PT1102837E

PT1102837E - Método de prevenção da infecção bacteriófaga das culturas bacterianas

Info

Publication number: PT1102837E
Application number: PT99931021T
Authority: PT
Inventors: Dan Nilsson; Thomas Janzen
Original assignee: Chr Hansen As
Priority date: 1998-07-03
Filing date: 1999-07-02
Publication date: 2010-08-18
Also published as: ES2345965T3; US7892585B1; DK1102837T3; EA200001232A1

Description

DESCRIÇÃO

MÉTODO DE PREVENÇÃO DA INFECÇÃO BACTERIÓFAGA DAS CULTURAS

BACTERIANAS

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao campo das culturas bacterianas que são usadas industrialmente na fabricação de por exemplo produtos alimentares ou produtos de metabolito úteis. Em particular ela provê estirpes bacterianas modificadas, que, quando são cultivadas num material de substrato seleccionado, não são susceptiveis ao ataque por bacteriófagos, e retiveram a sua capacidade de serem metabolicamente activas.

ANTECEDENTES TÉCNICOS E TÉCNICA ANTERIOR

As falhas de produção das culturas bacterianas provocadas pela infecção por bacteriófagos são consideradas como um dos problemas mais importantes no uso Industrial das culturas bacterianas. Os bacteriófagos forma descobertos para muitas das estirpes bacterianas usadas na Indústria, como as espécies de bactérias do ácido láctico por exemplo Lactococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus spp., e Streptococcus spp., Propionibacterium spp., Bifidobacterium spp., Staphylococcus spp., ou Micrococcus spp. Além disso, as infecções por bacteriófagos são também bem conhecidas noutras espécies industrialmente úteis como por exemplo Bacillus spp., Enterobacteriaceae spp., incluindo E. coli, Corynebacterium spp., Actinomycetes spp. e Brevibacterium spp.

Na indústria alimentar, as culturas iniciadoras bacterianas do ácido láctico são largamente usadas para as fermentações alimentares. Parece que entre os elementos das bactérias do ácido láctico, o Lactococcus spp. são as mais devastadas pelas infecções por bacteriófagos. Um factor, que conduz a infecções 1/35 de frequentes bacteriófago nas culturas iniciadoras bacterianas do ácido láctico é o facto de que as condições de fermentação na indústria alimentar incluindo a Indústria de Lacticinios geralmente não são estéreis. Assim, ainda não foi possível eliminar a contaminação por bacteriófagos sob estas condições industriais. 0 desenvolvimento lítico dos fagos envolve a adsorção dos fagos à superfície da célula hospedeira, a injecção do ADN do fago na célula, a síntese das proteínas do fago, a réplica do ADN do fago, a ensamblagem dos fagos da progénie e libertação da progénie do hospedeiro. Os mecanismos mediados pela células da interferência com quaisquer destes eventos pode prevenir uma infecção por fago. A capacidade das culturas bacterianas de resistir à infecção por bacteriófago durante o seu uso

Industrial depende em grande parte das características da estirpe hospedeira que afecta um ou mais dos mecanismos acima mencionados.

Assim, foi mostrado que a resistência ou mecanismos de defesa naturais aos bacteriófagos existem nas estirpes bacterianas que asseguram um certo nível de protecção contra o ataque por bacteriófagos. Estes mecanismos de defesa natural incluem a inibição da adsorção do fago, prevenção da penetração do ADN do fago, restrição do ADN do fago e infecção abortiva. A prevenção do contacto produtivo entre fagos e células bacterianas devido aos receptores alterados da superfície celular para fagos reduz imensamente a capacidade dos fagos de atacar as células. A adsorção dos fagos à superfície da célula nem sempre é suficiente para a translocação do ADN do fago. Foi mostrado que as proteínas da membrana celular específicas do hospedeiro estão envolvidas na prevenção da penetração do ADN do fago. 2/35 A restrição/modificação é um mecanismo que funciona pela cooperação de dois sistemas enzimáticos, uma enzima de restrição de clivagem do ADN e uma enzima modificadora do ADN, normalmente uma metilase. 0 mecanismo funciona pela clivagem do ADN do fago, à medida que ele entra na célula. A infecção do fago abortivo é descrito como um mecanismo que interfere com o desenvolvimento do fago depois de que a expressão do fago tenha iniciado. Isto pode eventualmente conduzir a um reduzido nível ou terminação da produção da progénie de fago viável.

No entanto, como muitos outros rasgos das estirpes bacterianas gue são importantes para o rendimento Industrial, os mecanismos naturais de defesa do fago acima descritos mostraram ser características instáveis, já que eles podem ser mediados por plasmídeos. Além disso, estes mecanismos de defesa são muitas vezes específicos do fago, isto é só são em relação a uma margem limitada de tipos de bacteriófagos. Consequentemente, a técnica anterior não é consciente de um mecanismo de resistência associado à célula hospedeira geral e mantida estável contra a infecção por bacteriófagos.

Tendo como base os mecanismos de defesa natural acima mencionados, a Indústria desenhou e implementou estratégias para possivelmente reduzir a infecção por bacteriófagos das culturas bacterianas incluindo culturas iniciadoras para a fermentação de produtos lácteos. As estratégias usadas actualmente incluem o uso de culturas iniciadoras misturadas e o uso alternativo de estirpes que têm diferentes perfis de susceptibilidade ao fago (rotação de estirpes).

Tradicionalmente, as culturas iniciadoras na Indústria de

Lacticínios são misturas de estirpes bacterianas do ácido láctico. A composição complexa das culturas iniciadoras misturadas assegura que um certo nível de resistência ao ataque 3/35 no fago esteja presente. No entanto, uma subcultura repetida de culturas de estirpe misturadas origina mudanças imprevisíveis na distribuição das estirpes individuais e eventualmente a dominação da estirpe indesejada. Isto por seu lado origina uma susceptibilidade aumentada ao ataque no fago e o risco de falhas da fermentação. A rotação das estirpes bacterianas seleccionadas que são sensíveis aos diferentes fagos é outra abordagem para limitar o desenvolvimento do fago. No entanto, é difícil e incómodo identificar e seleccionar um número suficiente de estirpes que tenham perfis de fago de diferentes tipos para prover um programa de rotação eficiente e fidedigno. Adicionalmente, o uso continuado de estirpes requer a monitorização cuidadosa por novos fagos infecciosos e a necessidade de substituir rapidamente uma estirpe que esteja infectada pelo bacteriófago novo por uma estirpe resistente ao fago. Nas Fábricas onde as culturas iniciadoras são fabricadas a granel normalmente uma resposta antecipada tão rápida não é possível.

Os estudos mostraram que uma capacidade de crescimento reduzida de uma cultura bacteriana como por exemplo uma bactéria do ácido láctico deficiente de proteinase resulta numa proliferação de fago reduzida (Richardson et al., 1983, 1984). No entanto, estas estirpes bacterianas estão ainda a crescer e portanto são ainda susceptíveis ao ataque por fagos.

Assim, a Indústria não tem em seu poder nenhuma estratégia fidedigna para garantir que as culturas bacterianas utilizadas para a fabricação industrial de produtos alimentares ou outros produtos são resistentes aos ataques por bacteriófagos. Além disso, nenhumas das estratégias actualmente usadas previnem infecções por qualquer tipo de bacteriófagos e nenhuma destas estratégias são capazes de impedir que os bacteriófagos, por um evento mutacional, contornem os mecanismos da resistência das estirpes da cultura bacteriana. 4/35 É portanto um objectivo significativo da presente invenção prover um método para prevenir a infecção por bacteriófagos das culturas bacterianas que são usadas na fabricação de produtos alimentares e outros produtos, em que as culturas são completamente resistentes ao ataque por qualquer tipo de bacteriófagos. 0 artigo (Meagher et al., Cell, 1997, vol. 10, pages 521-536) descreve a expressão das proteínas nas minicélulas de E.coli por plasmídeos recombinantes. O artigo (Helling et al., J. Bacteriol., 1970, vol. 104, no. 2, pages 1027-1029) descreve os auxotróficos resistentes ao ácido nalidíxico de E. coli. O artigo (Worland et al., Australian Journal of Plant Physiology, 1999, 26(6), pages 511-519) descreve que os auxotróficos de purina de Rhizobium, perturbados na nodulação, têm múltiplas mudanças na síntese das proteínas. O artigo (Anton et al., J. Bacteriol 77(1): 117-8, 1959) descreve uma timina "que requer" uma variante de LAB. Em nenhuma parte deste artigo é dito que esta variante não é replicante de ADN. Também, não há nada descrito sobre a resistência ao fago e uso para fazer um alimento/produto alimentar. O artigo (Ross et al., Appl. Environ. Microbiol., 56(7): 2164-9, 1990) refere-se ao uso de thyA como marcador genético. Não há nada descrito sobre a resistência do fago e uso para fazer um alimento/produto alimentar. O artigo (Pedersen et al., Appl. Environ. Microbiol., 68(6):3010-23, 2002) foi publicado em 2002. 5/35

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Um método para modificar um material de substrato mediante uma cultura bacteriana que é capaz de ser metabolicamente activa no dito substrato, com o qual a cultura bacteriana não é susceptivel ao ataque por bacteriófagos, compreendendo o método (i) isolar uma estirpe bacteriana que não é capaz da replicação do ADN no dito material de substrato mas é capaz de modificar metabolicamente o material de substrato, em que a estirpe bacteriana é uma estirpe mutante que é auxotrófica em relação a um composto que não está presente no material de substrato e que é requerida pela estirpe para a replicação do ADN, (ii) propagar a estirpe seleccionada num meio em que a estirpe é capaz de replicar-se para obter uma cultura da dita estirpe, (iii) adicionar a cultura bacteriana obtida ao material de substrato e manter o material sob condições em que a cultura é metabolicamente activa, pelo qual, se o material de substrato está contaminado com um bacteriófago, a actividade metabólica da cultura bacteriana não está substancialmente afectada pelo bacteriófago, e em que a cultura bacteriana é seleccionada do grupo constituído por Lactococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus, spp. Strepococcus spp., Propionibacterium spp., Bifidobacterium spp., Staphylococcus spp. Micrococcus spp., Bacillus, spp., Actinomycetes spp., Corynebacterium spp. e Brevibacterium spp; e caracterizado por o material de substrato ser um material iniciador para um produto comestível, o material ser seleccionado do grupo constituído por leite, um material vegetal, um produto à base de carne, um mosto, um sumo de frutas, um vinho, uma massa e uma massa para panar; e a cultura bacteriana como a obtida no método ser usada como uma cultura iniciadora na preparação de um produto seleccionado do grupo 1/3 constituído por um aroma lácteo, um produto aromatizante de queijo, um produto alimentar e uma comida. 2. 0 método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a estirpe mutante ser um mutante Pur que inclui a estirpe de Lactococcus lactis DN105 depositada com o número de acesso DSM 12289 . 3. 0 método acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a estirpe mutante ser um mutante thyA que inclui a estirpe de Lactococcus lactis MBP71 depositada com o número de acesso DSM12891. 4. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado por a cultura bacteriana ser a de Lactococcus lactis. 5. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado por a estirpe bacteriana ser adicionada ao material de substrato a uma concentração na margem de entre 105 e 101 2 CFU/ml ou g do material. 6. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado por a cultura compreender uma estirpe geneticamente modificada que, em relação à sua estirpe mãe é aumentada em pelo menos uma via metabólica. 7. 0 método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a estirpe modificada geneticamente ter em relação à sua estirpe mãe, uma actividade metabólica aumentada seleccionada do grupo constituído por fluxo glicolítico aumentado e fluxo aumentado através da via de pentose fosfato. 1 0 método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a estirpe modificada geneticamente ter em relação à sua estirpe mãe, uma actividade de ATPase aumentada. 2 2/3 9. 0 método de acordo com reivindicação 1, caracterizado por a cultura bacteriana compreender uma estirpe que é um mutante condicional, que a uma condição pré-determinada não executa a replicação do ADN. 10. 0 método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a condição pré-determinada ser seleccionada do grupo constituído pelo pH, pela temperatura, pela composição do material de substrato e pela presença/ausência de uma substância indutora. 11. 0 método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a cultura compreender uma estirpe bacteriana que é capaz de aumentar o tamanho das células sem mitose. 12. Uso de uma cultura como a obtida no método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11 como uma cultura iniciadora na preparação de um produto seleccionado do grupo constituído por um aroma lácteo, um produto aromatizante de queijo, um produto alimentar e comida. 13. Uma bactéria de ácido láctico mutante, caracterizada por a estirpe mutante ser a estirpe de Lactococcus lactis MBP71 do mutante thyA depositada com o número de acesso DSM12891. Lisboa, 04 de Agosto de 2010 3/3

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