reagentes shift em espectroscopia de NMR. As composições de acordo com a invenção são adequadas devido às suas propriedades radioactivas favoráveis e à boa estabilidade dos complexos nelas contidos, bem como agentes de radiodiagnóstico e radioterapêuticos. Mais pormenores sobre a sua aplicação e dosagem encontram-se descritos, v.g., na obra "Radiotracers for Medicai Applications", CRC-Press, Boca Raton, Florida, 37 1983, bem como em Eur. J. Nucl. Med. 17 (1990) 346-364 e em Chem. Rev. 93 (1993) 1137-1156.

Para a SPECT, são adequados os complexos com os '4- 111-,- _ 99mrj, isotopos In e Tc.

Um outro método de obtenção de imagens com radioisótopos é a tomografia de emissão de positrões, na qual são utilizados, v.g., isótopos emissores de positrões, , 43 o 44o 52-r-i 55 — 68^ _ 64 o·,, 86-^· 94rrirp tais como Sc, Sc, Fe, Co, Ga, Cu, Y e Tc (Heiss, W.D.; Phelps, M.E.; Positron Emission Tomography of Brain, Springer Verlag Berlin, Heidelberg, New York 1983).

Os compostos da invenção são surpreendentemente adequados para a diferenciação de tumores malignos e benignos em áreas que não possuam barreiras hemato-encefálicas.

Também são diferentes devido ao facto de serem completamente eliminados pelo corpo, sendo assim bem tolerados.

Uma vez que as substâncias de acordo com a invenção se acumulam em tumores malignos (não ocorrendo difusão para tecidos saudáveis, mas uma permeabilidade elevada para os vasos tumorais), eles também podem ser utilizados para radioterapia de tumores malignos. Tal é diferentes do diagnóstico correspondente apenas pela quantidade e pelo tipo de isótopo utilizados. 0 objectivo é a destruição das células tumorais por radiação de onda curta e de elevada energia num intervalo tão pequeno quanto possível. Estas interacções são exploradas nos complexos metálicos (tais como ferro ou gadiolínio) com radiação ionizante (v.g., raios-X) ou com feixe de neutrões. Através deste efeito, a dose local de radiação no local onde se encontra o complexo metálico (v.g., em tumores) é aumentada significativamente. 38

Para se produzir uma dose de radiação idêntica em tecidos malignos, a dose de radiação em tecidos saudáveis pode ser substancialmente reduzida exposição quando se utilizam tais complexos metálicos, evitando assim os efeitos secundários nos pacientes. Os novos conjugados de complexo metálico da invenção são assim adequados como substâncias radio- sensibilizadoras em radioterapia de tumores malignos (v.g., utilizando efeitos de Mõssbauer ou neutrões). Como iões β-emissores adequados refere-se, v.g., 46Sc, 47Sc, 48Sc, 72Ga,

73- 90 v 67- 109-,-,-, 111, 149- 153- 166„ 177, 186-^ Q

Ga, Y, Cu, Pd, Ag, Pm, Sm, Ho, Lu, Re e 188Re, sendo preferíveis 90Y, 177Lu, 72Ga, 153Sm e 67Cu. Como iões α-emissores que exibem períodos de semi-vida 211 radioactivos pequenos adequados refere-se, v.g., At, 211Bi, 212Bí, 213Bí e 214Bi, sendo preferível o 212Bi. Um ião 158 emissor de fotões e electrões adequado e Gd, o qual pode ser obtido a partir de Gd por captura de neutrões. A composição de acordo com a invenção pode ser aplicada em conformidade com R. L. Mills et ai. [Nature, Vol. 336, (1988), pág. 787], determinada pela variante sugerida de radioterapia, então o ião central deverá ser proveniente de um isótopo Mõssbauer, v.g., 57Fe e 151Eu. A aplicação in vivo das composições terapêuticas de acordo com a invenção pode ser combinada, v.g., com um veículo adequado, tal como soro ou uma solução de soluto salino fisiológica, e em conjunto com uma outra proteína, tal como albumina do soro humana. A dosagem irá depender do tipo de perturbação celular, do ião metálico utilizado e do tipo de método para a obtenção de imagens.

De preferência, as composições terapêuticas de acordo com a invenção são aplicadas por via parentérica e mais preferencialmente por via i.v.. 39

Mais pormenores sobre a aplicação de agentes radioterapêuticos encontram-se descritos, v.g., por R. W. Kozak et ai. TIBTEC, Outubro 1986, 262 (ver, Bioconjugate Chem. 12 (2001) 7-34).

Globalmente, foi possível sintetizar novos agentes de complexação, complexos metálicos e sais de complexos metálicos, abrindo-se assim novas possibilidades para uma melhoria no diagnóstico e em práticas terapêuticas.

Os exemplos seguintes são apresentados para ilustrar a presente invenção. Nos exemplos 10, 12-15, 18, 19, 20, 21, 28-31 encontram-se descritos conjugados com anticorpos. Os conjugados com outras biomoléculas podem ser preparados pelos procedimentos gerais seguintes.

No presente texto, o termo "AAV" designa cromatografia em fase estacionária e o termo "RP-18" designa cromatografia de fase inversa. O número de complexos por biomolécula foi determinado por cintigrafia ou por ICP (espectroscopia de emissão atómica de plasma acoplado por indução).

Procedimento geral (AAV) I: conjugados albumina-amida

Dissolve-se 3 mmol de ácido em 15 mL de DMF, adiciona-se, sob arrefecimento com gelo, a 380 mg (3,3 mmol) de N-hidroxi-succinimida e 681 mg de diciclo-hexilcarbodiimida e efectua-se a pré-activação durante 1 hora em gelo. Adiciona-se, gota a gota, a mistura de éster ao longo de 30 minutos a uma solução de 16,75 g (0,25 mmol) de albumina do soro de bovino (BSA) em 150 mL de tampão de fosfato (pH 7,4) e agita-se durante 2 horas à temperatura ambiente. Filtra-se a solução em lote, submete-se o filtrado a ultrafiltração através de AMICON® YM30 (corte de 30000 Da), 40 submete-se o material retido a cromatografia numa coluna Sephadex® G50 e congela-se as fracções que contêm produto.

Procedimento geral (AAV) II: conjugado albumina-maleimida

Dissolve-se 0,0438 mmol de maleimida em 1 mL de DMF em conjunto com 0,84 g (0,0125 mmol) de albumina do soro de bovino (BSA) em 15 mL de tampão de fosfato (pH 7,4) e agitou-se durante uma hora à temperatura ambiente. Filtra-se a solução do lote, submete-se o filtrado a ultrafiltração através de AMICON® YM30 (corte de 30000 Da), submete-se o material retido a cromatografia numa coluna Sephadex® G50 e congela-se as fracções que contêm produto.

Procedimento geral (AAV) III: produção do conjugado de amida

Dissolve-se 3 mmol de ácido em 15 mL de DMF, adiciona-se, sob arrefecimento com gelo, a 380 mg (3,3 mmol) de N-hidroxi-succinimida e 681 mg de diciclo-hexilcarbodiimida e efectua-se a pré-activação durante 1 hora em gelo. Adiciona-se, gota a gota, a mistura de éster a uma solução de 2,5 mmol do componente amina em 15 a 150 mL de DMF e agita-se de um dia para o outro à temperatura ambiente. Filtra-se a solução do lote e submete-se a cromatografia através de gel de sílica.

Procedimento geral (AAV) IV: preparação do conjugado maleimida-SH

Adiciona-se, gota a gota, 3 mmol de maleimida em 15 mL de DMF a 2,5 mmol do componente SH em 15 a 150 mL de DMF e agita-se durante uma hora à temperatura ambiente. Filtra-se a solução do lote, submete-se o filtrado a ultrafiltração 41 através de AMICON® YM30 (corte de 30000 Da) , submete-se o material retido a cromatografia numa coluna Sephadex® G50 e congela-se as fracções que contêm produto.

Procedimento geral (AAVj V: preparação do conjugado halogenoacetamido-SH

Adiciona-se, gota a gota, 3 mmol de halogenoacetamida em 15 mL de DMF a 2,5 mmol do componente SH em 15 a 150 mL de DMF e agita-se durante oito horas à temperatura ambiente. Filtra-se a solução do lote, submete-se o filtrado a ultrafiltração através de AMICON® YM30 (corte de 30000 Da) , submete-se o material retido a cromatografia numa coluna Sephadex® G50 e congela-se as fracções que contêm produto.

Exemplo 1 a) Éster terc-butilico do ácido (S)-(2-Hydroxy-l-methyl-ethyl)-carbâmico

Dissolve-se 10,50 g (140 mmol) de (S)-(+)-2-amino-l-propanol em 110 mL de THF e arrefece-se a 0°C. A esta solução agitada adiciona-se, gota a gota, uma solução de 30,2 (139 mmol) de dicarbonato de di-terc-butilo em 45 mL de THF. Agita-se a mistura de reacção durante 90 minutos a 25°C e concentra-se numa evaporadora rotativa. Retoma-se o resíduo em 300 mL de éter dietílico e depois lava-se com 90 mL de uma solução de HCL 0,01 M. Seca-se a fase orgânica sobre sulfato de sódio e concentra-se numa evaporadora rotativa com bomba de óleo. Utiliza-se o produto impuro (20,4 g) no passo subsequente sem mais purificação. 42 b) Éster 2-terc-butoxicarbonilamino-propílico do ácido (S)-metano-sulfónico

Dissolve-se 20,3 g (116 mmol) do composto la em 125 L de diclorometano, com 17,7 g (175 mmol) de trietilamina. Adiciona-se, gota a gota e a 0°C, a uma solução de 14,7 g (128 mmol) de cloreto de metano-sulf onilo em 30 mL de diclorometano. Agita-se a solução de reacção a 0°C durante 2 horas e depois mistura-se com 300 mL de água. Separa-se a fase orgânica. Extrai-se a fase aquosa duas vezes com 150 mL de diclorometano. Lava-se as fases orgânicas combinadas uma vez com 150 mL de uma solução de HCL 0,1 M, duas vezes com 150 mL de uma solução de bicarbonato de sódio a 5% e, por último, com 50 mL de uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio. Seca-se a fase orgânica sobre sulfato de sódio. Concentra-se a solução e deixa-se cristalizar num congelador. Lava-se os cristais com hexano frio. Obtém-se 25,4 g (100 mmol) do produto desejado. MS-FAB: 254 (M+ +1, 13). c) Ester terc-butilico do ácido (S)-(2-azido-l-metil-etil)-carbâmico mais

Mistura-se uma solução de 20,3 g (100 mmol) do composto lb em 155 ml de DMSO com 7,8 g (120 mmol) de azida de sódio e agita-se durante 24 horas a 45°C. Adiciona-se 250 mL de gelo fundente. Extrai-se a mistura uma vez com 200 mL de diclorometano. Lava-se as fases orgânicas combinadas duas vezes com 50 mL de uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio. Concentra-se a fase orgânica. Obtém-se 11,4 g de produto impuro. Utiliza-se o produto impuro no passo de reacção subsequente sem purificação. 43 MS-FAB: 201 (M+ + 1, 23) . d) Éster terc—butilico do ácido (S)-(2-amino-l-metil-etil)-carbâmico

Mistura-se uma solução agitada de 11,4 g (57 mmol) do composto lc em 165 ml de acetato de etilo com 1,8 g de Pd/C (a 10%) e submete-se a ambiente de hidrogénio a 4 bar. Separa-se o catalisador por filtração (designada por frita de vidro G4) . Concentra-se o filtrado numa evaporadora rotativa e purifica-se por cromatografia em coluna (S1O2 -diclorometano -> diclorometano:metanol a 1:1). Obtém-se o produto desejado com um rendimento de 73% (7,25 g; 42 mmol). MS-FAB: 175 (M+ + 1, 29). e) Éster terc-butilico do ácido (S,S)-{2-[2-terc-butoxicarbonilamino-3-(4-nitro-fenil)-propionilamino]—1— metil-etil}-carbâmico

Mistura-se uma solução agitada de 7,2 g (41 mmol) do composto ld, 245 mL de água e 245 mL de diclorometano com 12,9 g (42 mmol) de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-3-(4-nitro-fenil)-propiónico (Bachem), comercialmente disponível, e adiciona-se 6,4 g (42 mmol) de 1-hidroxi-benzotriazol-H20 (HOBT). Arrefece-se a solução até 0°C e adiciona-se 8,8 g (46 mmol) de 1-(dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDCI). Agita-se a solução de reacção durante sete horas e 0°C, durante 12 horas à temperatura ambiente e durante 24 horas a 60°C. Arrefece-se a solução até à temperatura ambiente. Separa-se a fase aquosa e extrai-se diversas vezes com diclorometano. Lava-se as fases orgânicas combinadas com bicarbonato de sódio a 5% e 44 com uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio. Seca-se sobre sulfato de sódio e concentra-se numa evaporadora rotativa. Trata-se o resíduo com hexano, tritura-se, submete-se a uma pressão hipobárica e lava-se com hexano frio. Seca-se o sólido sob uma pressão hipobárica a 30°C. Obtém-se o produto desejado le com um rendimento de 77% (14,9 g; 32 mmol). MS-FAB: 467 (M+ + 1, 38). f) (S,S)-N-(2-Amino-propil)-3-(4-nitro-fenil)-propano-1,2- diamina

Coloca-se em suspensão 14,9 g (32 mmol) do composto le em 180 mL de diclorometano. Depois, adiciona-se 54,2 g (475 mmol) de ácido trifluoroacético. Agita-se a solução durante uma hora e concentra-se numa evaporadora rotativa. Adiciona-se diclorometano e concentra-se novamente. Adiciona-se éter dietílico. Separa-se o precipitado sólido e lava-se com éter dietilico frio. Seca-se o sólido sob uma pressão hipobárica a 35°C. A uma solução agitada deste sólido (17,7 g) em 225 mL de THF absoluto adiciona-se, gota a gota, 225 mL (1 M) de complexo borano-tetra-hidrofurano. Aquece-se a solução durante 6 horas ao refluxo e agita-se de um dia para o outro à temperatura ambiente. Adiciona-se cuidadosamente, gota a gota, 60 mL de metanol e agitou-se durante mais 2 horas. Concentra-se a solução numa evaporadora rotativa e mistura-se com 150 mL de etanol. Introduz-se HCL gasoso, para se obter um sólido. Concentra-se e tratou-se com éter dietílico anidro. Separa-se o sólido, lava-se com éter dietílico frio e seca-se sob uma pressão hipobárica a 40°C. Obtém-se 9,61 g (-26,6 mmol) do produto desejado lf sob a forma do tricloridrato. 45 MS-FAB: 253 (M+ + 1, 28). g) Éster terc-butilico do ácido (S,S)-{[2—{[2-(bis-terc-butoxicarbonilmetil-amino)-propil]-terc-butoxicarbonil-metil-amino}-l-(4-nitro-benzil)-etil]-terc-butoxicarbonil-metil—amino—acético A uma solução agitada de 9,6 g (27 mmol) do composto lf em 290 mL de acetonitrilo e 60 mL de água adiciona-se 43,8 g (317 mmol) de carbonato de potássio e 39 g (200 mmol) de éster terc-butílico do ácido bromoacético. Aquece-se a solução durante 7 horas a 70°C. A essa solução adiciona-se 4,3 g (26 mmol) de iodeto de potássio. Agita-se a solução durante 7 horas a 70°C. Concentra-se a solução de reacção numa evaporadora rotativa, mistura-se com água e extrai-se três vezes com acetato de etilo. Lava-se as fases orgânicas combinadas com uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio, seca-se sobre sulfato de sódio e concentra-se. Purifica-se o resíduo por cromatografia em coluna (S1O2 - diclorometano -> diclorometano: metanol a 98:2). Obtém-se o produto desejado 1 g com um rendimento de 54% (23,2 g; 42 mmol). MS-FAB: 824 (M+ + 1, 58) . h) Ácido (S,S))-{[2-{[2-(bis-carboximetil-amino)-propil]-carboximetil-amino}-l-(4-nitro-benzil)-etil]-carboximetil-amino}-acético A uma solução agitada de 14,8 g (130 mmol) de ácido trifluoroacético, 25,5 g (300 mmol) de diclorometano e 2,9 g (25 mmol) de trietilsilano adiciona-se 1,65 g (2 mmol) do composto lg. Agita-se a mistura de reacção durante 1 hora e concentra-se numa evaporadora rotativa e bomba de óleo. 46

Trata-se o resíduo com éter dietílico. Separa-se o sólido por filtração e lava-se com éter dietílico. Obtém-se o produto desejado 1H com um rendimento de 99% (1,0 g; 1,99 mmol). MS-FAB: 543 (M+ + 1, 59).

Exemplo 2 Éster terc-butilico do ácido (S,S))-{[2-(4-amino-fenil)-1-({[2-(bis-terc-butoxicarbonilmetil-amino)-propil]-terc-butoxicarbonilmetil-amino}-metil)-etil]-terc-butoxi-carbonilmetil-amino}-acético A uma solução de 0,5 g (0,6 mmol) do composto lg em 10 mL de isopropanol adiciona-se 0,2 g Pd/C (a 10%) . A atmosfera sobre a mistura de reacção era de hidrogénio. Agita-se a solução durante 5 horas, filtra-se e concentra-se. Obtém-se o produto desejado 2 com um rendimento de 81% (397 mg; 0,5 mmol). MS-FAB: 795 (M+ + 1, 63).

Exemplo 3 Ácido (S,S)—[(1-(4-amino-benzil)-2g[2-(bis-carboximetil- amino)-propil]-carboximetil-amino}-etil)-carboximetil-amino] -acético Método A: a uma solução de 0,5 g (0,9 mmol) do composto lh em 10 mL de isopropanol adiciona-se 0,2 g de Pd/C (a 10%). A atmosfera sobre a mistura de reacção era de hidrogénio. Agita-se a solução durante 5 horas, filtra-se e concentra-se. Obtém-se o produto desejado 3 com um rendimento de 87% (410 mg; 0,78 mmol). MS-FAB: 513 (M+ + 1, 43) . 47 Método B: a uma solução agitada de 3,64 g (32 mmol) de ácido trifluoroacético, 6,38 g (75 mmol) de diclorometano e 0,7 g (6 mmol) de triet ilsilano adiciona-se 397 mg (0,5 mmol) do composto 2. Agita-se a mistura de reacção durante 1 hora e concentra-se numa evaporadora rotativa e bomba de óleo. Trata-se o residuo com éter dietilico. Separa-se o sólido por filtração e lava-se com éter dietilico. Obtém-se o produto desejado 3 com um rendimento de 99% (253 mg; 0,5 mmol). MS-FAB: 513 (M+ + 1, 48) .

Exemplo 4 Ácido (S,S)-[(2-{[2-(bis-carboximetil-amino)-propil]- carboximetil-amino}-l-{4-[3(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-pirrol-1-il)-proprionilamino]-benzil}-etil)-carboximetil-amino]-acético A uma solução agitada de 1,02 g (2 mmol) do composto 3 e 774 mg (6 mmol) de diisopropiletilamina em 20 mL de DMF, a 0°C, adiciona-se 800 mg (3 mmol) de éster 2,5-dioxo-pirrolidina-l-ílico do ácido 3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-pirrol-l-il)-propiónico (Aldrich). Agita-se a solução de reacção durante 4 horas à temperatura ambiente. Adiciona-se, gota a gota, a solução a 120 mL de éter dietilico vigorosamente agitado. Agita-se a suspensão durante 30 minutos e filtra-se. Seca-se o residuo numa bomba de óleo. Purifica-se uma porção do residuo por RP_HPLC semi-preparativa. MS-FAB: 664 (M+ + 1, 24).

Exemplo 5 48 Ácido (S,S)-[(1-(4-isotiocianato-benzil)—2—{[2-(bis- carboximetil-amino)-propil]-carboximetil-amino}-etil)-carboximetil-amino]-acético A um sistema de duas fases vigorosamente agitado constituído por 0,51 g (1 mmol) do composto 3, 3 mL de água, 605 mg (6 mmol) de trietilmina e 3 mL de clorofórmio, a 0°C, adiciona-se, gota a gota, 114 mg (1 mmol) de tiofosgénio numa pequena quantidade de clorofórmio. Agita-se a solução durante 3 horas. Separa-se a fase orgânica, Extrai-se a fase orgânicas duas vezes com água. Lava-se as fases aquosas combinadas com diclorometano, dilui-se com água e congela-se. Analisa-se a substância por HPLC quanto à sua pureza: coluna HyPurity C18 (5 μιη, 150 x 3,0 mm) com um gradiente de acetonitrilo:água:ácido trifluoroacético (3:96,9:0,1 -> 99,9:0: 0,1). Obtém-se o produto desejado 5 com um rendimento de 91 % (505 mg, 910 mmol). MS-FAB: 555 (M+ + 1, 39).

Exemplo 6 Ácido (S,S)-({2-{[2-(bis-carboximetil-amino)-propil]-carboximetil-amino }-l- [4-(2-bromo-acetilamino)-benzil]-etil}-carboximetil)-amino)-acético A uma solução de 0,51 g (1 mmol) do composto 3 e 606 mg (6 mmol) de trietilamina em 10 ml de DMF, a -20°C, adiciona-se 202 mg (1,1 mmol) de brometo de ácido bromoacético. Agita-se a solução de reacção durante uma hora à temperatura ambiente. Verte-se a solução sob éter dietílico vigorosamente agitado. Remove-se por filtração o precipitado, retoma-se em água e congela-se imediatamente. Analisa-se a substância por HPLC quanto à sua pureza: colina HyPurity C18 (5 pm, 150 x 3,0 mm) com um gradiente 49 de acetonitrilo:água:ácido trifluoroacético (3:96,9:0,1 -> 99,9:0:0,1). Obtém-se o produto desejado 6 com um rendimento de 82% (520 mg, 820 μιτιοί) . MS-FAB: 634 (M+ +1, 46).

Exemplo 7 Ácido (S,S)-({2—{[2-(bis-carboximetil-amino)-propil]- carboximetil-amino}-l-[4-(2-iodo-acetilamino)-benzil]-etil}-carboximetil-amino)-acético A uma solução de 0,51 g (1 mmol) do composto 3 e 606 mg (6 mmol) de trietilamina em 10 ml de DMF, a -20°C, adiciona-se 274 mg (1,1 mmol) de brometo de ácido iodo-acético. Agita-se a solução de reacção durante uma hora à temperatura ambiente. Verte-se a solução sob éter dietilico vigorosamente agitado. Remove-se por filtração o precipitado, retoma-se em água e congela-se imediatamente. Analisa-se a substância por HPLC quanto à sua pureza: colina HyPurity C18 (5 pm, 150 x 3,0 mm) com um gradiente de acetonitrilo:água:ácido trifluoroacético (3:96,9:0,1 99,9:0:0,1). Obtém-se o produto desejado 7 com um rendimento de 88% (600 mg, 880 μπιοί) . MS-FAB: 681 (M+ + 1, 32) .

Exemplo 8 Ácido (S,S)-({2—{[2-(bis-carboximetil-amino)-propil]- carboximetil-amino}-l-[4-(2-iodo-acetilamino)-benzil]-etil}-carboximetil-amino)-acético A uma solução de 0,51 g (1 mmol) do composto 3 e 6 06 mg (6 mmol) de trietilamina em 10 ml de DMF, a -20°C, adiciona-se 125 mg (1,1 mmol) de cloreto de ácido cloro-acético. Agita-se a solução de reacção durante uma hora à 50 temperatura ambiente. Verte-se a solução sob éter dietílico vigorosamente agitado. Remove-se por filtração o precipitado, retoma-se em água e congela-se imediatamente. Analisa-se a substância por HPLC quanto à sua pureza: colina HyPurity C18 (5 μπι, 150 x 3,0 mm) com um gradiente de acetonitrilo : água: ácido trif luoroacético (3:96,9:0,1 -> 99,9:0:0,1). Obtém-se o produto desejado 8 com um rendimento de 82% (520 mg, 820 μπιοί). MS-FAB: 590 (M+ + 1, 31) .

Exemplo 9 Ácido (S,S)-({2-{[2-(bis-carboximetil-amino)-propil]- carboximetil-amino}-l-[4-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-pirrol-l-il)-benzil]-etil}-carboximetil-amino)-acético

Em conformidade com o descrito em Tetrahedron Lett.; 38; 46; 1997; 8089-8092:

Aquece-se durante 5 minutos, num forno microondas (300 W) , uma mistura de cerca de 1 g de gel de sílica anidro, 100 mg (1,0 mmol) de anidrido maleico, 512 mg (1,0 mmol) do composto 3 e 35,6 mg (0,1 mmol) de cloreto de tântalo (V). Efectua-se a eluição do resíduo através de uma frita de vidro com metanol. Concentra-se o filtrado. Retoma-se o resíduo em água. Congela-se a solução. Purifica-se uma porção do resíduo por RP-HPLC semi-preparativa. Analisa-se a substância por HPLC quando à sua pureza: coluna HyPurity C18 (5 μπι, 150 x 3,0 mm) com um gradiente de acetonitrilo : água : ácido trif luoroacético (3:96,9:0,1 -> 99,9:0:0,1). Obtém-se o produto desejado 9, 94 mg (0,16 mmol), com um rendimento de 96%. MS-FAB: 593 (M+ +1 , 42) . 51

Exemplo 10

Conjugado de anticorpo do exemplo 4, nomeadamente ácido (S,S)-[(2-{[2-(bis-carboximetil-amino)-propil]-carboxi-metil-amino}-l-{4-[3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-pirrol-l-il)-propionilamino]-benzil}-etil)-carboximetil-amino]-acético

Dissolve-se 200 pg de um anticorpo com grupos tióis acessiveis livremente (v.g., HuM195 (ver, Michael R. McDevitt, J. Nuc. Med. 40, 1999, 1722; comercialmente disponível pela empresa Protein Design Labs Inc., Mountainview, CA, USA) - o anticorpo não possui grupos tiol acessíveis livremente, os quais podem ser produzidos por meio da utilização de 2-iminotiolano HC1 (v.g., EP 0 607 222 Bl)), em 1,2 mL de tampão borato (50 mM, pH 8,5), em conjunto com 159 pg (240 nmol) do produto do exemplo 4, dissolvido em 50 pL de tampão borato (ver antes), mistura-se e agita-se durante 3 horas a 37°C. Purifica-se através de uma coluna NAP-5 (Amersham Pharmacia Biotech AB, Sephadex G-25, fase móvel: PBS).

Exemplo 11 Ácido (S,S)-{[2—{[2-(bis-carboximetil-amino)-propil]- carboximetil-amino}-l-(4-{3-[2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-pirrol-l-il) -etil]-tioureído}-benzil)-etil]-carboximetil-amino }-acético A uma solução agitada de 555 mg (1 mmol) do composto 5 em 5 mL de DMF adiciona-se, gota a gota, uma solução de 154 mg (1,1 mmol) de 1-(2-amino-etil)-pirrol-2,5-diona em 2 mL de dioxano. Agita-se a solução de reacção de um dia ara o 52 outro e adiciona-se, gota a gota, 80 mL de éter dietilico vigorosamente agitado. Remove-se por filtração o precipitado e dissolve-se em água. Congela-se a solução. Purifica-se uma porção do resíduo por RP-HPLC semi-preparativa. Mistura de acetonitrilo:água (a 20:80). Analisa-se a substâncias por HPLC quando à sua pureza: coluna HyPurity C18 (5 pm, 150 x 3,0 mm) com um gradiente de acetonitrilo:água:ácido trifluoroacético (3:96,9:0,1 99,9:0:0,1). Obtém-se o produto desejado 11, 0,104 g (0,15 mmol), com uma pureza elevada. MS-FAB: 696 (M+ + 1, 33).

Exemplo 12

Complexo de índio do conjugado anticorpo do exemplo 4, nomeadamente ácido (S,S)-[(2—{[2-(bis-carboximetil-amino)-propil]-carboximetil-amino}-l-{4-[3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-pirrol-l-il)-propionilamino]-benzil}-etil)-carboxi-metil-amino]-acético

Dissolve-se 200 pg de um anticorpo com grupos tióis acessíveis livremente (v.g., HuM195 (ver, Michael R. McDevitt, J. Nuc. Med. 40, 1999, 1722; comercialmente disponível pela empresa Protein Design Labs Inc., Mountainview, CA, USA) - o anticorpo não possui grupos tiol acessíveis livremente, os quais podem ser produzidos por meio da utilização de 2-iminotiolano HC1 (v.g., EP 0 607 222 Bl)), em 1,2 mL de tampão borato (50 mM, pH 8,5), em conjunto com 159 pg (240 nmol) do produto do exemplo 11, dissolvido em 50 pL de tampão borato (ver antes), mistura-se e agita-se durante 3 horas a 37°C. Substituiu-se a solução de tampão borato com um tampão acetato, sendo a solução de amostra introduzida três vezes durante 1 hora 53 num dispositivo Slide-A-Lyzer 10000, Pierce MWCO (procedimento de diálise) contra 200 mL de tampões de NaOAc 0,1 M (pH 6,0). Por último, efectua-se a diálise de um dia para o outro contra 400 mL de tampão NaOH 0,1 M (pH 6,0) . Mistura-se a solução com 80 pL (0,05 M HC1) de [mIn] InCl3 ( 27, 88 MBq) e agita-se durante 30 minutos à temperatura ambiente. Purifica-se por passagem através de uma coluna NAP-5 (Amersham Pharmacia Biotech AB, Sephadex G-25, fase móvel: PBS).

Exemplo 13

Complexo de itrio dos conjugados de anticorpos de (1'R,2R,5S)-5-({[2-({l-carboxi-5-[3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-pirrol-l-il)-propionilamino]-pentil}-carboximetil-amino)-etil]-carboximetil-amino}-metil)-1-carboximetil-pirrolidina-2-carboxílico

Dissolve-se 200 pg de um anticorpo com grupos tióis acessíveis livremente (v.g., HuM195 (ver, Michael R. McDevitt, J. Nuc. Med. 40, 1999, 1722; comercialmente disponível pela empresa Protein Design Labs Inc., Mountainview, CA, USA) - o anticorpo não possui grupos tiol acessíveis livremente, os quais podem ser produzidos por meio da utilização de 2-iminotiolano HC1 (v.g., EP 0 607 222 Bl)), em 1,2 mL de tampão borato (50 mM, pH 8,5), em conjunto com 159 pg (240 nmol) do produto do exemplo 11, dissolvido em 50 pL de tampão borato (ver antes), mistura-se e agita-se durante 3 horas a 37°C. Substituiu-se a solução de tampão borato com um tampão acetato, sendo a solução de amostra introduzida três vezes durante 1 hora num dispositivo Slide-A-Lyzer 10000, Pierce MWCO (procedimento de diálise) contra 200 mL de tampões de NaOAc 54 0,1 Μ (ρΗ 6,0). Por último, efectua-se a diálise de um dia para o outro contra 400 mL de tampão NaOH 0,1 M (pH 6,0) . Mistura-se a solução com 50 MBq de [90Y]YC13 e agita-se durante 30 minutos à temperatura ambiente. Purifica-se por passagem através de uma coluna NAP-5 (Amersham Pharmacia Biotech AB, Sephadex G-25, fase móvel: PBS).

Exemplo 14

Complexo de escândio dos conjugados de anticorpos do ácido (1'R,2R,5S)-5-({[2-({l-carboxi-5-[3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-pirrol-l-il)-propionilamino]-pentilj-carboximetil-amino)-etil]-carboximetil-amino}-metil)-1-carboximetil-pirrolidina-2-carboxílico

Dissolve-se 200 pg de um anticorpo com grupos tióis acessíveis livremente (v.g., HuM195 (ver, Michael R. McDevitt, J. Nuc. Med. 40, 1999, 1722; comercialmente disponível pela empresa Protein Design Labs Inc. , Mountainview, CA, USA) - o anticorpo não possui grupos tiol acessíveis livremente, os quais podem ser produzidos por meio da utilização de 2-iminot iolano HC1 (v.g., EP 0 607 222 Bl)), em 1,2 mL de tampão borato (50 mM, pH 8,5), em conjunto com 159 pg (240 nmol) do produto do exemplo 11, dissolvido em 50 pL de tampão borato (ver antes), mistura-se e agita-se durante 3 horas a 37°C. Substituiu-se a solução de tampão borato com um tampão acetato, sendo a solução de amostra introduzida três vezes durante 1 hora num dispositivo Slide-A-Lyzer 10000, Pierce MWCO (procedimento de diálise) contra 200 mL de tampões de NaOAc 0,1 M (pH 6,0). Por último, efectua-se a diálise de um dia para o outro contra 400 mL de tampão NaOH 0,1 M (pH 6,0) . Mistura-se a solução com 50 MBq de [47Sc]ScC13 e agita-se 55 durante 30 minutos à temperatura ambiente. Purifica-se por passagem através de uma coluna NAP-5 (Amersham Pharmacia Biotech AB, Sephadex G-25, fase móvel: PBS).

Exemplo 15

Complexo de lutécio de conjugados de anticorpos do ácido (1' R, 2R,5S)-5-({[2-({l-carboxi-5-[3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-pirrol-l-il)-propionilamino]-pentil}-carboximetil-amino)-etil]-carboximetil-amino}-metil)-1-carboximetil-pirrolidina-2-carbxílico

Dissolve-se 200 pg de um anticorpo com grupos tióis acessíveis livremente (v.g., HuM195 (ver, Michael R. McDevitt, J. Nuc. Med. 40, 1999, 1722; comercialmente disponível pela empresa Protein Design Labs Inc., Mountainview, CA, USA) - o anticorpo não possui grupos tiol acessíveis livremente, os quais podem ser produzidos por meio da utilização de 2-iminot iolano HC1 {v.g., EP 0 607 222 Bl)), em 1,2 mL de tampão borato (50 mM, pH 8,5), em conjunto com 159 pg (240 nmol) do produto do exemplo 11, dissolvido em 50 pL de tampão borato (ver antes), mistura-se e agita-se durante 3 horas a 37°C. Substituiu-se a solução de tampão borato com um tampão acetato, sendo a solução de amostra introduzida três vezes durante 1 hora num dispositivo Slide-A-Lyzer 10000, Pierce MWCO (procedimento de diálise) contra 200 mL de tampões de NaOAc 0,1 M (pH 6,0). Por último, efectua-se a diálise de um dia para o outro contra 400 mL de tampão NaOH 0,1 M (pH 6,0). Mistura-se a solução com 50 MBq de [177Lu]LuC13 e agita-se durante 30 minutos à temperatura ambiente. Purifica-se por passagem através de uma coluna NAP-5 (Amersham Pharmacia Biotech AB, Sephadex G-25, fase móvel: PBS). 56

Exemplo 16 a) Éster benzilico do ácido (S)—6—benziloxicarbonilamino—2— (2-terc-butoxicarbonilaminoacetilamino)-hexanóico A uma solução agitada de 2,15 g (12,28 mmol) de Boc-Gly-OH e 4,08 mL (29,5 mmol) de trietilamina em 50 mL de diclorometano adiciona-se 1,55 g (13,5 mmol) de N-hidroxi-succinimida. Decorridos 20 minutos, adiciona-se 5 g (12,3 mmol) de cloridrato de H-Lys-(Z)-OBzl, que tinha sido dissolvido numa pequena quantidade de diclorometano, e 2,78 g (13,5 mmol) de diciclo-hexilcarbodiimida numa pequena quantidade de diclorometano. Agita-se a solução durante três dias e verte-se sobre 250 mL de gelo fundente. Separa-se a fase orgânica. Extrai-se a fase aquosa diversas vezes com diclorometano. Lava-se as fases orgânicas combinadas com uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio, seca-se sobre sulfato de sódio e concentra-se. Purifica-se o resíduo por cromatografia em coluna (SÍO2, hexano:acetato de etilo a 4:1 —hexano: acetato de etilo a 1:1) . Obtém-se o produto desejado 16a com um rendimento de 96% (6,2 g; 11,7 mmo1). MS-FAB: 528 (M+ + 1, 75) . b) Éster benzilico do ácido (S)-6-beniloxicarbonilamino-2-(2-{2-[2-(2-terc-butoxicarbonilaminoacetylamino)-acetil-amino]-acetilamino}-acetilamino)-hexanóico A uma solução de 6,2 g (11,7 mmol) do composto 16a em 30 mL de diclorometano, a 0°C, adiciona-se gota a gota, 30 mL de ácido trifluoroacético. Agita-se a solução durante 2 57 horas à temperatura ambiente e concentra-se numa evaporadora rotativa. Adiciona-se 50 mL de água e 50 mL de tolueno e remove-se novamente numa evaporadora rotativa. Repete-se este último passo três vezes. Por último, concentra-se numa bomba de óleo.

Dissolve-se uma solução agitada do resíduo em 90 mL de diclorometano, a 0°C, com 2,37 g (18,3 mmol) de diisopropiletildiamina, 3,02 g (14,7 mmol) de diciclo-hexilcarbodiimida numa pequena quantidade de diclorometano, e adiciona-se 1,69 g (14,7 mmol) de N-hidroxi-succinimida e 3,4 g (14,7 mmol) de Boc-Gly-Gly-OH. Agita-se a suspensão durante três dias à temperatura ambiente e trata-se com 150 m de gelo fundente. Separa-se a fase orgânica. Lava-se as fases orgânicas combinadas com uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio, seca-se sobre sulfato de sódio e concentra-se. Purifica-se o resíduo por cromatografia em coluna (S1O2, acetato de etilo -> metanol: acetato de etilo a 15:85). Obtém-se o produto desejado 16b com um rendimento de 53% (4,18 g; 6,5 mmol). MS-FAB: 643 (M+ + 1, 56) c) Ácido (S)-2-{2-[2-(2-terc-butoxicarbonilamino-acetil-amino)-acetilamino]-acetilamino}-6-[3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-pirrol-l-il)-propionilamino]-hexanóico A uma solução de 4,18 g (6,5 mmol) do composto 16b em 40 mL de isopropanol adiciona-se 1 g de Pd/C (a 10%) . A atmosfera sobre a solução agitada estava saturada com hidrogénio. Agita-se a solução de reacção durante 90 minutos, filtra-se e concentra-se.

Trata-se o resíduo a 0°C com 20 ml de DMF e adiciona-se 1,5 g (12 mmol) de diisopropiletilamina e 2,4 mg (9 58 mmol) de éster 2,5-dioxo-pirrolidina-l-ílico do ácido 3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-pirrol-l-il)-propiónico (Aldrich). Agita-se a solução de reacção durante 4 horas à temperatura ambiente. Adiciona-se a solução a uma solução de HC1 (pH 4) e extrai-se diversas vezes com acetato de etilo. Lava-se as fases orgânicas combinadas com uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio, seca-se sobre sulfato de sódio e concentra-se. Purifica-se o resíduo por cromatografia em coluna (S1O2, acetato de etilo -> metanol: acetato de etilo a 20:80). Obtém-se o produto desejado 16c com um rendimento de 67% (2,5 g; 4,4 mmol). MS-FAB: 570 (M+ + 1, 31).

d) (IS,1'S,4S)-1-[4—{3—[({[({l-Carboxi-5-[3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-pirrol-l-il)-propionilamino]-pentilcarbamoil}-metil)-carbamoil]-metil}-carbamoíl)-metil]-tioureído}]-benzil-4-metil-DTPA A uma solução agitada de 570 mg (1 mmol) do composto 16c em 5 mL de diclorometano, a 0°C, adiciona-se, gota a gota, 5 mL de ácido trifluoroacético. Agita-se a solução durante 2 horas à temperatura ambiente e concentra-se numa evaporadora rotativa. Agita-se o resíduo com éter dietílico. Por último, concentra-se numa bomba de óleo.

Retoma-se o resíduo em DMF com ~ 200 mg (~2 mmol) de trietilamina e adiciona-se 505 mg (0,9 mmol) do composto 5. Agita-se a solução durante 3 horas a 40°C e adiciona-se, gota a gota, a éter dietílico vigorosamente agitado. Remove-se por filtração o precipitado e submete-se a cromatografia em coluna RP. MS-FAB: 1016 (M+ + 1, 31) 59

Exemplo 17

Complexo de gadolínio de ácido (S, S)-[(1-(4-amino-benzil)-2-{[2-(bis-carboximetil-amino)-propil]-carboximetil-amino}-etil)-carboximetil-amino]-acético

Coloca-se em suspensão 128,1 mg (0,25 mmol) do composto 3 em 4 mL de água destilada, aquece-se até 80°C e transforma-se em solução. A esta solução adiciona-se progressivamente 45,3 mg (0,125 mmol) de Gd203 . Aquece-se a suspensão até 80°C e agita-se durante uma hora. Arrefece-se a solução até à temperatura ambiente e ajusta-se o valor de pH com uma solução de hidróxido de sódio (1 M) até pH = 7. Remove-se a água por congelamento. Obtém-se o produto desejado, 166,6 mg (0,25 mmol, 99,8%). MS-FAB (M+ + 1, 21) : 668

Exemplo 18

Conjugado de anticorpo de (IS,1'S,4S)-1-[4—{3—[({[({1-carboxi-5-[3-(2,5-dioxo2,5-di-hidro-pirrol-l-il)-propionilamino]-pentilcarbamoíl}-metil)-carbamoil]-metil}-carbamoíl)-metil]-tioureido}]-benzil-4-metil-DTPA

Dissolve-se 200 pg de um anticorpo com grupos tióis acessíveis livremente (v.g., HuM195 (ver, Michael R. McDevitt, J. Nuc. Med. 40, 1999, 1722; comercialmente disponível pela empresa Protein Design Labs Inc., Mountainview, CA, USA) - o anticorpo não possui grupos tiol acessíveis livremente, os quais podem ser produzidos por meio da utilização de 2-iminotiolano HC1 (v.g., EP 0 607 222 Bl)), em 1,2 mL de tampão borato (50 mM, pH 8,5), em conjunto com 243 pg (240 nmol) do produto do exemplo 16d, 60 dissolvido em 50 pL de tampão borato (ver antes) , mistura-se e agita-se durante 3 horas a 37°C. Purifica-se por passagem através de uma coluna NAP-5 (Amersham Pharmacia Biotech AB, Sephadex G-25, fase móvel: PBS).

Exemplo 19

Complexo de itrio dos conjugados de anticorpos de (1S,1'S,4S)—1—[4—{3—[({[({l-carboxi-5-[3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-pirrol-l-il)-propionilamino]-pentilcarbamoíl}-metil)-carbamoil]-metil}-carbamoíl)-metil]-tioureido}]-benzil-4-metil-DTPA

Dissolve-se 200 pg de um anticorpo com grupos tióis acessíveis livremente (v.g., HuM195 (ver, Michael R. McDevitt, J. Nuc. Med. 40, 1999, 1722; comercialmente disponível pela empresa Protein Design Labs Inc., Mountainview, CA, USA) - o anticorpo não possui grupos tiol acessíveis livremente, os quais podem ser produzidos por meio da utilização de 2-iminotiolano HC1 (v.g., EP 0 607 222 Bl)), em 1,2 mL de tampão borato (50 mM, pH 8,5), em conjunto com 243 pg (240 nmol) do produto do exemplo 16d, dissolvido em 50 pL de tampão borato (ver antes), mistura-se e agita-se durante 3 horas a 37°C. Substituiu-se a solução de tampão borato com um tampão acetato, sendo a solução de amostra introduzida três vezes durante 1 hora num dispositivo Slide-A-Lyzer 10000, Pierce MWCO (procedimento de diálise) contra 200 mL de tampões de NaOAc 0,1 M (pH 6,0). Por último, efectua-se a diálise de um dia para o outro contra 400 mL de tampão NaOH 0,1 M (pH 6,0). Mistura-se a solução com 50 MBq de [90Y]YC13 e agita-se durante 30 minutos à temperatura ambiente. Purifica-se por 61 passagem através de uma coluna NAP-5 (Amersham Pharmacia Biotech AB, Sephadex G-25, fase móvel: PBS).

Exemplo 20

Complexo de escândio dos conjugados de anticorpos de (IS,1'S,4S)-1—[4—{3—[({[({l-carboxi-5-[3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-pirrol-l-il)-propionilamino]-pentilcarbamoil}-metil)-carbamoil]-metil}-carbamoíl)-metil]-tioureído}]-benzil-4-metil-DTPA

Dissolve-se 200 pg de um anticorpo com grupos tióis acessíveis livremente {v.g., HuM195 (ver, Michael R. McDevitt, J. Nuc. Med. 40, 1999, 1722; comercialmente disponível pela empresa Protein Design Labs Inc., Mountainview, CA, USA) - o anticorpo não possui grupos tiol acessíveis livremente, os quais podem ser produzidos por meio da utilização de 2-iminotiolano HC1 (v.g., EP 0 607 222 Bl)), em 1,2 mL de tampão borato (50 mM, pH 8,5), em conjunto com 243 pg (240 nmol) do produto do exemplo 16d, dissolvido em 50 pL de tampão borato (ver antes), mistura-se e agita-se durante 3 horas a 37°C. Substituiu-se a solução de tampão borato com um tampão acetato, sendo a solução de amostra introduzida três vezes durante 1 hora num dispositivo Slide-A-Lyzer 10000, Pierce MWCO (procedimento de diálise) contra 200 mL de tampões de NaOAc 0,1 M (pH 6,0). Por último, efectua-se a diálise de um dia para o outro contra 400 mL de tampão NaOH 0,1 M (pH 6,0). Mistura-se a solução com 50 MBq de [47Sc]ScC13 e agita-se durante 30 minutos à temperatura ambiente. Purifica-se por passagem através de uma coluna NAP-5 (Amersham Pharmacia Biotech AB, Sephadex G-25, fase móvel: PBS). 62

Exemplo 21

Complexo de lutécio dos conjugados de anticorpos de

(IS,1'S,4S)-1—[4—{3—[({[({l-carboxi-5-[3- (2,5-dioxo-2,5-di-hidro-pirrol-l-il)-propionilamino]-pentilcarbamoíl}-metil)-carbamoil]-metil}-carbamoíl)-metil]-tioureido}]-benzil-4-metil-DTPA

Dissolve-se 200 pg de um anticorpo com grupos tióis acessíveis livremente (v.g., HuM195 (ver, Michael R. McDevitt, J. Nuc. Med. 40, 1999, 1722; comercialmente disponível pela empresa Protein Design Labs Inc. , Mountainview, CA, USA) - o anticorpo não possui grupos tiol acessíveis livremente, os quais podem ser produzidos por meio da utilização de 2-iminot iolano HC1 (v.g., EP 0 607 222 Bl)), em 1,2 mL de tampão borato (50 mM, pH 8,5), em conjunto com 243 pg (240 nmol) do produto do exemplo 16d, dissolvido em 50 pL de tampão borato (ver antes), mistura-se e agita-se durante 3 horas a 37°C. Substituiu-se a solução de tampão borato com um tampão acetato, sendo a solução de amostra introduzida três vezes durante 1 hora num dispositivo Slide-A-Lyzer 10000, Pierce MWCO (procedimento de diálise) contra 200 mL de tampões de NaOAc 0,1 M (pH 6,0). Por último, efectua-se a diálise de um dia para o outro contra 400 mL de tampão NaOH 0,1 M (pH 6,0). Mistura-se a solução com 50 MBq de [177Lu]LuCl3 e agita-se durante 30 minutos à temperatura ambiente. Purifica-se por passagem através de uma coluna NAP-5 (Amersham Pharmacia Biotech AB, Sephadex G-25, fase móvel: PBS). 63

Exemplo 22 Ácido (R,R)-{[2—{[2-(bis-carboximetil-amino)-propil]-carboxi-metil-amino}-l-(4-nitro-benzil)-etil]-carboximetil-amino}-acético A síntese do exemplo 22 é efectuada de um modo análogo à do exemplo 1, com a diferença de se ter utilizado (R)-2-amino-l-propanol em vez de (S), e também de se ter utilizado ácido (R)-2-terc-butoxicarbonilamino-3-(4-nitro-fenil)-propiónico em vez de (S) como bloco de construção. Obtém-se o produto desejado 22 com uma pureza elevada (>96%, RP-HPLC). MS-FAB: 513 (M+ + 1, 42)

Exemplo 23 Ácido (R,R))-[(1-(4-amino-benzil)-2-{[2-(bis-carboximetil-amino) -propil]-carboximetil-amino}-etil)-carboximetil-amino]-acético A síntese do exemplo 23 é efectuada de um modo análogo à do método A do exemplo 3, com a diferença de se ter utilizado como material de partida o composto 22 em vez do composto lh. Obtém-se o produto desejado 23 com um rendimento de 96%. MS-FAB: 513 (M+ + 1, 42)

Exemplo 24 Éster terc-butilico do ácido (R,R))-{[2-(4-amino-fenil)-1-({[2-(bis-terc-butoxicarbonilmetil-amino)-propil]-terc- 64 butoxicarbonilmetil-amino}-metil)-etil]-terc-butoxi-carbonilmetil-amino}-acético A síntese do exemplo 24 é efectuada de um modo análogo à do exemplo 2, com a diferença de se ter utilizado como reagente o intermediário correspondente em vez do composto 1 g, proveniente da síntese do composto 22. Obtém-se o produto desejado 24 com um rendimento de 86%. MS-FAB: 794 (M+ + 1, 53).

Exemplo 25 Ácido (R,R)-[(1-(4-isotiocianato-benzil)-2-{[2-(bis-carboxi- metil-amino)-propil]-carboximetil-amino}-etil)-carboxi-metil-amino]-acético A síntese do exemplo 25 é efectuada de um modo análogo à do exemplo 5, com a diferença de se ter utilizado como reagente o composto 23 em vez do composto 3. Obtém-se o produto desejado 25 com um rendimento de 74%. MS-FAB: 555 (M+ + 1, 33).

Exemplo 2 6 Ácido (R,R)-({2-{[2-(bis-carboximetil-amino)-propil]-carboxi-metil-amino}-1-[4-(2-bromo-acetilamino)-benzil]-etil}-carboximetil-amino)-acético A síntese do exemplo 26 é efectuada de um modo análogo à do exemplo 6, com a diferença de se ter utilizado como reagente o composto 23 em vez do composto 3. Obtém-se o produto desejado 23 com um rendimento de 71%. MS-FAB: 590 (M+ + 1, 48)

Exemplo 27 65 a) Ácido N-[4-(2-(bis-carboximetil-amino)-3-{[2-(bis-carboximetil-amino)-propil]-carboximetil-amino}-propil)-fenil]-succinaminico A uma solução de 793 mg (1 mmol) do composto 24 e 0,28 ml (~2 mmol) de diisopropiletilamina em 20 mL de THF adiciona-se 200 mg (2 mmol) de anidrido succínico. Agita-se a solução durante 2 horas à temperatura ambiente. Concentra-se a solução até um terço do seu volume, dilui-se com diclorometano e adiciona-se uma solução aquosa (pH = 4,5). Separa-se a fase aquosa e extrai-se diversas vezes com diclorometano. Lava-se as fases orgânicas combinadas com uma solução de cloreto de sódio. Seca-se sobre sulfato de sódio e concentra-se numa evaporadora rotativa.

Purifica-se o resíduo por cromatografia em coluna (CH2CI2 -MeOH). Obtém-se o produto desejado 27a com um rendimento de 85% (0,85 mmol). MS-FAB: 613 (M+ + 1, 58) .

b) (IR, 1'S,4R)—1—[4—(3—{[({[({l-carboxi-5-[3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-pirrol-l-il)-propionilamino]-pentilcarbamoíl}-metil)-carbamoíl]-metilj-carbamoil)-metil]-carbamoíl}-propionil)]-benzil-4-metil-DTPA A uma solução agitada de 570 mg (1 mmol) do composto 16c em 5 mL de diclorometano, a 0°C, adiciona-se, gota a gota, 5 mL de ácido trifluoroacético. Agita-se a solução durante 2 horas à temperatura ambiente e concentra-se numa evaporadora rotativa. Agita-se 0 resíduo com éter dietílico. Por último, concentra-se numa bomba de óleo. Coloca-se em suspensão 0 resíduo em diclorometano e adiciona-se 0,25 g (~2 mmol) de base de Hunig, 304 mg (2 mmol) de 1 -hidroxibenzotriazol - H2O (HOBT) e 122 mg (2 66 mmol) do composto 27a. Arrefece-se a solução até 0°C e trata-se com 419 mg (21 mmol) de 1-(dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDCI). Agita-se a solução durante 12 horas e verte-se sobre gelo fundente. Separa-se a fase aquosa e extrai-se diversas vezes com diclorometano. Lava-se as fases orgânicas combinadas com uma solução de cloreto de sódio. Seca-se sobre sulfato de sódio e concentra-se numa evaporadora rotativa. Purifica-se o resíduo por cromatografia em coluna (CH2CI2 - acetonitrilo). Obtém-se o produto desejado com um rendimento de 85% (0,85 mmol), o qual se retoma em 5 mL de diclorometano e se adiciona 3 mL de anisol e 5 mL ácido trifluoroacético, a 0°C. Agita-se a solução durante 8 horas, concentra-se e agita-se com éter dietílico. Obtém-se o produto desejado 27b com um rendimento de 90% (813,9 mg). MS-FAB: 1064 (M+ + 1, 38) .

Exemplo 28

Conjugado de anticorpo de (IR,1'S,4R)-1-[4-(3-{[({[({1-carboxi-5-[3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-pirrol-l-il)-propionilamino]-pentilcarbamoíl}-metil)-carbamoíl]-metil}-carbamoíl)-metil]-carbamoíl}-propionil)]-benzil-4-metil-DTPA

Dissolve-se 200 pg de um anticorpo com grupos tióis acessíveis livremente (v.g., HuM195 (ver, Michael R. McDevitt, J. Nuc. Med. 40, 1999, 1722; comercialmente disponível pela empresa Protein Design Labs Inc., Mountainview, CA, USA) - o anticorpo não possui grupos tiol acessíveis livremente, os quais podem ser produzidos por meio da utilização de 2-iminot iolano HC1 (v.g., EP 0 607 222 Bl)), em 1,2 mL de tampão borato (50 mM, pH 8,5), em 67 conjunto com 255 pg (240 nmol) do produto do exemplo 27b, dissolvido em 50 pL de tampão borato (ver antes), mistura-se e agita-se durante 3 horas a 37°C. Purifica-se por passagem através de uma coluna NAP-5 (Amersham Pharmacia Biotech AB, Sephadex G-25, fase móvel: PBS).

Exemplo 29

Complexo de itrio de conjugados de anticorpos de (IR,1'S,4R)—1—[4—(3—{[({[({l-carboxi-5-[3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-pirrol-l-il)-propionilamino]-pentilcarbamoíl}-metil)-carbamoíl]-metil}-carbamoíl)-metil]-carbamoíl}-propionil)]-benzil-4-metil-DTPA

Dissolve-se 200 pg de um anticorpo com grupos tióis acessíveis livremente (v.g., HuM195 (ver, Michael R. McDevitt, J. Nuc. Med. 40, 1999, 1722; comercialmente disponível pela empresa Protein Design Labs Inc. , Mountainview, CA, USA) - o anticorpo não possui grupos tiol acessíveis livremente, os quais podem ser produzidos por meio da utilização de 2-iminot iolano HC1 (v.g., EP 0 607 222 Bl)), em 1,2 mL de tampão borato (50 mM, pH 8,5), em conjunto com 255 pg (240 nmol) do produto do exemplo 16d, dissolvido em 50 pL de tampão borato (ver antes), mistura-se e agita-se durante 3 horas a 37°C. Substituiu-se a solução de tampão borato com um tampão acetato, sendo a solução de amostra introduzida três vezes durante 1 hora num dispositivo Slide-A-Lyzer 10000, Pierce MWCO (procedimento de diálise) contra 200 mL de tampões de NaOAc 0, 1 M (pH 6,0). Por último, efectua-se a diálise de um dia para o outro contra 400 mL de tampão NaOH 0,1 M (pH 6,0). Mistura-se a solução com 50 MBq de [90Y]YC13 e agita-se durante 30 minutos à temperatura ambiente. Purifica-se por 68 passagem através de uma coluna NAP-5 (Amersham Pharmacia Biotech AB, Sephadex G-25, fase móvel: PBS).

Exemplo 30

Complexo de lutécio de conjugados de anticorpos de (IR,1'S,4R)—1—[4—(3—{[({[({l-carboxi-5-[3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-pirrol-l-il)-propionilamino]-pentilcarbamoil}-metil)-carbamoil]-metil}-carbamoil)-metil]-carbamoil}-propionil)]-benzil-4-metil-DTPA

Dissolve-se 200 pg de um anticorpo com grupos tióis acessíveis livremente (v.g., HuM195 (ver, Michael R. McDevitt, J. Nuc. Med. 40, 1999, 1722; comercialmente disponível pela empresa Protein Design Labs Inc., Mountainview, CA, USA) - o anticorpo não possui grupos tiol acessíveis livremente, os quais podem ser produzidos por meio da utilização de 2-iminotiolano HC1 (v.g., EP 0 607 222 Bl)), em 1,2 mL de tampão borato (50 mM, pH 8,5), em conjunto com 255 pg (240 nmol) do produto do exemplo 16d, dissolvido em 50 pL de tampão borato (ver antes), mistura-se e agita-se durante 3 horas a 37°C. Substituiu-se a solução de tampão borato com um tampão acetato, sendo a solução de amostra introduzida três vezes durante 1 hora num dispositivo Slide-A-Lyzer 10000, Pierce MWCO (procedimento de diálise) contra 200 mL de tampões de NaOAc 0, 1 M (pH 6,0) . Por último, efectua-se a diálise de um dia para o outro contra 400 mL de tampão NaOH 0,1 M (pH 6,0). Mistura-se a solução com 50 MBq de [177Lu]LuC13 e agita-se durante 30 minutos à temperatura ambiente. Purifica-se por 69 passagem através de uma coluna NAP-5 (Amersham Pharmacia Biotech AB, Sephadex G-25, fase móvel: PBS).

Exemplo 31

Complexo de escândio de conjugados de anticorpos de (IR, 1'S,4R) -1-[4-(3—{[([({l-carboxi-5-[3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-pirrol-l-il)-propionilamino]-pentilcarbamoíl}-metil)-carbamoíl]-metil}-carbamoí1)-metil]-carbarmoíl}-propionil)]-benzil-4-metil-DTPA

Dissolve-se 200 pg de um anticorpo com grupos tióis acessíveis livremente (v.g., HuM195 (ver, Michael R. McDevitt, J. Nuc. Med. 40, 1999, 1722; comercialmente disponível pela empresa Protein Design Labs Inc., Mountainview, CA, USA) - o anticorpo não possui grupos tiol acessíveis livremente, os quais podem ser produzidos por meio da utilização de 2-iminot iolano HC1 (v.g., EP 0 607 222 Bl)), em 1,2 mL de tampão borato (50 mM, pH 8,5), em conjunto com 255 pg (240 nmol) do produto do exemplo 16d, dissolvido em 50 pL de tampão borato (ver antes), mistura-se e agita-se durante 3 horas a 37°C. Substituiu-se a solução de tampão borato com um tampão acetato, sendo a solução de amostra introduzida três vezes durante 1 hora num dispositivo Slide-A-Lyzer 10000, Pierce MWCO (procedimento de diálise) contra 200 mL de tampões de NaOAc 0,1 M (pH 6,0). Por último, efectua-se a diálise de um dia para o outro contra 400 mL de tampão NaOH 0,1 M (pH 6,0). Mistura-se a solução com 50 MBq de [47Sc]ScC13 e agita-se durante 30 minutos à temperatura ambiente. Purifica-se por 70 passagem através de uma coluna NAP-5 (Amersham Pharmacia Biotech AB, Sephadex G-25, fase móvel: PBS). 71

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pela requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o EPO não assume nenhuma responsabilidade.

Patentes de invenção citadas na descrição • EP 0071564 A [0005] • WO 9712850 A [0006] • WO 8801618 A [0009] • WO 0141743 A [0010] • WO 9623526 A [0035] • WO 0108712 A [0035] • EP 484984 A [0053] • US 4622420 A [0053] • US 4680338 A [0054] • WO 9515335 A [0054] • US 5273743 A [0054] • EP 446071 A [0054] • EP 345723 A [0054] • EP 71564 A [0055] • EP 130934 A [0055] • DE OS3401052 A [0055] • EP 0607222 BI [0104] [0106] [0107] [0108] [0109] [0115] [0116] [0117] [0118] [0126] [0127] [0128] [0129] 72

Literatura citada na descrição, para além das patentes de invenção • Câncer, 15. Februar2002, vol. 94 (4), 1349-57 [0003] • A Convenient Synthesis of Bifunctional Chelating Agents Based on Dietilenetriaminepentaacetic Acid and Their Coordination Chemistry with Yttrium. Bíonconjugate Chemistry, 1991, 180-186 [0009] • BRECHBIEL et al. Synthesis of (1-(p-isothiocyanatobenzil) derivatives of DTPA and EDTA. Antibody Labeling and Tumor-Imaging Studies. lnorg. Chern., 1986, vol. 25, 2772-2781 [0009] • MCMURRY et al. J. Med. Chern., 1998, vol. 41,3546-3549 [0011] • J. Med. Chern., 1998, vol. 41, 3546-3549 [0014] • M. ; A. BODANSZKY. The Practice of Peptide Synthesis. Springerverlag, 1984 [0022] • Chemie der Biomolekule. H. BERTHOLD et al. Chemie der Biomolekule. lnstitut fur Organische Chemie, 2001 [0032] • T. W. GREENE; P. G. M. WUTZ. Protective Groups in Organic Synthesis. John Wiley & Sons, Inc, 1991 [0042] • J. Amer. Chern. Soc., 1990, 9608 [0046] • Oxalylchlorid: J. Org. Chern., 1964, vol. 29, 843 [0048] • Thionylchlorid: Helv., 1959, vol. 42, 1653 [0048] • Carbodiimide. Helv., 1963, vol. 46, 1550 [0048] • Carbodiimide/Hydroxysuccinimid: J. Am. Chern. Soc., 1964, vol. 86, 1839 [0048] • J. Org. Chern., 1988, vol. 53, 3583 [0048] • Synthesis, 1972, 453 [0048] • Anhydridmethode:, 2-Ethoxy-l-ethoxycarbonil-l,2- dihydrochinolin. J. Am. Chern. Soc., 1986, vol. 90, 1651 [0048] 73 • Int. J. Pept. Prot. Res., 1985, vol. 26, 493 [0048] • Am. Soc., 1951, vol. 73, 3547 [0048] • lmidazolid-Methode: Am. Soc., 1969, vol. 91, 2691 [0048] • J. Med. Chern., 1996, 392596 [0048] • Tetrahedron Letters, 1994, vol. 35, 5981 [0048] • Bioorg. Med. Letters, 1996, vol. 6, 55 [0048] • J. Chern. Soc. Commun., 1994, 201 [0048] • H.—J. WEINMANN et al. Am. J. of Roentgenology, 1984, vol. 142, 619 [0065] • Radiotracers for Medicai Applications. CRC-Press, 1983 [0067] • Eur. J. Nucl. Med., 1990, vol. 17, 346-364 [0067] • Chern. Rev., 1993, vol. 93, 1137-1156 [0067] • HEISS, W.O.; PHELPS, M.E. Positron Emission Tomography of Brain. Springer Verlag, 1983 [0069] • VON R. L. MILLS et al. Nature, 1988, vol. 336, 787 [0073] • R. W. KOZAK et al. TIBTEC, Oktober 1986, 262 [0076] • Bioconjugate Chern., 2001, vol. 12, 7-34 [0076] • Anlehnung an Tetrahedron Lett, 1997, vol. 38 (46), 8089- 8092 [0103] • MICHAEL R. MCDEVITT. J. Nuc. Med., 1999, vol. 40, 1722 [0104] [0106] [0108] [0109] [0115] [0116] [0117] [0118] [0126] [0127] [0128] [0129]

Claims (14)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Conjugados de fórmulas estruturais Vila e Vllb í 7 í i r MM-, ? 1 1 V--·· \ . 1 1 v í k. V Ml x a 1 ^ N A E A'" k f \ Si t Z f T fU \ 7 { z Vlia em que o símbolo Z representa um átomo de hidrogénio ou um equivalente de ião metálico de um elemento com um número atómico 21-29, 31, 32, 37-39, 42-44, 46, 47, 49, 58-71, 75, 77, 82 ou 83, o símbolo A representa um grupo -COO-, o símbolo R representa uma biomolécula ligada através de um grupo funcional ou um radical alquilo (C1-C25) , de cadeia linear ou ramificada, saturado ou insaturado, o qual é facultativamente interrompido com um a seis átomos de 0, ou grupos fenileno, -NHC0-, -CONH-,

e/ou -NH-(C=S)-NH e é facultativamente substituído em qualquer posição por um a seis grupos carboxilo, grupos hidroxilo, grupos amino ou outros grupos funcionais, pelos quais as biomoléculas podem ser ligadas e seus sais com 2 bases orgânicas ou inorgânicas, desde que o radical alquilo possua, pelo menos, uma biomolécula ligada por meio de um grupo funcional e que, pelo menos, dois simbolos Z representem um equivalente de ião metálico.

2. Conjugados de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos dois dos radicais Z representam um equivalente de ião metálico de um elemento paramagnético de números atómicos 21-29, 42, 44 e 58-70.

3. Conjugados de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos dois dos radicais Z representam um equivalente de ião metálico de um elemento radioactivo de números atómicos 26, 27, 29, 31, 32, 37-39, 43, 46, 47, 49, 61, 62, 64, 70, 71, 75, 77, 82 e 83. em que o

4. Conjugados de acordo com a reivindicação 1, símbolo R representa um radical 3

.tf·A V0H % 'OH / OH / /x \ * X '-aA AA mu X^COOH '^s^COOH A ,-'-χχΌΟΟΗ V”A * % XX^-COOH Oh / OH OH ÇH £ A λ , f νΛ/·^ ^ y :00H V/\A JN % ^ ] /'χ/Α' í OH 5H OH OH V' X0H Α'·'-'"·''' *r V-'-*"xOrt ./v ΑΆ^νηϊ 1 % í \ / / / ^x. ,νΝΗ-. %Λ 5 / , #Ύ VOH /- J # ' ( " ^ '"'ccx :>h è-OOH 00 OH 1 OOOH H Q 9 n ~ 'vv/!i'/Nã 0 1 \ jy / 1- VAa pelo qual se liga uma biomolécula,

5. Conjugados de acordo com a reivindicação 1, em que o símbolo R representa um radical T X % ,Avi! \,^x a ,A, ,S.A A > V x v·' '"s Vi^X o v v x, % * V' ν·····Η?:!%. 4 4

Μ4 1 *, <5" 'ΝΑΑΑ'ν'£ΟΟΗ 1 .1 AVAA ^ ··*- - UJ ^V^CCSOH α ‘VA V·""1 Sl M T Nil, 1 > W*'*^ \ .VV AA X Ά * t> Ϊ; ^ CX + VA VA 'AVA^ —A k 5.¾ ^ 0 η il s 0 coo» A 0 A h & Is I 0 v, 0H .QK N. J v il * ^ ;···γ···''''^..-··"·'''·ν.'''?"·'·· 1 !'Λ 0 COOK 0 ΑΆ rt·' >ί·χ» 1 1Ax. A 'íi' K 15 Sj H O v-->\ .X, ^ * •i '. > SÍN*

V 5 pelo qual se liga uma biomolécula.

6. Conjugados de acordo com a reivindicação 1, em que o símbolo R representa um grupo funcional carboxilo, carboxilo activado, amino, nitro, isocianato, isotiocianato, hidrazina, semicarbazida, tio-semicarbazida, cloroacetamida, bromoacetamida, iodoacetamida, acrílico, acilamino, anidridos mistos, azida, cloreto de ácido, brometo de ácido, hidróxido, cloreto de sulfonilo, vinil-sulfona, carbodiimida, maleimida ou diazo, pelo qual se liga a biomolécula.

7. Compostos de acordo com a reivindicação 6, em que o grupo carboxilo activado é seleccionado entre

e

8. Conjugados de acordo com a reivindicação 1, em que a biomolécula é seleccionada entre o conjunto constituído por biopolímeros, proteínas, tais como proteínas que possuem uma função biológica, HSA, BSA, etc., proteínas e péptidos que se acumulem em áreas específicas no organismo (v.g., em 6 receptores, membranas celulares, duetos, etc.), péptidos cliváveis por proteases, péptidos com pontos de quebra sintéticos pré-determinados {v.g., ésteres lábeis, amidas, etc.), péptidos que possam ser cliváveis por metalo-proteases, péptidos com ligadores fotocliváveis, péptidos com grupos que possam ser clivados por agentes oxidativos (oxidases), péptidos com aminoácidos naturais e não naturais, glicoproteinas (glicopéptidos) , proteínas de sinal, proteínas antivirais e apoctose, biopolímeros sinteticamente modificados, tais como biopolímeros transformados com ligadores, metaloproteases modificadas e oxidases transformadas, etc., hidratos de carbono (mono- a poli-sacáridos), tais como açúcares transformados, açúcares cliváveis no organismo, ciclodextrinas e seus derivados, amino-açúcares, quitosano, poli-sulfatos e derivados de ácido acetilneuramínico, anticorpos, tais como anticorpos monoclonais, fragmentos de anticorpo, anticorpos policlonais, minicorpos, cadeias individuais (incluindo as ligadas por ligadores a múltiplos fragmentos) , glóbulos vermelhos sanguíneos e outros componentes sanguíneos, marcadores de cancro (v.g., CAA) e substâncias de adesão a células (v.g., derivados de Lewis X e de anti-Lewis X) , fragmentos de ADN e de ARN, tais como ADN e ARN transformados (v.g., os encontrados pelo método SELEX), ADN e ARN sintéticos (também com bases não naturais), APN (Hoechst) e anti-sense, β-aminoácidos (Seebach), aminas vector para infiltração em células, aminas biogénicas, produtos farmacêuticos, preparações oncológicas, polímeros sintéticos dirigidos a alvos biológicos (v.g, receptores), esteróides (naturais e modificados), prostaglandinas, taxol e seus derivados, endotelinas, alcaloides, ácido fólico e 7 seus derivados, lípidos bioactivos, gorduras, ésteres de ácidos gordos, mono-, di- e tri-glicéridos sinteticamente modificados, lipossomas transformados sobre a superfície, micelas provenientes de ácidos gordos naturais ou provenientes de compostos de perfluoroalquilo, porfirinas, texafirinas, porfirinas expandidas, citocromos, inibidores, neuramidases, neuropéptidos, imunomodulatores, tais como FK 506, CAPE e gliotoxina, endoglicosidases, substratos que são activados por enzimas, tais como calmodulina-cinase, caseína-cinase II, glutationa-S-transferase, heparinase, metaloproteases de matriz, β-insulina-receptor-cinase, UDP-galactose 4-epimerase, fucosidases, G-proteínas, galactosidases, glicosidases, glicosiltransferases e xilosidases, antibióticos, vitamina e análogos de vitamina, hormonas, intercaladores de ADN, nucleósidos, nucleótidos, lectinas, vitamina B12, Lewis X e substâncias associadas, psoralenos, antibióticos dieno-trieno, carbaciclinas, VEGF (factor de crescimento endotelial vascular) , somatostatina e seus derivados, derivados de biotina, anti-hormonas, proteínas específicas de tumor e sintéticos, polímeros que se acumulam em áreas acídicas ou básicas do corpo (distribuição controlada pelo pH) , mioglobinas, apomioglobinas, etc., péptidos neurotransmissores, factores de necrose tumoral, péptidos que se acumulam em tecidos inflamados, reagentes do conjunto sanguíneo, proteínas transportadoras de aniões e catiões, poliésteres (v.g., de ácido láctico), poliamidas e polifosfatos.

9. Método para a preparação de conjugados de fórmulas estruturais Vila e Vllb, de acordo com a reivindicação 1, 8 .., , _ . , ^ j v- os compostos de caracterizado pelo facto de se fazer reagi1 w ^ fórmulas estruturais VII'a e VII'b

Vir 3 w ^ em que o símbolo Z' possui as significações definidas para o símbolo Z ou representa um grupo protector de carboxilo, o símbolo R' representa um grupo funcional e o símbolo A representa um grupo -COO-, de um modo conhecido per se com uma biomolécula, facultativamente após a clivagem dos grupos protectores de carboxilo, e depois (facultativamente após clivagem dos grupos protectores de carboxilo) se fazer reagir os ácidos assim obtidos, pelo menos, com um óxido metálico ou sal metálico de um elemento com números atómicos 21-29, 31, 32, 37-39, 42-44, 46, 47, 49, 58-71, 75, 77, 82 ou 83 e depois, se desejado, converter os átomos de hidrogénio acídicos presentes com ácidos orgânicos ou aminoácidos em sais fisiologicamente compatíveis.

10. Estojo para a produção de radiofármacos, o qual compreende um conjugado de acordo com a reivindicação 1, em que o símbolo Z representa um átomo de hidrogénio, e um composto de um elemento radioactivo de números atómicos 26, 27, 29, 31, 32, 37-39, 43, 46, 61, 62, 64, 67, 70, 71, 75, 77, 82 e 83. 9

11. Agentes farmacêuticos que contêm, pelo menos, um composto fisiologicamente compatível de acordo com a reivindicação 2.

12. Agentes farmacêuticos que contêm, pelo menos, um composto fisiologicamente compatível de acordo com a reivindicação 3.

13. Utilização de um composto de acordo com a reivindicação 2 para a produção de agentes para diagnóstico por NMR.

14. Utilização de um composto de acordo com a reivindicação 3 para a produção de agentes para radiodiagnósticos ou radioterapia.