PT100017A - Moleculas de polipeptideos codificadoras de ribozimas de "splicing" trans (corte e ligacao trans em rna) celulas hospedeiras contendo-as e metodo para "splicing" trans - Google Patents

Description

Campo do Invento O presente invento é dirigido a novas ribozimas capazes de fazerem reacções de "splicing" em trans.

BREVE DESCRICÃO DE TRABALHOS RELACIONADOS

I. Intrões do Grupo I

As moléculas de RNA com actividade catalítica são designadas ribozimas ou enzimas de RNA (Cech, T.R., Ann. Rev. Biochem. 59:543-568 (1990). O precursor do rRNA de Tetrhvmena thermophila contem um intrão (uma ribozima) capaz de catalisar a sua própria excisão. Esta ribozima pertence a uma classe de intrões estruturalmente relacionados designada Grupo I. A actividade de "splicing’' do intrão modificado de T. thermophila requere a presença de um cofactor guanosina e de um . . ++ ++ catião divalente, Mg ou Mn e ocorre via duas reacções de transesterificação sequenciadas (Figura 1). Primeiro, uma guanosina livre é ligada à ribozima e o seu grupo hidroxilo 3' é colocado para atacar o átomo de fósforo no sítio de "splicing" 5'. A guanosina é ligada covalentemente à sequência de intrão e o exão 5' é libertado. Segundo, a ligação fosfodiéster situada no sítio de splicing 3' sofre ataque pelo grupo hidroxilo 3' recentemente libertado, resultando na produção das sequências de exão ligadas. O intrão excisado subsequentemente sofre uma série de reacções de transesterificação envolvendo o seu grupo hidroxilo 3' e sequências internas, resultando na formação de formas circulares curtas. c

Estas reacções sucessivas são quimicamente semelhantes e parecem ocorrer num único sítio activo. As reacções de

auto-,,splicing" são caracterizadas pela formação de .estruturas de RNA alternativas uma véz que cadeias de RNA diferentes são levadas a formar conformações semelhantes à volta do intrão altamente conservado. "Splicing" requere o alinhamento das junções intrão-exão ao longo de uma sequência complementar designada "sequência guia interna" ou IGS. A primeira clivagem no sítio de "splicing" 5' requere a formação de uma hélice emparelhada (Pl) entre IGS e sequências adjacentes ao sítio de "splicing". A presença de um par de bases "frágil" U:G dentro desta hélice define a ligação fosfodiéster que será quebrada na reacção catalítica da ribozima. Após clivagem desta ligação, uma fracção da hélice Pl é deslocada e uma nova hélice, PIO, é formada devido à complementaridade entre a IGS e sequências adjacentes ao sítio de "splicing" 3'. Um resíduo guanosina conservado precede o fosfodiéster no sítio de "splicing" 3', semelhante à fracção da sequência Pl que está em deslocamento. Assim, a ligação dos exões ocorre ao contrario da primeira reacção de clivagem mas onde novas sequências de exão foram substituídas pelas do intrão. Pode-se notar que as reacçõs de circularização dos intrões subsequentes à ligação de exões também envolve emparelhamento de bases das sequências 5' ao longo de IGS e o ataque mediado pelo grupo hidroxilo 3' do resíduo guanina terminal dos intrões (Been, M.D. et al.. "Selection of Circularization Sites In A Group I IVS RNA Requires Multiple Alignments Of An Internai Template-Like Sequence" Cell 50:951 (1987)). II. Actividades Catalíticas

Para melhor definir as propriedades estruturais e catalíticas dos intrões do Grupo I, sequências exão foram -4- -4-

retiradas do "núcleo" do intrão de T♦ thermophila. Cech, T.R. et al. r WO 88/04300, descreve pelo menos três actividades catalíticas que a ribozima intrão de Tetrahvmena possui: (1) uma activi-dade de desfosforilação, capaz de remover o fosfato terminal 3' de um RNA numa forma específica de sequência, (2) uma actividade de RNA-polimerase (nucleotidil-transferase), capaz de catalisar a conversão de oligorribonucleótidos em polirribonucleótidos e (3) uma actividade de endorribonuclease específica de sequência.

As actividades isoladas de ribozima podem interactuar com RNAs substrato in trans e estas interacções caracterizadas. Por exemplo, quando formas truncadas do intrão são incubadas com sequências correspondendo à junção de "splicing" 5', o sítio sofre clivagem dependente de guanosina simulando o primeiro passo no "splicing". 0 substrato e os RNAs de intrões endorribonucleo-líticos emparelham para formar a hélice PI e a clivagem ocorre apôs um emparelhamento de bases U:G na posição 4-6. Comparações filogenéticas e análises de mutaçõesindicam que a natureza das sequências imediatamente adjacentes ao resíduo uracilo conservado no sítio de "splicing" 5' não é importante para a catálise, desde que o emparelhamento de bases da hélice PI seja mantida (Doudna, J.A. et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 7402-7406 (1989)).

As necessidades em termos de sequências para a selecção do sítio de "splicing" 3' parece residir principalmente dentro da estrutura do prõpio intrão, incluindo a hélice P9.0 e o resíduo guanosina seguinte que delimita a fronteira 3' do intrão. No entanto, as sequências flanqueantes dentro do êxão 3' são necessárias para a formação da hélice P10 e "splicing" eficaz, como se mostra pela análise mutacional (Suh, E.R. et al.. Mol. Cell. Biol. 10: 2960-2965 (1990)). Em adição, os oligonucleõtidos foram ligados em trans. usando uma forma truncada do intrão e sequência guia "externa" e oligonucleõtidos que tenham sido prolongados por -5-

um resíduo guanosina 5'. Os oligonucleótidos" substrato correspondendo âs sequências exão 3' foram alinhados somente pela formação de hélices do tipo PIO num molde externo, antes da ligação (Doudna, J.A. et al. , Nature 339:519-522 (1989)). A actividade de clivagem das ribozimas foi direccionada para RNAs específicos através da obtenção de uma região de "hibridação" discreta na ribozima, tal região de hibridação sendo capaz de hibridar especificamente com o RNA pretendido. Por exemplo, Gerlach, W.L. et al.. EP 321,201, construiu uma ribozima contendo uma sequência complementar de um RNA alvo. Aumentando o comprimento desta sequência complementar aumentou a afinidade desta sequência para o alvo. No entanto, as regiões de hibridação e clivagem desta ribozima eram parte integral uma da outra. Quando da hibridação com o RNA alvo através das regiões complementares, a região catalítica da ribozima clivou o alvo. Foi sugerido que a ribozima seria útil para a inactivação ou clivagem do RNA alvo in vivo. como seja para o tratamento de doenças humanas caracterizadas pela produção de um RNA estranho ao hospedeiro. No entanto, o "splicing" em trans dirigido pela ribozima (em oposição à clivagem trans) não foi descrito ou sugerido. FEBS Lett. 228:228-230 (1988);

As actividades de endorribonuclease (as actividades de clivagem) de várias ribozimas naturais foram extensivamente estudadas. A análise da estrutura e sequência destas ribozimas indicou que certos nucleótidos à volta do sítio de clivagem estão altamente conservados mas as sequências flanqueantes não são tão conservadas. Esta informação conduziu à projecção de novas actividades de endorribonuclease não encontradas na natureza. Por exemplo, Cech e outros construíram novas ribozimas com especificidade da sequência substrato alterada (Cech, T.R. et al., WO 88/04300; Koizumi, M. et al.. -6-

Koizumi, M. et al.. FEBS Lett. 239:285-2881Γ Haseloff. J. et al.. Nature 334:585-591 (1987) ; e Heus, H.A. et al. . Nucl. Acids Res. 18:1103-1108 (1990)). De estudos anteriores dos viróides de plantas auto-clivãveis e RNAs satéliutes (Buzayan, J.M. et al. f Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83.:8859-8862 (198 6) , foram desenvolvidas linhas para a projecção de ribozimas que sejam capazes de clivar outras moléculas de RNA em trans numa sequência altamente específica (Haseloff, J. et al.. Nature 334:585-591 (1988)). No entanto, estas construções foram incapazes de catalisar eficazmente reacções direccionadas de "splicing" em trans. A ligação de exões contidos em RNAs separados, ou seja, "splicing" em trans. ocorre na natureza para intrões do grupo I e do grupo II mediados por snRNP e autocatalizados. Nos mRNAs de tripanossoma e de Caenorhabditis eleaans. sequências líder 5' são transcritas a partir de genes separados e sujeitas a "splicing" para as fraeções 3' dos mRNAs (Agabian, N., Cell 61:1157-1160 (1990); Hirsh, D. et al.. Mol. Biol. Reo. 14:115 (1990). Estes pequenos RNAs de "líder de splicing" (slRNAs) consistem no exão 5' fundido a sequências que podem substituir funcionalmente snENA Ul em extractos de "splicing" com snRNP de mamíferos.

Também, os intrões de auto-"splicing" tanto do grupo I como do grupo II são capazes da ligação de exões em trans em sistemas artificiais (Been, M.D. et al.. Cell 47:207-216 (1986); Galloway-Salvo, J.L. et al.. J. Mol. Biol. 211:537-549 (1990); Jacquier, A. et al.. Science 234:1099-1194 (1986); e Jarrell, K.-A. et al. . Mol. Cell. Biol. 8.:2361-2366 (1988)). "Splicing" em trans ocorre in vivo para os intrões do grupo II em genes cindidos ("split") dos cloroplastos (Kohchi, T. et al.f Nucl. Acids Res. 16:10025-10036 (1988)) e foi demonstrado para um intrão do grupo I num gene partido artificialmente em Escherichia coli (Galloway-Salvo, J.L. et al.. J. Mol. Biol. 211:537-549 (1990)). -7- -7-

Neste último caso, um gene da timidilato-sintetase (td) do bacteriofago T4 contendo um intrão do grupo I foi dividido na ansa ligando a hélice de intrão P6a. Demonstrou-se que os transcritos de segmentos do gene td sofrem "splicing" em trans in vitro e fazem a repescagem de células hospedeiras E. coli com deficiências. Emparelhamentos conhecidos (P3, P6 e P6a) e possíveis interacções terciárias entre os segmentos de intrão, permitiram a montagem e o processamento correctos das metades do gene.

In vitro. a ribozima de Tetrahvmena é capaz de catali-zar o "splicing" em trans de substratos modelo oligorribonucleó-tidos de cadeia simples. Foram necessários quatro componentes: ribozima, RNA de cadeia simples 3', exão 5' e GTP. Uma forma encurtada da ribozima de Tetrahvmena (RNA L-21 Seal IVS), começando na sequência guia interna e terminando em U4Qg foi usada naquela reacção (Flanegan, J.B. et al.f J. Cell. Biochem. (Supl.) 12 parte D:28 (1988)). 0 ataque por GTP no sítio de "splicing" 5' libertou o exão 5' que foi então ligado pela ribozima ao exão 3'numa reacção de transesterificação no sítio de "splicing" 3'.

Foi proposta a utilização in vivo de ribozimas como uma alternativa à utilização de RNA anticodão para o direccionamento e destruição de RNAs específicos (Gerlach, W.L. et al.. EP321,201; Cotten, M., Trends Biotechnol. 8:174-178 (1990); Cotten, M. et al. r EMBO J. 8_: 3861-3866 (1989); Sarver, N. et al. . Science 247:1222-1225 (1990)). Por exemplo, a expressão de uma ribozima com actividade catalítica endonucleolítica contra um RNA expresso durante a infecção com HIV-1 foi sugerido como uma potencial terapia contra a infecção pelo vírus da imunodeficiência adquirida tipo 1 (HIV-1) (Sarver, N. et al. . Science 247:1222-1225 (1990); Cooper, M., CDC AIDS Weeklv. 3 de Abril, 1989, página 2; Rossi, J.J., Resumo da Patente N2 1R01AI29329 em Dialog's Federal

Research in Progress File 265). No entanto, tais tentativas ainda não tiveram êxito.

Num estudo destinado a investigar a potencial utilização de ribozimas como agentes terapêuticos no tratamento da infecção pelo vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1), ribozimas do motivo em cabeça de martelo (Hutchins, C.J. et al.. Nucl. Acids Res. JL4:362.7 (1986); Keese, P. et al. . em Viroids and Viroid-Like Pathoqens. J.S. Semancik, ed., CRC Press, Boca Raton, FL, 1987, p. 1-47) foram direccionadas para os transcritos qaq de HIV-1. A expressão da ribozima direccionada para qaq em culturas de células humanas resultou num decréscimo /(mas não num desaparecimento completo) do nível de RNA de aaq de HIV-1 e em níveis de antigénio p24 (Sarver, N. et al., Science 247:1222-1225 (1990)). Assim, a eficácia médica da ribozima de Sarver foi limitada pela sua baixa eficiência uma vez que qualquer RNA do patogénio que escape permanece um problema para o hospedeiro.

Um outro problema com as aplicações de ribozimas in vivo é que é necessária uma proporção elevada de ribozima para substrato para a função inibidora da ribozima em extractos nucleares e tem sido díficil conseguir tais proporções. Cotton et al.. conseguiu uma elevada proporção de ribozima para substrato por microinjecção de uma cassete de expressão contendo um gene produtor de ribozima operacionalmente ligado a um promotor forte de tRNA (um promotor da polimerase III) em oócitos de rã, juntamente com RNA substrato que contem a sequência de clivagem para a ribozima (Cotton, M. et al.. EMBO J. 8:3861-3866 (1989). No entanto, a microinjecção não é um método adequado para a libertação em organismos multicelulares.

Foi descrita a actividade in vivo de ribozimas projec-tadas contra mRNA codificador da β-galactosidase de Escherichia -9- -9-

coli (Chuat, J.-C. et al.r Biochem♦ Biophvs?vRes. Commun. 162-:1025-1029 (1989)). No entanto, esta actividade foi apenas observada quando a ribozima e o alvo foram transfectadas para células bacterianas na mesma molécula. A actividade de ribozima foi ineficaz quando direccionada contra um mRNA transcrito derivado de um epissoma F bacteriano que possuia a parte do alvo do gene da B-galactosidase.

Assim, as aplicações tecnológicas correntes das activi-dades de ribozima estão limitadas às que propoem utilizar uma actividade de clivagem da ribozima para destruir a actividade de um RNS alvo. Infelizmente, tais aplicações muitas vezes requerem a destruição completa de todas as moléculas de RNA alvo e/ou proporções relativamente elevadas de ribozima:substrato para assegurar eficácia e isto foi difícil de conseguir. Mais importante ainda, as ribozimas modificadas não são capazes de dirigir eficazmente o "splicing" em trans♦

Assim, existe a necessidade de desenvolver ribozimas e sistemas de expressão de ribozimas altamente eficientes. Especialmente, não estão descritos métodos eficazes com os quais destruir uma sequência de RNA existente ou alterar a sequência codificadora de um RNA existente pelo "splicing" em trans de uma nova sequência de RNA num RNA de hospedeiro.

SUMARIO DO INVENTO

Reconhecendo o potencial da projecção de novas ribozimas e conhecendo a necessidade de métodos altamente eficazes para alterar as características genéticas de eucariotas superiores in vivo, os inventores estudaram a utilização de ribozimas para alterar a informação genética de RNAs nativos in vivo. Estes

esforços culminaram no desenvolvimento de ribòzimas de "splicing" em trans altamente eficazes e directivas para a sua manipulação.

De acordo com o invento, é primeiro proporcionada uma molécula de RNA ou DNA, tal molécula codificando uma ribozima de "splicing" em trans, tal ribozima sendo capaz de fazer eficazmente "splicing” de uma nova seguência de exão 3' em qualquer sequência de RNA alvo escolhida, de uma forma altamente precisa, in vitro ou in vivo e tal molécula sendo nova na capacidade para acomodar qualquer RNA alvo escolhido ou sequências exão 3' e ainda na adição de uma sequência complementar que aumenta a especificidade de tal ribozima.

De acordo com o invento, é também proporcionada uma molécula de RNA ou DNA, tal molécula codificando uma ribozima, a sequência de tal ribozima sendo um RNA de fusão, tal RNA de fusão proporcionando uma primeira sequência de RNA que é suficiente para o direcionamento de tal ribozima para hibridar com um RNA alvo e ainda uma segunda sequência de RNA, tal segunda sequência de RNA capaz de ser transposta para o RNA alvo e tal segunda sequência codificando uma sequência de RNA estranha para a sequência de RNA alvo.

De acordo com o invento, também é proporcionada uma molécula de RNA ou DNA, tal molécula codificando uma ribozima conformacionalmente alterada do invento, tal pro-ribozima sendo activada pelo substrato, ou seja, tal pro-ribozima possuindo actividade neglígivel ou mesmo nenhuma de auto-clivagem ou de "splicing" em trans. até ser reactivada pela interacção específica com RNA alvo.

De acordo com o invento, é ainda proporcionada uma molécula de RNA ou DNA contendo uma cassete de expressão de 11- 11-

ribozima ou de pro-ribozima, tal cassete -senda ^capaz de ser mantida estavelmente num hospedeiro ou inserida no genoma de um hospedeiro e tal cassete proporcionando a sequência de um promotor capaz de funcionar em tal hospedeiro, operacionalmente ligado à sequência de uma ribozima ou pro-ribozima do invento.

De acordo com o invento, é ainda proporcionado um método para "splicing" em trans in vitro. tal método compreendendo os passos de (1) obtenção de uma ribozima ou pro-ribozima do invento e de um substrato adequado para tal ribozima ou pro-ribozima in vitro. (2) proporcionar ainda condições de reacção in vitro que promovam a actividade catalítica de tal ribozima ou pro-ribozima; e (3) permitir que tal ribozima ou pro-ribozima reaja com tal substrato em tais condições.

De acordo com o invento, é ainda proporcionado um método para "splicing" em trans in vivof tal método compreendendo os passos de (1) fornecimento de uma molécula de RNA ou DNA do invento a uma célula hospedeira, (2) expressão da ribozima ou pro-ribozima codificada por tal molécula em tal célula hospedeira, (3) expressão de um substrato de tal ribozima ou pro-ribozima em tal célula hospedeira e (4) deixar que tal ribozima ou pro-ribozima reaja com tal substrato em tal célula hospedeira.

De acordo com o invento, é ainda proporcionado um método para inactivação da actividade de RNA alvo, tal método compreendendo (1) obtenção de uma ribozima ou pro-ribozima do invento, tal ribozima ou pro-ribozima sendo cataliticamente activa contra tal RNA alvo, (2) obtenção de tal RNA alvo e (3) obtenção de condições que permitam que tal ribozima ou pro-ribozima expresse a sua actividade catalítica contra tal RNA alvo.

De acordo com o invento, é ainda proporcionado um método para fornecer uma sequência genética pretendida a uma célula hospedeira in vivo, tal método compreendendo (1) fornecimento de uma ribozima ou pro-ribozima do invento a uma célula hospedeira de interesse, tal ribozima ou pro-ribozima sendo cataliticamente activa contra um RNA alvo em tal célula hospedeira, (2) obtenção de tal ribozima ou pro-ribozima codificadora de tal sequência genética pretendida e (3) obtenção de condições que permitam que tal ribozima ou pro-ribozima faça "splicing" em trans da sequência genética pretendida para dar a sequência do RNA alvo.

De acordo com o invento, é ainda proporcionado um método para manipular a esterilidade masculina ou feminina em espécies importantes para a agricultura, tal método caracterizan-do-se pela fornecimento de uma ribozima ou rpo-ribozima do invento a uma célula com interesse de tal espécie, tal ribozima ou pró-ribozima sendo direccionada para qualquer RNA expresso numa célula necessário â fertilidade, tal ribozima ou pro-ribozima proporcionando uma sequência codificadora de um produto tóxico ao RNA sujeito a "splicing" em trans.

De acordo com o invento, é ainda proporcionado um método de modificação genética de plantas usadas em agricultura, tal método compreendendo a introdução numa célula germinal de tal planta de uma ribozima do invento, tal ribozima codificando uma sequência capaz de conferir tal modificação genética pretendida em tal planta.

De acordo com o invento, é ainda proporcionado um método de imunização de plantas, tal método compreendendo a construção de plantas transgénicas capazes de expressarem uma -13- -13-

ribozima de fusão específica para o patogénio vegetal do invento e tal ribozima sendo capaz de destruir ou inibir o patogénio.

De acordo com o invento, é ainda proporcionado um microorganismo resistente a patogénios, tal microorganismo sendo resistente a um patogénio com interesse, tal microorganismo sendo transformado com uma ribozima do invento e tal ribozima proporcionando uma actividade catalítica que direcciona uma molécula de ácido nucleico expressa por tal patogénio.

De acordo com o invento, é ainda proporcionado um patogénio virai capaz de libertar uma actividade ribozima pretendida para um hospedeiro com interesse, tal actividade de ribozima sendo libertada por uma ribozima do invento.

DESCRICÃO DAS FIGURAS A Figura 1 ê um diagrama do mecanismo de "splicing" por ribozimas de intrões do grupo I. A Figura 2 é um diagrama da estrutura (A) do intrão de rRNA Tetrahvmena thermonhila; (B) mRNA alvo e ribozima de "splicing” em trans. A Figura 3(A) é um diagrama da projecção de uma ribozima de "splicing" em trans de α-peptídeo CAT-LacZ; 3(B) é uma sequência de DNA completa da ribozima de CAT-LacZ. A Figura 4 representa as sequências das ribozimas de "splicing" em trans do RNA 4 do vírus do mosaico do pepineiro (CMV). A: sequências alvo de RNA virai; B: sequências de oligonu-cleótidos alvo; C: ribozimas de "splicing" em trans de CMV RNA4 -cadeia A da toxina da difteria. -14- -14-

A Figura 5 é uma comparaçao entre^ sèquências 3/4 do vírus do mosaico do pepineiro. A Figura 6 apresenta uma sequência parcial do DTA selvagem e mutantes de DTA 3' e de exão. A Fig. 6(C) é a sequência codificadora completa de uma ribozima Ga14-DTA com a substituição de isoleucina. A Figura 7 apresenta o fundamento lógico para a projec-ção de "ribozimas". As setas mostram sítios de clivagem por ribozimas, regiões "anti-codão" estão apresentadas a preto, domínios catalíticos estão apresentados com sombreamento radial e as sequências de "exão" 3' estão apresentadas com sombreamento ligeiro. Na ausência do mRNA alvo, as ribozimas de "splicing" em trans podem transitoriamente emparelhar e reagir com sequências heterólogas (incluindo as suas próprias). Adicionalmente ocorrerá clivagem na junção do exão 3'. Pro-ribozimas inactivas foram construídas para conterem sequências autocomplementares extra que causam enrolamento deficiente do centro catalítico da ribozima. As ribozimas activas são formadas apenas após emparelhamento com o mRNA alvo e consequente deslocamento da estrutura secundária interferente. A Figura 8 mostra a sequência e estrutura secundária prevista da ribozima de "splicing" em trans CAT-LacZ. As sequências centrias da ribozima estão a sombreado (segundo Cech, Gene 71:259-271 (1988)). As hélices P8 estão apresentadas para a ribozima não modificada e pro-ribozimas 1 e 2, com 13 e 18 nucleótidos, respectivamente, da sequência complementar da região "anti-codão" (realçado). A Figura 9 mostra (1) ribozima activa CAT-LacZ apresentada esquematicamente, com "anti-codão", domínio de ribozima com

sequências hélice P8 e "exão" 3'; (2) (a) pro-ribozima CAT-LacZ inactiva 2 mostrada com emparelhamento de bases entre sequências na hélice P8 modificada e a região "anti-codão"; e (b) a pro-ribo-zima activa, após emparelhamento de bases com o mRNA CAT, deslocamento do emparelhamento hélice P8 - "anticodão" e reformação da hélice P8. A Figura 10 mostra a estabilidade dos transcritos pro-ribozima CAT-LacZ. Os plasmídeos contendo as sequências da ribozima CAT-LacZ e pro-ribozimas foram clivados com EcoRX e transcritos usando RNA-polimerase de T7 ou SP6 e [32-P]UTP. Os transcritos marcados radioactivamente foram fraccionados por electroforese num gel de 5% de poliacrilamida em ureia 7M e 25% de formamida e submetidos a auto-radiografia. Os transcritos de ribozima sofreram hidrólise extensa, principalmente na junção do "exão 3,H. As formas de pro-ribozima foram marcadamente menos reactivas. A Figura 11 mostra a actividade de endorribonuclease das pro-ribozimas CAT-LacZ. Os plasmídeos contendo a ribozima CAT-LacZ e as sequências de pro-ribozima foram clivados com Saci e transcritos com RNA-polimerase de T7 ou SP6. Os transcritos foram incubados durante 30 minutos a 37°C, 45°C e 50°C em 40 mM Tris-HCl pH 7,5, 6 mM MgC^, 2 mM espermidina, 10 mM NaCl, 2 mM GTP com RNA de CAT marcado radioactivamente, transcrito usando RNA-polimerase de T7 a partir do plasmídeo cortado com Pvul. Os produtos foram fraccionados por electroforese em gel de 5% de poliacrilamida em 7M ureia e 25% de formamida e sujeitos a autorradiografia. A clivagem mediada por RNA do RNACAT de 173 nt (nucleótidos) produz fragmentos 5' e 3' de 76 nt e 97 nt, respec-tivamente. -16-

A Figura 12 mostra hélices P8 ·* selvagens" e modificadas usadas na projecção de pro-ribozimas com possíveis pares de bases indicados de forma esquemática. As bases que são complementares da fracção "anti-codão" da correspondente pro-ribozima, estão apresentadas a cheio. 0 número de bases complementares está apresentado a seguir a cada uma das hélices. As hélices estão ordenadas pela estabilidade dos correspondentes transcritos de pro-ribozima, conforme medido pelo grau de hidrólise do "exão 3'" durante transcrição in vitro. A Figura 13 mostra a estabilidade de pro-ribozimas GAL4-DTA. Os plasmídeos contendo as sequências de ribozima e pro-ribozima foram linearizados com Xhol e transcritos usando RNA-polimerase de T7. Os transcritos foram incubados durante 60 minutos a 50°C em Tris-HCl pH 7,5, 6 mM MgC^, 2 mM espermidina, 10 mM NaCl, l mM GTP, foram fraccionados por electroforese em gel de 5% de poliacrilamida em ureia 7M e 25% de formamida e sujeitos a autorradiografia. Os transcritos da ribozima foram extensivamente hidrolisados nestas condições, enquanto que a pro-ribozima 1 é menos e a pro-ribozima 2 é estável.

DESCRICÃO DETALHADA DAS REALIZAÇÕES PREFERIDAS I. Definições

Na descrição que se segue, uma série de termos usados na tecnologia de DNA recombinante (rDNA) foram extensivamente usados. Para proporcionar uma compreensão clara e consistente da especificação e reivindicações, incluindo o âmbito a ser dado a tais termos, são proporcionadas as definições que se seguem.

Ribozima. Uma molécula de RNA que possui inerentemente actividade catalítica. -17- -17-

Splicina em trans. Uma forma de manipulação genética pela qual uma sequência de ácido nucleico de um primeiro polinu-cleótido é ligado colinearmente ou inserido colinearmente na sequência de um segundo polinucleótido, de uma forma que retem a ligação fosfodiêster entre tais polinucleõtidos. or "splicing em trans "dirigido" ou splicing em trans "especifico de substrato" significa uma reacção de splicing em trans que requere uma espécie especifica de RNA como substrato para a reacção de splicing em trans (ou seja, uma espécie especifica de RNA em que se faz o splicing da sequência transposta). Splicing em trans dirigida pode ter como alvo mais de uma espécie de RNA se a ribozima se destinar a uma sequência alvo presente numa série seleccionada de RNAs. RNA alvo. Uma molécula de RNA que é um substrato para a actividade catalítica de uma ribozima do invento.

Cassete de expressão. Uma sequência genética que proporciona sequências necessárias para a expressão de uma ribozima do invento.

Estável. Por inserção "estável" de uma sequência num genoma pretende-se significar de forma a resultar na hereditariedade de tal sequência em cópias de tal genoma.

Ligação operacional. Uma "ligação operacional" é uma ligação em que uma sequência é ligada a uma outra sequência (ou sequências) de forma a ser capaz de alterar o funcionamento da sequência (ou sequências). Por exemplo, por ligação operacional de uma sequência codificadora de ribozima a um promotor, a expressão da sequência codificadora da ribozima é colocada soba influência ou controle daquele promotor. Duas sequências de ácido nucleico (tais como uma sequência codificadora de ribozima e uma Τ' -18-

sequência da região do promotor no extremo 5' da sequência codificadora) são referidas como estando operacionalmente ligadas se a indução da função do promotor resultar na transcrição da sequência codificadora de ribozima e se a natureza da ligação-entre as duas seqyuências não resulte (1) na introdução de uma mutação de alteração da grelha de leitura, (2) interferência com a capacidade das sequências reguladoras da expressão para dirigir a expressão de ribozima. Assim, uma região do promotor seria operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico se o promotor for capaz de efectuar a síntese daquela sequência de ácido nucleico. II. Manipulação da ribozima do invento

As ribozimas de "splicing" em trans. pro-ribozimas e métodos do invento proporcionam pela primeira vez uma ribozima capaz de fazer o "splicing" em trans de qualquer sequência de RNA, e especialmente em mRNA maduro (sem intrões) . A ribozima de "splicing" em trans como.aqui é descrito, com a sua complementaridade prolongada com o alvo, difere grandemente das actividades de endorribonuclease derivada de T. thermophila descrita em trabalhos publicados. A complementaridade adicional das ribozimas do invento confere maior afinidade e especificidade para o alvo e a complementaridade não é uma parte integral da actividade catalítica. Em adição, a clivagem ocorre eficazmente e de forma precisa na ausência de desnaturantes e em concentrações +4* elevadas de Mg

As linhas de orientação aqui descritas para a projecção de ribozimas de "splicing" em trans são conservativas, baseado nas propriedades bem caracterizadas dos intrões de "auto-splicing" do grupo I e pretende-se que proporcionem um esquema geral para a projecção de qualquer ribozima de "splicing" em trans dirigido. -19- -19-

Assim, as linhas de orientação aqui apresentadas não estão limitadas ao intrão do grupo I do pre-mRNA de T. thermophila e podem ser usadas pelos familiarizados com a matéria para a projecção de uma ribozima do invento com outros intrões do grupo I usando linhas de orientação conhecidas. A ribozima nativa de T. thermophila (a sequência de intrão) está situada desde a base 53 até à base 465 na sequência abaixo do rDNA extracromossómica de T. thermoph i1a: TGACGCAATT CAACCAAGCG CGGGTAAACG GCGGGAGTAA CTATGACTCT CTAAATAGCA ATATTTACCT TTGGAGGGAA AAGTTATCAG GCATGCACCT CCTAGCTAGT CTTTAAACCA ATAGATTGCA TCGGTTTAAA AGGCAAGACC GTCAAATTGC GGGAAAGGGG TCAACAGCCG TTCAGTACCA AGTCTCAGGG GAAACTTTGA CATGGCCTTG CAAAGGGTAT GGTAATAAGC TGACGGACAT GGTCCTAACC ACGCAGCCAA GTCCTAAGTC AACAGATCTT CTGTTGATAT GGATGCAGTT CACAGACTAA ATGTCGGTCG GGGAAGATGT ATTCTTCTCA TAAGATATAG TCGGACCTCT CCTTAATGGG AGGTAGCGGA TGAATGGATG CAACACTGGA GCCGCTGGGA ACTAATTTGT ATGCGAAAGT ATATTGATTA GTTTTGGAGT ACTCGTAAGG TAGCCAAATG CCTCGTCATC TAATTAGTGA CGCGCATGAA TGGATTA [SEQ ID NO.l] (Kan, N.C. et al.. Nucl. Acids Res. 10:2809-2822 (1982)). -20- -20-

Como aqui descrito, as ribozimas de "splicing" em trans dirigido do invento são manipuladas usando o nucleóide catalítico deste intrão. O intrão e o seu nucleóide catalítico pode ser isolado por métodos conhecidos. 0 núcleo catalítico do intrão, ou seja, o intrão truncado difere do intrão de tamanho completo apenas por ser truncado no sítio Seal. removendo assim os últimos cinco nucleótidos do intrão. O RNA do intrão truncado pode ser preparado por técnicas conhecidas ou pode ser adquirido comercialmente em "kits" comerciais tais como por exemplo o produto

TM #72000 da US Biochemical, Cleveland, OH (kit RNAzyme Tet 1.0). Este kit da US Biochemical proporciona ribozima e o protocolo para a utilização da ribozima. 0 cDNA Tet.l transcrito pode ser usado como substrato para a mutagénese por reacção em cadeia com polimerase (PCR) como descrito abaixo para produzir uma enzima de "splicing" em trans sintética. A especificidade do substrato da ribozima do invento, ou seja, a capacidade da ribozima para o "alvejar” um RNA específico como substrato, é conferida fundindo sequências complementares específicas com o RNA alvo (substrato) com o o extremo 5' da ribozima. A especificidade de "splicing" em trans dirigido da ribozima do invento, ou seja, especificidade em "splicing" trans de uma sequência estranha com interesse com a sequência de um RNA alvo, é conferida proporcionando um novo exão 3' no extremo 3' da ribozima. Detalhes da projecção são fornecidos abaixo.

Para alterar as propriedades estruturais e catalíticas dos intrões do grupo I, as sequências de exão substituem as sequências flanqueantes de tais intrões de forma que apenas o nucleóide catalítico do intrão, a ribozima, permanece. A ribozima modificada resultante pode interactuar com RNAs substrato em -21- -21-

trans. Quando as formas truncadas do intrão (i.e., o "nucleóide" catalítico, i.e. truncado no sítio Seal, removendo os cinco últimos nucleótidos do intrão) são incubadas com sequências correspondendo à junção de "splicing" 5' da ribozima nativa, o sítio sofre clivagem dependente de guanosina simulando o primeiro passo do "splicing". A manipulação das ribozimas do invento requere a consideração de quatro quatro linhas gerais que se seguem.

Primeiro, um sítio de "splicing" deve ser escolhido dentro do RNA alvo. No complexo final de "splicing” em trans. apenas a fraeção 5' do duplex PI é contribuída pelo RNA alvo. Apenas um único resíduo conservado, uracilo, ê necessário imediatamente 5' relativamente ao sítio de "splicing" pretendido. Esta e a única necessidade em termos de sequência no RNA alvo. Não existe uma estrutura inata necessária para o RNA alvo. 0 RNA maduro pode sevir de alvo e a reacção de "splicing" em trans realizada no citoplasma das células em vez de no núcleo (contra pre-mRNA). Isto evita a necessidade de concentrações elevadas de ribozima no núcleo da célula.

Segundo, tendo escolhido uma sequência alvo particular, devem ser adicionadas alterações de sequência compensadoras à secção 5' da ribozima de forma a permitir a formação de uma hélice PI adequada entre os RNAs alvo e da ribozima. Pretende-se que a héklice PI contenha um par de bases U:G no sítio de "splicing" 5' e e que esteja colocada na posição 4, 5 (preferida) ou 6 a partir das bases da hélice (Doudna, J.A., et al.. "RNA Structure, Not Seqyuence Determines The 5' Splice-Site Specificity of a Group I Intron," Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 7402-7406 (1989), aqui incluido como referência). Para o intrão nativo de T. thermonhi1a. PI prolonga-se mais 3 pares de bases -22-

para além do sítio de "splicing" pretendido e numa realização preferida, isto é mantido na ribozima de '•splicing" em trans do invento. Para o "splicing" em trans ser eficiente, os RNAs substrato e do intrão endorribonucleolítico devem emparelhar para formar a hélice PI resultando num emparelhamento frágil U:G. A clivagem do rna alvo ocorre na ligação fosfodiéster imediatamente 3' (após) relativamente ao par de bases U:G. Comparações filoge-néticas e análises de mutações indicam que a natureza das sequências imediatamente adjacentes ao resíduo uracilo no sítio de "splicing" não são importantes para a catálise, desde que seja mantido o emparelhamento da hélice Pl.

Terceiro, as sequências de exão flanqueando o sítio de "splicing" 3' deve ser escolhido e feitos os ajustamentos na secção 5' da ribozima, se necessário, para permitir a formação de uma hélice Pio estável. Se bem que a hélice PIO possa ser dispensada se necessário, a sua presença aumenta o "splicing" e realizações preferidas da ribozima do invento retêm a hélice PIO (Suh, E.R. et al. . "Base Pairing Between The 3' Exon And An Internai Guide Sequence Increases 3' Splice Site Specificity in the Tetrahvmena Self-Splicing rRNA Intron", Mol. Cell. Biol. 10-:2960-2965 (1990)). As hélices Pl e PIO sobrepoem-se ao longo do intrão IGS de T. thermophila e os 22 e 32 resíduos a seguir aos sítios de "splicing" 5' e 3' são complementares dos mesmos resíduos no IGS (Figura 2). Se bem que possa haver alguma vantagem em seguir isto, muitos intrões do grupo I naturais não partilham esta restrição, assim, a escolha das sequências de exão 3' pode ser determinado principalmente por considerações experimentais. Tais considerações refletem a larga flexibilidade na escolha de sítios de "splicing". Por exemplo, caso se pretenda ligar duas sequências num dado ponto, a sequência em tal ponto não pode ser mutagenizada ou de outra forma alterada pelo acontecimento de "splicing" em trans. Pl ou PIO podem ser encurtados se η -23-

as sequências sobreponíveis não acomodarem o sítio de "splicing" pretendido.

As necessidades em termos de sequências para a selecção do sítio de "splicing" 3' parece residir principalmente dentro da estrutura do próprio intrão (a ribozima), incluindo a hélice P9.0 e o resíduo guanosina 3' adjacente que delimita a fronteira 3' do intrão. P9.0 está todo contido dentro das sequências do intrão e ajuda a definir o sítio de "splicing" 3' adjacente . Para a projecção do "splicing" em trans. a hélice P9.0 e o resto dos elementos de RNA funcionais dentro do intrão não estão alterados. As características estruturais da hélice P9.0 são conhecidas (Michel, F. et al. . "The Guanosine Binding Site of the Tetrahvmena Ribozyme," Nature 342:391-395 (1989)). No entanto, as sequências flanqueantes dentro do exão 3' são necessárias para a formação da hélice PIO e "splicing" eficaz, como se mostra por análise mutacional.

Quarto, uma região de sequência complementar é colocada no extremo 5' da ribozima de "splicing" em trans para aumentar a sua afinidade e especificidade para o RNA alvo. As sequências envolvidas em complementaridade não confinam imediatamente com as sequências envolvidas na formação da hélice PI mas estão separadas por exemplo, por cinco nucleótidos também envolvidos na formação de PIO. Como se mostra aqui, foi usado um comprimento arbitrário de cerca de 40 resíduos. Podem ser usados outros comprimentos desde que não sejam prejudiciais para o efeito pretendido.

Por exemplo, começando com o intrão de auto-"splicing" de T. thermophi1a (esquematizado abaixo): 1

5' PI UAGCAA

.........CUCUCUAAA U

* * A

........GGGAGGUUUCCAUUU nucleóide da ribozima. . . . GUAAGGUA . . .3'

PIO 2 (Os "l" e ,,2" no diagrama acima (noutros esquemas de ribozimas ao longo do pedido de patente) significam o primeiro e segundo sítios de "splicing”, respectivamente.) (1) um sítio "5'" é escolhido adjacente ao resíduo uracilo dentro de um RNA alvo escolhido; (2) sequências complementares do RNA escolhido são fundidas com a fracção 5' do intrão do grupo I de auto-"splicing". O emparelhamento de bases entre a ribozima e o RNA alvo permitem a formação da hélice Pl; (3) as sequências escolhidas de "exão 3'·· são fundidas à fracção 3' da ribozima, amntendo a hélice PIO conservada; e (4) para aumentar a afinidade para o RNA alvo, caso se pretenda, uma secção da sequência complementar prolongada é fundida com a fracção 5' da ribozima para permitir a formação de 3040 pares de bases. O alinhamento da ribozima de "splicing·' em trans com este RNA alvo pode ser esquematizada como se mostra imediatamente abaixo. A sequência de RNA alvo representa a linha -25-

de cima. A sequência de ribozima está alinhada abaixo dela, uma sequência contínua envolvendo as duas linhas inferiores em que a hibridação dos nucleótidos nos extremos 5' e 3' e PI e PIO, da ribozima, pode ser observada.

ιη ο Ώ -27-

De acordo com o invento, as ribozimas de "splicing" em trans podem ser projectadas de forma a fazer "splicing" em trans de essencialmente qualquer sequência de RNA em qualquer RNA alvo. Não é necessário que que o alvo contenha uma sequência de intrão ou que a ribozima seja um intrão na sequência alvo. Por exemplo, uma estratégia para tal projecção pode incluir (1) a identificação do RNA alvo pretendido (2) clonagem e/ou sequenciação do RNA alvo pretendido ou fracção dele (3) selecção de uma sequência codificadora com interesse para "splicing" em trans do RNA alvo, (4) a construção de uma ribozima do invento capaz de hibridar com tal alvo usando as linhas gerais aqui descritas e (5) confirmação de que a ribozima do invento utilizará o alvo como substrato para a reacção de "splicing" em trans específica que se pretende e (6) a inserção da ribozima na célula hospedeira pretendida. A escolha de um RNA alvo refletirá o fim pretendido da reacção de "splicing" em trans. Se a finalidade da reacção é inactivar um RNA específico, então tal RNA deve sofrer "splicing" em trans numa posição que destrói todos os domínios peptídicos funcionais codificados por tal RNA e numa posição que não resulta na expressão continuada das sequências genéticas indesejáveis. Se existir mais de um alelo do gene codificador de tal RNA, a ribozima deverá preferencialmente ser projectada de forma a inactivar o RNA alvo num sítio comum a todos os alelos expressos. Como alternativa, pode ser fornecida â célula mais de uma ribozima, cada uma delas destinada a inactivar uma forma alélica específica do RNA alvo.

Quando se pretende apenas a inactivação do RNA alvo e não a expressão de uma nova sequência de RNA pretendida não é necessário que o RNA estranho dado pela ribozima proporcione uma sequência capaz de ser traduzida pela célula hospedeira e uma sequência contendo codões de paragem da tradução pode ser usada -28-

como intrão truncado, por exemplo, a ribozima do intrão truncada no sítio Seal.

Se a finalidade da reacção de "splicing" em trans é proporcionar uma característica genética a uma célula hospedeira, então a escolha do RNA alvo refletirá o padrão de expressão pretendido da característica genética. Caso se pretenda que a característica genética seja expressa continuamente pelo hospedeiro, então o RNA alvo deverá também ser continuamente expresso. Caso se pretenda que a característica genética seja selectivamen-te expressa apenas sob uma condição de crescimento, hormonal ou ambiental pretendida, então o RNA alvo deverá também ser expresso selectivamente em tais condições. Não é necessário que a expressão da própria ribozima seja selectivamente limitada a uma condição pretendida de crescimento, hormonal ou ambiental se o substrato de tal ribozima não estiver presente no hospedeiro pois a própria ribozima não é traduzida pelo hospedeiro. Assim, as sequências codificadas pelo RNA fornecido pela ribozima do invento não são traduzidos até o "splicing" em trans ocorrer e tal acontecimento pode ser controlado pela expressão do substrato da ribozima no hospedeiro.

Caso se pretenda, a expressão da ribozima pode ser manipulada para ocorrer como resposta aos mesmos factores que induzem a expressão de um alvo regulado ou a expressão da ribozima pode ser manipulada para proporcionar um nível adicional de regulação de forma a limitar a ocorrência do "splicing" em trans às condições sob as quais tanto a ribozima como o alvo são selectivamente induzidas na célula, mas por factores diferentes, a combinação daqueles factores sendo o caso indesejável. Tal regulação permitirá que a célula hospedeira expresse o alvo da -29- -29-

, - > ribozima nas condições em que a própria ribozimà' não era coexpres sa. A sequência do domínio da ribozima que hibrida com o RNA alvo é determinada pela sequência do RNA alvo. A sequência do RNA alvo é determinada após clonagem das sequências codificadoras de tal RNA ou após sequenciação de um peptídeo codificador de tal alvo e dedução de uma sequência de RNA que codifique tal peptídeo. As técnicas de clonagem conhecidas podem ser usadas para a clonagem de uma sequência codificadora de um RNA alvo. A selecção de uma sequência com interesse a ser sujeita a "splicing" em trans no RNA alvo (aqui designada a "sequência de "splicing" em trans") reflectirá a finalidade do "splicing" em trans. Caso se pretenda um caso de "splicing" em trans que não resulte na expressão de uma nova sequência genética, então a sequência que sofreu "splicing" em trans não necessita de codificar uma sequência proteica susceptível de ser traduzida. Se se pretender um caso de "splicing" em trans que não resulte na expressão de uma nova sequência genética e especialmente uma nova sequência peptídica ou proteica, então a sequência de "splicing" em trans pode ainda fornecer codões de paragem da tradução e outra informação necessária ao processamento correcto da tradução do RNA na célula hospedeira. Caso se pretenda um produto proteico específico como resultado do caso de "splicing" em trans. então será necessário manter a grelha de leitura dos aminoácidos na fusão resultante. A identificação e confirmação da especificidade de uma ribozima do invento é feita testando uma capacidade de ribozima putativa em catalizar a reacção pretendida de "splicing" em trans na presença da sequência alvo com interesse. A reacção de "splicing" em trans não deverá ocorrer se as únicas sequências de -30-

RNA presentes forem sequências não alvo às quais a ribozima não deve responder (ou responder menos). Tal caracterização pode ser realizada com a ajuda de uma marca de forma que é mais facilmente controlada a actividade de ribozima correcta (ou incorrecta). Na maior parte dos casos é suficiente testar a ribozima contra o seu alvo com interesse in vitrod e depois usada para transformar uma célula hospedeira para o estudo dos seus efeitos in vivo.

Quando se pretende eliminar um RNA do hospedeiro tal eliminação deverá ser tão completa quanto possível. Quando se pretende proporcionar uma nova sequência genética a uma célula hospedeira, a reacção de "splicing" em trans do invento não necessita de ser completa. Constitui uma vantagem do invento que, dependendo da actividade biológica do peptídeo que é traduzido a partir de tal sequência genética, a ocorrência de "splicing" em trans pode de facto ser muito ineficaz, desde que ocorra "splicing" em trans suficiente e portanto o polipeptídeo codificado ao hospedeiro para o fim pretendido. A transcrição da ribozima do invento numa célula hospedeira ocorre após introdução do gene da ribozima na célula hospedeira. Caso não se pretenda a retenção estável da ribozima pela célula hospedeira, tal ribozima pode ser química ou enzimati-camente sintetizada e dada â célula hospedeira por métodos mecânicos, tais como microinjecção, transfecção mediada por lipossomas, electroporação ou precipitação com fosfato de cálcio. Como alternativa, quando se pretende a retenção estável do gene codificador da ribozima, tal retenção pode ser conseguida inserindo estavelmente pelo menos uma cópia de DNA da ribozima num plasmídeo que é retido estavelmente pela célula hospedeira.

De preferência a ribozima do invento é inserida no cromossoma da célula hospedeira como parte de uma cassete de 31- expressão, tal cassete de expressão proporcionando elementos reguladores da transcrição que controlarão a transcrição da ribozima na célula hospedeira. Tais elementos podem incluir, mas não necessariamente estão limitados a um potenciador ou elemento UAS e um sinal terminador da transcrição. A poliadenilação não é necessária pois a ribozima não é traduzida. No entanto, tais sinais de poliadenilação podem ser proporcionados em ligação com a sequência codificadora do elemento a ser sujeito a "splicing" trans. A expressão de uma ribozima cuja sequência codificadora foi estavelmente inserida num cromossoma do hospedeiro é controlada pela sequência do promotor que está operacionalmente ligada âs sequências codificadoras da ribozima. 0 promotor que dirige a expressão da ribozima pode ser qualquer promotor funcional na célula hospedeira, sendo desejáveis promotores procarióticos em células procarióticas e promotores eucariôticos em células eucariõticas. Um promotor é composto por módulos discretos que dirigem a activação e/ou repressão da transcrição do promotor na célula hospedeira. Tais módulos podem ser misturados e combinados no promotor da ribozima de modo a proporcionar a expressão correcta da ribozima no hospedeiro. Um promotor eucariótico pode ser qualquer promotor funcional em células eucarióticas e especialmente pode ser qualquer um com especificidade par RNA-polime-rase I, II ou III. Caso se pretenda expressar a ribozima numa larga variedade de células hospedeiras eucarióticas, deve ser seleccionado um promotor funciopnal na maior parte das células hospedeiras eucarióticas, como seja um promotor de rRNA ou de tRNA, ou o promotor de um mRNA largamente expresso como seja o promotor de um gene de actina ou um gene glicolítico. Caso se pretenda expressar a ribozima apenas num certo tipo de célula ou tecido, devem ser seleccionados elementos de promotor -32- -32-

específicos de uma célula (ou específicos de um tecido) · funcionais apenas naquele tipo de célula ou tecido. A reacção de "splicing" trans é quimicamente a mesma caso seja realizada in vitro ou in vivo. No entanto, in vivo, uma vez que os cofactores geralmente já estão presentes na célula hospedeira, a presença do RNA alvo e da ribozima serão suficientes para resultar em "splicing" trans.

As realizações acima descritas também se aplicarão à construção de pro-ribozimas. Uma ribozima de "splicing" trans, como descrita atrás, consiste em três elementos de sequência fundidos - uma região "anti-codão" 5' que é complementar do RNA alvo, a região catalítica que se baseia num intrão de suto-"splicing" do Grupo I e sequências de exão 3'. A região 5' pode emparelhar com o RNA alvo escolhido, para o colocar na proximidade de sequências catalíticas do intrão do Grupo I. A estrutura de intrão do Grupo I proporciona um ambiente químico adequado à catálise de "splicing" especifico do RNA alvo com as sequências de "exão" 3'. No entanto, na ausência de RNA alvo adequado, as sequências de ribozima podem ainda catalizar a separação na junção do "exão" 3' (hidrólise semelhante é observada para os intrões de auto-"splicing" do Grupo (Zaug et al.. Science 231;470-475 (1986)) e pode ser capaz de catalizar casos de "splicing" ilegítimos" através de emparelhamento transitórios da ribozima com sequências de RNA heterólogo (que podem incluir as suas próprias). Tais reacções secundárias e casos de "splicing" ilegítimo são indesejáveis e podem ser prejudiciais. Por exemplo, se se pretende usar "splicing" trans para a libertação condicionada de uma toxina in vivo. "splicing" trans ilegítimo pode resultar na expressão inesperada da actividade tóxica. A clivagem espontânea da junção do exão 3' baixaria a eficácia do "splicing" trans.

Para ajudar a evitar estes problemas, foram construídas formas de "pro-ribozima" dos RNAs de "splicing" trans em que é destruída uma hélice conservada (por exemplo, hélice P8). As pró-ribozimas foram construídas para conterem sequências extra de auto-complementaridade que provocam enrolamento errado do centro catalítico da ribozima. As pro-ribozimas são inactivas na ausência do RNA alvo de interesse; as formas activas são apenas formadas após emparelhamento dos RNAs da ribozima e alvo - com consequente deslocamento da estrutura secundária interferente dentro da ribozima. As pró-ribozimas destinam-se a ser espécies cataliticamente inertes na ausência do RNA alvo, para eliminar auto-clivagem indesejável e reacções de "splicing" trans ilegítimas in vitro e in vivo (Figura 7).

As pró-ribozimas descritas aqui estão com uma conformação inadequada e portanto são formas inactivas das actividades de "splicing" trans. Assim as pró-ribozimas possuem pouca actividade de auto-clivagem. Elas são apenas reactivadas pela interacção específica com o RNA alvo e assim são ribozimas activadas pelo substrato que são menos susceptíveis à catálise de "splicing" trans de um RNA alvo sem interesse. As ribozimas de "splicing" trans destinam-se a ser usadas para a libertação de novas actividades de genes in vivo e é desejável e pode ser necessária qualquer redução no grau de reacções secundárias indesejáveis ou de "splicing" ilegítimo.

Se bem que a disrupção da hélice P8 tenha sido exemplificada aqui para as pro-ribozimas de "splicing" trans, podem também ser usadas que sejam necessárias para actividade catalítica. A mesma abordagem, de destruição da conformação de uma estrutura cataliticamente importante de forma a que apenas o -34- -34-

emparelhamneto com o RNA substrato de interesse permita a formação de uma ribozima activa, poderá ser aplicada à projecção de outras ribozimas. Por exemplo, a sequência da ansa de uma endor-ribonuclease do tipo "cabeça de martelo" (Haseloff et al.. Nature 334:585-591 (1988)) poderá ser prolongada e tornada complementar de um dos braços "anti-codão" da ribozima - semelhante à modificação acima da hélice P8. A actividade de endorribonuclease será apresentada apenas após emparelhamento com o RNA alvo escolhido, deslocamento da estrutura secundária incorrecta e reformação da estrutura em ansa necessária para a catálise. Isto aumentaria eficazmente a especificidade da ribozima para o seu alvo.

Em adição, a activação de uma prõ-ribozima não se baseia no emparelhamento de bases com o próprio substrato. Em vez disso, um terceiro RNA ou ssDNA ou mesmo proteína escolhido poderá ser necessário à actividade. Mais um emparelhamento ou interacção RNA-proteína seria necessário para a formação de um complexo de ribozima activoa. A disponibilidade de tais componentes adicionais determinará a actividade da ribozima e poderá ser usada para alterar a selectividade da ribozima.

As ribozimas de "splicing" trans. pro-ribozimas e métodos do invento são úteis na produção de uma actividade de gene útil para a modificação genética de células alvo. Por exemplo, a reacção de "splicing" trans do invento é útil para introduzir uma proteína com propriedades tóxicas numa célula pretendida, A susceptibilidade das células será determinada pela escolha do RNA alvo e dos controles reguladores que ditam a expressão da ribozima. Por exemplo, uma ribozima ou pro-ribozima que transpõe uma sequência de RNA codificadora de uma proteína tóxica pode ser manipulada de forma a que a expressão da ribozima ou pró-ribozima dependerá das características de um promotor operacionalmente ligado. Numa realização altamente preferida, o -35- -35-

peptídeo A da toxina da difteria é codificado pela parte da ribozima sujeita a "splicing" trans num alvo pretendido no hospedeiro. A expressão condicionada da ribozima e do peptídeo A da toxina da difteria resulta na morte da célula hospedeira. Outras toxinas peptídicas potencialmente úteis incluem ricino, exotoxina A e timidina-cinase de herpes (Evans, G.A., Genes Dev. 2:259-263 (1989)). Em adição, várias enzimas líticas possuem o potencial de perturbar o metabolismo celular. Por exemplo, pode ser usada uma ribonuclease de fungos para provocar esterilidade de machos em plantas (Mariani, C. et al. . Nature 347:737-741 (1990)). Tecidos particulares podem ser destruídos devido a expressão limitada do RNA alvo. Ainda, se se usar um RNA virai como alvo, podem ser conseguidas novas formas de resistência a vírus ou terapias. A ribozima ou pro-ribozima do invento pode ser introduzida em qualquer célula hospedeira, procariótica ou eucarióticae especialmente numa célula hospedeira vegetal ou de mamífero, em cultura ou in vivo, usando técnicas conhecidas adequadas a tais hospedeiros. A ribozima ou pro-ribozima do invento pode ser também manipulada para destruir vírus. Numa realização, a ribozima ou pro-ribozima do invento é proporcionada de uma forma geneticamente estável a uma célula hospedeira antes do ataque" virai. A infecção pelo vírus adequado ou xpressão do vírus latente em tal célula hospedeira, (resultando no aparecimento do RNA alvo da ribozima ou pro-ribozima na célula hospedeira), estimulará à actividade catalítica da ribozima e destruição do RNA virai alvo e/ou produção de uma toxina via "splicing" trans resultando na morte da célula infectada pelo vírus. Numa outra realização, a ribozima ou pro-ribozima pode ser manipulada e encapsidada no próprio vírus, tais realizações serão especifica-mente úteis na projecção de vítus para fins de investigação, em que a ribozima ou pro-ribozima pode ser projectada para destruir -36- -36-

a função de um RNA virai específico e portanto permite o estudo da função virai na ausência de tal RNA. Os vírus portadores de ribozimas ou de pró-ribozimas podem também ser usados como veículos para transfectar células hospedeiras com uma actividade de ribozima ou pro-ribozima pretendida. A esterilidade masculina ou feminina pode ser conseguida em espécies importantes para a agricultura usando as ribozimas ou pró-ribozimas do invento. Por exemplo, a esterilidade masculina em tabaco pode ser conseguida direccionando mRNATA2 9 ou TA13 (genes específicos das anteras do tabaco; Seurinck, J. et al., Nucl. Acids Res. 18: 3403 (1990) com uma ribozima ou pro-ribozima do invento que faz o "splicing" trans do exão 3' DTA para aqueles alvos. A forma de plantas cultivadas pode ser manipulada por destruição selectiva ou modificação de tecidos usando as ribozimas ou pro-ribozimas do invento. Por exemplo, pode-se fazer frutos sem sementes através do direccionamento do mRNAda proteína de armazenamento da semente com uma ribozima ou pro-ribozima do invento que faz o "splicing" trans do exão 3' DTA para o alvo.

As plantas transgénicas podem ser protegidas conmtra a infecção por expressão de ribozimas ou pro-ribozimas específicas de vírus para matar as células infectadas. Isto seria uma forma artificial de "resposta hipersensível". Por exemplo, o mRNA da proteína do invólucro do vírus do mosaico do pepineiro pode ser direcionado com uma ribozima ou pro-ribozima do invento que faz o "splicing" trans do exão 3' DTA para o alvo.

Populações de microorganismos podem ser tornadas resistentes a patogénios específicos pela introdução de ribozimas ou pro-ribozimas de "splicing" trans. Por exemplo, as bactérias -37-

Λ \ que fazem ο queijo podem ser tornadas resistentes â infecção por fagos através do direcionamento do RNA fágico com um gene de toxina bacteriana ou enzima lítica codificada pelo exão 3' proporcionado pela ribozim,a ou pro-ribozima do invento, por exemplo, que interferisse com a replicação do fago causando lise prematura após infecção com o fago.

Podem ser construídos patogénios virais para libertar actividades tóxicas via "splicing" trans. Desta forma, tipos celulares específicos podem ser direccionados para ablação como seja no caso de cancro ou terapia virai. Por exemplo, mRNA de HIV pode ser direccionado por uma ribozima ou pro-ribozima do invento que é portadora do exão 3' DTA, para libertação com vírus ou com lipossomas.

Os exemplos abaixo têm fins ilustrativos e não pretendem limitar o âmbito do invento.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Construção e caracterização de uma ribozima de “splicing” trans CAT-LacZ I. Amplificação por PCR e clonagem da ribozima do invento

Seguindo as directivas descritas atrás, projectou-se uma ribozima de "splicing" trans de fusão que fará o "splicing" de um segmento da sequência codificadora do extremo amina do mRNA da β-galoctosidase de E. coli (LacZ) para um sítio no mRNA da cloranfenicol-acetil-transferase (CAT) (Figura 3). As secções da -38-

nova sequência flanqueando o centro da ribozima- de T. thermoohila e o exão 3' foram sintetizadas como oligonucleótidos. A sequência de ribozima intacta foi então montada por reacções sucessivas em cadeia com polimerase, usando oligonucleótidos sintéticos adaptadores como iniciadores com moldes de ribozima e de β-galactosidase (se bem que haja outro métodos, este é o mais conveniente).

Para a construção de uma ribozima capaz de fazer o "splicing" da sequência codificadora do peptídeo a da B-galactosi-dase (LacZ) para um sítio na sequência codificadora 5' da cloranfenicol-acetil-transferase (CAT) sintetizaram-se três oligonucleótidos.

Oligonucleótido 1 5'- GGCCA AGCTT CTTTA CGATG CCATT GGGAT ATATC AACGG TGGTA TAAAC CCGTG GTTTT TAAAA GTTAT CAGGC ATGCA CC-3' [SEQ ID NO. 2]

Oligonucleótido 2 5'- GATTA GTTTT GGAGT ACTCG TACGG ATTCA CGGCC GTCGT TTTAC AA -3' [SEQ ID NO. 3]

Oligonucleótido 3 5' - GGCCGH AATTC TTACA ATTTC CATTC AGGCT GCGCA ACTGT TGG - 3' [SEQ ID NO.4]

Os oligonucleótidos 2 e 3 (200 pmoles de cada) foram combinados com 0,1 μg de DNA de pGEM4 cortado com PvuII (o qual continha a sequência do peptídeo a de LacZ) e sujeito a amplificação por PCR num volume de 100 μΐ contendo: 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl pH 8,3,

1,5 mM MgCl2, 0,4 mM dNTPs, 0,1% gelatina e 5 D de DNA-polimerase Taql. e incubado durante 30 ciclos, 1 minuto a 94°C, 2 minutos a 50°C, 2 minutos a 72°C. O plasmídeo pGEM4 pode ser adquirido comercialmente à Promega Corporation, Madison WI, USA. O produto amplificado de 210 pares de bases foi purificado usando electroforese em agarose de ponto de gelificação baixo e foi usado como iniciador num segundo ciclo de amplificação por PCR.

Após o segundo ciclo de amplificaçãopor PCR, 2,0 /ig do produto de 210 pares de bases amplificado, 200 pmoles de oligonu-cleõtido 1 e 0,1 jLtg do fragmento de 450 pares de bases contendo IVS de T. thermophila foram misturados e sujeitos a amplificação por PCR usando as condições mostradas atrás. O produto resultante de 660 pares de bases foi digerido com as endonucleases de restrição EcoRI e HindIII e clonado no vector plasmídeo pGEM4. A sequência completa do DNA da ribozima do peptídeo a de CAT-LacZ está apresentada como SEQ ID NO. 5 e na Figura 3B. 0 vector de clonagem contendo as sequência clonadas foi usado para teansformar e propagado no hospedeiro bacteriano XLl/Blue (Stratagene, La Jolla, Califórnia) , usando técnicas conhecidas (Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Guide, 2§ edição, 1989 Cold Spring Harbor Laboratory, Publishers). No entanto, pode ser usado qualquer hospedeiro bacteriano capaz de manter estavelmente o vector, por xemplo, o JM109. -40- -40-

0 plasmídeo pode ser extraído da célula hospedeira para posterior análise usando técnicas normalmente conhecidas (Maniatis, Molecular cloninq. A Laboratorv Guide. edição, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, Publishers). II. Transcrição in vitro dos RNAs clonados da ribozima e alvo

Usando processos convencioanis, as sequências clonadas foram purificadas a partir do hospedeiro bacteriano e o plasmídeo linearizado usando uma endonuclease de restrição que não corta a sequência da ribozima (por exemplo, EcoRI), e transcritos usando RNA-polimerase de T7 num volume de 100 μΐ, contendo: 5 )Lig de DNA de plasmídeo linearizado, 40 mM Tris-HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 2 mM espermidina, 10 mM NaCl, 10 mM DTT, 32 1 mM NTPs (contendo 20 μΟι de [a- P]UTP, caso se pretenda transcritos de RNA marcados), 100 U de RNasina e 50 U de RNA-polimerase de T7, e a reacção foi incubada a 37°C durante 2 horas.

Os transcritos de RNA foram purificados por electrofore-se em gel de 5% de poliacrilamida antes de usar (TBE, gel com ureia 7M) . Os RNAs contendo sequências IVS activas de T. thermophila sofrem cisão espontânea na junção intrão exão 3' durante a transcrição. Os fragmentos foram removidos por purificação electroforética para maior clareza de análise durante subsequentes ensaios de "splicing" trans -41- -41-

III. Condições de Rreaccão de "splicing" trans in vitro

Alvo e/ou ribozimas de "splicing" trans foram incubadas nas condições que se seguem: 0,1 μg-0,5 μg do componente RNA (quantidade que depende do tipo de experiência, geralmente ribozima em excesso de 5 vezes relativamente ao alvo), 30 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 2 mM GTP, 5 mM MgCl2, num volume de 5 μΐ a 42°C, 60 minutos. A reacção foi iluida com 95 μΐ de 0,1 mM Na EDTA, 200 mM NaCl e precipitado com etanol. Os RNAs foram então analisados em géis de 5% de poliacrilamida contendo tampão TBE, ureia 7M e 25% de formamida e sujeitos a autorradiografia. IV. Ensaio de actividade endonucleolítica

Apõs emparelhamento de bases da ribozima e alvo, o primeiro passo no "splicing" trans é a clivagem mediada por guanosina do RNA alvo no sítio de "splicing” 5' pretendido. O emparelhamento e "splicing" trans podem ser realizados num tampão como seja 30 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 2 mM GTP a 42°C, Uma vez que o sítio de "splicing" 3' é dispensável para esta reacção, as ribozimas truncadas de "splicing" trans devem comportar-se como endorribonucleases altamente específicas. Para testar esta actividade, transcritos encurtados in vitro da ribozima de "splicing" trans do peptídeo α de CAT-LacZ descrito atrás (SEQ ID NO. 5 e Figura 3) foram incubados com sequências de mRNA de CAT. A cassete de ribozima CAT-LacZ é um fragmento HindiII-EçoRI. 0 sítio de clivagem Seal marca uma posição 5 bases -42-

a montante do sítio de "splicing" 3'. A ribozima especificamente clivou o RNA alvo no único sítio esperado para produzir os fragmentos de tamanho esperado. V. Reaccão de "splicing" trans

Para confirmar a capacidade da ribozima do peptídeo α de CAT-LacZ para catalizar a ligação das sequências de exão 3' no sítio de "splicing" 5', várias formas foram incubadas com RNA de CAT marcado radioactivamente. Os transcritos de ribozima foram sintetizados a partir de moldes de DNA os quais tinham sido truncados numa de várias posições, variando entre o extremo do nucleõide dà ribozima e a sequência do exão. A incubação com CAT marcado condiziu à formação dos produtos de "splicing" esperados, os quais diferiram em comprimento dependendo do tamanho da sequência exão 3'.

Em adição, uma certa proporção das moléculas de ribozima do peptídeoa de CAT-LacZ sofreram clivagem espontânea no sítio de "splicing" 3' durante transcrição in vitro. semelhante ao intrão de T, thermophi1a Estas formas clivadas terminaram no resíduo guanina adjacente ao sítio de "splicing" 3', foram também incubadas com RNA de CAT. Neste caso, a própria ribozima foi ligada a uma fracção 3' do RNA de CAT, para produzir um produto de aproximadamente 550 nucleótidos de tamanho. Esta reacção é semelhante à auto-circularização do intrão intacto e o mesmo produto de ligação é encontrado nas outras reacções de "splicing" trans. -43- VI. Precisão_do_"splicing"_trans

Os produtos de uma reacção de "splicng" trans do peptídeo a de CAT-LacZ foram sujeitos a tratamento com transcrip-tase reversa e amplificados por reacção em cadeia com polimerase usando dois oligonucleótidos complementares de sequências de ambos os lados dos sítios de "splicing" previstos. As sequências amplificadas foram clonadas e sequenciadas. Recombinantes individuais não apresentaram variação relativamente â sequência esperada dos produtos sujeitos a "splicing". Conforme encontrado em estudos com intrão intacto, "splicing" parece ser altamente preciso.

Assim, os estudos atrás mostraram que uma ribozima de "splicing" trans projectada de acordo com as directivas do invento é capaz de fazer "splicing" eficaz in vitro.

Exemplo 2

Proieccão de uma ribozima de "splicing" trans que proporciona resistência a vírus de plantas 0 vírus do mosaico do pepineiro (CMV) é um vírus pandémico com um grande número de estirpes conhecidas. Nove estirpes de sequências estão na região da iniciação do seu cistrão da proteína de revestimento codificada pelo RNA 3 e mRNA subgenõmico 4 (SEQ ID NOS. 7-25; Figuras 4(A) e 5). Foram escolhidos dois sítios que estão conservados na sequência e a jusante do codão de iniciação AUG da proteína de revestimento. Os oligonucleótidos para a construção de ribozimas capazes de fazer "splicing" trans no mutante ile de DTA para o mRNA proteína de revestimento de CMV estão apresentados na Figura 4B e discutidos abaixo.

As ribozimas de "splicing" trans mostradas na Figura 4C e D foram direccionadas para as sequências do vírus CMV mostrado na Figura 4B e resultarão não só na clivagem de moléculas de ENA de CMV como também na expressão da cadeia A da toxina da difteria na célula infectada. As cassetes de "splicing" trans mostradas na Figura 4 podem ser usadas para transformar quaisquer espécies vegetais susceptíveis ao CMV usando técnicas comnhecidas e a progénie transgénica testada relativamente à sensibilidade à infecção por CMV. A projecção da ribozima é tal que a infecção pelo vírus é necessária para iniciar a produção de toxina via "splicing" trans do RNA pois a própria enzima não é traduzida. A morte localizada das células infectadas que resulta da expressão da toxina pode limitar a replicação e dispersão do vírus dentro da planta dando uma resposta hipersensível artificial.

Exemplo 3

Construção de formas mutantes de DTA O principal critério para a projecção com êxito de uma ribozima que faça "splicing" trans de uma sequência codificadora de um produto tóxico não é só a catálise eficaz e precisa sdo "splicing" trans. como também que a expressão do gene tóxico não ocorra na ausência de "splicing" trans.

Estas moléculas de ribozima podem sofrer clivagem espontânea no sítio de "splicing" 3'. Dada a extrema toxicidade do DTA, é importante que quaisquer sequências exão 3' libertadas não dêem origem a produtos de tradução tóxicos. o exão 3' do DTA continha uma metionina na mesma grelha de leitura na posição 13, a qual poderá dar origem a um polipeptideo truncado mas tóxico. Para eliminar esta possibilidade, a sequência tipo selvagem (Rz-DTAmet) [SEQ ID NO. 6 (DNA) e SEQ ID NO. 38 (proteína)] foi alterado de metionina nesta posição para isoleucina (Rz-DTA.Qe) [SEQ ID NO. 39] ou leucina (Rz-DTAleu) [SEQ ID NO. 40] em duas construções de ribozima separadas (Figura 6) . A transformação de células hospedeiras com DTA^^e ou DTAleu não resultou em qualquer peptídeo truncado tóxico aparente na célula hospedeira.

Exemplo 4

Construção de pro-ribozimas para "splicing" trans A projecção e construção de RNAs catalíticos (ribozima) que podem especificamente clivar um RNA alvo e fazer o "splicing" de um segmento de RNA scolhido para a fracção 5' esta descrito atrás. São aqui apresentados novos meios de cnstrução de ribozimas de "splicing" trans que têm uma conformação alterada e portanto são inactivas, na ausência de RNA alvo.

Projecção

Como um teste para a projecção de pro-ribozimas, a ribozima de "splicing" trans CAT-LacZ descrita anteriormente foi modificada (Figura 7). Comparações filogenéticas e análise mutacional (para revisão, ver Cech, Ann Rev. Biochem. 59:543-568 (1990)) indicaram que uma região central dos intrões de auto--"splicing" do Grupo I é altamente conservada e importante para a actividade (Figura 8). Para a construção de pro-ribozimas de "splicing" trans uma hélice imediatamente adjacente a esta '0 -46-

região, P8, foi destruída. Nas primeiras experiências, 13 ou 18 nucleótidos da nova sequência foram introduzidos na cadeia 5' e ansa da hélice P8, para produzir a pro-ribozima 1 e 2, respecti-vamente. Os nucleótidos extra eram complementares da fracção "anti-codão" 5' da ribozima, enquanto que as sequências flan-queantes foram ajustados para conservar (1) as sequências na base de P8 e (2) o grau de emparelhamento possível dentro de P8 (Figura 8) . 0 grau de auto-complementaridade entre as sequências inseridas na hélice P8 e a região da pro-ribozima é tal que seria de esperar que esta nova hélice se forme em transcritos nascentes, de preferência a hélice P8. A formação desta hélice alternativa também seria de esperar que destruísse interacções flanquean-tes secundárias e talvez terciárias dentro do núcleo catalítico da ribozima. Assim, o enrolamento incorrecto da pro-ribozima torna-la-á cataliticamente inactiva (Figura 9). No entanto, o emparelhamento de bases da pro-ribozima com o RNA alvo com interesse deslocará o emparelhamento "anti-codão" P8, sequestro das sequências anti-codão e reformação da hélice P8 e de um domínio catalítico activo. 0 deslocamento da hélice "anti-codão" P8 resulta numa maior soma de pares de bases e permite enrolamento correcto do domínio catalítico, assim seja energeticamente favorecido.

Proribozimas CAT-LacZ

As sequências clonadas correspondendo âs duas pro-ribo-zimas CAT-LacZ foram construídas usando mutagénese por PCR como descrito atrás e RNAs foram produzidos por transcrição in vitro. Observou-se que a ribozima de "splicing" trans CAT-LacZ sofre clivagem durante a transcrição na junção de "splicing" 3', como resultado da hidrólise catalisada pelas sequências de intrão. Hidrólise semelhante é observada em transcritos in vitro do -47-

intrão não modificado de Tetrahvmena thermophila. Pelo contrário, os transcritos das pro-ribozimas CAT-LacZ diferentes são mais estáveis, sendo evidente pouca clivagem nas mesmas condições (Figura 10). isto indica que as pro-ribozimas são inactivas, o que seria de esperar se as sequências catalíticas estiverem mal enroladas. As formas truncadas das pro-ribozimas foram testadas relativamente a actividade específica de endorribonuclease dirigida contra o RNA de CAT. Os RNAs da pro-ribozima CAT-LacZ foram transcritos a partir de moldes truncados no sítio Saci, para remover a junção de "splicing" 3' e sequências LacZ. Tanto os RNAs de ribozimas como de pro-ribozimas são estáveis após remoção do sítio de "splicing" 3'. A incubação das pro-ribozimas truncadas com RNA de CAT levou â clivagem específica do RNA alvo para dar fragmentos dos tamanhos esperados (Figura 11). A actividade de clivagem específica foi observada a 37, 45 e 55 graus.

As formas de pro-ribozimas da ribozima de "splicing” trans GAL4-DTA foram também construídas (Figura 12). As regiões de 20 nucleõtidos (complementares da região "anti-codão") foramin-seridas na cadeia 5' e ansa da hélice P8. As duas pro-ribozimas diferiram no graus de emparelhamento de bases possível nas hélices P8 modificadas e a pro-ribozima 1 GAL4-DTA possuindo um pedúnculo maior e menos (3) bases acessíveis na ansa. A hélice P8 da pro-ribozima GAL4-DTA 2 assemelha-.se mais estreitamente à da pro-ribozima CAT-LacZ 2, com uma ansa maior (14 bases) contendo sequências complementares da região "anti-codão". Os transcritos das pro-ribozimas GAL4-DTA são mais estáveis do que os da ribozima não modificada. Em particular,a pro-ribozima 2 está essencialmente intacta após incubação em condições que resultam essencialmente em auto-clivagem completa da forma de ribozima (30 minutos de incubação a 50°C, 10 mM MgCl2, 2 mM GTP, ver Figura 13). v j :- % -48-

Tendo agora descrito totalmente o invento será compreendido pelos familiarizados com a matéria que o âmbito abrange uma larga gama de condições equivalentes, parâmetros e similares, sem afectar o espírito ou âmbito do invento ou qualquer realização dele.

Lisboa, 16 de Janeiro de 1992

J. PEREIRA DA CRUZ

Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR COROON, 10-A 3« 1200 USBOA