PT1499312E

PT1499312E - Utilização de derivados de hidroxipiridona na cicatrização de feridas

Info

Publication number: PT1499312E
Application number: PT03718739T
Authority: PT
Inventors: Manfred Bohn; Karl Theodor Kraemer; Roland H Wenger
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland
Priority date: 2002-04-20
Filing date: 2003-04-08
Publication date: 2007-05-31
Also published as: MXPA04009186A; BR0309403A; JP4709489B2; SI1499312T1; CA2482972C; ES2282615T3; CA2482972A1; JP2005529875A; AU2003222802A1; EP1499312B1; US20040014794A1; ATE357915T1; DK1499312T3; EP1499312A1; IL164536A; CY1106472T1; IL164536A0; EP1354586A1; AU2003222802B2; WO2003088966A1

Description

DESCRIÇÃO

"UTILIZAÇÃO DE DERIVADOS DE HIDROXIPIRIDONA NA CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS" A presente invenção refere-se à utilização de compostos da fórmula I, R 2

OH na qual R1; R2; R3 e R4 têm os significados indicados a seguir, na cicatrização de feridas, em que as feridas são definidas de acordo com a reivindicação 1.

Os compostos de fórmula I, tal como o sal 2-aminoetanol de 6-ciclo-hexil-l-hidroxi-4-metil-2(1H)-piridona, também conhecido como ciclopiroxolamina (CPX) são agentes antifúngicos comuns, utilizados para tratar micoses da pele e unhas há mais de 20 anos. Além da sua actividade antimicótica, a CPX também é eficaz contra bactérias gram-positivas e gram-negativas (Dittmar, W. et ai. (1981) Microbiological laboratory studies with ciclopiroxolamine. Arzneimittelforschung 31, 1317-1322). A CPX é aplicada como um creme ou gel a 1% para tratar dermatomicoses e como um verniz para unhas a 8% para tratar onicomicoses. A CPX é conhecida por inibir várias actividades enzimáticas fúngicas em microrganismos, incluindo o transporte 1 transmembranar de aminoácidos, potássio e fosfato. No entanto, o mecanismo molecular geral da actividade antimicrobiana de CPX não é totalmente conhecido.

Em estudos referentes a efeitos cutâneos de uma solução de CPX a 1%, aplicada em pele de coelho durante 20 dias, foi ocasionalmente observado vermelhidão passageira de pele sã e vermelhidão persistente de pele experimentalmente ferida (Alpermann, H. G., e Schutz, E. (1981) Studies on the pharmacology and toxicology of ciclopiroxolamine.

Arzneimittelforschung 31, 1328-1332) . A vermelhidão passageira ocasional de pele sã foi explicada como sendo uma reacção secundária de CPX. O documento WO 9937300 descreve preparações em pó contendo hidroxipiridonas para tratar úlceras da perna. A angiogénese terapêutica por factores de crescimento angiogénicos recombinantes ou por terapia génica tornou-se uma modalidade de tratamento importante durante os últimos anos (Hõckel, M. et al. (1993) Therapeutic angiogenesis. Arch. Surg. 128, 423-429) . Em ensaios clinicos, em curso no humano, a terapia génica com VEGF é aplicada para o tratamento de isquemia critica dos membros e isquemia do miocárdio. A terapia com VEGF também tem sido experimentalmente investigada em ulceração gástrica e duodenal, bem como em úlceras dérmicas e em substitutos de pele cultivados.

Constatou-se agora que os compostos da fórmula I têm uma actividade angiogénica potente e induzem angiogénese, como é evidenciado por muitos vasos ordenados, recentemente formados. Além disso, constatou-se que a aplicação tópica de CPX não 2 conduz a alterações sistémicas graves na expressão do VEGF, que limita a sua função a regiões de aplicação tópica. Isto é relativamente seguro e altamente vantajoso quando comparado com a terapia génica. Assim, os compostos da fórmula I podem ser utilizados para o tratamento de feridas e/ou cicatrização de feridas, porque a actividade angiogénica potente difere consideravelmente da actividade antimicrobiana conhecida dos compostos da fórmula I. Assim, não são evitadas apenas infecções durante o tratamento de feridas, mas também a cicatrização de feridas é melhorada, e. g., por formação de muitos vasos novos na ferida e em seu redor.

Assim, a invenção refere-se à utilização de l-hidroxi-2-piridonas da fórmula I

para a preparação de um fármaco para o tratamento de feridas e/ou cicatrização de feridas, em que as feridas são definidas de acordo com a reivindicação 1, na qual R1, R2 e R3 são iguais ou diferentes e são um átomo de hidrogénio ou alquilo tendo 1 a 4 átomos de carbono, e

R4 é um radical hidrocarboneto saturado tendo 6 a 9 átomos de carbono ou um radical da fórmula II 3

(II), Ar-Z

X-CH; onde X é S ou 0, Y é um átomo de hidrogénio ou até 2 átomos de halogéneo, tais como cloro e/ou bromo, Z é uma ligação simples ou um radical divalente compreendendo a) 0, ou b) S, ou c) -C(R5) (R6)-; em que R5 e R6 são idênticos ou diferentes e são, independentemente, átomo de hidrogénio ou alquilo-(Ci-C4); ou d) outros radicais divalentes tendo 2 a 10 carbonos na forma de uma cadeia, que compreende ainda, opcionalmente, um ou mais do seguinte: i) uma ligação dupla carbono-carbono, ou ii) 0, S ou uma sua mistura, em que se 2 ou mais átomos de 0 e/ou S ou uma sua mistura, estão presentes, cada átomo de 0 ou S está separado por, pelo menos, 2 átomos de carbono; e, 4 em qualquer um dos radicais divalentes anteriores, as valências livres dos átomos de carbono do referido radical divalente estão saturadas por um átomo de hidrogénio, alquilo-(C1-C4), ou uma sua mistura; e

Ar é um sistema anelar aromático contendo até dois anéis que podem estar substituídos por até três radicais do grupo que consiste em flúor, cloro, bromo, metoxilo, alquilo-(C1-C4) , trifluorometilo e trifluorometoxilo na forma livre ou de sal.

Nos radicais "Z", os membros da cadeia de carbono são, de um modo preferido, grupos -CH2. Se os grupos -CH2- estão substituídos por grupos alquilo-(C1-C4), os substituintes preferidos são CH3 e C2H5.

Exemplos de radicais "Z" são: -0-, -S-, -CH2-, - (CH2) m- (m = 2-10), -C(CH3)2-, -CH20-, -och2-, -ch2s-, -sch2-, -SCH(C2Hs)-, -ch=ch-ch2o-, -o-ch2-ch=ch-ch2o-, -och2-ch2o-, -och2-ch2ch2o-, -sch2ch2ch2s-, -sch2ch2ch2ch2o-, -sch2ch2och2ch2-, -sch2ch2och2ch2o-ch2ch2s- ou -S-CH2-C(CH3)2-CH2-S-. 0 radical "S" significa um átomo de enxofre; o radical "O" significa um átomo de oxigénio. O termo "Ar" significa fenilo ou sistemas condensados, tais como naftilo, tetra-hidronaftilo e indenilo e, também, sistemas isolados, tais como aqueles que são derivados de bifenilo, difenilalcanos, éteres difenílicos e tioéteres difenílicos. 5 0 termo "radical hidrocarboneto saturado tendo 6 a 9 átomos de carbono" significa que o radical pode ser de cadeia linear, ramificada ou ciclico e não contém ligações múltiplas alifáticas, i. e., sem ligações etilénicas ou acetilénicas. Exemplos do radical R4 são, e. g., hexilo, heptilo, octilo, ciclo-hexilo ou ciclo-heptilo. 0 radical hidrocarboneto R4 no composto de fórmula I é, de um modo preferido, um radical -alquilo-(C6-C8) ou ciclo-hexilo, o qual também pode estar ligado, através de um grupo metileno ou etileno, ao anel de piridona ou pode conter um grupo endometilo. R4 também pode ser um radical aromático o qual está, no entanto, de um modo preferido, ligado ao radical piridona através de, pelo menos, um átomo de carbono alifático.

Representantes importantes da classe de composto caracterizado pela fórmula I são: 6-[4-(4-clorofenoxi)fenoximetil]-l-hidroxi-4-metil-2-piridona, 6-[4-(2,4-diclorofenoxi)fenoximetil]-l-hidroxi-4-metil-2-piridona, 6-(bifenilil-4-oximetil)-l-hidroxi-4-metil-2-piridona, 6-(4-benzil-fenoximetil)-l-hidroxi-4-metil-2-piridona, 6-[4-(2,4-dicloro-benziloxi)fenoximetil]-l-hidroxi-4-metil-2-piridona, 6 6-[4-(4-clorofenoxi)fenoximetil]-l-hidroxi-3,4-dimetil-2-piridona, 6-[4-(2,4-diclorobenzil)fenoximetil]-l-hidroxi-3,4-dimetil-2-piridona, 6-[4-(cinamiloxi)fenoximetil]-l-hidroxi-4-metil-2-piridona, l-hidroxi-4-metil-6-[4- (4- trifluorometilfenoxi)fenoximetil]-2-piridona, l-hidroxi-4-metil-6-ciclo-hexil-2-piridona, l-hidroxi-4-metil-6-(2,4,4-trimetilpentil)-2-piridona, l-hidroxi-4-metil-6-n-hexil-, -6-iso-hexil-, -6-n-heptil-ou -6-iso-heptil-2-piridona, l-hidroxi-4-metil-6-octil- ou -6-iso-octil-2-piridona, em particular, l-hidroxi-4-metil-6-ciclo-hexil-metil- ou -6-ciclo-hexiletil-2-piridona, onde o radical ciclo-hexilo, em cada caso, também pode conter um radical metilo, l-hidroxi-4-metil-6-(2-biciclo[2,2,1]heptil)-2-piridona, l-hidroxi-3,4-dimetil-6-benzil- ou -6-dimetilbenzil-2-piridona ou l-hidroxi-4-metil-6-(β-feniletil)-2-piridona. 7

Os compostos da fórmula I acima referidos podem ser utilizados tanto na forma livre como de sais; é preferida a utilização na forma livre.

Se são utilizadas bases orgânicas, de um modo preferido, são utilizadas bases pouco voláteis, por exemplo, alcanolaminas de baixo peso molecular, tais como etanolamina, dietanolamina, N-etiletanolamina, N-metildietanolamina, trietanolamina, dietilaminoetanol, 2-amino-2-metil-n-propanol, dimetilaminopropanol, 2-amino-2-metilpropanodiol, triisopropanolamina. Outras bases pouco voláteis que podem ser referidas são, por exemplo, etilenodiamina, hexametilenodiamina, morfolina, piperidina, piperazina, ciclo-hexilamina, tributilamina, dodecilamina, Ν,Ν-dimetildodecilamina, estearilamina, oleilamina, benzilamina, dibenzilamina, N-etilbenzilamina, dimetilestearilamina, N-metilmorfolina, N-metilpiperazina, 4-metilciclo-hexilamina, N-hidroxietilmorfolina. Também podem ser utilizados os hidróxidos de sais quaternários de amónio, tais como hidróxido de trimetilbenzilamónio, hidróxido de tetrametilamónio ou hidróxido de tetraetilamónio e, ainda, guanidina e seus derivados, em particular, os seus produtos de alquilação. No entanto, também é possível utilizar, por exemplo, alquilaminas de baixo peso molecular, tais como metilamina, etilamina ou trietilamina como agentes de formação de sal. Também são adequados sais com catiões inorgânicos, por exemplo, sais de metal alcalino, em particular, sais de sódio, potássio ou amónio, sais de metal alcalino-terroso, tais como, em particular, os sais de magnésio ou cálcio, e sais com catiões di- a tetravalentes, por exemplo, o sal de zinco, alumínio ou zircónio, para os compostos serem utilizados de acordo com a invenção.

Os compostos da fórmula I podem ser preparados, por exemplo, pelo processo de acordo com os documentos US 2540218 ou US 4797409. A presente invenção também se refere à utilização do composto da fórmula I, em que Ar é um sistema bicíclico, que é derivado de bifenilo, difenilalcano ou éter difenílico. A presente invenção também se refere à utilização do composto da fórmula I, que contém um radical ciclo-hexilo na posição R4. A presente invenção também se refere à utilização do composto da fórmula I, que contém um radical octilo da fórmula -CH2-CH(CH3)-CH2-C(CH3)3 na posição R4. A presente invenção também se refere à utilização do composto da fórmula I, em que é utilizada l-hidroxi-4-metil-6-[4-(4-clorofenoxi)fenoximetil]-2-(1H)piridona, l-hidroxi-4-metil-6-ciclo-hexil-2-(1H)piridona ou l-hidroxi-4-metil-6-(2,4, 4-trimetilpentil)-2-(1H)piridona. A presente invenção também se refere à utilização dos compostos da fórmula I para a produção de um fármaco para o tratamento de feridas em que as feridas são definidas de acordo com a reivindicação 1.

Devido à indução de angiogénese, a cicatrização de feridas é melhorada, uma vez que são formados novos vasos sanguíneos e o abastecimento da ferida com nutrição e oxigénio é melhorada. Assim, também a cicatrização de feridas não infectadas é 9 dramaticamente melhorada. Os compostos da fórmula I não apenas previnem infecções da ferida por, e. g., levedura, bactérias ou fungos, mas também auxiliam a cicatrização de feridas através de um abastecimento melhorado da ferida, pela indução de vasos sanguíneos recentemente formados. Assim, a cicatrização de feridas não infectadas e infectadas é melhorada pelo tratamento com os compostos da fórmula I.

Entender-se-á que o termo "feridas" significa, e. g., feridas por esmagamento, cortes, feridas abertas, ferimentos de bala, incisões, feridas por pressão, ferimentos causados por corte ou feridas devido a cirurgia ou cirurgia plástica.

Entender-se-á que o termo "cicatrização de feridas" significa processos regenerativos para o fecho de uma ferida; especialmente, formação de vasos capilares novos e aumento de tecido conjuntivo e células epiteliais.

Os compostos da fórmula I, e seus sais fisiologicamente toleráveis, podem ser administrados, como fármacos, a animais, de um modo preferido, a mamíferos e, em particular, a humanos para o tratamento de feridas e/ou cicatrização de feridas. Podem ser administrados isolados ou em misturas, uns com os outros, ou na forma de preparações farmacêuticas, que permitem a administração tópica. Entender-se-á que o termo "mamíferos" significa, e. g., humano, cavalo, gado, porco, rato, murganho, ovelha ou cão.

Os fármacos podem ser administrados por via percutânea ou tópica, por exemplo, na forma de emulsões, unguentos, soluções ou tinturas, pós, ou por outras vias, por exemplo, na forma de aerossóis ou espumas. Para utilização dos compostos referidos, 10 de acordo com a invenção, são adequadas preparações farmacêuticas liquidas, semi-sólidas e sólidas, em particular, soluções, cremes, unguento, pós e preparações de gel, em que os últimos são utilizados, de um modo preferido, devido à sua libertação acrescida de composto activo.

As preparações farmacêuticas, de acordo com a invenção, são preparadas de um modo conhecido per se e familiar para um perito na técnica, sendo utilizados veículos inorgânicos e/ou orgânicos inertes farmaceuticamente aceitáveis além do(s) composto(s) da fórmula I e/ou seu(s) sal(sais) fisiologicamente tolerável(eis).

Os compostos da fórmula I também podem ser incorporados em ou sobre gaze cirúrgica, ligadura ou penso.

Pensos adequados são ilustrados em mais pormenor pelos seguintes exemplos:

Pensos de alginato

Pensos de alginato para feridas são tecidos a partir de fibras de alginato de cálcio. 0 alginato de cálcio é um biopolímero marinho que é derivado a partir de alga marinha.

Os alginatos são altamente absortivos. Quando o penso de alginatos entra em contacto com o exsudado da ferida, forma-se um gel macio, mantendo um ambiente húmido na superfície da ferida que é propício à formação de tecido de granulação e epitelização. Os pensos de alginato estão indicados para feridas com elevada exsudação, uma vez que têm a capacidade para absorver até 20 vezes o seu peso. 11

Pensos compostos

Em geral, são de multicamadas, incluindo uma camada não aderente que está em contacto com a ferida, e várias camadas absorventes, com função de mecha e semi-oclusivas. A camada absorvente não inclui uma espuma, alginato, hidrocolóide ou hidrogel. Um suporte, não tecido, de fita adesiva prende o penso à pele. Estes pensos são utilizados como pensos de cobertura para todas as fases da cicatrização da ferida e são pensos primários para vários tipos de feridas pós-operatórias.

Camadas de contacto

As camadas de contacto são pensos de folha fina colocados directamente sobre uma ferida aberta para proteger o tecido da ferida do contacto directo com outros agentes ou pensos aplicados na ferida. Pensos secundários são sempre utilizados com camadas de contacto.

Pensos de espuma

Os pensos de espuma são preparados principalmente a partir de poliuretano, mas também é utilizado silicone. Estão disponíveis como pensos de espuma lisos ou como enchimentos, e são destinados para utilização na granulação e epitelização de feridas que produzem algum exsudado. 12

Gaze

Pensos de gaze tecida são preparados a partir de fio de algodão a 100%. As fibras são tecidas horizontalmente e verticalmente, com 10 a 20 passos de manufactura separados, empregues no processo de produção de uma compressa de gaze 4x4 polegadas, 12 camadas. Os pensos de gaze tecida existem numa gama alargada de tipos e são normalmente utilizados para a limpeza e remoção de tecido infectado.

Artigos não tecidos não são nem de tecido nem de malha. As fibras são ordenadas de modo a parecerem que são tecidas. A maioria dos pensos não tecidos são fabricados a partir de uma mistura de rayon e poliéster. 0 rayon proporciona macieza e absorvência, enquanto que o poliéster proporciona resistência. A principal aplicação de pensos de gaze não tecida é para absorção e envolvimento.

Pensos de gaze impregnados

Pensos de gaze impregnados são materiais tecidos, ou não tecidos, nos quais a substância foi incorporada no material do penso.

Pensos hidrocolóides

Pensos hidrocolóides são pensos apreciados, de segunda geração, que são de absorção moderada, retentores de humidade, adaptável à ferida e auto-adesivos. Também são oclusivos, formando uma barreira contra a contaminação bacteriana. Além de 13 estarem disponíveis em formas dimensionais, os hidrocolóides são fornecidos como pós, grânulos, pastas e outras formas especializadas. Os principais componentes funcionais são gelatina, pectina ou hidrocolóides relacionados. Estão indicados para utilização em úlceras de pressão, queimaduras e uma variedade de outros tipos de feridas.

Pensos de hidrogel

Os hidrogéis são pensos semipermeáveis em que a água é o componente principal. A glicerina ou o propilenoglicol estão incluídos como humectantes e, por vezes, é adicionado um amido de copolímero como absorvente. Os pensos estão disponíveis como discos impregnados de gaze, folhas e géis amorfos, e estão indicados para feridas de espessura parcial e total sem dreno até dreno moderado.

Pensos em película transparente

Os pensos em película transparente são pensos oclusivos que consistem numa membrana de poliuretano presa por uma camada adesiva. Os pensos variam em espessura, grau de oclusão e outras propriedades. Os pensos em película transparente estão indicados para utilização em pequenas incisões cirúrgicas, pontos de inserção para cateteres periféricos e venosos centrais, queimaduras superficiais, ruptura parcial da espessura das feridas e como pensos secundários. 14

Pensos biológicos e biossintéticos

Este sector inclui um grupo de pensos com base em colagénio, naturalmente absorventes e biologicamente compatíveis pensos constituídos por aminoácidos biocompatíveis relacionados e hidrolisados de proteína pensos que combinam materiais derivados sintética e biologicamente

Os compostos da fórmula I podem ser administrados por via tópica a humanos e outros mamíferos, tais como cão, gato, cavalo, porco, gado ou ovelha.

As preparações farmacêuticas contêm, normalmente, desde cerca de 0,05% até cerca de 5%, de um modo preferido, desde 0,5% até 2%, em especial, de um modo preferido, 1%, em peso dos compostos da fórmula I e/ou seus sais fisiologicamente toleráveis. Também são possíveis percentagens inferiores e superiores.

Além dos ingredientes activos da fórmula I e/ou seus sais fisiologicamente aceitáveis e substâncias veículo, as preparações farmacêuticas podem conter aditivos, tais como, por exemplo, enchimentos, aglutinantes, lubrificantes, agentes molhantes, estabilizantes, emulsionantes, conservantes, corantes, espessantes, diluentes, substâncias tampão, solventes, agentes de solubilização, agentes para conseguir um efeito de depósito, sais pata alterar a pressão osmótica, agentes de 15 revestimento ou anti-oxidantes. Também podem conter dois ou mais compostos da fórmula I e/ou seus sais fisiologicamente toleráveis. Além disso, além de pelo menos um composto da fórmula I e/ou seus sais fisiologicamente toleráveis, as preparações farmacêuticas também podem conter um ou mais de outros ingredientes terapeuticamente ou profilacticamente activos. Tais ingredientes activos adicionais podem ser dexpantenol, alantoína, dextranómero e/ou extractos da planta Echinacea.

Entender-se-á que variações que não afectem, de um modo substancial, a actividade das várias formas de realização desta invenção estão incluídas no âmbito da invenção aqui descrita. Assim, os seguintes exemplos pretendem ilustrar mas não limitar a presente invenção.

Exemplo 1

Indução da expressão génica do VEGF por CPX Métodos

Cultura celular

As células HRCH05 contendo um gene repórter dependente de HIF-1, transfectado de um modo estável, foram anteriormente descritas (Wanner, R. M., et al. (2000) Epolones induce erythropoietin expression via hypoxia-inducible factor-la activation. Blood 96, 1558-1565). A linha celular hepatoma HepG2 humana foi obtida da American Type Culture Collection (ATCC números HB-8065). Todas as linhas celulares foram cultivadas em 16 meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, glucose elevada, Life Technologies) com suplemento de FCS a 10% desactivado por calor, penicilina a 100 U/mL, estreptomicina a 100 pg/mL, 1 x aminoácidos não essenciais e Na-piruvato a 1 mM (todos adquiridos da Life Technologies) numa atmosfera húmida contendo C02 a 5%, a 37 °C. As pressões parciais de oxigénio no incubador (Forma Scientific, modelo 3131) foram de 140 mm Hg (02 a 20% v/v, normóxia) ou de 7 mm Hg (02 a 1% v/v, hipóxia) . A ciclopiroxolamina (CPX), mesilato de deferoxamina (DFX) e 2,2' -dipiridilo (DP) foram adquiridos da Sigma. As soluções stock de CPX e DP foram preparadas em metanol a 0,5 M e 1 M, respectivamente. O DFX foi dissolvido no momento a 10 mM no meio de cultura celular. A transfecção de transiente, gene repórter e ensaios de viabilidade, células HepG2 foram submetidas a electroporação, de modo transiente, com uma construção de luciferase, controlado pelo promotor de VEGF, como descrito anteriormente (Ikeda, E., et al. (1995) Hypoxia-induced transcriptional activation and increased mRNA stability of vascular endothelial growth factor in C6 glioma cells. J. Biol. Chem. 270, 19761-19766). Após a estimulação, células transfectadas, de modo transiente, e estáveis, foram lisadas em tampão de lise passiva (Promega) e a actividade de luciferase foi determinada utilizando um kit de ensaio de luciferase de acordo com as instruções do fabricante (Promega) num luminómetro de 96 poços (MicroLumat LB96P, EG&G Berthold). A proliferação/viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) como descrito (30,31). Foram determinadas as absorvâncias a 570 nm num fotómetro de 96 poços (Rainbow, SLT Labsystems). 17

Resultados A CPX numa concentração desde 5 μΜ até concentrações de 20 μΜ induziu fortemente a proteina HIF-Ια em células de hepatoma HepG2 em normóxia após 6 e 24 horas de tratamento. Enquanto que nenhuma proteina HIF-Ια pôde ser detectada em células com normóxia, a hipóxia (02 a 1%) também induziu fortemente a HIF-Ια. A combinação de CPX e hipóxia não aumentou mais os niveis de HIF-Ια após 6 horas mas, em vez disso, reduziu os niveis de HIF-Ια após 24 horas de tratamento.

Como determinado pelo método de transferência de Northern do mARN derivado de células HepG2 tratadas com CPX, DFX e DP durante 24, 48 e 72 horas, estes quelantes de ferro também induziram a expressão dos genes de VEGF endógenos alvo de HIF-1, transportador de glucose-1 (Glut-1) e aldolase mas não dos genes de controlo L28 e β-actina. A funcionalidade da expressão de ARNm do VEGF, induzida por CPX, foi ainda demonstrada pela acumulação de proteína de VEGF no sobrenadante da cultura de células HepG2, que aumentou de um modo dependente da dosagem após 6 ou 24 horas de tratamento.

Um gene repórter luciferase conduzido por um fragmento, de 1180 bp, do promotor de VEGF, foi transfectado, de um modo transiente, em células HepG2, que foram separadas e tratadas com concentrações crescentes de CPX durante 24 horas. Foi observado um aumento na actividade de luciferase dependente da dosagem, sugerindo que a CPX activa, de um modo transcricional, a expressão de VEGF. Em resumo, estes resultados demonstram que a CPX pode activar a transcrição de VEGF endógeno, expressão de mARN e acumulação de proteina segregada. 18

Exemplo 2

Falta de indução do gene alvo de HIF-1 por CPX no rim isolado perfundido de rato A DFX, administrada de forma sistémica, pode induzir estabilidade ubíqua do HIF-1 e expressão de eritropoietina específica de rim em murganhos (Wang, G. L., e Semenza, G. L. (1993) Desferrioxamine induces erythropoietin gene expression and hypoxia-inducible factor 1 DNA-binding activity: implications for models of hypoxia signal transduction. Blood 82, 3610-3615). Relativamente a uma aplicação tópica de CPX como um agente indutor de HIF-1 para angiogénese terapêutica, foi importante testar se a CPX conseguia conduzir a uma indução sistémica de VEGF. Como um modelo ex-vivo, rins isolados de rato foram perfundidos durante 3 horas sob condições normóxicas com concentrações crescentes de CPX. No entanto, a CPX não induziu os níveis de mRNA dos genes de VEGF alvo de HIF-1, Glut-1 ou aldolase a concentrações na gama desde 0,1 μΜ até 100 μΜ. As concentrações de CPX mais elevadas (33 μΜ e 100 μΜ) conduziram a uma regulação negativa da função renal, como indicado por um forte aumento nas taxas de excreção de albumina e sódio. Após a perfusão com oxigénio a 3% durante 3 horas, foi observado um aumento nos níveis de mRNA de Glut-1 mas não nos de VEGF e aldolase, que não aumentou mais com a CPX.

Exemplo 3

Indução de angiogénese na membrana corioalantóide de galinha (CAM) por Ensaio membrana corioalantóide de embrião de pintainho (CAM) com CPX 19 Método

Os ensaios CAM foram realizados como descrito por Olivo, M. et al. (A comparative study on the effects of tumor necrosis factor-α (TNF-a), human angiogenic factor (h-AF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) on the chorioallantoic membrane of chick embryo, (1992). Anat. Rec. 234, 105-115).

Resumidamente, ovos fertilizados (adquiridos da Lohmann Tierzucht, Cuxhaven, Alemanha) foram incubados a 37 °C numa atmosfera húmida. Os ovos foram mantidos nas suas posições e virados ao contrário duas vezes ao dia. Após 6 dias, uma pequena cavidade foi perfurada através da casca até ao saco de ar (visualizado utilizando uma fonte de luz forte) e uma janela de aproximadamente 0,5 cm2 foi recortada na face do ovo. A janela foi selada com adesivo e os ovos foram novamente incubados até ao dia 9, quando o Sal 2-aminoetanol de 6-ciclo-hexil-l-hidroxi-4-metil-2(1H)-piridona (CPX) foi aplicado ao CAM utilizando o método Elvax® (ver Olivo, M. et al. acima). Assim, pérolas de copolímero etileno/acetato de vinilo (Elvax® 40L-03, DuPont, fornecido por C. H. Erbslõh KG, Krefeld, Alemanha) foram abundantemente lavadas em etanol e secas sob pressão reduzida. Em seguida, as pérolas Elvax® foram, então dissolvidas em cloreto de metileno a 10% (p/v) e foi adicionado CPX até à concentração desejada. Foi pipetada uma gota (40 pL) desta solução para uma lâmina de vidro em silicone e deixou-se evaporar completamente o solvente. Utilizando fórceps, o disco de Elvax® foi cuidadosamente levantado das lâminas de vidro e colocado na CAM. No dia 11, a janela foi alargada e a CAM foi registada utilizando uma câmara digital (Olympus) acoplada a uma ocular de um microscópio estereoscópico. 20

Resultado

Com base nas observações de que CPX induziu a expressão de VEGF em cultura celular (ver exemplo 1), foi analisada a capacidade angiogénica num modelo in vivo de angiogénese. Assim, a CAM de galinha, no dia 9 de desenvolvimento, foi sobreposta com discos de polímero inerte contendo várias concentrações de CPX ou apenas solvente. Após dois dias de incubação, nenhum sinal de angiogénese pôde ser observado com os discos de controlo com solvente. Pelo contrário, os discos de polímero contendo CPX a 50 mM induziram, de um modo consistente, angiogénese de CAM, como evidenciado por muitos vasos recentemente formados, dispostos radialmente. Um total de 10 CAMs tratadas com CPX a 50 mM apresentaram angiogénese semelhante, enquanto que todas as 7 CAMs de controlo careceram de quaisquer sinais de angiogénese. A CPX a 5 mM foi indistinguível a partir dos controlos e a CPX a 500 mM foi tóxica para o embrião de pintainho.

Exemplo 4

Modelo de ferida na pele de murganho Método

Ambas as orelhas de murganhos NMRI adultos foram feridas, sob anestesia com Cetamina a 100 mg/kg (Narketan®) e Xilazina a 5 mg/kg (Rompun®), por furos, de 2 mm diâmetro, perfurados de um lado ao outro utilizando um instrumento corrente para furar orelhas. As orelhas foram tratadas diariamente com um creme de 21 pele corrente contendo (Batrafen®) ou não contendo CPX a 1% (p/v) . Uma orelha foi tratada com CPX e a outra orelha com o creme de controlo. A quantidade de creme foi suficiente para tapar o furo e foi distribuído equitativamente ao longo de toda a orelha.

Resultado A CPX pode induzir angiogénese num modelo de ferida na pele de murganho

Os furos de 2 mm diâmetro, perfurados de um lado ao outro (um modo corrente de marcar murganhos em instalações para animais) foram diariamente tratados com um creme dérmico disponível comercialmente, contendo CPX a 1% numa orelha e, na outra orelha, um isento de CPX, mas de resto idêntico ao creme dérmico comum, respectivamente. A CPX pode provocar vermelhidão nas margens da ferida, a qual nunca foi observada na zona de pele saudável da mesma orelha. Nesta série, 4 de 10 animais apresentaram efeitos semelhantes e nenhum dos animais teve vermelhidão mais pronunciada na margem da ferida tratada com placebo do que na margem da ferida tratada com CPX. A vermelhidão induzida por CPX pode ser crescimento vascular acrescido.

Lisboa, 3 de Maio de 2007 22

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de l-hidroxi-2-piridonas da fórmula I R

(O para a preparação de um fármaco para a cicatrização de feridas, em que as feridas são feridas por esmagamento, cortes, ferimentos de bala, incisões, feridas por pressão, ferimentos causados por corte ou feridas devido a cirurgia ou cirurgia plástica, em que o composto da fórmula I é administrado por via tópica na forma de emulsões, unguentos, soluções, tinturas, pós, preparação em creme ou gel ou na forma de aerossóis ou espumas, em que R1, R2 e R3 são idênticos ou diferentes e são um átomo de hidrogénio ou alquilo tendo 1-4 átomos de carbono, e R4 é um radical hidrocarboneto saturado tendo 6 a 9 átomos de carbono ou um radical da fórmula II 1 onde Ar-Z

X-CH; (Π), X é S ou 0, Y é um átomo de hidrogénio ou até 2 átomos de halogéneo, tais como cloro e/ou bromo, Z é uma ligação simples ou o radical divalente compreendendo a) 0, ou b) S, ou c) -C(R5) (R6)-; em que R5 e R6 são idênticos ou diferentes e são, independentemente, átomo de hidrogénio ou alquilo-(C1-C4) ; ou d) outros radicais divalentes tendo 2 a 10 carbonos na forma de uma cadeia, que compreende ainda, de um modo opcional, um ou mais do seguinte: i) uma ligação dupla carbono-carbono, ou ii) 0, S, ou uma sua mistura, em que se 2 ou mais átomos de 0 e/ou S, ou uma sua mistura, 2 estão presentes, cada átomo de 0 ou S está separado por, pelo menos, 2 átomos de carbono; e, em qualquer um dos radicais bivalentes anteriores, as valências livres dos átomos de carbono do referido radical bivalente estão saturadas por um átomo de hidrogénio, alquilo-(C1-C4), ou uma sua mistura; e Ar é um sistema anelar aromático tendo até dois anéis que podem estar substituídos por até três radicais do grupo consistindo em flúor, cloro, bromo, metoxilo, alquilo-(C1-C4), trifluorometilo e trifluorometoxilo na forma livre ou de sal.
2. Utilização como reivindicado na reivindicação 1, em que Ar no composto da fórmula I é um sistema bicíclico, que é derivado de bifenilo, difenilalcano ou éter difenílico.
3. Utilização como reivindicado na reivindicação 1, em que o composto de fórmula I contém um radical ciclo-hexilo na posição R4.
4. Utilização como reivindicado na reivindicação 1, em que o composto de fórmula I contém um radical octilo da fórmula -CH2-CH(CH3)-CH2-C(CH3)3 na posição R4.
5. Utilização como reivindicado em uma ou mais das reivindicações 1, em que o composto de fórmula I é l-hidroxi-4-metil-6-[4-(4-clorofenoxi)fenoximetil]-2- 3 (1Η)piridona, l-hidroxi-4-metil-6-ciclo-hexil-2- (lH)piridona ou l-hidroxi-4-metil-6-(2,4,4-trimetilpentil)-2-(1H)piridona.
6. Utilização como reivindicado em uma ou mais das reivindicações 1 a 5, em que o composto de fórmula I é administrado isolado, ou em misturas um com o outro.
7. Utilização como reivindicado em uma ou mais das reivindicações 1 a 6, em que a dosaqem do composto de fórmula I na preparação farmacêutica é desde cerca de 0,05% até cerca de 5%, de um modo preferido, desde 0,5% até 2%, em especial, de um modo preferido, 1% em peso do composto da fórmula I e/ou seus sais fisiologicamente toleráveis.
8. Utilização como reivindicado em uma ou mais das reivindicações 1 a 7, em que a preparação farmacêutica contém ainda um ingrediente activo, tais como dexpantenol, alantoina, dextranómero ou extractos da planta Echinacea ou uma mistura dos referidos ingredientes. Lisboa, 3 de Maio de 2007 4