PT100152A

PT100152A - Utilizacao de factores estimuladores de colonias de granulocitos-macrofagos (fec-gm) e de factores estimuladores de colonias de granulocitos (fec-g) para promover a aceleracao da cicatrizacao de lesoes

Info

Publication number: PT100152A
Application number: PT100152A
Authority: PT
Inventors: Glenn Pierce; Bruce W Altrock
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 1991-02-22
Filing date: 1992-02-21
Publication date: 1993-05-31
Also published as: NO924073D0; FI924778A0; EP0526630A4; US6689351B1; FI924778A7; NO924073L; EP0526630A1; IL101028A0; AU1462392A; IE920560A1; WO1992014480A1; JPH05506673A; CA2081104A1; FI924778L

Description

"UTILIZAÇÃO DE FACTORSS ESTIMULADORES DE COL0MIAS DE C-RANULdC IT OS -MACE 0FAGOS (FEC-GE) E DE FAGTORSS ESTIMULADORES DE COLORIAS DE GRANULOCITOS (FEC-G) PARA PROMOVER A ACELERAÇÃO DA CICATRIZAÇÃO DE LESÕES" Âmbito da invenção A presente invenção refere-se genericamente a métodos que favorecem a cicatrização acelerada de ferimento em pacien tes que tenham sofrido lesões. Especificamente, a presente invénção descreve métodos que favorecem a cicatrização acelerada de ferimentos em pacientes q$e exibem diversos ferimentos,, utilizando os factores estimuladores de eolonias hematopoiéti-cas FEG-G e FEC-GM.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A. Ferimentos e cicatrização de ferimentos A pele humana é constituída por duas camadas distintas, a epiderme e a derme. Sob estas camadas situa-se o tecido sub cutâneo. A.s funções principais destes tecidos consistem em proporcionar protecção, sensação e termorregulação aos animais. Secundariamente, essas camadas protegem os orgãos internos do organismo contra choques ou traumas amortecendo os impactos provenientes de forças e objectos externos. A camada mais exterior da pele, isto é, a epiderme, Μ ι £ % \ \ possui uma espessura aproximada do-Ό,Ό^; mm, e a vascular, e constituída por quatro tipos de células (ceratinócitos, mela nécitos, células de Langerhans e células de Merkel) e ^ -encontra-se estratificada em diversas camadas celulares epi teliais /"Leeson et al., (1985) Textbook of Eistology, WB Saunders Go., Philadelphia J, A camada epitelial mais interior da epiderme é a membrana pavimentosa que se encontra em contacto directo com a derme e permite segurar a epiderme. Todas as divisões celulares epiteliais que ocorrem na pele são efectuadas na membrana pavimentosa. Após a divisão celular, as células epiteliais migram para a superfície exterior da epiderme. Durante esta migração, as células são submetidas a um processo conhecido pela designação de eeratinização no qual são perdidos os núcleos e as células se transformam em células mortas, fortes, resistentes e planas. A migração fi ca cofápleta quando as células atingem a estrutura epidermal externa, o extracto córneo, que é uma camada celular escamosa e seca e à prova de água, que auxilia a evitar a desseca çao do tecido subjacente. Esta camada de células epiteliais mortas é contlnuamente mudada e substituída por células cera tinizadas que se movem para a superfície. Uma vez que o epi télio epidermal é avaseulsr , a membrana pavimentosa é dependente da derme para o seu abastecimento em nutrientes. A derme é uma camada tecidular altamente vaisularizs da que fornece nutrientes a epiderme. Além disso, a derme possui terminais nervosos, tecido linfático, proteínas cola-genicas e tecido conjuntivo. A derme- possui uma espessura aproximada de 0,5 mm e é constituída por essencialmente por fSfcCQfelÃgteQS e Hiaerdfagos. Estes tipos de células são largamente responsáveis pela produção e pela manutenção do colagé neo que e a proteína existente no tecido conjuntivo de todos os animais e tambán na pele. 0 colagénió é essencialmente responsável pela natureza elástica ou resiliente da pele. 0 tecido subcutâneo existente por baixo da derme rica em cola-gáneo e responsável pela mobilidade da pele, pelo seu isola-lamento, pelo armazenamento de calorias e fornece sangue aos tecidos sobrejacentes.

Sempre que ocorre uma lesão de pele e/ou do tecido macio subjacente, tem início imediatamente, em organismos saú dáveis, um processo de reparação do ferimento resultante. Nos seres humanos, este processo não conduz à regeneração total do tegumento lesado a não ser no caso de a lesão se encontrar con finada à epiderme deixando Intacta a membrana pavimentosa /'Wokalek, H., (1988) CRC Criticai Rev/iews in Biocompatibilify, vol. if, edição 3: 209-^6 J. Em consequência, no caso de o ferimento se caracterizsr por uma lesão tecidular mais extensa, o tecido danificado, destruído ou perdido não será reconstituído com tecido idêntico e em vez disso será substituído por tecido de tipo escaras. Os ferimentos caracterizados por uma disrupção tecidular que penetre completamente através da epiderme e da derme são designados por "ferimentos a toda a espessura", ao passo que os ferimentos que apenas lesionam a epiderme mas não passaifi completamente através da derme são designados por "ferimentos de espessura parcial".

Os-meognismos das lesões em tecido macio podem ser divi didos em duas categorias gerais, designadamente de categoria mecânica e categoria térmica. As forças mecânicas são de três tipos: compressão, corte e tracção. A compressão, no caso de se aplicar força suficiente, esmaga os tecidos contactados e produz ferimentos graves, tais como os traumas originados por forças bruscas e as lesões provocadas por projécteis com armas de fogo. Os ferimentos provocados pelas forças de corte constituem o tipo mais vulgar de lesão por penetração da pele. As incisões, tanto de tipo cirúrgico como de tipo não cirúrgico, constituem exemplos de ferimentos produzidos por forças de corte. Uma vez que nesses casos apenas é transferi da para o tecido circundante uma pequena quantidade de energia, ocorre uma pequena desvitalização de tecido e normalmente a cicatrização não e complicada. Os ferimentos provocados por forças de tracção ocorrem quando a pele é arrancada da sua base subcutânea, quer completamente quer deixando uma aibà ligada pelo menos por uma aresta. A gravidade de um ferimento provo cado por forças de tracção depende da quantidade de sangue for necido à aba de pele rasgada e também das dimensões, da espessura e da proporção entre a largura da base dessa aba e o comprimento da referida aba.

As forças térmicas susceptíveis de produzirem ferimen tos englobam o frio, a condução, a convecção, a electricida-de e a irradiação. De uma forma geral, a gravidade das lesões de origem térmica depende da fonte, da temperatura, do tempo de exposição e da capacidade da pele para resistir a transferência de calor (Trott, A.; MAnn. Emer. Med."; vol. 17; 1988;?. 1879-83). A cicatrização de ferimentos é o processo segundo o qual se processe a reparação dos tecidos danificados. Os ferimentos caracterizados por fraca ou nenhuma perda de tecido -cicatrizam por um processo simples ou primário ao passo que os ferimentos nos quais ocorreu perda de tecido cicatrizam por um processo secundário. 0 processo de cicatrização de fe rimentos subdivide-se em três fases distintas, designadas por inflamação, formação de tecido de granulação e finalmente a formação e remodelação da matriz /^Ten Dijke et al., "Biotechnology", vol. 7? 1989; P. 793-98 J. A resposta inflamatória às lesões do tecido macio tem início imediatamente após a ocorrência da lesão desde que as arestas de tecido fiquem separadas e o sangue escorra para o ferimento activando 0 processo sequencial de coagulação que conduz à hemostase. Inicialmente existe uma fase curta de va-sodilatação nos tecidos da vizinhança do local do ferimento seguindo-se uma vesocorstrição. As plaquetas na ferida, as quais se agregam para formar o coágulo, libertam também diversos compostos vasoactivas, agentes químicos de atracção e fae tores de crescimento /Goslen, J. B.; "J. Dermatol. Surg. Onco.", vol. 9; 1988, P. 959-72,/. 0 próprio coágulo ê crí tico para a eventuairação do ferimento uma vez que a matriz de fibronectina provisional e utilizada pelos fibroblas-tos e pelas células epiteliais para ingressarem no ferimento. Por outro lado, e aumentada a permeabilidade capilar periferi ca em relação ao ferimento e, devido ao reduzido fluxo sanguí neo, os leucócitos polimorfonucleares (PMNs) aderem às paredes dos capilares e migram para o interior do ferimento tal como sucede com os monóeitos /Eckersley et al,, (1988) Brltish 6 6

í 9 Medicai Bulietin, vol. M+, NS 2: ^23-36 J.

Os PMNs? tais como os neutrofilos, constituem o tipo celular predominante existente inicialmente no ferimento. Os PMNs e os macrofagos iniciam 0 processo de limpeza da ferida. Este processo de limpeza e executado principslmente através do fenómeno da fagocitose do tecido desvitalizado e de outros resíduos, Decorridos 3 a 5 dias apos a ocorrência da lesão veri fica-se que os PMNs foram já amplamente substituídos por ma-crdfagos os quais continuam a remover o tecido morto e objec-tos estranhos. Em 1972, os investigadores Simpson e Eoss / "J. Clin. Invest,l!; vol. 51; P. 2009-23 J demonstraram que uma ausência quase total de PMNs no local dò ferimento não inibe a cicatrizsção desse ferimento. Todavia, a função dos macrdfagos na reparação de tecidos pode constituir um faetor crítico /'piegelmann et al.j "Plast. Reconstr, Surg.M; vol.68; 1981 j P. 107-113$ Em ferimentos monocitopénicos experimen^ tais, a formação de tecido de granulação, a fibroplasia e a disposição do colagéneo, encontram-se notavelmente dibilitados e a cicatrização é retardada /'Leibovich et al., (1975) Am. J. Path., vol. 78: 71-100; Mustoe et al., (1989) Am..J.,·Surgc^ . vpl. 158: 3*+5-50j Pierc et al., (I9S9) Proc. Nat. Acad. Sei. USA, vol. 86: 2229-33^· Babasse que os· macrdfagos Lexisten- tes nos ferimentos libertam uma diversidade de substâncias bio logicamente activas que servem como agentes químicos de atrac-ção para os mondeitos e para os flbroblastos, por exemplo, 0 faetor β do crescimento transformante (FjjCT) e 0 faetor de crescimento derivado das plaquetas (ÇCDP) /Rappollee et al., (1988) Science, vol. 2hl: 708-12; Pierce et al., supra: 2

Pierce st al., (1989) J. Cell Biol., vol. 109: k29-kQ Veja-se Obberghen-Schilling et al., (198$) J. Blol. Chem., vol. 328: 715-17; and Coffey et al., (1987) Nature, vol.328: 317-20. Os macrofagos activados digerem 0 colagéneo desvitalizado e o coágulo da fibrina. A dissolução do coágulo permi te a formação de tecido granuloso no local do ferimento, reali zando-se assim a segunda fase de cicatrização do ferimento. A formação de tecido de granulação começa §res ou qua tro dias a pés a ocorrência da lesão e continua a processar-se na ferida aberta até que tenha ocorrido a formação de novo epitélio. Bsta fase caracteriza-se pela proliferação de íi-broblastos e pela sua migração para 0 interior do local do fe rimento onde vão originar uma matriz extracelular, conhecida pela designação de substarsefe, pavimentosa, constituída por cola geneo, fibronectina e ácido ialurénieo, substituindo o coágulo digerido. 3sta matriz extracelular serve de plataforma de sustentação sobre a qual se as células endoteliais, os fibroblastos e os macrófagos. Também é utilizada pelos mio fibroblastos no sentido de promover 0 fecho do ferimento pelo processo da contracção da ferida em lesões de tipo "a toda a espessura” que cicatrizam pelo processo de cicatrização secun dário.

Os miofibroblastos são provenientes da diferenciação dos fibroblastos residentes imediatamente apos a ocorrência de uma lesão de tipo "a toda a espessura". Ssses miofibroblas tos alinham-se radialmente utilizando a matriz extracelular recentemente depositada e em associação com essa matriz, desis nada por fibronexo, contraem-se e promovem mais rapidamente o fecho da ferida / Singer et al.j "J. Cell Biol."; vol. 98; 198^5 2091-2106 /.

Para além do fecho da ferida, nesta fase de cicatri-zação do ferimento ocorre também a formação do novo epitélio. As células epiteliais proliferam na periferia do ferimento e migram através da substancia pavimentosa. As células epiteli ais apenas se podem mover sobre tecido vascular viável. A mi gração é interrompida pela inibição proporcionada pelo contaç to entre células epiteliais ss quais nesse momento se dividem e diferenciam para reconstituírem 0 epitélio /Hunt et al., (1979) Fundamentais of wound management , Appleton-Century--Crofts J. λ medida que se processa a formação de tecido granular, ocorre também a angiogénese, isto é, a formação de novos vasos sanguíneos produzidos pela divisão e migração das células endoteliais como resultado das condições hipdxicas existentes no ferimento. Knighton e seus colaboradores / "Science"; vol. 221; 1983; P. 1283-85 7 demonstraram que os macrófa gos, em condições hipóxicss, estimulam a angiogénese. 0 resul tante aumento de vascularização aumenta o fluxo sanguíneo e a oxigenação do ferimento. Eventualmente, s medida que progride a cicatrização do ferimento na fase de formação e remodelação da matriz, a maior parte desta vasculatura recentemente formada regride deixando escaras relativamente avasculares. A remodelação do colagéneo e da matriz começa simultaneamente com o início da formação do tecido granular e mantem--se durante muito tempo apés 0 ferimento ter sido coberto pelo novo epitélio e pode prolongar-se durante mais de um ano. 2

Esta fase final de cicatrização de ferimentos ea^acteriza-se por uma desvascularização e pela substituição do tecido e ee lulas granulares por uma matriz constituída essencialmente por colagóneo de tipo I. Este novo tecido relativamente acelular e avascular representa a escara. A formação de escacas serve fundamentalmente, para restabelecer a resistência à trscção do tecido lesionado. Contudo, a escara não possui mais do que 80 % do valor da resistência à tracção que o tecido tinha antes de ter sido lesionado.

Existem muitos factores que podem afectar prejudicial mente o processo de cicatrização de ferimentos, incluindo a presença de resíduos neeroticos, corpos estranhos, medicação e idade, saúde e estado nutricional do indivíduo lesionado.. Por outro lado, qualquer processo que impeça a circulação san guínea periférica tal como a arteriosclerose, pressão prolon gada, doenças venosas de tipo >varicose e estase venosa, podem afectar prejudieislmente o fornecimento de oxigénio, nutrientes, estímulos químicos e tipos celulares adequados para procederem a mediação da cicatrização num paciente lesionado, irá originar dificuldades no processo de cicatrização do feri mento.

Os resíduos necrótieos e os corpos estranhos são geralmente removidos numa fase precoce do processo de cicatrizs, ção, inicialmente por lavagem do ferimento para remoção dos contaminantes macroscópicos e depois pelos Pffls e macrófa-gos endógenos que removem os resíduos microscópicos remanescentes .

Os factores que inibem a formação de resíduos ceJLula- 10 10 .¾ f res strasem, a cicstrizaçao do ferimento. Esses factores englo bam a dessecação do ferimento, a medicação, eventualmente por aplicação de agentes quimioterapêuticos ou esterdides, e ainda o estado precário de saúde e/ou nutrição do paciente. 0 estado físico do paciente também é importante no pro cesso de cicatrização de um ferimento. À medida que a idade aumenta, diminui s capacidade de reparação dos tecidos lesiona dos na medida em que a pele se torna mais fina e diminui o número de fibroblastos e a quantidade de colagéneó total existen te na pele /‘Shuster et al., (1975), Br. J. Dermatol., vol. 93: 639-43 J7· Os estados de doença tais como o alcoolismo, a anemia, os biabetes, a desnutrição, choques e ureia contribuem para diminuir o fornecirilenté de oxigénio e de nutrientes ao lo cal do ferimento, inibindo consequentemente o processo de cica. trização. Além disso, as doenças que contribuem para a monoci topenia podem piorar significativamente o processo de cicatrização de um ferimento.

Os medicamentos utilizados para tratar determinadas do enças podem originar uma deterioração do processo de cicatriza ção de um ferimento. As técnicas de quimioterapia utilizadas para eliminar a divisão celular em pacientes cancerosos suprime também a capacidade desses pacientes para cicatrizarem os seus ferimentos uma vez que este processo depende do crescimen to de novas células. Os esterdides têm um impacto negativo nas tres fases do processo de reparação de ferimentos, inibindo a resposta inflamatória inicial, retardando a produção de novo epitélio e de tecido vascular e enfraquecendo a matriz de colagéneo no tecido constituído pelas escaras f*Bryant, B. (1987) J. Enterostomal Therapy, vol. 14, N9 6: 262-66]. A infecção bacteriana dos ferimentos é a causa local mais vulgar para um prolongado processo de cicatrização dos fe rimentos. A pele humana é tipicamente colonizada por numerosos microrganismos incluindo Candida albicans, Staphilococcus epidermidis, Staphilococcus aureus e também algumas estirpes de Streptococcus. Desta forma qualquer lesão que exponha os tecidos subjacentes à acção do meio ambiente fica infectada p^ lo menos com a flora microbiana residente. Os ferimentos que são bem cuidados e ocorrem em tecidos altamente vascularizados resistem âs infecções ao passo que os ferimentos que ocorrem em tecidos esquémicos são muito mais susceptíveis de serem infectados . 0 fluxo sanguíneo e o fornecimento de oxigénio são requisitos necessários para aniquilação das células bacterianas proporcionada pelos leucócitos. Os leucócitos que realizam a fagocitose sobre as bactérias implicam um aumento de dez a vin te vezes no consumo de oxigénio. 0 oxigénio molecular atmosférico é utilizado no metabolismo oxidativo e também para produzir iões de superóxido e ainda peróxido de hidrogénio (H2O2) sendo todos estes produtos utilizados para aniquilar as bactérias internalizadas [Hunt, T.; Annais of Emergency Medicyne"5 vol. 17; 1983; P. 1265-73]. As lesões que possuem uma certa perfusão de oxigénio sub-óptima são muito menos capazes de rejeitar os micróbios contaminantes e por essa razão constituem um risco superior para o desenvolvimento de uma infecção.

Existem outros factores que participam numa infecção bacteriana tais como a administração medicamentosa e o estado físico do paciente que podem originar a nao cicatrizaçao de fe rimentos. Algumas lesões de tipo "a toda a espessura" ou de íápo "de espessura parcial" tais como queimaduras, enxertos de pele e diversos tipos de úlceras resistem à reparaçãooe pro duzem dores significativas e algum desconforto para o indivíduo lesionado. B. Factores estimuladores das coldnias 0 sistema hematopoidtico humano (formador do sangue) substitui uma diversidade grande de glábú&asssanguíneos brancos (incluindo os neutrdíilos, os macrdfagos e os basofilos/mes tdcitos), os gldbulos sanguíneos vermelhos (sritrdcitos) e as cdlulas formadoras de coágulo (megacaridfcitos/plaquetas). Determinou-se que o sistema hematopoidtico dos homens no senti do estrito do termo produz cerca de V,5 x 1011 granuldcitos e eritrdcitos em cada ano, o que e sensivelmente equivalente à substituição anual da massa corporal total /“Dexter et al.$ "BioEssays; vol. 2; 1985? P·

Os factores estimuladores das coldnias (FEC) são gli-coproteínas semelhantes a hormonas que regulam a hematopoiese e são necessários para o desenvolvimento clonal e para a maturação das cdlulas precursoras hematopoieticas normais existentes na medula dssea. Estes factores são produzidos por diversos tecidos. Fòfcgfi identificados quatro FEC isolados a partir de fontes humanas: factor estimulador das coldnias de granuldcitos (FSC-G) /'Welte et al.j "Proc. Nat. Acad. Sei."; USA, vol. 82; 1985} P. 1526-30./; factor estimulador das coldnias de granuldcitos-macrofagos (FEC-GMj fCantrell et al. j "Proc. Nat. Acad. Sei.»; USA; vol. 82; 1985; P. 6250-5^/5 fac tor estimulador das colonias de mecréfagos (FSC-M); e factor estimulador de colonias múltiplas (FEC múltiplas), também designado por interleucina-3 /'Nicola et al., (158½) Proc. Nat. Acad. Sei., USA, vol. 8l: 3765-69«/, contribuindo cada um desses factores para a diferenciação dos tipos celulares progenitores imaturos particulares originando células maduras. Além disso, estes factores também são necessários para a manutenção^ dos tipos celulares maduros. Em expêriencias efectuadas in vi-tro. verificou-se que p remoção do FEC adequado de uma cultura origina a rapida degeneração das células hematopoiéticas ter minalmente diferenciadas que dependem desse FEC .

Sabe-se que 0 FEC-G estimula a produção de colonias de granulocitos predominantemente neutrofilas quando utilizado ir. •vitro no ensaio correspondente st unidade formadora de ccld-niss-gs?anuldcitos/maca?dfagos. Também foram descritas outras actividades dos FEC-G. Actuslmente os FEC-G estão a ser estudados para utilização no tratamento do cancro não so como agentes' quiirioterapêuticos por si próprios mas também como com postos capazes de reduzir a toxicidade de outros regimes de tra tamento quimioterapluticos.

Outro factor estimulador de colónias terapeuticamente importante é o FSC-GM. Este polipéptido é necessário permanen temente para a proliferação in vitro de células progenitoras macrofagas e granulocíticas. Também controla 0 envolvimento irrevsrsô^vel desses progenitores na formação de granuldcitos e de macrofagos. Como exemplos de outras actividades biológicas refere-se s regulação da setividade funcional dos tipos das ce lulas iça duras et al.; "Nature"; vol. 309; 198^ j P. 763-67 J e 0 aumento da quimiotaxia no sentido do reconhecimento dos agentes químicos de atracção, /'Hematology Ml ed., 1990, Williams et al., eds. J7. Embora 0 FEG-GP: actue na mes. ma linhagem celular progenitora em que actua 0 FEC-G, também estimula a produção de monécitos e por essa rasão pode ser util no tratamentõ de doenças monocíticas tais como a monocitopenia.

Para conhecimento dos processos que descrerem a produção de FEC-G recombinantes (FKC-Gr), veja-se a patente de invenção' norte-americana H2 M810ÓM3 cpjo conteddo aqui se incor pora por referência. Os procedimentos para a produção de FEC-GM humanos recombinantes foram descritos por Burgess e seus colaboradores f"Blood"; 69, (1); 1987; P. ^3-51-7· A utiliração terapêutica destas proteínas recombinantes implica actuaImente s administração pòr via psrentérica na medi da em que o estado dé doença que se pretende tratar é de tipo sistémico ou afecta algum tecido ou orgão interno que não se encontra exposto. Quando se administra o FSC-GK a pacientes através de uma veia periférica há lugar à ocorrência de flebite. Por esse motivo 0 mecanismo de fornecimento preferido con siste em utilisar um catéter venoso central. Deseobriu-se que injecções diárias subcutâneas desta citoquina são tão eficases para proporcionar a resposta desejada como a administração intravenosa /Rematology. Mã ed., supra J. As dosas-de:=B3C-GM acima de 32 ^gAg de massa corporal/dia, fornecidas por qualquer vis, não são bem toleradas devido a reacções inflamatórias e devido a sua toxicidade pulmonar. Doses inferiores de Α5

FEC-GM sao geralmente bem toleradas mas ocorrem ligeiros efei. tos secundários tais como dores dorsais, mialgias, calefrios, náuseas, rubor facial e febre.

Por outro lado, o FEC-G produz uma neutrofilia significativa sem que haja quaisquer efeitos secundários apreciáveis, excepto no que diz respeito ao efeito secundário de dores dsseas _--par.a r valores correspondentes à dose limite, admitindo-se que tal fenómeno seja devido à expansão das celu las granuloeíticas da medula óssea. A dose máxima que ê possí, vel administrar por injecção ou por cateter venoso sem qye ocorra este efeito adverso e da ordem de ÓO jug/kg de massa cor poral/dia.

Para serem utilizadas como agentes terapêuticos e admi nistradas por via parentárica, as proteínas recombinantes de tipo FEC-G e FEC-GM são formuladas geralmente em preparações farmaeeuticamente aceitáveis antes de serem administradas aos pacientes. Essas formulações implicam normalmente a preparação de suspensões da substância biologicamente activa em solu ção aquosa tampão isotdnica ajustada para valores fisiológicos de pH. A administração parentárica dos polipáptidos tal como agora descrito permite a estimulação e a proliferação dos tipos celulares implicados na cicatrização de ferimentos e por esse facto pode constituir um tratamento adequado nessas situações. C. Métodos actuais de promover a cicatrização de ·*****»-* mm m ,ΐ'·«Ί—é— ii· i— —li— m—————r—h— »WU. ·ι — , ferimentos

Com exclusão de infecções ou de outras complicações, 16 o processo normal de cicatrização de ferimento origina fre-quentemente a restauração completa da função tecidular. Em termos clássicos, a profissão médica limitou-se a fazer os possíveis para promover a cicatrização dos ferimentos. No passado, essas actividades limitavam-se ã limpeza e à remoção de resíduos no ferimento inicial, suturação do ferimento e eventual enxerto de pele quando apropriado, revestimento do ferimento para evitar a dessecação e a infecção e aplicação de antibióticos, tanto local como sistemicamente, para reduzir o risco de infecção. Este tipo de tratamento foi concebido para proporcionar condições óptimas que facilitassem o t processo de cicatrização natural.

Verificou-se entretanto que diversos factores de cres cimento recombinantes podiam acelerar o processo de cicatrização de ferimentos, tanto em lesões agudas como em lesões ; ©irónicas, em modelos de animais. Estes factores recombinantes derivados englobam o factor de crescimento derivados das plaquetas (FCDP), o factor de crescimento epidermal (FGE) e os factores 0( ββ do crescimento transformante (leíCT e ύ'βΟΐ). Além disso, existem outros factores de crescimento recombinantes incluindo a insulina, os factores de crescimento insulíni-cos I e II (FCI-I e FCI-II, respectivamente), os interferões (IFN), as interleucinas (IL), o factor de crescimento eerati-nocítico (FCC), o factor estimulador das colónias de macrófagos (FEC-M), o factor de crescimento celular endotelial derivado das plaquetas (FCCE-D?) e o factor dos hemocitoblastos (FHC), os quais podem promover a activação, a proliferação e/ou s es timulação dos tipos celulares implicado’© no processo da cica- 12 trização de ferimentos. 0 FCE é um factor de crescimento polipeptídico (a sua forma matura processada possui 53 aminoácidos de compri mento /"Gray et al..; "Nature."; vol. 303; 1903} P. 722-25J). Nos seres humanos, esta proteína inibe a secreção do ácido gás, trico ao passo que o FCE dos murinos e mitogenico para diver sos tipos celulares, incluindo as células endoteliais, epite-liais e fibroblásticas /"Nalcagav/a et al.; "Differantiation"; vol. 29; 1985; P. 28k-88 J. 0 FCF e constituído por uma família de proteínas de cadeia linear com dimensões variáveis entre l*f e 18 KD as quais ligam firmemente a poderosa heparina anticoagulante. Há conhecimento relatado sobre dois tipos de FCF , o tipo ácido e o tipo alcalino. A forma alcalina constituída por 1^-6 amino ácidos (FCFb) é mais estável e dez vezes mais poderosa no que diz respeito à estimulação das células da mesoderme tais como os fibroblastos, as células endoteliais e os ceratindcitos, do que o FCF ácido (FCFa). /Veja-se Esch e colaboradores; »Proc. Nat. Acad. Sei.»; USA, vol. 85; 1985; P. 6507-H /. A insulina é uma hormona proteica segregada pelas célu las dos ilhéus pancreáticos. Essa hormona é segregada em resposta a elevados níveis sanguíneos de glicose, aminoácidos, ácidos gordos e corpos cetonicos, promovendo a eficiência do seu armazenamento e da sua utilização como combustível celular, modelando o transporte de metabolitos e de iões através das membranas celulares e regulando diivears^s percursos de biossín- tese intercelular. A insulina promove a entrada nas células de glicose, ácidos gordos e aminoácidos. Além disso, promove 18

também a síntese do glicogéneo, de proteínas e de lipidos, ao mesmo tempo que inibe a glucogénese, a degradação do glicogéneo , e catabolismo proteico e a lipolise. A insulina é cons-' t .fbituída por duas sub-unidades p( e β ligadas por duas pontes dissulfureto .

As proteínas FCI-I e FGI-II são membros de umaffamí-lia dependente da hormona do crescimento constituindo mediadores dos efeitos das hormonas do crescimento. Sabe-se que estas proteínas são importantes na regulação do crescimento do esqueleto. Qualquer dessas moléculas possui uma homologia estrutural próxima da insulina e possui actividades biológicas ;id|n&.i§&s. A molécula de FGI-I partilha *+3 % da homologia da sequência de aminoacidos com a pró-insulina, ao passo que a molécula FCI-II partilha 60 % de homologia com a molécula do FGI-I. As moléculas dos FCI constituem de alguma forma estruturas rônicas quando comparadas com outras proteínas agora descritas, pelo facto de não existir essencialmente nenhuma espécie de FCI livre e detectavel presente no plasma sanguíneo dos mamíferos. Em vez disso, as molébulas FCI estão ligadas a proteínas do plasma veiculares específicas de elevado peso molecular £ Ooi et al., (1988) J. Endocr., vol. 118; 7-18 J. Qualquer das espécies de FCI estimula a síntese do ADN , do ARN e das proteínas, estandó implicados na proliferação, diferenciação e quimiotaxia de alguns tipos de células. Sabe-se que a administração local de FCI-I permite estimular a regeneração dos nervos periféricos. Além disso, quando se administra FCI-I e FCDP , topicamente a ferimentos de suínos consegue-se um efeito sinergico no sentido de promover urna cicatrizagão mfiisreficaz do que nos ciiqb em que se administra qualquer desses factores isoladamente /*Skoffner et al., (1988) Acta. Paediatr. Scand. (Suppl), vol. 3^-7: 110-121.

Os interferões foram inicialmente identificados como proteínas que faziam com que as células se tornassem resisten tes a infecções devidas a uma ampla variedade de vírus. Foram identificados três tipos de interferões, designadamente os IFN-¢(, IFN-β e IFN-7Γ os quais são produzidos pelas células activadas T e NK. (aniquiladoras naturais). 0 interferão IFN-(tf é constituído por uma família de cerca de 15 proteínas estreitamente afins ao passo que os interferões IFN- e IFN-^f existem como espécies únicas. Por outro lado, existe um interferão IFN-(tf de consenso sintético concebido para in corporar regiões de características comuns entre todos os sub--tipos de interferões IFN-(tf conhecidos, o qual se encontra descrito na patente de invenção norte-americana NQ 4-897^71 cujo conteúdo se considera aqui incorporado por referência. Todos os interferões (IFN) são moléculas inibidoras do crescimento que desempenham uma função importante na cascata da linfo-quina. Qualquer dessas moléculas exerce uma ampla variedade de acções reguladoras nas células normais, em células cancerosas e em células de defesa do sistema imune do hospedeiro. Gomo actividades dos interferões IFN-^ refere-se a activação dos macréfagos para aumentar a fagocitose e para melhorar a capaci dade de aniquilar tumores. Actualment^ essas proteínas são utilizadas principalmente na terapia do cancro /"Balkhill et 20

al.; " Lancet”; 1987; P. 317-18 Λ

As interleucinas (IL) constituem uma família de poli péptidos que desempenha uma função principal na resposta imu ne corporal. Esses polipéptidos são produzidos por diversos tipos de células, particularmente pelas células T , em resposta a um estímulo antigénico ou mitogénico. A interleu-cina IL-Í é produzida apos o reconhecimento de um antigeno estranho. Para além de servir como mediador da resposta imune, a interleucina IL-1 está implicada na resposta inflamatéria a flama infectao aguda. A interleucina IL-I activa as células B e as células T . Induz também a síntese da interleucina IL-2 . Desempenha a função de cofactor na proliferação e na diferenciação das células B . Permite aumentar a toxicidade das células T e das células NK . A interleucina IL-1 melhora também a respostas dos progenitores da medula éssea a diversos factores estimuladores de colénias (FEC). Nos casos de inflamação, a interleucina IL-1 provoca a libertação de granulécitos de medula dssea, serve como agente químico de atracção das células polimononucleares, estimula a proliferação de fibroblastos e desempenha uma função na libertação de colagenese.....f Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs,

Copsey and Delnatt, Stockton Press, 1988 J. A síntese das T proporcionada pela interleucina IL-2 é induzida pela interleucina IL-1 . A interleucina IL-2 é um factor de crescimento das células B e das células T. lí também um sinal de activação de crescimento das células NK, estimulando-as a tornarem-se células aniquiladoras activadas pela linfoquina (LAK), altamente citotéxicas. A interleucina

IIr-2 regula também a actividade dos macrdfagos, promovendo a sua citotoxicidade / Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs, supra 7. Ã interleucina IL-3 , também designada por FEC-mdltiplas, sintetizada por linfocitos T induzidos por antigéneos ou por mitogéneos, está associada ao crescimento e a diferenciação dos progenitores hematopoiéticos £ 0'Garra$ ,1 (1990) "Lancet"; vol. 1; 1003-1005 Em experiências in vitro verificou-se que a interleucina IL-^f e essencial para 0 desen volvimento do tecido das mucosas e do tecido conjuntivo. Esta interleucina aumenta também a actividade tumoricida e a capaci dade dos macrdfagos para enfrentarem os antigeneos. A interleuv cina ΙΙι·Λ interactua sinergicamente com os FEC sobre diver sas linhagens celulares hematopoiéticas não diferenciadas.

Alem disso, activa as células B em repouso £ 0'Garra, supra The Atlas of Science, Kishimoto, ISI, 1988 J. Por outro lado, a interleucina IL-*+ desregula a função imune dos mondcitos inibindo a actividade dos mondcitos e dos macrdfagos e suprimindo a produção da interleucina IL-8 nos mondcitos estimula, dos /'Standiford et al., (1990) J. Immunol., vol. 1^-5, 5: 1^35-39 J.

Apds 0 estímulo antigénico, a interleucina IL-5 induz 0 crescimento e a diferenciação das células B proporcionando células segregadoras de imunoglobulina £ 0' Garra, supra,? Esta interleucina estimula também a proliferação, a diferenciação e a activação dos eosinofilos £Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs, supra J. A interleucina IL-6, produzida pelos fibroblastos, pelas células endoteliais e pelos mondei tos, para além. de actuar sobre as células T , induz também a 22 a.“Λ * diferenciação terminal das células B activadas proporcionando células produtoras de anticorpos. Adicionalmente, activa os progenitores hematopoiéticos permitindo-lhes responder à inter-leucina IL-3 / Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs, supra; The Atlas of Science, supra,J, A interleucina IL-7 induz in vitro a proliferarão de células B e de timdcitos f OOarra, supra /. A interleucina IL-8 é expressada . ' . tap.to nos tipos de células imunes como nas células não imunes. Nos monocitos estimulados, a expressão da interleucina IL-8 é suprimida pela interleucina IL-^f, ao passo que a expressão nos fibroblastos e nas células endoteliais previamente activadas pelo factor de necrose tumoral (FNT) ou pela interleu cina IL-1 não é suprimida pela interleucina IL-Λ. Salienta--se 0 facto de se desconhecer quais os factores in vivo mediadores da migração dos neutréfilos, mas admite-se'? que a interleucina IL-8, que possui uma poderosa acção activadora dos neu-trdfilos e possui também actividades quimiotacticas, pode mediar in vivo a acumulação de neutréfilos /Standiford et al., (1990) Biochem. and Biophys. Res. Comm., vol. 171, NS 2; 531“3^ 2* A interleucina expressada em algumas linhas de células T e pelos linfdcitos do sangue periférico estimulados pelos mitogéneos /Yang et al., (1989) Blood, vol. 7k, 6: 1880-8½^ A interleucina IL-9 melhora a proliferação dos mastécitos e estimula também a produção de interleucina IL-6 nos mastdei-tos derivados da medula éssea fUltner et al., (1990) Exp. Hematol., vol. 18: 873-77 2·· Recentemente descoberta nos mur ganhos, a interleucina IL-10 também designada por factor ini- bidor da síntese da citoquina dos murganhos (FISG) inibe a pro- dução de citoquina em populações de células T não humorais estimuladas /Moore et al., (1990) Science, vol. 2^8: 1230-3^ /. A molécula FGC é um mitogeno específico das células epiteliais segregado pelos fibroblastos de estremas normais. Em experiências efectuadas in vitro. ficou demonstrai do que essa molécula era tão poderosa como a ràolécula do FCE para estimular a proliferação dos ceratinécitos humanos /Marchese et al., (1990) J. Cell Physiol., vol. 1M+ NS 2: 326-32 /. A molécula do FEC-M , também conhecida pela designação de FEC-1, é um factor estimulador de colénias homodiméri cas que actua apenas sobre os progenitores dos macrdfagos. Esta proteína específica de uma linhagem de macrdfagos é pro duzida constitutivamente in vitro pelos fibroblastos e pelas linhas celulares estromais. Em experiências efectuadas in vivo. ao contrario de outras moléculas de FEC , atendendo a que o FEC-M surge logo no início da embriogénese, admite-se que este polipéptido desempenhe uma função potencial de desenvolvimento /Ds&amarter, J., (1988) Biochemical Pharmacology, vol. 37, NQ 16: 3057-62 /. A molécula do FCCE-DP é um mitogeno celular endote-lial derivado das plaquetas-e que possui um peso molecular de aproximadamente *+5 KD. Contrariamente à família dos FCF dos mitogenos celulares endoteliais, a molécula do FCCE-DP não se liga a heparina nem induz a proliferação de fibroblastos. Contudo, o FCCE-DP estimula realmente o crescimento celular endotelial e a quimiotaxia in vitro e a angiogénese in vivo 2k / Ishikawa et al., (19Ôy) Nature, vol. 338: 557-61/. A molécula de FCDP constitui um poderoso estimulador dos tipos celulares do mesenquima, tais como os fibroblastos e as células do músculo liso, mas não estimula o crescimento de células epiteliais /*Rose et al., (1986) Cell, vol. kj: 155“^9/· Para fracos valores de concentração, o FCDP actua como agente químico de atracção para os fibroblastos e também como agente químico de atracção e como sinal activador para os monocitos e para os neutrdfilos /Deuel et al., (1982) J. Clin. Invest., vol. 69: 10^6-1+9 J· A molécula do FHC recombinante representa um novo faç, tor de crescimento celular que estimula o crescimento das células progenitoras hematopoiéticas na sua fase inicial) os homo-citoblastos neurais e os monocitoblastos germinativos primordiais / PCT/US90/055^8? depositada 09/28/90 J. A molécula do FHC exibe poderosas sctividades sinérgicas em conjunto com factores estimuladores de colénias, originando um número acrescido de colénias e também colénias de maiores dimensões /Martin et al. ; "Cell"; vol. 63; 1990? P. 203-11 /. Deste modo, a admi nistração de FHC aos mamíferos de doses farmacológicas, isoladamente ou em combinação com outros factores estimuladores de colénias ou com outros factores de crescimento hematopoiéticos, pode proporcionar a melhoria das células danificadas em diversos sistemas de órgãos divergentes.

As moléculas dos FdfcT e F|JCT actuam sinergicamente no sentido de induzirem 0 crescimento independente da fixação em algumas linhas celulares cancerosas. Os compostos F^CT cons tituem unia classe de proteínas homodiméricas ligadas por uçia ligação de dissulfuretc^ sendo cada uma delas constituída por 112 aminoáeidos / Sporn et al., (1987) J. Cell Biol:;, vol.105: 1039-^5 -Λ 3sta proteína dimérica produz muitos efeitos biold gicos, tais como a mitogénese, a inibição do crescimento e a indução da diferenciação consoante o ensaio utilizado. A molécula F^JlCT representa o composto de tipo n CT mais estudado no que diz respeito à. cicatrização de ferimentos /*Ten Dijke, supra J. Considerado como uma classe, o F/9 CT consti tui um poderoso agente químico de atracção de monócitos e de fibroblastos.

Uma vez que qualquer factor de crescimento recombinan-te anteriormente referido pode eventualmente actuar como mito-geno, Inibidor ou agente químico de atracção para os diversos tipos de células fortemente implicadas no processo de cicatri zaçao de fermentos, isto é, mondcitos/macrdfagos , neutrófilos, fibroblastos e células endoteliais e epiteliais, têm sido inten samente estudados em modelos de cicatrização de ferimentos em animais. Descobriu-se que o factor de crescimento mais estuda do em relação a cicatrização de ferimentos, a molécula de FEC, acelera a cicatrização de ferimentos e queimaduras superficiais quando aplicada repetidamente sobre o local do ferimento. As moléculas de FCDP e F^CT aumentam a velocidade de cicatriza-çao dos ferimentos provocados por incisões quando administrados uma ao local da incisão imediatamente após ter sido provo cada a lesão. Todavia, na literatura existente não ha qualquer descrição sobre a utilização de outros factores tais como os factores estimuladores das colónias hematopoiéticas.

Deste modo, constitui 0 ob^ectivo da presente invenção 26

% proporcionar um método pare acelerar o processo da cicatriza ção de ferimentos. Faz-se observar que em relação aos ferimentos que cicatrizam pelo processo normal, o método descrito permite acelerar esse processo. No que diz respeito aos ferimentos que tipicamente resistem à cicatrização, o método descrito agora permite conseguir também a cicatrização desses ferimentos. 0 método da presente invenção permite reduzir o tempo necessário pera a reparação da lesão e por esse motivo reduzirá consequentemente o tempo de sofrimento que têm que suportar os pacientes lesionados à medida que os seus ferimen tos cicatrizarão.

SUMáBIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um método para promo ver a cicatrização acelerada de ferimentos em pacientes lesio nados, administrando-lhes uma quantidade terapeutieamente efi caz de FEC-G recombinante ou de FEC-GM recombinante na zona da lesão. Isto pode ser conseguido incorporando o agente terapêutico em. diversas substancias incluindo: cremes à base de colagéneo, películas, microcapsulas ou pos; ácido hialurénico ou outras preparações derivadas de glicosaminoglicano; cremes, espumas, materiais de sutura; e substâncias para a cobertura de ferimentos. Em alternativa, o agente terapêutico pode ser incorporado em uma solução farmaceuticamente aceitável concebida para administração tépica. Por outro lado, o agente terapêutico também pode ser formulado para administração paren-térica.

Os métodos da presente invenção são eficazes para acg £Ζ

lerar a cicatrização de ferimentos no caso das lesões provocadas por incisão, compressão, efeito térmico, e ainda no ca. , so de lesões agudas, crónicas, infectadas e de tipo estéril.

Adicionalmente o FEC-G recombinante pode ser incor porado em uma mistura que contenha pelo menos uma das seguin tes proteínas: FEC, FCE, FEC-GM, FCI-I, FÇI-II, insulina, um interferão, uma interleucina, FCC, FEC-M, FCCE-DP, FGDP, FHC, Fo(CT e F|?CT. De modo idêntico, o FEC-GM também pode ser incorporado em uma mistura que contenha, pelo menos uma das seguintes proteínas recombinantes: FEC, FCF, FEC-G, FCI-I, FCI-II, insulina, um interferão, uma interleucina, FCC, FEC-M, FCCE-DP, FCDP, FH, F^CT e Fj>CT. Estas misturas também são eficazes para promover a cicatrização acelerada de ferimen tos em pacientes lesionados.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A figura 1 representa à resistência à rotura de ferimentos provocados por incisão tratados com 2 pg de FEC-CM recombinante comparetivamente com a resistência à rotura de ferimentos semelhantes que cicatrizaram naturalmente. A figura 2 representa a resistência a rotura decorridos 7 9 llf dias após o ferimento provocado por incisão e tratado topicamente com 30 pg de FEC-GM. A figura 3 representa o regime de fecho de lesões infectadas cronicamente granulares não tratadas e também tratadas com FEC-GM recombinante.

Existem numerosos aspectos e vantagens da presente invenção que se tornam evidentes para os especialistas na maté- 28 ráa?após consideração da memória descritiva pormenorizada seguinte, a qual proporciona uma perspectiva para a prática da? presente invenção nas suas variantes preferenciais.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA

Uma vez que as lesões típicas são localizadas, os tipos de células necessárias para efectuar a reparação da lesão devem ser concentradas no local e na vizinhança da zona lesio nada. Deste modo, e preferível que os factores necessários para a promoção da actividade cicatrizadora do ferimento desses tipos de células estejam presentes na área atingida. A aplicação tópica dos polipéptidos constitui a forma mais eficiente de alcançar esses objectivos. A presente invenção baseia-se no facto de se ter descoberto que o FSC-GM recombinante pode acelerar o processo de cicatrizapo de ferimentos de todos os tipos, particularmente quando administrado por via tópica, isto e, quando apli cado sobre a superfície do local da lesão. A administração de FEC-GM recombinante também e eficaz para promover o processo de cicatrização de ferimentos, particularmente quando e administrado aos ferimentos infectados por via tópica. Quando o FSC-GM ou o FEC-G são administrados dessa forma, todos os tipos de ferimentos, de origem mecânica ou térmica, agudos ou crónicos, infectados ou estéreis, cicatrizam mais rapidamente do que os ferimentos semelhantes em processo de cicatrização natural ou que são tratados pelos métodos aetual mente disponíveis. Todavia, conforme referido antes, a presente invenção proporciona também a administração parentéri- 29 ca de polipéptidos que desempenhem uma função no processo de cicatrização de ferimentos. 0 processo de cicatrização de ferimentos implica a fo_r mação de tecido conjuntivo subjacente . e- formação de novo epitélio após a lesão. Recorreu-se a um modelo de lesão por incisão de tipo "a toda a espessura'1 provocada cirurgicamente num rato, para se demonstrar a capacidade do FEC-GM recombi nante para acelerar o processo de cicatrização do ferimento. 0 modelo deste tipo de incisão no rato traduz analogicamente os ferimentos por incisão "a toda a espessura" em seres humanos .

Alem disso, utilizou-se um modelo de rato com lesão infectada cronicamente granular "a toda a espessura" para simular um ferimento humano crónico típico não cicatrizante. No modelo do rato, a contaminação bacteriana significativa inibe a cicatrização natural do ferimento eventualmente devido ao fac to de prolongar a fase inflamatória do processo de cicatriza ção. A administração diãria de FEC-GM supera esta inibição bacteriana spesar de persiêtencis continuada de uma significativa infecção bacteriana. 0 recurso a este modelo de ferimento granular infectado cronicamente permitiu demonstrar que o FEC-GM pode promover a cicatrização de ferimento normalmente resistentes a sua restauração.

Em conformidade com a presente invenção, o termo "lesão" significa um ferimento que se desenvolve desde a superfície da pele de um paciente penetrando o tecido subjacente podendo even tualmente essa lesão atravessar totalmente o paciente, originan do simultaneamente ferimentos de entrada e ferimentos de saída. 30

O termo "paciente" significa qualquer mamífero que tenha sido vítima de uma lesão conforme definido antes. 0 termo "agente terapêutico" significa um composto que produz um resultado te rapeuticamente desejável, tal como a cicatrização acelerada de ferimento. Na presente invenção, os agentes terapêuticos são o FEC-G e o FEC-GM. Alêm disso, o termo "agente terapêutico" refere-se a uma combinação de FEC-G com uma ou várias das seguintes proteínas recombinantes; FCE, FCF, FEC-GM, FCI-I, FCI-II, insulina, um interferão, uma interleucina, FCC, FEC-M, FCCE-DP, FCDP, FMC, Fe^CT e F^CT ou FEC combinado com pelo menos um dos compostos seguintes: FCE, FCF, FEC-GM, FCI-I, FCI-II, insulina, um interferão, uma interleucina, FCC, FEC-M, FCCE-DP, FCDP, FMC, FG^CT e F^> CT ou FEC. Na presente memória descritiva, o termo "cicatrização acelerada de ferimentos" refe re-se ao processo de cicatrização de ferimentos de tal modo que essa cicatrização, em consequência da administração de um agente terapêutico em conformidade com a presente invenção, ocorre mais rapidamente do que num ferimento que não recebesse tratamento com esse agente terapêutico. O termo "administração tópica" significa o fornecimento do agente terapêutico â superfície do ferimento e ao epitélio adjacente. O termo "administração parentérica" significa o fornecimento sistémico do agente terapêutico através duma injecção aplicada ao paciente. 0 termo "quantidade terapeuticamente eficaz" de um agente terapêutico no âmbito da presente invenção si£ nifica a quantidade de agente terapêutico que se administra ao paciente de acordo com a opinião do médico ou do veterinário. Essas quantidades são facilmente determinadas por um especialis^ ta na matéria e proporcionarão a cicatrização acelerada de fe-

όλ » rimentos quando administradas em conformidade com a presente invenção. Os factores que determinam qual a quantidade tera pêticamer.te eficaz abrangem, entre outros, a actividade espe. cífica do agente terapêutico que se pretende utilizar, o tipo de lesão (de origem mecânica ou térmica, a toda a espessura ou de espessura parcial, etc.), as dimensões da lesão, a profundidade da lesão (no caso de ocorrer a toda a espessura), a ausência ou a presença de infecção, o tempo decorrido desde a ocorrência da lesão e ainda a idade, o estado físico, a existência de outros estados de doença e o estado nutricional do paciente. Além disso, quaisquer outros medicamentos que o paciente esteja a receber podem afectar a quantidade terapêutica mente eficaz do agente terapêutico que se pretende administrar. 0 termo aceitável sob o ponto'·' fevist-a-f4mã.eêuticas.i‘gnifi^ que os diversos componentes que em conjunto com o agente terapêuti co constituem a formulação, são adequados para administração ao paciente que se pretende tratar em conformidade com a presente invenção.

De acordo com a presente invenção, o termo "revestimen tos para ferimentos" refere-se a qualquer tipo de material uti lizado para tapar e proteger um ferimento. Como exemplos refe re-se os revestimentos oclusivos, os revestimentos adesivos, os revestimentos antissépticos e os revestimentos de protecção. No que diz respeito as preparações farmacêuticas, o termo "cre me" significa uma emulsão semi-sélida de tipo oleo-em-agua ou de tipo água-em-oleo adequada para administração tópica. Em conformidade com a presente invenção, os cremes e as espumas utilizados serão também adequados para utilização com os agen- 32

. tes terapêuticos agora descritos.

Os FEC-GM ou FEC-G reeombinantes, quando administra-

I dos em conformidade com a presente invenção numa quantidade terapêuticamente eficaz, aceleram significativamente o processo de cicatrização de todos os tipos de ferimentos. Admite-se que css mecanismos pelos quais o FEC-GM promove a aceleração desse processo estejam associados com o acréscimo de activi-'-dade dos macrófagos proporcionado pela administração deste com posto. Nos sistemas naturais de cicatrização de ferimentos podem eventualmente estar presentes factores de crescimento extracelulares tais como o FEC-GM em quantidades bastante li mitadas. Deste modo, a administração parentérica e/ou tópica desses factores pode promover a cicatrização acelerada de feri mentos. 0 polipéptido FEC-GM aumenta in vitro a proliferação de gfanulócitos e de macrófagos. Além disso,, este polipépti. do aumenta a quimiotaxia dessas células no sentido de agentes químicos de atracçao conhecidos. A administração in vivo de FEC-GM recombinante exógeno melhora a capacidade do organismo para responder a uma lesão. 0 aumento da quimiotaxia promove uma mais rapida limpeza dos resíduos existentes no ferimento proporcionando uma fase inflamatória de mais curta duração.

Os macrófagos estão intensamente implicados na degradação do coagulo que inicia o processo de cicatrização, na sua substituição com tecido granular e ainda na maturação e na remodelação do ferimento com novo epitélio. A presença de um ndmero acrescido deste tipo de células, para além de aumentar a acti-vidaae celular, ajuda a diminuir o tempo necessário g§Ç§ a ci- catrização . Alem disso, os proprios macrófagos libertam fac tores que inibem ou estimulam outros tipos de células tais 4 como os fibroblastos, os quais desempenham fundões importantes no processo de cieatrização de ferimentos.

Por outro lado, o FEC-G estimula a produção e a proliferação de células predominantemente neutrofílicas. Embora os neutrofilos não constituam uma exigência absoluta para a cieatrização de um ferimento a sua presença na fase inflamatória proporciona uma eliminação mais rápida do tecido desvi talizado e de outros contaminantes existentes no local da lesão. Os ferimentos crónicos, particularmente os que se eneon tram infectados, resistem por definição à cieatrização.

Esses ferimentos permanecem tipicamente numa fase inflamatória persistente. A administração de FEC-G recombinante e os consequentes fenómenos de aumento da actividade granulocítica , ingresso e proliferação local podem proporcionar uma eliminação mais rápida e mais completa dos elementos responsáveis pelo prolongamento da fase inflamatória, propiciando consequente mente a progressão do processo de cieatrização. E! possível utilizar quaisquer análogos dos FEC-G ou FEC-GM que possuam uma actividade biológica in vivo compa rével ou aumentada, em conformidade com os métodos da presente invenção. Esses análogos podem ser gerados por supressão, inserção ou substituição de aminoácidos na estrutura primária das proteínas naturais, ou por modificação química, tal como sucede no caso da pegilação de uma proteína. Por exemplo, para proporcionar a exprissão desses polipéptidos em microrganismos hospedeiros procarióticos, é necessário um codão de metionina inicial para dar início à tradução. Existem outros anãlogos que podem possuir uma actividade biológica superioj* in vitro e/ou in vivo, exibir melhor estabilidade para diver sos valores de pH ou de temperatura, manter a sua actividade biológica em condições ambientais bastante diferenciadas ou que podem possuir períodos de semi-vida ou de depuração mais longos in vivo.

Para se fabricar quantidades suficientes de FEC-G e de FEC-GM para aplicação farmacêutica comercial, essas proteínas são produzidas sob a forma de produtos da expressão re combinante das células hospedeiras. Sabe-se que é possível re cuperar as formas biologicamente activas de FEC-GM ou de FEC-G em grandes quantidades a partir de hospedeiros proca-rióticos tais como E. coli sempre que esses hospedeiros, transformados com vectores de expressão adequados que codificam esses polipéptidos, se desenvolvem em condições que propor cionam a expressão do gene exógeno. Em consequência é preferi vel utilizar os FEC-G ou os FEC-GM produzidos por este pro cesso.

As proteínas FEC-G ou FEC-GM recombinantes são formuladas em formulações farmacêuticas adequadas para adminis tração ao paciente. Faz-se observar aos especialistas na matéria que essas formulações podem incorporar adjuvantes e di-luentes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. Quando a administração e de tipo sistémico, a quantidade terapêutica mente eficaz do agente terapêutico é fornecida por via paren- térica, isto é, por injecção subcutânea, intravenosa, intramuscular ou intraperitoneal. Os tratamentos de ferimentos por injecção parenterica podem eventualmente implicar a administração simples, múltipla ou contínua do agente terapêutico, dependendo de diversos factores tais como o tipo, a gravidade e a localização da lesão,

Sm conformidade com um aspecto preferencial da presente invenção, as proteínas FEC-G ou FEC-GM recombinantes devem ser administradas topicamente ao local do ferimento pa ra promoverem a cicstrização acelerada do ferimento do pacien te. Esta administração tápica pode ser efectuada através de uma dose única ou através de doses repetidas administradas em diversos intervalos pré-determinados. Os especialistas na ma teria concluem facilmente que o regime de dosagem preferencial variará com o tipo e com a gravidade da lesão que se pretende tratar. For exemplo, os ferimentos originados por incisão cirúrgica provocam fracos danos aos tecidos envolventes,uma vez que o objecto cortante que provoca a lesão transmite pouca ener gia aos tecidos. Verificou-se que uma administração tópica úni ca do agente terapêutico proporciona uma cicatrização significa tivamente mais rápida do que aquela que ocorre em ferimentos idênticos que não recebem esse tipo de tratamento. No caso de o ferimento estar infectado e permanecer: cronicamente granular, verificou-se que a aplicação diária repetida do agente te rapeutico proporcionava uma cicatrização do ferimento mais rápido do que aquela que ocorria em ferimentos semelhantes que não recebessem esse tipo ds tratamento. EMbora seõa possível administrar o agente terapêutico como um composto puro ou praticamente puro, isto é, sem estar incorporado em qualquer outra formulação farmacêutica, 4 pr§ ferível administrar esse agente terapêutico incorporado numa formulação dav-numàucámposição farmacêuticas. Essas formulações incorporam uma quantidade terapèucicamente eficaz de agente activo conjuntamente com um ou vários veículos e/ou adjuvantes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. Os veículos utilizados devem ser compatíveis com os outros ingredientes existentes na formulação. De p,referência, a formulação não deve incorporar agentes oxidantes ou redutores ou quaisquer outras substâncias conhecidas que sejam incompatíveis com os polipeptidos descritos. Em todos os métodos de formulação existe uma fase que consiste em associar o ingredi ente biologicamente activo com os veículos e/ou adjuvantes.

De um modo geral, o agente terapêutico da presente invenção será formulado associando-o com veículos líquidos, com veícu los sólidos finamente divididos ou com ambos.

As formulações adequadas para a administração tdpica, em conformidade com a presente invenção, incorporam quantidades terapêuticamente eficazes de agente terapêutico em conjun to com um ou mais veículos e/ou adjuvantes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. £Í preferível um veículo de tipo aquoso ou à base de colageneo para administração tdpica dos agentes terapêuticos descritos na presente invenção. No caso da formulação se destinar a ser administrada uma 'dnica vez, 4 preferível utilizar um veículo à base de colageneo. Como exemplo de um veículo desse tipo refere-se o "Ziderm^" (Collagen Corpo., Paio Alto, CA). Se para tratar do'ferimento

az em causa forem necessárias fflàltiplas aplicações do agente tera pèuticamente activo, a intervalos pré-determinados, é preferi vel utilizar um veículo de tipo aquoso aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Contudo, também é possível incorporar o agente terapêutico em diversos materiais vulgarmente utilizados para o tratamento de ferimentos. Esses materiais englo bam o ácido hialuronieo ou outras preparações derivadas de glicosaminoglicano, matérias de sutura e produtos para revestir ou cobrir ferimentos.

No caso de o agente terapêuticamente activo, de acordo com a presente invençzo, ser constituído por mais do que uma proteína, administra-se a mistura resultante de modo idêntico ao das formulações que aplSSS Incorporam um polipéptido como agente terapêuticamente activo.

Os exemplos seguintes tem como objectivo ilustrar melhor a presente invenção, mas não constituem qualquer limitação dpnsgu objecto.

Exemplo 1

Modelo de incisão de tipo "a toda a espessura"

Anestesiou-se com pentobarbital oito ratos macho adultos e ainda jovens da estirpe Sprague-Dawley com o peso compreendido entre 300 e 350 gramas (Sascoj Omaha, NE). Rapou--se e esfregou-se o dorso de cada animal. Sobre o dorso de cada animal e em campo estéril efectuaram-se duas incisões de 6 cm de tipo "a toda a espessura". Cada incisão ficou situada a 1,5 cm da linha média dorsal. Depois administrou-se, a 2ã / ceda animal, uma suspensão de colagéneo de bovino contendo 1 mg de colagéneo e 80 yug de FEC-GM no interior de um dos dois ferimentos provocados pelas incisões, utilizando uma se*^ ringa de tuberculina. Depois injectou-se no outro ferimento de cada animal ums suspensão contendo apenas colagéneo de bovi no para servir como controlo interno. As incisões'foram depois fechadas com três grampos cirúrgicos uniformemente espaçados. Apés a intervenção cirúrgica, os animais foram mantidos durante 10 dias em gaiolas individuais e decorrido esse tempo foram removidos para se efectuar a colheita de tecidos.

Essa colheita foi efeetuada sacrificando de forma, huma na cada um dos ratos. Apos o sacrifício, procedeu-se à remoção cuidadosa por métodos cirúrgicos de toda a pele da região dorsal. Utilizou-se depois uma matriz com lâminas cirúrgicas paralelas para a remoçi© ?de ' duas ou três tiras de pele provenientes da érea envolvente de cada ferimento e perpendiculares ao eixo da incisão. Cada ume dessas tiras possuía 8 mm de lar gura e foi excisada da região entre os grampos cirúrgicos.

Apos a excisão, manteve-se devidamente humedecidas as amostras homologas e emparelhadas provenientes dos ferimentos experiíren tais e de controlo as quais forem depois utilizadas para a determinação da resistência à rotura dos ferimentos tratados com FECuM e dos ferimentos não tratados. Além disso, procedeu-se tamoém à excisão de uma ou duas amostras da extremidade de cada excisão, as quais foram preparadas para análise histolégica.

Utilizou-se um tensometro (Tensometer 10j Monsanto Go., St. Louis, MO) para a determinação da resistência a rotura dos ferimentos devidamente fechados. A figura 1 representa os re- 22

sultados das medições da resistência à rotura. Não foram efec tuadas medições nos ferimentos que demonstravam quaisquer sinais de infecção, hemorragia excessiva ou fraca coaptação, Os testes T. de Student emparelhados das avaliações da resistên cia a rotura e das diferenças entre os valores experimentais e de controlo foram efectuados recorrendo a um sistema de analise de dados SAS (Division of Biostatistics, Washington' University St. Louis, MO). Estas analises revelaram no teste T.de Student um valor correspondente a 2,136298 e um valor de p correspondente a 0,038, significando isto que o tratamento com FEC-GM melhora significativamente a resistência à rotura dos ferimentos cicatrizados, comparstivamente com os controlos não tratados. A ana'lise histológica dos ferimentos coaptados foi efec tuada procedendo ao exame de amostras removidas das extremidades das incisões decorridas entre 2b e *+8 horas apds a excisão.

Antes dos exames, cada amostra foi mergulhada em parafina e cor tada em fatias com aproximadamente 3 pm de espessura. As secções destinadas a exame para observação da formação de tecido granular e de tipo celular foram coradas com hematoxilina e con tra coradas com eosina recorrendo-se para esse efeito a técnicas normalizadas. Essas secções foram depois avaliadas por mi-croscopia optica com uma ampliação de lOOx em observações efec, tuadas por dois observadores independentes. Estas observações demonstraram que os ferimentos tratados com FEC-GM tinham re cebido um influxo de monocitos e de fibroblastos muito maior do que os ferimentos não tratados. ãstes resultados tensiometricos e histologicos indicam

bO y

/ que um único tratamento com 20 jig de FEC-GM acelera significa tivamente o processo de cicatrização de ferimentos in vivo. Observou-se uma celularidade acrescida e uma produção de cola géneo acrescida em ferimentos tratados com FEC-GM comparativamente com os ferimentos.de controlo não tratados . —Desta for ma, o acréscimo da resistência s rotura observado em ferimen* tòs; tratados com FEC-GM pode ser atribuído à capacidade do polipéptido FEC-GM administrado topicamente para promover um ingresso superior de macrdfagos e de fibroblastos nas áreas le sionadas. Este acréscimo rápido da celularidade origina por sua vez uma transição precoce do tecido granuloso para a matriz à base de colagéneo característica~do tecido com escara.

Para além da experiência anteriormente descrita, reali zou-se também outra experiência utilizando o mesmo modelo de ferimento por incisão "a toda a espessura" para comparação dos tratamentos tépico e sistémico com o polipéptido FEC-GM.

Neste caso, utilizaram-se ratos machos da estirpe Sprague--Dawley com um peso variando entre 250 e 309 gramas. As in*.L.-cisões "a toda a espessura" foram efectuadas conforme descri to antes. Para a administração tópica, combinou-se FEC-GM recombinante (0,5 mg/ml) com uma suspensão emulsionada de colagéneo de bovino (10 mg/ml) de modo a aplicar-se uma qusntida de de 30 Jig de FEC-GM a cada fissura da lesão no momento de a fechar utilizando uma seringa de tuberculina com um volume total de 0,1 ml. 0 ferimento de controlo do par correspondente em csdâ animal recebeu uma quantidade de 100 jul exclusivamente constituída pelo veículo colagéneo.

Seleccionou-se uma série separada de animais para^exa- minar o efeito da administração tópica do FEC-GM em ferimentos provocados por incisões em animais monocitopénicos. A monocitopenia foi induzida administrando a cada animal submetido â experiência uma injecçio intramuscular de metilpred-nisolona na proporção de 30 mg/kg (cerca de 10 mg/rato) dois dias antes da lesão. Efectuou-se uma análise quantitativa com pleta do sangue extraído da veia da cauda dois dias após terem sido provocadas as lesões, num conjunto representativo de animais de cada grupo granuloso (tanto normais como monocitopéni-cos) com o objectivo de se examinar os possíveis efeitos sisté micos da administração tópica de FEC-GM ao local da lesão. Os valores obtidos, particularmente no que diz respeito â variação diferencial dos glóbulos brancos, revelaram uma falta de absorção sistémica significativa de FEC-GM quando a administra ção foi efectuada por via tópica.

Os animais tratados por via tópica foram sacrificados alternativamente ao 72 dia ou ao 142 dia após inflicção da lesão. Depois procedeu-se à recolha das suas peles e a partir de cada lesão prepararam-se tiras normalizadas de 8 mm conforme descrito antes. Cada uma dessas tiras foi depois submetida a um ensaio de determinação da resistência â rotura utilizando um tensÓmetro. Os resultados foram analisados recorrendo ao teste T de Student para valores emparelhados (Basica, IBM Corp.). Todos os ferimentos que demonstraram excessiva formação de crostas ou fraca aproximação («^5 % para todos os ferimentos) foram excluídos da análise. Os resultados para os animais normais, isto é, animais não monocitopénicos estão indicados na figura 2 e confirmam os resultados indicados na figura 1, designadamente k2 o facto de a administração tópica de FEC-GM a uma lesão pro*· vocada por uma incisão aumentar significativamente a velocida-* de de cicatrização do correspondente ferimento. Foram obtidos resultados contraditórios com experiências efeetuadas em ratos monoeitopénicos. 0 tratamento com glucocorticóides antes da existência do ferimento eliminou o efeito positivo da administração tópica de FEC-GM ao local da lesão.

Em simultâneo com as experiências de administração tópica descritas antes, procedeu-se também à administração sisté mica de FEC-GM a ratos, aos quais foram provocados ferimentos idênticos por incisão. Injectaram-se estes animais subcutâneamente com FEC-GM na proporção de 100 pg/kg em um veículo tamponado com fosfato, em cada 12 horas, com início dois dias antes da lesão e mantendo o tratamento durante 5 dias após terem sido efeetuadas as incisões. Os animais de controlo receberam injecções de volumes equivalentes de apenas solução sa lina de acordo com o mesmo esquema. Recolheram-se amostras de sangue da vela caudal no dia anterior ao início da administração de FEC-GM e no primeiro e nono dias após administração.

Os animais foram sacrificados humanamente sete dias após a intervenção eirdrgica e procedeu-se à medição da resistência da lesão a traeção conforme descrito antes. Os resultados obtidos para os animais lesionados pelas incisões e tratados sis-temicamente com FEC-GM revelaram que essa via de administração era ineficaz no caso do polipéptido FSC-GM no que diz respeito à sua capacidade de promover a cicatrizaçio acelerada de lesões provocadas por incisão. Embora uma análise dos diver sos tipos de células sanguíneas demonstre uma resposta defini- *+3 *+3

„ da à administração de FEC-GK, os ferimentos em amimais que receberam o FKC-GM subcutâneamente não apresentaram uma resistência à rotura superior a dos animais tratados apenas com solução salina. Estes resultados, quando associados com os que foram anteriormente apresentados para o caso da administra ção tópica, demonstram claramente que a aplicação de FEC-GM ao próprio ferimento constitui o método mais eficaz para acelerar a cicatrização em animais lesionados.

Exemplo 2

Modelo de ferimento cronicamente granuloso

Efeetuou-se s anestesia de 72 ratos machos da estirpe Sprague-Dawley (Sasco; Omaha, NE) com uma massa corporal compreendida entre 200 e 250 gramas e rapou-se e desimfectou-se a superfície dorsal de cada rato. A cada rato foi provocada uma lesão de acordo com o modelo de queimadura modificado por Brooke, ca^acterizado por uma queimadura na sua superfície dor sal correspondente a 20 % da espessura total. De acordo com esse modelo de queimadura modificado por Brooke /.Walker et al.j "Annals of Surgery"; Ag. 196*4·; P. 297-305 J utili2ou-se Uma matriz que foi aquecida a temperatura de 100°C. Esta matriz foi depois colocada sobro o dorso do animal submetido a experiencia durante 15 segundos. Imediatamente após se ter in o fligido a queimadura, inoculou-se uniformemente 10 E. coli (ATCC, estirpe Ns 25922) sobre essa lesão por queimadura em *+0 dos reféiridoss ratos . Depois de terem recuperado da anes tesia os animais foram colocados numa única gaiola.

Decorridos cinco dias após terem sido infligidas as queimaduras, submeteu-se os animais que sobreviveram a infec-ção provocada pela queimadura a uma escarectomia em condições de anestesia, tendo as escaras que cobriam a lesão sido elimi nadas por meios mecânicos. A remoção das escaras permitiu de terminar que o ferimento cronicamente granuloso continha níveis bacterianos da ordem de 10^ bacterias/grama de tecido. Efectuou-se uma análise quantitativa e qualitativa das bactérias limpando primeiro o ferimento com álcool isopropílico e procedendo depois a eliminação das escaras. Efectuou-se depois uma biópsia removendo um núcleo de 2-3 mm de tecido granuloso. Depois pesou-se o tecido da biópsia, queimou-se , ho mogeneizou-se e diluiu-se em uma solução 1 : 10 de tioglico-lato. Depois procedeu-se a diluição desta solução em serie e efectuaram-se preparações sobre placas de gelose sanguínea pa ra se proceder a uma contagem bacteriana.

Depois de determinada a contagem bacteriana inicial dividiram-se os animais em tres grupos. 0 grupo 1 ficou constituído por 80 animais nao infectados com E. coli. os quais foram tratados com FEC-GM, sendo esse grupo designado por grupo de controlo não tratado. Os grupos 2 e 3 constituíram os grupos experimentais . 0 grupo 2 ficou constituí do por 20 animais aos quais se administrou, por via tópica, apenas veículo inerte em conformidade com a mesma distribuição·· temporal do grupo 3 a cujos animais se administrou indivi- dualmente 10 /ig de FEC-GM. Nos grupos 2 e 3, as formulações tópicas adequadas foram administradas diariamente com uma se- ringa de tuberculina durante 10 dias. 0 regime de epiteliaçio e/ou contrscção da lesão foi determinado por planimetria radial em cada 2 a 3 dias durante todo o tempo da experiência. Alem disso, fizeram-se biópsias ao 5S e ao 10s dias para determinação dos níveis bacterianos nos ferimentos dos diversos grupos . A contagem bacteriana no tecido foi inferior no grupo 3 (média = 3,78 x 10^ bactérias/grama) comparativamente com o grupo, de controlo infectado (grupo 2, média = 1,9 x 10') ao 10e dia. Todavia os níveis bacterianos nos grupos 2 e 3 per-maneceraimsignificativamente superiores aos níveis do grupo 1 (média <í 10^ bactérias/grama) durante todo 0 tempo da experi ência.

Os ferimentos cronicamente granulosos do grupo 2, cicatrizaram mais lentamente do que os ferimentos dos animais do grupo 1, o que permite concluir que a contaminação baete-riana inibe a cicatrização de ferimentos neste modelo. Contu do, os animais tratados com FEC-GM do grupo 3 foram capazes de superar esta inibição bacteriana conforme ficou demonstrado pela cicatrização significativamente mais rapida dos ferimentos (p ^ 0,005 Wilcoxon) comparativamente com os resultados observados nõ grupo 2 (figura 2). Desta forma,a apli cação tópica de FEC-GM acelera o fecho da lesão apesar de uma intensa e continuada contaminação bacteriana. Na realidade, a velocidade de fecho da lesão observada no ferimento cronicamen te granuloso a que se administrou FEC-GM atingiu valores comparáveis aos que se observam em animais não infectados. Estes resultados indicam que a aplicação tópica de FEC-GM a feri-

kS

c mentos que previamente não cicatrizavam permite obter uma ve-, locidade normal de cicatrização de um ferimento mesmo no caso em que este se encontre altamente contaminado.

Apesar de a presente invenção ter sido descrita em termos dos seus aspectos preferenciais, pode haver variações e modificações susceptíveis de serem praticadas pelos especialistas na matéria tendo presente a descrição anterior. Sm consequência, pretende-se que as reivindicações anexas abranjam todas essas variações que possam ser englobadas no âmbito da presente invenção. -

Rei-

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. - Método para promover a cicatrizaçio acelerada de lesões num paciente lesionado, caracterizado pelo facto de consistir na administração tópica ou na administração parent£ rica de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um factor estimulador de colónias seleccionado entre o.grupo constituí do pelo factor estimulador de colónias de granulócitos (FEC-G) e pelo factor estimulador de colónias de granulócitos -macrófsgòs (FEC-GM)-
2. - Método de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de o factor estimulador das colónias ser o produto da expressão das células hospedeiras eucarióticas recombinantes.
3.- Método terizado pelo facto de o produto da expressão recombinantes. de acordo com a reivindicação 1, cara£ o factor estimulador das colónias ser de células hospedeiras procarióticas

%
4. - Método de acordo com a reivindicação 1, carac, terizado pelo facto de a lesão ser do tipo seleccionado entre o grupo constituído por lesões de origem mecânica, térmi ca, aguda, crónica, infectada e estéril.
5. - Método de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de o paciente lesionado ser um ser humano. acordo com a reivindicação 3, carac célula hospedeira procariótica re-
6. - Método de terizado pelo facto de a combinante ser E. coli. acordo com a reivindicação 6, caraç^ factor estimulador da colónia ser
7. - Método de terizado pelo facto de o FEC-G. acordo com a reivindicação 7, carac^ factor estimulador da colónia ser o
8. - Método de terizado pelo facto de o FEC-G de origem humana.
9. - Método de acordo com a reivindicação 6, carac_ terizado pelo facto de o factor estimulador da colónia ser o FEG-GM.
10.- Método de acordo com a reivindicação 9, carac terizado pelo facto de o factor estimulador da colónia ser o FEG-GM de origem humana.
11.- Método de acordo com a reivindicação 1, cara£ terizado por se aplicar também pelo menos uma outra proteína recombinante seleccionada entre o grupo constituído por factor de crescimento da epiderme (FCE), factor de crescimento dos fibroblastos (FGF), factor estimulador da colónia dos granulócitos (FEC-G), factor estimulador da colónia dos granu lócitos-macrófagos (FEC-GM), factor de crescimento insuliní-co I (FCI-I)factor de crescimento insullníco II (FCI-II), in sulina, um interferão, uma interleucina, factor de crescimento dos ceratinócitos (FCC), factor estimulador da colónia dos macrófagos (FEC-M), factor de crescimento das células endoteliais derivado das plaquetas (FCCE-DP), factor de crescil mento derivado das plaquetas (FCDP), factor das células secundárias reprodutivas (FCS), factor do crescimento transfor-mante (F^CT) e factor 6 do crescimento transformante (f3cT).
12.- Método de acordo com a reivindicação 11, carac

terizado pelo facto de o interferão ser seleccionado entre o grupo constituído pelos interferoes IFN-^6,
13.- Método de acordo com a reivindicação 11, cara£ terizado pelo facto de a interleucina ser seleccionada entre o grupo constituído pelas interleucinas IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 e IL-10.
14. - Método de acordo com a reivindicação 1, caraç terizado pelo facto de a administração tópica de uma formulação farmaceuticamente aceitável contendo uma quantidade te-rapeuticamente eficaz de um factor estimulador de colónias se efectuar através da aplicação de um produto para cobrir Xe sões e o qual contenha vim factor estimulador de colónias, se-leccionado entre , o grupo constituído por cremes â base de colagéneo, películas â base de colagineo, microcápsulas â base de colagineo, pós ã base de colagéneo, ácido hialurõnico ou outros glicosaminoglicanos, cremes, espumas, materiais' de sutura e produtos para cobertura de lesões.
15. - Método de acordo com a reivindicação 14, ca-racterizado pelo facto de se incorporar também pelo menos uma outra proteína seleccionada entre o grupo constituído por FCE, FCF, FEC-G, FEC-GM, FCI-I, FCI-II, insulina, um inter-ferão, tona interleucina, FCC, FEC-M, FECE-DP, FCEP, FCS, F*ÍCT e F6 CT.
16.- Método de acordo com a reivindicação 15, ca-racterizado pelo facto de se seleccionar o interferão entre o grupo constituído pelos interferões IFN-°C., IFN-p e IFN-
17. - Método de acordo com a reivindicação 15, ca- racterizado pelo facto de se seleccionar a interleucina entre o grupo constituído pelas interleucinas IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 e IL-10.
18.- Método de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo facto de a administração tópica de uma formulação farmaceuticamente aceitável que contém uma quantidade terapeuticamente eficaz de um factor estimulador de colónias se efectuar através da aplicação de uma solução que incorpora esse factor estimulador de colónias.
19.- Método de acordo com a reivindicação 18, ca-racterizado pelo facto de se incorporar também pelo menos uma outra proteína seleccionada entre o grupo constituído por FCE, FCF, FEC-G, FEC-GM, FCI-I, FCI-II, insulina, um interfe-rão, uma interleucina, FCC, FEC-M, FECE-DP, FCDP, FCS, FQÍCT
20.- Método de acordo com a reivindicação 19, ca-

racterizado pelo facto de o interferão ser seleccionado entre o grupo constituído pelos interferões IFN-^d, 52 /
21,- Método de acordo com a reivindicação 19 racterizado pelo facto de se seleccionar a interleucina tre o grupo constituído pelas interleucinas IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 e IL-10. ca- en- IL-3, ©Agente Oficial da Propriedade Industrial