PT116424B

PT116424B - Formulação biofertilizante microbiana

Info

Publication number: PT116424B
Application number: PT116424A
Authority: PT
Inventors: Miguel Da Silva Marques Guilhermina; Silva Laranjeira Sara; Isabel Ribeiro Pereira Sandra; Alexandra Domingos Reis Sara
Original assignee: Univ De Tras Os Montes E Alto Douro
Priority date: 2020-05-25
Filing date: 2020-05-25
Publication date: 2022-11-30
Also published as: PT116424A

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO ENQUADRA-SE NA ÁREA DA AGRICULTURA SUSTENTÁVEL. É OBJETO DA PRESENTE INVENÇÃO UMA MISTURA DE MICRORGANISMOS COM PROPRIEDADES ESTIMULANTES E PROMOTORAS DO CRESCIMENTO DAS PLANTAS PARA USO COMO BIOFERTILIZANTES E A SUA UTILIZAÇÃO COMO COMPLEMENTO OU EM SUBSTITUIÇÃO DE FERTILIZANTES SINTÉTICOS. A MISTURA DESTES ORGANISMOS PROMOVE AINDA A TOLERÂNCIA DAS PLANTAS AO STRESS HÍDRICO. A PRESENTE INVENÇÃO APRESENTA AINDA O MÉTODO DE PRODUÇÃO E APLICAÇÃO NAS SEMENTES, NO SOLO OU NOS SUBSTRATOS DE SEMENTEIRA.

Description

DESCRIÇÃO

FORMULAÇÃO BIOFERTILIZANTE MICROBIANA

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao uso de microrganismos promotores do crescimento das plantas para uso como biofertilizantes na produção agrícola. Enquadra-se na área da agricultura sustentável por contribuir para a redução ou eliminação do uso de compostos químicos de síntese, que têm impactos negativos na saúde e no ambiente. Em particular, apresenta a composição e método de produção de um biofertilizante promotor do crescimento e produtividade de plantas e aumento da tolerância das culturas à acidez e secura.

uso de biofertilizantes microbianos baseados em microrganismos habitantes naturais do solo é uma estratégia biotecnológica para melhorar a produtividade das plantas, a resistência a doenças e tolerância a condições desfavoráveis de crescimento, como a falta de água no solo, pH desfavorável ou a reduzida fertilidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Nas últimas décadas deu-se um enorme avanço no conhecimento da microbiologia do solo, em resultado do desenvolvimento das técnicas moleculares que permitiram revelar uma enorme diversidade microbiana e impulsionar o seu uso biotecnológico na produção agrícola. Um elevado número de

- 2 microrganismos da rizosfera, ou associados intimamente ao sistema radicular das plantas, tem merecido particular atenção pelo seu potencial em melhorar a produtividade das culturas. Estes microrganismos que colonizam as raízes das plantas, protegem as plantas e melhoram o seu crescimento por diversos mecanismos, são geralmente designados por rizobactérias promotoras do crescimento das plantas (PGPB, plant growth promoting bactéria). Este grupo de microrganismos inclui uma elevada diversidade de espécies, principalmente pertencentes aos géneros Bacillus, Pseudomonas, Burkholderia, Azospirillum, entre outros.

Vários estudos têm demonstrado que muitos destes microrganismos apresentam, em simultâneo, propriedades biofertilizantes e antagonistas contra agentes fitopatogénicos. Assim, as PGPB podem atuar como biofertilizantes, bioestimulantes, biorremediadoras ou agentes de controlo biológico/biopesticidas (Lugtenberg and Kamilova, 2009; Ma et al., 2016).

As PGPB são consideradas simbiontes universais de plantas superiores capazes de melhorar o seu desenvolvimento. Os mecanismos de promoção de crescimento das plantas incluem a melhoria da fixação de nutrientes, como a fixação de azoto atmosférico, a solubilização do fósforo e do potássio, a síntese de fito-hormonas, como o ácido indolacético (AIA) e citoquininas, a produção de ácidos orgânicos e a decomposição dos resíduos orgânicos, permitindo melhorar o teor de matéria orgânica do solo (Bulgarelli et al., 2013; Souza et al., 2015). Por outro lado, conferem proteção contra agentes fitopatogénicos (fungos, insetos, nemátodos) funcionando como agentes de controlo biológico, principalmente através da produção de compostos químicos

- 3 (por exemplo, antibióticos, cianeto de hidrogénio (HCN), de enzimas, bem como pela ativação da resistência sistémica induzida. Além disso, promovem o estabelecimento e a nutrição das plantas em condições desfavoráveis de crescimento (Glick, 2010; Nadeem et al., 2014), permitindo melhorar a produtividade e qualidade da produção agrícola (Vejan et al., 2016) e contribuir para uma agricultura sustentável (Kundan et al., 2015).

As PGPBs podem influenciar o crescimento das plantas pela modificação da assimilação de nutrientes, por exemplo, pela alteração da ramificação radicular ou pela solubilização de nutrientes. Por exemplo, reduzidos níveis de fosfato solúvel pode limitar o crescimento das plantas, sendo normalmente esse problema resolvido com adição de adubos fosfatados. Algumas PGPBs são capazes de solubilizar o fosfato a partir de fontes orgânicas e inorgânicas, disponibilizando-o para a planta (Wang et al., 2017).

Um grupo particular de microrganismos benéficos são os genericamente designados rizóbios, capazes de estabelecer associação simbiótica com plantas leguminosas específicas para a fixação biológica do azoto atmosférico. No entanto, os rizóbios são capazes também de colonizar as raízes de plantas não leguminosas e produzir fito-hormonas, sideróforos e cianeto de hidrogénio, exercendo antagonismo contra os agentes fitopatogénicos (Glick, 2012).

A capacidade das PGPBs terem grande capacidade de adaptação a condições desfavoráveis como a secura (Niu et al., 2018), salinidade, (Mayak et al. 2004), temperatura elevada (Rajkumar et al., 2017), e solos contaminados (Babu et al., 2015), demonstra o potencial para a melhoria da

- 4 produtividade agrícola em áreas desfavoráveis e pouco férteis.

Estes microrganismos benéficos são considerados, assim, uma alternativa ecológica que permite reduzir o impacto ambiental da agricultura (por exemplo, emissões gasosas, lixiviação, aumento da salinidade) e, por este facto, tem sido uma área prioritária de investigação para o desenvolvimento de novos produtos para uma produção agrícola mais amiga do ambiente, onde se inclui o modo de produção biológico, em franco crescimento em todo o mundo.

uso de PGPBs permite restaurar a fertilidade natural dos solos, conservar a biodiversidade, reduzir a pegada ecológica da agricultura, melhorar a segurança alimentar e promover a resistência das culturas a fatores como a salinidade, a secura, temperaturas extremas, doenças, etc. Uma grande vantagem do uso de PGPBs em agricultura sustentável é que podem atuar tanto como biofertilizantes como biopesticidas. 0 uso de biofertilizantes microbianos permite deste modo contribuir para diminuir os problemas ambientais e na saúde humana, resultantes da agricultura convencional muito baseada em produtos químicos e, simultaneamente, aumentar a resiliência das culturas agrícolas às alterações climáticas (Sayyed e Patel, 2011; Sayyed et al., 2019).

De modo a que estes benefícios se façam sentir nas culturas agrícolas, é essencial garantir uma população suficiente destes organismos associados ao sistema radicular, traduzida num elevado número de unidades formadoras de colónias (UFC) por grama de solo. Por este facto, tem-se desenvolvido o mercado dos biofertilizantes microbianos de modo a garantir

- 5 que determinados microrganismos benéficos estão associados a uma particular cultura, com o objetivo de beneficiar das suas propriedades. De igual modo se tem desenvolvido diversos métodos de aplicação dos inóculos no solo ou no revestimento das sementes (Rocha et al., 2019).

O interesse no uso de inóculos microbianos na agricultura para o aumento da produção e para garantir maior sustentabilidade no sector e produzir alimentos mais seguros, tem sido crescente. No entanto, esta estratégia depende da disponibilidade de microrganismos selecionados pela sua eficiência, tolerância a condições ambientais, sobrevivência ao armazenamento, facilidade de aplicação e capacidade de competir com as populações de microrganismos autóctones do solo (Bashan et al.,2014; Patil e Solanki,2016).

Assim, há uma necessidade continua de isolar e identificar novos microrganismos benéficos para as culturas e testar a sua compatibilidade com as práticas agrícolas e adaptação às várias condições edafoclimáticas. Além disso deve ser testado o seu comportamento isoladamente ou em consórcio de modo a avaliar potenciais sinergismos.

Existem várias patentes neste domínio, como o pedido de patente US9687000 que divulga estirpes microbianas, composições e seus métodos de utilização para melhorar o crescimento e/ou o rendimento de uma planta. Também divulga materiais e métodos para apresentar, inibir ou tratar o desenvolvimento de patogéneos de plantas ou doenças fitopatogénicas.

- 6 A inoculação de plantas com microrganismos benéficos selecionados é uma prática que permite a redução ou substituição de fertilizantes sintéticos que têm impacto na qualidade da água, provocam desequilíbrios nos ecossistemas agrícolas e prejudicam a qualidade do solo. Esta é uma prática biológica que estimula a atividade microbiana do solo e contribui para uma intensificação agrícola mais sustentável e em equilíbrio com o ambiente. A seleção destes microrganismos deve ter em conta a sua capacidade de colonização do sistema radicular e adaptação a diferentes condições ambientais, tipos de solos e compatibilidade com as práticas agrícolas.

A combinação de microrganismos eficientes com diferentes propriedades promotoras do crescimento das plantas pode levar ao estabelecimento de sinergismos entre eles, com melhoria da capacidade de adaptação a diferentes condições edafoclimáticas, aumento da capacidade competitiva com os microrganismos autóctones do solo e vantagens na produtividade das plantas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção inclui uma mistura de bactérias promotoras do crescimento de plantas (PGPB, plant growth promoting rhizobacteria) para a promoção do crescimento das plantas, aumento da produtividade, resistência a doenças e tolerância a condições desfavoráveis de crescimento.

Na presente invenção, desenvolveu-se uma mistura de microrganismos biofertilizantes com diferentes propriedades e adequadas a uma grande gama de plantas, incluindo leguminosas e, em particular, a cultura do grão-de-bico. As

- 7 culturas de plantas leguminosas são uma importante fonte de proteína na alimentação humana e animal. Uma vez que estas culturas são muitas vezes produzidas em condições de solos pobres, ácidos e sem irrigação, a produtividade pode ser reduzida e desincentivar o estabelecimento destas culturas. No entanto, as tendências da alimentação e os benefícios das plantas leguminosas para a fertilidade do solo, tornam estas culturas muito interessantes para sistemas de produção sustentáveis e resilientes às alterações climáticas.

Estes biofertilizantes são adequados para o modo de produção biológico e são capazes de se estabelecer nas culturas, mesmo em condições de acidez do solo. Muitos microrganismos benéficos apresentam sinergismo na sua atividade, pelo que se procura introduzir, no mesmo biofertilizante, microrganismos com diferentes propriedades compatíveis e que se complementam. Estes biofertilizantes microbianos representam assim uma alternativa aos fertilizantes sintéticos que apresentam impactos negativos no ambiente e na saúde humana.

Entre as propriedades conferidas pela mistura de bactérias destacam-se a assimilação de azoto atmosférico, a solubilização do fósforo, a produção de sideróforos, de ácido indolacético e de cianeto de hidrogénio (HCN), que são características importantes para a produtividade e sanidade das culturas agrícolas.

A eficácia dos inóculos bacterianos depende da utilização de métodos de produção adequados bem como de uma formulação que permita assegurar que um número suficiente de microrganismos é fornecido às sementes ou à planta no momento da inoculação. De modo a que estes produtos sejam acessíveis e representem

- 8 uma alternativa viável aos fertilizantes e pesticidas de síntese é necessário assegurar um processo simples e pouco dispendioso de produção. Após o crescimento das culturas bacterianas em meio líquido, a formulação do produto pode ser sólida ou líquida, utilizando materiais de suporte acessíveis e que promovam a proteção das células bacterianas, bem como sejam fáceis de transportar e armazenar. Estes microrganismos podem ser utilizados em conjunto ou individualmente, de acordo com os benefícios que se pretende obter.

uso destes produtos é compatível com as práticas normais de produção agrícola embora seja desaconselhável o uso de pesticidas de síntese que podem reduzir as populações destes microrganismos e exigir um maior número de aplicações.

No âmbito da presente invenção são descritos ensaios de avaliação em culturas de grão-de-bico em condições de campo submetidos a diferentes níveis de irrigação e stress hídrico.

Os microrganismos benéficos para as plantas, incluindo PGPBs e rizóbios, podem reduzir ou eliminar o uso de fertilizantes sintéticos na agricultura, pela melhoria da nutrição das plantas e aumento da tolerância a condições desfavoráveis de crescimento e a agentes patogénicos. As propriedades destes microrganismos apresentam grande interesse agronómico e ambiental pela redução do uso de agroquímicos que têm impactos negativos no ambiente, resultantes de emissões, lixiviação e aumento da salinidade.

uso destes microrganismos benéficos para as plantas promove a melhoria da germinação e estabelecimento das culturas e na melhoria da produtividade e segurança alimentar, com redução

- 9 no uso de agroquímicos. Os biofertilizantes baseados em PGPB são considerados uma alternativa natural aos fertilizantes sintéticos, pois aumentam a produtividade agrícola através da melhoria da assimilação e solubilização dos nutrientes do solo, estimulação da ramificação radicular, associação simbiótica com plantas leguminosas e melhoria da tolerância a condições desfavoráveis de crescimento como salinidade, acidez ou défice hídrico.

A presente invenção engloba também o método de produção e métodos de aplicação nas sementes.

Numa primeira etapa da produção do inoculo, o crescimento das bactérias pode fazer-se em meio de cultura líquido, como Caldo de Triptona de Soja, a 28 °C, numa incubadora orbital com 120 rpm de agitação, ou em meio sólido, como Agar de Triptona de Soja (TSA) ou Agar de Manitol e Extrato de Levedura (YMA). Após 72 horas de crescimento as culturas são centrifugadas e/ou suspensas em solução de cloreto de sódio (NaCl a 0,8%, p/v)) de modo a atingir uma densidade óptica de 0,5 num espetrofotómetro a 600 nm, correspondendo a uma concentração entre 1X10⁷-1x10⁸ unidades formadoras de colónias por mililitro de solução (UFC/mL).

Numa forma de realização, as bactérias são ser formuladas em meio líquido, em água ou outras soluções aquosas, em gel ou adicionadas a um suporte sólido esterilizado, como vermiculite ou turfa para serem posteriormente aplicadas diretamente nas sementes, no solo ou nos substratos de sementeira.

Numa forma de realização adicional, a formulação da presente invenção é ainda utilizada no revestimento de sementes previamente desinfetadas superficialmente e revestidas com

- 10 diversos materiais adesivos, de suporte e nutricionais para assegurar a sobrevivência mais prolongada dos microrganismos.

Numa forma de realização a inoculação das sementes é feita por revestimento das sementes ou peletização de modo simples, nas explorações agrícolas, utilizando uma misturadora ou um saco, ou a nível industrial recorrendo a equipamento mais sofisticado. O material de suporte pode ser turfa, argila, talco, vermiculite, serrim, pó de cortiça, farelos de cereais, entre outros. Como adesivos pode usar-se polímeros sintéticos ou naturais como metilcelulose, carboximetilcelulose, goma arábica, óleo vegetal, entre outros. A escolha destes materiais pode ter em conta a disponibilidade, custo, origem e impacto ambiental.

Numa outra forma de realização, as bactérias são usadas em combinação com outras substâncias fertilizantes ou promotoras do crescimento das plantas, nomeadamente fungos micorrízicos.

Numa forma de realização adicional, outras bactérias e fungos, por exemplo, pertencentes aos géneros Bacillus, Paenibacillus, Trichoderma, Beauveria, Cordyceps, Metarhizium, Paecilomyces e, entre outros, são adicionados à mistura.

Os métodos e a composição microbiana apresentada na invenção pode ser aplicada a várias culturas agrícolas e ornamentais, preferencialmente nas hortícolas e frutícolas.

Numa forma de realização, a presente invenção refere-se a uma formulação biofertilizante compreendendo pelo menos dois microrganismos isolados caracterizada por os referidos

- 11 microrganismos serem selecionados a partir de Pseudomonas sp., Burkholderia sp., Mesorhizobium sp. e/ou suas misturas, cada um dos referidos microrganismos isolados compreendendo uma sequência de ácido desoxirribonucleico (ADN) com pelo menos 99% de identidade com uma sequência selecionada a partir da seguinte lista: SEQ. n° 1, SEQ. n° 2, SEQ. n° 3, SEQ. n° 4, SEQ. n° 5, SEQ. n° 6, SEQ. n° 7, SEQ. n° 8, SEQ. n° 9, SEQ. n° 10, SEQ. n° 11 e/ou SEQ. n° 12.

Num modo de realização adicional, a presente invenção referese adicionalmente a uma formulação biofertilizante compreendendo pelo menos dois microrganismos isolados, cada um dos referidos microrganismos compreendendo uma sequência de ADN com 100 % de identidade com uma sequência selecionada a partir da seguinte lista SEQ. n° 1, SEQ. n° 2, SEQ. n° 3, SEQ. n° 4, SEQ. n° 5, SEQ. n° 6, SEQ. n° 7, SEQ. n° 8, SEQ. n° 9, SEQ. n° 10, SEQ. n° 11 e/ou SEQ. n° 12.

Num modo de realização adicional, a presente invenção referese adicionalmente a uma formulação biofertilizante compreendendo três microrganismos isolados, cada um dos referidos microrganismos compreendendo uma sequência de ADN com pelo menos 99 % de identidade com uma sequência selecionada a partir da seguinte lista: SEQ. N° 1, SEQ. n° 2, SEQ. n° 3, SEQ. n° 4, SEQ. n° 5, SEQ. n° 6, SEQ. n° 7, SEQ. n° 8, SEQ. n° 9, SEQ. n° 10, SEQ. n° 11 e/ou SEQ. n° 12.

Num modo de realização adicional, a presente invenção referese adicionalmente a uma formulação biofertilizante compreendendo três microrganismos isolados, cada um dos referidos microrganismos compreendendo uma sequência de ADN

- 12 com 100 % de identidade com uma sequência selecionada a partir da seguinte lista SEQ. N° 1, SEQ. n° 2, SEQ. n° 3, SEQ. n° 4, SEQ. n° 5, SEQ. n° 6, SEQ. n° 7, SEQ. n° 8, SEQ. n° 9, SEQ. n° 10, SEQ. n° 11 e/ou SEQ. n° 12.

Num modo de realização adicional, a presente invenção referese adicionalmente a uma formulação biofertilizante, na qual o/s microrganismo/s isolado/s é/são bactéria/s.

Num modo de realização adicional a presente invenção referese a um biofertilizante que compreende adicionalmente outros compostos fertilizantes, pesticidas, outros microrganismos, promotores do crescimento de plantas ou outros compostos químicos e/ou suas combinações.

Num modo de realização adicional a presente invenção referese a um biofertilizante que compreende microrganismos pertencentes aos géneros Bacillus, Paenibacillus, Trichoderma, Beauveria, Cordyceps, Metarhizium, Paecilomyces e/ou fungos micorrízicos.

Num modo de realização adicional a invenção refere-se a uma formulação biofertilizante sólida, em gel ou líquida.

Num modo de realização adicional a presente invenção referese a sementes de plantas revestidas com a formulação da presente invenção, que podem num modo de realização compreender adicionalmente óleo vegetal.

Num modo de realização adicional a presente invenção referese a um método de revestimento das referidas sementes compreendendo os seguintes passos: i) desinfeção das referidas sementes;

ii) revestimento das referidas sementes com material adesivo, de suporte e/ou nutricional para promover a sobrevivência dos microrganismos;

iii) inoculação das referidas sementes com a formulação da presente invenção, que pode ser por revestimento ou peletização.

Num outro modo de realização a presente invenção refere-se a um método de revestimento de sementes caracterizado por o material de suporte ser turfa, argila, talco, vermiculite, serrim, pó de cortiça, farelos de cereais, e/ou suas combinações.

Num outro modo de realização a presente invenção refere-se a um método de revestimento de sementes em que o material adesivo ser um polímero sintético ou natural como metilcelulose, carboximetilcelulose, goma arábica, óleo vegetal, e/ou suas combinações.

Num modo de realização adicional a presente invenção referese a um método de produção do biofertilizante caracterizado por compreender os seguintes passos:

i) produção do inoculo de Pseudomonas sp., Burkholderia sp., Mesorhizobium sp. e/ou suas misturas em meio líquido ou sólido;

ii) centrifugação e/ou suspensão do inoculo em solução de NaCl até atingir a densidade óptica desejada;

iv) formulação das bactérias para posterior utilização.

Num modo de realização adicional a presente invenção referese a um método caracterizado por a densidade óptica se encontrar no intervalo entre 1X10⁷-1x10⁸ unidades formadoras de colónias por mililitro de solução.

- 14 Num modo de realização a presente invenção refere-se ainda ao uso do biofertilizante aqui descrito na indústria agrícola e ornamental, preferencialmente na produção de hortícolas e frutícolas, mais preferencialmente na produção de leguminosas, ainda mais preferencialmente na produção de grão-de-bico.

Num modo de realização a presente invenção refere-se ainda ao uso da formulação biofertilizante da presente invenção como complemento ou em substituição de fertilizantes sintéticos.

Num modo de realização a presente invenção refere-se ainda ao uso da formulação biofertilizante da presente invenção como biopesticida.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 - Representação da relação filogenética da bactéria Burkholderia sp. DSM 33394 baseada nas sequências do gene 16S rDNA. Ά história evolutiva foi inferida pelo método Neighbor-Joining. As distâncias evolutivas foram calculadas usando o método Kimura 2 - parameter. Análises evolutivas foram realizadas no software MEGA (v. 6.0).

Figura 2 - Relação filogenética da bactéria Mesorhizobium sp. symbiovar ciceri DSM 33395 baseada nas sequências do gene 16S rDNA. A história evolutiva foi inferida pelo método Neighbor-Joining. As distâncias evolutivas foram calculadas usando o método Kimura 2 - parameter. Análises evolutivas foram realizadas no software MEGA (v. 6.0).

- 15 Figura 3 - Relação filogenética da bactéria Pseudomonas sp. DSM 33393 baseada nas sequências do gene 16S rDNA. A história evolutiva foi inferida pelo método Neighbor-Joining. As distâncias evolutivas foram calculadas usando o método Kimura 2 - parameter. Análises evolutivas foram realizadas no software MEGA (v. 6.0).

Figura 4 - Relação filogenética das bactérias Mesorhizobium sp. symbiovar ciceri DSM 33395 e Burkholderia sp. DSM 33394 baseada nas sequências do gene nodC. A história evolutiva foi inferida pelo método Neighbor-Joining. As distâncias evolutivas foram calculadas usando o método Kimura 2 parameter. Análises evolutivas foram realizadas no software MEGA (v. 6.0).

Figura 5 - Relação filogenética da bactéria Burkholderia sp. DSM 33394 baseada nas sequências do gene nodA. A história evolutiva foi inferida pelo método Neighbor-Joining. As distâncias evolutivas foram calculadas usando o método Kimura 2 - parameter. Análises evolutivas foram realizadas no software MEGA versão 6.0.

Figura 6 - Relação filogenética da bactéria Burkholderia sp. DSM 33394 baseada nas sequências do gene gyrB. A história evolutiva foi inferida pelo método Neighbor-Joining. As distâncias evolutivas foram calculadas usando o método Kimura 2 - parameter. Análises evolutivas foram realizadas no software MEGA (v. 6.0).

Figura 7 - Relação filogenética da bactéria Mesorhizobium sp. symbiovar ciceri DSM 33395 baseada nas sequências do gene gyrB. A história evolutiva foi inferida pelo método Neighbor-Joining. As distâncias evolutivas foram calculadas

- 16 usando o método Kimura 2 - parameter. Análises evolutivas foram realizadas no software MEGA (v. 6.0).

Figura 8 - Relação filogenética da bactéria Pseudomonas sp. DSM 33393 baseada nas sequências do gene gyrB. A história evolutiva foi inferida pelo método Neighbor-Joining. As distâncias evolutivas foram calculadas usando o método Kimura 2 - parameter. Análises evolutivas foram realizadas no software MEGA (v. 6.0).

Figura 9 - Relação filogenética da bactéria Burkholderia sp. DSM 33394 baseada nas sequências do gene SMc00019. A história evolutiva foi inferida pelo método Neighbor-Joining. As distâncias evolutivas foram calculadas usando o método Kimura 2 - parameter. Análises evolutivas foram realizadas no software MEGA (v. 6.0).

Figura 10 - Relação filogenética da bactéria Mesorhizobium sp. symbiovar ciceri DSM 33395 baseada nas sequências do gene SMc00019. A história evolutiva foi inferida pelo método Neighbor-Joining. As distâncias evolutivas foram calculadas usando o método Kimura 2 - parameter. Análises evolutivas foram realizadas no software MEGA (v. 6.0).

Figura 11 -Relação filogenética da bactéria Pseudomonas sp. DSM 33393 baseada nas sequências do gene SMc00019. A história evolutiva foi inferida pelo método Neighbor-Joining. As distâncias evolutivas foram calculadas usando o método Kimura 2 - parameter. Análises evolutivas foram realizadas no software MEGA (v. 6.0).

Figura 12 - Produção de duas cultivares de grão-de-bico (Elixir e CHK 3357) em função dos tratamentos [C = controlo

- 17 - plantas não inoculadas, PGPB = plantas inoculadas com uma mistura de bactérias promotoras do crescimento {Pseudomonas sp. strain DSM 33393, Burkholderia sp. DSM 33394 e Mesorhizobium sp. simbiovar ciceri DSM 33395) sob diferentes regimes de irrigação [100, 50 e 25 % das necessidades hídricas (WR) , 100% das WR durante a fase reprodutiva (floração e enchimento do grão) (Dl) e sequeiro (R). Os dados representam as médias para os dois anos de ensaio (2018 e 2019). Tratamentos com a mesma letra, dentro de cada gráfico, não apresentam diferenças significativas (P> 0.05).

Figura 13 - Produção de duas cultivares de grão-de-bico (Elixir e CHK 3357) em função dos tratamentos de inoculação [C = controlo - plantas não inoculadas, PGPB = plantas inoculadas com uma mistura de bactérias promotoras do crescimento {Pseudomonas sp. DSM 33393, Burkholderia sp. DSM 33394 e Mesorhizobium sp. simbiovar ciceri DSM 33395) . Os dados representam as médias para os dois anos de ensaio (2018 e 2019). Tratamentos com a mesma letra, dentro de cada gráfico, não apresentam diferenças significativas (P> 0.05).

Figura 14 - Produção de duas cultivares de grão-de-bico (Elixir e CHK 3357) em função do regime de irrigação [100, 50 e 25 % das necessidades hídricas (WR), 100% das WR durante a fase reprodutiva (floração e enchimento do grão) (Dl) e sequeiro (R) . Os dados representam as médias para os dois anos de ensaio (2018 e 2019). Tratamentos com a mesma letra, dentro de cada gráfico, não apresentam diferenças significativas (P> 0.05).

Figura 15 - Produção de duas cultivares de grão-de-bico (Elixir e CHK 3357) em função dos tratamentos [C = controlo - plantas não inoculadas, PGPB = plantas inoculadas com uma

- 18 mistura de bactérias promotoras do crescimento (Pseudomonas sp. DSM 33393, Burkholderia sp. DSM 33394 e Mesorhizobium sp. simbiovar ciceri DSM 33395), PGPB+AMF = plantas inoculadas com a anterior mistura de bactérias promotoras de crescimento e uma mistura de fungos micorrizicos arbusculares(Rhizophagus irregularis BEG140, Funneliformis geosporum BEG199 e Claroideoglomus claroideum BEG210), sob diferentes regimes de irrigação [100, 50 e 25 % das necessidades hídricas (WR), 100% das WR durante a fase reprodutiva (floração e enchimento do grão) (Dl) e sequeiro (R) . Os dados representam as médias para os dois anos de ensaio (2018 e 2019). Tratamentos com a mesma letra, dentro de cada gráfico, não apresentam diferenças significativas (P> 0.05) .

Figura 16 - Produção de duas cultivares de grão-de-bico (Elixir e CHK 3357) em função dos tratamentos de inoculação [C = controlo - plantas não inoculadas, PGPB = plantas inoculadas com uma mistura de bactérias promotoras do crescimento (Pseudomonas sp. DSM 33393, Burkholderia sp. DSM 33394 e Mesorhizobium sp. simbiovar ciceri DSM 33395), PGPB+AMF = plantas inoculadas com a anterior mistura de bactérias promotoras de crescimento e uma mistura de fungos micorrizicos arbusculares (Rhizophagus irregularis BEG140, Funneliformis geosporum BEG199 e Claroideoglomus claroideum BEG210). Os dados representam as médias para os dois anos de ensaio (2018 e 2019) . Tratamentos com a mesma letra, dentro de cada gráfico, não apresentam diferenças significativas (P> 0.05).

Figura 17 - Produção de duas cultivares de grão-de-bico (Elixir e CHK 3357) em função do regime de irrigação [100, 50 e 25 % das necessidades hídricas (WR), 100% das WR durante

- 19 a fase reprodutiva (floração e enchimento do grão) (Dl) e sequeiro (R) . Os dados representam as médias para os dois anos de ensaio (2018 e 2019). Tratamentos com a mesma letra, dentro de cada gráfico, não apresentam diferenças significativas (P> 0.05).

Os diferentes aspetos da invenção são pormenorizados na descrição detalhada da invenção que se apresenta de seguida, com as respetivas reivindicações.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

As técnicas e procedimentos a seguir descritos são bem compreendidos por peritos da área em que se enquadra a invenção.

As bactérias foram selecionadas pelas suas caracteristicas bioquímicas e benefícios que conferem às plantas em condições de estufa e em condições de campo, em particular no aumento da produtividade e na tolerância à secura e acidez do solo.

As bactérias apresentam-se em culturas puras, identificadas como Pseudomonas sp. UTAD11.3 (depositada como DSM 33393), Burkholderia sp. UTADB34 (depositada como DSM 33394) e Mesorhizobium sp. UTADM31 (depositada como DSM 33395). Apresentou-se a origem geográfica, método de isolamento, caracterização fisiológica e molecular com as respetivas sequências nucleotídicas utilizadas na identificação e números de depósito das sequências no GenBank (National Center for Biotechnology Information). Para identificação e estabelecimento das relações filogenéticas, as sequências

- 20 foram comparadas com as de estirpes bacterianas tipo disponíveis no GenBank e alinhadas utilizando o algoritmo Multiple Alignment using Fast Fourier Transform (MAFTT). A análise filogenética fez-se utilizando o software Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) versão 6.0. As sequências das diferentes regiões analisadas apresentam-se abaixo e as relações filogenéticas destas bactérias apresentam-se nas figuras 1 a 11.

As estirpes foram avaliadas quanto à sua capacidade de induzir nódulos nas raízes de grão-de-bico. Além disso, foi avaliada a ocorrência de quatro mecanismos promotores do crescimento de plantas, nomeadamente, solubilização de fósforo, produção de ácido indolacético (IAA), produção de cianeto de hidrogénio (HCN) e a produção de sideróforos.

A capacidade de solubilização de fósforo foi aferida através de um ensaio de placas usando o meio de crescimento de fósforo do NBRIP (National Botanical Research Institute) . Este meio contém 5 g L^-1 de fosfatos insolúveis minerais fosfato tricálcico (Ca3(PO4)2) ou fosfato de alumínio (ALPO4) , como única fonte de fósforo (Nautiyal 1999) . O pH do meio foi ajustado a 7,0 antes da autoclavagem. As bactérias foram colocadas nas placas e a atividade solubilizadora do fosfato foi detetada pela formação de um halo em volta da colónia de acordo com escalas de solubilização (Brígido et al., 2017).

A capacidade de produção de sideróforos foi estimada qualitativamente pelo ensaio Chrome Azurol S (CAS) (Alexander e Zuberer 1991) . Uma aliquota de 10 mL da cultura bacteriana foi aplicada no meio CAS e posteriormente incubada a 30°C durante 5 dias. A produção de sideróforos é revelada pela mudança do meio CAS de azul para laranja.

- 21 A produção de ácido indolacético foi avaliada por um método colorimétrico descrito por Patten e Glick (2002) com algumas modificações. As culturas bacterianas incubaram à temperatura de 28 °C em meio Agar Extrato Malte Levedura (YMA) suplementado com triptofano (250 pg mL^_l) até atingirem a fase estacionária. Após a incubação, as células bacterianas foram centrifugadas a 8500 x g durante 5 minutos e 2 mL do sobrenadante foi usado para inocular 4 mL do reagente Salkowski (1 mL 0.5M FeCls em 50 mL ácido perclórico a 35%) e 100 pL de ácido ortofosfórico. Após a incubação à temperatura ambiente durante 25 min, no escuro, a absorvância foi medida a 530 nm. Ά concentração de IAA foi calculada por comparação com uma curva de calibração utilizando como padrão IAA puro.

A produção de cianeto de hidrogénio (HCN) foi detetada pelo método qualitativo definido por Bakker e Schippers (1987). As culturas bacterianas cresceram em meio Luria-Bertani Agar (LBA) suplementado com glicina (4.4g L^-1) . A tampa da placa de Petri continha um filtro Whatman No.l previamente impregnado em 0.5% de ácido picrico e 2% de carbonato de sódio. Ά alteração da cor do papel de filtro de amarelo para castanho é uma indicação da produção de HCN.

A seleção das bactérias fez-se em condições de estufa, com base no aumento do crescimento e da produtividade das plantas de grão-de-bico, e posteriormente em condições de campo, em solos ácidos (pH=5.4), geralmente desfavoráveis à simbiose rizóbio-leguminosas.

A nova mistura de bactérias é constituída pelas estirpes Pseudomonas sp. UTAD11.3, Burkholderia sp. UTADB34 e

- 22 Mesorhizobium sp. UTADM31. As estirpes foram depositadas em cultura pura no Leibniz Institute, DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, sob o número de depósito DSM 33393, DSM 33394 e DSM 33395, respetivamente.

As novas estirpes de bactérias biofertilizantes são definidas pelas suas sequências nucleotidicas do gene 16S do ARN ribossomal e por outras regiões genómicas indicadas na lista de sequências, que foram depositadas no National Center for Biotechnology Information (NCBI).

As sequências são mencionadas abaixo como SEQ n°l, SEQ n°2, SEQ n°3, SEQ n°4, SEQ n°5, SEQ n°6, SEQ n°7, SEQ n°8, SEQ n°9, SEQ n°10, SEQ n°ll, SEQ n°12 e consistem, respectivamente, em:

SEQ n° 1 (Pseudomonas sp. UTAD11.3, DSM 33393, 16S rDNA) com número de registo no NCBI MN880080:

ACACATGCAAGTCGAGCGGATGAAAGGAGCTTGCTCCTGGATTCAGCGGCGGACGGGTG AGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATA CCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGC CTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTG GT C T GAGAGGAT GAT CAGT CACAC T GGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGG CAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTG AAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGTTGTAGATTAATAC TCTGCAATTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGC GGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTG GTTTGTTAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGG CAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAT ATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGC GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTC AACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGC CTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCG GTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCA ATGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAGCATTGAGACAGGTGCTGCATGGC TGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGT CCTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGA GGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCT ACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGA TCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCG

- 23 CGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACC ATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTTACCACGG TGT

SEQ n° 2 (Pseudomonas sp. UTAD11.3, DSM 33393, SMc00019) com número de registo no NCBI MN882345:

GAACTTTGCCCACACCTTGACCTACATCGTCGAGCACACGGCCAATGGCGCGATGGGGC TGGTGGTCAACAGGCCGCAAGACTTGAACCTGGCCGACATCCTCGAGCAGCTGCGCCCG GACATCGAGCCGCCGGCGCGTTGCCAGGATGTGCCGATCTTCATCGGCGGGCCGGTGCA GACCGATCGCGGTTTCGTCCTGCACCCGGCGGGCCAGACCTTCCAGGCCACGGCGCAGC TGGACGGCGACCTGGCCCTGTCGACTTCGCAGGACGTGCTGTTTGCCATCGCTGACGGC GTCGGCCCCGCGCAGAGCCTGATCACCCTCGGTTACGCCGGTTGGGAAGCCGGGCAACT GGAAGCCGAACTGGCCGACAACGGCTGGCTCACCTGCCC

SEQ n° 3 (Pseudomonas sp. UTAD11.3, DSM 33393, gyrB) com número de registo no NCBI MN882342:

TACAAGGTATCCGGCGGTCTGCACGGCGTAGGTGTGTCGGTAGTGAACGCGCTGTCCGA AGAACTGGTCCTGACTGTGCGCCGCAGTGGCAAGATCTGGGAACAGACTTACGTTCACG GTGTGCCTCAGGCACCGATGGCCATCGTTGGCGACAGCGAAACCACCGGTACCCAGATC CACTTCAAGGCTTCCAGCGAAACCTTCAAGAACATTCACTTCAGCTGGGACATTCTCGC CAAGCGCATTCGTGAACTGTCCTTCCTCAACTCCGGTGTCGGCATCGTCCTCAAGGACG AGCGCAGCGGCAAGGAAGAGCTGTTCAAGTACGAAGGTGGCCTGCGTGCGTTCGTTGAA TACCTGAACACCAACAAGACTGCGGTCAATCAGGTGTTCCACTTCAACATCCAGCGTGA AGACGGCATCGGCGTGGAAATCGCCCTGCAGTGGAACGACAGCTTCAACGAGAACCTGT TGTGCTTCACCAACAACATTCCGCAGCGCGACGGCGGCACCCACCTGGTGGGCTTCCGC TCGGCGCTGACGCGTAACCTGAACAACTACATCGAGCAGGAAGGTCTGGCGAAGAAGCA CAAAGTCGCCACCACCGGTGACGACGCTCGTGAAGGCCTGACCGCGATCATCTCGGTGA AAGTGCCGGATCCGAAGTTCAGCTCGCAGACCAA

SEQ n° 4 (Burkholderia sp. UTADB34, DSM 33394, 16S rDNA) com número de registo no NCBI MN880078:

AGCACGGGTGCTTGCACCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACAT GTCCTGTAGTGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCGCATACGATCCACGGA TGAAAGCGGGGGACCTTCGGGCCTCGCGCTATAGGGTTGGCCGATGGCTGATTAGCTAG TTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAG CCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTG GACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTG TAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATCCTTGACTCTAATACAGTCGGGGGATGACGGTA CCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCG AGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTGCTAAGACCGATGT GAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTGGCAGGCTAGAGTATGGCAG AGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGAT GGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAATACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAA

- 24 CAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATT CATTTCCTTAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAA GATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAAT TCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGGTCGGAATCCTGCTGAGAGGT GGGAGTGCTCGAAAGAGAACCGGCGCACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGC

SEQ n° 5 {Burkholderia sp. UTADB34, DSM 33394, nodC) com número de registo no NCBI MN882348:

ACGCAAGGCGCAGATCGCCGCCATCCGCCGCTCATCTGGAGATTTCGTGCTCAGCGTCG ACTCTGACACGACACTTGCGTCCGACGTCATCACAAAGCTTGCAGTAAAAATGCGGGAT TCCATGGTCGGAGCGGCCATGGGCCAGCTGACGGCATACAACCGCAGCGACACTTGGTT GACCCGATTGATCGATATGGAATACTGGCTGGCTTGCAATGAGGAGCGCGCGGCGCAAG GTCGCTTTGGTGCGGTCATGTGCTGCTGCGGCCCATGTGCAATGTACCGCCGGTCTTGT CTCCTTTCTCTGCTGGATCAATACGAGACGCAGCTGTTCAGGGGGAAACCAAGCGACTT CGGTGAAGACCGTCATCTTACGATCCTCATGCTGAAAGCAGGCTTTCGAACCGAGTACG TTCCAGGTGCCGTCGCGGCGACAGTCGTTCCGGACAAGATGGGACCTTATTTGCGCCAA CAACTCCGCTGGGCACGAAGCACCTTCCGGGACACGATGCTTGCGCGAGGTCTACTGCG TGGCCTGGATCGCTATCTAACTTTGGATGTGATGGGAGAGAATCTCGGCCCATTGTTGC TCGGCATCGCGGTAGTAACGGCGCTCGGTGAGCTACTATTTTCACATACAGTAAATTGG TGGACGGTGCTGGCTATTGTCACGATGACCATAATCAGATCTACGGTGTTATCTTTCCG C AC T C GGC AG C T T C GAT T CAT C G G C ΤΆΤ T CAAT GC AC

SEQ n° 6 {Burkholderia sp. UTADB34, DSM 33394, nodA) com número de registo no NCBI MN882346:

GACTTTTTTCGAAAGACCTATGGACGGACTGGCGCCTTCAACGCGGAGCCATTCGAAGG CGGCCGCAGTTGGGCCGGCGCGAGGCCGGAATTCCGCGCAATCGGCTACGACGCGCATG GGGTAGCGGCTCACATCGGCATGCTGCGGCGCTTCATCAAAGTTGGCGAGGTCGACTTG ATCGTCGCTGAATTGGGCCTGTACGCGGTTCGTCCGGATCTTGAAGGGCTCGGAATCGG TTTTTCGATGCGCGTGGCGTACCCAGTGCTCCATCAGTTGGGTGTTCCATTCGCTTTCG GCACGGTTCGGCACGCGCTGCGAAACCATGTCGAAAGATTCTGCAGAGCCGGCCTCGCG AACATTGTGTCGGGCGTTCGCGTACGATCGACCCGTCCAGATGTGCATCCCGACCTGCC GCCCACGCGCCTGGAAGACGTACTCGTGTTGGTTTCGCCGATCGGACGCTCGATGGACG AGTGGCCGTCCGGTACCCTGATCGACCGGAACGGTCCGGAACTATGAAGCCTCTGGACT ACATATGCGAAGGGCAGAGTGACAATGCCGATGGCACTGCAGAGCGCAGCGTCTA

SEQ n° 7 {Burkholderia sp. UTADB34, DSM 33394, SMc00019) com número de registo no NCBI MN882343:

TCGGGAACGGTGGTCTATCTTTGCGATCACAGCGAGCGCGGTGCGCTCGGCCTCGTCAT CAATCGTCCGACCGACATCGATCTCGAATCGCTGTTCAACCGCATCGACCTGAAGCTCG ACATCGAGCCGCTGCTGCACATTCCGGTGTACTTCGGCGGTCCGGTCCAGACCGAGCGC GGCTTCGTGCTGCACGAGCCGGTCGAGGGCGCGAGCTACAACTCGTCGATGTCCGTCGA CGGCGGGCTCGAGATGACGACGTCGAAGGACGTGCTCGAGGCGGTCGCAACGGGCACCG GCCCGAAGCGCTTCCTGCTCACGCTCGGCCATGCGGGCTGGGGCGCCGGGCAGCTCGAG GAAGAAATTGCCCGCAACGGCTGGCT

- 25 SEQ n° 8 (Burkholderia sp. UTADB34, DSM 33394, gyrB) com número de registo no NCBI MN882340:

TGCACGGCGTGGGCGTGTCGTGCGTGAACGCGCTGTCGAGCTGGCTGCGCCTCACCGTC CGCCGCGACGGCAAGAAGCGCTTCATGGAATTCCACCGCGGCGTCGCGCAGGATCGCGT GCTCGAAGTGGTGGACGGCGTGGAAGTGTCGCCGATGCTCGTGACCGGCGACACCGAGA ACCGCGGCACCGAAGTGCATTTCATGGCCGATCCGACCATTTTCGGCACGGTCGAGTAT CACTACGACATCCTCGCGAAGCGGATGCGCGAGCTTTCGTTCCTGAACAACGGCGTGCG GATTCGTCTCACGGACCTGCGCTCGGGCAAGGAAGACGATTTCGCGTTCGCCGGCGGCG TGAAGGGCTTCGTCGAGTACATCAACAAGACGAAGACCAACCTGCACCCGACCGTGTTC TTCGCCAACGGCGAGAAGGACGGCGTGGGCGTCGAAGTCGCGATGCAGTGGAACGACAG CTACAACGAGAACGTGCTGTGCTTCACGAACAACATTCCGCAGCGCGACGGCGGCACGC ACCTGACCGGCCTGCGGGCCGCGATGACGCGCGTCATCAACAAGTACATCACCGACAAC GAAATCGCGAAGAAGGCGAAGGTCGAGACGACCGGCGACGACATGCGCGAAGGGCTGTC GTGCGTGCTCTCCGTGAAGGTGCCGGAGCCGAAGTTCAGCTCGCAGACGAAGGACAA

SEQ n° 9 (Mesorhizobium sp. UTADM31, DSM 33395, 16S rDNA) com número de registo no NCBI MN880079:

GTCGAGCGCCCCGCAAGGGGAGCGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATCTACCCAT CTCTACGGAACAACTCCGGGAAACTGGAGCTAATACCGTATACGTCCTTCGGGAGAAAG ATTTATCGGAGATGGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCCTAC CAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACATTGGGACTGAGACAC GGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGA TCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCAACGGTGA AGATAATGACGGTAACCGTAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTA ATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATA TTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTTTGATACTGGGTAT CTCGAGTCCGAGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTC GGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGGTACTGACGCTGAGGTGCGAAA GCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGGAAGCT AGCCGTTGGCAAGTTTACTTGTCGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGCTTCCCGCCTGGG GAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGA GCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCCCTTGACATCCCGGTCG CGGTTTCCAGAGATGGATTCCTTCAGTTCGGCTGGACCGGTGACAGGTGCTGCATGGCT GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCC

SEQ n° 10 (Mesorhizobium sp. UTADM31, DSM 33395, nodC) com número de registo no NCBI MN882347:

ACGCAAGGCGCAGATCGCCGCCATCCGCCGCTCATCTGGAGATTTCGTGCTCAGCGTCG ACTCTGACACGACACTTGCGTCCGACGTCATCACAAAGCTTGCAGTAAAAATGCGGGAT TCCATGGTCGGAGCGGCCATGGGCCAGCTGACGGCATACAACCGCAGCGACACTTGGTT GACCCGATTGATCGATATGGAATACTGGCTGGCTTGCAATGAGGAGCGCGCGGCGCAAG GTCGCTTTGGTGCGGTCATGTGCTGCTGCGGCCCATGTGCAATGTACCGCCGGTCTTGT CTCCTTTCTCTGCTGGATCAATACGAGACGCAGCTGTTCAGGGGGAAACCAAGCGACTT

- 26 CGGTGAAGACCGTCATCTTACGATCCTCATGCTGAAAGCAGGCTTTCGAACCGAGTACG TTCCAGGTGCCGTCGCGGCGACAGTCGTTCCGGACAAGATGGGACCTTATTTGCGCCAA CAACTCCGCTGGGCACGAAGCACCTTCCGGGACACGATGCTTGCGCGAGGTCTACTGCG TGGCCTGGATCGCTATCTAACTTTGGATGTGATGGGAGAGAATCTCGGCCCATTGTTGC TCGGCATCGCGGTAGTAACGGCGCTCGGTGAGCTACTATTTTCACATACAGTAAATTGG TGGACGGTGCTGGCTATTGTCACGATGACCATAATCAGATCTACGGTGTTATCTTTCCG CACTCGGCAGCTTCGATTCATCGGCTATTCAATGCAC

SEQ n° 11 (Mesorhizobium sp. UTADM31, DSM 33395, SMc00019) com número de registo no NCBI MN882344:

ACGCGCTCGGTCATCTACATCTGCGCGCACAGCGATGAAGGCGCGATGGGCCTGATCAT CAACCAGACGCAGCAGATGCTGTTTCCGGATCTGTTGGTGCAGCTCGGCATCATGAACG AGCAGGAGGCGATCCGCCTGCCGGCGCAGGCGCGCGATTTCGTCGTGCGCAACGGCGGG CCTGTCGACCGCAGCCGCGGCTTTGTCCTGCATTCGGGCGATTACCGCGTGGAATCGTC GCTGACCGTTTCCGACGACATCTGTCTGACCGCGACGGTCGATATATTGCGCGCCATAT CGTCGGGCCGCGGCCCGCGTCACGCGCTGATGGCGCTCGGTTATTCCGGCTGGGGCGCC GGCCAGTTGGAAACCGAGATCGCCGAGAACGGCTGGCT

SEQ n° 12 (Mesorhizobium sp. UTADM31, DSM 33395, gyrB) com número de registo no NCBI MN882341:

CCTGCACGGCGTCGGCGTGTCGGTCGTCAACGCCCTGTCGGCCTGGCTGAAGCTGAAGA TTCGCCGCAACGGCCATATCTTCGAGATGAGCTTCACGCATGGCAACGCCGACGCGCCG CTGCGCATCACCGGCAGTTATGAACAGGACAAGGTCCCCGGCACCTATGAAGGGCGCAG CGGCAGCGAAATCACGTTCTTGCCGTCGTCCGAGACCTTCACCATGGTCGAATTCGACT ACGGTACGCTGGACCATCGGCTGCGCGAACTCGCCTTCCTGAACTCCGGCGTGCGCATC GTTTTGACCGATGCCCGCCATGCCGACATCGTGCGCCATGAACTGCATTACGATGGCGG GCTGGAAGAGTTCGTCCGATATCTCGATCGGACGAAGAAGCCGTTGCTCGACAAGCCAA TTTCAATCCGCGCCGAGCGGGACGGCATCACCGTCGAAGTCGCCATGTGGTGGAACGAC AGCTACCATGAAAACGTGCTGGCGTTCACCAACAACATCCCGCAACGCGACGGCGGCAC GCACCTTGCAGGCTTTCGCGGCGCGCTGACACGCCAGATAACCGGCTATGGCGACTCCT CGGGCCTGACCAAGAAGGAAAAAGTGGCGCTGATCGGCGACGATTGCCGCGAAGGGCTC ACCGCGGTGCTGTCGGTCAAGGTTCCCGACCCGAAATTCTCC

A bactéria Pseudomonas sp. UTAD11.3 (DSM 33393), identificada nas SEQ. n°l, n°2 e n°3, é uma bactéria que foi isolada de raízes de plantas de grão-de-bico (Cicer arietinum L) na região de Aveiro, em Portugal.

As bactérias Burkholderia sp. UTADB34 (DSM 33394), identificada nas SEQ. n°4, n°5, n°6, SEQ.n°7 e n°8 e Mesorhizobium sp. UTADM31 (DSM 33395), identificada nas SEQ. n°9, n°10, n°ll e SEQ. n°12 foram isoladas de nódulos de

- 27 plantas de grão-de-bico (Cicer arietinum L.) recolhidas na região de Eivas, em Portugal.

As plantas de onde se recolheram os nódulos foram colhidas em culturas instaladas em solos sem historial de uso de inóculos microbianos. 0 isolamento fez-se pelos procedimentos descritos por Vincent (1970). A superfície dos nódulos foi esterilizada pela imersão inicial em 3% (v/v) de solução de hipoclorito de sódio durante 2 minutos, seguida da passagem por etanol a 70% durante 1 minuto e depois lavagens sucessivas com água destilada esterilizada. Os nódulos foram esmagados e fez-se o riscado em placas de Petri com meio de agar manitol extrato de levedura (YMA) suplementado com 0,0025% de corante Vermelho do Congo. As culturas bacterianas foram incubadas a 28°C e repicadas para novas placas até à obtenção de culturas puras.

A extração de ADN foi realizada de acordo com os métodos descritos por Laguerre et al., (1994) com algumas modificações. Resumidamente, a cultura bacteriana foi suspensa em 250 pL de brometo de cetiltrimetilamónio (CTAB) e incubada durante Ih a 65°C. Esferas de vidro (1 mm) esterilizadas foram adicionadas e as amostras foram agitadas no equipamento FastPrep (MP Biomedicals) . Posteriormente, 50 pL de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 10%, 500 pL de GES (5 M tiocianato de guanidina, 100 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 0.5 % (v/v) Sarkosyl) e 250 pL de C2H7NO2 7.5M foram adicionados às amostras que de seguida foram incubadas a -20°C durante 10 min. Posteriormente, foi adicionado às amostras 500 pL de fenol, clorofórmio e álcool isoamílico (25:24:1). As amostras foram centrifugadas e à camada aquosa adicionaram-se 600 pL de isopropanol. As amostras foram incubadas a -20°C durante Ih

- 28 e centrifugadas. 0 precipitado foi lavado em etanol a 70% e suspenso em água destilada esterilizada. A quantidade e a qualidade do DNA foram determinadas por espectrofotómetro e eletroforese em gel de agarose.

A identificação molecular dos isolados foi determinada através da sequenciação dos genes 16S do RNA ribossómico (16S rRNA), SMc00019 (conserved hypothetical protein) e gyrB (gyrase subunit B) . A posição taxonómica dos isolados ao nível simbiovar foi determinada através da análise dos genes simbióticos nodC (N-acetylglucosaminytransferase) e nodA (Nacyltransferase NodA).

A amplificação do DNA foi realizada num termociclador através da técnica reação em cadeia de polimerase (PCR). A reação continha 7.5 pL de DNA, 10 pL 2x My Taq HS Mix (Bioline) e um 1 pL de cada primer (10 pM).

As condições de PCR estão apresentadas na Tabela 1. Os produtos de PCR e a sua concentração foram verificados por eletroforese em gel de agarose a 1%.

de primers utilizados e condições das reações

Tabela 1

Pares

PCR para cada região amplificada

Primer	Sequência 5'	-3'					Referência	Ciclo PCR
fDl	AGA	GTT	TGA	TCC	TGG	CTC	AG		(Weisburg	3 min 95°C, 34 x	(30
									et al.,	s 95 C, 30 s 54	°C, 2
rDl	AAG	GAG	GTG	ATC	CAG	CC			1991)	min 72°C) 10 min	72°C
										3 min 95 °C, 34 x	(30
27F	AGA	GTT	TGA	TCM	TGG	CTC	AG

										s y □ u, ou s □4	(_/ f z.
1492R	TAC	GGY	TAC	CTT	GTT	ACG	ACT	T		min 72°C) 10 min
	TAA	TAC	GAC	TCA	CTA	TAG	HHC	ADT		3 min 95°C, 35 x	(30
SMc00019MRS-F	YCC	TBA	THG	CCA	THC	C			(Zhang et	s 95°C, 30 s 63	°C, 1
SMC00019MRS-R	GCV	GGR	CAN	KTS	AGC	CAD	CCR	TT	al., 2012)	min 72°C) 5 min	72°C
	TAA	TAC	GAC	TCA	CTA	TAH	HHT	TCG
									(Tampakaki	2 min 95 C, 35 x	(30
gyrB340F-T7	ACC	ARA	AYT	CUT	ACA	AGG			et al.,	s 95°C, 45 s 57	°C,
	GAT	TTA	GGT	GAC	ACT	ATA	GCC	AAY
gyrB1057R-S96	TTR	TCC	TTG	GTC	TGC	G

nodCMesoF

CGA(CT)CG(AG)AG(AG)TTCAA(CT)TTC (Rivas et al., 2007) min 95°C, 35 x (1 min 95°C, 2 min

48.5°C, 2 min 72°C) 7 min 72°C nodCMesoR

CT(CT)AATGTACACA(AG)(GC)GC

nodA-1__________TGC RGT GGA ARN TRN NCT GGG AAA (Haukka et al., 1998) nodA-2 GGN CCG TCR TCR AAW GTC ARG TA

2 min 95°C, 35 x (30 s 95°C, 45 s 58°C, 1 min 72°C) 10 min 72°C

Na tabela 2 apresentam-se as caracteristicas e origem das bactérias e os números de acesso no GenBank das regiões sequenciadas.

Tabela 2 - Origem, caracteristicas bioquímicas e número de acesso no GenBank das regiões genómicas sequenciadas das bactérias.

Bactéria	DSM 33393 UTAD11.3	DSM 33394 UTADB34	DSM 33395 UTADM31
Origem	Aveiro	Eivas	Eivas
Fosfato tricálcico (TCP)	Positivo	Positivo	Positivo
A1PO4	Positivo	Negativo	Negativo
Sideróforos	Negativo	Positivo	Positivo
HCN	Positivo	Negativo	Negativo
ΙΆΑ (pg ml^-1)	0	0	0.45
16S	MN880080	MN880078	MN880079
nodC	-	MN882348	MN882347
nodA	-	MN882346	-
SMc00019	MN882345	MN882343	MN882344
gyrB	MN882342	MN882340	MN882341

- 30 Para a preparação do inoculo microbiano, o crescimento fezse em meio de cultura Agar de Manitol e Extrato de Levedura (YMA) . Após 72 horas de crescimento as culturas foram suspensas em solução de cloreto de sódio (NaCl) a 0,8%, (p/v) de modo a atingir uma densidade óptica de 0,5 num espectrof otómetro com o comprimento de onda de 600 nm, correspondendo a uma concentração cerca de IxlO⁸ de unidades formadoras de colónias (UFC) por mililitro. Ά suspensão bacteriana foi misturada em turfa esterilizada, de modo a assegurar uma dose de aplicação de IxlO⁷ a IxlO⁸ células viáveis por semente, correspondente a 1 g de inoculo, garantindo uma dose necessária para uma efetiva colonização.

Os ensaios de campo com as bactérias selecionadas, com base nos resultados dos ensaios em estufa e na caracterização bioquímica, realizaram-se na Primavera de 2018 e 2019 em Vila Real (41 ° 28 N; 7 ° 73 ' ; 430 m) com os genótipos de grão-de-bico CHK 3357 e Elixir.

Os ensaios de eficiência em condições de campo realizaramse em comparação com plantas controlo, não inoculadas. Foi instalado um campo de ensaios com dois tratamentos de inoculação: C = (controlo - plantas não inoculadas) e PGPB = plantas inoculadas com Pseudomonas sp. DSM 33393, Burkholderia sp. DSM 33394 e Mesorhizobium sp. simbiovar ciceri DSM 33395).

Antes da sementeira, as sementes foram desinfetadas superficialmente com hipoclorito de sódio a 3% (v/v) durante 5 minutos e posteriormente lavadas com três lavagens sucessivas com água destilada esterilizada. Aa sementes foram mergulhadas em óleo vegetal de girassol, utilizado como agente adesivo, e introduzidas num recipiente com o

- 31 inoculo constituído pela mistura das três bactérias. 0 recipiente foi agitado de modo a revestir completamente as sementes com a turfa inoculada. As sementes não inoculadas, utilizadas como controlo, foram envolvidas apenas em turfa esterilizada.

campo de ensaios foi preparado com uma mobilização prévia do solo. No segundo ano de ensaios manteve-se o desenho experimental. A sementeira foi feita manualmente, com espaçamento entre sementes de 20cm X 40 cm, correspondendo a 12 sementes por metro quadrado. Cada parcela tinha uma área de 2,4 metros quadrados, separados 1,2 metros entre si. Foram impostos diferentes níveis de irrigação para simular condições de secura. Os regimes de irrigação aplicados durante o ciclo cultural da cultura foram: 100% das necessidades hídricas (WR) da planta (100WR), 50% (50WR), 25 % (25WR) 100% das WR durante a fase reprodutiva (floração e enchimento do grão) (Dl) e sem rega (R).

As parcelas foram estabelecidas em blocos casualizados, com três repetições. O sistema de rega foi instalado com uma fita de rega em cada linha de plantas, com gotejadores com intervalos de 0,33 m. A rega foi efetuada através de um controlador automático que debitou a água calculada para cada parcela de acordo com os teores de água no solo ao nível das raízes da planta. O teor de água no solo foi monitorizado ao longo do perfil do solo, em tubos de acesso localizados na área do sistema radicular, até uma profundidade de 60 cm, utilizando um equipamento TDR Delta-T PRl/4d-02 ligado a um leitor portátil TRIME-FM. Os valores das leituras dos teores de água foram convertidos em teores volumétricos de água.

- 32 0 plano de irrigação e volume de água aplicado foi baseado nas medições de teor de água na área do sistema radicular. A evapotranspiração da cultura (ETc) foi obtida pelo produto da evapotranspiração de referência (ETo) e o coeficiente da cultura (Kc) , de acordo com a expressão ETc=ETo*Kc. 0 coeficiente da cultura foi 0,54 no estado reprodutivo e 0,97 no estado reprodutivo. De modo a assegurar as necessidades hídricas totais da planta (tratamento 100WR), a dose teórica de irrigação (Id) , foi calculada de acordo com a equação Id=(ETc-Ep) /Ef, em que ETc é a evapotranspiração da cultura, E_p a precipitação efetiva e Ef a eficiência do sistema de rega.

No final do ciclo da cultura avaliou-se o comportamento dos genótipos relativamente ao peso total da parte aérea (SDW), número de vagens (NP), peso de vagens (WP), número de sementes (NS), peso de sementes (WS), peso de 100 sementes (100S), índice de colheita (Hl) e proteína bruta (PB), em cinco plantas colhidas aleatoriamente em cada uma das parcelas. A produção (GY) foi determinada em todas as plantas de cada parcela.

Com base nos dados de produção (GY), foi determinada a produção relativa (RGY) de cada tratamento para o tratamento controlo com 100% das necessidades hídricas satisfeitas (RGY:C100%WR). Os cálculos foram realizados de acordo com a seguinte equação RGY=[ (GYT_x-GYC100%WR)/GYC100%WR]*100, em que, GYTx corresponde à produção dos tratamentos a serem comparados com a produção (GY) do tratamento controlo irrigado com 100% das necessidades hídricas (GYC100%WR). GYC100%WR representa a produção do tratamento controlo irrigado com 100% das necessidades hídricas satisfeitas.

- 33 0 teor de azoto total em amostras secas e moídas de grão-debico foi determinado pelo método de Kjeldahl (método n° 954.01) da Associação Oficial de Química Analítica (AOAC, 1990) . A proteína bruta total foi calculada pela multiplicação do teor em azoto por 6,25.

Para a análise estatística, os dados foram submetidos a teste de normalidade e homogeneidade e, posteriormente, a análise de variância (ANOVA). A comparação de médias foi efetuada utilizando o teste de Tukey para um nível de significância de 5%. As análises foram efetuadas no software IBM SPSS.

Nos ensaios de campo, as bactérias inoculadas mostraram ser competitivas com os microrganismos autóctones do solo e promoveram o crescimento das plantas, dispensando o uso de fertilizantes de síntese. Nas tabelas 3 e 4 apresentam-se os resultados para todos os parâmetros avaliados nas variedades Elixir e CHK 3357, respetivamente, nos 2 anos de estudo.

Na Figura 12 apresenta-se a produção das duas cultivares em função dos tratamentos [C = controlo - plantas não inoculadas, PGPB = plantas inoculadas com uma mistura de bactérias promotoras do crescimento (Pseudomonas sp. strain DSM 33393, Burkholderia sp. DSM 33394 e Mesorhizobium sp. simbiovar ciceri DSM 33395), sob diferentes regimes de irrigação [100, 50 e 25 % das necessidades hídricas (WR), 100% das WR durante a fase reprodutiva (floração e enchimento do grão) (Dl) e sequeiro (R).

Tabela 3 - Efeito dos diferentes tratamentos de inoculação no genótipo Elixir [C = controlo - plantas não inoculadas, PGPB = plantas inoculadas com uma mistura de bactérias promotoras do crescimento (Pseudomonas sp. DSM 33393, Burkholderia sp. DSM 33394 e Mesorhizobium sp. simbiovar ciceri DSM 33395) sob diferentes regimes de rega [100, 50 e 25 % das necessidades

- 34 hídricas (WR), 100% das WR durante a fase reprodutiva (floração e enchimento do grão) (Dl) e sequeiro (R)].

Ano	Regim e de rega	Trat.	SDW (g)	NP	WP (g)	NS	WS (g)	100S (g)	HI %	GY (kg ha’¹)	PB (%)
2018	R	C	63c	56c	33, 2 d	62e	23, 5f	38,1 a	38, 9 ab	2933 f	19, 7a
		PGPB	82bc	8 9bc	47,9 bcd	91de	32, Oe f	35,3 a	41,2 ab	3997 ef	19, 0a
	25WR		94bc	93bc	51,5	113b	38,4c	34,5	43, 6	4800	16, 3a
		c			bcd	cd	def	a	ab	cdef
		PGPB	121a b	108bc	61,3 bcd	111c d	38,9c de	34,9 a	34,6 b	4864 cde	18,6a
	50WR		8 9bc	83bc	44, 8	99cd	36, 7d	37,4	46,2	4582	18,8a
		c			cd	e	ef	a	ab	def
			111b	112bc	59, 1	122b	43, 0c	35,5	43, 6	5376	18,5a
		PGPB			bcd	cd	de	a	ab	cde
	Dl		120a	132ab	75,6	158a	59, 5a	38,4	54,0	7433	17,9a
		C	b		ab	b	b	a	a	ab
		PGPB	164^a	171a	95, 1 a	191a	70,5a	37,8 a	4 6,6 ab	8814 a	16, 7a
	100WR		119a	128ab	72,1	140b	49,2b	35,0	42,8	6154	17,4a
		c	b		abc	c	cd	a	ab	bcd
		PGPB	111b	lllbc	64,1 bc	143b c	53, 4b c	37,8 a	50,3 ab	6680 bc	18,3a

2019	R	C	37e	58c	26, 5 d	61d	19, 6d	32,1 a	53, 5 a	2452 d	18,2a b
		PGPB	72de	104bc	48,7 cd	113c d	36,4c d	31, 9 a	50,0 a	4549 cd	17,4a bcd
	25WR	C	88d	136ab	59, 6 c	145b c	44, 9c	31,3 a	50,8 a	5611 c	16, 8c d
		PGPB	102b cd	125b	66, 0 bc	145b c	49, 3b c	33, 6 a	47,5 a	6168 bc	18,2a b
	50WR	C	93cd	123b	66, 9 bc	144b c	49,2b c	34,5 a	52,5 a	6154 bc	17,3b cd
		PGPB	104b cd	134ab	69, 8 abc	152b c	53, la bc	34,8 a	51,0 a	6633 abc	18,4a
	Dl		135a	189a	95, 5	208a	71,2a	36, 8	52,0	8903	17,8a
			bc	ab	b	b	a	a	ab	bc
		PGPB	149a	189a	100, 0a	226a	74, 7a	33, 1 a	49, 8 a	9337 a	18,4a
	100WR		104b	147ab	73, 9	171a	55,7a	32,4	52, 9	6959	17,9a
			cd	abc	bc	bc	a	a	abc	b
		PGPB	144a b	192a	96, 0 ab	210a b	69, 8a b	33,2 a	48,7 a	8727 ab	16, 7d

Tabela 4 - Efeito dos diferentes tratamentos de inoculação no genótipo CHK 3357[C = controlo - plantas não inoculadas, PGPB = plantas inoculadas com uma mistura de bactérias promotoras do crescimento (Pseudomonas sp. strain DSM 33393, Burkholderia sp. strain DSM 33394 e Mesorhizobium sp. simbiovar ciceri strain DSM 33395) sob diferentes regimes de irrigação [100, 50 e 25 % das necessidades hídricas (WR), 100% das WR durante a fase

- 35 reprodutiva (floração e enchimento do grão) (Dl) e sequeiro (R) ] ·

Ano	Regim e de rega	Trata mento	SDW (g)	NP	WP (g)	NS	WS (g)	100S (g)	Hl %	GY (kg ha-1)	PB (%)
2018	R	C	69b	47d	33,	65c	26,	41,0	37,	3304c	18,8
					8c		4c	b	8ab		ab
		PGPB	77a	55c	38,	72b	30,	41,7	39,	3745bc	19, 1
			b	d	4bc	c	Obc	ab	7ab		ab
	2 5WR	C	88a	69a	46,	87a	35,	40,4	40,	4370ab	19, 6
			b	bcd	3ab	bc	Oab	b	4ab	c	a
					c		c
		PGPB	84a	66b	48,	85b	35,	42, 6	43,	4412ab	19, 1
			b	cd	5ab	c	3ab	ab	3ab	c	ab
					c		c
	50WR	C	91a	71a	46,	90a	35,	40,1	39,	4448ab	16, 9
			b	bcd	9ab	bc	6ab	b	6ab	c	ab
					c		c
		PGPB	111	74a	43,	89a	40,	48,2	36,	5080ab	18,5
			a	bcd	9bc	bc	6ab	a	9b		ab
	Dl	C	111	80a	55,	106	41,	39, 9	40,	5235ab	18,1
			a	bc	lab	ab	9ab	b	Oab		ab
		PGPB	106	95a	64,	122	48,	40,5	46,	6070a	18,3
			a		4a	a	6a	b	4a		ab
	100WR	C	106	91a	55,	101	41,	42,0	40,	5185ab	17,4
			a	b	8ab	ab	5ab	ab	4ab		ab
		PGPB	95a	86a	55,	104	43,	41,7	45,	5402ab	15,9
			b	b	5ab	ab	2ab	ab	7a		b

2019	R	C	48d	57c	33,	73d	25,	35,0	53,	3191d	17,1
					ld		5d	ab	9a		d
		PGPB	70c	84b	46,	100	34,	34,3	49,	4321cd	18,1
			d	c	4cd	cd	6cd	ab	5a		abcd
	25WR	C	84b	104	58,	140	44,	31,4	50,	5520bc	17,6
			cd	abc	Obc	bcd	2bc	b	6a	d	cd
					d		d
		PGPB	97a	118	66,	154	51,	33, 4	52,	6445bc	17,6
			bc	ab	2ab	abc	6bc	ab	3a		cd
					c
	50WR	C	91b	107	59,	133	45,	33, 4	48,	5662bc	18,7
			c	abc	9bc	bcd	3bc	ab	6a	d	abc
					d		d
		PGPB	102	121	68,	158	54,	35,0	53,	6839ab	18,0
			abc	ab	8ab	abc	7ab	ab	5a	c	abcd
					c		c
	Dl	C	121	149	82,	190	62,	33, 7	51,	7791ab	19, 4
			ab	a	Oab	ab	3ab	ab	5a	c	a
		PGPB	139	153	96,	220	75,	34,6	54,	9485a	17,8
			a	a	4a	a	9a	ab	2a		bcd
	100WR	C	110	124	74,	164	58,	35,4	53,	7250ab	17,1
			abc	ab	Oab	abc	Oab	ab	0a		d
					c		c
		PGPB	115	105	80,	178	64,	36, 6	56,	8033ab	19, 0
			ab	abc	8ab	ab	3ab	a	0a		ab

- 36 Relativamente aos parâmetros de produção de biomassa dos genótipos em estudo, os resultados obtidos revelaram que o tratamento com rega durante a fase reprodutiva da planta e com inoculação (Dl PGPB) apresentou o valor mais elevado no peso da parte aérea, número de vagens, peso de vagens, número de sementes e peso de sementes por planta (Tabela 3 e 4) . Nessas condições, os genótipos Elixir e CHK 3357 obtiveram uma produção média de 907 6 kg ha^-1 e 7777 kg ha^-1, respetivamente (Figura 12).

De outro modo, em ambos os genótipos, as plantas em condições de sequeiro e não inoculadas (R C) apresentaram os valores mais baixos para todos os parâmetros de produção de biomassa, com exceção do peso de 100 sementes e índice de colheita (Tabela 3 e 4). Nessas condições, os genótipos Elixir e CHK 3357 obtiveram um rendimento médio de grão de 2693 e 3248 kg ha^-1, respetivamente (Figura 12).

Em todos os regimes de rega impostos, as plantas não inoculadas (C) apresentaram o valor mais baixo de produção comparativamente aos respetivos tratamentos com inoculação dos microrganismos selecionados (Figura 12). No genótipo Elixir, a inoculação com PGPB resultou num aumento médio na produção de 16% quando comparado com as plantas não inoculadas (Figura 13). No genótipo CHK 3357, a inoculação com PGPB resultou num aumento médio na produção de 15% quando comparado com as plantas controlo (Figura 13).

Os resultados evidenciam que a inoculação com os microrganismos selecionados aumenta a produtividade do grãode-bico quando comparado com o tratamento controlo, e que mesmo em condições de sequeiro, estes microrganismos têm potencial para ser aplicados como biofertilizantes, de modo

- 37 a beneficiar a produção agrícola sustentável de grão-de-bico e enfrentar os problemas decorrentes da escassez de água. 0 uso destes microrganismos (Figura 13) e a rega deficitária, durante a fase reprodutiva das plantas (Dl) (Figura 14), pode ser uma estratégia para reduzir a quantidade de fertilizantes sintéticos e a quantidade de água aplicada sem perdas no rendimento das culturas.

As misturas microbianas revelaram ser eficientes, tolerar condições de défice hídrico e ser persistentes no solo. Caracterizam-se também por tolerar as condições de conservação mantendo-se viáveis pelo menos 6 meses à temperatura de refrigeração e congelação, quando conservados em substrato de turfa e vermiculite.

efeito das bactérias promotoras do crescimento foi avaliado em combinação com uma mistura de fungos micorrízicos arbusculares (AMF). 0 inóculo de fungos micorrízicos utilizado neste trabalho foi adquirido à empresa Symbiom (Républica Checa) e continha Rhizophagus irregularis BEG140, Funneliformis geosporum BEG199 e Claroideoglomus claroideum BEG210 (1:1:1). Cada semente de grão-de-bico recebeu Ig da mistura de AMF, que possuía 60 esporos viáveis por g da mistura final.

Tabela 5 - Efeito dos diferentes tratamentos de inoculação no genótipo Elixir [C = controlo - plantas não inoculadas, PGPB = plantas inoculadas com uma mistura de bactérias promotoras do crescimento (Pseudomonas sp. strain DSM 33393, Burkholderia sp. strain DSM 33394 e Mesorhizobium sp. simbiovar ciceri strain DSM 33395, PGPB+AMF = plantas inoculadas com a anterior mistura de bactérias promotoras de crescimento e uma mistura de fungos micorrízicos arbusculares (Rhizophagus irregularis BEG140, Funneliformis geosporum BEG199 e Claroideoglomus claroideum BEG210) sob diferentes regimes de irrigação [100, 50 e 25 % das necessidades hídricas (WR), 100% das WR durante a fase

- 38 reprodutiva (floração e enchimento do grão) (Dl) e sequeiro (R) ] ·

	Reg	Trat.	SDW	NP	WP	NS	WS	10	HI	GY	PB
An	ime		(g)		(g)		(g)	OS	%	(kg	(%)
O	de							(g		ha
	reg							)		^x)
	a
20	R	C	63c	56d	33,2d	62e	23,5e	38	38,	293	19, 7
18								, 1	9ab	3e	a
								ab
		PGPB	82bc	89c	47, 9c	91d	32, Od	35	41,	399	19, 0
				d	d	e	e	, 3	2ab	7 de	a
								ab
		PGPB+A	109ab	92c	60,4a	98d	35,3c	37	37,	441	18,6
		MF	c	d	bcd	e	de	, 2	4ab	5cd	a
								ab		e
	25W	C	94bc	93c	51,5b	113	38,4c	34	43,	480	16, 3
	R			d	cd	cde	de	, 5	6ab	Ocd	a
								b		e
		PGPB	121ab	108	61,3a	111	38,9c	34	34,	486	18,6
				abc	bcd	cde	de	, 9	6b	4cd	a
				d				ab		e
		PGPB+A	116ab	101	59, 7b	127	41,3b	33	40,	516	17,7
		MF	c	bcd	cd	cd	cde	, 5	3ab	2bc	a
								b		de
	50W	C	89bc	83c	44,8c	99d	36, 7c	37	46,	458	18,8
	R			d	d	e	de	, 4	2ab	2cd	a
								ab		e
		PGPB	lllab	112	59, lb	122	43, 0b	35	43,	537	18,5
			c	abc	cd	cd	cd	, 5	6ab	6bc	a
				d				ab		d
		PGPB+A	98bc	110	60,1b	119	45, 2b	38	47,	565	19, 8
		MF		abc	cd	cd	cd	, 4	2ab	5bc	a
				d				ab		d
	Dl	C	120ab	132	75, 6a	158	59, 5a	38	54,	743	17,9
				abc	bc	abc	b	, 4	0a	3ab	a
								ab
		PGPB	164a	171	95,1^a	191	70,5a	37	46,	881	16, 7
				a		ab		, 8	6ab	4a	a
								ab
		PGPB+A	155a	159	84, 9a	199	70, 0a	35	45,	874	19, 5
		MF		ab	b	a		, 2	6ab	5a	a
								ab
	100	C	119ab	128	72,1a	140	49, 2b	35	42,	615	17,4
	WR			abc	bc	bcd	cd	, 0	8ab	4bc	a
								ab		d
		PGPB	lllab	111	64,1a	143	53, 4a	37	50,	668	18,3
			c	abc	bcd	abc	bc	, 8	3ab	Oab	a
				d		d		ab		c
		PGPB+A	114ab	115	69, 3a	134	54,0a	40	48,	675	18,4
		MF	c	abc	bc	cd	bc	, 8	5ab	6ab	a
				d				a		c

20	R	C	37f	58e	26, 5e	61e	19, 6f	32	53,	245	18,2
19								, 1	5ab	2f	abc
								ab
		PGPB	72ef	104	48,7d	113	36, 4e	31	50,	454	17,4
				de	e	de	f	, 9	Oab	9ef	bcde

ab

	PGPB+A	7 9def	112	55,9c	132	42,5d	32	53,	531	18,4
	MF		cde	de	cde	ef	, 5	9ab	Ode	ab
							ab		f
25W	C	88cde	136	59, 6c	145	44,9c	31	50,	561	16, 8
R			bcd	de	cd	def	, 3	8ab	lcd	de
							b		ef
	PGPB	102bc	125	66, 0b	145	49, 3b	33	47,	616	18,2
		de	bcd	cd	cd	cde	, 6	5b	8bc	abc
			e				ab		de
	PGPB+A	106bc	147	71,4a	174	53, 8a	31	48,	673	18,3
	MF	de	abc	bcd	abc	bcde	, 2	2b	Oab	abc
			d		d		b		cde
50W	C	93cde	123	66, 9b	144	49, 2b	34	52,	615	17,3
R			bcd	cd	cd	cde	, 5	5ab	4bc	cde
			e				ab		de
	PGPB	104bc	134	69, 8a	152	53, la	34	51,	663	18,4
		de	bcd	bcd	bcd	bcde	, 8	Oab	3ab	ab
							ab		cde
	PGPB+A	118ab	182	85, 9a	205	65,3a	31	56,	816	17,7
	MF	cde	abc	bc	abc	bcd	, 8	lab	5ab	abcd
							ab		cd	e
Dl	C	135ab	189	95,5a	208	71,2a	36	52,	890	17,8
		c	ab	b	abc	b	, 8	Oab	3ab	abcd
							a
	PGPB	149ab	189	100, 0	226	74, 7a	33	49,	933	18,4
			ab	ab	ab	b	, 1	8ab	7ab	ab
							ab
	PGPB+A	156a	215	101,5	238	75,6a	31	49,	941	18,7
	MF		a	a	a		, 9	lab	3a	a
							ab
100	C	104bc	147	73,9a	171	55,7a	32	52,	695	17,9
WR		de	abc	bcd	abc	bccde	, 4	9ab	9ab	abc
			d		d		ab		cde
	PGPB	144ab	192	96, 0a	210	69, 8a	33	48,	872	16, 7
			ab	b	abc	bc	, 2	7ab	7ab	e
							ab		c
	PGPB+A	125ab	174	90,1a	210	70,7a	33	57,	884	18,7
	MF	cd	abc	bc	abc	b	, 8	la	2a	a
			d				ab

Tabela 6 - Efeito dos diferentes tratamentos de inoculação no genótipo CHK 3357[C = controlo - plantas não inoculadas, PGPB = plantas inoculadas com uma mistura de bactérias promotoras do crescimento (Pseudomonas sp. strain DSM 33393, Burkholderia sp. strain DSM 33394 e Mesorhizobium sp. simbiovar ciceri strain DSM 33395, PGPB+AMF = plantas inoculadas com a anterior mistura de bactérias promotoras de crescimento e uma mistura de fungos micorrizicos arbusculares (Rhizophagus irregularis BEG140, Funneliformis geosporum BEG199 e Claroideoglomus claroideum BEG210) sob diferentes regimes de irrigação [100, 50 e 25 % das necessidades hídricas (WR), 100% das WR durante a fase reprodutiva (floração e enchimento do grão) (Dl) e sequeiro (R) ] ·

Reg Trat. SDW NP WP NS WS 1Õ Hl GY PB ime(g)(g)(g) 0S %(%)

An ο	de reg a	(g )	(kg ha ^x)
20	R	C	69c	47d	33, 8d	65d	26, 4d	41	37,	330	18,8
18								, o	8a	4d	ab
								b
		PGPB	77bc	55c	38,4c	72c	30,0c	41	39,	374	19, 1
				d	d	d	d	, 7	7a	5cd	ab
								ab
		PGPB+A	82bc	69b	4 5, Ob	82b	34,6b	42	42,	432	19, 4
		MF		cd	cd	cd	cd	, 1 ab	9a	9b c d	a
	25W	C	88bc	69b	46, 3b	87b	35, Ob	40	40,	437	19, 6
	R			cd	cd	cd	cd	, 4 b	4a	Obc d	a
		PGPB	84bc	66b	4 8,5b	85b	35,3b	42	43,	441	19, 1
				cd	cd	cd	cd	, 6 ab	3a	2bc d	ab
		PGPB+A	HOab	7 6b	54, 6b	96b	37,9b	39	36,	474	17,5
		MF		cd	c	cd	cd	, 2 b	8a	3bc d	ab
	50W	C	91bc	71b	4 6, 9b	90b	35,6b	40	39,	444	16, 9
	R			cd	cd	cd	cd	, 1 b	6a	8bc d	ab
		PGPB	lllab	74b	4 3, 9b	8 9b	4 0, 6b	48	36,	508	18,5
				cd	cd	cd	cd	, 2 a	9a	Obc d	ab
		PGPB+A	104ab	82a	52,8b	109	41,0b	38	39,	511	17,7
		MF	c	bc	cd	abc	cd	, 8 b	7a	9b c d	ab
	Dl	C	lllab	80a	55,1a	106	41,9b	39	40,	523	18,1
				bc	bc	abc	cd	, 9 b	Oa	5bc d	ab
		PGPB	106ab	95a	64,4a	122	48,6a	40	46,	607	18,3
			c	b	b	ab	b	, 5	4a	Oab	ab
								b
		PGPB+A	132a	112	75,3a	144	60,2a	42	45,	752	19, 1
		MF		a		a		, 7	5a	4a	ab
								ab
	100	C	106ab	91a	55,8a	101	41,5b	42	40,	518	17,4
	WR		c	b	bc	bcd	cd	, o	4a	5bc	ab

PGPB	95abc	86a bc	55,5a bc	104 abc d
	115ab	109	59, 4a	122
PGPB+A		a	b	ab

MF

43, 2b c	41 , 7 ab	45, 7a	540 2bc	15, 9 b
43,6b c	35 , θ b	38, 3a	545 4bc	17,8 ab

20 19	R	C	48f	57e	33, ld	73e	25, 5e	35 , o ab	53, 9a	319 le	17,1 e
		PGPB	70def	84d	46, 4c	100	34,6d	34	49,	432	18,1
				e	d	de	e	, 3	5a	Ide	abcd
								ab			e
		PGPB+A	68ef	73d	46, 4c	108	36, 4c	34	55,	454	18,9
		MF		e	d	de	de	, 7	6a	8cd	abcd
								ab		e
	25W	C	84def	104	58,0c	140	44,2c	31	50,	552	17,6
	R			cde	d	bcd	de	, 4	6a	Ocd	de
						e		b		e
		PGPB	97 cde	118	66,2b	154	51,6a	33	52,	644	17,6
			f	bcd	cd	abc	bcde	, 4	3a	5ab	cde
						de		ab		cde
		PGPB+A	104bc	109	73, 2a	160	57,2a	35	53,	715	18,8
		MF	de	cde	bc	abc	bcd	, 5	9a	2ab	abcd
						d		ab		cd
	50W	C	91cde	107	59, 9c	133	45,3b	33	48,	566	18,7
	R		f	cde	d	cde	cde	, 4	6a	2bc	abcd
								ab		de
		PGPB	102bc	121	68,8a	158	54,7a	35	53,	683	18,0
			de	bcd	bc	abc	bcd	, o	5a	9ab	abcd
						d		ab		cd	e
		PGPB+A	lllab	117	74,8a	166	58,0a	34	54,	724	18,8
		MF	cde	bcd	bc	abc	bcd	, 9	3a	5ab	abcd
						d		ab		cd
	Dl	C	121ab	149	82,0a	190	62,3a	33	51,	779	19, 4
			cd	abc	bc	abc	bcd	, 7	5a	lab	a
								ab		cd
		PGPB	139ab	153	96, 4a	220	75, 9a	34	54,	948	17,8
			c	abc	b	ab		, 6	2a	5a	bcde
								ab

	PGPB+A MF	157a	182 a	103, 6 a	229 a	77,4a	33 , 6 ab	50, 0a	967 la	18,6 abcd
100	C	HOab	124	74,0a	164	58,0a	35	53,	725	17,1
WR		cde	abc	bc	abc	bcd	, 4	0a	Oab	e
			d		d		ab		cd
	PGPB	115ab	105	80,8a	178	64,3a	36	56,	803	19, 0
		cde	cde	bc	abc	bc	, 6	0a	3ab	abc
					d		a		c
	PGPB+A	154ab	176	98,1a	228	73,3a	31	47,	915	19, 1
	MF		ab	b	a	b	, 9	5a	8ab	ab

b

Relativamente aos parâmetros de produção de biomassa dos genótipos em estudo, os resultados evidenciam que a aplicação combinada de bactérias promotoras do crescimento e fungos micorrizicos arbusculares (PGPB+AMF) foi benéfica para o crescimento das plantas (Tabela 5 e 6) .

Em ambos os genótipos, o valor de produção mais elevado foi observado nas plantas inoculadas com bactérias promotoras de crescimento e fungos micorrizicos arbusculares com rega durante a fase reprodutiva da cultura (PGPB+AMF, Dl). Nestas condições, o genótipo Elixir apresentou um rendimento médio de 9079 kg ha^-1, enquanto o genótipo CHK 3357 revelou um rendimento médio de 8597 kg ha^-1 (Figura 15).

No genótipo Elixir, a inoculação com PGPB+AMF resultou num aumento médio da produção de 405 e 1321 kg ha^-1 quando comparado com as plantas inoculadas com bactérias promotoras do crescimento (PGPB) e plantas não inoculadas (C) , respetivamente (Figura 16). No genótipo CHK 3357, a inoculação com PGPB+AMF resultou num aumento médio da produção de 511 e 1298 kg ha^-1 quando comparado com as plantas inoculadas com bactérias promotoras do crescimento (PGPB) e plantas controlo (C), respetivamente (Figura 16).

- 43 Em todos os regimes de rega impostos, as plantas inoculadas com bactérias promotoras do crescimento e fungos micorrizicos arbusculares (PGPB+AMF) apresentaram um rendimento superior comparativamente às plantas inoculadas com bactérias promotoras do crescimento (PGPB) e plantas não inoculadas. Em ambos os genótipos, a rega durante a fase reprodutiva da planta resultou nos maiores valores de produção (Figura 17).

Num modo de realização, as caracteristicas técnicas constituintes da presente invenção, nas suas demais combinações, são adequadas para formulações sólidas, em gel ou líquidas e são facilmente adicionadas às sementes por diversos métodos de revestimento que permitam a adesão da solução ou da mistura sólida, nomeadamente a adesão do material de suporte por adição de um óleo vegetal.

Como será evidente a um perito na especialidade, a presente invenção não deverá estar limitada aos modos de realização descritos no presente documento, sendo possíveis diversas alterações que se mantêm no âmbito da presente invenção.

Evidentemente, os modos preferenciais acima apresentados são combináveis, nas diferentes formas possíveis, evitando-se aqui a repetição de todas essas combinações.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Formulação biofertilizante compreendendo pelo menos dois microrganismos isolados caracterizada por cada um dos referidos microrganismos ser selecionados a partir de Pseudomonas sp., Burkholderia sp. , Mesorhizobium sp. e/ou suas misturas, cada um dos referidos microrganismos isolados compreendendo uma sequência de ácido desoxirribonucleico (ADN) com pelo menos 99% de identidade com uma sequência selecionada a partir da seguinte lista: SEQ. n° 1, SEQ. n° 2, SEQ. n° 3, SEQ. n° 4, SEQ. n° 5, SEQ. n° 6, SEQ. n° 7, SEQ. n° 8, SEQ. n° 9, SEQ. n° 10, SEQ. n° 11 e/ou SEQ. n° 12.
2. Formulação biofertilizante de acordo com a revindicação anterior caracterizada por compreender pelo menos dois microrganismos isolados, cada um dos referidos microrganismos compreendendo uma sequência de ADN com 100 % de identidade com uma sequência selecionada a partir da seguinte lista SEQ. n° 1, SEQ. n° 2, SEQ. n° 3, SEQ. n° 4, SEQ. n° 5, SEQ. n° 6, SEQ. n° 7, SEQ. n° 8, SEQ. n° 9, SEQ. n° 10, SEQ. n° 11 e/ou SEQ. n° 12.
3. Formulação biofertilizante de acordo com qualquer uma das revindicações anteriores caracterizada por compreender três microrganismos isolados, cada um dos referidos microrganismos compreendendo uma sequência de ADN com pelo menos 99 % de identidade com uma sequência selecionada a partir da seguinte lista: SEQ. n° 1, SEQ. n° 2, SEQ. n° 3, SEQ. n° 4, SEQ. n° 5, SEQ. n° 6, SEQ. n° 7,

- 2 SEQ. n° 8, SEQ. n° 9, SEQ. n° 10, SEQ. n° 11 e/ou SEQ. n°

12.
4. Formulação biofertilizante de acordo com qualquer uma das revindicações anteriores caracterizada por compreender três microrganismos isolados, cada um dos referidos microrganismos compreendendo uma sequência de ADN com 100 % de identidade com uma sequência selecionada a partir da seguinte lista SEQ. n° 1, SEQ. n° 2, SEQ. n° 3, SEQ. n° 4, SEQ. n° 5, SEQ. n° 6, SEQ. n° 7, SEQ. n° 8, SEQ. n° 9, SEQ. n° 10, SEQ. n° 11 e/ou SEQ. n° 12.
5. Formulação biofertilizante de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizada por o/s microrganismo/s isolado/s ser/em bactéria/s.
6. Formulação biofertilizante de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizada por compreender adicionalmente outros compostos fertilizantes, pesticidas, microrganismos adicionais, promotores do crescimento de plantas e/ou suas combinações.
7. Formulação biofertilizante de acordo com a reivindicação anterior caracterizada por os microrganismos adicionais serem fungos micorrizicos.
8. Formulação biofertilizante de acordo com a reivindicação 8 caracterizada por os microrganismos adicionais serem selecionados a partir da seguinte lista: Bacillus, Paenibacillus, Trichoderma, Beauveria, Cordyceps, Metarhizium, Paecilomyces e/ou suas misturas.
9. Formulação biofertilizante de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizada por ser uma formulação sólida, em gel ou liquida.
10. Semente de planta caracterizada por ser revestida com a formulação biofertilizante de qualquer uma das reivindicações anteriores.
11. Semente de planta de acordo com a reivindicação anterior caracterizada por compreender adicionalmente óleo vegetal.
12. Método de revestimento de sementes caracterizado por compreender os seguintes passos:

i) desinfeção das referidas sementes;

ii) revestimento das referidas sementes com material adesivo, de suporte e/ou nutricional para promover a sobrevivência de microrganismos;

iii) inoculação das referidas sementes com a formulação biofertilizante de qualquer uma das reivindicações 1-9.
13. Método de revestimento de sementes de acordo com a revindicação anterior caracterizado por a inoculação ser feita por peletização e/ou revestimento.
14. Método de revestimento de sementes de acordo com as revindicações 12 e 13 caracterizado por o material de suporte e/ou nutricional ser turfa, argila, talco,

- 4 vermiculite, serrim, pó de cortiça, farelos de cereais e/ou suas combinações.
15. Método de revestimento de sementes de acordo com qualquer uma das reivindicações 12-14 caracterizado por o material adesivo ser um polímero sintético ou natural selecionado a partir da seguinte lista: metilcelulose, carboximetilcelulose, goma arábica, óleo vegetal e/ou suas combinações.
16. Método de produção de uma formulação biofertilizante de qualquer uma das reivindicações 1-9 caracterizado por compreender os passos de:

i) produção de um inoculo de Pseudomonas sp., Burkholderia sp., Mesorhizobium sp. e/ou suas misturas em meio líquido, em gel ou sólido;

ii) centrifugação e/ou suspensão do referido inoculo em solução de NaCl até atingir a densidade óptica desejada;

iii) obtenção da formulação biofertilizante de qualquer uma das reivindicações 1-9 .
17. Método de produção da formulação biofertilizante de acordo com a reivindicação anterior caracterizado por a densidade óptica se encontrar no intervalo entre 1X10⁷-1x10⁸ unidades formadoras de colónias por mililitro de solução.
18. Uso da formulação biofertilizante de qualquer uma das reivindicações 1-9 na indústria agrícola e ornamental na produção de hortícolas e frutícolas.
19. Uso da formulação biofertilizante de qualquer uma das reivindicações 1-9 de acordo com a reivindicação anterior na produção de leguminosas.
20. Uso da formulação biofertilizante de qualquer uma das reivindicações 1-9 de acordo com a reivindicação anterior na produção de grão-de-bico.
21. Uso da formulação biofertilizante de qualquer uma das reivindicações 1-9 como complemento ou em substituição de fertilizantes sintéticos.
22. Uso da formulação biofertilizante de qualquer uma das reivindicações 1-9 como biopesticida.