PT1419239E - Níveis de substância inibidora mülleriana e resposta ovárica - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"NÍVEIS DE SUBSTÂNCIA INIBIDORA MULLERIANA E RESPOSTA OVÁRICA"

INTERESSE GOVERNAMENTAL A presente invenção foi parcialmente financiada pela subvenção número AG15425 dos Institutos Nacionais de Saúde [National Institutes of Health] . Por conseguinte o Governo poderá deter determinados direitos relativos à presente invenção.

REFERENCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS 0 presente pedido de utilidade reivindica prioridade relativamente ao pedido de patente U.S. com o número de série 60/313,545, depositado a 20 de Agosto, 2001.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao campo da tecnologia reprodutiva, da biologia desenvolvimental e molecular e da avaliação do estado reprodutivo da mulher. Mais particularmente, a presente invenção providencia novos métodos para a previsão e para a monitorização da resposta da mulher a tratamentos de fertilização.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Ao longo do presente pedido ou no final da presente especificação é feita referência a diversas publicações ou patentes para descrever o estado da técnica ao qual a presente invenção pertence. A infertilidade é uma doença que resulta no funcionamento anormal do sistema reprodutivo humano. É definido como a 2 incapacidade de conceber decorrido um ano de relações sexuais desprotegidas ou a incapacidade de levar a cabo uma gravidez de um nado-vivo. De acordo com os Centros de Controlo de Doenças [Centers for Disease Control] (CDC), 2.1 milhões de casais casados sofrem de infertilidade ou de outras condições que impedem a sua capacidade para ter filhos e aproximadamente 6.1 milhões de mulheres em idade de ter filhos nos Estados Unidos são inférteis. A fertilidade feminina começa a entrar em declinio muitos anos antes do inicio da menopausa apesar dos ciclos ovulatórios regulares contínuos. Contudo não existe uma definição precisa para a idade reprodutiva avançada nas mulheres, sendo que a infertilidade é mais prevalente após os 35 anos. Devido ao aumento da idade média das gestantes nos últimos trinta anos considerando que mais mulheres seguiram estudos superiores e carreiras, um número sem precedentes de mulheres terá atingido os anos reprodutivos avançados na altura em que estiver preparado para constituir família. Por conseguinte, muitas irão necessitar da assistência de tratamentos de fertilização para conceber uma criança. Com pacientes dispostas a pagar milhares de dólares em tratamentos para realizar o desejo de constituir família, a infertilidade transformou-se numa indústria de $2 mil milhões anuais nos E.U.A..

Com excepção da doação de oócitos, todos os tratamentos de fertilização actualmente disponíveis para mulheres incapazes de conceber naturalmente dependem da reserva ovárica da mulher. A designação "reserva ovárica" refere-se à produção actual do número de folículos ováricos e à qualidade dos oócitos da mulher e está estreitamente associada ao potencial reprodutivo. Em geral, quanto maior 3 é o número de óvulos restantes, maior é a probabilidade de concepção. Ao contrário, uma reserva ovárica pequena diminui drasticamente as probabilidades de concepção da paciente. À medida que a mulher vai envelhecendo, a respectiva produção de óvulos vai diminuindo gradualmente ao longo do tempo até que os óvulos se esgotam na menopausa. Até mesmo antes de nascer, os óvulos produzidos pela mulher diminuem em número. A grande maioria dos oócitos perde-se após o quinto mês da vida intra-uterina, altura em que é registado um máximo de aproximadamente sete milhões de óvulos. À nascença, ambos os ovários contêm aproximadamente um milhão de foliculos primordiais. A vida reprodutiva inicia-se com aproximadamente 0.5 milhões de foliculos primordiais durante a menarca. Posteriormente tem lugar a perda de foliculos com um número fixo de aproximadamente 1000 por mês, acelerando após os 35 anos de idade. O número de óvulos continua a diminuir à medida que a mulher vai envelhecendo até que não restam óvulos na altura da menopausa. O aspecto mais significativo de uma reserva ovárica diminuta, e associado à diminuição do potencial reprodutivo, é que o respectivo início é muito variável. A função ovárica é única em cada indivíduo, quer quanto ao número de anos do desempenho reprodutivo de pico quer quanto ao início e à progressão da respectiva diminuição. Algumas mulheres com ciclos menstruais normais terão dificuldade em conceber no final dos vinte anos ou no início dos trinta anos. Devido à elevada variabilidade individual do estado ovárico, é de uma importância vital para os clínicos avaliar a reserva ovárica de um paciente infértil. De facto, a avaliação da reserva ovárica de uma mulher é um dos factores mais críticos na avaliação da 4 infertilidade em pacientes de qualquer idade. As mulheres com uma reserva ovárica diminuta experienciam menos respostas à indução de ovulação, requerem maiores dosagens de gonadotrofina, apresentam taxas mais elevadas de ciclos de FIV (Fertilização In Vitro) cancelados, e experienciam menores taxas de gravidez através de FIV.

Os métodos de avaliação da reserva ovárica actualmente existentes podem ser classificados em testes passivos e em testes dinâmicos. 0 objectivo de ambas as abordagens é o de fornecer informação relativamente à qualidade e à quantidade de oócitos de modo a avaliar se uma mulher é candidata a um tipo especifico de tratamento de infertilidade. 0 teste padrão passivo da reserva ovárica consiste na medição do nivel sérico de FSH basal e de estradiol no 3.° dia do ciclo menstrual. Numa fase folicular inicial um nivel de FSH de menos de 10 mlU/ml e um nivel de estradiol de menos de 80 pg/ml tipicamente são considerados indicadores de uma reserva ovárica normal, embora tenham sido registados valores minimos de FSH tão elevados como 20 a 25 mlU/ml devido ao uso de diferentes padrões de referência na análise do FSH. É difícil estabelecer valores absolutos que definam o quão elevado os niveis de FSH podem ser devido às variações nas avaliações laboratoriais e nos métodos de tratamento. Além disso, as mulheres com valores de referência normais podem ter diminuído as reservas e no momento de uma elevação do nível de FSH é evidente que poderá ser tarde demais para conseguir engravidar ou sujeitar-se a um tratamento de fertilização. Algumas mulheres com um FSH normal podem estar completamente alheias ao facto de a respectiva reserva ovárica estar a diminuir rapidamente e são conduzidas a um falso sentimento de segurança no que 5 respeita aos respectivos projectos de constituir familia. Outros testes passivos da reserva ovárica estão sob investigação mas ainda não foram recomendados para o uso clínico rotineiro devido aos dados limitados relativamente ao respectivo valor prognóstico. Ao contrário das medições estatísticas da reserva ovárica, o teste do desafio com citrato de clomifeno (CCCT [clomiphene citrate challenge test]) é uma abordagem dinâmica. 0 referido teste tem como propósito estimular o ovário a iniciar a produção de óvulos em resposta ao fármaco de fertilização clomifeno. Embora o teste do desafio com citrato de clomifeno geralmente seja considerado como mais exacto do que o teste do nível sérico de FSH basal, nenhum dos testes actualmente disponíveis demonstrou reflectir com exactidão o estado da reserva ovárica.

Fallat M. et al., Fertility and Sterility, Maio 1997, vol. 67, n.°5, págs. 962-965, descrevem que os níveis séricos de MIS são obtidos no momento em que a recuperação de oócitos, ou seja, após o tratamento agonista da hormona libertadora de gonadotrofina, ter sido iniciado. Contudo, não é possível prever a resposta de uma mulher a um tratamento de infertilidade com o método descrito no referido documento.

Considerando o que acima foi dito, torna-se evidente que existe uma necessidade de métodos mais exactos e fiáveis para a previsão e monitorização da resposta da mulher ao tratamento da infertilidade. Além disso, um novo método que prevenisse o esgotamento da reserva ovárica seria altamente desejável no campo da tecnologia reprodutiva.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS 6 A figura 1 apresenta a comparação de grupos de mulheres com ^6 contra >11 oócitos recuperados. As mulheres de ambos os grupos apresentavam idades semelhantes e os respectivos valores de FSH no 3.° dia não divergiam significativamente. Contudo, os valores do nível sérico da substância inibidora mulleriana (MIS) das mulheres do grupo com >11 oócitos eram 2.5 vezes mais elevados do que aqueles do grupo de mulheres das quais eram recuperados menos de 6 oócitos. Assim, os níveis séricos de MIS estão positivamente correlacionados com o número de oócitos maduros produzidos e constituem um marcador significativo da reserva ovárica. A figura 2 apresenta o nível sérico de FSH, estradiol e MIS no 3.0 dia enquanto função do número de oócitos maduros recuperados. Os valores p confirmam o significado das referidas relações e demonstram que a correlação mais elevada com o número de oócitos é a concentração sérica de MIS .

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Actualmente, existe uma grande necessidade de marcadores séricos que reflictam com exactidão o estado da reserva ovárica da mulher. Os indicadores séricos contemporâneos da reserva ovárica incluem uma combinação de hormonas directas (FSH) e de uma variedade de hormonas indirectas tais como o estradiol (E2) ou a inibina B (Sharara e al., Am J. Obstet. Gynecol. 1998; 179: 804-812). Numa fase folicular inicial o nível sérico de FSH reflecte a actividade de uma mistura de hormonas ováricas (E2, inibinas, activinas, follistatinas) que respondem ao hipotálamo e à pituitária. O estradiol é predominantemente segregado por células granulosas nos folículos pré-antrais e antrais. A inibina B é directamente segregada da granulosa nos folículos antrais pequenos. A 7 inibina A é um produto de células granulosas luteínizadas do folículo dominante e do corpo lúteo e influencia o nível sérico de FSH folicular inicial através da respectiva presença durante a transição lútea-folicular. Assim aparentemente uma desvantagem adicional dos marcadores dos níveis séricos actualmente utilizados ao nível clínico é que predominantemente são um reflexo do folículo dependente de FSH em desenvolvimento à medida que progride do respectivo estado antral inicial para o estado pré-ovulatório. Além de apresentar dificuldades em estabelecer valores clinicamente relevantes e reduzir as variações laboratoriais, os marcadores séricos actualmente disponíveis baseados no desenvolvimento do folículo dominante dependente de FSH têm um valor limitado na avaliação de reservas foliculares ováricas que não estão em crescimento.

Uma avaliação mais exacta da reserva ovárica envolve necessariamente a determinação do número de folículos primordiais independentes de FSH, restantes. Os folículos primordiais restantes continuamente entram no pool folicular crescente no ovário ao longo da vida. Estudos com animais revelaram que a perda de folículos está inversamente relacionada com o número de folículos primordiais presentes nos ovários (Hirshfield A. N., Biol. Reprod. 1994; 50: 421-428). Uma vez estimulados para crescer, os folículos ou podem alcançar a maturidade e ovular ou podem tornar-se atrésicos. Estima-se que intervalo de tempo estimado para o desenvolvimento entre o estádio antral inicial e os folículos pré-ovulatórios leva aproximadamente três meses. Para determinar a possibilidade de concepção de uma criança de uma mulher num intervalo de tempo de um tratamento de fertilização típico (meses a anos), por isso é mais importante obter uma estimativa fiável do tamanho do pool dos respectivos foliculos primordiais, em oposição à avaliação do número reduzido de foliculos que rapidamente se aproximam da maturidade e serão perdidos durante os processos subjacentes à ovulação no ciclo menstrual corrente. A substância inibidora mulleriana (MIS) é um componente de fluido folicular produzido por células granulosas (Vigier et al., Endocrinology, 1984; 114: 1315-20; Takashi et al., Biol. Reprod., 1986 ; 35: 447-53; Bezard et al., J. Reprod. Fértil., 1987; 80: 509-16; Rajpert-De Metys et al., J. Clin. Endocrinol. Metab 1999; 84: 3836-44) e está presente no soro humano desde o inicio da adolescência até à idade adulta mas desaparece durante a menopausa (Hudson et al., J Clin Endocrinol Metab 1990; 70: 16-22; Josso et al., J Endocrinol Metab 1990; 70: 23-7; Lee et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 1996; 81: 571-6). Tanto o ADN como as sequências proteicas de MIS são bem conhecidas no estado da técnica (Lee e Donahoe, Endocrine Reviews 1993; 14(5): 152-164; Cate et al., Cell, 1986; 45: 685-689). Os níveis de MIS variam ligeiramente com o ciclo menstrual (Cook et al., Fértil Steril 2000; 73: 859-61), alcançando um máximo no final da fase folicular.

Os níveis de fluido folicular de MIS de mulheres submetidas a recuperação para a fertilização in vitro foram medidos demonstrando a respectiva presença nos foliculos pré-ovulatórios de mulheres superovuladas (Seifer et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 1993; 76: 711-4). O receptor de MIS do tipo II é expresso em células granulosas de roedores (di Clemente et al., Mol Endocrinol 1994; 8: 1006—8; Baarends et al., Endocrinology 1995; 136: 4951-62; Teixeira 9 et al., Endocrinology 1996; 137: 160-5), e a MIS parece actuar de um modo paracrínico para regular as células granulosas e a função dos oócitos (Takashi et al., Mol Cell Endocrinol 1986; 47: 225-34; Kim et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 1992; 75: 911-7; Seifer et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 1993; 76: 711-4). Um estudo recente com ratos knockout MIS demonstrou que as fêmeas com zero MIS e aquelas heterozigóticas para a mutação com zero MIS apresentavam um esgotamento relativamente precoce do respectivo pool de foliculos primordiais (Durlinger et al., Endocrinology 1999; 140: 5789-96). O referido trabalho sustenta o papel da MIS enquanto reguladora do recrutamento folicular primordial, implicando que a segregação de MIS reflecte o tamanho do pool primordial. Um marcador sérico que é indicativo do pool primordial de foliculos independentes de FSH que não crescem antes da iniciação seria muito útil na previsão de uma eventual resposta ovárica aos medicamentos da indução de ovulação utilizados na preparação de um ciclo de técnicas de reprodução assistida.

Em conformidade, a presente invenção providencia novos métodos in vitro para a previsão da resposta ovárica numa amostra de uma mulher submetida a uma indução de ovulação como parte integrante de um ciclo de técnicas de reprodução assistida. Os métodos de acordo com a presente invenção permitem ao clinico prever com exactidão quais as mulheres que serão boas respondedoras e quais as mulheres que serão más respondedoras aos tratamentos de infertilidade actualmente disponíveis. Além disso, a presente invenção providencia métodos in vitro para a monitorização da resposta ovárica de mulheres durante tratamentos de infertilidade. Isto permitirá um planeamento e um timing 10 mais exactos para a recuperação de oócitos, resultando em menos ciclos cancelados e reduzindo significativamente os custos financeiros e emocionais dos tratamentos de fertilização. Considerando que em média um ciclo de fertilização in vitro custa entre $10,000 e $17,000, os métodos de acordo com a presente invenção conduzirão a uma redução substancial dos custos para as pacientes e as seguradoras. Não menos importante, a presente invenção providencia igualmente métodos in vitro para a previsão, monitorização e prevenção da síndrome da hiperestimulação ovárica. A sindrome da hiperestimulação ovárica (OHSS) caracteriza-se por um grupo de perturbações que podem oscilar desde sintomas ligeiros a graves e potencialmente fatais. A OHSS frequentemente inclui dores pélvicas agudas, distensão abdominal, alargamento ovárico, ascites com hemoconcentração, efusão pleural ou pericárdica, ou ambas, insuficiência renal, oligúria, hipercalcemia, e hipercoagulação. Mais frequentemente está associado à administração de gonadotrofinas exógenas. Os métodos de acordo com a presente invenção permitem ao clínico prevenir a síndrome de hiperestimulação ovárica, através da eliminação da administração de hCG. Assim, medindo os níveis de MIS, o clínico pode tomar uma decisão informada relativamente à administração de hCG devido ao risco de hiperestimulação ovárica. Outra medida na prevenção da síndrome de hiperestimulação ovárica é o congelamento dos embriões em vez da transferência de volta para o paciente, um processo designado por criopreservação. Através dos métodos de acordo com a presente invenção, podem ser identificadas situações em que, a gravidez deverá ser adiada e os níveis de hCG mantidos a um mínimo até que o risco de hiperestimulação ovárica por excesso de hCG tenha passado. 11

Os métodos de prevenção do esgotamento das reservas de folículos ováricos e os métodos para a estimulação do desenvolvimento de folículos, que tratam a infertilidade na mulher, serão mais detalhadamente descritos.

Os métodos de acordo com a presente invenção podem ser aplicados para obter resultados que prevêem respostas boas, sub-óptimas ou fracas a tratamentos de fertilização. Os métodos são altamente úteis para aplicação clínica enquanto guia para a determinação da dose óptima de fármaco de fertilização para mulheres submetidas a tratamentos de fertilização in vitro (FIV). As clínicas de FIV habitualmente baseiam-se na idade do paciente como único indicador para a especificação da quantidade de fármacos de fertilização a ser administrada. Contudo, a idade, constitui um indicador inespecífico e não fiável da resposta ovárica e a presente invenção representa uma melhoria significativa em relação às ferramentas de diagnóstico actualmente disponíveis. Os métodos de acordo com a presente invenção podem ser aplicados a todas as pacientes antes da respectiva submissão a um tratamento de FIV para identificar respondedores fracos e por conseguinte reduzir a taxa de cancelamento bem como para identificar respondedores excessivos e por conseguinte reduzir o risco de hiperestimulação. Deste modo a presente invenção permite ajustes ao regime de estimulação ovárica para compensar uma reserva ovárica diminuta em mulheres identificadas como respondedoras sub-óptimas. 0 presente documento descreve um método de correlacionar os níveis séricos de MIS com a reserva ovárica. A correlação entre os níveis de MIS e a reserva ovárica pode ser obtida 12 pela determinação do número de oócitos recuperados de um sujeito particular e pela determinação do nível sérico de MIS desse sujeito bem como pela escolha de uma representação gráfica para os dados obtidos. As ferramentas para a análise e para a representação eficaz e eficiente de dados são bem conhecidos no estado da técnica. As referidas ferramentas incluem a recorrência à estatística para analisar os dados e estimar erros e a recorrência a computadores para implementar as referidas técnicas e outros métodos de análise. Além disso, a representação gráfica dos dados e das funções pode recorrer à utilização de tabelas, gráficos e outros diagramas bem como a programas de computador para realizar cálculos e produzir os referidos gráficos, diagramas e tabelas. 0 presente documento descreve igualmente um método de avaliação da reserva ovárica numa mulher que procura um tratamento de fertilização através da determinação do nível sérico de Mis na mulher e da comparação do nível determinado com os dados que correlacionam o nível sérico de MIS com o número de oócitos maduros recuperados. Uma representação exemplificativa de dados que correlacionam os níveis séricos de MIS com o número de oócitos maduros recuperados é o gráfico apresentado na figura 2. Determinando o nível sérico de MIS e o respectivo valor de recuperação de oócitos correlacionado, a reserva ovárica da mulher pode ser fiavelmente avaliada podendo ser seleccionado um protocolo de tratamento de fertilização apropriado.

0 presente documento descreve igualmente um kit de diagnóstico para a determinação da reserva ovárica de uma mulher através da medição do respectivo nível sérico de MIS 13 e da correlação do nível de MIS obtido com o valor empírico dos oócitos maduros recuperados através da recorrência a dados estatísticos tais como aqueles apresentados na figura 2. A medição do nível sérico de MIS pode ser realizada através da recorrência a anticorpos monoclonais ou policlonais específicos para a MIS e pode incluir a identificação de reagentes para os anticorpos específicos da MIS. Adicionalmente, o receptor de MIS e os respectivos péptidos derivados podem ser utilizados para detectar os níveis de MIS. 0 kit pode igualmente incluir instruções para a respectiva utilização.

Outra forma de realização preferida é um método in vitro para a previsão da resposta ovárica de uma mulher em resposta à indução de ovulação através da determinação do respectivo nível sérico de MIS numa amostra obtida da referida mulher e da comparação do nível sérico de MIS determinado com um nível padrão que correlaciona o nível sérico de MIS com o número de oócitos obtidos após a indução de ovulação; deste modo determinando a resposta ovárica à indução de ovulação. Além disso é descrito um kit para a previsão da resposta ovárica à indução de ovulação. 0 referido kit inclui reagentes tais como anticorpos monoclonais e policlonais específicos para a MIS e a identificação de substâncias para a determinação de um nível sérico de MIS, bem como um gráfico para correlacionar qualquer nível sérico de MIS particular com o número de oócitos maduros passíveis de serem recuperados. Adicionalmente o kit poderá ainda compreender instruções para a respectiva utilização e para a interpretação dos dados obtidos. 14

Na presente invenção é contemplado um método para a medição dos níveis séricos de MIS num sujeito feminino enquanto indicador prognóstico da resposta ovárica à hiperestimulação. 0 referido método pode implicar a utilização de anticorpos monoclonais e/ou policlonais de MIS enquanto reagentes diagnósticos para a medição dos níveis fisiológicos de MIS como indicador prognóstico da quantidade de oócitos e, mais importante, da qualidade dos oócitos. Quanto mais elevada for a concentração de MIS endógeno produzido por um sujeito feminino, maior é o respectivo potencial reprodutivo inerente, considerando que níveis de MIS elevados estão positivamente correlacionados ao potencial reprodutivo. Vide figuras 1 e 2. 0 presente documento descreve igualmente um método de estimulação do desenvolvimento folicular numa mulher através da administração de MIS ao sujeito feminino. Para fins de administração clínica, a MIS pode ser combinada com um portador farmaceuticamente aceitável. 0 método de administração de MIS pode ser via parenteral ou qualquer outra via medicamente adequada. Na mulher humana média, apenas aproximadamente 400 folículos alcançam o estádio maduro pré-ovulatório e ovulam ao longo de uma vida. A vasta maioria dos folículos ao longo da vida de uma mulher são perdidos através de um processo designado por atresia com morte celular programada como mecanismo molecular subjacente em vez do respectivo crescimento e subsequente ovulação. Assim, a estimulação do crescimento folicular através da administração de MIS pode salvar uma determinada percentagem de folículos que de outro modo estariam destinados a ser submetidos à apoptose. A sobrevivência melhorada dos referidos folículos aumenta a reserva ovárica 15 de uma mulher e melhora as respectivas possibilidades de ser bem-sucedida num tratamento de fertilização. 0 presente documento descreve igualmente um método para a modificação das gonadotrofinas num sujeito feminino, que compreende a administração de MIS ao sujeito. A importância das gonadotrofinas e de diversos factores de crescimento para suprimir a apoptose tem sido objecto de investigações intensivas. Demonstrou-se que o FSH diminui a apoptose nas células granulosas obtidas de ratos hipofisectomizados e previne mudanças apoptóticas de foliculos pré-ovulatórios cultivados (Chun S. Y. et al., Endocrinology 1994; 135: 1845-1853). 0 presente documento descreve igualmente um método para a identificação de uma boa respondedora a tratamentos de infertilidade, que compreende a determinação do nível sérico de MIS num sujeito. Uma vantagem significativa providenciada pelo referido método é a capacidade de diferenciar entre mulheres que exibem níveis de FSH elevados que, aos olhos da prática actual, seriam desencorajadas de tentar tratamentos de fertilização. Assim, o referido método confere aos clínicos a capacidade de identificar potenciais respondedoras de entre sujeitos cujos valores de diagnóstico convencionais são sub-óptimos. 0 presente documento descreve igualmente um kit para a identificação da quantidade, a presença ou a ausência de MIS com o fim de monitorizar a utilização de medicamentos de indução de ovulação e de prever o respectivo resultado. 0 presente documento descreve igualmente um método para o tratamento da infertilidade in vivo utilizando MIS para 16 estimular o desenvolvimento folicular e por conseguinte a produção e a maturação de oócitos, que em último caso conduz a um aumento da fertilidade em sujeitos femininos. 0 receptor MIS do tipo II é expresso em células granulosas de roedores e a MIS parece actuar de um modo paracrinico para regular as células granulosas e a função dos oócitos. Devido à localização do receptor MIS, uma dose terapeuticamente eficaz de MIS preferencialmente ou é administrada directamente nos foliculos ováricos ou via parenteral numa outra parte do sujeito de modo que a MIS alcance o ovário.

Uma dose terapeuticamente eficaz de MIS para administração in vivo tipicamente é formulada com um portador farmaceuticamente aceitável, o que significa não tóxico para os destinatários nas dosagens e concentrações empregues e que seja compatível com os outros ingredientes da formulação. Por exemplo, a formulação não pode conter quaisquer substâncias que sejam conhecidas como deterioradoras da MIS. 0 portador pode conter aditivos tais como substâncias que realçam a isotonicidade e a estabilidade química. Os materiais aditivos podem conter tampões tais como fosfato, citrato, succinato, ácido acético e outros ácidos orgânicos ou respectivos sais; antioxidantes tais como ácido ascórbico; polipeptidos de baixo peso molecular (inferior a aproximadamente doze resíduos), proteínas, tais como soroalbumina, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, ácido glutâmico, ácido aspártico ou arginina; monosacarídeos, disacarídeos e outros carbohidratos incluindo celulose ou respectivos derivados, trealose, glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; álcoois de 17 açúcar tais como manitol ou sorbitol; contra-iões tais como sódio; e/ou agentes não iónicos de superfície tais como polissorbatos, poloxameres ou PEG. A preparação de MIS final pode ser um líquido ou um sólido liofilizado. A Mis, um derivado adequado ou um respectivo metabolito podem ser utilizados individualmente ou numa mistura com um ou mais agentes activos adicionais. A MIS e as respectivas composições terapêuticas discutidas no presente documento podem igualmente ser adequadamente administradas através de sistemas de libertação controlada, tais como matrizes poliméricas semi-permeáveis sob a forma de produtos formados, como microcápsulas. As matrizes de libertação controlada incluem polilácticos, copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato, poli(2-hidroxietil metacrilato), etileno vinil acetato ou poli-D-(-)-3-ácido hidroxibutírico. As composições de libertação controlada incluem igualmente compostos liposomicamente encapsulados. Preferencialmente os liposomas são de aproximadamente 200-800 angstrom do tipo unilamelar. A MIS a ser utilizada para administração terapêutica preferencialmente é estéril, o que pode ser alcançado através da filtragem com membranas de filtragem estéreis de aproximadamente 0.2 mícron de tamanho. As composições de MIS terapêuticas geralmente são colocadas num recipiente com um ponto de acesso estéril, por exemplo, um frasco de solução intravenosa com uma tampa furável com uma agulha de injecção hipodérmica. As formulações acima referidas são igualmente adequadas para utilização in vitro.

Geralmente a MIS é armazenada à unidade ou em recipientes multi-dose, por exemplo, ampolas ou frascos selados, 18 enquanto solução aquosa ou enquanto formulação liofilizada para reconstituição. Como exemplo de uma formulação liofilizada, são enchidos frascos de 10-mL com 5 mL de solução de MIS aquosa estéril-filtrada a 1% (w/v) e a mistura resultante é liofilizada. A dose terapeuticamente eficaz de MIS em termos gerais é de aproximadamente 0.01 pg/kg até aproximadamente 100 mg/kg por dia. Preferencialmente de 0.01 pg/kg a 1 pg/kg. Um clinico administra as formulações de MIS até ter sido alcançada uma dosagem que melhora a condição de infertilidade, considerando os factores habituais como a idade, o peso corporal, o estado de saúde e outros factores individuais do sujeito. O progresso da referida terapia é facilmente monitorizado através de análises convencionais. O presente documento descreve igualmente a importância da qualidade e da fertilidade dos oócitos. Os oócitos podem ser melhorados in vivo ou ex vivo. Os oócitos podem estar imaturos ou completamente desenvolvidos. Isto pode ser utilizado em sujeitos femininos humanos ou não humanos animais. Quando utilizado em sujeitos humanos, o método preferido é utilizado em sujeitos inférteis, que não conseguem conceber sem intervenção clínica, ou em sujeitos que podem não ser capazes de conceber sem intervenção clínica no futuro, tais como sujeitos que se preparam para ser submetidos a quimioterapia. Quando utilizado em sujeitos não humanos, o método preferencialmente é utilizado em animais em cativeiro e mais preferencialmente em espécies em vias de extinção.

Os métodos ex vivo primeiramente requerem a remoção dos oócitos, preferencialmente oócitos imaturos, de folículos 19 no ovário. Isto pode ser realizado por meio das técnicas convencionais, tais como os métodos que utilizam o ciclo natural ou a indução de ovulação, durante intervenções cirúrgicas tais como a ooforectomia, durante protocolos de hiperestimulação no contexto de um programa de FIV ou por meio de necropsia. No ciclo natural, o ultra-som ou a laparoscopia permitem a identificação de um ou mais foliculos em desenvolvimento na superfície ovárica aproximadamente a meio do ciclo. Os foliculos que se aproximam da ovulação estão distendidos e são consideravelmente translúcidos. Em seguida os foliculos são aspirados com uma agulha e um ou mais oócitos extraidos via transvaginal. Posteriormente os oócitos são avaliados em função do número e da densidade das células granulosas envolventes, da presença ou da ausência do primeiro corpúsculo polar e da espessura da zona pelúcida, bem como de outros factores. São igualmente descritos métodos para a melhoria da fertilidade de oócitos já em maturação incluindo oócitos de sujeitos estimulados com hormonas, de modo que os oócitos estão mais maduros do que os oócitos de ovários não estimulados. Os agentes utilizados para induzir uma maturação folicular múltipla controlada desta natureza incluem inibina administrada directamente ao ovário, citrato de clomifeno ou gonadotrofinas menopausais humanas ou uma mistura de FSH e lh e/ou de gonadotrofinas coriónicas humanas. Os referidos agentes de fertilização são administrados em doses terapeuticamente eficazes. Pode igualmente ser utilizado um agonista ou antagonista hormonal que liberta gonadotrofina conjuntamente com FSH. 20

Sob o referido aspecto após a extracção são administradas doses terapeuticamente eficazes de MIS ao oócito. Preferencialmente a MIS liga-se ao respectivo receptor nas células granulosas e/ou nos oócitos e estimula o crescimento e a maturação dos oócitos, originando oócitos maduros e saudáveis prontos para a fertilização. A MIS a ser administrada é administrada individualmente ou preferencialmente misturada com um portador farmacêutico. Quando o método é realizado in vivo, o sujeito preferencialmente produz um ou mais oócitos maduros, saudáveis que são amplificados para a fertilização. Quando o método é realizado in vitro, o oócito é amadurecido e fertilizado com esperma no momento apropriado. Quando o embrião resultante atinge o estádio de célula 4-8 ou enquanto blastocisto, preferencialmente é implantado no portador e desenvolve-se até ao nascimento.

DEFINIÇÕES

Existem diversos termos que são utilizados na presente invenção ao longo da especificação e das reivindicações.

Conforme utilizado no presente documento, "MIS" refere-se à substância inibidora miilleriana de qualquer espécie, incluindo a bovina, ovina, porcina, equina, aviária e, preferencialmente, a humana, na sequência nativa ou numa forma geneticamente modificada, de qualquer fonte, quer seja natural, sintética ou recombinantemente produzida. O termo "parenteral" refere-se à introdução do polipéptido por via intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, intraventricular, intracraniana, subcutânea, subdérmica, transvaginal, oral, nasal ou rectal. 21 "Dose terapeuticamente eficaz" é uma dose que produz os efeitos para os quais é administrada. "Paracrínico" é uma forma de assinalar se a célula-alvo está próxima da célula libertadora do sinal.

Conforme utilizado no presente documento o termo "oócito" refere-se ao gâmeta do folículo de um animal feminino. "Anticorpos" conforme utilizado no presente documento inclui anticorpos policlonais e monoclonais, quiméricos, de cadeia única e anticorpos humanizados, bem como fragmentos Fab, incluindo os produtos de um Fab ou outra expressão de imunoglobulina. "Anticorpos monoclonais" são populações homogéneas de anticorpos de um antigénio particular. Podem ser obtidos através de qualquer técnica que providencia a produção de moléculas de anticorpo por meio de linhas de células continuas numa cultura. Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos através dos métodos conhecidos dos peritos na técnica. Vide, por exemplo, Kohler, et al., Nature 256: 495-497, 1975, e U.S. Pat. N.° 4,376,110. "Anticorpos policlonais" são um grupo de anticorpos heterogéneos produzidos por B linfócitos diferentes em resposta ao mesmo antigénio, em que diferentes anticorpos no grupo reconhecem diferentes partes do antigénio. "Gonadatrofinas" são um grupo de glicoproteinas hormonais do lóbulo anterior da hipófise. Estimulam o crescimento das gónadas e a secreção de hormonas sexuais. Os exemplos de gonadotrofinas incluem, entre outras, substâncias como a 22 hormona de estimulação dos folículos (FSH), a hormona luteinizante (LH) e a gonadotrofina coriónica humana (hCG).

Os termos "padrão" e "nível padrão" no presente documento são utilizados para definir uma determinada concentração de MIS obtida através de diversas leituras, preferencialmente leituras de um número estatisticamente significativo conforme apresentado na figura 2. 0 padrão pode ser arbitrariamente fixado dependendo do grau de sucesso que a leitura acima ou abaixo do padrão pretende indicar.

EXEMPLOS

Os exemplos que se seguem são providenciados para explicar mais detalhadamente a invenção reivindicada e não devem ser interpretados como limitadores do âmbito da presente invenção. Na medida em que são mencionados materiais específicos, isto acontece meramente com a finalidade de ilustrar e não com a intenção de limitar a presente invenção.

Exemplo 1

As amostras de soro no dia 3 que tinham sido conservadas a -80°C entre Março de 1999 e Março de 2001 foram descongeladas e analisadas em lotes para MIS. Foi analisada uma amostra de cada uma de 107 mulheres que tinham tirado soro nos 2 meses em que foram submetidas a uma dessensibilização pituitária com acetato de leuprolida (Lupron; TAP Pharmaceuticals, North Chicago, IL) seguida da estimulação de gonadotrofina em preparação para a FIV. Os detalhes da estimulação foram semelhantes àqueles descritos numa publicação anterior (Seifer et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 1993; 76: 711-4). A estimulação com a hormona de estimulação dos folículos foi quase 23 exclusivamente utilizada para a estimulação de gonadotrofina. Ocasionalmente, o acetato de leuprolida era suspenso uma vez que as gonadotrofinas tinham sido iniciadas. Os dois grupos estudados consistiram de 28 amostras de mulheres com ^6 oócitos (gama, 1-6 oócitos) e de 79 amostras de mulheres com £11 oócitos (gama, 11-44 oócitos) recuperados.

Os critérios de selecção de ^6 e £11 oócitos recuperados foram arbitrariamente escolhidos numa tentativa de exacerbar potenciais diferenças fisiológicas entre grupos de mulheres com respostas ováricas diferentes. 0 soro das mulheres com FSH elevado (£10 1U/L) foi excluído numa tentativa de determinar se o MIS sérico no dia 3 podia ser associado ao número de oócitos recuperados numa gama "normal" de valores de FSH sérico no dia 3. Os folículos que mediam £18 mm de diâmetro foram aspirados mediante sedação da paciente 36 horas após a injecção de hCG. O referido estudo foi isento de aprovação do comité de avaliação institucional [institutional review board] considerando que as amostras de soro tinham sido conservadas como parte de um seguro de qualidade do laboratório e como tal eram consideradas ser material clinicamente inútil.

Exemplo 2

Substância Inibidora Míilleriana ELISA O ELISA utilizado para medir a MIS humana tem sido exaustivamente descrita (Hudson et al., J. Clin. Endorinol.

Metab. 1990; 70: 16-22; Lee et al., J. Clin. Endorinol. Metab. 1996; 81: 571-6). As amostras foram analisadas em duplicado em seis diluições em série; os resultados apresentados são a média de três diluições que caem na 24

porção linear da curva padrão, gerada utilizando o ajustamento de curva logístico de quatro parâmetros DeltaSoft II (BioMetallics, Inc., Princceton, NJ) . A sensibilidade da referida análise foi de 0.5 ng/mL; os coeficientes da intra- análise e da interanálise apresentaram uma variação de 9% e 15%, respectivamente. 0 ELISA de MIS não reconhece o LH, FSH, activina, inibina ou β-TGF e não reage de forma cruzada com a MIS bovina ou de roedores (Hudson et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 1990; 70: 16-22).

Exemplo 3

Análise estatística

Os valores séricos são expressos enquanto média ± erro padrão da média (SEM) em todos os casos. Um teste t ímpar realizado através do StatView (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA) foi utilizado para determinar se as diferenças entre os grupos comparados eram estatisticamente significativas. As diferenças com valores P ^.05 foram consideradas estatisticamente significativas. As correlações entre MIS sérico e FSH, E2, número de oócitos recuperados e número de oócitos maduros recuperados foram determinadas através da construção de ajustamentos de curva lineares dos dados representados em eixos lineares. Os declives das linhas resultantes foram testados relativamente a uma diferença estatisticamente significativa de zero obtendo os respectivos valores P das tabelas de valores críticos para os coeficientes de correlação correspondentes.

RESULTADOS A comparação das idades médias, FSH sérico no dia 3, E2, MIS, concentrações máximas E2 do ciclo de estimulação e do 25 número de oócitos entre mulheres com ^6 oócitos e aquelas com hll oócitos recuperados é resumida na figura 1. A idade média era similar entre grupos. Embora a média ± SEM do FSH sérico no dia 3 (5.9 1U/L ± 0.4 vs. 4.9 1U/L ± 0.2) e a média do E2 sérico no dia 3 (41 pg/mL ± 3 vs. 32 pg/mL ± 1) estatisticamente fossem significativamente diferentes (P = .01 e P = .003, respectivamente), as diferenças nos respectivos valores não foram clinicamente significativos. Os niveis de E2 máximos alcançados eram significativamente mais elevados no grupo do número de oócitos elevado (2,950 pg/mL ± 140 vs. 1,720 pg/mL ± 160; P < .0001). As concentrações de MIS médias foram de 1.0 ng/mL ± 0.4 vs. 2.5 ng/mL ± 0.3 ou uma concentração de MIS >2.5-vezes mais elevada (P = .006) entre grupos (figura 1). A correlação entre MIS sérico e outras medidas da função ovárica demonstrou relações inversas estatisticamente significativas entre MIS e E2 no dia 3 (r = -0.169, P ± .05) e FSH (r = -0.295, P ^ .005). Registaram-se correlações positivas estatisticamente significativas entre MIS e número de oócitos recuperados (r = 0.522, P ^ .001) e a concentração de E2 sérico máxima (r = 0.328, P < .001) obtidos durante a indução de ovulação.

Além disso, o MIS sérico no dia 3, mas não o E2 ou o FSH, foi positivamente correlacionado com o número de oócitos maduros finalmente recuperados (figura 2). Embora todas as correlações fossem estatisticamente significativas, a correlação de MIS (r = 0.48, P ^ .0005) foi consideravelmente mais forte do que a de qualquer dos outros marcadores da reserva ovárica (ou seja, E2 ou FSH) . 26

DISCUSSÃO A substância inibidora mulleriana é uma glicoproteína dimérica e membro da superfamília factor-β transformadora de crescimento dos factores de crescimento. É produzida pelas células granulosas ováricas (Vigier et ai., Endocrinology 1984; 114: 1315-20; Takashi et al., Biol. Reprod. 1986 ; 35: 447-53; Bezard et al., J. Reprod. Fértil. 1987; 80: 509-16; Rajpert-De Meyts et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 1999; 84: 3836-44) e está presente no soro humano desde o inicio da adolescência até à idade adulta mas desaparece na menopausa (Hudson et al., J Clin Endocrinol Metab 1990; 70: 16-22; Josso et al., J Endocrinol Metab 1990; 70: 23-7; McGee et al., Biol. Reprod. 2001; 64: 293-8). Foram medidos os níveis de fluido folicular da substância inibidora mulleriana de mulheres submetidas a recuperação para FIV, demonstrando a respectiva presença nos folículos pré-ovulatórios de mulheres superovuladas (Seifer et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 1993; 76: 711-4).

Pela primeira vez os dados demonstram uma associação entre MIS sérico da fase folicular inicial e o número de oócitos recuperados, apesar das concentrações de FSH sérico e de E2 no dia 3 serem clinicamente semelhantes. Mais especificamente, concentrações mais elevadas de MIS sérico foram associadas a um maior número de oócitos recuperados. Além disso, o MIS sérico no dia 3 foi associado ao número de oócitos recuperados e ao número de oócitos maduros apesar do chamado FSH sérico no dia 3 de ^ 10 lU/mL de gama normal. A concentração de MIS sérico pode reflectir o tamanho do pool folicular primordial e assim providenciar um marcador associado ao número antecipado de oócitos a serem recuperados após a estimulação ovárica controlada 27 para a FIV. Permanece por esclarecer quais são as contribuições relativas que o pool primordial e os folículos pré-antrais e antrais iniciais podem ter na determinação da concentração sérica de MIS no dia 3 do ciclo. Considerando que a expressão de MIS começa no terceiro trimestre de gestação (Rajpert-De Meyts et ai., J. Clin. Endocrinol. Metab. 1999; 84: 3836-44), na realidade muito antes de poder ser detectado no soro, parece que o MIS desempenha um papel significativo no desenvolvimento folicular inicial num momento muito anterior ao que se pensava dantes. Além disso, a expressão de MIS continua na maioria, se não em todos, os foliculos após o nascimento e muito antes dos efeitos da gonadotrofina.

Uma vez iniciados os ciclos ováricos, contudo, os niveis de MIS sérico variam ligeiramente de um valor básico estável (Cook et al., Fértil Steril 2000; 73: 859-61), presumivelmente como resultado da estimulação de um pequeno grupo de foliculos e da perda de produção de MIS à medida que se forma o corpo lúteo. Os niveis de MIS sérico na fase folicular inicial resultam do pool de foliculos que começou a produzir MIS no útero independentemente do eixo hipotalâmico-pituitário e por conseguinte podem ser considerados distintos de outros indicadores dependentes de gonadotrofina da reserva ovárica. O MIS sérico no dia 3 pode oferecer uma contribuição clinica ao conjunto dos marcadores séricos actualmente utilizados para avaliar a reserva ovárica. Um tal marcador do estado do pool primordial pode providenciar uma perspectiva única não disponível através dos marcadores séricos actuais nem directamente mensurável por ultra-som. Esta possibilidade é sustentada por dois relatórios 28 recentes que concluem que a MIS induz o crescimento folicular (Durlinger et al., Endocrinology 1999; 140: 5789-96; McGee et al., Biol. Reprod. 2001; 64: 293-8). São contemplados estudos adicionais que analisam as taxas de cancelamento e os resultados das gravidezes em populações de pacientes mais amplas.

Lisboa, 29 de Outubro de 2010

Claims (6)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método in vitro para a previsão da resposta ovárica em resposta à indução de ovulação num sujeito que necessita de uma indução de ovulação, compreendendo: a) a determinação de um nivel sérico de substância inibidora mulleriana (MIS) numa amostra obtida de um sujeito; b) a comparação do nivel sérico de MIS determinado com um padrão que correlaciona o nivel sérico de MIS com o número de oócitos obtidos após a indução de ovulação, e; c) a determinação da resposta ovárica esperada.

2. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que a resposta ovárica é prevista durante a indução de ovulação.

3. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que a resposta ovárica é prevista antes da indução de ovulação.

4. 0 método de acordo com a reivindicação 1 compreendendo adicionalmente a avaliação do risco de ocorrência da sindrome de hiperestimulação ovárica devido à indução de ovulação através da comparação do referido nível sérico de MIS com um nível padrão.

5. 0 método de acordo com a reivindicação 4, em que o risco de ocorrência da sindrome de hiperestimulação ovárica é avaliado durante a indução de ovulação.

6. 0 método de acordo com a reivindicação 4, em que o risco de ocorrência da sindrome de hiperestimulação ovárica é avaliado antes da indução de ovulação. Lisboa, 29 de Outubro de 2010