PT103503B

PT103503B - Novos derivados do bisnaftalimidopropil, processo para a sua preparação, composições farmacêuticas que os contêm e sua utilização em doenças cancerígenas e parasitárias, nomeadamente leishmanioses, tripanossomíases e malária.

Info

Publication number: PT103503B
Application number: PT103503A
Authority: PT
Inventors: Anabela Cordeiro Da Silva; Joana Alexandra Pinto Da Costa Tavares; Paul Kong Thoo Lin
Original assignee: Univ Do Porto
Priority date: 2006-06-19
Filing date: 2006-06-19
Publication date: 2009-05-18
Also published as: CA2635903A1; US8350036B2; US20090062329A1; EP2029545B1; PT103503A; AU2007273886A1; AU2007273886B2; EP2029545A2; WO2008007262B1; ES2532501T3; WO2008007262A2; CA2635903C; WO2008007262A3

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO DIZ RESPEITO À OBTENÇÃO DE NOVOS DERIVADOS DO BISNAFTALIMIDOPROPIL E SUA UTILIZAÇÃO NO TRATAMENTO DE DOENÇAS CANCERÍGENAS E PARASITÁRIAS. FORAM SINTETIZADOS OS SEGUINTES DERIVADOS DO BISNAFTALIMIDOPROPIL DE FÓRMULA GERAL A (FIG 1), NA QUAL (A) REPRESENTA O PONTO DE DIVERSIDADE): BNIPPUT, BNIPDAPEN, BNIPDAHEX, BNIPDAHEP, BNIPDAOCT, BNIPDANON, BNIPDADEC, BNIPDADOD, BNIPDPTA E BNIPDETA). VERIFICOU-SE QUE O RENDIMENTO DE SÍNTESE RONDOU OS 50 A 70%. FOI AVALIADA A SUA CITOTOXICIDADE, CONTRA CÉLULAS TUMORAIS (CACO-2) E CONTRA O PARASITA LEISHMANIA INFANTUM PELO MÉTODO DO MTT E PELA ACTIVIDADE DA LUCIFERASE PRESENTE NO PARASITA, RESPECTIVAMENTE. VERIFICOU-SE QUE A CITOTOXICIDADE NAS CÉLULAS CACO-2 FOI MANIFESTADA COM VALORES DE IC50 ENTRE 0,3 E 22 UM, APÓS 48 HORAS DE INCUBAÇÃO COM OS COMPOSTOS. OS VALORES DE IC50 CONTRA LEISHMANIA INFANTUM VARIAM ENTRE 0,39 E 2,09 UM, PARA A FORMA PROMASTIGOTA, ENTRE 5,24 E 17,42 UM, PARA A FORMA AMASTIGOTA AXÉNICA E ENTRE 2,43 A 9,52 UM, PARA A FORMA AMASTIGOTA INTRACELULAR. ESTES COMPOSTOS REPRESENTAM UMA ALTERNATIVA À TERAPÊUTICA EXISTENTE PARA AS ÁREAS REFERIDAS, PODENDO RESOLVER OS PROBLEMAS DE TOXICIDADE E DE RESISTÊNCIA EM RELAÇÃO AOS COMPOSTOS EXISTENTES NO MERCADO.

Description

DESCRIÇÃO

NOVOS DERIVADOS DO BISNAFTALIMIDOPROPIL, PROCESSO PARA A

SITA FR&ÇOAÇÃO, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTÊM E SUA UTILIZAÇÃO EM DQE^ÇAS CANCERÍ GEMAS E PARASITÁRIAS, NCMEADAMERTE LEISHMANIOSES . TRIPAMOSSCMÍASES E MALÁRIA^-·

Domínio técnico da invenção:

A presente invenção refere-se a obtenção de novos compostos derivados do bisnaftalimidopropil e a composições farmacêuticas que os contêm, bem como a respectiva utilização no tratamento de doenças cancerígenas e parasitárias, nomeadamente leishmanioses, tripanossomíases e malária, com aplicação na indústria farmacêutica, uma vez que se verificou que estes compostos apresentam propriedades de inibição do crescimento do parasita protozoário Leishmania infantum e propriedades citotóxicas em células cancerígenas.

Estado da técnica anterior:

Os derivados naftalimido exibem um efeito citotóxico na quimioterapia do cancro (Brana et al, 2001). Os autores da invenção sintetizaram e testaram a actividade biológica de uma nova série de compostos poliamínicos derivados do bisnaftalimidopropil (Kong et al, 2000) . Trabalhos posteriores demonstraram que a presença do grupo funcional bisnaftalimidopropil seria essencial para uma actividade biológica óptima, uma vez que um átomo de oxigénio na posição a do anel naftalimido tende a reduzir a actividade (Pavlov et al, 2001) .

A maioria das investigações tradicionais focam-se nas modificações dos anéis naftalimídicos para aumentar as actividades antitumorais, devido ao aumento da ligação ao DNA e clivagem. Por exemplo, a acenaftalimida foi introduzida no cromóforo naftalimida para aumentar a solubilidade dos compostos bisnaftalimida (Patten et al, 1992 e Brana et al, 1995). 0 furano foi adicionado ao cromóforo naftalimida e estes compostos na ordem de concentrações dos nanomolar exibem forte ligação ao DNA com toxicidade para as células leucémicas (Brana et al, 1995). A pirazina foi também recentemente fundida com as naftalimidas e estas pirazino-naftalimidas exibem toxicidade in vitro com valores de na gama de 0, 002 a 7,8μΜ, após 72h de tratamento das seguintes células tumorais: HT29, HeLa e PC3 (Bailly et al, 2003).

Os inventores têm vindo a desenvolver novos compostos derivados do bisnaftalimidopropil por adição de poliaminas naturais como a putresceina, espermidina e espermina. Os derivados da espermidina e da espermina exibem uma solubilidade em água aumentada, mantendo a boa actividade biológica (Carrasco et al, 2003 e Kong et al, 2003) . Nas células do cancro da mama MCF7, estes derivados do bisnaftalimidopropil assim como os conjugados com a espermidina (BNIPSpd) induzem danificação do DNA (Dance et al, 2005). Estes Últimos, apresentaram pela primeira vez um efeito anti-proliferativo nas formas promastigota e amastigota do parasita Leishmania infantum, por um mecanismo de morte celular do tipo apoptótico (Tavares et al, 2005).

Na leishmaniose a quimioterapia de primeira escolha é limitada ao uso de derivados de antimónio pentavalentes (Murry et al, 2001) . No entanto, como consequência do uso prolongado destes fármacos o aparecimento de reacções adversas e resistências conduz a uma constante pesquisa de novos compostos mais eficazes. A eficácia do tratamento também está comprometida em situações de imunodeficiência em particular na co-infecção Leishmania/iilV.

As poliaminas naturais, putrescina, espermidina e espermina, presentes na maioria das células eucarióticas desempenham uma importante função na proliferação e diferenciação celular (Muller et al, 2001) . No caso dos tripanosomatídeos as poliaminas desempenham um papel adicional na medida em que participam no equilíbrio redox endóqeno através do componente tripanociona [NI, N8-bis (glutationil)espermidina]. Estas moléculas e reacções enzimáticas são consideradas como bons alvos para actuação de fármacos (Fairlamb e Cerami, 1992; Barrete et al, 1999) . Inibidores da síntese da poliaminas como por exemplo o DFMO (a-difluormetilornitina) mostrou-se activo contra alguns estádios do parasita Plasmodium sp. O facto deste parasita possuir uma enzima bifuncional com actividade de ornitina e S-adenosilmetionina descarboxilase, ausente nas células do hospedeiro, faz desta enzima um forte alvo de actuação de fármacos (Muller et al, 2001) .

Interferir com a função reguladora das poliaminas tem sido assim, uma estratégia na pesquisa de compostos eficazes com actividade anti-tumoral e anti-parasitária.

Esta invenção tem como objectivo obter novos compostos derivados do bisnaftalimidopropil diaminas e triaminas: BNIPDapen, BNIPDahex, BNIPDahep, BNIPDaoct, BNIPDanon, BNIPDadec, BNIPDadod, BNIPDpta e BNIPDeta, baseado nos compostos líderes BNIPPut (I)e BNIPSpd (XI) com modificação na cadeia central.

A modificação consiste na variação do tamanho da cadeia alquilica central, contendo 2 ou 3 átomos de azoto, modulando assim o número de cargas positivas nas moléculas. Estas alterações visam aumentar as propriedades citotóxicas em células cancerígenas e a actividade anti-parasitária (anti-protozoária). Estes melhoramentos incluem a potência, especificidade, selectividade, biodisponibilidade oral, penetração nos tecidos alvo e duração da acção, e diz respeito a novos compostos de fórmula geral A, na qual (a)

representa o A :^:W	ponto	de diversidade.
Ν’
/ · % < : 1	H .
<·		.A'
......... Λχ''		...... V ' ' '

Compostos BNIPDiaminoalquilo

BNIPDapen

BNIPDahex

ii

BNIPDaOct

BNIPDanon

BNIP Dadec

ο

Compostos BNIPTriaminoalquilo

	Λ'	P
		N

	%. A™
	'X-XxG.··''	o

Q. .·

	N H	.••'’ν·. A ^: ‘x: .·' - N í— XAJ
	.ν'Χ.χ	% _?.....V

*4

ÍX

BNIPSpd ’· 'X em que:

A cadeia central alquilica sofre modificações de tamanho ou introdução de 1 átomo de azoto.

Os compostos preferidos da fórmula I incluem:

1. Bisnaftalimidopropilputrescina - BNIPPut (I)

2. Bisnaftalimidopropildiaminopentano - BNIPDapen (II)

3. Bisnaftalimidopropildiaminohexano - BNIPDahex (III)

4. Bisnaftalimidopropildiaminoheptano - BNIPDahep (IV)

5. Bisnaftalimidopropildiaminooctano - BNIPDaoct (V)

6. Bisnaftalimidopropildiaminononano - BNIPDanon (VI)

7. Bisnaftalimidopropildiaminodecano - BNIPDadec (VII)

8. Bisnaftalimidopropildiaminododecano- BNIPDadod (VIII)

9. Bisnaftalimidopropildipropiltriamina - BNIPDpta (IX)

10. Bisnaftalimidopropildietiltriamina - BNIPDeta (X)

11. Bisnaftalimidopropilespermidina - BNIPSpd (XI)

Ainda outro aspecto da invenção diz respeito as composições farmacêuticas que compreendem um dos referidos compostos (um composto da fórmula II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX e X) em combinação com um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, bem como a sua utilização no tratamento e/ou prevenção de doenças parasitárias e cancerígenas.

Descrição da invenção:

A síntese dos compostos referidos nesta invenção foi baseada em métodos previamente descritos pelo nosso grupo (Kong et al, 2003) . Os compostos bisnaftalimida contendo na cadeia de ligação dois átomos de azoto foram previamente sintetizados fazendo reagir a correspondente alquiltetraamina com o anidrido 1,8-naftálico (Brana et al, 1995). Com o objectivo de introduzir heteroátomos na cadeia de ligação foi utilizada a reacção de N-alquilação descrita segundo Kong (Kong et al, 1998) . O intermediário comum para sintetizar os diferentes compostos foi o toluenosulfoniloxipropilnaftalimida. Este composto foi preparado por reacção do anidrido 1,8-naftálico com aminopropanol originando N-(3-hidroxipropil)naftalimida que ao reagir com o cloreto de tosilo origina toluenosulfoniloxipropilnaftalimida, com rendimento de 60%. Para a obtenção dos derivados bisnaftalimida a poliamina utilizada dependendo do composto a sintetizar e foi inicialmente protegida com cloreto de 2,4,5trimetilsulfonil em piridina seguida da N-alquilação com o composto toluenosulfoniloxipropilnaftalimida originando os derivados bisnaftalimida protegidos. A desproteção realizou-se com ácido bromidrico / ácido acético glacial em diclorometano originando os respectivos derivados na presença de ácido bromidrico.

As células Caco-2 foram obtidas da Colecção Europeia de Cultura Celular (ECACC, 8601202) . A cromatografia em camada fina foi realizada em placas 60 F254 numa partilha de solventes clorofórmio: metanol (97:3 ou 99:1). A cromatografia em coluna foi realizada em gel de sílica 60, com malha de 230-400 e utilizou-se como eluente clorofórmio e metanol. O espectro de massa FAB foi obtido num espectrómetro analítico VG (25Kv), o espectro EC/CI foi obtido num instrumento Micromass Quatro II (baixa resolução) ou VG analítico ZAB-E. Os espectros de RMN de e ¹³C foram realizados num espectrómetro de RMN, JEOL JNMEX90 FT.

Os compostos BNIPSpd e BNIPPut foram sintetizados de acordo com os métodos previamente descritos pelo nosso grupo (Kong et al, 2003, Tavares et al, 2005) .

Estudos de citotoxicidade

A citotoxicidade foi avaliada em células cancerígenas de intestino (Caco-2) utilizando o ensaio do Brometo de 3(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT; Dance et al, 2005) . As células Caco-2 foram mantidas em meio mínimo essencial Earle^, suplementado com soro bovino fetal a 10%, L-glutamina 2mM, aminoácidos não essenciais a 1%, penicilina lOOUI/ml e estreptomicina ΙΟΟμς/τηΙ. As células em crescimento exponencial foram colocadas em placas de 96 orifícios numa concentração de 2xl0⁴ células / cm² e incubadas durante 24h antes da adição dos compostos. As soluções mães dos compostos foram preparadas dissolvendo os compostos em DMSO a 20% e as soluções de trabalho foram obtidas após diluição em meio de cultura completo.

Após 24 e 48h de incubação a 37 °C, o meio foi removido e adicionado 2 00μ1 da solução de MTT (lmg/ml) em meio sem soro, a cada orifício. As placas foram incubadas a 37 durante 4h. No fim do período de incubação, o meio foi removido e adicionado DMSO puro (200μ1>) a cada orifício. O produto de metabolização do MTT dissolvido em DMSO foi guantificado pela leitura da absorvância a 560nm num leitor de microplacas. Os valores de ϊ'Εν foram definidos como a concentração do composto necessário para reduzir a absorvância em 50% em relação ao valor do controlo. Os valores de A'· foram calculados pela eguação da zona linear da curva logarítmica. O valor de I:® foi determinado pela eguação guando y = 50 (50% do valor).

As formas promastigota de Leishmania infantum (clone Mu -.s' · »4^ η*».' ₍ transf ectadas com o gene repórter gue codifica para a enzima luciferase (Roy et al, 2000), foram colocadas a crescer a 27 °C em meio RPMI suplementado com soro bovino fetal inactivado a 10%, L-glutamina 2mM, Hepes 20mM, penicilina lOOU/ml e estreptomicina ΙΟΟμς/πιΙ. Os parasitas (10⁶/ml) na fase logarítmica de crescimento (2 dias de cultura) foram incubados com uma série de diferentes concentrações de cada composto a temperatura de 27 °C durante 3 dias, ao fim dos quais o crescimento parasitário foi determinado pela quantificação da actividade da luciferase sobre o substracto, luciferina.

A forma amastiqota axénica de Leishmania infantum (clone MKÍIR/RA',.? tTtV ‘ , transfectada com o qene repórter que codifica a enzima luciferase (Roy et al, 2000), foi colocada a crescer a 37 com 5% de CO₂ em meio de cultura MAA (meio para crecimento de amastiqotas axénicas). O meio MAA/20 consiste na modificação do meio 199 (solução salina Hank) suplementado com triptocaseina 0,5%, D-qlucose 15mM, qlutamina 5mM, bicarbonato de sódio 4mM, hemina bovina 0,023mM, e HEPES 25mM num pH final de 6,5 e suplementado com 20% de soro bovino fetal inactivado. Os parasites foram incubados com uma qama de concentrações de cada composto a testar, durante 3 dias a 37 C em estufa de CO₂ a 5%. O crescimento dos parasitas foi determinado pela quantificação da actividade da luciferase sobre o substracto, luciferina.

A forma amastiqota intracelular de Leishmania infantum (clone MHOM/MA671TMA-P263) foi cultivadas numa linha celular de monócitos humanos, THP-1, por diferenciação em macrófaqos após 2 dias de cultura em meio contendo 20ng/ml de acetato de miristato de forbol. Estas células foram cultivadas em meio de cultura: RPMI suplementado com soro bovino fetal inactivado a 10%, L-glutamina 2mM, penicilina lOOU/ml e estreptomicina ΙΟΟμς/ιηΙ. As células não diferenciadas foram removidas por lavagem com meio préaquecido a 37 C e as diferenciadas foram infectadas com a forma do parasita amastigota axénica transfectada com o gene que codifica para a luciferase numa proporção de 3:1 (3 parasitas para uma célula). A infecção ocorreu durante 4 horas a 37 °C em atmosfera de 5% de CO2. Os parasitas presentes no sobrenadante foram removidos por lavagem com RPMI. Os compostos foram adicionados na gama de concentrações a testar e incubados durante 3 dias a 37 °C em estufa de 5% de CO2. Após 5 dias de incubação com os diferentes compostos, as células foram lisadas para determinar a actividade da luciferase.

Resultados:

Química

A estratégia de síntese dos derivados bisnaftalimidapropil: BNIPDapen, BNIPDahex, BNIPDahep, BNIPDaoct, BNIPDanon, BNIPDadec, BNIPDadod, BNIPDpta e BNIPDeta foi baseado em métodos previamente desenvolvidos (Kong et al, 2000). A protecção e a activação de todas as diaminas e triaminas foram realizadas com cloreto de mesitileno em piridina a temperatura ambiente de forma a obter os compostos de II a X com alto rendimento. A N-alquilação dos compostos 0tosilpropilnaftalimida foi realizada com carbonato de césio em DMF anidro produzindo derivados bisnaftalimidopropil completamente proteqidos, os quais após desprotecção com ácido bromidrico e ácido acético qlacial em diclorometano origina os seguintes compostos: BNIPDapen, BNIPDahex, BNIPDahep, BNIPDaoct, BNIPDanon, BNIPDadec, BNIPDadod, BNIPDpta e BNIPDeta com rendimento que varia entre 50-70%.

Alquildiaminas Mts em piridina durante 2horas a temperatura ambiente

n = 3,4, 5,6,7,8,10

1. DMF, xp»®/ durante 12h a 80

2. 20% HBr/CH₃COOH glacial durante a noite a temperatura ambiente

li	BNIPDapen,	n = 3
	BNIPDahex,	n = 4
!V	BNIPDahep,	n = 5
V	BNIPDaoct,	n = 6
VI	BNIPDanon,	n = 7
w	BNIPDadec,	n = 8
VIII	BNIPDadod,	n = 10

Esquema I.

Estratégia de síntese dos derivados bisnaftalimidapropilalquildiaminas.

3. DMF ^SC durante 12h a 80

HA, 20% HBr/CH₃COOH qlacial durante a noite a



ΰ fK· “ 'μ'
•t Η \—X 3Η£>'· Cí ^<:·	$ ·!·Υ

BNIPDeta

/Λ /		ί< -- Ν	/‘Λ
4 7 <	Η	.. Η \™.
'······' 0		ο

Esquema II.

Estratégia de síntese dos derivados bisnaftalimidapropilalquiltriaminas.

Actividade Biológica

A citotoxicidade in vitro para todos os derivados bisnaftalimidopropil descritos foi realizada em linhas celulares cancerígenas de intestino e nos parasitas

Leishmania infantum. Na linha celular cancerígena os valores de para cada composto foram determinados após e 48 horas de exposição a diferentes compostos (Tabela

I). Todos os compostos excepto o BNIPDeta (valor de TCK

21,7 e 22,3μΜ para 24 e 48 horas, respectivamente) apresentaram valores de entre 0,15 e ΙΙμΜ. O BNIPSpd foi o composto mais activo com um valor de ISS de 0,15 e 0,47μΜ, ao fim de 24 e 48 horas, respectivamente. Na mesma ordem de actividade, o composto BNIPDadec apresentou um valor de de 0,77 e 0,36μΜ, ao fim de 24 e 48 horas, respectivamente.

A remoção do átomo de azoto da cadeia de ligação policarbonada parece não afectar substancialmente as propriedades citotóxicas dos compostos. Estudos anteriores mostraram que quando o grupo alquilo central é uma cadeira butilica, o composto (BNIPPut) não é solúvel na maior parte dos solventes. A solubilidade em água dos compostos bisnaftalimidapropil foi aumentada pela introdução de um heteroátomo como o azoto ligado a cadeia central (Kong et al, 2000). O aumento do tamanho da cadeia alquilo central, como no BNIPDaoct, BNIPDpta e BNIPDadec ajudou a solubilidade em água.

O aumento das cadeias alquilicas entre os dois anéis naftalimido, não levou a perda da interacção n-n entre os anéis aromáticos e melhorou a solubilidade em meio aquoso. O composto BNIPDadec apresenta uma alta citotoxicidade contra as células Caco-2 com valores de IC50 de 0,36μΜ (48horas) e 0,77μΜ (24 horas).

Tabela 1. Citotoxicidade dos derivados bisnaftalimidopropil em células cancerígenas Caco-2.

ewów
24h	48h
BNIPSpd	0, 15	0, 4 7
BNIPPut		W:
BNIPDapen
BNIPDahex		<Í- .i· \
BNIPDahep		ϋ. 34
BNIPDaoct		3.: >0
BNIPDanon	_t ^:'
BNIPDadec
BNIPDadod		2'4 3'0
BNIPDpta	<·., g g
BNIPDeta		22, 32

^s Citotoxicidade determinada pelo ensaio do MTT. Os resultados foram obtidos após tratamento das células Caco-2 com uma gama de concentrações entre 0,01-40 μΜ, durante 24 e 48 horas. Os resultados representam a media de 6 ensaios. ND: não determinado.

Os gráficos apresentados nas Figuras 1 e 2, representam o efeito dos diferentes derivados do bisnaftalimidopropil no crescimento parasitário in vitro. As curvas de crescimento das formas promastigota e amastigota axénica transfectadas com o gene repórter que codifica para a luciferase, representativas de cinco ensaios realizados independentemente.

Ambas as formas do parasita, promastigota e amastigota axénica, foram incubadas com uma gama de concentrações de 0,39 a 12,5μΜ, a temperatura de 27

C, e de 3,125 a ΙΟΟμΜ, a temperatura de 37 C em C02 a 5% respectivamente, durante 3 dias. As curvas de crescimento representadas traduzem percentagem de crescimento relativamente ao controlo para cada concentração de composto utilizada após determinação da actividade da luciferase. Cada ponto representa a média de três ensaios i o desvio padrão.

O tratamento das diferentes formas do parasita Leishmania infantum, promastigota, amastigota axénica e amastigota intracelular com os compostos, BNIPSpd, BNIPPut, BNIPDaoct, BNIPDanon, BNIPDpta e BNIPDeta, em concentrações na gama de 0, 39 a 50μΜ resultou numa inibição dose dependente do crescimento parasitário, excepto na forma amastigota axénica incubada com o composto BNIPDaoct, o qual não inibiu o crescimento parasitário até a concentração de 50μΜ (Gráficos 1). Observou-se que o crescimento dos parasitas foi completamente bloqueado a partir das concentrações de

6,25μΜ para a forma promastigota e 50μΜ para a forma amastigota axénica, excepto em relação ao composto BNIPDaoct.

No caso da forma promastigota os ICàs I SD determinados foram: 1,86 I 0,82; 0,40 I 0,15; 0,39; 2,09 I 0,54; 1,09

I 0,12; 0,96 i 0,17μΜ, para os seguintes compostos:

BNIPSpd, BNIPPut, BNIPDaoct, BNIPDanon, BNIPDpta e

BNIPDeta, respectivamente. Sendo o composto BNIPDaoct, aquele que se mostrou mais activo para esta forma parasitária.

No caso da forma amastigota axénica os determinados foram:

9,61 ± 1,84;

5,49 I

0, 67;

> 50,00;

17,42 i 0,97;

5,24 ±

0,93; 6,97 I

0,20μΜ, para os seguintes compostos: BNIPSpd, BNIPPut, BNIPDaoct,

BNIPDanon,

BNIPDpta e BNIPDeta, respectivamente. Sendo o composto

BNIPDpta, aquele que se mostrou mais activo para esta forma parasitária.

No caso da forma amastiqota intracelular os Iws ± SD determinados foram: 8,92 I 1,07; 4,53 I 0,54; 2,43 I 0,19;

6/03 i 0,67; 4,22 I 1,07; 9,52 I 0,56μΜ, para os sequintes compostos: BNIPSpd, BNIPPut, BNIPDaoct, BNIPDanon, BNIPDpta e BNIPDeta, respectivamente. Sendo o composto BNIPDaoct, aquele que se mostrou mais activo para esta forma parasitária.

De acordo com os resultados obtidos todos os compostos em estudo possuem uma actividade anti-parasitária que os torna potenciais fármacos para o tratamento da leishmaniose.

Tabela 2. Citotoxicidade dos derivados bisnaftalimidopropil nas diferentes formas do parasita Leishmania infantum

Composto³	IC50 Promastigotas	Amastigotas axénicas	Amastigotas intracelulares
BNIPSpd	1,86 I 0,82	9,61 I 1,84	8,92 ± 1,07
BNIPPut	0,40 ± 0,15	5,49 I 0, 67	4,53 + 0,54
BNIPDapen	ND	ND	ND
BNIPDahex	ND	ND	ND
BNIPDahep	ND	ND	ND
BNIPDaoct	3 0,39	> 50,00	2,43 I 0,19
BNIPDanon	2,09 ± 0,54	17,42 I 0,97	6,0 3 í 0,6 7
BNIPDadec	ND	ND	ND
BNIPDadod	ND	ND	ND
BNIPDpta	1,09 ± 0,12	5,24 I 0,93	4,22 ± 1,07
BNIPDeta	0,96 ± 0,17	6,97 I 0,20	9/52 ± 0,56

® ' i < determinada pelo ensaio da luciferase. Os resultados foram obtidos após tratamento das diferentes formas do parasita com uma gama de concentrações entre 0,39-50 μΜ, após 72 horas. Os resultados representam a media I SD de pelo menos 5 ensaios. ND: não determinado.

Em conclusão, os novos derivados bisnaftalimidopropil exibem citotoxicidade contra linhas tumorais e contra parasitas podendo ser bons antitumorais e antiparasitários.

Conclusão:

O emprego dos compostos da fórmula I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI pode ser útil no tratamento de patologias cancerígenas e parasitárias nomeadamente no tratamento de leishmanioses, tripanossomíases e malária.

Para a preparação de composições farmacêuticas contendo os compostos das fórmulas I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII,

IX, X, XI adjuvantes farmaceuticamente inertes são misturados com os compostos activos. Os adjuvantes empregues podem ser sólidos ou líquidos. As formas sólidas incluem pós, comprimidos, grânulos dispersíveis e cápsulas. 0 adjuvante sólido pode ser uma ou mais substâncias que actuam como diluentes, aromatizantes, edulcorantes, solubilizantes, lubrificantes, agentes suspensores, ligantes ou agentes desagregantes e pode ainda ser um agente encapsulante.

A preparação farmacêutica apresenta-se de preferência sob a forma de dosagem unitária; a embalagem contém quantidades discretas do preparado tal como comprimidos revestidos, cápsulas, pós em frascos ou ampolas e formulações lipossómicas.

A dosagem pode variar de acordo com as necessidades do animal ou do paciente, a gravidade da doença e o composto a utilizar. A determinação da dosagem apropriada para uma situação em particular compete aos conhecedores da arte da medicina. Por conveniência, a dosagem diária total pode ser dividida e administrada por partes ao longo do dia.

Descrição pormenorizada da invenção:

Método geral para a síntese da diamina ou triamina mesitilada

A correspondente diamina ou triamina foi dissolvida em piridina anidra seguida da adição de cloreto de mesitileno (2,1 molar em excesso para diamina e 3,1 molar em excesso para triamina). A solução resultante foi colocada a temperatura ambiente durante 4 horas. A remoção da piridina foi feita pela adição de água fria com formação de um precipitado, o qual foi filtrado e lavado com água. 0

produto bruto foi recristalizado com	álcool	absoluto.
μ , O ró	έ ,L; OCCèn·.::	<s 2- (70%), W	NMR (£	VI. h 6:	20,82
Oh Mts),	22,85	Mts), 26/3	4 (CH₂)	_s 28,70	(CH₂) _s
2 9,41 (CHO	, 41,05	(N-CH₂), 47,58	(ch₂) ,	133 (carbonos
aromáticos,	Mts) .
o , Õ Vu	t :^:O vo;:	Ó 3- (36%), V	NMR K	W 6:	20,82
(CS_Si Mts) ,	22,85	Mts), 2 6,3	ís (CH₂)	λ 28,70	(CH₂) _s
29,41 (CH₂)	, 41,05	(N-CH₂), 47,58	(CH₂) ,	133 (carbonos
aromáticos,	Mts) .
	ϊ * v ; , *₄'a? ' ί	K 4- (48%), W	NMR K	Oh. 6:	20,82
(CH₃, Mts),	22,85	(CH₃, Mts), 26, 34 (CH₂)	, 28,70	(CH₂),
29,41 (CH₂)	, 41,05	(N-CH₂), 47,58	(CH₂),	133 (carbonos
aromáticos,	Mts) .
V , V \ ' . ' : ; . ' ' 5-	(67%) ,	-O NMR (
δ: 20,85 (CH₃, Mts)	, 22,7 9 (CH₃, <	27 p	(C-v,	X.· .y _Λ: -P ·.:··

(N-CH₂) , 43,11 (N-CH₂) , 132,17 (carbonos aromáticos, Mts),

139,98 (carbonos aromáticos, Mts).

bd 6- (59%), W NMR K OVl-s i

Ô: 21,35 (CH₃, Mts), 23,06 (CH₃, Mts), - p u , 47,58 (N-CH₂) , 133 (carbonos aromáticos, Mts).

Síntese de O-tosíharoiailnaftaliniicla ! !!!!!!!!!! I I !!!!!!!! III 'l . 1.11111.1 life I I I T itl II I Ί I I

Anidrido naftálico (6,349, 0,032 mole) foi dissolvido em

DMF (50ml) seguido da adição de 3-aminopropanol (2,459, 0,032 mole) e BDU (4,87g, 0,032 mole). A solução foi deixada a agitar a 85 °C durante 4 horas. O solvente DMF foi removido sobre pressão reduzida e o resíduo resultante foi transformado em pó por agitação num banho de agua refrigerado (200ml) até se formar um precipitado. Posteriormente foi filtrado utilizando um funil de Buchner e lavado com uma solução saturada de bicarbonato. O rendimento da reacção foi de 95%. 0 composto obtido, naftalimidopropanol apresentou um grau de pureza suficiente para ser utilizado no passo seguinte sem posterior purificação. NMR = 8,65-7,80 (m, 6H, protões aromáticos), 4,39 (t, 2H, -N-CH₂) , 3,69 (t, 2H, CH₂-O-) ,

3,20 (s, cheio, 1H, OH), 2,06 (p, 2H, CH₂) . NMR (CDC1₃) :

δ.= 161,70 (C=O), 135,70-122,90 (carbonos aromáticos), 74,90; 59,90; 30;90 (3xCH₂).

Naftalimidopropanol (5,10g, 20mmol) foi dissolvido em piridina anidra (80ml). A solução foi deixada a agitar a 4 °C durante 15 minutos. Cloreto de tosil (5,72g, 30mmol) foi adicionado gradualmente durante 30 minutos. A solução foi deixada a 4 FC durante a noite e transformado em pó por agitação num banho água refrigerado (200ml) para formar um sólido estável. O sólido formado foi filtrado e lavado continuamente com água. O produto bruto foi recristalizado com etanol e acetato de etilo para originar o O-tosil-6propilnaftalimida (53%). NMR (CDC13): 8 = 8,65-7,80 (m,

6H, protões aromáticos), 4,45 (t, 2H, 4,35 (t, 2H,

CH₂), 2,50 (s, 3H, CH₃) , 2,25 (p, 2H, CH₂) - NMR δ .= 161,30 (C=O), 145, 10-123, 10 (carbonos aromáticos),

73,1; 67,90; 28,70 (3 x CH₂) , 22,10 (CH₃) . LRMS (FAB): O cálculo para C12H19NO6S 425,09, encontrado: [O® MH]⁺ .

Reacção geral de N-alquilação

As poliaminas mesitiladas (2-6) (0,651 mmol) foram dissolvidas em DMF anidro (13,5 ml) seguida da adição 7x (0,13 mmol) e carbonato de césio (l,06g). A solução foi deixada a 85 °C e a complementação da reacção foi monitorizada por cromatografia em camada fina. O DMF foi removido por vácuo e o resíduo foi transformado em pó em banho de água refrigerado sendo o precipitado resultante filtrado e lavado continuamente com água. Após secagem, o produto bruto foi recristalizado do etanol e obtido um produto completamente purificado e protegido com alto rendimento (75-85%).

Reacção geral de desprotecção

Os derivados poliamínicos (0,222 mmol) completamente protegidos foram dissolvidos em diclorometano anidro (lOml) seguido da adição de ácido bromidríco e ácido acético glacial (lml). A solução foi deixada a agitar a temperatura ambiente durante 24h. O precipitado amarelo formado, foi filtrado e lavado com diclorometano, acetato de etilo e éter.

Utilizando o processo descrito e processos relacionados, óbvios para os conhecedores da arte, usando cadeias alguílicas apropriadas, foram sintetizados,

Bisnaftalimidopropildiaminopentano (BNIPDapen). LRMS (ESI) : O cálculo para 2HBr 738.52[M]⁺, encontrado:

657.1 [M-H-Br] ' .

Bisnaftalimidopropildiaminohexano (BNIPDahex). LRMS (ESI) : O cálculo para <.2HBr 752.71 [M]⁺, encontrado: 671.3[M-H-Br]⁺.

Bisnaftalimidopropildiaminoheptano (BNIPDahep). LRMS (ESI): O cálculo para 2HBr 766.74[M] ⁺ , encontrado: 685.2[M-H-Br]⁺.

Bisnaftalimidopropildiaminooctano (BNIPDaoct). (85%)

DMSO-dg, δ: 24,43 (CH₂) , 25,30 (CH₂), 25,66 (CH₂) ,

CTO. 41/¾ (N-CH₂), 46, 60 (N-CH₂) , 121,9¾ 127,13; 130,62; 131,21; 134,31 (carbonos aromáticos), 163,61 (C=O). LRMS (FAB) : 0 cálculo para - U /¾ 619,3279, encontrado:

619,3282 [M-H-2Br]⁺.

Bisnaftalimidopropildiaminononano (BNIPDanon). (85%)

DMSO-d₆, δ: 24,88 (CH₂) , 25,84 (CH₂) , 26,16 (CH₂) , 28,76 (CH₂), 45,29 (N-CH₂), 47,29 (N-CH₂), - . 127,51; 131,12;

131,42; 134,76 (Naftalimida carbonos aromáticos), 164,00 (C=O) . LRMS (FAB) : O cálculo para ' _x ·. > , 633,3435, encontrado: 633,3440 [M-H-2Br] ⁺.

Bisnaftalimidopropildiaminodecano (BNIPDadec). (75%)

DMSO-dg, δ: 24,97 (CH₂) , 25,90 (CS/.. 26,22 ///), 28,79 (CH₂), 29, 00 (CH₂), 45,35 (N-CH₂) , 4 7 /3 8 (N-CH₂) , 1¾¾ 127,66; 131,30; 131,51; 134,94 (Naftalimida carbonos aromáticos), 164,21 (C=O). LRMS (FAB): O cálculo para 647,4, encontrado: 647,4 [M-H-2Br] ⁺ .

Bisnaftalimidopropildiaminododecano (BNIPDadod). LRMS (ESI): O cálculo para 2HBr 836.71[M]⁺, encontrado:

675.4[M-2H-2Br]⁺.

Bisnaftalimidopropildipropiltriamina (BNIPDpta). (85%)

DMSO-d₆, δ: 23.7'' (CH₂) , 21/7G (CH₂) , «// (N-CH₂) , WZC (N-CH₂) , 45,00 (N-CH₂) , 130 (carbonos aromáticos), 164,87 (C=O) . LRMS (FAB): O cálculo para R' 3HBr 850,7;

encontrado: 606,4 [M-2H-3Br]⁺.

Bisnaftalimidopropildietiltriamina (BNIPDeta). (67%) //-/.ò: 22,20 (CH₂) , 24,70 (CH₂) , /¾ (N-CH₂) , 44,20 (N-CH₂) , 45,00 (N-CH₂) , 130 (carbonos aromáticos). LRMS (FAB): 0 cálculo para 3HBr 578,2762 [M-2H-3Br]⁺, encontrado: 578,2760 [M-2H-3Br]⁺.

Exemplo 1: Síntese do BNIPDaoct

A diaminooctano foi dissolvida em piridina anidra seguida da adição de cloreto de mesitileno (2,1 molar em excesso). A solução resultante foi colocada a temperatura ambiente durante 4 horas. A remoção da piridina foi feita pela adição de água fria com formação de um precipitado, o qual foi filtrado e lavado com água. O produto bruto foi recristalizado com álcool absoluto.

Xxí : ._s._;...... ... > χ·- ·>.*·- .-s		S 2- (70%	) , -0 NMR	:'yv \'· ··;<· .A;J ;	6: 20,82
(CH₃,	Mts) ,	22,85	(CH₃, Mts)	, 26,34 (CH₂)	, 28,	70 (CH₂),
29,41	(CH₂)	, 41,05	(N-CH₂) ,	47,58 (CH₂) ,	133	(carbonos
aromáticos,	Mts) .

O anidrido naftálico (6,349, 0,032 mole) foi dissolvido em DMF (50ml) seguido da adição de 3-aminopropanol (2,45g, 0, 032 mole) e BDU (4,87g, 0, 032 mole). A solução foi deixada a agitar a 85 °C durante 4 horas. O solvente DMF foi removido sobre pressão reduzida e o resíduo resultante foi transformado em pó por agitação num banho agua refrigerado (200ml) até se formar um precipitado. Posteriormente foi filtrado utilizando um funil de Buchner e lavado com uma solução saturada de bicarbonato. O rendimento da reacção foi de 950. O composto obtido, naftalimidopropanol apresentou um grau de pureza suficiente para ser utilizado no passo seguinte sem posterior purificação. NMR (CDC13)ô:

8,65-7,80 (m, 6H, protões aromáticos),

4,39 (t, 2H, -N-CH₂),

3,69 (t,

2H, CH₂-O-),

3,20 (s, cheio, 1H, OH), 2,06 (p, 2H, CH₂) .

NMR

δ.= 161,70 (C=O),

74,90; 59,90; 30;90 (3χ CH₂) .

(carbonos aromáticos),

Naftalimidopropanol (5,10g, 20mmol) foi dissolvido em piridina anidra (80ml). A solução foi deixada a agitar a 4 °C durante 15 minutos. Cloreto de tosil (5,72g, 30mmol) foi adicionado gradualmente durante 30 minutos. A solução foi deixada a 4 durante a noite e transformado em pó por agitação num banho água refrigerado (200ml) para formar um sólido estável. O sólido formado foi filtrado e lavado continuamente com água. 0 produto bruto foi recristalizado com etanol e acetato de etilo para originar o O-tosil-6propilnaftalimida (53%).

NMR (CDC13): 6

6H, protões aromáticos),

4/35 (t, 2H,

2,25

S.'·

NMR (CDC1₃) :

161,30 (carbonos aromáticos),

73,1; 67,90;

8,70 (3 x CH₂) cálculo para

C12H19NO6S 425,09,

22,10 (CH₃) . LRMS (FAB): O encontrado: [426 MH]* .

A cadeia poliaminica mesitilada (0,651 mmol) foi dissolvida em DMF anidro (13,5 ml) seguida da adição 7x (0,13 mmol) e carbonato de césio (l,06g). A solução foi deixada a 85 °C e a complementação da reacção foi monitorizada por cromatografia em camada fina. 0 DMF foi removido por vácuo e o resíduo foi transformado em pó em banho de água refrigerado sendo o precipitado resultante filtrado e lavado continuamente com água. Após secagem, o produto bruto foi recristalizado do etanol e obtido um produto completamente purificado e protegido com alto rendimento (75-85%).

Os derivados poliaminicos (0,222 mmol) completamente protegidos foram dissolvidos em diclorometano anidro (lOml) seguido da adiçao de ácido bromidrico e ácido acético glacial ambiente durante 24h. O precipitado amarelo formado, foi filtrado e lavado com diclorometano, acetato de etilo e éter.

Desta forma foi sintetizado

Bisnaftalimidopropildiaminooctano (85%) DMSO44,72

131,21;

25, 66 (CH₂),

121,99; 127,13; 130,62;

134,31 (carbonos aromáticos), 163,61 (C=O). LRMS (FAB): O cálculo para

619,3282 [M-H-2Br]⁺.

£ 619,3279, encontrado:

BNIPDpta

A dipropiltriamina foi dissolvida em piridina anidra seguida da adiçao de cloreto de mesitileno (3,1 molar em excesso). A solução resultante foi colocada a temperatura ambiente durante 4 horas. A remoção da piridina foi feita pela adiçao de água fria com formaçao de um precipitado, o qual foi filtrado e lavado com água.

O produto bruto foi recristalizado com álcool absoluto.

7.·; 2 triamina 5- (CH₃,

43,11 (N-CH₂) , 132,17 (carbonos aromáticos, Mts),

139,98 (carbonos aromáticos, Mts).

O anidrido naftálico (6,349, 0,032

DMF (50ml) seguido da adiçao de

3-aminopropanol (2,459, deixada a agitar a 85 durante 4 horas. 0 solvente DMF foi removido sobre pressão reduzida e o resíduo resultante foi transformado em pó por agitação num banho agua refrigerado (200ml) até se formar um precipitado. Posteriormente foi filtrado utilizando um funil de Buchner e lavado com uma solução saturada de bicarbonato. 0 rendimento da reacção foi de 95%. 0 composto obtido, naftalimidopropanol apresentou um grau de pureza suficiente para ser utilizado no passo seguinte sem posterior

purificação. NMR	(CDC1₃)ô: = 8,65-	-7,80	(m,	6H,	protões
aromáticos), 4,39	(t, 2H, -N-CH₂),	3, 69	(t,	2H,	CH2-O-),
3,20 (s, cheio, 1H,	OH), 2,06 (p, 2H	, CH₂) .	-¹¾	NMR	(CDC1₃) :
Ô.= 161,70 (C=O) ,		(carbonos	aromáticos),
74/9 0 ; 59/90 ; 30; 90	(3x CH₂) -

Naftalimidopropanol (5,10g, 20mmol) foi dissolvido em piridina anidra (80ml). A solução foi deixada a agitar a 4 Ά durante 15 minutos. Cloreto de tosil (5,72g, 30mmol) foi adicionado gradualmente durante 30 minutos. A solução foi deixada a 4 °C durante a noite e transformado em pó por agitação num banho água refrigerado (200ml) para formar um sólido estável. O sólido formado foi filtrado e lavado continuamente com água. O produto bruto foi recristalizado com etanol e acetato de etilo para originar o O-tosil-6propilnaftalimida (53%). NMR (CDC13): δ = 8,65-7,80 (m,

6H, protões aromáticos), 4/45 (t, 2H, CH₂) , 4/35 (t, 2H, CH₂), 2,50 (s, 3H, CH₃), 2/25 (p, 2H, CH₂) . NMR (CDC1₃) :

δ.= 161,30 (C=O) , 5.4.5·» 1® (carbonos aromáticos),

3,1; 67,90; 28,70 (3 x CH₂) , 22/10 (CH₃) . LRMS (FAB): 0 cálculo para C12H19NO6S 425,09, encontrado: [426 MH]⁺ .

A poliamina mesitilada (2-6) (0,651 mmol) foi dissolvida em DMF anidro (13,5 ml) seguida da adição 7x (0,13 mmol) e carbonato de césio (l,06g). A solução foi deixada a 85 °C e a complementação da reacção foi monitorizada por cromatografia em camada fina. O DMF foi removido por vácuo e o resíduo foi transformado em pó em banho de água refrigerado sendo o precipitado resultante filtrado e lavado continuamente com água. Após secagem, o produto bruto foi recristalizado do etanol e obtido um produto completamente purificado e protegido com alto rendimento (75-85%) .

O derivado poliaminico (0,222 mmol) completamente protegidos foi dissolvidos em diclorometano anidro (lOml) seguido da adição de ácido bromidrico e ácido acético glacial (lml). A solução foi deixada a agitar a temperatura ambiente durante 24h. 0 precipitado amarelo formado, foi filtrado e lavado com diclorometano, acetato de etilo e éter.

Desta forma foi sintetizado o

Bisnaftalimidopropildipropiltriamina (BNIPDpta).

(85%) DMSO-dê, 6:

(CH₂) , 24,70 (CH₂), 44,10 (N-CH₂), 44,20 (N-CH₂) , 45,00 (NCH₂) , 130 (carbonos aromáticos), 164,87 (C=O) . LRMS (FAB):

O cálculo para

3HBr 850,7; encontrado: 606,4 [MBibliografia:

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Lisboa, 9 de Novembro de 2006

Claims

1. Composto de fórmula geral A, em que (a) representa o ponto de diversidade, caracterizado pelo facto de a cadeia alquílica de união dos dois anéis aromáticos variar em tamanho, entre 4 e 20 átomos de carbono e em número de átomos de azoto, entre 2 e

2. Compostos definidos na reivindicação

1, caracterizados pelo facto de serem:

1. Bisnaftalimidopropildiaminopentano - BNIPDapen (II)

2. Bisnaftalimidopropildiaminohexano - BNIPDahex (III)

3. Bisnaftalimidopropildiaminoheptano - BNIPDahep (IV)

4. Bisnaftalimidopropildiaminooctano - BNIPDaoct (V)

5. Bisnaftalimidopropildiaminononano - BNIPDanon (VI)

6. Bisnaftalimidopropildiaminodecano - BNIPDadec (VII)

7. Bisnaftalimidopropildiaminododecano- BNIPDadod (VIII)

8. Bisnaftalimidopropildipropiltriamina - BNIPDpta (IX)

9. Bisnaftalimidopropildietiltriamina - BNIPDeta (X)

3. Composição farmacêutica, útil no tratamento de doenças cancerígenas e parasitárias, nomeadamente no tratamento do cancro e no tratamento de tripanossomíases, leishmanioses e malária, caracterizada pelo facto de compreender como ingrediente activo um ou mais compostos de acordo com a reivindicação 1 e /ou 2.

4. Composição farmacêutica, caracterizada por conter um composto de fórmula geral A e seus derivados II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, em associação com um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

5— Composição farmacêutica, segundo reivindicações de 3 e

4, caracterizada por compreender igualmente um ou vários compostos utilizados para a prevenção e/ou tratamento de doenças ligadas a uma infecção por protozoários, tais como leishmanioses, tripanossomoses e malária.

6— Composição farmacêutica, segundo reivindicações de 3 a

5, caracterizada por os compostos utilizados para a prevenção e/ou tratamento de doenças ligadas a uma infecção por protozoários, tais como leishmanioses, tripanossomoses e malária, serem preferencialmente miltefosina, derivados antimoniais pentavalentes, alopurinol, anfotericina B, pentamidina e derivados, melarsoprol, benzinidazol, nifurtimox, ketoconazol, difluorometilornitina, cloroquina e derivados e quinino.

7. Composição farmacêutica, segundo revindicações 3 e 4, caracterizada por compreender igualmente um ou vários compostos utilizados para a prevenção e / ou tratamento de doenças cancerígenas, serem preferencialmente bleomicina, cisplatina, ciclofosfamida, citarabina, dactinomicina, doxorrubicina, ectoposideo, fluoruracilo, mecloroetamina,mercaptopurina, metotrexato, mitomicina, citrato de tamoxifeno, sulfato de vimblastina e sulfato de vincristina.

8. Utilização segundo as reivindicações

3 a 6, caracterizada por se destinar ao tratamento de doenças parasitárias, provocadas pelos parasitas do género Leishmania, incluindo as espécies, L.

infantum, L. donovani, L. major, L. trópica,

L. mexicana,

L. amazonensis braziliensis.

9 Utilização da segundo as reivindicações

6, caracterizada por se destinar ao tratamento de doenças parasitárias, provocadas pelos parasitas do género

Trypanosoma, incluindo as espécies,

T.

cruzi, T. brucei,

T.

gambiense.

da composição farmacêutica, segundo as reivindicações

6, caracterizada por se destinar ao tratamento de doenças parasitárias provocadas pelos parasitas do género Plasmodium, incluindo as espécies, P.

falciparum, P.

vivax, P. ovale.

11. Utilização da acordo com a reivindicação caracterizada por se destinar ao tratamento e / ou prevenção de doenças cancerígenas.