PT1224264E - Modificação de células imunogénicas - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO
MODIFICAÇÃO DE CÉLULAS IMUNOGÉNICAS
DOMINO TÉCNICO DO INVENTO
Este invento refere-se à modificação de células imunogénicas.
ANTECEDENTES
As células dendríticas (daqui para a frente referidas como "DC") são as únicas células que apresentam antigénio, ou apv, capazes de induzir respostas imunitárias primárias (Cella, et al. 1997. "Origin, Maturation and antigen presenting function of dendritic cells", Curr Opin Immunol 9:10; Banchereau, J. a R.M. Steinman 1998 "Dendritic cells and the control of immunity", Nature 391:245). Precursores das DC circulantes circulam para os tecidos em que residem como células de captura de antigénio imaturas com elevada actividade endocitica e fagocitica. A seguir à incorporação de antigénio, as DC migram para os órgãos linfóides secundários onde se tornam maduras e se tornam células que apresentam antigénio capazes de seleccionar e activar células T CD4+ específicas para antigénio naive. Isto permite a diversificação da resposta e a activação de efectores antigénio-específicos, tais como linfócitos T citotóxicos específicos para o antigénio (daqui para a frente referidos como "CTL") e células B assim como efectores não específicos tais como as células NK, macrófagos e eosinófilos (Sogn, J.A. 1998. "Tumor immunology: the glass is half full", Immunity 9: 757).
As DC têm sido utilizadas para provocar uma resposta imunológica contra tumores. A indução da imunidade ao tumor pode ser vista como um processo em três passos que inclui: 1) apresentação dos antigénios associados ao tumor; 2) selecção e activação das células T específicas para antigénios associados 1 ao tumor assim como dos efectores não específicos; 3) localização das células T específicas para o antigénio associados ao tumor no local do tumor; e 4) reconhecimento dos elementos de restrição conduzindo à eliminação das células de tumores. A patente U.S. No. 5.637.483 concedida a Dranoff et al. descreve um método através do qual células de tumores modificadas expressando citoquinas, tais como GM-CSF e IL-2 são irradiadas ou a sua proliferação é tornada incapaz e então são administradas a um doente para actuar como um estimulador ou supressor do sistema imunológico sistémico de um doente. Experiências com ratos demonstraram o desenvolvimento de respostas antitumorais, quer protectoras quer terapêuticas induzidas pelas DC carregadas com antigénios associados ao tumor (Bell, et al. 1999. "Dendritic cells", Adv Immunol. 72:255). Para além disso, ensaios clínicos piloto em seres humanos mostram a exequibilidade da administração das DC e a capacidade das DC carregadas com péptido de induzirem respostas das células T específicas para os péptidos em doentes com linfomas, melanoma maligno e carcinoma da próstata (Mukherji, et al. 1995. "Induction of antigen-specific cytolitic T cells in situ in human melanoma by immunization with synthetic peptide-pulsed autologous antigen presenting cells", Proc Natl Acad Sei USA 92:8078; Hsu, et al. 1996. "Vaccination of patients with B-cell lymphoma using autologous antigen-pulsed dendritic-call-based vaccines", Câncer Immunol Immunother 46:82; Mestle, et al. 1998. "Vaccination of melanoma patients with peptide- or tumor lysate-pulsed dendritic cells", Nat Med 4:328; Tjoa, et al. 1998. "Evaluation of phase i/n clinicai trials in prostate câncer with dendritic cells and PSMA peptides", Prostate 36:39).
De modo a que as DC afectem o sistema imunitário as células devem possuir fragmentos de péptido processados para interagir com as células T ou serem "carregadas". Um dos desafios críticos para a utilização das DC como vectores de imunoterapia é a identificação de uma estratégia eficiente de carregamento de antigénio. Vários sistemas foram desenvolvidos para administrar 2 antigénios associados a tumores às DC, incluindo: 1) péptidos definidos de sequências conhecidas (Mayordomo, et al. 1995. "Bone Marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumor peptides elicit protective and therapeutic antitumor immunity", Nat Med 1:1297; Celluzzi, et al. 1996. "Peptide-pulsed dendritic celss induce antigen-specific CTL-mediated protective tumor immunity", J Exp Med 183:282); 2) péptidos eluídos com ácidos indefinidos de tumores autológos (Zitvogel, et al. 1996. "Therapy of murine tumors with tumor peptide-pulsed dendritic cells: dependence on T cells, B7 costimulation, and T helper cell 1-associated cytokines", J Exp Med 183:87); lisatos de tumor completo (Fields, et al. 1998. "Murine dendritic cells pulsed with whole tumor lysates mediate potent antitumor immune responses in vitro and in vivo", Proc Natl Acad Sei USA 95:9482); 4) vectores retrovirais e adenovirais (Song, et al. 1997. "Dendritic cells genetically modified with an adenovirus vector encoding the cDNA for a model antigen induce protective and therapeutic antitumor immunity", J Exp Med 186:1247; Specht, et al. 1997 "Dendritic cells retrovirally transduced with a
model antigen gene are therapeutically effective against established pulmonary metastases", J Exp Med 186:1213); 5) ARN derivado de células de tumores (Boczkowski, et al. 1996. "Dendritic cells pulsed with RNA are potent antigen-presenting cells in vitro and in vivo" J Exp Med 184:465); e 6) fusão das DC com células de tumores (Gong, et al. 1998. "Reversal of tolerance to human MUCI antigen in MUCI transgenic mice immunized with fusions of dendritic and carcinoma cells", Proc Natl Acad Sei USA 95:6279).
Embora todos os métodos para administrar antigénios associados a tumores descritos atrás induzam respostas das células T e provoquem efeitos antitumorais consideráveis, cada um tem desvantagens potenciais (Sogn, et al. 1998. "Tumor immunology: the glass is half full", Immnunity 9:757). Em primeiro lugar as estratégias à base de péptidos são limitadas por 1) conhecimento do haplotipo MHC de cada doente; 2) 3 conhecimento dos motivos de ligação MHC de classe I dos antigénios associados ao tumor; 2) variabilidade da afinidade de ligação ao MHC de classe I dos péptidos sintéticos; e 4) conhecimento de se, ou que vários péptidos definidos representam os antigénios associados ao tumor in vivo.
Ao contrário de uma aproximação com base em péptidos que requer informação acerca do haplotipo de MHC e da sequência de péptido, o tecido tumoral não fraccionado pode proporcionar epitopos de MHC de classe I e de MHC de Classe II sem identificar os antigénios associados a tumor. Estudos recentes demonstraram a capacidade das DC de incorporar células mortas ou a morrer e originar respostas de CTL secundários restringidos à MHC de classe I (Albert, et al. 1998. "Dendritic cells acquire antigen from apoptotic cells and induce class I-restricted CTLs", Nature 392:86; Albert, et al. 1998. "Tumor-specific killer cells in paraneoplastic cerebellar degeneration", Nat Med 4:1321). Estes estudos indicaram que 1) as DC carregadas com células mortas ou a morrer infectadas com o virus da gripe podem activar os linfócitos para aumentar as respostas de CTL específicos do virus; e 2) as DC que incorporam células de tumores mortas ou a morrer podem apresentar antigénios em relação a células T especificas para péptidos de antigénios associados ao tumor que são derivados de doentes com degeneração cerebelar paraneoplástica. Devido ao potencial das DC modificadas de contribuir positivamente para o tratamento de doenças humanas, é desejado um método simples para a sua produção. A patente US N°. 5.851.756 concedida a Steinman et al. descreve métodos através dos quais culturas proliferativas dos precursores de DC e DC maduras podem ser produzidos in vitro. Steinman et al. descreve a produção de antigénios dependentes das células T utilizando culturas de DC maduras, em que os antigénios são compreendidos por antigénios modificados por DC ou DC activadas por antigénio. Steinman et al. descreve ainda 4 que os antigénios modificados por DC ou DC activadas por antigénio podem ser utilizados como imunogénios em vacinas ou no tratamento de doenças infecciosas.
Os principais problemas na imunoterapia de tumores experimentados nos métodos apresentados atrás são o número limitado de antigénios associados a tumores bem definidos e a falta de evidência de que os antigénios associados a tumores conhecidos representem na verdade antigénios de rejeição in vivo. Para além disso, a utilização de péptidos de ligação a MHC de classe I está associada à restrição de HLA e ao limite das respostas imunitárias induzidas às células CD8+ T. Neste contexto, a utilização de material antigénico não fraccionado, sob a forma de células de tumores alogénicos mortas ou a morrer, que proporciona epitopos de MHC quer de classe I quer de classe II que conduzem a uma resposta imunológica diversificada envolvendo muitos clones das células T CD4+ e CTL, representa uma alternativa atractiva. 0 Pedido de Patente Internacional No. WO 99/42564 de Albert et al. descreve métodos directamente direccionados para o desenvolvimento de terapias para aumentar a imunidade do doente a infecções crónicas e tumores induzindo células de tumores ou infectadas a sofrer apoptose, tendo as células de tumores ou infectadas apóptoticas ganho acesso a células dendríticas em maturação, fagociticas e expondo as células dendriticas espoletadas por células apoptóticas expressando antigénio de interesse a células τ in vivo ou in vitro para a indução de respostas de antigénio especifico de células T.
Desenvolveu-se agora um método para modificar as DC imunogénicas. Aperfeiçou-se um processo utilizando células que apresentam antigénio humano imaturas, incluindo DC, obtidas de voluntários saudáveis e de doentes que podem capturar células alogénicas mortas ou a morrer e que subsequentemente apresentam os seus antigénios a células T autólogas, induzindo, deste modo, 5 a proliferação das células T CD4+ autólogas e as células τ CD8+. para além disso, ao utilizar os processo aqui descritos, verificou-se que as DC carregadas com células de tumores alogénicas podem activar as células T CD8+, gerar CTL específicos para antigénios expressos pelas células mortas ou a morrer e podem também reconhecer antigénios que são partilhados entre diferentes linhas de células de tumores. Ainda outra verificação foi a de que, ao utilizar o processo aqui descrito, as DC carregadas com linhas de células de tumores alogénicas mortas ou a morrer podem espoletar células T naives e induzir a sua diferenciação em relação ao antigénio específico dos CTL.
Num aspecto, o invento está direccionado para a indução de uma resposta imunológica de tumor específico citotóxica num doente que tenha um tumor utilizando células dendríticas que são preparadas in vitro co-incubando células dendríticas obtidas a partir do doente com células de tumores humanas apoptóticas alogénicas, para formar células dendríticas carregadas, em que as referidas células de tumores alogénicas possuem, pelo menos, um antigénio partilhado entre as células de tumores alogénicas e as referidas células de tumores do doente, e em que a referida resposta imunológica citotóxica está direccionada contra o referido antigénio tumoral partilhado. Desse modo, as células do doente por contacto com as células dendríticas carregadas evoluem para formar células citotóxicas expressando actividade citotóxica contra células de tumores provocando, deste modo, a rejeição do tumor. As células citotóxicas resultantes podem ser quer CD4 positivas quer CD8 positivas ou ambas. As células apoptóticas podem ser obtidas a partir de linhas de células alogénicas. A resposta imunológica específica ao tumor pode ser direccionada contra antigénios de tumores partilhados múltiplos.
Noutro aspecto, o invento é refere-se à indução de uma resposta imunológica específica para um tumor num doente que tenha um tumor utilizando células T citotóxicas que são preparadas in vitro através de co-incubação de células 6 dendríticas humanas com células de tumores humanas apoptóticas alogénicas para formar células dendríticas carregadas; e co-desenvolvimento em cultura das células dendríticas carregadas com células T naive humanas para formar células T citotóxicas, em que as referidas células de tumores alogénicas possuem, pelo menos, um antigénio partilhado entre as células de tumores alogénicas e as referidas células de tumores do doente, e em que a referida resposta imunológica citotóxica é direccionada contra o referido antigénio tumoral partilhado. As células citotóxicas resultantes podem ser células assassinas naturais ou células T assassinas naturais; estas podem ser quer CD4 positivas quer CD8 positivas ou ambas. As células apoptóticas podem ser obtidas a partir de linhas de células alogénicas. A resposta imunológica específica ao tumor pode ser direccionada contra antigénios de tumores partilhados múltiplos.
Ainda noutro aspecto o invento refere-se a um ensaio in vitro para determinar o grau de actividade citotóxica das células citotóxicas contra células de tumores de um doente compreendendo (a) a co-incubação de células dendríticas humanas com células de tumores alogénicas humanas apoptóticas possuindo antigénios para os quais é desejada resposta imunológica para formar células dendríticas carregadas; (b) co-desenvolvimento em cultura das referidas células dendríticas carregadas com células precursoras citotóxicas para formar células citotóxicas; (c) isolamento das referidas células citotóxicas; (d) incubação das referidas células citotóxicas com as referidas células de tumores do doente; e (e) monitorização da morte das referidas células de tumores do doente, em que o grau de morte de células de tumores é proporcional à actividade citotóxica das referidas células citotóxicas.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. lA-C mostra que as células DC imaturas capturam células de tumores mortas ou a morrer. Na Fig. IA, foi induzida 7 apoptose a células do carcinoma da próstata DU145 com anti-Fas (1 \iq/ml, CH-11, 16h), as geradas células mortas ou a morrer foram coradas com FITC-anexina V e PI. A percentagem de células mortas ou a morrer foi medida por citometria de fluxo. Na Fig. 1B, foi induzida apoptose às células de carcinoma da próstata DU145 com anti-Fas (1 μg/ml, CH-11, 16h); as geradas células mortas ou a morrer foram marcadas com 7-AAD e incubadas com DC imaturas marcadas com CDla-FlTC, durante 1 h, a 37°C. A captura de células mortas ou a morrer pelas DC foi quantificada por citometria de fluxo como a percentagem de DC CDla+ que se tornava positiva com 7AAD. A seguir a análise de dipersão/dispersão lateral de DC CDla+7-ADD+ (Rl) e DC CDla+7-ADD- (R2) revela o aspecto granular aumentado da população positiva dupla confirmando o envolvimento dos corpos de células pelas DC. Na Fig. 1C, as DC imaturas foram incubadas com células de tumores mortas ou a morrer geradas a partir das linhas de células de tumores indicadas, quer a 4°C quer a 37°C e a percentagem de células positivas duplas foi medida através do ensaio de citometria de fluxo. A Fig. 2A-2B mostra que as DC derivadas de monócitos (MDDC) de doentes com carcinoma da próstata capturam eficientemente corpos PrCa. Os corpos de células PrCa marcados com 7AAD foram co-incubados com DC derivadas de monócito marcadas com CDla de um doente com carcinoma na próstata (Fig. 2A) ou de voluntários saudáveis (Fig. 2B), durante lh, a 37°C. A incorporação foi avaliada por citometria de fluxo. A Fig. 3A-3D mostra que as DC imaturas carregadas com corpos de células de tumores induzem proliferação de células T CD4+ e CD8+ purificadas. As DC imaturas marcadas com CDla-FITC foram co-desenvolvidas em cultura com células de tumores mortas ou a morrer (Ap), durante 1 h, a 37°C e separadas com base na expressão de CDla. As células separadas foram co-desenvolvidas em cultura, durante 5 dias, com células τ CD4+ purificadas 8 autólogas (Fig. 3a) ou células τ CD8+ (5xl04 células/poço) (Fig. 3B) . Após 4 dias de incubação, timidina tritiada foi adicionada e a incorporação de timidina foi medida 16 h depois. As experiências que avaliam a proliferação das células T CD8+ foram realizadas na presença de CD40L (200 ng/ml) para induzir a maturação das DC e IL-2 (5U/ml) para aumentar a proliferação das células T. As DC imaturas marcadas com CDla-FITC foram co-desenvolvidas em cultura com células de tumores mortas ou a morrer (Ap), durante 1 h, a 37°C e separadas com base na expressão de CDla. As células separadas foram co-desenvolvidas em cultura durante 5 dias com células T CD4+ purificadas autólogas (Fig. 3C) ou células T CD8+ (5xl04 células/poço) (Fig. 3D) na presença de mAbs contra moléculas de MHC de classe I ou classe II antes do inicio das culturas e, subsequentemente durante todo o período das culturas. Após 4 dias de incubação, timidina tritiada foi adicionada e a incorporação de timidina foi medida 16 h depois. A Fig. 4A e 4B mostra as DC carregadas com CTL espoletadas por linhas de células de carcinoma da próstata mortas ou a morrer. As DC imaturas marcadas com CDla-FITC foram carregadas com corpos de células derivados de carcinoma da próstata DU145 (Fig. 4A) ou PC3 (Fig. 4B), durante 1 h, a 37°C, separadas com base na expressão de CDla e utilizadas como células estimuladoras. As culturas foram montadas numa placa de 24 poços plaqueando células estimuladoras quer com células T CD8+ purifiçadas autólogas quer com PBMC total. Ligando CD40 solúvel (Immunex Corp) foi adicionado para induzir maturação das DC. Após 7 dias de cultura, as células T foram recolhidas, lavadas e replacadas com células estimuladoras preparadas de fresco durante 7 dias adicionais. A actividade citotóxica das CTLs expandidas foi avaliada num ensaio corrente de libertação de 51Cr utilizando células sensibilizantes, células não sensibilizantes e K562 como alvos. A percentagem de citoxicidade foi medida como função de libertação espontânea e total. Os resultados são 9 representativos de três experiências e cada valor representa a médida de poços triplicados. A Fig. 5 mostra a ligação HLA-A2 de péptidos PSA, PSAl e PSA2. Células T2 foram incubadas com péptidos PSA durante a noite e então as células foram lavadas e coradas com mAB HLA-A2-especifico conjugado com FITC (HLA-A2,28). A regulação das moléculas HLA-A2 nas células T2 após ligação ao péptido foi demonstrada sob a forma de histogramas desviados. Os histogramas a cheio mostram a coloração de controlo do isotipo. A Fig. 6A e 6B mostra DC carregadas com CTL especifico de PSA induzido por LnCAP de linha de células de carcinoma da próstata mortas ou a morrer. DC imaturas marcadas com CDla-FITC geradas a partir de dadores de HLA-A2+ femininos (Fig. 6A) e masculinos (Fig. 6B) foram carregadas com corpos de células derivados de carcinoma da próstata (LnCAP), durante 1 h, a 37°C, separadas com base na expressão de CDla e utilizadas como células estimuladoras. As culturas foram montadas numa placa de 24 poços plaqueando células estimuladoras com células τ CD8+ purificadas autólogas. Ligando CD40 solúvel (Immunex Corp) foi adicionado para induzir maturação das DC. Após 7 dias de cultura, as células T foram recolhidas, lavadas e replacadas com células estimuladoras preparadas de fresco durante 7 dias adicionais. A actividade citotóxica das CTLs expandidas foi avaliada num ensaio corrente de libertação de 51Cr utilizando células sensibilizantes LnCAP, células T2 pulsadas com péptidos PSA assim como K562 NK-sensiveis como alvos. A percentagem de citoxicidade foi medida como função de libertação espontânea e total. Os resultados são representativos de três experiências e cada valor representa a média de poços triplicados. A Fig. 7A e 7B mostra que DC carregadas com células de melanoma mortas induzem a proliferação das células T. As DC não carregadas (UL-DC) e as DC carregadas (L-DC) são separadas e desenvolvidas em cultura com células T CD4+ (Fig. 7A) e CD8 + 10 (Fig. 7B) autólogas purificadas (com CD40L e IL2). Incorporação da timidina no dia 5. Representativo de duas experiências.
As Fig 8A e 8B mostram a indução dos CTL pelas DC carregadas com células de melanoma mortas. Células T CD8+ purificadas são desenvolvidas em cultura durante 3 semanas com DC não carregadas (UL-DC) ou DC carregadas com Me 275. As células T são testadas num ensaio de libertação de crómio de 4 horas utilizando como alvo células Me275 imunizantes e células K562 como controlo para a actividade NK (a, média _+ SE (desvio padrão), n=4) (Fig.8A), assim como linhas de células de tumores HLA-A201+ não relacionadas: cancro da próstata (LnCAP) e cancro da mama (1806) (Fig.8B). Nenhuns CTL são originados quando as células T são desenvolvidas em cultura com células de melanoma sem as DC (não mostrado). A Fig. 9A e 9B mostra a indução dos CTL específicos de melanoma por DC carregadas com células de melanoma mortas. Células T CD8+ purificadas são desenvolvidas em cultura durante 3 semanas com DC carregadas com Me275 e não carregadas. A Fig. 9A mostra IFN ELISPOT utilizando como alvos DC, quer pulsadas quer não pulsadas com os quatro péptidos (4P) de melanoma. Representativo de 3 experiências realizadas utilizando DC e células T de diferentes dadores. A Fig. 9B mostra a actividade CTL num ensaio de libertação de crómio de 4 horas utilizando péptido de melanoma pulsado e não pulsado (4P; valores médios de 3 experiências) e células T2 pulsadas com péptido de PSA de controlo (uma experiência). A Fig. 10A-10C mostra DC carregadas com células T naive espoletadas por células de melanoma mortas. Células T CD8+CD45RA+CD45RO“ naive são desenvolvidas em cultura durante 3 semanas com DC não carregadas (UL-DC) ou com DC carregadas com células de melanoma mortas (L-DC). Células T são testadas num ensaio de libertação de crómio de 4 horas. Os CTL originados pelas DC carregadas com corpos Me275 matam as células T2 11 pulsadas com diferentes péptidos de melanoma (teste bilateral com base em dados transformados em log comparando a morte das células T2 pulsadas e não pulsadas com péptido) (Fig. 10A) . Células T CD27+CD45RA+CD8+ diferenciam-se em CTL capazes de matar a linha de células utilizada para imunização (Fig. 10B) e células T2 pulsadas com péptidos de melanoma mas não péptido de PSA (Fig. 10C) (representativo de duas experiências). A Fig. 11 mostra o espoletamento cruzado utilizando DC carregadas com células de melanoma mortas. Células T CD27+CD45RA+CD8+ naive são espoletadas por DC HLA-A201+ autólogas carregadas com células Colo829 HLA-A201” mortas. As células T originadas são capazes de matar alvos de melanoma HLA-201+ mas não células do cancro da mama HLA-201+ nem monócitos autólogos.
As Figs. 12A e 12B mostram que subconjuntos de CD derivadas de CD34+HPC no grau IV do melanoma capturam células de melanoma mortas ou a morrer e induzem a proliferação de células T autólogas. As CD34+HPC foram desenvolvidas em cultura durante 9 dias com GM-CSF, TNF e FLT3L. As DC totais (Fig. 12A) e os seus subconjuntos isolados (Fig. 12B) foram então carregados com a linha de células de melanoma C0L0829 mortas ou a morrer. Após a cultura durante a noite na presença do factor CD40L de maturação das DC, as DC foram subsequentemente desenvolvidas em cultura em doses graduadas (eixo horizontal) com células T autólogas durante 5 dias. A proliferação das células T foi determinada pela incorporação de timidina (eixo vertical, xlO3) .
As Figs. 13A e 13B mostram que as DC imaturas de melanoma do doente capturam células de melanoma mortas ou a morrer e induzem proliferação quer das células CD4+ quer CD8+. As DC imaturas do doente com melanoma de grau IV foram co-desenvolvidas em cultura com corpos de melanoma durante 1 h, separadas e co-desenvolvidas em cultura durante 5 dias com células T CD4+ purificadas autólogas (+CD40L) (Fig. 13A) ou células T CD8+ (5xl04 células/poço) (Fig. 13B) e timidina tritiada foi medida no Dia 5 12 (eixo vertical x 103) . A proliferação das células T CD8+ foi realizada na presença de CD40L (200 ng/ml) e IL-2 (5 U/ml).
As Figs. 14A-14C mostra a indução de CTL específicos de melanoma por DC carregadas com células de melanoma mortas utilizando DC e células T de doente com melanoma maligno avançado. Células T CD8+ purificadas são desenvolvidas em cultura durante 3 semanas com DC não carregadas ou carregadas com Me275. A Fig. 14A mostra IFN ELISPOT utilizando DC como alvos, quer não pulsadas quer pulsadas com os quatro péptidos de melanoma (4P). Resultados de um doente. A Fig. 14B mostra a actividade dos CTL num ensaio de libertação de crómio de 4 horas. As células T são capazes de matar as Me275 utilizadas para imunização, e a morte é aumentada quando as células Me275 são pulsadas com quatro péptidos de melanoma. Resultados semelhantes foram obtidos com dois doentes. A Fig. 14C mostra o espoletamento de células T naive. As células CD8+CD45RA+CD45RO“ são desenvolvidas em cultura com DC carregadas com células Me275 mortas, matam as células T2 pulsadas com 4 péptidos de melanoma. A Fig. 15 mostra que as DC carregadas com as células de cancro da mama mortas induzem a proliferação de células T CD4+ autólogas. As DC carregadas são preparadas e desenvolvidas em cultura com várias concentrações com 105 células τ CD4+ autólogas (pureza >85%). A proliferação da célula T é determinada após 5 dias pela incorporação de timidina (cpm x 103) . A curva de controlo representa cpm de poços em que as células BrCa mortas foram plaqueadas em conjunto com as células T. A Fig. 16 mostra que DC carregadas podem sensibilizar células T que, por seu turno, podem matar células de tumores específicas. DC imaturas são misturadas com células 1806 de cancro da mama alogénicas mortas. As DC são incubadas com células de tumores mortas durante 48 horas na presença de meio condicionado por monócitos para induzir a maturação das DC. As DC recolhidas são então utilizadas como estimuladores de células 13 T CD8 autólogas em culturas de 3 semanas (3 estimulações). As células T recolhidas são testadas num ensaio de libertação de crómio (percentagem de lise especifica, eixo vertical). A Fig. 17 mostra que as DC carregadas maduras podem sensibilizar células T para matar células de tumores. As células DC imaturas são misturadas com células 1806 de cancro da mama alogénicas mortas. As DC são incubadas com células de tumores mortas durante 48 horas na presença de meio condicionado de monócitos para induzir a maturação das DC. As DC recolhidas são então utilizadas como estimuladores de linfócitos do sangue periférico autólogos em culturas de 3 semanas (3 estimulações) . As células T recolhidas são ensaiadas num ensaio de libertação de crómio (percentagem de lise especifica, eixo vertical). A Fig. 18 mostra que as DC carregadas podem sensibilizar células T para matar células de tumores sem a necessidade de factores de maturação das DC exógenas. As DC imaturas são misturadas com células 1806 de cancro da mama alogénicas mortas. As DC são incubadas com células de tumores mortas durante 48 horas. As DC recolhidas são então utilizadas como estimuladores de linfócitos do sangue periférico autólogos em culturas de 3 semanas (3 estimulações). As células T recolhidas são ensaiadas num ensaio de libertação de crómio (percentagem de lise especifica, eixo vertical). A Fig. 19 mostra que as DC carregadas podem sensibilizar células T que por sua vez podem matar células de tumores especificas. As DC imaturas são misturadas com Células MCF de cancro da mama alogénicas mortas. As DC são incubadas com células de tumores mortas durante 48 horas na presença de meio condicionado com monócitos para induzir a maturação das DC. As DC recolhidas são então utilizadas como estimuladores de células T CD8 autólogas em culturas de 3 semanas (3 estimulações) . As células T recolhidas são ensaiadas num ensaio de libertação de 14 crómio (percentagem de lise específica, eixo vertical). Células MCF-7 são incubadas com lFN-γ durante 7 dias como alvos dos CTL. A Fig. 20 mostra que os CTL específicos de antigénio podem ser enriquecidos por eliminação de células T alo-específicas. O gráfico mostra a percentagem de lise específica (eixo das ordenadas) de células T2 carregadas com péptido e células K562 para razões indicadas de efector em relação aos alvos. As células efectoras foram geradas a partir de células T CD8+ adultas, após eliminação de células T alo-específicas com duas acções de estimulação (7 dias cada) com DC autológas carregadas com corpos derivados de C0L0829 na presença de IL-7 (10 U/ml, primeiro ciclo) e IL-2 (10 U/ml, 3o e 4o ciclo). O ligando CD40 foi adicionado para induzir maturação das DC. Células T2 foram carregadas com péptido durante 2 horas. A Fig. 21 mostra que DC carregadas com linhas de células EBV mortas induzem proliferação de células T CD4 naive. DC derivadas de monócitos imaturas são carregadas com células EBV mortas, separadas com base na expressão de CDla e desenvolvidas em cultura durante 5 dias com células T CD4+CD45RA+ naive autólogas. A proliferação é medida por incorporação de timidina (cpm, eixo vertical). A Fig. 22 mostra que DC carregadas com linhas de células EBV mortas e tratadas com o inibidor NFkB induzem tolerância de células T CD4+ naive. No primeiro ciclo de estimulação células T CD4+CD45RA+ purificadas (106/poço) foram co-desenvolvidas em cultura em placas de 24 poços com DC imaturas autólogas separadas (lxl05/poço) carregadas com uma linha de células alogénicas mortas (colo 829) na presença, ou na ausência, de um inibidor de NAC para translocação de NFkB (25 mM, SIGMA). Após 5 dias, células T de ambas as co-culturas (-NAC e +NAC) são recolhidas, lavadas e deixadas em repouso durante 2 dias adicionais. Células T de culturas primárias são re-tratadas num 15 segundo ensaio de proliferação com as DC carregadas com células EBV mortas que são quer autólogas (Colo-EBV) quer alogénicas (Hom2-EBV) em relação à linha de células Colo829 utilizada na primeira estimulação. A proliferação é determinada pela incorporação de (1 μCi/poço durante pelo menos 16 h) timidina (eixo vertical). As células T são tolerizadas a antigénios de células Colo ou Colo-EBV (painel esquerdo) mas podem proliferar em respostas a outro antigénio (painel direito)-
DESCRIÇÃO DETALHADA
Novas células que apresentam antigénio, incluindo mas não limitadas a células dendríticas (DC), que são carregadas com antigénios de linhas de células alogénicas mortas ou a morrer e os métodos para produzir tais células que apresentam antigénio são descritas. Estas células que apresentam antigénio carregadas são úteis para induzir quer respostas imunológicas profiláticas quer respostas iminológicas terapêuticas em seres humanos e animais. Em particular, tais células que apresentam antigénio carregadas são úteis na gestão do cancro e das doenças infecciosas. Alternativamente, as células que apresentam antigénio carregadas podem ser utilizadas para eliminar respostas imunológicas indesejadas, tais como respostas autoimunes e problemas de enxerto versus hospedeiro ou reacção de hospedeiro versus enxerto, i.e., rejeição do enxerto em transplantes de órgãos e de medula óssea.
As células que apresentam antigénio úteis no presente invento são células dendriticas em vários estágios de diferenciação (precursores, células dendriticas imaturas e células dendriticas maduras), células dendriticas derivadas de precursores do sangue incluindo células dendriticas derivadas de células progenitoras hematopoiéticas CD34, subconjuntos de células dendriticas, tais como as células Langerhans, DCs intersticiais e DCs linfóides. Preferencialmente, as células que apresentam antigénio são de 16 origem humana. A menos que especificado de outro modo, deve entender-se que os termos "célula dendrítica" ou "DC" tal como aqui utilizados referem-se a todas as células que apresentam antigénio úteis no presente invento. Numa forma de concretização do presente invento, as células dendriticas e as células T são derivadas de doentes com cancro ou outra forma de doença tumoral. Ainda noutra forma de concretização, as células dendriticas são utilizadas quer para aplicação autóloga quer alogénica.
No presente invento, as novas células dendriticas são obtidas carregando células dendriticas com células alogénicas apoptóticas. Células de tumores alogénicas apoptóticas úteis no presente invento incluem, mas não estão limitadas a, linhas de células de tumores e células de tumores alogénicas isoladas. Estas células dendriticas carregadas com células alogénicas apoptóticas são capazes de originar células citotóxicas capazes de matar células de tumores assim como alvos carregados com péptidos derivados de antigénio associado a tumor. Células citotóxicas incluem, mas não estão limitadas a, células τ CD8, células T CD4, células assassinas naturais e células T assassinas naturais. Deve entender-se daqui para a frente que, a menos que indicado em contrário, a referência a células T citotóxicas significa uma ou mais células citotóxicas. Células dendriticas carregadas com antigénio preparadas tal como aqui descrito podem também espoletar células T naive para se diferenciarem em células efectoras capazes de reconhecer antigénios de tumores múltiplos e/ou partilhados que são expressos quer nas células de tumores que são utilizadas para carregar as células dendriticas e/ou noutras células de tumores. Este espoletamento cruzado contra antigénios múltiplos partilhados entre diferentes células, por exemplo células de tumores é importante para provocar amplas respostas imunológicas. A geração dos CTL está associada à proliferação de células T CD4+ restringidas ao MHC de classe II. As DC carregadas podem também induzir a proliferação de células T CD4+ 17 restringidas ao MHC de classe II. Esta apresentação cruzada de antigénios capturados é de particular importância porque as células T CD4+ podem exercer uma função auxiliar para indução e manutenção de células T CD8+ antitumorais, e possuir uma função efectora directa contra os tumores positivos ao MHC de classe li assim como uma função efectora indirecta por activação de outras células, e.g. macrófagos.
No presente invento, os CTL originados pelas DC carregadas com corpos de células de uma fonte tumoral alogénica especifica podem ser utilizados para proporcionar um efeito mortal em outros tumores. Por exemplo, os CTL originados pelas DC carregadas com corpos de células derivados de uma linha de células de carcinoma da próstata alogénicas especificas, tais como a PC3, matam outras linhas de células de tumores, tais como o carcinoma da próstata DU145 e LnCAP. Resultados semelhantes foam obtidos com linhas de células de melanoma, linhas de células de cancro da mama e CTL originados pelas DC carregadas com LnCAP contra células T2 pulsadas com péptido de PSA. Deste modo, uma resposta imunológica antitumoral pode ser obtida por activação de células T especificas para antigénios de tumores partilhados. Além disso, tal como aqui demonstrado, a actividade dos CTL contra os péptidos de PSA, utilizando uma terceira linha de células de cancro da próstata, prova formalmente que 1) a actividade dos CTL induzida não é somente devida à existência de aloantigénios partilhados e 2) a presença de aloantigénios não evita a activação de células T especificas para antigénios de tumores partilhados.
No presente invento, células de tumores alogénicas podem ser utilizadas para ter como alvo antigénio associado a tumor (TAA) para DC para permitir a geração de CTL TAA-especifico. Primeiro, corpos de células alogénicos podem ser utilizados para carregar DC para induzir respostas antitumorais em doentes. Estas fontes de antigénio bem caracterizadas podem permitir uma mais rigorosa avaliação clinica do que as preparações de tumores autólogas 18 definidas para a doença que não podem permitir padronização e são frequentemente limitadas na sua quantidade. Estes antigénios de tumor partilhados podem ser utilizados para gerar respostas imunológicas que conduzirão à rejeição do tumor. Uma consequência importante do presente invento é a de que os antigénios de tumores partilhados não necessitam de ser sobre-expressados, tal como evidenciado com células transfectadas ou animais transgénicos. Finalmente, esta estratégia oferece a possibilidade de identificar novos antigénios de tumores partilhados indisponíveis a partir da análise de clones de células T que reagem com tumores autólogos.
Durante as respostas imunológicas, as respostas aloantigénio- específicas podem ser eliminadas utilizando agentes que matam linfócitos activados (e.g. anticorpo anti-Fas) sem evitar o desenvolvimento de respostas contra antigénios partilhados, proporcionando um método para inactivar clones autoreactivos em doenças autoimunes, e clones de células específicos alogénicas/xenogénicas no contexto do transplante alogénico/xenogénico.
As células T que são expostas a células dendríticas carregadas com células mortas podem ser tolerizadas contra o(s) antigénio(s) expresso(s) nas células mortas. Isso pode ser conseguido por manipulação de células dendríticas carregadas que permite a apresentação de antigénio mas inibe a expressão de moléculas co-estimuladoras.
Exemplo 1: Indução de uma Resposta Imunológica Contra o Cancro da Próstata com DC carregadas com Linhas de Células de
Tumores Alogénicas
Fagocitose de células de tumores mortas ou a morrer por DC imaturas 19
Determinou-se que DC derivadas de monócitos imaturas geradas in vitro (MDDC) eram capazes de capturar células de tumores mortas ou a morrer. DC derivadas de monócitos imaturas foram geradas a partir da fracção aderente de monócitos do sangue periférico (PBMC) (Bender, et al. 1996. "Improved methods for the generation of dendritic cells from non proliferating progenitors in human blood", J Immunol Methods 196:121). PBMCs de um dador saudável foram suspensos em meio completo (CM) consistindo de RPMI 1640, 1% de L-Glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina, 50 μΜ de 2-mercaptoetanol, 1% de piruvato de sódio, 1% de aminoácidos essenciais e 10% de soro fetal bovino (FCS) inactivado por calor (todos da GIBCO BRL, Grand Island, N.Y.). As células foram deixadas a aderir aos pratos de plástico (Placas de 6 poços Falcon da Bectin-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) . Após incubação durante 2 horas, a 37°C, as células não aderentes foram removidas e as células aderentes foram desenvolvidas em cultura em CM com GM-CSF (100 ng/ml GM-CSF Leukine, Immunex, Seattle, WA) e IL-4 (5 ng/ml R&D System, Minneapolis, MN) . As culturas foram alimentadas de 2 em 2 dias. As células foram rotineiramente utilizadas no dia 6 e a recuperação das DC utilizando este método, tal como determinada por imunofluorescência e citometria de fluxo, foi de >90% das células CDla+CDl4-, caracteristicas fenotipicas das DC derivadas de monócitos imaturas.
Linhas de células de tumores do linfoma de célula τ Jurkat (clone E6-1), carcinomas da próstata DU145, PC3, LnCAP e melanomas malignos A375.S2 e A2058 foram adquiridas na American Type Culture Collection; Manassas, VA e mantidas em CM. Foi induzida apoptose às células de tumores. Foi induzida apoptose às células de linfoma de célula T de Junkart e às linhas de células de melanona A2058 w A375.S2 tratando as células (lxl06/ml) com anti-Fas mAB (1 pg/ml, clone CH-11, da Beckman-Coulter) durante 16 h em CM. Este processo resultou em 20 aproximadamente >89% de células mortas ou a morrer, tal como determinado através de ligação de anexina V e coloração com PI utilizando uma metodologia corrente bem conhecida na arte (Fig. IA) . Antes das células do carcinoma da próstata P3 terem sido tratadas com anti-Fas mAb, estas foram sensibilizadas com ciclo-heximida (25 pg/ml, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) durante 2 horas. A morte das células LnCAP do carcinoma da próstata foi induzida por tratamento com TNF-a (40 ng/ml; CellPro, Inc. Bothell, WA) durante 24 horas seguido por irradiação γ (80 Gy).
Antes do desenvolvimento em cultura das células de tumor a morrer e das DC em conjunto, todas as células foram especificamente marcadas para se detectar a incorporação pelas DC das células de tumores a morrer. As células de tumores a morrer foram recolhidas, lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e marcadas com o corante fluorescente especifico de ADN 7-aminoactiomicina (7-AAD) (Sigma Chemical Co.) a 20 pg/ml por 106 células, durante 30 minutos, a 4°C. Os corpos foram subsequentemente lavados e re-suspensos em CM a lxlO6 células/ml. As DC imaturas foram recolhidas, lavadas com meio de coloração (PBS com EDTA 5 mM e 2% de soro bovino fetal (FBS)) e marcadas com CDla-FITC (DAKO, Carpenteria, CA), durante 45 minutos, a 4°C. Após coloração, as DC foram lavadas com PBS com 2% de FCS (Gibco) e re-suspensas em CM com uma concentração de 2xl05 células/ml. As DC e as células de tumores mortas ou a morrer foram co-desenvolvidas em cultura com uma razão de 1:5, durante 1 hora, a 4°C ou 37°C, em CM. Após o co-desenvolvimento em cultura, as células foram recolhidas, lavadas em PBS e tratadas com 0,05% tripsina/0,02% EDTA, durante 5 minutos, para romper as ligações células-células. O carregamento dos corpos de células de tumores com 7-AAD por DC FITC-CDla+ foi medido por citometria de fluxo como a percentagem de DC duplamente positivas em relação a FITC-CDla+ e 7-AAD (Fig. 1B) . Análise de dispersão frontal/dispersão lateral revelou um aumento na granularidade da população duplamente 21 positiva, confirmando ainda a absorção dos corpos de células de tumores pelas DC (Fig. 1B) . Tal como mostrado na Fig. 1C, até 45% das DC eram capazes de carregar corpos de células das linhas de células A2058, A375.S2, DU145, PC3, LnCAO e linfoma T Jurkat.
Em dados não mostrados, observou-se fagocitose numa concretização autóloga em que foram utilizadas uma linha de células B-linfoblastóides transformadas por EBV mortas ou a morrer e células B não transformadas. A extensão com que as DC capturam células de tumores mortas ou a morrer era independente do facto de a morte das células ser induzida por ligação Fas ou por irradiação γ. A coloração de ADN e a coloração Giemsa corrente indicaram que apenas uma fracção, até 45%, das DC imaturas capturam os corpos das células de tumores contendo pelo menos um fragmento nuclear. Esta captura parcial não parece ser devida à falta de substrato dado que muitas células de tumores mortas ou a morrer marcadas permaneciam não envolvidas pelas DC.
Os resultados da separação das células activada por fluorescência e da microscopia confocal demonstraram que as DC imaturas possuem a capacidade de fazer a fagocitose de corpos de células mortas ou a morrer derivados de diferentes linhas de células de tumores. DC derivadas de doente com carcinoma na próstata capturam linhas de células PrCa
Mostrou-se que as DC derivadas de monócitos (MDDC) que foram geradas por desenvolvimentos de culturas de monócitos de um doente com carcinoma na próstata com GM-CSF e IL-4 capturavam corpos derivados de linhas de células PrCa. A coloração com Giemsa das MDDC indicou que as MDDC tinham corpos fagocitosados derivados da linha de células de cancro da próstara DU145. Tal como mostrado na Fig. 2A, até 20% das MDDC do doente fagocitosaram corpos de células DU145, similarmente às DC geradas a partir de um voluntário saudável (Fig. 2B). 22 DC carregadas induzem proliferação de células τ CD4+ e células T CD8+ autólogas DC carregadas com células de tumores alogénicas mortas ou a morrer induziram proliferação de células T autólogas.
As DC foram carregadas com corpos de células de tumores, tal como atrás e separadas, com base em coloração com CDla-FITC, para serem utilizadas como estimuladores de células T autólogas. As fontes de células T foram PBMC não separados, células T CD4+ purificadas (>90%) e células T CD8+ purificadas (>90%) . As células T CD4+ e T CD8+ foram obtidas a partir de PBMC separados por Ficoll de voluntários saudáveis (sem história de transfusão de sangue) e esgotadas de outras células utilizando CD3 purificadas (UCHTl), CD4 (13B8.2), CD8 (B9.ll), CD14 (RM052), CD16 (3G8), CDl 9 (J4.119), CD56 (NKH-1), e anticorpos monoclonais (mAbs) anti-HLA-DR (B8.12.2) e antiglicoforina A (D2.10) (todos da Beckman-Coulter, Miami, FL) (Nouri-Shirazi, et al. 2000. "Dendritic celss capture killed tumor cells and present their antigens to elicit tumor-specific immune responses", J Immunol 165:3797-3803) e anti-rato IgG da cabra Dynabeads (Dynal, Lake Success, NY) . A pureza das populações enriquecidas era de >85%. DC marcadas com CDla foram co-desenvolvidas em cultura com corpos de células de tumores (sem marcação do ADN), separadas com base na expressão de CDla (pureza >98%) e plaqueadas em placas de 96 poços de fundo redondo com doses graduadas de 0 a 5000 DC/poço. PBMC autólogos (lxl05/poço/200 μΐ), células T CD4+ purificadas (5xl04/poço/200 μΐ) ou células T CD8+ (5xl04/poço/200 μΐ) foram adicionadas aos poços contendo DC marcadas com CDla. O ensaio de proliferação foi realizado num meio de cultura suplementado com 10% de soro AB humano inactivado por calor (Gemini Bio-products, Woodland, CA) . CD40L solúvel (200 ng/ml, Immunex, Seattle, WA) foi adicionado no inicio da cultura para induzir maturação das DC e foi adicionado IL-2 (5 U/ml, Genzyme 23
Co., Cambridge, MA) para auxiliar a proliferação das células T CD8+ purificadas. Após 4 dias de incubação, foi adicionada timidina tritiada (Wallac, Inc., Gaithersburg, MD) com a actividade de 1 pCi/poço. As placas foram recolhidas 16 horas mais tarde e a radioactividade incorporada foi medida por cintigrafia de acordo com as instruções do fabricante. 0 mesmo ensaio para detectar a expansão das células T foi também realizado na presença de mAbs direccionado contra HLA-Dre HLA-A, B, C para determinar os péptidos antigénicos nas moléculas de MHC de classe I e II apresentadas pelas DC que são essenciais para a iniciação da proliferação das células T. As DC foram incubadas com mAbs contra HLA-DR (clone L243 da Becton Dickinson) e HLA-A, B, C (W 6/32, da DAKO, Botany, N.S.W.) com uma concentração final de 5 pg/ml em CM durante 30 minutos antes da adição das células T. Os mAbs estavam presentes ao longo do periodo de cultura. mAbs irrelevantes foram utilizados como controlos de isotipo.
Tal como mostrado na Fig. 3A, as DC carregadas com corpos de linfoma Jurkat induziu a proliferação de células T CD4+ autólogas independentemente da presença de CD40L exógeno (que induz maturação das DC) . Tal como mostrado na Fig. 3C, a proliferação das células T CD4+ foi fortemente inibida pela presença de mAbs contra as moléculas de MHC de classe II. Para além disso, as DC carregadas com corpos de células de carcinoma da próstata DU145 induziram a proliferação de células T CD8+ autólogas (Fig. 3B) . Em dados não mostrados, a indução da maturação das DC através da adição de CD40L e IL-2 exógenos foi necessária para induzir proliferação máxima das células T CD8+ purificadas. A inibição da proliferação das células T CD8+ foi também vista quando mAb contra as moléculas de MHC de classe II foi adicionado às culturas (Fig. 3D). Embora os macrófagos fossem mais potentes na captura de corpos de células transformados por EBV do que as DC imaturas, estas falham em fazer surgir respostas às células T CD8+ (dados não mostrados) . 24 DC carregadas com corpos de células de tumores conduzem à
expansão de CTL
Uma vez demonstrado que as DC possuem a capacidade de fazer a fagocitose de corpos de células mortas ou a morrer derivados de diferentes linhas celulares de tumores e foram capazes de induzir a proliferação de células T autólogas, foi então determinado que as DC carregadas com corpos de células de tumores permitem a expansão de CTL possuindo actividade citotóxica contra a linha de células de tumor imunizante.
As DC carregadas com células de tumor mortas ou a morrer (tal como preparadas atrás neste exemplo) foram separadas, tal como descrito atrás e utilizadas como células estimuladoras, enquanto que PBMC autólogo ou células T CD8+ purificadas (tal como preparadas atrás neste exemplo) foram utilizados como respondedor. Foram preparadas culturas em placas de 24 poços (Costar, Corning, Inc., Acton, MA) plaqueando 0,5-lxl05 células/ml de DC carregadas imaturas com 2xl06 células/ml de células respondedoras num volume final de 2 ml. 0 meio de cultura foi suplementado com 10% de soro AB humano (Gemini Bio-products, Woodland, CA) e IL-7 (10 U/ml da Immunex, Seattle, WA) no primeiro ciclo de sete dias. Após sete dias, as células foram recolhidas e lavadas em meio de cultura, e estimulação com DC carregadas com tumor foi repetida durante dois ciclos adicionais de sete dias na presença de IL-2 (10 U/ml, Genzyme Co. Cambridge, MA) . Para cada ciclo de estimulação foi preparado um lote fresco de DC carregadas com antigénio. As células foram então recolhidas e a sua actividade tóxica foi testada num ensaio corrente de libertação de crómio (Sitkovsky, M.V., Cytotoxic Cells: Recognition, Effector Function, Generation and Methods, Henkart, P.A., eds., Birkhauser, Boston, 1993). A citoxicidade das células T sensibilizadas pelas DC carregadas com antigénios da linha de células de carcinoma da próstata DU145 foi comparada com a linha de células K562 NK-sensiveis. 25
Tal como mostrado na Fig. 4A, as células τ expandidas sensibilizadas pelas DC carregadas com DU145 foram capazes de efectuar lise das células DU145 mas não do alvo K562, demonstrando assim CTL em vez de actividade NK. Os CTL com actividade citotóxica equivalente foram também expandidos contra o espoletamento da linha de células de tumor quando foi utilizado PBMC total em vez de células T CD8+ purificadas como células respondedoras (Fig. 4A). Espoletamento de CTL comparável foi também obtido quando as DC foram carregadas com corpos de células de carcinoma da próstata PC3 (Fig. 4B) .
Significativamente, os CTL expandidos foram capazes de efectuar lise quer das células PC3 utilizadas para a sensibilização quer das células de outra linha de células de carcinoma da próstata DU145, substanciando o reconhecimento pelos CTL dos antigénios partilhados. Estes resultados mostraram que estas duas linhas de células de carcinoma da próstata partilham antigénios capazes de provocar a origem de CTL e demonstraram que as DC carregadas com corpos de tumores permitiam a expansão dos CTL com actividade citotóxica contra a linha de células de tumor utilizada para carregar as DC assim como contra antigénios de tumores partilhados.
DC carregadas com corpos de células LnCAP de carcinoma da próstata expandem CTL específicos de PSA A carga das DC com corpos de células de tumores permitiu a indução de CTL específicos de c(TAA). Células T2, uma linha de células negativas HLA-A201 corrente obtida na American Type Culture Collection, foram carregadas com antigénios específicos de PSA, utilizando péptidos sintéticos de PSA, PSAl (NH2-FLTPKKLQCH-0H; aminoácidos 141-150) e PSA2 (NH2-KLQCVDLHV-OH; aminoácidos 146-154) (Biosynthesis, Lewisville, Texas). Estes péptidos específicos de PSA foram previamente identificados como péptidos de ligação HLA-A2 (Correale, et al., 1997. "In vitro generation of human cytotoxic T lymphocytes 26 specific for peptides derived from prostate-specific antigen", J. Natl Câncer Inst 89:293). A afinidade de ligação HLA-A2 dos péptidos de PSA foi avaliada por regulação da expressão da superfície A2 nas células T2 após ligação do péptido. Cerca de lxlO6 células T2 foram incubadas num meio completo sem soro com 50 pg de péptido/ml, a 37°C, em 5% de C02 durante a noite. As células foram então lavadas duas vezes com PBS e subsequentemente coradas com mAB específico de HLA-A2 conjugado com FITC (10% v/v), HLA-A2, 20 da One Lamda, Inc, Canoga Park, CA). A intensidade de fluorescência média da coloração de HLA-A2 com ou sem carga de péptido foi analisada por citometria de fluxo.
Utilizando os métodos previamente descritos neste exemplo, as DC foram carregadas com a linha de células LnCAP de carcinoma da próstata porque estas células expressam PSA e apresentam péptidos de PSA no contexto do HLA-A2 para a lise mediada por células T (Correale, et al. 1998. "Generation of human cytolitic T Lymphocyte lines directed against prostate-specific antigen (PSA) employing a PSA oligopeptide peptide", J Immunol 161:3186). A coloração de imunofluorescência confirmou a expressão citoplasmática de PSA em células LnCAP mas não em células P3. Para avaliar se os corpos LNCaP carregados nas DC eram capazes de originar CTL específicos de PSA restringidos por HLA-A2 in vitro, DC imaturas geradas a partir quer de dadores masculinos quer femininos HLA-A2+ foram co-desenvolvidas em cultura com corpos de células LnCAP e então separadas e utilizadas como estimuladores de células T CD8+ autólogas, obtidas através de métodos apresentados anteriormente neste exemplo. Após três ciclos repetidos de estimulação, as células respondedoras foram recolhidas e a actividade e especificidade citotóxica foram determinadas utilizando células LnCAP, células K562 e células T2 carregadas com péptidos de PSA como alvos. 27 A ligação dos péptidos de PSA a células T2 foi confirmada por citometria de fluxo (Fig. 5) . Tal como mostrado na Fig. 6A, os CTL originados a partir de um dador feminino provocaram a lise das células LnCAP mas não as células alvo K562 NK-sensiveis. É importante notar que os CTL foram capazes de, eficientemente e especificamente matarem as células T2 carregadas com péptido de PSA mas não as células T2 não carregadas. Foi conseguido até 50% (um aumento de cinco vezes) da lise especifica das células LnCAP e das células T2 carregadas com PSA com uma razão de efector:alvo de 50:1, em comparação com células T2 não carregadas e células K562 (Fig. 6A) . As DC geradas a partir de um dador masculino HLA-A2+ foram carregadas com corpos de células LnCAP e utilizadas como estimuladores de células T CD8+ autólogas. Tal como mostrado na Fig. 6B, os CTL gerados a partir de dadores masculinos foram também capazes de matar células T2 carregadas com péptidos de PSA mas não células T2 não carregadas nem células K562 NK-sensiveis. Adicionalmente, os CTL gerados não foram capazes de matar as células T2 carregadas com um péptido da matriz de influenza (gripe) (MP) de controlo, mostrando novamente a especificidade da resposta (dados não mostrados) .
Exemplo 2: Indução de uma Resposta Imunológica Contra o
Melanoma com DC Carregadas com Linhas de Células de Tumor
Alogénicas DC carregadas com células T naive espoletadas por células de melanoma alogénicas mortas para se diferenciarem em CTLs que eram específicos para um largo espectro de antigénios de melanoma partilhados e eram capazes de matar linhas de células de melanoma.
Linhas de células e indução de morte de células de tumor
As linhas de células de melanoma Colo829 e SkMel28, K562, linha de células do carcinoma da próstata LnCAP, linha de 28 células do cancro da mama 1806 (estabelecida pelos Drs. A. Gazdar e J. Minna no UTSW Medicai Center em Dallas) e células T2 foram adquiridas à American Type Culture Collection (ATCC; MAnassas, VA). As linhas de células Me275 e Me290 foram estabelecidas no Ludwig Câncer institute em Lausanne. Todas as linhas de células foram mantidas em CM. A morte das células ME275 foi induzida por tratamento com 10 pg/ml de ácido betulínico durante 48 horas. As células Colo829 foram mortas através do mesmo método ou através de irradiação gama (150 Gy e então desenvolvidas em cultura 48 horas em meio livre de soro) . A morte das células foi avaliada pela morfologia, externalização da fosfatidilserina utilizando anexina V marcada com FITC (CALTAG, Burlingame, CA) e coloração com corantes específicos de ADN: 7AAD e azul de triptano (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).
Para determinar se as células de melanoma alogénicas mortas administradas às DC permitiriam a selecção e expansão de células T especificas para antigénios do melanoma partilhados, foram utilizadas duas linhas de células de melanoma: Me 275 e Colo829. A escolha foi baseada em 1) expressão de HLA-A201 pelas células Me275 mas não pelas células Colo829, e 2) expressão de TAA de melanoma "conhecido", expressando ambas as linhas de células Melan A/MART-1, gplOO, tirosinase e MAGE-3 ao nivel do ARN e proteína (de Vries, T. J., et al. 1997. "Heterogenous expression of immunotherapy candidate proteins gplOO, MART-1, and tyrosine in human melanoma cell lines and in human melanocytic lesions" Câncer Res. 57:3223) .
Para gerar células tumorais mortas, foram testados vários factores de indução de morte incluindo danos no NA e morte mediada por receptor, sendo a morte das células monitorizada utilizando coloração com Anexina V/PI. As células Colo829 podem ser mortas por irradiação γ/esgotamento do soro (150 Gy, >30% de células mortas). As células Me275 provaram ser resistentes à 29 irradiação γ assim como à morte mediada por receptor quer através de ligação Fas quer TNF ou TRAIL (não mostrado).
Contudo, as células Me275 sofreram uma morte rápida quando tratadas com ácido betulinico (BA) (Pisha, et al. 1995. "Discovery of betulinic acid as a selective inhibitor of human melanoma that funtions by induction of apoptose", Nat Med 1:1046-1051; Fulda, et al. 1999. "Betulinic acid: a new
cytotoxic agent against malignant brain-tumor cells", Int J Câncer 82:435-441; e Selzer, et al. 2000. "Effects of betulinic acid alone and in combination with irradiation in human melanoma cells", J Invest Dermatol 114:935-940). O BA é particularmente activo contra o melanoma (assim como contra as células do tumor maligno do cérebro) e induz a morte dependente das mitocondrias através da activação de caspase-8 e caspase-3. Com base na cinética inicial e nas experiências de resposta à dose (não mostradas) as células de melanoma foram tratadas durante 48 horas com 10 pg/ml BA (>50% de células mortas, uma combinação de apoptose e necrose). As Colo829 e as Me275 desenvolvem-se como células aderentes e destacam-se quando morrem e, deste modo, foi utilizada a fracção não aderente composta principalmente por células mortas para carregamento das DC.
Geração de DCs derivadas de monócitos DC imaturas foram geradas a partir de PMBC separados com Ficoll de voluntários saudáveis HLA-A201+ ou doentes com melanoma de grau IV. PBMC de GM-CSF não mobilizado ou mobilizado (Amgen, Thousand Oaks, CA) foram suspensos em CM e deixados a aderir em pratos plásticos (Falcon de 6 poços, Franklin Lakes, NJ), durante 2 horas, a 37°C. As células não aderentes foram removidas e as células aderentes foram desenvolvidas em cultura em CM durante 6 dias. GM-CSF (100 ng/ml; Leukine, Immunex, Seattle, WA) e IL4 (5 ng/ml; Schering-Plough) foram adicionados à cultura a cada dois dias. A recolha de DC no dia 7, tal como determinado por imunofluorescência corrente e análise FACS foi de >90% de células CDla+. Para induzir a maturação das DC, 30 ligando CD40 solúvel (SCD40L; 200 ng/ml; Immunex, Seattle, WA) foi adicionado à cultura do dia 5 ao dia 7.
Purificação das células T Células T CD4+ e CD8+ purificadas (autólogas em relação às DC) foram esgotadas de outras células utilizando purificadas CD4 (13B8.2), CD8 (B9.ll), CD14 (RM052), CD16 (3G8), CD19 (J4,119), anti-CD45 RO (UCHLl), CD56 (NKH-1), anti-HLA-DR (B8.12.2) e anticorpo monoclonais (mAbs) de anti-glicoforina A (D2.10) (todos da IMMUNOTECH, Marselha, França) e anti-rato IgG da cabra Dynabeads (Dynal, Lake Success, NY) (Nouri-Shirazi, et al. 2000. "Dendritic cells capture killed tumor cells and present their antigens to elicit tumor-specific immune responses", J Immunol 165:3797-3803). Para as células T CD8+CD45RA+CD27+, as células T CD8+ foram coradas com anti CD45RA-PE e anti CD27-FITC (Becton-Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA) e separadas através de FACS. As células CD4+ e CD8+ purificadas foram então utilizadas no ensaio de proliferação de células T dado abaixo.
Análise de citometria de fluxo (FACS) A análise de citometria de fluxo foi realizada num equipamento FACSCalibur e a separação num equipamento FACS Vantage (Becton Dickinson, Mountaisn View, CA) . Os anticorpos utilizados para o fenótipo ou separação das células foram Anti-CSla-FTlC marcados (Bioresouce), Anti-CDl4-APC, Anti-CD80-PE, Anti-CD83-PE, Anti-CD86-PE, Anti-HLA DR.PerCP, Anti CD45RA-PE e Anti-CD2 7-FITC.
Ensaio de proliferação de células T DC marcadas com CDla-FITC foram co-desenvolvidas em cultura, durante 1 h, a 37°C, com corpos de tumores e então separadas com base na expressão de CDla (pureza >95%) e plaqueadas em placas de 96 poços com o fundo em U com doses graduadas de 0 a 5000 31 DC/poço. Células T CD4+ purificadas ou células T CD8+ purificadas (105/poço/200 μΐ) foram adicionadas às placas. 0 ensaio de proliferação foi realizado num meio de cultura suplementado com 10% de soro AB humano inactivado por calor (Gemini Biopoducts, Woodland, CA) . CD40 L solúvel (200 ng/ml; Immunex, Seattle, WA) foi adicionado para induzir maturação às DC e IL2 (10 U/ml; Genzyme Co., Cambridge, MA) foi adicionado para auxiliar a proliferação das células T CD8+ purificadas. Após 5 dias, timidina tritiada (NEN, Boston, MA) foi adicionada com uma actividade de 1 Ci/poço. As placas foram recolhidas 16 h depois (Wallac, Inc., Gaithersburg, MD) e a radioactividade incorporada foi medida por cintigrafia liquida de acordo com as instruções do fabricante.
Geração de linfócitos T citotóxicos específicos (CTL) DC carregadas com corpos de células derivadas de tumor e separadas foram utilizadas como células estimuladoras enquanto que células T CD8+, células CD8+CD45Ra+CD45RO” ou CD8+CDR45A+CD27+ foram utilizadas como respondedoras. As culturas foram preparadas em placas de 24 poços (Costar) plaqueando DC carregadas a lxlO5 células com lxlO6 células T num volume final de 1 ml. O meio de cultura foi suplementado com 10% de soro AB, SCD40L (200 ng/ml; Immunex, Seattle, WA); IL7 (10 Ul/ml na Ia semana) e IL2 (10 Ul/ml na 2a e na 3a semana) . As células T foram re-estimuladas com preparações frescas de DC não carregadas ou DC carregadas com células de tumor mortas todas as semanas durante mais duas semanas. Seis dias após a última estimulação, as células foram recolhidas e a sua actividade tóxica assim como a sua capacidade de libertação de IFN-Y foram testadas.
Ensaio de citoxicidade de 51Cr A citoxicidade foi medida num ensaio corrente de 4 horas de libertação de 51Cr. Resumidamente, células T2 foram pulsadas 32 durante a noite com 10 pg/ml de vários péptidos. Então, os diferentes alvos foram marcados com 51Cr (NEN, Boston, MA) e lavados três vezes com PBS. Linfócitos T citotóxicos (CTL) foram co-desenvolvidos em cultura, a 37°C, durante 4 horas, com lxlO3 células alvo marcadas com 51Cr em 200 μΐ de CM suplementado com 10% de soro AB em placas de cultura de 96 poços. Após 4 horas, 50 μΐ de sobrenadante foi recolhido e a percentagem de células mortas foi calculada utilizando a fórmula: percentagem de libertação = 100 x (experiência de cpm -libertação espontânea de cpm)/(libertação máxima de cpm - libertação espontânea de cpm).
Ensaio ELISPOT da libertação de IFN-V
Para quantificar as células T efectoras de libertação de IFN-y especifico de antigénio, foi utilizado um ensaio "immunospot" ligado a enzimas (ELISPOT) tal como recomendado pelo fabricante. Células T CD8+ (1 a 2xl05/poço) foram adicionadas em triplicado a placas de 96 poços com o fundo de nitrocelulose (MAHA S4510); Millipore Corp.) pré-revestidas com mAb anti-IFN-Y primário (1-DlK; Mabtech, Suécia) em 50 μΐ cRPMl por poço. Para a detecção de células T reactivas especificas, foram adicionadas células dendriticas derivadas de monócitos maduros autólogos pulsadas com péptidos restringidos com MHC de classe I numa quantidade de 104/poço (volume final 100 μΐ/poço) . Após 20 horas, os poços foram lavados seis vezes, incubados com segundo mAb para IFN-y biotinilado (7 B6-1; Mabtech) durante 2 horas, lavadas e coradas com um kit de Vectastain Elite (Vectors Labs.). DC capturam células de melanoma mortas e apresentam os seus antigénios a células T autólogas
Foi avaliada a capacidade das DC derivadas de monócitos imaturos de capturarem células de melanoma mortas. DC imaturas foram misturadas com células de melanoma mortas numa razão de 1:5 e incubadas durante 1 hora, a 37°C, para 33 permitir a fagocitose. Depois disto, as DC foram separadas por citometria de fluxo baseada e propriedades de dispersão frontal/dispersão lateral reflectindo a dimensão e a granularidade de acordo com os procedimentos aqui descritos.
Foi então determinado que a apresentação de antigénios carregados pelas DC poderia induzir a proliferação de células T autólogas. Tal como descrito atrás neste exemplo, as DC imaturas marcadas com CDla-FlTC foram carregadas com células de melanoma mortas, separadas por citometria de fluxo baseada na expressão de CDla (pureza >90%) e co-desenvolvidas em cultura com células T autólogas purificas (>90%) na presença de CD40L, que induz a maturação quer de DC carregadas quer não carregadas, tal como determinado pela expressão de CD83 (dados não mostrados). As células T proliferaram quando desenvolvidas em cultura com DC carregadas com células Me275 mortas, mas não quando desenvolvidas em cultura com células de melanoma mortas apenas (Fig. 7) . Estes resultados demonstraram que as DC capturavam células de melanoma alogénicas mortas e através da apresentação dos seus antigénios, induziram a proliferação de células T autólogas. DC carregadas com células de melanoma mortas originam CTL capazes de matar células de melanoma
Foi determinado que as DC carregadas com células de melanoma mortas originam células T com actividade citotóxica contra as células de melanoma utilizadas para imunização. DC HLA-A201+ imaturas foram carregadas com Me275 mortas, separadas e utilizadas para estimular células T CD8+ autólogas purificadas ao longo de uma cultura de 3 semanas. CD40L solúvel foi adicionado para induzir maturação das DC, assim como IL-7 (10 U/ml na Ia semana) e IL-2 (10 U/ml na 2a e na 3a semana) para auxiliar a proliferação de células T. As células T foram recolhidas após três ciclos de estimulação e a sua actividade 34 citotóxica foi determinada utilizando Me275, células de tumor HLA-A201+ não relacionadas, LnCAP, 1806 e células K562 NK-sensíveis. Tal como mostrado na Fig. 8, as DC carregadas induziram diferenciação de CTL capazes de matar as células de melanoma Me275, lise especifica 50+10% (média + SE, n=4; lise especifica 6+0,5% utilizando células T de controlo desenvolvidas em cultura com DC não carregadas) nas não as células de tumor HLA-A201+ não relacionadas, LnCAP, 1806 e linhas de células K562 NK-sensiveis. Estes resultados demonstraram que as DC carregadas com células de melanoma alogénicas mortas podem espoletar as células T CD8+ para se diferenciarem em CTL capazes de matar as células de melanoma utilizadas para imunização.
Carregamento de DC com células de melanoma alogénicas mortas induziram CTL específicos para TAA de melanoma partilhados múltiplos
Os dois ensaios descritos atrás neste exemplo foram desenvolvidos para estabelecer se linhas de células T geradas com DC carregadas com células de melanoma mortas contêm células T específicas para antigénios associados a melanoma: 1) um teste IFN-γ ELISPOT durante a noite com as DC HLA-A201+ pulsadas com péptidos de melanoma: Melan A/MART-I27-35 e MAGE-327i-279 assim como gplOOg2o9-2M mutados; e 2) um ensaio de libertação de crómio citotóxico utilizando células T2 pulsadas com os quatro péptidos como células alvo. Tal como mostrado na Fig. 9A, as linhas de células de 3 semanas originadas utilizando DC carregadas com células Me275 mortas contêm células que reconhecem uma combinação dos quatro péptidos de melanoma, 27 +; 2,9 pontos específicos de melanoma/2 x 105 células T (média + SE, n=3, p=0,03). As linhas de células T geradas com DC não carregadas e DC pulsadas com péptido só (sem as células T) originaram 3 + 1 e 4 +_ 1,5 pontos, respectivamente. Tal como mostrado na Fig. 9B, estas linhas de células T foram capazes de matar células T2 pulsadas com uma combinação de quatro péptidos (56 + 13% de lise específica; média + SE, n=3), mas não células T2 carregadas com péptido derivado de PSA indicando, deste modo, a especificidade em relação ao TAA do melanoma. A capacidade de induzir CTL específicos de melanoma não foi restringida às células Me275 dado que as células T originadas pelas DC carregadas com o HLA-A201”Colo829 também continham células quer poderiam matar as células T2 carregadas com cada um dos quatro péptidos de melanoma (Tabela I) . Deste modo, podem ser utilizados linhas de células de melanoma diferentes e métodos diferentes para matar células de melanoma para carregar DCs para originar linhas de CTL específicos para antigénios associados a melanoma.
Tabela I: Células T originadas pelas DC carregadas com células de melanoma mortas matam célulasa T2 pulsadas com péptido de melanoma
Sem péptido Tyr GplOO MAGE-3 MART-1 Exp.1/Me275 18 + 5b 68 + 5 48 + 4 nd nd Exp.2/Me2 75 22 + 2,5 60 + 7 40 + 9,5 nd nd Exp.3/Colo829 19 + 4,5 65 + 9,5 34 + 3,5* 33 + 3* 36 + 7,5* Média SD 20 + 2 64 + 4 p=0, 006 41 + 7 P=0, 03 a Percentagem de lise específica, média de triplicados +_ SD. Teste bilateral com base em dados transformados em log comparando a morte de células T2 não pulsadas e pulsadas com péptidos. b 23% de lise utilizando células T2 carregadas com péptido de PSA. c p = 0,02; nd - não efectuado DC carregadas com células T CD8 naive espoletadas com células de melanoma mortas para se diferenciarem em CTL específicos de melanoma 36
Foi então determinado que as DC carregadas com células T CD8+ naive espoletadas com células de melanoma mortas se diferenciam em CTL específicos de melanoma.
Primeiro, células T CD8+ naive CD45RA+CD45RO“ (>80% puras) foram desenvolvidas em cultura com DC carregadas com células Me275 mortas. Em duas experiências independentes, as células T originadas foram capazes de matar (1) células T2 pulsadas com os quatro péptidos de melanoma (até 70% de lise especifica, (Fig. 10A), (2) células T2 carregadas com um péptido único: tirosinase ou gplOO ou MAGE-3 (Fig. 10A), e (3) a linha de células Me275 utilizada para imunização (dados não mostrados).
Embora sobretudo compreendida por verdadeiras células T naive, o conjunto de células T CD8+ CD45RA+CD45RO” contém uma pequena fracção de células com "memória efectora" que se podem expandir nas nossas condições de cultura. Em consequência, com base na expressão de CD27, o conjunto de células T CD8+ CD45RA+CD45RO“ foi subdividido para distinguir verdadeiramente células T não experimentadas (CD45RA+CD27+) de células T não efectoras (CD45RA+CD27“) (Hamaan, D., et al. "Phenotypic and functional separation of memory and effector human CD8+ T cells" 1997. j. Exp. Med. 186:1407-1418). Quando desenvolvidas em cultura com DC carregadas com células de melanoma mortas, estas células T CD8+ CD45RA+CD27+ originaram CTL específicos de melanoma capazes de matar as células de melanoma utilizadas para imunização (até 75% de lise específica, Fig. 10B) e células T2 pulsadas com péptidos de melanoma (75% de morte específica de péptido de melanoma) (Fig. 10C). A indução de células T específicas de melanoma foi ainda confirmada por IFN-Y ELISPOT com DC autólogos pulsados com péptidos de melanoma (23 pontos específicos de péptidos/105 células T versus 5 pontos/105 células T base, dados não mostrados). Muito importantemente, estas células T naive espoletadas por DC carregadas com células HLA-A201“Colo829 foram capazes de matar alvos de melanoma HLA-A201+ 37 incluindo células Me275, Me290 e SkMel28, demonstrando deste modo espoletamento cruzado (Fig. 11).
Tomados em conjunto, os resultados demonstraram, pela primeira vez, que as DC carregadas com células de melanoma alogénicas mortas podem espoletar células T CD8+ naive para se diferenciarem em CTL específicos para antigénios associados a melanoma partilhados e foram capazes de matar células tumorais HLA correspondentes às células dendríticas. DC obtidas a partir de doentes com melanoma de grau IV capturam células de melanoma mortas ou a morrer e induzem proliferação de células T autólogas
Noutra fase do estudo, foi medida a capacidade das DC derivadas de sangue CD34+HPC em doentes com melanoma de grau IV de capturar células de melanoma mortas ou a morrer e de apresentar os seus antigénios a células T autólogas. Para este fim, as CD34DC no Dia 9 da cultura foram separadas com base na expressão de CDla e CD14. As CD34DC totais e os seus subconjuntos isolados foram desenvolvidos em cultura com células C0L0829 da linha de células de melanoma alogénicas induzidas para morrer com irradiação γ durante 4 horas para permitir a captura de antigénio e, subsequentemente, durante a noite com CD40L para permitir a activação/maturação das DC. Depois disto, as DC foram utilizadas como estimuladores em cultura com células T autólogas. Tal como mostrado na Fig. 12A e 12B, apenas as CD34DC maduras carregadas com células de melanoma mortas ou a morrer induziram proliferação de células T autólogas. Para além disso, embora ambos os subconjuntos fossem capazes de captura de antigénios e de apresentação neste sistema, as DC cdla parecem mais eficientes na indução de proliferação de células T autólogas. Estes dados indicam que as células dendríticas derivadas de CD34+HPC, que consistem de células de Langerhans e DC intersticiais, podem capturar e apresentar corpos de células de tumor alogénicas. As Figuras 13A e 13B demonstram que DC 38 derivadas de monócitos imaturas de um doente com melanoma de grau IV co-desenvolvidas em cultura com células mortas ou a morrer a partir de uma linha de células de melanoma induzem proliferação de quer células T CD4+ (Fig.l3A) quer células T CD8+ (Fig. 13B).
DC carregadas com células de melanoma mortas originam respostas específicas ao melanoma a partir de células T de doentes com melanoma de grau IV
Embora possa ser desejável vacinar doentes com melanoma com DC carregadas com células de melanoma mortas para originar respostas imunológicas, estes doentes podem sofrer de uma disfunção imunológica que se pode reflectir na incapacidade das suas células T do sangue aumentarem as respostas imunológicas especificas do melanoma. (Lee, P.P. et al. "Characterization of circulating T cells specific for tumor-associated antigens in melanoma patients" 1999. Nat. Med. 5:677-685). Verificou-se que as DC carregadas com linhas de células de melanoma alogénicas mortas podem originar CTL específicos do melanoma utilizando células T do sangue de DCs de doentes com melanoma maligno avançado.
Para se determinar se as células τ CD8+ de doentes com melanoma metastático se podem diferenciar em CTL específicos do melanoma eficazes, células T CD8+ purificadas desenvolvidas em cultura durante 3 semanas com DC carregadas com células Me275 mortas contêm células T específicas do melanoma tal como determinado por IFN-γ ELISPOT utilizando DCs pulsadas por péptidos (15 pontos/2 x 105 células T, doente #6, Fig. 14A). Tal como mostrado na Fig. 14B, células T CD8+ purificadas desenvolvidas em cultura com DC carregadas com Me275 mortas geraram linhas de CTL capazes de matar células Me275, quer não pulsadas (50% de lise específica) quer pulsadas com os quatro péptidos de melanoma (88% de lise específica; doente #1) . Em dois doentes, verificou-se que as células T CD45RA+CD45RCTCD8+ 39
desenvolvidas em cultura durante três semanas com DC carregadas com células de melanoma mortas, se diferenciavam em CTL específicos de melanoma, tal como mostrado pela sua capacidade de matar células T2 pulsadas com uma combinação de quatro péptidos de melanoma (Fig. 14C e dados não mostrados).
Exemplo 3: Indução de Uma Resposta Imunológica Contra o Cancro da Mama com DC Carregadas com Linhas de Células de Cancro da Mama Alogénicas
Verificou-se agora que DC carregadas com células de cancro da mama mortas podem induzir proliferação de células T CD4 autólogas. As DC foram primeiro carregadas com células de cancro da mama mortas, quer separadas quer enriquecidas por centrifugação diferencial, e então co-desenvolvidas em cultura em doses graduadas com 1 x 105 células T CD4 autólogas (pureza > 85%). DC derivadas de monócitos e células T foram preparadas tal como descrito nos Exemplos 1 e 2. A captura de células do cancro da mama mortas por DC imaturas foi monitorizada por citometria de fluxo e coloração Giemsa tal como descrito nos Exemplos 1 e 2. Após 5 dias de co-desenvolvimento em cultura com células T, timidina tritiada (NEN, Boston, MA) foi adicionada a cada poço com a actividade de 1 Ci/poço. As placas foram recolhidas 16 horas depois (Wallac, inc., Gaithersburg, MD) e a radioactividade incorporada foi medida tal como descrito atrás. Tal como mostrado na Fig. 15, as DC carregadas induziram células T de voluntários saudáveis a proliferar, indicando que as DC podem processar antigénios a partir de células de cancro da mama mortas e apresentá-los a células T CD4+ autólogas.
Foi também determinado que diferentes células tumorais podem requerer condições únicas para carregar as DCs com células de tumor mortas. 0 método para o carregamento das DC que originou suficiente apresentação de antigénio quando foram utilizadas linhas de células de melanoma ou linha de célula de cancro da próstata mortas, não foi suficiente quando foram utilizadas 40 células de cancro da mama mortas. Deste modo, foi estabelecido um novo método em que as DCs foram co-desenvolvidas em cultura com células de cancro da mama mortas na razão de 1:1, durante 48 horas.
Foi também determinado que linhas de células T possuindo actividade citotóxica contra o cancro da mama podem ser geradas in vitro. DC imaturas foram geradas com células 1806 de cancro da mama alogénicas (mortas através de uma combinação de CHX e ligação Fas, tal como descrito no Exemplo 1), desenvolvidas em cultura durante 48 horas com uma razão de 1:1 na presença de citoquinas TNF-a que induzem a maturação das DC (10 ng/ml), IL-6 (10 ng/ml) e IL-1 (10 ng/ml) (todos da Genzyme). Depois disto, as DC foram utilizadas para estimular células T CD8 autólogas purificadas utilizando os procedimentos descritos nos Exemplos 1 e 2. As células T foram recolhidas utilizando um ensaio de libertação de crómio após três ciclos de estimulação e a sua actividade citotóxica foi determinada utilizando um painel de linhas de células de tumor. Tal como mostrado na Fig. 16, as DC carregadas com corpos 1806 de cancro da mama induziram diferenciação dos CTL capazes de matar células 1806 do cancro da mama com 30% de lise especifica mas não linhas de células K562 NK-sensiveis nem outras células de tumor, LnCaP e MCF-7.
Foi também determinado que as DC carregadas com células de cancro da mama mortas podem originar células T citotóxicas quando desenvolvidas em cultura com os linfócitos do sangue periférico, sem a necessidade de purificação das células T e sem adicionar citoquinas para auxiliar a proliferação das células T (tais como IL-2 e IL-7) . Todos os procedimentos são os mesmos que utilizados atrás excepto que são utilizados linfócitos do sangue periférico em vez de células T CD8 purificadas (Fig. 17) .
Foi também determinado que os CTL específicos do cancro da mama podem ser originados pelas DC carregadas com células de cancro da mama mortas utilizando linfócitos do sangue periférico 41 sem a adição de citoquinas para induzir a maturação das DC durante o carregamento com células de cancro da mama mortas. Deste modo, as DCs imaturas são misturadas com células de cancro da mama mortas (todos os procedimentos como atrás) e desenvolvidas em cultura, durante 48 horas, em CM. Depois disto, as DCs carregadas são utilizadas como estimuladores de linfócitos do sangue periférico autólogos. Todos os procedimentos são como atrás (Fig. 18).
Foi também determinado que o tratamento de células de tumor com IFN-Y aumentaram quer a imunogenicidade das células de tumor mortas (não mostrado) quer a sua susceptibilidade à lise mediada por CTL (Fig. 19) . Todos os procedimentos são os mesmos que atrás excepto que as células de cancro da mama são tratadas com IFN-Y durante 1 semana antes de ser utilizadas como alvos no ensaio de citoxicidade. Através deste método, os CTL específicos de cancro da mama podem ser originados utilizando diferentes linhas de cancro da mama (dados não mostrados), indicando que as DC carregadas com células de cancro da mama mortas ou a morrer podem ser utilizadas na imunização de pessoas contra o cancro da mama.
Exemplo 4: DC carregadas com linhas de células alogénicas podem ser utilizadas para eliminar respostas imunológicas indesejadas
Por causa de linhas de células de tumor alogénicas serem utilizadas como fonte de antigénios tumorais, a resposta aos alo-antigénios pode representar um componente importante das respostas aos CTL induzidas. Por isso, verificou-se que um sistema in vitro permitia a eliminação de células T alo-específicas e um enriquecimento potencial de CTL específicos do antigénio do tumor. A linha de célula C0L0829 de melanoma foi a fonte de alo-antigénios e antigénios associados a tumor, enquanto que a linha de células transformadas EBV (C0L0829-BL) derivadas do mesmo dador foi a fonte de alo-antigénio. 42
As DC foram carregadas com corpos C0L0829, separadas tal como descrito atrás e utilizadas como estimuladoras para a expansão de células T CD8+ autólogas plaqueadas numa razão de 1:5. As células T foram espoletadas no primeiro ciclo utilizando o mesmo procedimento que descrito no Exemplo 1 pelas DC carregadas com C0L0829, recolhidas e subsequentemente co-desenvolvidas em cultura, num segundo ciclo, com as DC carregadas com a linha de células C0L0829-BL transformada com EBV na presença de anticorpo anti-Fas de Fas-ligando exógeno, tal como descrito no Exemplo 1 (Immunotech, Marselha, França). 0 conceito por trás desta aproximação foi o de que a utilização de corpos de células EBV e ligando Fas permite a eliminação de células T alo-reactivas. Após estes dois ciclos de sete dias, as células T CD8+ sobreviventes foram recolhidas e re-estimuladas em mais dois ciclos de sete dias por DC carregadas com corpos de células de melanoma C0L0829 para expandir as células T especificas de antigénio de melanoma. A actividade citotóxica resultante foi determinada num ensaio de libertação de 51Cr corrente utilizando péptidos de melanoma carregados em células T2 e as células K562 NK-sensíveis como alvos (os mesmos métodos tal como descritos atrás). Tal como mostrado na Fig. 20, a linha de CTL originada foi capaz de, especificamente, efectuar a lise de células T2 carregadas com gplOO, tirosinase e em menor extensão com péptidos MART-1. CTL específicos de antigénio de tumor podem ser enriquecidos por eliminação de células T alo-específicas. Estes resultados indicaram uma apresentação cruzada dos antigénios do tumor e a exequibilidade da eliminação dos CTL alo-específicos e proporcionaram a base e as ferramentas para a imunização de doentes com carcinoma da próstata com DC carregadas com corpos de linhas de célula de carcinoma da próstata alogénicas e a identificação de novos e partilhados antigénios associados ao tumor da próstata. 43
Exemplo 5: Indução de uma tolerância específica a antigénios com células que apresentam antigénios carregadas com células alogénicas mortas Células dendriticas podem ser também carregadas com células que expressam um antigénio com o qual as células T podem ser tolerizadas. Isto é demonstrado na Fig. 21 e 22 em que as DCs carregadas são tratadas com compostos que permitem a apresentação de antigénio mas inibem a expressão de moléculas co-estimuladoras. Deste modo, as células T podem reconhecer o antigénio mas tornar-se-ão tolerantes, tal como demonstrado na Fig. 22 e as células T são incapazes de proliferarem quando re-estimuladas com o mesmo antigénio.
As células T CD45RA+CD4+ purificadas foram obtidas de PBMC separado com Ficoll de voluntários saudáveis, esgotado de outras células Utilizando CD8 (B9.ll), CD45RO (UCHLl), CD14 (RM052), CD16 (3G8), CD19 (J4.119), CD56 (NKH-1), anti-HLA-DR (B8.12.2), anticorpos monoclonais (mAbs) anti-glicoforina A (D2.10) (Beckman-Coulter, Miami, FL) e anti-rato igG da cabra Dynabeads (Dynal, lake Sucess, NY) . A pureza das populações enriquecidas foi de >90%. DC derivadas de monócitos imaturas são geradas a partir da fracção aderente de PBMC do sangue periférico, tal como descrito no Exemplo 1. As linhas de células alogénicas (Colo 829, Colo-EBV e Hom2 EBV) são preparadas tal como descrito no Exemplo 1. DCs carregadas com antigénio são preparadas, tal como descrito atrás, para estimular células T CD4 naive, tal como descrito atrás.
No ensaio de tolerância células T CD4+CD45RA+ purificadas (106/poço) foram co-desenvolvidas em cultura em placas de 24 poços com DC imaturas autólogas separadas (1 x 105/poço) carregadas com uma linha de células alogénicas mortas (colo 829) na presença ou ausência de um inibidor de NAC para translocação 44 de NFkB (25 mM, SIGMA) . Após 5 dias, as células T de ambas as co-culturas (-NAC e +NAC) foram recolhidas, lavadas e deixadas em repouso durante 2 dias adicionais. As células T das culturas primárias são re-estimuladas num segundo ensaio de proliferação com os estimuladores indicados na Fig. 22 (colo EBV, Hom2 EBV) . A proliferação é determinada pela incorporação de (1 pCi/poço durante as últimas 16 h) timidina tritiada.
Exemplo 6: Tratamento de doente com células que apresentam antigénio carregadas como células de tumor alogénicas
As respostas anti-tumorais num doente podem ser obtidas por administração de células que apresentam antigénio, incluindo mas não limitadas a DC, carregadas com células de tumor alogénicas mortas. Os antigénios de tumor múltiplos e/ou partilhados apresentados nas células que apresentam antigénio carregadas podem originar respostas imunológicas no doente, conduzindo à rejeição do tumor.
Exemplo 7: Tratamento de doente com células T específicas de antigénio expandidas ex vivo por células que apresentam antigénio carregadas com células de tumor mortas alogénicas
As respostas anti-tumorais num doente podem ser obtidas por administração de células T específicas de antigénio originadas ex vivo por DC carregadas com células de tumor alogénicas mortas. Os antigénios de tumor partilhados apresentados nas células de tumor podem ser reconhecidos pelas células T específicas para antigénios de tumor múltiplos e/ou partilhados, conduzindo à rejeição do tumor.
Exemplo 8: Eliminação das complicações de transplante utilizando células que apresentam antigénio com células dadoras
Ainda noutro aspecto a presente invenção pode ser útil no transplante da medula óssea ou de órgãos. Em particular, a 45 presente invenção permite a eliminação de células T não desejadas que reagem quer contra o transplante quer contra o hospedeiro, que elimina ou minimiza o risco da rejeição do enxertos ou a doença enxerto versus hospedeiro.
As células que apresentam antigénio do dador ou do hospedeiro são carregadas com células B transformadas com EBV mortas ou a morrer do hospedeiro ou do dador, respectivamente. Fármacos imunossupressores tais como a azatioprina, ciclosporina e metotrexato são administrados ao doente, permitindo a morte das células T activadas. Após transplante subsequente não haverá rejeição do enxerto ou doença do enxerto versus hospedeiro, respectivamente, porque as células T reactivas foram eliminadas.
Exemplo 9: Eliminação de doença residual pós-transplante em malignidades hematológicas
Ainda noutro aspecto a presente invenção pode ser útil na eliminação da doença residual em doentes pós-transplante com malignidades hematológicas incluindo, mas não limitado a, leucemias e linfornas.
As células que apresentam antigénio do dador são carregadas com células leucémicas mortas ou a morrer do dador ou linhas de células alogénicas. Tais células que apresentam antigénio carregadas são então administradas a doentes e os antigénios partilhados apresentados nas células que apresentam antigénio carregadas originam respostas imunológicas conduzindo à rejeição do tumor e à eliminação da doença residual.
Lisboa, 9 de Março de 2010. 46 usadas para carregar as células dendríticas e/ou outras células tumor. As células citotóxicas T geradas por exposição a células dendríticas carregadas de antigénio preparadas como aqui descrito podem também ser utilizadas em terapia adoptiva. Esta indução de respostas contra múltiplos antigénios partilhados entre células diferentes, por exemplo, células tumorais, como aqui descrito é importante dado que conduz a extensas respostas imunitárias. Na presente invenção, as células T que estão expostas a células dendríticas carregadas com células assassinas podem ser toleradas contra os antigénios expressos nas células assassinas. Isto pode ser alcançado por manipulação das células dendríticas carregadas que permitem apresentação dos antigénios mas impedem a expressão de moléculas co-estimuladoras. 2
Claims (10)
- REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de células dendríticas para preparar uma composição farmacêutica para induzir uma resposta imunológica citotóxica especifica em relação a um tumor de um doente humano tendo um tumor, em que as referidas células dendríticas são preparadas in vitro através de (a) co-incubação de células dendríticas do referido doente com células de tumores humanas apoptóticas alogénicas, para formar células dendríticas carregadas, em que as referidas células de tumores alogénicas possuem, pelo menos, um antigénio partilhado entre as células de tumores alogénicas e as referidas células de tumores do doente, e em que a referida resposta imunológica citotóxica é direccionada contra o referido antigénio de tumor partilhado para provocar a rejeição do tumor.
- 2. Utilização da Reivindicação 1, em que as referidas células apoptóticas são obtidas a partir de linhas de células alogénicas.
- 3. Utilização da Reivindicação 1 ou 2, em que a referida resposta imunológica citotóxica é direccionada contra antigénios de tumores partilhados múltiplos.
- 4. Utilização de células T citotóxicas para preparar uma composição farmacêutica para induzir uma resposta imunológica citotóxica específica em relação a um tumor num doente que tenha um tumor, em que as referidas células T citotóxicas são preparadas in vitro através de: 1 (a) co-incubação de células dendríticas humanas com células de tumores humanas apóptóticas alogénicas para formar células dendríticas carregadas; e (b) co-cultura das referidas células dendríticas carregadas com células T naive humanas para formar células τ citotóxicas, em que as referidas células de tumores alogénicas possuem, pelo menos, um antigénio partilhado entre as células de tumores alogénicas e as referidas células de tumores do doente, e em que a referida resposta imunológica citotóxica é direccionada contra o referido antigénio de tumor partilhado.
- 5. Utilização da Reivindicação 4, em que as referidas células apóptóticas alogénicas são obtidas a partir de linhas de células alogénicas .
- 6. Utilização da Reivindicação 4 ou 5, em que a referida resposta imunológica citotóxica é direccionada contra antigénios de tumores partilhados múltiplos.
- 7. Utilização da Reivindicação 4 a 6, em que as células citotóxicas são células assassinas naturais ou células T assassinas naturais.
- 8. Utilização da Reivindicação 4 a 6, em que as células citotóxicas são CD4 positivas.
- 9. Utilização da Reivindicação 4 a 6, em que as células citotóxicas são CD8 positivas.
- 10. Ensaio in vitro para determinar o grau de actividade citotóxica de células citotóxicas contra células de tumores de um doente compreendendo: 2 (a) co-incubação de células dendríticas humanas com células de tumores humanas apóptóticas alogénicas possuindo antigénios para os quais é desejada resposta imunológica para formar células dendríticas carregadas; (b) co-cultura das referidas células dendríticas carregadas com células precursoras citotóxicas para formar células citotóxicas; (c) isolamento das referidas células citotóxicas; (d) incubação das referidas células citotóxicas com as referidas células de tumores do doente; e (e) monitorização da morte das referidas células de tumores do doente, em que o grau de morte de células de tumores é proporcional à actividade citotóxica das referidas células citotóxicas. Lisboa, 9 de Março de 2010. 3
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