PT1468008E - Polimorfismo do promotor do fator de inibição da migração de macrófagos (mif) na doença inflamatória - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "POLIMORFISMO DO PROMOTOR DO FATOR DE INIBIÇÃO DA MIGRAÇÃO DE MACRÓFAGOS NA DOENÇA INFLAMATÓRIA" ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Domínio da invenção

Esta invenção refere-se a um método de diagnóstico e aparelho baseado num polimorfismo funcional do promotor de um gene que codifica o fator de inibição da migração de macrófagos (MIF). Mais especificamente, esta invenção refere-se a um método para diagnóstico de pré-disposição de certos estados de doença, através do rastreio da presença deste polimorfismo do promotor. A invenção também se refere ao aparelho para rastreio do polimorfismo, genes MIF contendo o polimorfismo e a uma sonda deste.

Antecedentes da tecnologia

Um número de estudos experimentais levou ao conceito que o fator de inibição da migração de macrófagos (MIF) funciona como um contra-regulador fisiológico da ação dos glucocorticóides no sistema imunitário. Neste papel, a posição do MIF na cascada das citoquinas é de agir em conjunto com glucocorticóides endógenos para controlar o momento preciso e a magnitude da resposta inflamatória (1). 0 MIF tem também vários papéis diretos, pró-inflamatórios, em doenças inflamatórias como a artrite reumatóide (2), sépsis (3, 4), síndrome de dificuldade respiratória aguda (5), e glomerulonefrite (6). 2 0 MIF foi originalmente descrito há mais de 30 anos como um fator derivado do linfócito T que inibia a migração de macrófagos peritoneais (7), mas é agora conhecido que vários outros tipos celulares, incluindo os próprios macrófagos, são fontes importantes de MIF (8). Os níveis de MIF estão elevados no soro e no líquido sinovial de doentes com artrite reumatóide (2, 9), e na parte sinovial da articulação a imunocoloração de MIF pode ser localizada nos macrófagos CD14+ do revestimento sinovial e nos sinoviócitos semelhantes a fibroblastos (2). Após a libertação, o MIF é diretamente pró-inflamatório ao ativar ou ao promover a expressão de citoquinas (TNFa (8, 10), IL-1β, IL-2 (11), IL-6 (8, 12), IL-8 (13) e IFNy (11, 14)), libertação de óxido nítrico (15), expressão da metaloproteinase de matriz (MMP) (16, 17), e indução da via da ciclooxigenase-2 (Cox-2) (18). A capacidade do MIF de induzir a ativação sustentada da via da p44/p42 (ERK-1/2) MAP quinase (18) e de inibir a apoptóse dependente de p53 (19, 20) também sugere que este mediador tem um papel chave na iniciação do pannus reumatismal. A patente U. S. n° 6,030,615 de Bucala, et al. divulga uma combinação de métodos para tratamento de doenças causadas por toxicidade mediada por citoquinas, compreendendo a administração de uma quantidade efetiva de (a) um inibidor do MIF, tal como um anticorpo que se liga a um polipeptídeo MIF, em que o polipeptídeo MIF tem um peso molecular de cerca de 12,5 kDa, em combinação com (b) anti-TNFa, anti-IL1, anti-IFN-γ, IL-1RA, um esteróide, um glucocorticóide, ou IL-10. O conceito que o polimorfismo em genes da resposta imunitária contribui para a patogénese de certas doenças autoimunes/inflamatórias humanas tem tido um aumento de interesse ao longo dos últimos anos. Presentemente, muito 3 poucos polimorfismos de genes têm-se revelado serem funcionalmente significantes e terem um valor prognóstico em estados de doenças específicos. Exemplos previamente definidos incluem polimorfismos em TNFa e IL-lra que demonstraram ter uma certa significância prognóstica na malária e na doença cardíaca isquémica respetivamente (24,25). Similarmente, um número, de polimorfismos em TNFa e IL—β têm sido reportados estarem associados à gravidade da artrite reumatóide (26-28).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção baseia-se em parte na identificação de um novo polimorfismo do gene Mif humano que consiste na repetição do tetranucleótideo CATT localizado na posição 817 do promotor Mif. Como divulgado aqui, este polimorfismo do promotor é funcionalmente significativo in vitro, e a análise de uma coorte de doentes com artrite reumatóide indica que esta repetição CATT está associada com a gravidade da doença.

Um objetivo da invenção, por isso, é de pôr à disposição um método de diagnóstico compreendendo a determinação do genótipo de um promotor Mif humano.

Outro objetivo desta invenção é de pôr à disposição meios de diagnóstico, compreendendo um meio para determinar o genótipo de um promotor Mif humano.

Assim em conformidade, a invenção refere-se a um método de diagnóstico da gravidade de uma doença inflamatória não infeciosa ou de uma predisposição para a gravidade de uma doença inflamatória não infeciosa compreendo a deteção de um polimorfismo num promotor Mif humano que se correlaciona 4 com um aumento ou diminuição da expressão do polipeptídeo MIF. Neste método a doença inflamatória não infeciosa é, por exemplo, autoimunidade, doença do enxerto contra hospedeiro, ou preferivelmente artrite reumatóide, e preferivelmente a deteção do polimorfismo é indicativo da gravidade da doença ou predisposição para a gravidade da doença. Preferivelmente, este polimorfismo num promotor Mif humano que está correlacionado com um aumento ou diminuição da expressão do polipeptídeo MIF, é um polimorfismo da repetição do tetranucleótideo CATT na posição 817 do gene Mif humano, selecionado do grupo constituído por 5, 6, 7 e 8 unidades repetidas, em que a presença de 5 unidades repetidas indica a ocorrência de ou predisposição para ligeira gravidade da doença. 0 método de diagnóstico da invenção preferivelmente compreende um passo de amplificação do promotor Mif utilizando a técnica PCR. Com este fim, a invenção põe à disposição um conjunto de iniciadores de PCR selecionado para amplificar a região de um promotor Mif humano. Por exemplo, o conjunto de iniciadores de PCR pode ser selecionado do grupo constituído por: (i) MIF-F (-1024) e MIF-R (-421); (ii) MIF-F (-441) e MIF-R (+4); (iii) MIF-F (-13) e MIF-R (+395); e (iv) MIF-F (+379) e MIF-R ( + 1043), como apresentado na tabela 1, ver abaixo. A invenção também se refere a um método para utilização de um conjunto de iniciadores da invenção para detetar um polimorfismo numa região do promotor Mif humano, e um artigo de fabrico (tal como um kit de diagnóstico) compreendendo um conjunto de iniciadores de PCR da invenção. A invenção além disso refere-se à molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência do promotor Mif humano, na qual o tetranucleótideo CATT na posição 817 está 5 repetido 5, 6, 7 ou 8 vezes. Preferivelmente, a molécula de ácido nucleico é uma molécula de DNA isolada, particularmente um fragmento de DNA genómico isolado que foi amplificado de uma amostra de DNA de um sujeito humano. Em formas de realização preferidas, a molécula de ácido nucleico isolada da invenção compreende uma porção de um promotor Mif humano que compreende o polimorfismo de repetição do tetranucleótideo CATT na posição 817 do gene Mif humano.

Outro aspeto da presente invenção refere-se a um método de terapia da doença inflamatória compreendendo o rastreio de um indivíduo relativamente à gravidade de uma doença inflamatória não infeciosa ou à predisposição para a gravidade de uma doença inflamatória não infeciosa. Este método compreende: detetar num sujeito humano um polimorfismo num promotor Mif humano que se correlaciona com um aumento ou diminuição da expressão do polipeptídeo MIF, em que a deteção do polimorfismo é indicativo da gravidade da doença ou da predisposição para a gravidade da doença. Este método de terapia da doença inflamatória compreende além disso tratar o sujeito humano para prevenir ou reduzir a gravidade da doença inflamatória ou para atrasar o início da doença inflamatória. Por exemplo, a terapia pode compreender tratar o sujeito humano administrando uma quantidade efetiva de pelo menos um agente selecionado do grupo constituído por um inibidor MIF, um anticorpo anti-TNFa, um anticorpo anti-ILl, e um anticorpo anti-IFN-γ, IL-1RA, um esteróide, um glucocorticóide, e IL-10.

Numa forma de realização preferida do método da invenção de terapia da doença inflamatória, a doença inflamatória é artrite reumatóide e o polimorfismo num promotor Mif humano 6 é um polimorfismo da repetição do tetranucleótideo CATT na posição 817 do gene Mif humano.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Fig. 1 apresenta uma representação esquemática da região do promotor Mif humano. Locais de ligação do fator de transcrição putativo e áreas de interesse estão em caixas. A região de repetição CATT polimórfica (-817 to -797/-785) está indicada por uma falta de sombreamento. FIG. 2 apresenta a atividade de transcrição basal de variantes polimórficas do promotor Mif humano em células Cos-7. A atividade do promotor MIF foi determinada por ensaios dual-luciferase com resultados expressos como unidades luminosas relativas (RLU). As células Cos-7 foram co-transfetadas transitoriamente com 800 ng de vetor de DNA teste: pGL3-básico (controlo negativo), pMIF-5, pMIF-6, pMIF-7, ou pMIF-8 (construções promotor MIF-luciferase especificas do polimorfismo de repetição 5, 6, 7, ou 8- CATT) e 200 ng do vetor de controlo pRLTK. Após 48 horas, as células foram lisadas e foi determinada a atividade de luciferase em relação à atividade de renilla utilizando um kit dual-luciferase (Promega) e um luminómetro TD 20/20. Os dados representam a média de quatro experiências individuais, cada uma efetuada em duplicado ± STDEV. * indica P<0,03 versus atividade da construção pMIF-5. FIG. 3 apresenta o efeito da variação polimórfica da repetição CATT nas respostar do promotor Mif à estimulação por soro e forscolina em células Cos-7. A atividade do promotor MIF foi determinada através de ensaios dual-luciferase com os resultados expressos como unidades luminosas relativas (RLU). As células Cos-7 foram co- 7 transfetadas transitoriamente com 800 ng do vetor DNA teste: pGL3-básico (controlo negativo), pMIF-5, pMIF-6, pMIF-7, ou pMIF-8 (construções promotor MIF-luciferase especificas do polimorfismo de repetição 5, 6, 7, ou 8-CATT) e 200 ng do vetor de controlo pRLTK. Após 24 horas de transfeção, as células foram lavadas em PBS e depois cultivadas em meio sem soro durante a noite. As células foram então ou deixadas sem estimulação (privação de soro) ou tratadas com soro fetal bovino a 2% (FCS) ou 1 μΜ forscolina ("1 uM FSK"). Após outras doze horas de incubação, foi determinada a atividade de luciferase como na FIG. 2. Os dados representam a média de quatro experiências individuais, cada uma levada a cabo em duplicado ± STDEV. * indica P<0,03 versus atividade da construção pMIF-5.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO O novo polimorfismo do gene Mif aqui identificado está associado com atividade do promotor MIF reduzida, e a presença deste genótipo no estado homozigoto parece estar associado a um risco reduzido de artrite reumatóide severa.

Foi demonstrado que MIF promove a secreção de TNFa e aumenta a secreção de óxido nítrico induzida por IFNy de macrófagos (8) . Além disso, MIF é um importante regulador autócrino da ativação de macrófagos (8), células T (11) e fibroblastos (18). Estes dados levaram a numerosas investigações sobre o papel potencial de MIF em condições inflamatórias crónicas tais como artrite reumatóide.

Os níveis de proteína MIF circulam em níveis mais elevados no soro de doentes com artrite reumatóide e a expressão de MIF celular é aumentada na sinovial (2, 9). Os fibroblastos sinoviais cultivados obtidos de doentes com artrite reumatóide secretam quantidades significativas de MIF espontaneamente em cultura, e a secreção aumenta ainda mais após estimulação pró-inflamatória. A estimulação de MIF em fibroblastos sinoviais reumatóides resulta na expressão aumentada de metaloproteinases de matriz (16), assim como na indução da expressão de fosfolipase A2 (PLA2) e de COX-2 (29). Também se verificou que a imunoneutralização da atividade de MIF em culturas de sinoviócitos inibe a expressão de COX-2 e de PLA2 mRNA induzida por IL-Ip (29) . A administração de um anticorpo neutralizante anti-MIF também atrasa o inicio e diminui a gravidade da artrite induzida por colagénio do tipo-II em ratinhos (30) e inibe de forma extrema o desenvolvimento da artrite induzida por adjuvante em ratos (31). Assim existe evidência considerável implicando o MIF na patogénese da artrite inflamatória.

Divulgado aqui é uma associação significativa entre doentes que são homozigotos para o alelo 5-CATT com baixa expressão e a doença reumatóide menos agressiva. Apenas 1/79 (1,2%) de doentes com artrite reumatóide severa herdaram este genótipo, comparado com 101105 (9,5%) de doentes com doença não progressiva, mais ligeira. Isto sugere que uma predisposição genética para baixa expressão de MIF protege contra inflamação persistente e/ou destruição das articulações. É desconhecido atualmente qual o fator de transcrição que pode estar envolvido na modulação dos efeitos da transcrição da região polimórfica, mas o alelo 5-CATT apresenta respostas reduzidas in vitro após estimulação com soro e com forscolina assim como atividade basal reduzida. Um elemento repetido CATT também existe no promotor do fator estimulador de colónias de granulócitos-macrófagos humanos (GM-CSF), e é necessário para a atividade do promotor (32, 33). Foi verificado que o fator nuclear YY134, e mais recentemente os fatores AP-1 e SP-1, 9 pode formar complexos com esta região do promotor GM-CSF (35). Se qualquer destes mesmos fatores também influencia a atividade do MIF repetição CATT, permanece ainda por esclarecer. A região de repetição CATT no gene Mif contém vários locais de ligação do fator de transcrição putativo Pit-1. Pit-1 é um fator de transcrição especifico da hipófise que é critico para a expressão de hormonas hipofisárias tais como prolactina e hormona de crescimento (36). A glândula hipófise anterior é uma fonte importante de MIF em roedores (3) e secreta MIF em resposta a stress fisiológico ou infecioso (37). Também foi verificado que o fator de libertação da corticotropina é um indutor potente da expressão MIF em células da hipófise cultivadas. Uma análise funcional recente do promotor do gene MIF murino utilizando células da hipófise de rato e a linhagem de células da hipófise AtT-20 demonstrou que a expressão do gene induzida por CRF é dependente de uma proteína de ligação de um elemento que responde ao cAMP (38). É interessante notar que apareceram recentemente na literatura relatórios de ligação do lócus CRF à artrite reumatóide, e que existe alguma evidência que o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) pode ter um papel na patogénese da artrite reumatóide em certos doentes. Foi verificado que doentes com artrite reumatóide ativa têm niveis de cortisol diurnos anormalmente baixos face à função hipofisiária e adrenal normal, sugerindo um defeito a nível do hipotálamo (40) . Dada a capacidade de MIF de contra-regular a ação dos glucocorticóides no sistema imunitário (revisto por Bucala (1)), a expressão de MIF pela glândula hipófise anterior pode ser importante para o desenvolvimento de doenças inflamatórias tais como artrite reumatóide. 10

Desde o início destes estudos, foi reportado por Donn, et ai. (41) um polimorfismo de um único nucleótideo -173*G/C (SNP) no promotor do gene Mif e foi demonstrado estar associado com a artrite idiopática juvenil de início sistémico (JIA de início sistémico). A posse de pelo menos um alelo 173*C foi verificada em 36,8% dos doentes com JIA de início sistémico, comparativamente a 20,3% da população normal (41). No entanto não existe informação relativamente ao efeito deste SNP na expressão do gene. Uma análise preliminar, realizada pelos presentes inventores, indica gue o alelo 173*C não pode explicar os atuais dados ou resultados de associação de ensaios do promotor; de fato, não há evidência de desequilíbrio de ligação positivo entre o alelo 173*C e o alelo 5-CATT (dados não apresentados). 0 TNFa é considerado como sendo uma citoquina efetor crítica na artrite reumatóide, e a terapia anti-TNFa emergiu tendo elevada eficácia no tratamento desta doença (42). De notar, existe uma estreita relação entre MIF e TNFa. Parece que MIF age como um importante regulador a montante da expressão TNFa. MIF promove a excreção de TNFa pelos macrófagos e anula a capacidade de glucocorticóides de suprimir a produção de TNFa pelos macrófagos (43) . A imunoneutralização de MIF também reduz os níveis em circulação de TNFa (3) . Num cenário clínico, a análise do polimorfismo MIF proporciona um prognosticador da gravidade da doença, particularmente em doenças inflamatórias e mais particularmente na artrite reumatóide, e pode auxiliar na seleção da terapia de intervenção. Os dados inclusos também reafirmam a importância potencial de MIF como um alvo terapêutico na artrite reumatóide e possivelmente noutras doenças inflamatórias. 11

Parte experimental

Materiais e métodos

Doentes: Foram obtidas amostras de DNA do "Wichita Rheumatic Disease Data Bank" (banco de dados de doença reumática do Wichita) e eram representativas de doentes caucasianos seguidos numa consulta de reumatologia desde 1974. Os doentes com artrite reumatóide foram divididos em 2 grupos utilizando os seguintes critérios: A) severa (n = 79); idade média de inicio 55 anos, média de duração da doença de 13 anos, média da pontuação de Larsen de 4,0, média do titulo de RF de 339,24 e uma média da pontuação do HAQ de 1,36. B) ligeira (n =105); idade média de inicio 45 anos, média de duração da doença de 15 anos, média da pontuação de Larsen de 1,0, média do titulo RF de 362,84 e uma média da pontuação do HAQ de 0,93. Voluntários caucasianos saudáveis colocaram à disposição DNA genómico que foi utilizado como grupo de controlo normal (n= 159).

Extração do DNA: Foi extraído DNA de sangue total utilizando o “G Nome kit" (Bio 101 Inc., CA, USA) e de escovas orais utilizando o "Pure Gene Kit"® (Gentra Systems Inc., MN, USA).

Análise de sequenciação e polimorfismo do gene Mif: O gene Mif (número de acesso no GenBank: L19686, por este meio incorporado na sua totalidade aqui por referência) está localizado no cromossoma 22qll.2 (44). O gene tem 2167 bp de comprimento e tem 3 exões separados por 2 intrões de 189 bp e 95 bp. Foram utilizados quatro conjuntos de iniciadores para abranger todo o gene (tabela 1, a seguir). 12

Tabela 1: Sequências do iniciador e condições para PCR do gene Mif Conjunto PCR Locali zações do inicia dor Sequências do iniciador (5'-3 ') Temp de hibri dação (°C) Condições especiais Tamanho do produto de PCR Conjunto 1 MIF-F (-1074) MIF-R (-421) TGCAGGAACCAATACCCATAGG (SEQ. ID N°: 1) TGCGTGAGCTTGTGTGTTTGAG (SEQ. ID N°: 2) 58,1 654 bp Conjunto 2 MIF-F (-441) MIF-R ( + 4) T CAAACACACAAGC T CACGCA (SEQ. ID N°: 3) TGGTCCCGCCTTTTGTG (SEQ. ID N°: 4) 60,8 10% DMSO 445 bp Conjunto 3 MIF-F (-13) MIF-R (+395) CACAAAAGGCGGGACCACA (SEQ. ID N°: 5) ACTGCGAGGAAAGGGCG (SEQ. ID N°: 6) 62,3 25% 7-deaza GTP em 1,25 mM dNTP 408 bp Conjunto 4 MIF-F (+379) MIF-R (+1043) CGCCCTTTCCTCGCAGT (SEQ. ID N°: 7) TAGAATGGAAAGACAC TGGG (SEQ. ID N°: 8) 10% DMSO 665 bp A reação PCR consistiu em tampão II PCR lx (Perkin Elmer, CA, USA), 20 ng DNA, 1,5 mM MgCl2, 20 pmoles de cada iniciador direto e inverso e 0,5 unidades de polimerase Amplitaq Gold® (Perkin Elmer - Applied Biosystems, CA, USA) . O dNTP foi utilizado numa concentração de 0,2 mM exceto para o conjunto 3, em que o 0,2 mM dNTP tinha 0,05 mM de 7-deaza GTP numa reação PCR de 20 pL. As condições de PCR foram as seguintes: 95°C/12 min, seguido por 40 ciclos de 95°C/30 seg, temp. de hibridação (tabela 1)/30 seg, 72°C/60 seg e 72°C/10 min. Os produtos de PCR foram separados utilizando um gel agarose a 1% corado com brometo de etideo. 13

Os produtos de PCR de 6 controlos normais e de 6 doentes com artrite reumatóide foram sequenciados utilizando o kit de reação preparada para sequenciamento por ciclos Big Dye Terminator® (Perkin Elmer-Applied Biosystems). As sequências de todos os quatro conjuntos de iniciadores foram compilados de forma a representar todo o qene Mif e foram comparados para analisar diferenças entre o grupo com artrite reumatóide e os controlos normais.

Rastreio rápido para o polimorfismo de repetição CATT: 0 iniciador direto do conjunto 1 (SEQ. ID. N°: 1) foi utilizado com o iniciador inverso MIF-R -728 (5' AATGGTAAACTCGGGGAC - 3'; SEQ. ID N° : 9). 0 iniciador inverso foi marcado com substância fluorescente com TET para permitir a deteção dos produtos de PCR utilizando eletroforese capilar (45).

As condições de PCR foram tampão II PCR IX, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 0,75 pmoles de cada iniciador, 1 ng DNA, 0,05μ1 polimerase AmpliTaq Gold® numa reação PCR de lOpL. As condições dos ciclos de PCR utilizadas foram as mesmas que as descritas anteriormente exceto para as condições de hibridação de 53,8°C/30 seg. Foi adicionado 1 pL de produto de PCR diluído a 12 pL de formamida deionizada contendo 0,5 pL GS-500 TAMRA tamanho padrão (Perkin Elmer-Applied Biosystems). As amostras foram desnaturadas antes de serem separadas utilizando um analisador genético ABI 310 (Perkin Elmer-Applied Biosystems). As amostras de DNA de indivíduos homozigotos que tinham sido previamente totalmente sequenciados, foram utilizadas como controlos para os tamanhos da repetição obtidos por eletroforese capilar.

Clonagem do promotor MIF e ensaios repórter: DNA genómico obtido do primeiro rastreio, que continha o polimorfismo de 14 repetição do tetranucleótideo 5, 6, 7, ou 8-CATT, foi utilizado como um modelo para PCR para clonagem inicial no vetor pCR2.1-T0P0 (Invitrogen, CA, USA). Os seguintes iniciadores foram utilizados para gerar um produto PCR 1173 - 1189 bp representado 1071 - 1087 bp da região que flanqueia a montante a sequência que codifica MIF mais os primeiros 102 bp do exão I (ver FIG. 1):

Iniciador direto: 5'-CTCGAGCTGCAGGAACCAATACCCAT-3' (SEQ. ID N° : 10);

Iniciador inverso: 5'-AAGCTTGGCATGATGGCAGAAGGACC-3' (SEQ. ID N°: 12) .

Após completar a sequenciação, a região do promotor foi excisada do vetor pCR2.1 e clonada nos locais Xhol/HindIII do vetor luciferase pGL3-básico (Promega, WI, USA) . Este vetor contém o CDNA que codifica a versão modificada da luciferase do pirilampo na ausência do potenciador eucariótico ou elementos do promotor. Foram geradas construções luciferase reguladas diretamente pelo promotor MIF, contendo o polimorfismo 5, 6, 7, ou 8-CATT. Foram

realizadas transfeções transitórias utilizando 3 μΐ Fugene 6 (Roche, NJ, USA) e lpg de DNA por poço numa placa de seis poços consoante as indicações do fabricante. As linhas celulares utilizadas incluíram Cos-7 (fibroblastos do rim de macacos), A549 (epitélio do pulmão humano) e CCD-19LU (fibroblasto do pulmão humano primário). Os dados foram normalizados relativamente a um controlo interno de Renilla luciferase que foi regulado por um promotor da timidina quinase do vírus Herpes simplex (PRL-TK vector - Promega, WI, USA). Subsequentemente, cada transfeção era constituída por 800 ng de DNA teste (gene regulado por luciferase do promotor MIF) combinado com 200 ng de DNA do vetor de controlo PRL-TK. Os ensaios luciferase foram avaliados utilizando um luminómetro TD-20/20 (Turner Designs, CA, 15 USA) e o sistema repórter dual-luciferase (Promega, WI, USA). A atividade basal do promotor foi determinada medindo a atividade da luciferase 36 horas após a transfeção. Em alguns casos, as células foram estimuladas nas últimas 20 horas antes da medição da atividade do promotor.

Análise do genótipo e estatística: Os dados foram analisados utilizando o software Genotyper® 2.1 (Perkin Elmer-Applied Biosystems, CA, USA) . A relação entre os genótipos e o estado da doença (normal, ligeira ou severa) foi examinada utilizando o teste do qui-quadrado e o teste exato de Fisher. Os ensaios de gene repórter foram repetidos 3 a 10 vezes em duplicado. Os dados são apresentados como média ± STDEV e comparados por testes não-paramétricos U de Mann-Whitney. A significância foi definida como P < 0,05.

Resultados

Identificação de uma repetição do microssatélite no promotor Mif. O DNA genómico de seis voluntários normais e de seis doentes reumatóides foi utilizado para sequenciação total do gene Mif. Devido ao elevado conteúdo de GC deste gene, a análise foi realizada em quatro seções. O alinhamento de todas as doze sequências identificou um polimorfismo de repetição do tetranucleótideo CATT na região a montante do promotor na posição -817 (FIG. 1) . Foram descobertos indivíduos com alelos da repetição 5, 6, 7 ou 8-CATT nas suas sequências. Os indivíduos eram ou heterozigotos ou homozigotos para estes alelos, embora não tenham sido descobertos nenhuns homozigotos 7-CATT na população normal e nenhuns homozigotos 8-CATT em qualquer das populações estudadas. 16

Para rápido rastreio do polimorfismo do promotor, foi desenhado um iniciador inverso marcado com substância fluorescente que era proximal para as unidades de repetição do tetranucleótideo de forma a amplificar um fragmento de PCR mais pequeno (340-352 bp) . Este fragmento foi depois analisado utilizando eletroforese capilar num analisador genético ABI 310. O DNA de indivíduos previamente sequenciado foi utilizado como um modelo para gerar fragmentos de DNA controlo, de forma a correlacionar o tamanho do fragmento observado no analisador ABI 310 com o número de repetições de CATT nas amostras teste. Assim em conformidade, os tamanhos dos 4 produtos de PCR tinham 340, 344, 348, e 352 bp de comprimento, e estes correspondiam a cinco, seis, sete, e oito-CATT repetições, respetivamente. Os genótipos observados foram: 5,5; 5,6; 5,7; 6,6; 6,7; 7,7; 5,8; e 6,8. O genótipo 8,8 não foi observado nem nas populações normais (n=159) nem nas doentes (n=184); e o genótipo 7,7 não foi observado na população normal, mas foi observada num doente do grupo com artrite reumatóide.

Distribuição dos alelos Mif em controlos normais e doentes com artrite reumatóide. A distribuição dos diferentes alelos Mif em controlos normais, doentes com artrite reumatóide ligeira e com artrite reumatóide severa é apresentada na tabela 2, de seguida. 17

Tabela 2: Distribuição dos genótipos MIF e a frequência do alelo 5-CATT em populações normais e com artrite reumatóide (RA)

População Genótipo MIF Frequência do alelo 5-CATT 5,5 6,6 7,7 5,6 5,7 6,7 5,8 6,8 Alelos 5,5 ou 5,X Alelos X,X Normal (n=159) 8 (5,03%) 53 (33,33%) 0 61 (38,36¾) 10 (6,3¾) 25 (15,72%) (0,63%) 1 (0,63¾) 80 (50,31%) 79 (49,69%) Wichita RA ligeira (n=105) 10 (9,52¾) 49 (46,67%) 1 (0,95%) 23 (21,91%) 8 (7,62%) 14 (13,33%) 0 0 41 (39,05¾) 64 (60,95%) Wichita RA severa (n=79) 1 (1,27%) 40 (50,63%) 0 20 (25,31%) 4 (5,06¾) 13 (16,46%) 0 1 (1,27¾) 25 (31,65¾) 54 (68,35%) 18 Não houve desvio do equilíbrio Hardy-Weinberg nos controlos normais (p = 0,69). Foi descoberto que as frequências dos alelos 5, 6, 7 e 8 eram 0,277, 0,607, 0, 11 e 0,006 respetivamente. O número de indivíduos portadores de pelo menos um alelo 5-CATT diminui de 50,31 % na população normal para 31,65% na população com artrite reumatóide severa (Tabela 2). A diferença entre os doentes com artrite reumatóide severa e os controlos é estatisticamente significativa (p<0,02). Os casos e controlos analisados neste estudo não eram totalmente coincidentes para a origem geográfica e étnica, por isso os dados devem ser interpretados com alguma precaução. Por isso foi realizada uma comparação dos genótipos específicos entre as populações com artrite reumatóide ligeira e severa, como apresentado na Tabela 2. O genótipo 5,5 é observado em 9,5% dos doentes com artrite reumatóide ligeira, mas diminui significativamente para 1,3 % nos doentes com doença severa (p = 0, 0252 pelo teste exato de Fisher). Estes dados indicam que um alelo 5-CATT homozigoto é protetor relativamente ao desenvolvimento de doença severa.

Efeito do polimorfismo de repetição CATT na atividade do promotor MIF. Para investigar se o polimorfismo de repetição CATT estava associado com a regulação funcional da expressão de MIF, foi desenvolvido um ensaio de gene repórter e estudado sob condições definidas in vitro. Os ensaios de gene repórter têm sido largamente empregues para estudar a regulação da transcrição, ou como visualização para monitorizar o fator de transcrição (21,22). 19 A transfeção da construção luciferase regulada pelo promotor Mif em células Cos-7, células A549, e células CCD-19Lu foi associada com forte atividade basal do promotor, como indicado pela elevada produção de luciferase, em comparação com o vetor de controlo (pGL3-básico) (FIG. 2 e dados não apresentados). A atividade do promotor foi aumentada com forscolina (um indutor da síntese de CAMP 23) e estimulação através de soro (FIG. 3), assim como estimulação através de éster de forbol (dados não apresentados). Em geral, a atividade basal do promotor era elevada em cada uma das linhas celulares testadas quando comparadas com controlos negativos (vetor pGL3 vazio) e positivos (pRL-TK), e estes dados parecem estar correlacionados com o elevado nível da expressão da proteína MIF endógena que foi observado nestas linhas celulares (dados não apresentados) . De notar, em cada das linhas celulares testadas, a construção do promotor MIF da repetição 5-CATT apresentou atividade de transcrição significativamente mais baixa quando comparado com as construções do promotor das repetições 6, 7, ou 8-CATT.

Lista de referência

Os seguintes documentos são citados por número em parênteses na descrição anterior.

Listagem da sequência <110> Cytokine PharmaSciences, Inc. <120> Polimorfismo do promotor (MIF) do fator de inibição da migração de macrófagos na doença inflamatória <130> EPP90368 <140> US 10/323,656 <141> 2002-12-20 20 <150> US 60/341,832 <151> 2001-12-21 <160> 11 <170> FastSEQ para versão Windows 4.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> <220> Sequência artificial <223> Iniciador <400> 1 tgcaggaacc aatacccata gg 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> <220> Sequência artificial <223> Iniciador <400> 2 tgcgtgagct tgtgtgtttg ag 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> <220> Sequência artificial <223> Iniciador <400> 3 tcaaacacac aagctcacgc a 21 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> <220> Sequência artificial <223> Iniciador <400> 4 21 tggtcccgcc ttttgtg 17 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> <220> Sequência artificial <223> Iniciador <400> 5 cacaaaaggc gggaccaca 19 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> <220> Sequência artificial <223> Iniciador <400> 6 actgcgagga aagggcg 17 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> <220> Sequência artificial <223> Iniciador <400> 7 cgccctttcc tcgcagt 17 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> <220> Sequência artificial <223> Iniciador <400> 8 tagaatggaa agacactggg 20 <210> 9 <211> 18 22 <212> DNA <213> <220> Sequência artificial <223> primer <400> 9 aatggtaaac tcggggag 18 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> <220> Artificial Sequence <223> Iniciador <400> 10 ctcgagctgc aggaaccaat acccat 26 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> <220> Sequência artificial <223> Iniciador <400> 11 aagcttggca tgatggcaga aggacc 26 Lisboa, 24 de Julho de 2013.

Claims (4)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método de diagnóstico in vitro da ocorrência de, ou da predisposição para artrite reumatóide, compreendendo a deteção das unidades de repetição dos tetranucleótideos 5, 6, 7 ou 8 CATT entre as posições -817 e -785 do gene MIF humano, com a utilização do conjunto de iniciadores de amplificação com a SEQ ID N° : 1 e SEQ ID N°:2, ou SEQ ID N°:l e SEQ ID N°:9, ou SEQ ID N° : 1 e SEQ ID N° : 4, ou SEQ ID N°: 1 e SEQ ID N°: 6, ou SEQ ID N°:l e SEQ ID N°: 8, ou SEQ ID N°:10 e SEQ ID N°:12, em que a presença de uma unidade de repetição do tetranucleótideo 5,5 CATT homozigota indica a ocorrência de, ou a predisposição para, baixa gravidade da doença, e em que a ausência de uma unidade de repetição do tetranucleótideo 5,5 CATT homozigota indica a ocorrência de, ou a predisposição para, severa gravidade da doença.

2. Um método de rastreio in vitro da gravidade da artrite reumatóide, compreendendo a deteção da presença ou ausência de uma unidade de repetição do tetranucleótideo 5,5 CATT homozigota entre as posições -817 e -785 do gene MIF humano, com a utilização do conjunto de iniciadores de amplificação com a SEQ ID N° : 1 e SEQ ID N°:2, ou SEQ ID N°:l e SEQ ID N°:9, ou SEQ ID N° : 1 e SEQ ID N° : 4, ou SEQ ID N° : 1 e SEQ ID N°: 6, ou SEQ ID N°:l e SEQ ID N°: 8, ou SEQ ID N°:10 e SEQ ID N°:12, em que a presença de uma unidade de repetição do tetranucleótideo 5,5 CATT homozigota está associado com um menor risco de artrite severa, e em que a ausência de uma unidade de repetição do 2 tetranucleótideo 5,5 CATT homozigota está associada com um maior risco de artrite severa.

3. Utilização de um conjunto de iniciadores para amplificar uma região do promotor MIF humano, na qual o tetranucleótideo CATT na posição -817 está repetido cinco vezes, seis vezes, sete vezes ou oito vezes.

4. Utilização de acordo com a reivindicação 3, em que um dos seguintes conjuntos de iniciadores é utilizado: SEQ ID N° : 1 e SEQ ID N°:2, ou SEQ ID N°:l e SEQ ID N°:9, ou SEQ ID N°:l e SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 1 e SEQ ID N°: 6, ou SEQ ID N°:l e SEQ ID N°: 8, ou SEQ ID N° :10 e SEQ ID N°:12. Lisboa, 24 de Julho de 2013.