PT1204421E - Complexos de péptidasproteínas de tensão como vacinas contra patogénios intracelulares - Google Patents

Description

Descrição

Complexos De Péptidas-Proteínas De Tensão Como Vacinas Contra Patogénios Intracelulares A presente invenção refere-se a uma vacina e método para produção dessa vacina. Mais especificamente, a invenção é referente a métodos para a produção de vacinas de complexos fragmentos de péptida antigénica / proteina de choque em células infectadas por patogénios intracelulares e composições obtidas deste modo.

Uma componente importante de qualquer resposta de imunidade humana é a presença em células T da apresentação células de antigénios (APCs) tais como macrófagos, células B ou células dendriticas. Os fragmentos de péptidas de antigénios alheios são apresentados na superfície do macrófago em combinação com moléculas de complexa histocompatibilidade (MHC), em associação com moléculas assistentes, tais como CD4 e CD8. Tais fragmentos de péptidas antigénicas que são apresentados neste modo são reconhecidos pelo receptor T de células T. A interacção de fragmentos de péptida antigénica com o receptor T resulta na proliferação de células T com antigénios específicos e linfoquinas secretadas pelas células T. A natureza dos fragmentos de péptinas antigénicas apresentadas pelos APCs é critica no estabelecimento da imunidade.

As proteínas de choque de calor (HSPs) formam uma família de proteínas altamente conservadas que são vastamente distribuídas pelas plantas e pelos reinos animais. Na base dos seus pesos moleculares, os HSP são agrupados em seis famílias distintas: pequenos (hsp 20-30kDa); hsp40; hsp60; 1/17 hsp70; hsp90; e hsplOO. Ainda que os HSP tenham sido originalmente identificados em células sujeitas à pressão do calor, foi descoberta a sua associação com outras formas de tensão, tais como infecções, e assim mais comummente conhecidas como proteínas de tensão (SPs). Por conveniências, as iniciais SP serão usadas aqui para denotar em geral todas as formas de proteínas de tensão produzidas, sendo as iniciais HSP usadas para denotar as proteínas que foram produzidas por tensão de calor.

Membros da família de mamíferos hsp90 incluem hsp90 cistólico (hsp83) e retículo endoplásmático hsp90 (hsp83), hsp87, Grp94( Erp99) e gp97, ver por exemplo Gething e tal. (1992) Nature 355:33-45. Membros da família hsp70 incluem hsp70 cistólico (p73) e hsp70 (p72), o retículo endoplásmático parcial BiP (GRP78), o mitocondrial parcial hsp70 (Grp75) . Membros da família de mamíferos hsp60 foram somente identificados na mitocondria.

Os SP têm presença frequente nas células. Um dos papéis dos SPs é supervisionar as péptidas de um compartimento celular para outro e apresentar as péptidas às moléculas MHC da apresentação da superfície celular para o sistema imunitário. No caso de células doentes, os SPs também supervisionam as péptidas virais ou com tumor na superfície celular, ver Li e Sirivastave(1994) Behring Inst. Mitt, 94:37-47 e Suzue et al. (1997) Proc.Natl.Acad.Sei. USA 94:13146-51. A função de supervisão é cumprida através da formação de complexos entre os SPs e os fragmentos de péptida antigénica e entre os SPs e os fragmentos de péptida associados a tumor ou vírus numa reacção dependente de ATP. Os SP cooperam com uma variedade de fragmentos de péptidas de largo espectro num modo dependente de ATP. As péptidas em tais complexos aparentam ser uma mistura 2/17 aleatórias de fragmentos de péptidas. As misturas das naturezas exactas dos fragmentos de péptidas ainda não foram determinados. A complexa formação de vários fragmentos de péptidas foi observada também em tecidos normais, não sendo um fenómeno especifico de tumores, ver Srivastava(1994) Experimentia 50:1054-60.

Num contexto terapêutico, foi proposto o uso de mamíferos HSPs como vacinas. As Patentes Internacionais W097/10000 e W097/10001 descrevem que uma mistura de HSPs isolados de células cancerígenas ou infectadas por vírus é capaz de bloquear a imunidade de protecção ou conectar linfócitos T citotóxicos ao tumor ou vírus. No entanto, em contraste, os HSPs isolados de tais células normais são incapazes de bloquear tal imunidade. Não é o caso que os HSPs não sejam imunogénicos por si, mas estão aptos a bloquear a imunidade devido à sua associação com o tumor ou fragmentos de péptidas antigénicos específicos de vírus que são gerados durante o processamento de antigénios. Especificamente os fragmentos de péptidas associados com os HSPs são imunogénicos, e são apresentados às células T. Os HSP livres dos associados fragmentos de péptidas perdem a sua imunogenicidade, ver Udono, H. e Srivastava, P.K., Journal of Experimental Medicine, 178, página 1391 ff, 1993. Até ao presente momento, a natureza destes fragmentos de péptida ainda não foi determinada.

Actualmente acredita-se que a imunogenicidade dos SPs resulta não dos SP por si, mas dos complexos fragmentos de péptidas associados aos SP. Esta conclusão é baseada num número de características dos complexos. Não existe nenhuma diferença na estrutura dos complexos SPs derivados a partir de células normais e células com tumores. Certos complexos de SPs com fragmentos de péptidas perdem a sua 3/17 imunogenicidade mediante o tratamento com ATP, Udone e tal. (1993) J. Exp. Med. 178:1391-96. Tal perda imunogenicidade é devida à dissociação do complexo nas componentes SP e de péptidas. A imunogenicidade das preparações SP depende da presença de células fagóciticas, tais como macrófagos e outros APCs. Pensa-se actualmente que os SPs são tomados por macrófagos, e que os fragmentos de péptidas associados com esses SPS são apresentados às moléculas de classe I através de MHC do macrófago. Deste modo , a resposta da célula T é iniciada. 0 uso de mamíferos HSP/antigénicos com complexos de fragmento de péptidas bem como vacinas contra patogénios intracelulares foi descrito na Patente Internacional WO 95/24923. Os HSP isolados das células infectadas com virus têm sido sugeridos como a fonte das péptidas antigénicas, que poderiam ser posteriormente apresentados às células T. Tal necessita da produção e purificação dos HSPs de tais células. A estimulação das células através de choques de calor produz um aumento generalizado no nivel das proteinas de de choque de calor. A Patente Internacional W098/34641 descreve o tratamento de doenças infecciosas de complexos de proteinas de choque de calor (s) não covalente limitada por moléculas antigénicas.

Em Heikema et al. (1997) as células são infectadas com o virus recombinante Semliki Forest expressando a nucleoproteina do viruz de influência. Os complexos das proteinas de choque dessas células foram usados para imunização. 4/17

Nem na Patente Internacional W098/34641, nem em Heikema et al. (1997) os complexos são obtidos através de calor ou tratamento TNF.

No entanto, não tem sido sugerido que as células possam ser tratadas por choque de calor ou outras tensões, de modo a aumentar os níveis intracelulares dos HSPs. Tal deve-se provavelmente ao facto de ser desejável a estimulação da produção para apenas um pequeno subconjunto de HSPs, que são especialmente imunogénicos, portanto actualmente não existe modo de estimular as células para produzir qualquer subconjunto de HSPs com imunogenicidade melhorada.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Portanto, num primeiro aspecto, a presente invenção providencia um método in vitro para produção de uma composição de vacina, compreendendo componente activo determinante imunogénico, caracterizado por compreender os passos de : a) sujeição das células infectadas com uma bactéria intracelular, protozoário, ou patogénio parasitico para gerar tensão com o calor ou factor de necrose em tumor; e b) extracção de SP/complexos de fragmentos de péptida antigénica a partir das células sujeitas a tensão; e c) uso de produtos extraídos tais como o imunogénico determinante na preparação da composição da vacina. É surpreendente que o tratamento de células infectadas com patogénio intracelular com factores de calor ou de necrose por tumor produza SPs que são mais imunogénicos que os SPs derivados a partir de células não induzidas ou células que foram sujeitas a tensão por outros estímulos. Um aspecto notável do bloqueio de imunidade destes SPs induzidos é a 5/17 memória de longo prazo quando comparados com outros subconjuntos de SPs imunizados. As melhores respostas em termos de memória para bactérias patogénicas são observados em proteínas com calor induzido e em protozoários e patogénios parasíticos com factor de necrose devido a tumor. 0 termo vacina é aqui usado para designar qualquer composição contendo um determinante imunogénico que estimule o sistema imunitário de modo que possa responder melhor a futuras infecções. Será considerado vantajoso que a vacina contenha um determinante imunogénico e um adjuvante, que melhor de modo não especifico a resposta a esse determinante.

Preferivelmente, o determinante imunogénico para a presente invenção é doseado em combinação com um adjuvante. Os adjuvantes adequados podem ser facilmente providenciados por um perito na técnica, tal como um adjuvante Freund completo, um adjuvante Freund incompleto, Quil A, Detox ISCOMs ou esqualeno. No entanto é considerado uma vantagem que a vacina da presente invenção seja eficiente sem um adjuvante. Tal vacina deve ser dada por meios adequados, oralmente ou por injecção.

Os termos proteínas de choque o proteínas de choque de calor, conforme usados aqui, incluem as famílias de proteínas GroEL, GroES e DnaK e DnaJ bactérias HSPs e famílias relativas em outros patogénios extra celulares. Estas famílias são designadas na base da dimensão das péptidas a que dão o nome. As famílias são altamente conservadas entre espécies. Em adição muitas bactérias também expressam homólogos de proteínas eucarióticas. Preferivelmente a vacina contem uma variedade de complexos 6/17 de fragmentos de péptidas antigénicas / SP derivas do patogénio sujeito a tensão. Preferimos particularmente as famílias de proteínas GroEL, GroES, DnaK e DnaJ para serem usados como determinantes imunogénicos na presente invenção com DnaJ e GroEL sendo as preferidas. Preferivelmente os complexos de SP tem uma homologia superior a 25% e/ou 20% para identificar ao nível dos aminoácidos as famílias HSP de indução de calor. A presente invenção necessita que o tratamento de tensão que é usado esteja apto a estimular a presença de SPs dentro das células infectadas. Preferimos que nas células infectadas com protozoários e patogénios parasíticos a indução de tensão sejam por um factor de necrose por tumor e particularmente factor de necrose-α(TNF-a). Em células infectadas por patogénios bacterianos preferimos que a indução de tensão seja por tratamento de calor das células infectadas a uma temperatura de 5-10°C acima do crescimento natural da temperatura da célula não infectada. Sem estarmos restritos à teoria, pensa-se que o tratamento de células infectadas por patogénios intracelulares opera de modo a induzir especificamente aos HSPs mais aptos a interagir com as péptidas antigénicas a partir do patogénio, ou para induzir os HSPs que são mais facilmente fagocitozados por APCs, ou ambos.

As condições óptimas para indução de SPs pode ser prontamente determinada por tentativa e erro e o efeito da mudança de estímulo avaliada através de técnicas convencionais, tais como o teste in vivo em animais ou outras técnicas, por exemplo as descritas em 'Current Protocols in Immunology', Wiley Interscience, 1997. 7/17

Caso as células sejam sujeitas a tensão por tratamento com TNF, o TNF é adequadamente usada a 0.5-1000 unidades internacionais (i.u)/ml de media, preferivelmente cerca de 1-500 i.u/ml. Especificamente para TNF-α preferimos que as células sejam tratadas com 10-500 i.u/ml e sejam depois cultivadas durante 10-16 horas. Alternativamente as células podem crescer em mono-camadas de alimentação e produção de citoquinos ou induzidas para produzir TNF endógeno. Além disso, o tempo de incubação das células varia também com a tensão do estimulo. Preferimos que seja usada uma exposição de 10-16 horas, podendo ser reduzida para 2-4 horas em alguns casos sendo ainda eficiente.

Os meios para testar o calor óptimo ou niveis de TNF e período de incubação estão prontamente disponíveis para um perito na técnica. No entanto será considerada uma mais valia que o tratamento exacto não seja crucial para a invenção desde que o tratamento estimule a produção dos produtos imunogénicos desejados, notavelmente o complexos de fragmentos de péptidas antigénicas/SP, entre as células tratadas. De modo semelhante, as outras condições de tratamento, tais como a duração da exposição e o meio de incubação celular não são aspectos essenciais da presente invenção e pode ser variados mediante a natureza exacta da população de células em que é usada. Meios para variar e optimizar os parâmetros estão facilmente acessíveis a um perito na técnica.

Preferivelmente, o TNF deve ser isolado do organismo no qual a célula é tratada. O tratamento de células com TND provenientes do mesmo organismo providencia uma estimulação óptima da síntese dos complexos de SP. NO entanto, o use de TNF de outras espécies ou indivíduos pode ser útil na majoração da regulação dos níveis de SP nas células, de 8/17 modo a providenciar complexos SP adequados para o uso na presente invenção.

Qualquer célula patogénio infectada adequada ou linha de células pode ser usada na presente invenção, para providenciar uma origem de complexos SP. As células infectadas são obtidas por infecção de uma linha de células adequadas com o patogénio desejado in vitro ou através da isolação de células infectadas pelo patogénio in vivo. As células infectadas deste modo podem ser depois sujeitas a tensão adequada in vitro para produzir complexos de SP imunogénico adequados para a vacinação desse patogénio. Tal inclui células recombinantes que expressem antigénios heterologos a partir do patogénio intracelular desejado. Estes também incluem todos os tipos de células afectadas recombinantes usadas para produzir vacinas recombinantes, tais como linhas de células de mamíferos afectados com vectores recombinados através de métodos Standard na técnica tais como a electropuração, fusão e fosfato de cálcio. Além disso, a invenção também inclui a formação dos complexos de SP desejados a partir de células eucarioticas que expressam antigénios de patogénio intracelular heterologo que respondem ao tratamento por calor ou TNF. Ainda que os fragmentos anitigénicos são predominantemente proteínas e péptidas, estes ainda podem incluir carbohidratos, ácido nucleico e lípidos que inibem os SPs.

Será apreciado que as células infectadas por patogénios intracelulares para o uso presente possam ter sido modificadas para lhes permitir uma síntese de SPs normalmente induzida pelos adequados estímulos de pressão extra celulares usando qualquer adequada técnica DNA recombinante, por exemplo as descritas em 'Current Protocols in Molecular Biology', Wiley Interscience, 1997. 9/17 A extracção e purificação dos materiais induzidos a partir do material celular através da aplicação de tensão, notavelmente complexos de fragmentos de péptidas antigénicas/SP, a partir do material celular remanescente podem ser obtidos usando qualquer técnica adequada. Por exemplo a tensão do matéria tratado pode ser por homogeneização ou fragmentação ultrasónica, seguida de uma centrifugação para obter a preparação SP de crude. As preparações endógenas de crude SP podem ser usadas directamente como a vacina da invenção. Opcionalmente, as preparações SP podem ser adicionalmente purificadas através de colunas ADP ou outros métodos adequados prontamente disponíveis para um perito na técnica, ver por exemplo as descrições das Patentes WO 97/1000 e WO 97/10001.

Será considerado uma mais valia o facto de os complexos de fragmentos de péptidas antigénicas/SP imunogénicos específicos, poderem ser isolados a partir da mistura de complexos produzidos a partir da tensão do material celular de modo produzir uma vacina especifica para este patogénio. No entanto, tal não será usualmente necessário podendo ser uma mistura de complexos usada para induzir imunidade de amplo espectro. Caso seja desejado, os fragmentos específicos de péptida antigénica podem ser recuperados a partir do complexo, por exemplo através do tratamento com ATP usando técnicas convencionais.

Os complexos de fragmentos de péptidas anitgénicas/SP da vacina da presente invenção podem ser prescritos em combinação com um adjuvante e numa carreira aquosa. Os adjuvantes adequados são claros para um perito na técnica, tais como o adjuvante completo de Freund, o adjuvante incompleto de Freund, Quil A, Detox, ICOMs ou esqualeno. No 10/17 entanto, as composições de vacina da presente inveção podem ser eficientes sem recurso a um adjuvante. A invenção também providencia o uso de uma invenção de uma vacina em combinação opcional com um adjuvante, na preparação de um medicamento para bloqueio de imunidade de resposta no animal. 0 animal é tipicamente um humano. No entanto, a invenção também pode ser aplicada a outros mamíferos tais como cavalos, gado, caprinos, ovelhas ou suinos, e a pássaros, notavelmente domésticos tais como galinhas ou perus.

As composições de vacinas da presente invenção podem ser administradas através de meios adequados, tais como oralmente, por inalação, transdermicamente ou através de injecção por qualquer meio de carreira médio. No entanto, é preferível administrar a vacina numa composição aquosa através da injecção usando qualquer agulha adequada ou com técnicas que não necessitem de agulhas.

As vacinas da invenção podem conter qualquer concentração adequada de complexos de fragmentos de péptidas antigénicas/SP. Preferimos que os complexos de SP sejam administrados de 10-600 μqr preferivelmente 10-100 \x.q, ainda preferivelmente 25 μρ, por Kg de massa corporal do animal a ser tratado. Será preferido que a vacina da presente invenção possa ser aplicada como tratamento inicial seguida de um ou mais tratamentos subsequentes com as mesmas ou outras taxas de dosagem num intervalo de 2 6 semanas entre cada tratamento para providenciar imunização prolongada contra o patogénio.

Os exemplos seguintes são providenciados para ilustração, não sendo no entanto limitativos. As figuras 1 3 são perfis 11/17 de Capilares Zona Electroforecticas (CZE) de complexos de SP obtidos através de vários métodos de tensão. A Figura 1 é um perfil de CZE de péptidas/polipéptidas isoladas da conjunção de SPs isolados de M. Tuberculosis rato peritoneal infectado com macrofagos; A Figura 2 é um perfil CZE de péptidas/polipéptidas isoladas de SPs isolados do rato peritoneal infectado com macrofagos M. Tuberculosis; a Figura 3 é um perfil de CZE de péptidas/polipéptidas isoladas de SPs TNF-induzido isolados do rato peritoneal infectado com macrofagos M. Tuberculosis.

Exemplo 1: Preparação de SPs induzidos por calor

As células infectadas com M. Bovis foram lavadas num meio livre de cera, tal como RPMI(Sgima), sendo depois aquecidas a 45°C por hora ou 42°C por 5 horas e cultivados durante a noite. As células são então lavadas num meio livre de cera, sendo de seguida lavadas com salinas borrifadas com fosfato (PBS) . As células são então novamente suspensas por um tampão homogeneização. 0 tampão de homogeneização pode ser um tampão hipotónico, tal como 10 mM fosfato pH 7.4 com 2mM MgCI2, após o qual as células são separadas usando um dispositivo de homogeneização de células (ex. um dispositivo Dounce ou Potter, ou Ultraturrax ou Waring). Alternativamente, o tampão de homogeneização pode conter detergente, tal com PBS com 0.%Tween, sendo a concentração de detergente entre 0.1-1% e adequada para solubilizar a membrana da célula. 0 dano celular é então tratado por centrifugação, tipicamente 3-5000g durante 5 minutos, para remover os resíduos das células e dos núcleos, seguidos de uma alta velocidade de centrifugação, tipicamente 100,000g durante 15-30 minutos. O sobrenadante assim obtido é processado para originar complexos fragmentos de péptida antigénica/SP adequados para uso na vacina. Tal pode ser 12/17 simplesmente feito por precipitação de sulfato de amónio que usa um corte de 20-70% de sulfato de amónio. Especificamente 20% (w/w) é adicionado a 4°C, seguido de uma adição de mais sultato de amónio, tal como salina, para remover o sulfato de amónio antes do uso. Será apreciado que os complexos de SP isolados deste modo não sejam purificados por homogeneização, mas que sejam adequados para uso como componente de vacina.

Caso seja necessário um complexo de SP purificado, os complexos podem ser purificados a partir do sobrenadante, através de afinidade por cromatografia em matrizes com difosfato de adenosina, tal como ADP-agarose ou sefarose de ADP. Estes métodos são descritos nas Patente WO 97/10000, WO 97/10001 e WO 97/10002.

Os complexos de SP podem ser usados a qualquer concentração para providenciar um determinante imunogénico na composição da vacina. Preferimos que a quantidade de complexo de SP induzida que é administrada esteja entre 10-600 μq, preferivelmente 10-100 μρ, ainda preferivelmente 25 μρ por kg da massa corporal do animal.

De modo a determinar a imunogenicidade dos complexos de SP, as análises de proliferação de células T pode ser usada. As análises adequadas incluem reacções mistas de linfócitos(MLR), analisados por timidina tritiada, analises de toxicidade para determinar a libertação de 511CR a partir das células alvo, ver 'Current Protocols in Immunology' Wiley Interscience, 1997. Alternativamente, a produção de anticorpos pode ser examinada, usando análises convencionais ou avaliadas através de protecção intraneurina, ver 'Current Protocols in Immunology'. 13/17

Exemplo 2: Preparação de SPs TNF-induzidos:

As linhas de células induzidas pelo patogénio malarial plasmodio foram incudas num meio livre de cera, tal como RPMI(Sigma) , e incubadas com TNF-α durante a noite. Tipicamente o os figados de rato hepatócitos preparados por tratamente de colagenese de tecido de figado de rato, foram infectados por plasmodio Berghei através de um incubação das células do figado do rato com cerca de 3 vezes o número de células parasita, durante 5 horas a 35°C. As células permaneceram durante a noite a 37°C com e sem TNF-α. As células TNF-induzidas e as células de controlo foram então lavadas num meio livre de cera seguido de uma lavagem numa salina borrifada com fosfato(PBS).

As células são então novamente suspensas com um tampão de homogeneização e deformadas usando um homogeneizador de células, por ciclos de congelamento ou através de detergente. 0 lisato celular é então tratado por centrifugação, tipicamente 3-5000g durante 5 minutos, para remover os resíduos das células e do núcleo, seguidos de alta velocidade de centrifugação, tipicamente 100,000g durante 15-30 minutos. O sobrenadante assim obtido é processado para originar um SP complexo adequado para uso numa vacina conforme descrito no Exemplo 1.

Exemplo 3: Imunização com SPs induzidos; imunidade no recipiente da vacina:

Os SPs foram preparados conforme descrito acima e os ratos e coelhos foram vacinados com 1-10 microgramas de proteína de tensão contendo extracto de salina borrifada de fosfato e distribuídos com doses de vacinas idênticas um mês após a injecção inicial. A indução de imunidade do patogénio foi 14/17 analisada por uma análise Western blot usando unicamente plasmódio ou proteinas M. bovís. Os niveis de anticorpos de 1:1-10,000 foram obtidos de modo rotineiro sendo a actividade citotóxica das células T direccionada para as células infectadas com o patogénio que também poderiam ser detectadas no rato imunizado. Os coelhos foram sujeitos a plasmodio M. bovis durante períodos de 6,12 e 18 meses após as imunizações iniciais reultaram na produção de boas respostas de anticorpos com 1:10 000 indicando boas respostas de memória nos animais imunizados.

Exemplo 4: Comparação das péptidas associadas em complexos de SP induzidos e constituídos e o seu uso em vacinas

Os ratos peritoneais isolados de macrofagos através de lavagem de cavidade peritoneal foram infectados com M. Tuberculosis (3Χ10Λ6 células incubadas com 10Λ7 células bacterianas durante 6hrs a 35°C). As culturas de células infectadas cresceram durante a noite na presença ou ausência de lug/ml TNF-α a 37°C, para a isolação da SPs TNF-induzidos ou constituídos, ou chocados a calor através de incubação a 42°C durante duas horas para a isolação dos SPs induzidos por calor (HSPs). As células tratadas foram comprimidas por centrifugação a 3000g durante 5 minutos e e novamente suspensas na solução de 1% em lOOmM Tris-HCI, pH8. O lisato celular foi centrifugado a 5000 durante 5 minutos para remover os detritos das células e dos núcleos, seguido de uma alta velocidade de centrifugação a 100,000 g durante 15-30 minutos. Os SPs e HSps foram preparados a partir dos lisatos limpos da precipitação de sulfato de amónio conforme descrito no Exemplo 1 acima.

As péptidas associadas foram removidas dos HSPs e SPs purificados e novamente suspensas nos complexos 15/17 precipitados em 10% de ácido acético ficando em vapor durante 15 minutos para dissociar os complexos. O HSPs desnaturados e os SPs comprimidos numa Beckman durante 30 minutos num quarto frio contendo as péptidas sobrenadantes extraídas por secagem a frio e analisando a zona capilar por electroforese usando um sistema CZE Beckman. Os perfis das péptidas removidas dos SPs M. Tuberculosis TNF-induzidos ou constituídos foram significativamente diferentes entre si conforme mostrado nas Figuras 1-3, indicando que todos os tipos de SPs considerados nas diferentes famílias de péptidas associadas. A imunização dos coelhos evidenciou similar estrutura de anticorpos em animais imunizados com SPs TNF-induzidos ou constituídos relativamente a anticorpos com estrutura significativamente superior (10-50x) em animais imunizados com SPs bacterianos com calor induzido. A imunização com misturas de péptidas removidas e SPs ou HSPs desnaturados a partir dos quais são isolados originou uma fraca resposta de anticorpos indicando que a imunidade nativa necessária, permanece intacta em complexos de péptidas SP associados.

Exemplo 5: Comparação de vacinas com SPs induzidos e constituídos

Os hepatócitos de fígado de rato foram preparados através da digestão forçada de colagenese (PVG) em fígados de rato através de uma mistura fina e lavagem de células isoladas através da centrifugação por DMEM em meios de cultura de tecidos. As células lavadas foram novamente suspensas numa densidade de célula de 7χ10Λ6 células/ml e infectadas com Plasmodio Berghei através de co-cultura a 37°C durante 4 horas. As células infectadas foram usadas para preparar lisatos para análise de anticorpos, ou cultivadas durante a noite na presença ou ausência de lug/ml TNF-α a 37°C para 16/17 isolamento de SPs TNF-induzidos ou constituídos. AS células foram comprimidas através de centrifugação a 3000g durante 5 minutos e novamente suspensas em soluções de 1% de tween em lOOmM Tris-HCI, pH8. O lisato celular foi centrifufado a 5000g durante 5 minutos para remover os resíduos do celulares e do núcleo, seguidos de elevada velocidade de centrifugação a 100,000g durante 15-30 minutos. O lisato limpo foi então usado para análise de anticorpos ou para isolamento de SPs. Os SPs TNF-induzidos ou constituídos foram preparados a partir dos lisatos limpos através da precipitação de sulfato de amónio conforme descrito no Exemplo 1 acima.

Os coelhos foram imunizados com SPs isolados de TNF-induzido ou constituído e bactérias novamente suspensas a calor induzido em salina borrifada com fosfato sem a adição de qualquer adjuvante na primeira ou posteriores vacinas. As estruturas de anticorpos nos animais imunizados foram analisadas em 10 séries de diluições usando um ensaio em todas os lisatos celulares a partir de hepatocitos recentemente contamindos conforme descrito na análise acima. Os animais vacinados com SPs TNF-induzidos evidenciaram uma estrutura de anticorpos 10 a 100 vezes superior do que nos imunizados SPs constituídos.

Lisboa, 11 de Fevereiro de 2009 17/17

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um método in vitro para produção de uma composição de vacina, compreendendo componente activo determinante imunogénico, caracterizado por compreender os passos de: a) sujeição das células infectadas com uma bactéria intracelular, protozoário, ou patogénio parasitico para gerar tensão com o calor ou factor de necrose em tumor; e b) extracção de SP/complexos de fragmentos de péptida antigénica a partir das células sujeitas a tensão; e c) uso de produtos extraídos tais como o imunogénico determinante na preparação da composição da vacina.
2. 2. Um método conforme reivindicado na reivindicação 1, em que o ingrediente activo do determinante imunogénico consiste predominantemente em ou mais complexos de fragmentos de péptidas antigénicas/proteinas de choque.
3. 3. Um método conforme reivindicado nas reivindicação 1 ou 2, caracterizado por as células serem infectadas por patogénios bacterianos e que a tensão aplicada seja o calor.
4. 4. Um método conforme reivindicado na reivindicação 3, em que a tensão de calor é obtida através do aquecimento de 5 a 8°C acima da temperatura normal da cultivação das células.
5. 5. Um método conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado por as células serem infectadas através de patogénios parasiticos e que a tensão seja induzida por um factor de necrose por tumor. 1/2
6. 6. Um método conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por as células terem sido modificadas para induzir a síntese de proteínas de tensão.
7. 7. Uma composição para vacina contendo um determinante imunogénico, caracterizada pelo determinante imunogénico ser produzido através de um método conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
8. 8. Uma composição para vacina conforme reivindicado na reivindicação 7, caracterizada por a composição também compreender um adjuvante para o determinante imunogénico.
9. 9. Uma composição para vacina conforme reivindicado nas reivindicações 7 ou 8, caracterizada por a composição ser uma composição aquosa.
10. 10. Uso de uma composição para vacina conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações 7 a 9 para a preparação de um medicamento para bloqueamento de resposta de imunização do animal.
11. 11. O uso conforme reivindicado na reivindicação 10, caracterizado pela composição para vacina ser para administração para injecção. Lisboa, 11 de Fevereiro de 2009 2/2